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CN118373896A - 抗pd-1抗体与il-2突变体的双功能融合蛋白 - Google Patents

抗pd-1抗体与il-2突变体的双功能融合蛋白 Download PDF

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CN118373896A
CN118373896A CN202410477737.6A CN202410477737A CN118373896A CN 118373896 A CN118373896 A CN 118373896A CN 202410477737 A CN202410477737 A CN 202410477737A CN 118373896 A CN118373896 A CN 118373896A
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fusion protein
tumor
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mutein
cell
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蔡祥海
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Shanghai Keqi Pharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供了抗PD‑1抗体与IL‑2突变体的双功能融合蛋白。本发明的双功能融合蛋白包含通过突变的FC相连的PD‑1抗体与IL‑2突变体。本发明的双功能融合蛋白具有活化扩增PD‑1阳性淋巴细胞、调节Treg细胞活性的作用,可激活肿瘤免疫从而治疗癌症。本发明还提供了双功能融合蛋白在肿瘤治疗领域的应用。本发明还提供了双功能融合蛋白与阿替利珠单抗联用治疗肿瘤的组合疗法。

Description

抗PD-1抗体与IL-2突变体的双功能融合蛋白
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说,本发明涉及一种抗PD-1抗体与IL-2突变体的双功能融合蛋白。
背景技术
肿瘤免疫治疗一直是癌症研究的热点,其目的在于激活或刺激免疫系统,通过自然机制识别、攻击、清除癌细胞,从而达到治疗癌症的效果。肿瘤免疫治疗主要包含细胞因子疗法、免疫检查点抑制剂、过继性免疫细胞治疗三大类,其中细胞因子疗法是最早的肿瘤免疫疗法,在肿瘤治疗中具有重大意义。
免疫检查点抑制剂以PD-1(Programmed Death-1)抑制剂为代表。PD-1是免疫负性调节因子,与其配体PD-L1或PD-L2结合,下调T细胞活性,介导免疫耐受,在肿瘤微环境中介导癌细胞的免疫逃逸。PD-1抑制剂可阻断PD-1与PD-L1的结合,恢复T细胞对肿瘤细胞的识别与杀伤。目前,上市的PD-1抑制剂有Nivolumab、Pembrolizumab等,用于不同肿瘤适应症的一、二线治疗。然而,部分患者对PD-1抑制剂无应答,这一问题可以通过细胞因子刺激效应T细胞解决。
细胞因子疗法以白细胞介素2(IL-2,Interleukin 2)为代表。IL-2是一种15kDa的多效分泌蛋白,主要由活化的CD4+T细胞分泌,与IL-2受体(IL-2R)结合,通过CD122、CD132激活下游JAK1-JAK3-STAT5、PI3K-mTOR1和MAPK信号通路,调节免疫反应。免疫环境稳定时,CD4+T细胞分泌较低浓度IL-2。免疫激活后,CD4+和CD8+T细胞、NK细胞、树突细胞(DCs)和肥大细胞通过自分泌和旁分泌IL-2,作用于表达IL-2受体(IL-2R+)的效应免疫细胞。IL-2通过受体IL-2α/β/γ形成的三/二聚体发挥调节免疫作用。三聚体IL-2R由α链(IL-2Rα;CD25)、β链(IL-2Rβ;CD122)、共同链(γc/CD132,与IL-4等共享)组成,具有高亲和力,主要在Treg细胞、初期活化的CD4+和CD8+T细胞部分NK细胞上表达。由IL-2Rβ和γ链组成的二聚体表现中等亲和力,主要在CD8+记忆T细胞和NK细胞上表达。IL-2低剂量时倾向结合高亲和力受体,IL-2高剂量时可被中亲和力受体结合。
IL-2与PD-1抑制剂联合治疗是肿瘤免疫治疗的新策略之一。然而,尽管IL-2具有较好的疗效,但因其半衰期短,需要高剂量给药,易导致细胞因子释放综合征和血管渗漏综合征等严重不良反应,限制了IL-2在临床中的应用。
因此,本领域需要开发一种具有高疗效和低副作用的IL-2/PD-1抑制剂联合治疗药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种具有高疗效和低副作用的IL-2/PD-1抑制剂联合治疗药物。
在本发明的第一方面,提供了一种IL-2突变蛋白,所述突变蛋白相对于SEQ IDNO:7所示的野生型IL-2蛋白具有以下突变:
第65位P突变为K、R、H、D、E、N、Q、Y、W或F;
第125位C突变为S、A、G、T或V。
在另一优选例中,所述IL-2突变蛋白对Treg细胞的激活能力为野生型IL-2的20%(较佳地10%,更佳地1%,更佳地0.1%)或以下。
在另一优选例中,所述IL-2突变蛋白对IL-2Rβγ的结合能力为野生型IL-2的80%(较佳地90%,更佳地95%,更佳地99%)或以上。
在另一优选例中,所述的IL-2突变体除所述突变(如第65位和125位氨基酸)外,其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.7所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中,所述的IL-2突变蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,或与其具有至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在本发明的第二方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白包括如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白。
在另一优选例中,所述的融合蛋白包含以下蛋白元件:
(i)抗PD-1抗体;
(ii)Fc片段;
(iii)如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白。
在另一优选例中,所述的融合蛋白从N端到C端具有下式I所示的结构:
P-F-I(I)
式中,各“-”独立地为连接肽或肽键;
P是抗PD-1抗体;
F是Fc片段;
I是所述IL-2突变蛋白。
在另一优选例中,所述的PD-1是人PD-1。
在另一优选例中,所述的抗PD-1抗体选自下组:Fab片段、单链抗体、单域抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述的抗PD-1抗体具有轻链可变区和重链可变区。
在另一优选例中,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中,所述的抗PD-1抗体从N端到C端具有下式IIa或IIb所示的结构:
VH-L-VL(IIa);
VL-L-VH(IIb);
其中,
VL为轻链可变区;
VH为重链可变区;
L为连接肽或肽键。
在另一优选例中,所述的L为柔性接头或刚性接头。
在另一优选例中,所述的柔性接头为1-6个(较佳地,3-5个)连续的G4S所示的序列。
在另一优选例中,所述抗PD-1抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,或与其具有至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在另一优选例中,所述的Fc片段为野生型IgG1来源的Fc片段,或突变型Fc片段。
在另一优选例中,所述的突变型Fc片段相对于SEQ ID NO:12所示的野生型IgG1Fc片段具有以下突变:
第234位L突变为A,第235位L突变为A,第329位P突变为G。
在另一优选例中,所述Fc片段氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中,所述IL-2突变蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选例中,所述的抗PD-1抗体和Fc片段通过连接肽连接,较佳地为柔性连接肽,更佳地为GGS所示序列。
在另一优选例中,所述的Fc片段和IL-2突变蛋白通过连接肽连接,较佳地为柔性连接肽,更佳地为GGGS(SEQ ID NO:13)所示序列。
在另一优选例中,所述的融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或与其具有至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在本发明的第三方面,提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:
(1)如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白;或
(2)如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第四方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的载体选自下组:DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在本发明的第五方面,提供了一种工程化的宿主细胞,所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为真核细胞,如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞,如大肠杆菌。
在另一优选例中,所述宿主细胞为293细胞或CHO细胞。
在本发明的第六方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白的方法,包括步骤:
(i)在合适的条件下,培养如本发明第五方面所述的宿主细胞,从而获得含有如本发明的第一方面所述的融合蛋白的混合物;和
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离,从而获得如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第七方面,提供了一种免疫偶联物,所述免疫偶联物含有:
(a)如本发明第二方面所述的融合蛋白;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中,所述偶联物部分选自:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在本发明的第八方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物含有:
(a)第一活性成分,所述活性成分选自下组:如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或其组合;以及
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物还含有第二活性成分,所述第二活性成分为抗肿瘤药物。
在另一优选例中,所述的第二活性成分选自下组:化疗药物、靶向药物、免疫刺激剂、抗体偶联药物、多肽药物、核酸类药物。
在另一优选例中,所述的第二活性成分为PD-1抗体或PD-L1抗体。
在另一优选例中,所述的第二活性成分为阿替利珠单抗。
在另一优选例中,所述的药物组合物用于治疗疾病。
在另一优选例中,所述的疾病为高表达PD-L1的肿瘤。
在本发明的第九方面,提供了如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第五方面所述的宿主细胞、、如本发明第六方面所述的免疫偶联物、或如本发明第八方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
在另一优选例中,所述的肿瘤为高表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中,所述血液肿瘤选自下组:急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征、或其组合。
在另一优选例中,所述实体瘤选自下组:前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、胸腺癌、或其组合。
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:结肠癌、肾癌、或其组合。
在另一优选例中,所述的药物还含有其他抗肿瘤药物。
在另一优选例中,所述的抗肿瘤药物选自下组:化疗药物、靶向药物、免疫刺激剂、抗体偶联药物、多肽药物、核酸类药物、或其组合。
在另一优选例中,所述的抗肿瘤药物为PD-1抗体或PD-L1抗体。
在另一优选例中,所述的抗肿瘤药物为阿替利珠单抗。
在本发明的第十方面,提供了一种治疗肿瘤的方法,所述方法包括向有需要的对象施用有效量的如本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或如本发明第八方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中,所述的肿瘤为高表达PD-L1的肿瘤。
在另一优选例中,所述的方法进一步包括用另外的疾病治疗方法治疗受试者。
在另一优选例中,所述的另外的疾病治疗方法选自下组:手术、放射疗法、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、辅助疗法、免疫疗法、或其组合。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了融合蛋白结构示意图。
图2显示了融合蛋白与人PD-1蛋白的结合活性。
图3显示了融合蛋白与人IL-2Rα(A)、IL-2Rβγ(B)、IL-2Rαβγ(C)的结合差异。
图4显示了KY-0118体外激活免疫细胞的功能研究。
图5显示了KY-0118对PBMC体外扩增活性评价。
图6显示了KY-0118的ADCC效应评价。
图7显示了KY-0118诱导PBMC释放IFN-γ。
图8A和8B显示了KY-0118诱导PBMC细胞-肿瘤共培养物释放IFN-γ。
图9显示了荷瘤hPD-1小鼠的体重变化及肿瘤体积变化。
图10显示了PBMC人源化小鼠模型中786-O移植瘤体积变化。
图11显示了C57-hPD-1小鼠模型的体重变化及肿瘤体积变化。
图12显示了肿瘤细胞PD-L1的表达水平。
图13显示了IFN-γ、TNF-α和IL-10检测结果。
图14显示了IL-6检测结果。
图15显示了C57-hPD-1-hPD-L1小鼠模型的体重变化及肿瘤体积变化。
图16显示了huPBMC-NCG-dko小鼠模型中786-O移植瘤的体积变化。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次开发了一种抗PD-1抗体与IL-2突变体的双功能融合蛋白。本发明的双功能融合蛋白包含通过突变的FC相连的PD-1抗体与IL-2突变体。本发明的双功能融合蛋白具有活化扩增PD-1阳性淋巴细胞、调节Treg细胞活性的作用,可激活肿瘤免疫从而治疗癌症。在此基础上,完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义,本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
如本文所用,术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用,不仅包括封闭式定义,还包括半封闭、和开放式的定义。换言之,所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用,术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用,术语“治疗有效量”,是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解,所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
本发明的双功能融合蛋白
如本文所用,术语“本发明的融合蛋白”、“本发明的双功能融合蛋白”、“本发明的PD-1抗体/IL-2融合蛋白”、“KY-0118”可互换使用,均指本发明第二方面中所述的融合蛋白。
本发明的融合蛋白包含以下蛋白元件:
(i)抗人PD-1抗体;
(ii)Fc片段;
(iii)IL-2突变蛋白。
本发明融合蛋白中抗PD-1抗体可以是任意的具有PD-1特异性结合力的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用,“抗原结合片段”指具有抗原结合活性的Fab片段,Fab’片段,F(ab’)2片段,或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区,但没有恒定区,并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的,Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头,且能够形成抗原结合所需的结构。在一种实施方式中,所述抗PD-1抗体是单链抗体(scFv)。
在本发明中,本发明的scFv还包括其保守性变异体,指与本发明scFv的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在优选的实施方式中,所述抗PD-1抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
如本文所用,除非另外说明,Fc是指人免疫球蛋白的Fc片段。术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白链恒定区,特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分,例如免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合,在优选例中,所用的免疫球蛋白的Fc区包括至少一个免疫球蛋白绞链区,一个CH2结构域和一个CH3结构域,优选缺少CH1结构域。
在优选的实施方式中,本发明融合蛋白中的Fc片段是人IgG1免疫球蛋白Fc片段的突变体。在一种实施方式中,本发明的Fc片段相对于野生型IgG1 Fc片段具有以下突变:L234A、L235A、P329G,但不限于此。本发明的Fc片段还可以包括任意的其他突变,只要所得到的融合蛋白相对于具有野生型Fc片段的融合蛋白具有降低的ADCC和CDC活性。
在优选的实施方式中,所述Fc片段氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
如本文所用,术语“IL-2突变体”、“IL-2突变蛋白”均是指本发明第一方面所述的IL-2突变蛋白。传统的IL-2药物,多由于外周血毒性过大而导致管线终止。本发明通过对IL-2进行突变设计,使突变的IL-2偏向性结合IL-2Rβγ受体,从而提高药物的安全性。
在一种实施方式中,本发明的IL-2突变蛋白相对于野生型IL-2蛋白具有以下突变:P65K和C125S,但不限于此。本发明的IL-2突变蛋白(或含有该IL-2突变蛋白的本发明的融合蛋白)还可以包括任意的其他突变,只要所得到的突变体相对于野生型IL-2蛋白具有降低的IL-2Rα的结合能力和Treg细胞的激活能力,并且具有相同或基本相同的IL-2Rβγ的结合能力。
在优选的实施方式中,所述的IL-2突变蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在一种实施方式中,本发明的融合蛋白的结构如图1中KY-0118所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的融合蛋白还包括上述融合蛋白的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-5个(通常为1-3个,更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内,较佳地为3个以内,更佳地为1个以内)氨基酸,或在蛋白N端或C端添加氨基酸侧链较小的氨基酸片段作为linker(如甘氨酸、丝氨酸等)。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外,所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比,有至多5个,较佳地至多3个,更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外,还可以对本发明的融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“本发明的多核苷酸”可以是包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1% Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。
本发明的融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地,被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中,编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
在本发明的融合蛋白制备方法中,可以使用任何合适的载体,可选自pET、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR之一,表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
真核/原核宿主细胞均可用于本发明的融合蛋白的表达,真核宿主细胞优选哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统,优选COS、CHO、NS0、sf9及sf21等细胞;原核宿主细胞优选为DH5a、BL21(DE3)、TG1之一。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的一类融合蛋白进行分离纯化,根据所利用的亲和柱的特性,可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白。
利用上述方法,可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质,例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
药物组合物
在本发明中,还提供了一种含有本发明融合蛋白或其免疫偶联物的药物组合物。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明的融合蛋白(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。所述的融合蛋白或其免疫偶联物可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂从而更稳定地发挥疗效,这些制剂可以保证本发明的其融合蛋白的氨基酸核心序列的结构完整性,同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。所述制剂可以是各种形态,通常情况下,对于液体制剂,通常可以在2℃-8℃条件下至少稳定保存一年,对于冻干制剂,在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂,优选水针或冻干制剂。
对于本发明的药物组合物(如水针或冻干制剂),其中药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合,其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80);poloxamer(如poloxamer 188);Triton;十二烷基硫酸钠(SDS);月桂硫酸钠;十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸;Pluronics;MONAQUATTM等,其加入量应使蛋白的颗粒化趋势最小,溶液稳定剂可以为糖类,包括还原性糖和非还原性糖,氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸,醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合,溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到在稳定的时间内保持稳定状态,等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一,缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明的融合蛋白或其免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约50微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约100毫克/千克体重,较佳地该剂量是约100微克/千克体重-约50毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。典型地,通常,总给药量不能超过一定范围,例如静脉注射的剂量是10至3000mg/天/50kg,较佳地100至1000mg/天/50kg。
本发明的融合蛋白和含有其的药物制剂可以作为抗肿瘤药物用于肿瘤治疗,本发明所称的抗肿瘤药物,指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物,可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低,它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现,还也减少或防止转移。
上述融合蛋白及其药物制剂还可以和其他的抗肿瘤药联合给药,用于肿瘤的治疗,这些用于联合给药的抗肿瘤药包括但不限于:1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物:烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类;铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等;丝裂霉素(MMC);(2)影响核酸合成的药物:二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等;胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等;嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等;核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等;DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等;(3)作用于核酸转录的药物:选择性作用于DNA模板,抑制DNA依赖RNA聚合酶,从而抑制RNA合成的药物如:放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等;(4)主要作用于微管蛋白合成的药物:紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱;(5)其他细胞毒药:门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成;2、激素类抗雌激素:三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等;芳香化酶抑制剂:氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等;抗雄激素:氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂:诺雷德、依那通等;3、生物反应调节剂:主要通过机体免疫功能抑制肿瘤的干扰素;除IL-2外的其他白细胞介素;胸腺肽类;4、单克隆抗体:美罗华(MabThera);Cetuximab(C225);赫赛汀(Trastuzumab);Bevacizumab(Avastin);Yervoy(Ipilimumab);Pembrolizumab(Keytruda);Atezolizumab(Tecentriq);5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物;细胞分化诱导剂如维甲类;细胞凋亡诱导剂。
本发明还包括本发明融合蛋白与阿替利珠单抗(Atezolizumab)联合治疗肿瘤的药物组合物和治疗方法。
本发明的主要优点包括:
1)本发明的双功能融合蛋白中,IL-2突变体经过特殊的改造设计(P65K和C125S突变)。与野生型IL-2相比,本发明的双功能融合蛋白对人IL-2Rα的亲和力基本消除,保留了较高的IL-2Rβγ二聚体结合活性。本发明的双功能融合蛋白偏向性激活表达IL-2Rβγ的淋巴细胞,不刺激或低水平刺激Treg细胞,可以显著降低IL-2信号通路导致的全身毒性。
2)本发明的双功能融合蛋白可以诱导PBMC更高浓度的IFN-γ释放。相比PD-1/PD-L1单抗,本发明的双功能融合蛋白可以促进PBMC释放大量效应细胞因子,如IFN-γ,同时促进T细胞的高效扩增,本发明的双功能融合蛋白具有更高效的肿瘤细胞杀伤能力。
3)本发明的双功能融合蛋白在动物实验水平具有更强的肿瘤抑制效果,在多种肿瘤模型中抑瘤效果显著优于Nivolumab和商品化IL-2。
4)本发明还提供了本发明的双功能融合蛋白+阿替利珠单抗联用的治疗方法,有较高的治疗效果和安全性。与融合蛋白单药、阿替利珠单抗单药相比,联合疗法引起的IFN-γ的释放量明显提高,同时IL-6、IL-10和TNF-α的释放量均无明显提高,安全性较好。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.融合蛋白的结构设计和表达制备
本发明所涉及的融合蛋白结构见图1,各融合蛋白的基本信息见表1,融合蛋白的氨基酸序列信息见表8。KY-0118的结构形式为VL-VH-Fc-IL-2v,氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,aPD-1-Fc-IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,aPD-1-Fc的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示,Fc-IL-2v的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示,Fc-IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,IL-2v的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在293细胞或CHO细胞中转染上述融合蛋白的质粒,培养后裂解细胞,进行融合蛋白纯化,收集洗脱液并浓缩,表达纯化后的融合蛋白用于后续实验。
表1融合蛋白基本信息总结
SEQ ID NO: 融合蛋白 氨基酸数量 理论等电点
1 KY-0118 600 8.36
2 aPD-1-Fc-IL-2 600 8.17
3 aPD-1-Fc 463 8.3
4 Fc-IL-2v 354 7.76
5 Fc-IL-2 354 7.25
6 IL-2v 133 7.99
7 IL-2 133 7.05
实施例2.融合蛋白可结合人PD-1蛋白
实验步骤如下:
1)将目标蛋白PD-1(His tag)使用PBS稀释至0.5μg/mL,按每孔100μl加入酶标板孔过夜包被;
2)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板一遍;
3)使用PBS缓冲液配置3%BSA封闭液,按每孔300μL加入封闭液,盖上酶标板盖,在37℃静置封闭2小时;
4)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板两遍;
5)将检测样品(KY-0118、aPD-1-Fc-IL-2、Fc-IL-2v、Fc-IL-2、aPD-1-Fc),阳性对照(Pembrolizumab、Nivolumab)和阴性对照(Isotype)稀释至20nM起始,按5倍比8梯度进行倍比稀释,每孔加入100μl,盖上酶标板盖,在37℃静置孵育1小时;
6)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板三遍;
7)将酶标二抗(Goat anti human-IgG Fc-HRP)按1:10000稀释后,在酶标板中每孔加入100μL,盖上酶标板盖,在37℃静置孵育0.5小时;
8)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板四遍;
9)每孔加入100μL TMB显色液,室温显色5min,加入50μl终止液终止后上机检测;
实验结果如图2所示,KY-0118、aPD-1-Fc-IL-2、aPD-1-Fc与PD-1(His tag)蛋白均具有较好的结合活性。
实施例3.融合蛋白与人IL-2Rα、IL-2Rβγ、IL-2Rαβγ蛋白的结合差异
实验步骤如下:
1)将目标蛋白IL-2Rα(His tag)和IL-2Rαβγ(His tag)使用PBS稀释至1μg/mL,目标蛋白IL-2Rβγ(His tag)使用PBS稀释至2μg/mL,按每孔100μl加入酶标板孔过夜包被;
2)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板一遍;
3)使用PBS缓冲液配置3%BSA封闭液,按每孔300μL加入封闭液,盖上酶标板盖,在37℃静置封闭2小时;
4)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板两遍;
5)将检测样品(KY-0118、aPD-1-Fc-IL-2、Fc-IL-2v、Fc-IL-2、aPD-1-Fc)和阴性对照(Isotype)分别稀释至100nM和20nM起始,按5倍比8梯度进行倍比稀释,其中20nM起始的样品按每孔100μl加入至包被IL-2Rα(His tag)和IL-2Rαβγ(His tag)的酶标板板孔,100nM起始的样品按每孔100μl加入至包被IL-2Rβγ(His tag)的酶标板板孔,盖上酶标板盖,在37℃静置孵育1小时;
6)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板三遍;
7)将酶标二抗(Goat anti human-IgG Fc-HRP)按1:10000稀释后,每孔加入100μL酶标板孔,盖上酶标板盖,在37℃静置孵育0.5小时;
8)取出酶标板,每孔加入300μL PBST洗板四遍;
9)每孔加入100μL TMB显色液,室温显色5min,加入50μl终止液终止后上机检测;
实验结果如图3所示,图3A、3B表明IL-2段未突变的aPD-1-Fc-IL-2、Fc-IL-2对IL-2Rα和IL-2Rαβγ蛋白均具有较高的结合活性;IL-2段突变后的KY-0118、Fc-IL-2v与IL-2Rα和IL-2Rαβγ蛋白未表现出明显结合活性;图3C表明IL-2段突变前和突变后的分子均保持了基本相同的IL-2Rβγ结合活性。
IL-2可以高效激活免疫细胞,是最具潜力的肿瘤治疗靶点,同时也是研发风险较高的靶点。IL-2可以与IL-2Rα、IL-2Rβγ、IL-2Rαβγ结合,无差别的激活T细胞、Treg细胞和NK细胞,所以在临床研究中,IL-2相关药物最大的研发风险为毒性太大。KY-0118偏向性激活表达IL-2Rβγ的淋巴细胞,不刺激或低水平刺激Treg细胞,可以显著降低IL-2信号通路导致的全身毒性。
实施例4.KY-0118与FcγRs、FcRn、C1q蛋白的亲和力
实验步骤如下:
KY-0118与FcγRs的亲和力检测:
1)芯片制备:将鼠抗His抗体用固定试剂(10mM醋酸钠,pH 4.5)稀释到50μg/mL。将950μL固定试剂加入50μL鼠抗His抗体用于固定八个通道。CM5芯片的表面用400mM EDC和100mM NHS以10μL/min的流速进行420s的活化。随后,将50μg/mL的抗体以10μL/min的流速注入到通道(channel 1-8,Fc1,2)约420s,固定量约为7000至14000RU。完成固定后,芯片用1M乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。
2)蛋白重构:按照产品COA将蛋白冻干粉进行重构,以大于10μg每管的规格进行分装,避免反复冻融。
3)缓冲液置换:使用脱盐柱及运行试剂1将KY-0118进行缓冲液置换,置换后的样品用SPECTROstarNano进行浓度测定。
4)捕获配体:将3个Fcγ受体用运行试剂1稀释至0.25μg/mL,并以10μL/min的流速依次注入到His捕获芯片实验通道(Fc2)约100RU。参比通道(Fc1)不需要进行配体的捕获。
5)分析物多循环分析:将KY-0118用运行试剂1进行稀释。将稀释后的KY-0118依次以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道,结合和解离相应时间。结合解离步骤均在运行试剂1中进行。每一个浓度分析后,芯片需要用pH1.5的10mM甘氨酸盐酸,以30μL/min的流速再生60s,洗掉配体以及未解离的分析物。进行下一个浓度分析时,实验通道需要重新捕获相同量的配体。
KY-0118与FcRn的亲和力检测:
1)芯片制备:将鼠抗His抗体用固定试剂(10mM醋酸钠,pH 4.5)稀释到50μg/mL,950μL固定试剂加入50μL鼠抗His抗体用于固定八个通道。首先,CM5芯片的表面用400mMEDC和100mM NHS以10μL/min的流速进行420s的活化。其次,将50μg/mL的鼠抗His抗体以10μL/min的流速注入到通道(channel1-8,Fc1,2)约420s,固定量约为7000至15000RU。最后,芯片用1M乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。
2)蛋白重构:按照产品COA将蛋白冻干粉进行重构,以大于10μg每管的规格进行分装,避免反复冻融。
3)缓冲液置换:使用脱盐柱及运行试剂2将KY-0118进行缓冲液置换,置换后的样品用SPECTROstarNano进行浓度测定。
4)捕获配体:将FcRn蛋白用运行试剂2稀释至0.25μg/mL并以10μL/min的流速注入到His捕获芯片实验通道(Fc2)约100RU。参比通道(Fc1)不需要进行配体的捕获。
5)分析物多循环分析:将KY-0118用运行试剂2进行2倍倍比稀释。将稀释后的3个抗体以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道,结合和解离相应时间。结合解离步骤均在运行试剂2中进行。每一个浓度分析后,芯片需要用pH值为1.5的甘氨酸盐酸,以30μL/min的流速再生60s,洗掉配体以及未解离的分析物。进行下一个浓度分析时,实验通道需要重新捕获相同量的配体。
KY-0118与C1q的亲和力检测:
1)蛋白重构:按照产品COA将蛋白冻干粉进行重构,以大于10μg每管的规格进行分装,避免反复冻融。
2)缓冲液置换:使用脱盐柱及运行试剂将KY-0118和C1q进行缓冲液置换,置换后的样品用SPECTROstarNano进行浓度测定。
3)芯片制备:将KY-0118用固定试剂(10mM醋酸钠,pH4.5)稀释到10μg/mL。CM5芯片表面用400mM EDC和100mM NHS以10μL/min的流速进行420s的活化。其次,将10μg/mL的KY-0118以10μL/min的流速注入到实验通道(Fc2)固定约1000RU,最后,芯片用1M乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。参比通道(Fc1)不注入KY-0118,其他操作与实验通道(Fc2)相同。
4)分析物多循环分析:将C1q用运行试剂1进行2倍倍比稀释。稀释后的C1q依次以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道,结合和解离相应时间。结合解离步骤均在运行试剂中进行。每一个浓度分析后,芯片需要用运行试剂,以30μL/min的流速再生60s,洗掉未解离的分析物。
实验结果如表2所示,KY-0118与与人FcRn亲和力强,与CD64、CD32a弱结合,与CD16a、C1q不结合。
表2KY-0118与人FcγRs、FcRn、C1q蛋白亲和力测试结果
实施例5.KY-0118对免疫细胞激活的影响
实验步骤如下:
1)稀释KY-0118和野生型IL-2样品,12个梯度,0.00001~1000000pM。
2)PBMC细胞清洗,使用PBS重悬;400g,8min离心去上清。
3)PBMC细胞用1640基础培养基重悬,铺96孔板,50μL/孔,加入药物(50μL药物+50μL PBMC),37℃孵育15min。
4)加BD Cytofix Buffer 1mL,涡旋混匀,37℃,固定10min,2000rpm,5min离心去上清。
5)每管加入1mL Stain buffer(FBS),重悬洗一遍,2000rpm,5min离心去上清。
6)每管加入-20℃预冷的Perm Buffer III 0.5mL,涡旋混匀,4℃孵育30min进行破膜(或冰上孵育30min)。
7)2000rpm,5min离心去上清,加1mL Stain buffer(FBS),每100μL反应体系,加入Fc-blocker,室温避光孵育10min;反应完成后,加1mL Stain buffer(FBS),清洗细胞1次,2000rpm,5min离心去上清。
8)CD3(FITC)、CD8(PerCP)、CD56(PE)和STAT5(APC)使用Stain buffer(FBS)配制成Mix,100μL/管,室温避光40min。Treg检测试剂盒中Alexa488anti-human FOXP3/CD25 PE/CD4 PerCP抗体混合物和STAT5(APC),配制为Mix。染色方法参考BD的STAT5抗体检测步骤,室温孵育40min。
9)加1mL Stain buffer(FBS),2000rpm,5min离心去上清;用200μL体积Stainbuffer(FBS)重悬细胞,流式检测。
如图4结果显示,KY-0118对CD8+T细胞、NK细胞的激活能力与野生型IL-2相近。KY-0118对CD4+T细胞的激活激活能力弱于野生型IL-2。KY-0118对Treg细胞的激活能力明显弱于野生型IL-2,表明KY-0118中IL-2位点的突变有效降低与IL-2Rα的结合,削弱对Treg细胞的激活。KY-0118对Treg细胞激活的EC50值为190.6pM,IL-2对Treg细胞的激活能力的EC50值<0.0001pM。
实施例6.KY-0118对免疫细胞体外扩增活性的影响
实验步骤如下:
1)离心PBMC细胞(4E6个),PBS清洗一次。
2)用PBS1:20稀释2mM的CFSE(100μg用90μL DMSO溶解)母液,终浓度0.1nM。
3)预热的PBS(10mL)重悬PBMC,加入10μL CFSE稀释液,37℃孵育15min。
4)加入10mL的预热的完全培养基(1640+10%FBS+1%三抗)终止反应,400g离心10min,去上清,将细胞重悬至20mL新鲜培养基中,37℃孵育30min。
5)细胞400g离心10min,去上清,用2.5mL新鲜培养基重悬。细胞密度约为1E6-1.5E6/mL。
6)细胞按1E5-1.5E5/孔接种至96孔板中,每孔100μL,添加相应浓度的药物100μL。
7)孵育培养5天。使用含FBS的PBS清洗细胞一次。
8)添加流式抗体混合液进行染色,抗体混合液:CD3(PerCP)、CD4(APC)、CD56(PE),
9)室温避光40min。
10)含FBS的PBS清洗两次,400g,离心5min,进行流式检测(分群:CD8+T细胞定义为CD3+CD4-、CD4+T细胞定义为CD3+CD4+、NK细胞定义为CD3-CD56+)。
如图5实验结果显示,KY-0118可促进CD4+T细胞、CD8+T细胞扩增。基于KY-0118的IL-2V的P65K和C125S突变,KY-0118扩增活性弱于IL-2,结果符合设计预期。
实施例7.KY-0118的ADCC效应评价
实验步骤如下:
1)含10% FBS的培养基稀释样品蛋白至200、40、10、2.5、0.625、0.1562、0.0390、和0.0040nM,转移至细胞板中,每孔50μL。
2)PD-1-CHO细胞转移至离心管中,离心去上清,用含10% FBS的RPMI1640培养基重悬计数后,细胞密度调整为4×105cells/mL。
3)CD16-NF-AT-jurkat细胞离心去上清,含10% FBS的RPMI1640培养基重悬计数,细胞密度调整至2×106cells/mL。
4)将PD-1-CHO细胞与CD16-NF-AT-jurkat细胞充分混合,转移至含有样品稀释液的96孔板中,50μL/孔,37℃、5% CO2培养箱中培养6小时。
5)检测前将细胞板取出,于室温中平衡10分钟,加入已平衡至室温的Bright-Lite检测液,每孔50μL,进行流式检测。
如图6实验结果显示,Anti-hPD-1-Ni-hIgG1为ADCC阳性对照抗体,Anti-βGal-hIgG1为ADCC阴性对照抗体。基于KY-0118中Fc部分的LALA PG突变,KY-0118不具有ADCC效应,与实施例4显示的CD32a、CD64弱结合现象一致。
实施例8.KY-0118诱导PBMC释放IFN-γ
实验步骤如下:
1)hPBMC的活化:新鲜hPBMC,配平后使用离心机400G,离心5min,将上清倒出,倾斜离心管2min左右,使用200μL规格移液器将管口残留的液体吸出。加入培养基(X-Vivo15Medium+10%灭活FBS+1%P/S)重悬,将细胞密度调整至2×106cells/mL。转移至T175细胞培养瓶中,加入10nM Anti-CD3 mAb和2nM Anti-CD28 mAb,细胞培养箱中孵育24h。
2)24h后,使用PBS溶液清洗hPBMC三次。最后一次使用培养基(RPMI 1640+10%灭活FBS+1% P/S+55μM 2-Mercaptoethanol)重悬,将细胞密度调整为2×106cells/mL,以100μL、2×105cells/well的密度种植在96孔板中。
3)样品(KY-0118)用注射用水溶解至10mg/mL。使用RPMI 1640+10%灭活FBS+1%P/S+55μM 2-Mercaptoethanol将Isotype和KY-0118样品稀释。Isotype共两个浓度:100nM,10nM。KY-0118共9个浓度,起始浓度2000nM,以4倍梯度稀释。设立阴性对照(Mediumcontrol)。向孔中加入100μL样品和对照组,于细胞培养箱中孵育72h。
4)72h后,350g离心5分钟,收取150μL细胞上清。使用人IFN-γElisa检测试剂盒检测细胞上清中IFN-γ含量。
实验结果如图7所示,KY-0118能够剂量依赖性的诱导hPBMC细胞释放IFN-γ因子。
实施例9.KY-0118可促进T细胞-肿瘤共培养物释放IFN-γ
实验步骤如下:
1)hPBMC的活化:新鲜hPBMC,配平后使用离心机400G,离心5min,将上清倒出,倾斜离心管2min左右,使用200μL规格移液器将管口残留的液体吸出。加入培养基(X-Vivo15Medium+10%灭活FBS+1%P/S)重悬,将细胞密度调整至2×106cells/mL。转移至T175细胞培养瓶中,加入T cell Transact试剂或10nM Anti-CD3 mAb和2nM Anti-CD28 mAb,细胞培养箱中孵育24h。
2)24h后,使用PBS溶液清洗hPBMC三次。最后一次使用培养基(RPMI 1640+10%灭活FBS+1% P/S+55μM 2-Mercaptoethanol)重悬,将密度调整为1×106cells/mL,以100μL、1×105cells/well的密度种植在96孔板中。
3)将对数生长期的肿瘤细胞用胰酶于室温中处理3-10min,使贴壁细胞从培养瓶底脱离,加入4-6倍胰酶体积的1640完全培养基或等体积的FBS作终止处理。1000rpm,离心5min,弃上清,使用培养基(RPMI 1640+10%灭活FBS+1%P/S+55μM 2-Mercaptoethanol)重悬。将肿瘤细胞分别按照hPBMC:Tumor cell=2:1,4:1的比例以每孔50μL细胞种植在hPBMC96孔板中。
4)样品(KY-0118)用注射用水溶解至10mg/mL。使用RPMI 1640+10%灭活FBS+1%P/S+55μM 2-Mercaptoethanol将KY-0118样品和Nivolumab稀释。设立阴性对照(Mediumcontrol)。向孔中加入50μL样品和对照组,于细胞培养箱中孵育72h。
5)72h后,350g离心5分钟,收取150μL细胞上清。使用人IFN-γElisa检测试剂盒检测细胞上清中IFN-γ含量。
结果:图8A为PBMC与4种肿瘤细胞(H1993,A498,U-87MG,HCT116)按照效靶比2:1的共孵育条件下,KY-0118和Nivolumab对IFN-γ释放量的影响。
图8A结果表明,31.25nM和0.488nM的KY-0118能显著提升PBMC与肿瘤细胞共孵育体系下的IFN-γ释放量,与NC相比具有显著性差异。在该实验体系下,Nivolumab较弱地促进IFN-γ的释放,31.25nM的KY-0118实验组的IFN-γ的释放量明显优于33nM的Nivolumab实验组。
图8B为PBMC与4种肿瘤细胞(H1993,A498,U-87MG,HCT116)按照效靶比4:1的共孵育条件下,KY-0118和Nivolumab对IFN-γ释放量的影响。
图8B结果表明,31.25nM和0.488nM的KY-0118能显著提升PBMC与肿瘤细胞共孵育体系下的IFN-γ释放量,与NC相比具有显著性差异。在该实验体系下,Nivolumab较弱的促进IFN-γ的释放,31.25nM的KY-0118实验组的IFN-γ的释放量明显优于33nM的Nivolumab实验组。
图8A和图8B结果表明,在其他实验条件保持相同的情况下,效靶比4:1实验组的IFN-γ的释放量低于效靶比2:1实验组。
实施例10.KY-0118可低剂量显著抑制hPD-1小鼠中MC38移植瘤的生长实验步骤如下:
1)将MC38细胞接种于雌性C57-hPD-1小鼠右侧前胁肋部皮下(8-10周龄,50只);
2)待肿瘤生长至80-120mm3左右时分组,每组6只,分7组,组别及给药情况见表3:
表3小鼠分组给药信息表
3)尾静脉注射给予溶媒对照组、KY-0118 0.05mg/kg组、KY-0118 0.15mg/kg组、KY-0118 0.5mg/kg组以及Fc-IL-2v组0.29mg/kg,每周1次,持续3周;腹腔注射给予Nivolumab 3mg/kg组,每周1次,持续3周;皮下注射给予IL-2组,每天1次,每周5次,持续3周;
4)每周2次测量肿瘤体积及体重,记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系;
5)计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率:
肿瘤体积(V)计算为:(长×宽2)/2
肿瘤生长抑制率(TGI%)用以下公式计算:
肿瘤生长抑制率=(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100%
实验结果如图9所示,在MC38肿瘤细胞C57-hPD-1小鼠模型中,KY-01180.05mg/kg、0.15mg/kg、0.5mg/kg剂量均能有效抑制肿瘤细胞MC38在小鼠体内的生长增殖,Day20的抑瘤率分别为81.8%、92.3%,99.2%,呈剂量依赖性;Fc-IL-2v 0.29mg/kg剂量下,Day20的抑瘤率为-26.4%,未表现出抑瘤作用;Nivolumab 3mg/kg剂量Day20的抑瘤率为95.2%,表现出显著的抑瘤作用;IL-2经多次给药(20万IU/次,QD×5/week×3)后Day20的抑瘤率为7.6%,几乎没有抑瘤作用;上述结果表明,0.05mg/kg及以上剂量的KY-0118能够有效抑制小鼠结肠癌MC38细胞在小鼠体内的生长和增殖,且呈剂量依赖关系;KY-0118的抑瘤效果优于等摩尔剂量下的无靶向作用的Fc-IL-2v;KY-0118的抑瘤效果优于高剂量IL-2;在近似抑瘤效果下,KY-0118使用剂量远低于Nivolumab剂量。
实施例11.KY-0118可有效抑制PBMC人源化小鼠中786-O移植瘤的生长实验步骤如下:
1)在80只雌性PBMC人源化B2M小鼠右侧前胁肋部皮下接种人肾癌786-O细胞;
2)待肿瘤生长至100-150mm3左右时,将小鼠随机分成6组,每组10只,分组情况见表4:
表4小鼠分组给药信息表
3)尾静脉注射给予溶媒对照组、KY-0118 0.08mg/kg组、KY-0118 0.2mg/kg组、KY-0118 0.5mg/kg组,每周1次,持续4周;腹腔注射给予Nivolumab 3mg/kg组,每周1次,持续4周;皮下注射给予IL-2组,每天1次,每周5次,持续4周;
4)每周2次测量肿瘤体积及体重,记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系;
实验结果显示(图10),在786-O肿瘤细胞PBMC人源化B2M小鼠模型中,KY-01180.08mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg剂量均能有效抑制肿瘤细胞786-O在小鼠体内的生长增殖,Day28的抑瘤率分别为45.75%、62.93%,73.78%,呈剂量依赖关系;Nivolumab 3mg/kg剂量Day28的抑瘤率为6.41%,未表现出抑瘤作用;IL-2经多次给药(20万IU/次,QD×5/week×4)后Day28的抑瘤率为64.95%,表现出抑瘤作用;上述结果表明,KY-0118在0.08mg/kg及以上剂量,能够有效抑制人肾癌786-O细胞在小鼠体内的生长和增殖,且呈剂量依赖关系;高于KY-0118高剂量的Nivolumab 3mg/kg组亦未表现出抑瘤效果;KY-0118的抑瘤效果优于高剂量IL-2;在近似抑瘤效果(64.95%vs 62.93%)下,IL-2的使用量(20万IU/次,QD×5/week×4)远高于KY-0118(0.2mg/kg,QW×4)使用量。
实施例12.KY-0118可显著抑制hPD-1小鼠中Pan02-CDX移植瘤的生长
实验步骤如下:
1)准备雌性C57-hPD-1小鼠(8-10周龄),60只;雌性C57小鼠(8-10周龄),20只;
2)将Panc02细胞接种于以上小鼠右侧前胁肋部皮下;
3)待肿瘤生长至80-120mm3左右时分组,C57-hPD-1小鼠每组8只,分6组;C57小鼠每组8只,分2组,组别及给药情况见表5:
表5小鼠分组给药信息表
4)尾静脉注射给予C57-hPD-1溶媒对照组、C57-hPD-1KY-0118 0.1mg/kg组、C57-hPD-1KY-0118 0.3mg/kg组、C57-hPD-1KY-0118 1mg/kg组以及C57溶媒对照组和C57 KY-0118 1mg/kg组,每周1次,持续4周;腹腔注射给予C57-hPD-1Nivolumab 3mg/kg组,每周1次,持续4周;皮下注射给予C57-hPD-1IL-2组,每天1次,每周5次,持续4周;
5)每周2次测量肿瘤体积及体重,记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系;
6)计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率:
肿瘤体积(V)计算为:(长×宽2)/2
肿瘤生长抑制率(TGI%)用以下公式计算:
肿瘤生长抑制率=(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100%
实验结果显示(图11),在Panc02肿瘤细胞C57-hPD-1小鼠模型中,KY-01180.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg剂量均能有效抑制肿瘤细胞Panc02在小鼠体内的生长增殖,Day27的抑瘤率分别为78.1%、96.2%,100%,呈剂量依赖性,且KY-0118 1mg/kg在Day17的抑瘤率达100%;Nivolumab 3mg/kg剂量Day27的抑瘤率为49.9%,表现出抑瘤作用;IL-2经多次给药(20万IU/次,QD×5/week×4)后Day27的抑瘤率为13.0%,几乎没有抑瘤作用;在Panc02肿瘤细胞C57小鼠模型中,KY-0118 1mg/kg在Day17的抑瘤率为30.2%。
上述结果表明,KY-0118在0.1mg/kg及以上剂量,能够有效抑制小鼠胰腺癌Panc02细胞在小鼠体内的生长和增殖,且呈剂量依赖关系;等剂量KY-0118在可靶向模型中的抑瘤效果优于不可靶向模型;0.1mg/kg KY-0118的抑瘤效果优于高剂量20万IU/次IL-2(KY-0118摩尔量:IL-2摩尔量=1:187);在更优的抑瘤效果下,0.1mg/kg KY-0118使用剂量低于3mg/kg Nivolumab剂量(KY-0118摩尔量:Nivolumab摩尔量=1:14)。KY-0118表现出显著的协同效果。
实施例10-12的结果显示,相比Nivolumab和商品化IL-2,KY-0118具有更强的肿瘤抑制效果,且呈剂量依赖趋势。
实施例13.高表达PD-L1抗原的肿瘤细胞株筛选
实验步骤如下:
1)从液氮取出冻存的肿瘤细胞,37℃水浴复苏,转移到含完全培养基的离心管中,离心弃上清,用1×PBS重悬,离心清洗1次,去除冻存液中的DMSO。
2)各肿瘤细胞用相应的培养基重悬,转移到培养瓶中培养24h后换液。
3)待细胞贴壁生长到80%的密度后,消化传代。
4)各细胞传代一次后,再次培养到80%的密度后进行PD-L1标志物的鉴定。
5)胰酶消化贴壁的肿瘤细胞,完全培养基中止后离心弃上清,再用PBS重悬离心清洗一次,去除残留的胰酶。用肿瘤细胞相应的培养基重悬并计数。
6)用FACS buffer(1×PBS+2%FBS)分别将APC-anti-human CD274(B7-H1,PD-L1)Antibody和APC-Mouse IgG2bκIsotype Ctrl Antibody稀释50倍,备用。
7)待测的肿瘤细胞平行操作:每个细胞取出5×105的细胞数,用FACS buffer重悬到2×106cells/mL,取出2份100μL的细胞,一份与100μL 50倍稀释后的APC-anti-humanCD274(B7-H1,PD-L1)Antibody充分混合作为PD-L1阳性组;一份与100μL 50倍稀释后的APC-Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody充分混合作为阴性对照,4℃孵育60min。
8)用FACS buffer重悬细胞,离心弃上清,清洗3次后用200μL FACS buffer重悬混匀,用流式细胞仪读取数据,调整阴性对照的阳性率为1%为背景,以记录PD-L1阳性组的PD-L1阳性率。
结果如图12显示,EBC-1、NCI-H1975、HCC827、NCI-H1993、NCI-H596、A498、786-O、Hs746T、HCT116、U-87MG细胞的PD-L1抗原有高表达,阳性率可达95%以上。
实施例14.KY-0118与阿替利珠单抗联合的体外活性
实验步骤如下:
IFN-γ、TNF-α和IL-10释放量检测:
1)从厂家购得新鲜hPBMC,离心重悬,用激活培养基(含CD3单抗和CD28单抗的X-Vivo15培养基)重悬,计数,调整密度至2×106cells/mL,于37℃,5%CO2环境中激活24h。
2)用1×PBS清洗激活24h后的hPBMC 4次,用共孵育培养基(1640培养基+10%FBS+1%P/S+55μM巯基乙醇)重悬并计数,调整细胞密度至5×105cells/mL。以100μL/孔加到96孔细胞培养板中。
3)消化对数生长期的人肾癌细胞A498,用共孵育培养基重悬并调整密度至1×106cells/mL,以50μL/孔加到含hPBMC的96孔细胞培养板中。
4)配制待测样品,50μL/孔加到上述96孔细胞培养板中,于37℃,5%CO2环境中培养72h。
5)72h后离心取上清,适当稀释后使用BD CBA检测试剂盒检测。
6)将试剂盒中的beads等体积混匀得混合beads。
7)将样品上清、混合beads和PE检测抗体各50μL混合,混匀后室温避光3h。
8)用1×Wash buffer清洗3次后用1×Wash buffer重悬,上机读数。使用线性拟合计算上清中细胞因子含量。
结果如图13所示,IL-2组为阳性对照。与Isotype和NC相比,该实验中KY-0118单药可显著增强IFN-γ的释放;但阿替利珠单抗单药不能(或微弱)地促进IFN-γ的释放。阿替利珠单抗+KY-0118的联用相比KY-0118单药,可显著提高IFN-γ的释放。在多个给药浓度下,均可观察到联用疗法引起的IFN-γ释放量提高水平较两单药组之和更高,显示阿替利珠单抗+KY-0118的联用治疗具备协同效果。在一定范围内,随着阿替利珠单抗浓度的增加,IFN-γ的释放量也增加。
与KY-0118单药、阿替利珠单抗单药相比,阿替利珠单抗+KY-0118联用刺激hPBMC释放的TNF-α和IL-10有一定增加,但释放量均处在较低水平。
IL-6释放量检测:
1)从厂家购得新鲜hPBMC,离心重悬,用激活培养基(含CD3单抗和CD28单抗的X-Vivo15培养基)重悬,计数,调整密度至2×106cells/mL,于37℃,5%CO2环境中激活24h。
2)用1×PBS清洗激活24h后的hPBMC 4次,用共孵育培养基(X-Vivo15培养基+1%P/S+55μM巯基乙醇)重悬并计数,调整细胞密度至5×105cells/mL。以100μL/孔加到96孔细胞培养板中。
3)消化对数生长期的人肾癌细胞A498,用共孵育培养基重悬并调整密度至1×106cells/mL,以50μL/孔加到含hPBMC的96孔细胞培养板中。
4)配制待测样品,50μL/孔加到上述96孔细胞培养板中,于37℃,5%CO2环境中培养72h。
5)72h后离心取上清,适当稀释后使用ELISA检测试剂盒检测。
6)将试剂盒中的Biotin-Anti-IL-6Antibody和稀释后的样品上清(包括标准曲线)各50μL混合,室温孵育1h。用1×Wash buffer清洗5次。
7)加入50倍稀释后的Streptavidin-HRP,50μL/孔,室温孵育30min。用1×Washbuffer清洗5次
8)加入100μL/孔的显色液,避光室温孵育15min。
9)加入50μL/孔的终止液停止显色,用酶标仪取OD450-OD630的值。扣除空白孔数值后,采用4参数拟合的方式计算上清中IL-6的含量。
图14结果显示,与KY-0118单药组相比,阿替利珠单抗+KY-0118联用组未表现出IL-6释放量的增加。与NC相比,阿替利珠单抗+KY-0118联用组的IL-6释放量有微弱增加。
实施例15.hPD-L1小鼠的MC38肿瘤模型中,KY-0118与阿替利珠单抗联用药效优于单药药效
实验步骤如下:
1)实验小鼠:雌性C57-hPD-1-hPD-L1小鼠,实验时32只,6-8周龄
2)实验细胞:人源化PD-L1小鼠结肠癌MC38细胞(hPD-L1-MC38)
3)接种量:1×106cells/只
4)接种位置:小鼠右侧前胁肋部皮下
5)分组给药:待肿瘤生长至80-120mm3左右时分组,每组8只,分4组,组别及给药情况见表6:
表6小鼠分组给药信息表
6)尾静脉注射给予溶媒、单药组KY-0118及联用组KY-0118 0.3mg/kg,每周1次,持续3周;腹腔注射给予单药组阿替利珠单抗及联用组阿替利珠单抗5mg/kg,每周2次,持续3周。每周2次测量肿瘤体积及体重,记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积,计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率,肿瘤体积(V)计算为:(长×宽2)/2,肿瘤生长抑制率=(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100%。
实验结果显示(图15),在hPD-L1-MC38肿瘤细胞C57-hPD-1-hPD-L1小鼠模型中,KY-0118 0.3mg/kg与阿替利珠单抗5mg/kg剂量可以有效抑制肿瘤细胞hPD-L1-MC38在小鼠体内的生长增殖,Day21的抑瘤率分别为65.9%、64.8%;KY-0118 0.3mg/kg与阿替利珠单抗5mg/kg联用,Day21的抑瘤率为85.6%,联用组抑瘤效果较两个药物单用具有显著性差异(p<0.05)。
实施例16.huPBMC-NCG-dko小鼠的786-O肿瘤模型中,KY-0118与阿替利珠单抗联用药效优于单药药效
实验步骤如下:
1)实验小鼠:雌性huPBMC-NCG-dko小鼠,实验时32只,6-8周龄
2)实验细胞:人肾癌786-O细胞
3)接种量:1×107cells/只
4)接种位置:小鼠右侧前胁肋部皮下
5)分组给药:待肿瘤生长至100-150mm3左右时分组,每组8只,分4组,组别及给药情况见下表:
表7小鼠分组给药信息表
6)尾静脉注射给予溶媒、单药组KY-0118及联用组KY-0118 0.2mg/kg,每周1次,持续3周;腹腔注射给予单药组阿替利珠单抗及联用组阿替利珠单抗3mg/kg,每周2次,持续3周。每周2次测量肿瘤体积及体重,记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积,计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率,肿瘤体积(V)计算为:(长×宽2)/2,肿瘤生长抑制率=(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100%。
实验结果显示(图16),在786-O肿瘤细胞huPBMC-NCG-dko小鼠模型中,KY-01180.2mg/kg与阿替利珠单抗3mg/kg剂量可以有效抑制肿瘤细胞786-O在小鼠体内的生长增殖,Day18的抑瘤率分别为69.2%、65.7%;KY-01180.2mg/kg与阿替利珠单抗3mg/kg联用,Day18的抑瘤率为100%,联用组抑瘤效果较两个药物单用具有显著性差异(p<0.05)。
表8氨基酸序列表
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种IL-2突变蛋白,其特征在于,所述突变蛋白相对于SEQ ID NO:7所示的野生型IL-2蛋白具有以下突变:
第65位P突变为K、R、H、D、E、N、Q、Y、W或F;
第125位C突变为S、A、G、T或V。
2.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包括如权利要求1所述的IL-2突变蛋白,所述的融合蛋白从N端到C端具有下式I所示的结构:
P-F-I(I)
式中,各“-”独立地为连接肽或肽键;
P是抗PD-1抗体;
F是Fc片段;
I是如权利要求1所述的IL-2突变蛋白。
3.如权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述抗PD-1抗体氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示,所述Fc片段氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述IL-2突变蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
4.如权利要求3所述的融合蛋白,其特征在于,所述的融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或与其具有至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
5.一种多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:
(1)如权利要求1所述的IL-2突变蛋白;或
(2)如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白。
6.一种载体,其特征在于,所述载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种工程化的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有如权利要求6所述的载体或基因组中整合有如权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种制备如权利要求1所述的IL-2突变蛋白或如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
(i)在合适的条件下,培养如权利要求7所述的宿主细胞,从而获得含有如权利要求1所述的IL-2突变蛋白或如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白的混合物;和
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离,从而获得如权利要求1所述的IL-2突变蛋白或如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白。
9.一种免疫偶联物,其特征在于,所述免疫偶联物含有:
(a)如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
10.一种药物组合物,所述药物组合物含有:
(a)第一活性成分,所述活性成分选自下组:如权利要求1所述的IL-2突变蛋白、如权利要求2-4中任一项所述的融合蛋白、如权利要求7所述的宿主细胞、如权利要求9所述的免疫偶联物、或其组合;以及
(b)药学上可接受的载体。
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