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CN116096353A - 异二聚体fc融合蛋白的配制品、剂量方案和制造工艺 - Google Patents

异二聚体fc融合蛋白的配制品、剂量方案和制造工艺 Download PDF

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CN116096353A
CN116096353A CN202180042458.1A CN202180042458A CN116096353A CN 116096353 A CN116096353 A CN 116096353A CN 202180042458 A CN202180042458 A CN 202180042458A CN 116096353 A CN116096353 A CN 116096353A
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A·布劳恩
A·F·张
J-M·库列罗
M·德罗斯
A·格林贝格
E·古铁雷斯
P·科比
C·R·摩根
M·C·奈尔
S·奥尼尔
M·希夫林
N·瓦特曼
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Dragonfly Therapy Co ltd
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Abstract

本发明涉及异二聚体Fc融合蛋白的药物配制品，其有利于实现生产过程中这些蛋白的更高滴度、储存过程中更高稳定性以及在用作治疗剂时改善的功效。还提供了用于治疗癌症如局部晚期或转移性实体瘤的此类异二聚体Fc融合蛋白和药物配制品的剂量方案。

Description

异二聚体FC融合蛋白的配制品、剂量方案和制造工艺
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月22日提交的美国临时申请号63/013,834和2020年6月1日提交的美国临时申请号63/033,161的优先权和权益，其各自通过引用以其整体特此并入本文。
序列表
与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：3338_259PC03_Seqlisting_ST25.txt；大小：946,336字节；以及创建日期：2021年4月21日)中电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本披露涉及异二聚体Fc融合蛋白的药物配制品和剂量方案，以及使用此类蛋白治疗癌症的方法。
背景技术
生理活性蛋白大多具有体内半衰期短的缺点。为了解决这个缺点，已经尝试将它们与PEG(聚乙二醇)等缀合，或者将它们融合到抗体Fc(可结晶片段)区。由两个或更多个不同亚基构成的蛋白(其中该两个或更多个不同亚基形成蛋白复合物以表现出生理活性)可以与野生型Fc结构域融合制备Fc融合蛋白形式，从而由于Fc的同二聚体性质形成同二聚体。由两个或更多个不同亚基构成的蛋白(其中该两个或更多个不同亚基形成蛋白复合物以表现出生理活性)还可以融合到不仅衍生自IgG1，而且衍生自其他同种型抗体(如IgG2、IgG3和IgG4)的异二聚体Fc区，形成异二聚体Fc融合蛋白。因此，由两个或更多个不同亚基构成并且其中两个或更多个亚基通过形成蛋白复合物以表现出生理活性的蛋白的一个或多个亚基可以融合到异二聚体Fc变体区的末端以形成改进的Fc融合蛋白形式。
Fc异二聚化是一种技术，其通过基因工程改造在Fc的两个不同CH3结构域中诱导突变，使得两个Fc片段形成具有最小序列变异的异二聚体，同时它们具有与天然存在的抗体非常相似的三级结构(参见，例如，美国专利号7,695,936)。
本披露中描述的发明提供了用于改进Fc融合蛋白形式的设计，其中通过在Fc的CH2和CH3结构域中引入不同长度的接头或突变，异二聚体蛋白的两个亚基连接到具有不同异二聚化结构域的两个Fc结构域。此外，本披露中描述的发明提供了此类蛋白的药物配制品、制备此类蛋白和配制品的方法、以及使用此类蛋白治疗癌症的方法。
发明内容
本发明总体上涉及包含某些含有一个或多个IL12亚基的异二聚体Fc融合蛋白的药物配制品、制备此类蛋白和药物配制品的工艺。还提供了使用此类异二聚体Fc融合蛋白和药物配制品治疗癌症如局部晚期或转移性实体瘤的剂量方案。
因此，在一个方面，本文提供了包含异二聚体Fc融合蛋白、柠檬酸盐、糖、糖醇和非离子表面活性剂且pH 6.0至7.0的药物配制品，该异二聚体Fc融合蛋白包含含有第一抗体Fc结构域多肽和多亚基细胞因子的第一亚基的第一多肽以及含有第二抗体Fc结构域多肽和该多亚基细胞因子的第二不同亚基的第二多肽，其中该第一和第二抗体Fc结构域多肽各自包含促进异二聚化的不同突变，并且其中该多亚基细胞因子的该第一亚基和第二不同亚基相互结合。在一些实施例中，第一和/或第二抗体Fc结构域多肽包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变。
在一些实施例中，药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约10mM至约30mM。在某些实施例中，药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约20mM。在一些实施例中，药物配制品中糖的浓度为约3％至约12％(w/v)。在某些实施例中，药物配制品中糖的浓度为约6％(w/v)。在某些实施例中，糖是二糖。在某些实施例中，二糖是蔗糖。在一些实施例中，药物配制品中糖醇的浓度在约0.5％至约6％(w/v)之间。在某些实施例中，药物配制品中糖醇的浓度为约1％(w/v)。在某些实施例中，糖醇衍生自单糖。在某些实施例中，糖醇是甘露醇。
在一些实施例中，药物配制品中非离子表面活性剂的浓度在约0.005％至约0.02％(w/v)之间。在某些实施例中，药物配制品中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)。在某些实施例中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在某些实施例中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。
在一些实施例中，pH在约6.1和约6.9之间。在某些实施例中，pH在约6.2和约6.8之间。在某些实施例中，pH在约6.3和约6.7之间。在一些实施例中，pH在约6.4和约6.6之间。在某些实施例中，pH为约6.5。
在一些实施例中，药物配制品还包含水。在某些实施例中，水是注射用水，USP。
在一些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约1g/L至约10g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约2g/L至约8g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约4g/L至约6g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约5g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，药物配制品包含用于施用的浓度为约0.5g/L至约1.5g/L的蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含用于施用的浓度为约0.75g/L至约1.25g/L的蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含用于施用的浓度为约1g/L的蛋白。
在一些实施例中，配制品被设计为在2℃和8℃之间的温度下储存。在一些实施例中，药物配制品是澄清、无色溶液并且不含可见颗粒。
在一些实施例中，配制品具有由以下定义的热稳定性谱：大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、或大于约66℃的Tm1；和/或大于约70℃、大于约71℃、大于约72℃、大于约73℃、大于约74℃、大于约75℃、大于约76℃、或大于约77℃的Tm2，如通过差示扫描荧光法测量。在某些实施例中，配制品具有由约67.0℃的Tm1和约77.3℃的Tm2定义的热稳定性谱。在某些实施例中，由Tm1和/或Tm2定义的药物配制品的热稳定性谱当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
在一些实施例中，配制品具有由大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、大于约66℃、或大于约67℃的Tagg定义的热稳定性谱，如通过差示扫描荧光法测量。在某些实施例中，由Tagg定义的药物配制品的热稳定性谱当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
在一些实施例中，在将药物配制品在5℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。在一些实施例中，在将药物配制品在50℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有小于约15nm、小于约14nm、小于约13nm或小于约12nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约11.6nm的Z-平均流体动力学直径。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在药物配制品在50℃孵育2周后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm、小于约16nm或小于约15nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约14.4nm的Z-平均流体动力学直径。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在药物配制品经受五个冻融循环后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm或小于约16nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约15.3nm的Z-平均流体动力学直径。
在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28或小于约0.27，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.26。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在药物配制品在50℃孵育2周后小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28、小于约0.27或小于约0.26，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.25。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在药物配制品经受五个冻融循环后小于约0.40、小于约0.35、或小于约0.34，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.33。
在一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％。在某些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱为约99.0％。
在一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱在药物配制品在50℃孵育2周后大于约75％、大于约80％、大于约81％、大于约82％、大于约83％、大于约84％或大于约85％。在某些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱为约85.2％。
在一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱在药物配制品经受五个冻融循环后大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％或大于约98％。在某些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱为约98.9％。
在另一个方面，本披露提供了一种方法，该方法包括将药物配制品作为单剂量疗法施用给有需要的受试者。
在另一个方面，本披露提供了一种方法，该方法包括将药物配制品以多剂量疗法以这些剂量之间至少三周或这些剂量之间至少四周的间隔施用给有需要的受试者。在一些实施例中，药物配制品每三周一次施用给受试者。在一些实施例中，药物配制品每四周一次施用给受试者。在某些实施例中，药物配制品每六周一次施用给受试者。
在一些实施例中，该方法进一步包括如果受试者发展为疾病进展、不可接受的毒性或满足退出标准，则停止多剂量疗法。在一些实施例中，如果受试者在多剂量疗法期间经历完全缓解(CR)，则在确认完全缓解后进一步施用多剂量疗法至少12个月。在某些实施例中，多剂量疗法的总持续时间等于或小于24个月。在某些实施例中，总治疗持续时间大于24个月。
在一些实施例中，通过皮下注射施用药物配制品。
在一些实施例中，将药物配制品施用给受试者，其量足以提供基于受试者的体重在约0.05μg/kg至约1.75μg/kg之间的剂量的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，将药物配制品施用给受试者，其量足以提供基于受试者的体重约0.05μg/kg、约0.10μg/kg、约0.20μg/kg、约0.40μg/kg、约0.60μg/kg、约0.80μg/kg、约1.00μg/kg、约1.20μg/kg、约1.40μg/kg、或约1.75μg/kg的剂量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，将药物配制品施用给受试者，其量足以提供基于受试者的体重大于0.00μg/kg且小于约0.05μg/kg的剂量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，将药物配制品施用给受试者，其量足以提供基于受试者的体重大于约1.75μg/kg的剂量的异二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，受试者患有癌症。在某些实施例中，受试者患有局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施例中，使用实体瘤缓解评估标准(RECIST)1.1版确认受试者中癌症的存在。在某些实施例中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、结直肠癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、肾细胞癌(RCC)、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、和三阴性乳腺癌。在某些实施例中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、结直肠癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌(RCC)、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、和三阴性乳腺癌。在某些实施例中，受试者是抗PD-1难治性的。
在一些实施例中，受试者患有黑色素瘤。在某些实施例中，受试者先前已经用抗PD-1抗体治疗至少6周。在某些实施例中，受试者在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1抗体的同时被确认具有疾病进展。在某些实施例中，通过放射学或临床观察来确认疾病的进展。在某些实施例中，如果受试者具有包含BRAF激活性突变的肿瘤，则受试者先前已用BRAF抑制剂治疗。
在一些实施例中，受试者患有RCC。在某些实施例中，RCC具有透明细胞组织学。在某些实施例中，患者先前已经用抗PD-1/PD-L1抗体和/或抗血管内皮生长因子疗法治疗。在某些实施例中，受试者先前已接受三个或更少的疗法线。
在一些实施例中，受试者患有尿路上皮癌。在某些实施例中，受试者患有局部晚期或转移性尿路上皮移行细胞癌。在某些实施例中，受试者先前已经用包含含铂方案的单一治疗进行了治疗，并且在最后一次施用含铂方案后6个月内显示放射学进展复发。在某些实施例中，受试者先前已经接受了两个或更少的疗法线。在某些实施例中，受试者先前没有接受过作为单一疗法或与基于铂的化学疗法的组合的检查点抑制剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)疗法。
在一些实施例中，将药物配制品作为单一疗法施用给受试者。
在一些实施例中，将药物配制品作为组合疗法施用给受试者。
在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用抗PD-1抗体。在某些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)。在某些实施例中，静脉内施用派姆单抗。在某些实施例中，以200mg的剂量施用派姆单抗。在某些实施例中，派姆单抗的施用在药物配制品的每次施用之前。在某些实施例中，在完成派姆单抗施用后1小时内施用药物配制品。
在某些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗。在某些实施例中，静脉内施用纳武单抗。在某些实施例中，以约480mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，纳武单抗的施用在药物配制品的每次施用之前。在某些实施例中，在完成纳武单抗施用后1小时内施用药物配制品。
在一些实施例中，组合疗法用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、NSCLC、SCLC、RCC、经典型霍奇金淋巴瘤、HNSCC、尿路上皮癌、结直肠癌、肝细胞癌、和食管癌。在一些实施例中，组合疗法用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、NSCLC、SCLC、RCC、经典型霍奇金淋巴瘤、HNSCC、尿路上皮癌、结直肠癌、肝细胞癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、和前列腺癌。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤是不可切除的。在一些实施例中，癌症是结直肠癌。在一些实施例中，结直肠癌是微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷转移性(dMMR)结直肠癌。
在一些实施例中，该方法进一步包括进行手术干预以在受试者中裂解癌细胞、去除肿瘤或减积肿瘤。在某些实施例中，手术干预包括冷冻疗法。在某些实施例中，手术干预包括超热疗法。在某些实施例中，手术干预包括向受试者施用放射疗法。在某些实施例中，放射疗法是立体定向体部放射疗法(SBRT)。
在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用NK细胞靶向疗法。在某些实施例中，向受试者施用多特异性结合蛋白。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用嵌合抗原受体疗法。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用细胞因子疗法。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用先天免疫系统激动剂疗法。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用化学疗法。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用靶向抗原疗法。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用溶瘤病毒疗法。
在另一个方面，本披露提供了一种在接受药物配制品的受试者中检测毒性的方法，该方法包括测量该受试者血液中C反应蛋白(CRP)的浓度，其中该药物配制品包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂，并且其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在一些实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则受试者被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中；以及如果受试者血液中的CRP浓度大约等于或低于阈值C反应蛋白浓度，则受试者不被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中。在某些实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则暂停药物配制品的施用，以较低剂量施用异二聚体Fc融合蛋白，或采取补救措施以减少或减轻该配制品在该受试者中的毒性作用。
在本文所述的药物配制品或方法的一些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是人IgG1 Fc结构域多肽。在某些实施例中，多亚基细胞因子是人IL12。在某些实施例中，人IgG1 Fc结构域多肽包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽包含选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A或L235E、G237A、P329A、A330S、和P331S的突变。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽各自包含突变L234A、L235A和P329A。在某些实施例中，多亚基细胞因子的第一亚基是IL12的p40亚基并且多亚基细胞因子的第二亚基是IL12的p35亚基。在药物配制品或方法的某些实施例中，多亚基细胞因子的第一亚基包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列并且多亚基细胞因子的第二亚基包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在药物配制品或方法的某些实施例中，多亚基细胞因子的第二亚基通过包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的接头与第二抗体Fc结构域融合。在药物配制品或方法的某些实施例中，第一抗体Fc结构域包含突变L234A、L235A、P329A、Y349C、K360E、和K409W，并且第二抗体Fc结构域包含突变L234A、L235A、P329A、Q347R、S354C、D399V、和F405T。在药物配制品或方法的某些实施例中，第一抗体Fc结构域包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列，第二抗体Fc结构域包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。在药物配制品或方法的某些实施例中，第一抗体Fc结构域肽包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列并且第二抗体Fc结构域肽包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列。
在另一个方面，本文提供了一种试剂盒，其包括一个或多个包含药物配制品的容器，并且其中该药物配制品包含异二聚体Fc融合蛋白，该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变；和药学上可接受的载剂，并且该一个或多个容器共同包含约0.1mg-约2mg的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，一个或多个容器共同包含约0.5mg至约2mg的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，一个或多个容器共同包含约1mg的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，试剂盒包含一个容器，该容器包含约1mg的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物配制品是冻干配制品或液体配制品。在某些实施例中，药物配制品是以1mL的体积供应的液体配制品。
在另一个方面，本披露提供了异二聚体Fc融合蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该药物被制造成包含含在一个或多个容器中的约0.5g/L至约1.5g/L的异二聚体Fc融合蛋白的液体药物配制品，并且其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在一些实施例中，液体药物配制品包含约1.0g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
在另一个方面，本文提供了异二聚体Fc融合蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该药物被制造成包含含在一个或多个容器中的约0.1mg至约2mg的异二聚体Fc融合蛋白的液体药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在一些实施例中，液体药物配制品包含1mg的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物包含在一个容器中。在一些实施例中，其中每个容器含有1mg的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，在每3周第1天将药物施用给受试者。在一些实施例中，在每4周第1天将药物施用给受试者。在一些实施例中，皮下施用药物。在一些实施例中，药物以约0.1mL至约1mL的体积施用。在某些实施例中，药物以约1mL的体积施用。在一些实施例中，将药物施用至最多两个注射部位。在某些实施例中，在第一注射后10分钟内完成第二注射。在一些实施例中，以约0.05mg/kg至约1.75mg/kg的剂量施用药物。在某些实施例中，以约1mg/kg的剂量施用药物。在一些实施例中，在施用之前将药物稀释在0.9％盐水(注射用氯化钠)和0.01％聚山梨醇酯80的溶液中。
在另一个方面，本文提供了一种制造异二聚体Fc融合蛋白以制备其药物配制品的方法，该方法包括向含有异二聚体Fc融合蛋白(得自表达该异二聚体Fc融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物)的溶液中加入乙酸保持30分钟至90分钟，其中乙酸盐将该溶液的pH调节并维持在pH 3.55至3.75，并且其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在某些实施例中，将乙酸加入到包含异二聚体Fc融合蛋白的溶液中保持约60分钟。在某些实施例中，乙酸将溶液的pH调节并维持在约3.65。在某些实施例中，表达异二聚体Fc融合蛋白的CHO细胞培养物维持在悬浮液中。在某些实施例中，表达异二聚体Fc融合蛋白的CHO细胞培养物在生物反应器中培养7-21天。在某些实施例中，表达异二聚体Fc融合蛋白的CHO细胞培养物在生物反应器中培养14天。在一些实施例中，通过深度过滤收获表达异二聚体Fc融合蛋白的CHO细胞培养物以产生CHO收获培养基。在某些实施例中，深度过滤是由DOHC和XOHC过滤器组成的两级一次性深度过滤。在某些实施例中，使用蛋白A捕获色谱、混合模式色谱和阳离子交换色谱从CHO收获培养基中纯化异二聚体Fc融合蛋白以产生包含异二聚体Fc融合蛋白的溶液。
在一些实施例中，蛋白A捕获色谱包括用20mM Tris、150mM NaCl在pH 7.5平衡蛋白A树脂，将CHO收获培养基加载到蛋白A树脂上；用20mM Tris、150mM NaCl在pH 7.5洗涤加载的蛋白A树脂；用pH 5.4的50mM乙酸盐洗涤加载的蛋白A树脂；并用50mM乙酸盐、100mM精氨酸在pH 3.7从蛋白A树脂中洗脱异二聚体Fc融合蛋白，并通过280nm UV(从1.25AU/cm上升开始并在1.25AU/cm下降结束)进行收集。在某些实施例中，将乙酸以0.5M的浓度添加到包含从蛋白A树脂洗脱的异二聚体Fc融合蛋白的溶液中，其中乙酸将溶液的pH酸化至pH3.65保持60分钟，然后通过添加2M Tris将溶液中和至pH 5.2。在某些实施例中，在酸化和中和溶液之后，使包含异二聚体Fc融合蛋白的溶液通过0.2μm过滤器。在某些实施例中，使包含从蛋白A树脂洗脱的异二聚体Fc融合蛋白的过滤溶液通过X0SP深度过滤。
在一些实施例中，混合模式色谱包括用pH 5.2的50mM乙酸盐平衡混合模式色谱柱；将通过X0SP过滤的溶液加载到混合模式色谱柱上；用pH 5.2的50mM乙酸盐洗涤加载的混合模式色谱柱；并用50mM乙酸盐、250mM NaCl在pH 5.2从混合模式色谱柱中洗脱异二聚体Fc融合蛋白，并通过280nm UV(从0.625AU/cm上升开始并在1.50AU/cm下降结束)进行收集。在某些实施例中，使包含从混合模式色谱柱洗脱的异二聚体Fc融合蛋白的溶液通过0.2μm过滤器。
在一些实施例中，阳离子交换色谱包括用pH 7.4的50mM Tris平衡阳离子交换色谱树脂；将从混合模式色谱柱洗脱的过滤溶液加载到阳离子交换色谱树脂上；用pH 7.4的50mM Tris洗涤加载的阳离子交换色谱树脂；用50mM Tris(pH 7.4)和50mM Tris、0.5MNaCl(在pH 7.4)的梯度从阳离子交换色谱树脂中洗脱异二聚体Fc融合蛋白，并通过280nmUV(从2.5AU/cm上升开始并在4.5AU/cm下降结束)进行收集。在某些实施例中，使包含从阳离子交换色谱树脂洗脱的异二聚体Fc融合蛋白的溶液通过0.2μm过滤器。在某些实施例中，使包含从阳离子交换色谱树脂洗脱的异二聚体Fc融合蛋白的过滤溶液通过预过滤器、20nm标称过滤器和0.2μm膜进行纳米过滤。
在一些实施例中，对包含异二聚体Fc融合蛋白的纳米过滤溶液进行超滤和渗滤，其中超滤和渗滤包括用50mM Tris、265mM NaCl在pH 7.4平衡超滤系统；将包含异二聚体Fc融合蛋白的纳米过滤溶液浓缩至约5.0g/L的浓度；使用20mM柠檬酸盐(pH 6.5)的7个渗滤体积交换缓冲液；将包含异二聚体Fc融合蛋白的渗滤溶液浓缩至约11.0g/L的浓度；用pH6.5的20mM柠檬酸盐将包含异二聚体Fc融合蛋白的浓缩溶液稀释至约5g/L至约10g/L的浓度；并且添加20mM柠檬酸盐、18％(w/v)蔗糖、3％(w/v)甘露醇、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80(pH 6.5)以实现超滤/渗滤截留物溶液的最终浓度，该溶液包含20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，使包含异二聚体Fc融合蛋白的超滤/渗滤溶液通过0.2μm膜以产生批量原料药。
在一些实施例中，将批量原料药在包含20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80(pH 6.5)的0.2μm过滤缓冲液中稀释至80％药物产品溶液。在某些实施例中，将批量原料药或80％药物产品在包含20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80(pH 6.5)的0.2μm过滤缓冲液中稀释至用以施用1mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白的浓度。
一种在已接受检查点抑制剂抗体治疗至少6周的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在某些实施例中，检查点抑制剂抗体是抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体。在某些实施例中，癌症是黑色素瘤。在某些实施例中，黑色素瘤是不可切除的或转移性的。在某些实施例中，受试者在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1抗体的同时被确认具有疾病进展。在某些实施例中，受试者在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1抗体的同时被确认具有疾病进展。在某些实施例中，通过放射学或临床观察来确认疾病进展。
在另一个方面，本文提供了一种在已接受检查点抑制剂抗体或抗血管内皮生长因子疗法作为单一疗法或组合疗法治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在某些实施例中，检查点抑制剂抗体是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在某些实施例中，癌症是晚期肾细胞癌(RCC)。在某些实施例中，RCC是不可切除的或转移性的。在某些实施例中，RCC具有透明细胞组分。在某些实施例中，受试者接受不超过3个先前的疗法线。在某些实施例中，受试者尚未接受过检查点抑制剂的治疗。在某些实施例中，检查点抑制剂包含作为单一疗法或与基于铂的化学疗法组合的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在另一个方面，本文提供了一种在已接受仅一种含铂方案治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在某些实施例中，含铂方案是铂与选自吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱和多柔比星的药剂组合。在某些实施例中，癌症是局部晚期或转移性移行细胞尿路上皮癌。在某些实施例中，尿路上皮癌包括由肾盂、输尿管、尿路上皮和尿道组成的组中的一种或多种。在某些实施例中，尿路上皮癌是不能手术的。在某些实施例中，尿路上皮癌的特征是在最后一次施用作为辅佐的含铂方案后6个月内放射学进展或复发。
在一些实施例中，尿路上皮癌被认为是一线含铂方案的失败。在某些实施例中，受试者在施用药物配制品之前已接受不超过2个疗法线(包括含铂方案)用于治疗尿路上皮癌。在某些实施例中，受试者尚未接受过用检查点抑制剂(CPI)作为一线疗法的治疗。在某些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在某些实施例中，检查点抑制剂是单一疗法或与基于铂的化学疗法组合。
在一些实施例中，药物配制品与派姆单抗组合施用。在某些实施例中，每3周施用一次派姆单抗。在某些实施例中，在药物配制品施用之前施用派姆单抗。在某些实施例中，在完成派姆单抗施用后一小时内施用药物配制品。在一些实施例中，以200mg的剂量施用派姆单抗。在一些实施例中，静脉内施用派姆单抗。在一些实施例中，组合用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定癌症、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、和子宫内膜癌。在一些实施例中，组合用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定癌症、胃癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、和子宫内膜癌。
在一些实施例中，药物配制品与纳武单抗组合施用。在某些实施例中，每4周施用一次纳武单抗。在一些实施例中，在药物配制品施用之前施用纳武单抗。在一些实施例中，在完成纳武单抗施用后一小时内施用药物配制品。在一些实施例中，以约480mg的剂量施用纳武单抗。在一些实施例中，静脉内施用纳武单抗。在一些实施例中，组合用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、和食管癌。在一些实施例中，组合用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、和前列腺癌。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在某些实施例中，黑色素瘤是不可切除的或转移性的。在一些实施例中，癌症是结直肠癌。在某些实施例中，结直肠癌是微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。
在一些实施例中，在每3周第1天将药物配制品施用给受试者。在一些实施例中，在每4周第1天将药物配制品施用给受试者。在一些实施例中，皮下施用药物配制品。在一些实施例中，药物配制品以约0.1mL至约1mL的体积施用。在一些实施例中，药物配制品以约1mL的体积施用。在一些实施例中，将药物配制品施用至最多两个注射部位。在某些实施例中，在第一注射后10分钟内完成第二注射。
在一些实施方案中，以约0.05mg/kg至约1.75mg/kg的剂量施用药物配制品。在某些实施例中，以约1mg/kg的剂量施用药物配制品。在一些实施例中，在施用之前将药物配制品稀释在0.9％盐水(注射用氯化钠)和0.01％聚山梨醇酯80的溶液中。
在一些实施例中，使用实体瘤缓解评估标准(RECIST)1.1版确定癌症的存在。在一些实施例中，除非满足中止标准，否则在确认后用药物配制品治疗具有确认的完全缓解的受试者至少12个月。
在另一个方面，本文提供了治疗其血液C反应蛋白(CRP)浓度被监测的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。在一些实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则受试者被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中；以及如果受试者血液中的CRP浓度大约等于或低于阈值C反应蛋白浓度，则受试者不被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中。在一些实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则(1)暂停药物配制品的施用；(2)以较低剂量施用异二聚体Fc融合蛋白；或(3)采取补救措施以减少或减轻该配制品在该受试者中的毒性作用。
在另一个方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者皮下施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变；并且该药物配制品包含柠檬酸盐；糖；糖醇；和非离子表面活性剂，并且该配制品的pH值在5.5和7.0之间。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白的第一Fc区和第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施例中，人IgG1 Fc区包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变。在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，第一Fc区和第二Fc区包含一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A或L235E、G237A、P329A、A330S和P331S的突变。在一些实施例中，第一Fc区和第二Fc区各自包含突变L234A、L235A和P329A。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的某些实施例中，IL12的p40亚基包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列并且IL-12的p35亚基包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在本文提供的试剂盒、用途或方法的某些实施例中，IL-12的p35亚基通过包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的接头融合至第二Fc区。在一些实施例中，第一Fc区包含突变L234A、L235A、P329A、Y349C、K360E,和K409W，并且第二Fc区包含突变L234A、L235A、P329A、Q347R、S354C、D399V、和F405T。在某些实施例中，第一Fc区包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列，并且第二Fc区包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。在一些实施例中，与IL12的p40亚基连接的第一Fc区包含SEQID NO:290的氨基酸序列，并且与IL-12的p35亚基连接的第二Fc区包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品包含：(a)柠檬酸盐；(b)糖；(c)糖醇；和(d)非离子表面活性剂，进一步其中配制品的pH在约6.0和约7.0之间。在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约10mM至约30mM。在一些实施例中，药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约20mM。在一些实施例中，药物配制品中糖的浓度为约3％至约12％(w/v)。在一些实施例中，药物配制品中糖的浓度为约6％(w/v)。在一些实施例中，糖是二糖。在一些实施例中，二糖是蔗糖。在一些实施例中，药物配制品中糖醇的浓度在约0.5％至约6％(w/v)之间。在一些实施例中，药物配制品中糖醇的浓度为约1％(w/v)。在一些实施例中，糖醇衍生自单糖。在一些实施例中，糖醇是甘露醇。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中非离子表面活性剂的浓度在约0.005％至约0.02％(w/v)之间。在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)。在一些实施例中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。在一些实施例中，pH在约6.1和约6.9之间。在一些实施例中，pH在约6.2和约6.8之间。在一些实施例中，pH在约6.3和约6.7之间。在一些实施例中，pH在约6.4和约6.6之间。在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，pH为约6.5。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品进一步包含水。在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，水是注射用水，USP。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约1g/L至约10g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约2g/L至约8g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约4g/L至约6g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约5g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物配制品包含用于施用的浓度为约0.5g/L至约1.5g/L的蛋白。在一些实施例中，药物配制品包含用于施用的浓度为约0.75g/L至约1.25g/L的蛋白。在一些实施例中，药物配制品包含用于施用的浓度为约1g/L的蛋白。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品被设计为在2℃和8℃之间的温度下储存。在一些实施例中，药物配制品是澄清、无色溶液并且不含可见颗粒。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品具有由以下定义的热稳定性谱：大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、或大于约66℃的Tm1；和/或大于约70℃、大于约71℃、大于约72℃、大于约73℃、大于约74℃、大于约75℃、大于约76℃、或大于约77℃的Tm2，如通过差示扫描荧光法测量。在一些实施例中，配制品具有由约67.0℃的Tm1和约77.3℃的Tm2定义的热稳定性谱。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，由Tm1和/或Tm2定义的药物配制品的热稳定性谱当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。在一些实施例中，配制品具有由大于60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、大于约66℃、或大于约67℃的Tagg定义的热稳定性谱，如通过差示扫描荧光法测量。在一些实施例中，由Tagg定义的药物配制品的热稳定性谱当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，在将药物配制品在5℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。在一些实施例中，在将药物配制品在50℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有小于约15nm、小于约14nm、小于约13nm或小于约12nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约11.6nm的Z-平均流体动力学直径。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在药物配制品在50℃孵育2周后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm、小于约16nm或小于约15nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约14.4nm的Z-平均流体动力学直径。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在药物配制品经受五次冻融循环后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm或小于约16nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约15.3nm的Z-平均流体动力学直径。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28或小于约0.27，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.26。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在药物配制品在50℃孵育2周后小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28、小于约0.27或小于约0.26，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.25。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在药物配制品经受五个冻融循环后小于约0.40、小于约0.35、或小于约0.34，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.33。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％。在一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱为约99.0％。在一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱在药物配制品在50℃孵育2周后大于约75％、大于约80％、大于约81％、大于约82％、大于约83％、大于约84％或大于约85％。在一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱为约85.2％。
在本文提供的试剂盒、用途或方法的一些实施例中，如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱在药物配制品经受五个冻融循环后大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％或大于约98％。在一些实施例中，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，药物配制品的纯度谱为约98.9％。
总之，本发明提供了多亚基蛋白的异二聚体Fc融合蛋白构建体。这些融合蛋白构建体可以表现出与天然/自然多亚基蛋白相比更高的血清半衰期，在生产过程中提高的产量，在储存过程中提高的稳定性，和/或在用作治疗剂时提高的功效。
附图说明
图1A-1D说明了示例性异二聚体Fc融合蛋白的各种特征，该异二聚体Fc融合蛋白包含通过接头与第一抗体Fc结构域多肽连接的多亚基蛋白的第一亚基，和通过另一个接头与第二抗体Fc结构域多肽连接的多亚基蛋白的第二不同亚基，其中这些亚基通过两个二硫键连接。图1A显示了显示示例性异二聚体Fc融合蛋白的不同组分的一般示意图。图1B显示了示例性异二聚体Fc融合蛋白，其包括IL12亚基p40和p35、接头和具有突变的Fc结构域。图1C显示了说明可以存在于图1A或1B的异二聚体Fc融合蛋白中的示例性突变的示意图。图1D显示了说明可以在图1A、图1B或图1C的异二聚体Fc融合蛋白中形成的示例性二硫键的示意图。
图2A-2C的图显示接种CT26肿瘤细胞并用重组小鼠IL-12(rmIL-12)(图2A)、DF-mIL-12-Fc wt(图2B)、DF-mIL-12-Fc si(图2C)或mIgG2a同种型对照每周一次治疗的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图3的图显示接种CT26肿瘤细胞并用rmIL-12、DF-mIL-12-Fc wt、DF-mIL-12-Fcsi或mIgG2a同种型对照每周一次治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。
图4A-4D的图显示接种CT26肿瘤细胞并用以下每周一次治疗的个体小鼠的肿瘤生长曲线：摩尔当量为1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt(图4A)、摩尔当量为1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc si(图4B)、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt(图4C)、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc si(图4D)、或mIgG2a同种型对照。
图5的图显示接种CT26肿瘤细胞并用以下每周一次治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线：摩尔当量为1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt、摩尔当量为1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc si、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc si，或mIgG2a同种型对照。
图6A-6C的图显示接种B16F10黑色素瘤细胞并用rmIL-12(图6A)、DF-mIL-12-Fcwt(图6B)、DF-mIL-12-Fc si(图6C)或mIgG2a同种型对照每周一次治疗的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图7的图显示接种B16F10黑色素瘤细胞并用rmIL-12、DF-mIL-12-Fc wt、DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型对照每周一次治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。
图8A-8D的图显示接种B16F10黑色素瘤细胞并用以下每周一次治疗的个体小鼠的肿瘤生长曲线：摩尔当量为0.5μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt(图8A)、摩尔当量为0.5μgrmIL-12的DF-mIL-12-Fc si(图8B)、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt(图8C)、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc si(图8D)、或mIgG2a同种型对照。
图9的图显示接种B16F10黑色素瘤细胞并用以下每周一次治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线：摩尔当量为0.5μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt、摩尔当量为0.5μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc si、摩尔当量为0.1μg rmIL-12的DF-mIL-12-Fc wt、摩尔当量为0.1μgrmIL-12的DF-mIL-12-Fc si，或mIgG2a同种型对照。
图10A的图显示使用HEK-Blue IL-12报告基因测定时IL-12对DF-hIL-12-Fc si(DF IL-12-Fc)或重组人IL-12(rhIL-12)治疗的反应。
图10B的图显示外周血单核细胞(PBMC)响应于用DF-hIL-12-Fc si(DF IL-12-Fc)和rhIL-12治疗产生IFNγ。
图11是显示在等摩尔量的DF-hIL-12-Fc si或野生型rhIL-12以10μg/kg单次静脉内给药后食蟹猴K2 EDTA血浆中DF-hIL-12-Fc si、rhIL-12和IFNγ的相对血浆浓度。
图12A-12B的图显示初治Balb/c小鼠中rmIL-12(图12A)和DF-mIL-12-Fc si(图12B)的PK/PD谱。图12A显示了初治Balb/c小鼠中rmIL-12的PK/PD谱并且图12B显示了初治Balb/c小鼠IL-12中DF-mIL-12-Fc si的PK/PD谱。通过ELISA分析血清中的IL-12和IFNγ水平。图12C的图显示在初治Balb/c小鼠中静脉内施用的DF-mIL-12-Fc si的PK/PD谱。图12D的图显示在初治Balb/c小鼠中腹膜内施用的DF-mIL-12-Fc si的PK/PD谱。图12E的图显示在初治Balb/c小鼠中皮下施用的DF-mIL-12-Fc si的PK/PD谱。平均血清水平代表平均值±SEM。
图13A-13C的图显示用DF-mIL-12-Fc si、抗PD-1或其组合治疗的B16F10荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。用0.5μg同种型对照或0.5μg DF-mIL-12-Fc si(图13A)、同种型对照或抗PD-1(图13B)，和同种型对照或DF-mIL-12-Fc si/抗-PD-1(图13C)腹膜内治疗小鼠。如上所示，动物每周注射一次DF-mIL-12-Fc si，每周注射两次抗PD-1。评估肿瘤生长60天。图显示了个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图14A-14B的图显示用DF-mIL-12-Fc si、抗PD-1或其组合治疗的B16F10荷瘤小鼠的生存和体重。用同种型、DF-mIL-12-Fc si、抗PD-1或DF-mIL-12-Fc si和抗PD-1的组合治疗小鼠。动物每周注射一次0.5μg DF-mIL-12-Fc si，每周注射两次200μg抗PD-1或同种型。图14A显示Kaplan-Meier生存曲线。图14B显示作为平均值±标准偏差的小鼠体重。
图15A-15C的图显示用DF-mIL-12-Fc si、mcFAE-C26.99 TriNKET或其组合治疗的B16F10荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。用150μg同种型对照或0.5μg DF-mIL-12-Fc si(图15A)、同种型对照或150μg TriNKET(图15B)，和同种型对照或DF-mIL-12-Fc si/TriNKET(图15C)腹膜内治疗小鼠。如上所示，动物每周注射一次DF-mIL-12-Fc si，每周注射三次TriNKET。评估肿瘤生长72天。图显示了个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图16A-16B的图显示用DF-mIL-12-Fc si、mcFAE-C26.99 TriNKET或其组合治疗的B16F10荷瘤小鼠的生存和体重。用同种型、DF-mIL-12-Fc si、TriNKET或DF-mIL-12-Fc si和TriNKET的组合治疗小鼠。动物每周注射一次0.5μg DF-mIL-12-Fc si，每周注射三次150μg TriNKET或同种型。图16A显示Kaplan-Meier生存曲线。图16B显示作为平均值+标准偏差的小鼠体重。
图17的图显示来自图15的B16F10肿瘤模型实验(用DF-mIL-12-Fc si/TriNKET组合疗法治疗(n＝3)，通过植入2x105个B16F10黑色素瘤细胞再次激发)的完全缓解者(CR)小鼠的肿瘤生长曲线。
图18A的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用单剂量DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图18B的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用每周剂量的DF-mIL-12-Fc si、mIgG2a同种型或rmIL-12的小鼠的体重±标准偏差。
图18C的图显示当先前在CT26肿瘤模型中施用单剂量DF-mIL-12-Fc si时再次激发的个体小鼠的肿瘤生长曲线，这些小鼠是初治或完全缓解者(CR)。
图19A-19B的图显示接种CT26肿瘤细胞并腹膜内(IP)(图19A)或皮下(SC)(图19B)施用每周剂量的DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图20的图显示接种B16F10黑色素瘤细胞并施用单剂量DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图21A-21B的图显示接种B16F10黑色素瘤细胞并腹膜内(IP)(图21A)或皮下(SC)(图21B)施用每周剂量的DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图22A-22B的图显示接种CT26肿瘤细胞并以1μg rmIL-12的摩尔当量腹膜内施用单剂量(图22A)或每周一次剂量(图22B)的DF-mIL-12-Fc si或mIgG2A同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图23A-23B的图显示接种CT26肿瘤细胞并皮下施用每周一次剂量的DF-mIL-12-Fcsi的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图23A的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用2μgmIgG2a同种型对照或1μg DF-mIL-12-Fc si治疗一次(每周)的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图23B的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用2μg mIgG2a同种型对照或2μg DF-mIL-12-Fc si治疗一次(每周)的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图24A-24C的图显示在携带B16F10肿瘤的C57BL/6小鼠中在单剂量DF-mIL-12-Fcsi后72小时在血液(左)和肿瘤(右)样品中的IFNγ(图24A)、CXCL9(图24B)和CXCL10(图24C)水平。
图25A-25C的线图显示用1μg/kg(图25A)、2μg/kg(图25B)，或4μg/kg(图25C)的DF-hIL-12-Fc si的单次皮下剂量治疗的食蟹猴中的DF-hIL-12-Fc si的药代动力学。2240、2241、2740、2741(图25A)；3240、3241、3740、3741(图25B)；4240、4241、4740、4741(图25C)表示个体食蟹猴受试者。
图26A-26F的线图显示用单次皮下剂量的DF-hIL-12-Fc si治疗的食蟹猴中IFNγ和IP10/CXCL10的浓度。图26A、26C和26E显示分别用1μg/kg、2μg/kg和4μg/kg DF-hIL-12-Fc si治疗的食蟹猴中的IFNγ浓度/表达水平。图26B、26D和26F显示分别用1μg/kg、2μg/kg和4μg/kg DF-hIL-12-Fc si治疗的食蟹猴中的IP10/CXCL10浓度/表达水平。1240、1740、2240、2241、2740、2741(图26A-26B)；1240、1740、3240、3241、3740、3741(图26C、26D、26F)；1240、1740、4240、4241、4740、4741(图26E)表示个体食蟹猴受试者。
图27的图显示接种乳腺癌细胞并施用每周剂量的单一疗法(同种型对照、DF-mIL-12-Fc si、
Figure BDA0003996373120000241
(化学疗法)或用10Gy放射)或组合疗法(DF-mIL-12-Fc si与
Figure BDA0003996373120000242
或放射组合)的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
图28A的图显示接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用同种型对照或抗PD-1抗体治疗(两周一次)的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图28B的图显示接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用同种型对照或抗PD-1抗体治疗(两周一次)连同每周用1μg DF-mIL-12-Fc si治疗的Balb/c小鼠的肿瘤生长曲线。
图29A的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用同种型对照或DF-mIL-12-Fc si瘤内治疗一次(每周)的个体小鼠中经治疗的(Tr)肿瘤的肿瘤生长曲线。图29B的图显示在图29A中描述的个体小鼠中未治疗的(NT)CT26-Tyrp1肿瘤的肿瘤生长曲线。
图30A的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用2μg mIgG2a同种型对照或2μgDF-mIL-12-Fc si治疗一次的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图30B的图显示用CT26-Tyrp1肿瘤细胞接种并用2μg mIgG2a同种型对照、1μg DF-mIL-12-Fc si(每周施用)、2μg DF-mIL-12-Fc si(每周施用)或2μg DF-mIL-12-Fc si(一次)治疗的个体小鼠的平均肿瘤生长曲线。
图31A的图显示用具有L234A、L235A和P329A突变(LALAPA)或L234A、L235A和P329G突变(LALAPG)的DF hIL-12-Fc-si处理的经PHA刺激的PBMC的IFNγ产生。图31B显示在存在或不存在具有LALAPA突变或LALAPG突变的DF hIL-12-Fc-si的情况下，荧光团缀合的hIgG1与THP-1细胞结合的流式细胞术直方图。
图32是显示制备DF hIL-12-Fc si的步骤的工艺流程图。
图33是显示制备含有DF-hIL-12-Fc si的药物配制品的步骤的工艺流程图。
图34A的图显示在含有不同缓冲液的各种药物配制品中DF-hIL-12-Fc si的紫外-可见光谱(UV-Vis)计算的浓度。图34B是显示含有DF-IL-12-Fc si的各种药物配制品的pH的图。
图35A-35B是某些含有DF-hIL-12-Fc si的药物配制品的各种配制品在5℃(图35A)和50℃(图35B)孵育1周后的视觉外观照片。
图36A和36B的图显示在各种药物配制品中在5℃孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的平均Tm1(图36A)和Tm2(图36B)。
图36C和36D的图显示在各种药物配制品中在50℃孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的平均Tm1(图36C)和Tm2(图36D)。
图36E-36H的图显示在各种药物配制品中在5℃(图36E-36F)和在50℃(图36G-36H)孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的代表性差示扫描荧光法(DSF)熔解曲线。
图37A-37B的图显示在各种药物配制品中在5℃(图37A)和50℃(图37B)孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的平均Tagg。
图37C-37F的图显示在各种药物配制品中在5℃(图37C-37D)和在50℃(图37E-37F)孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的代表性DSF聚集曲线。
图38A-38B的图显示在含有不同缓冲液的各种药物配制品中在5℃(图38A)和50℃(图38B)孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的UV-Vis计算的浓度。
图39A-39B的图显示在5℃(图39A)和50℃(图39B)孵育1周后含有DF-hIL-12-Fcsi的各种药物配制品的pH。
图40A-40B的图显示在含有不同缓冲液的各种药物配制品中在5℃孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的Z-平均流体动力学直径(图40A)和多分散性指数(图40B)。图40C-40D的图显示在含有不同缓冲液的各种药物配制品中在5℃孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的平均单体尺寸和平均单体％Pd。
图40E-40F的图显示在含有不同缓冲液的各种药物配制品中在50℃孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的Z-平均流体动力学直径(图40E)和多分散性指数(图40F)。图40G-40H的图显示在含有不同缓冲液的各种药物配制品中在50℃孵育1周后DF-hIL-12-Fc si的平均单体尺寸(图40G)和平均单体％Pd(图40H)。
图40I-40J显示了用于计算图40A-40D中描述的数据的代表性动态光散射(DLS)迹线。图40K-40L显示了用于计算图40E-40H中描述的数据的代表性DLS迹线。
图41的图显示在50℃孵育1周后含有不同缓冲液的各种药物配制品中DF-hIL-12-Fc si的％纯度，如通过尺寸排阻色谱高效液相色谱(SEC-HPLC)测量。
图42的图显示在50℃孵育1周后含有不同缓冲液的各种药物配制品中DF-hIL-12-Fc si的％纯度，如通过毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)测量。
图43A的图显示在含有不同缓冲液和赋形剂的各种药物配制品中1mg/mL的DFhIL-12-Fc-si的UV-Vis计算的浓度。参考图43A：1代表缓冲液交换；2代表2-8℃；3代表50℃；并且4代表冻/融。图43B的图显示在含有不同缓冲液和赋形剂的各种药物配制品中10mg/mL的DF hIL-12-Fc-si的UV-Vis计算的浓度。参考图43B：1代表缓冲液交换；2代表2-8℃；3.代表50℃；并且4代表冻/融。
图44A-44D的图显示各种药物配制品中的1mg/mL和10mg/mL的DF hIL-12-Fc-si的平均Tm1(图44A和44B)和Tm2(图44C和44D)。
图45A-45D显示了各种药物配制品中DF hIL-12-Fc-si的代表性DSF熔解曲线。
图46A-46B的图显示各种药物配制品中1mg/mL(图46A)和10mg/mL(图46B)的DFhIL-12-Fc-si的平均Tagg。
图46C-46F显示了各种药物配制品中1mg/mL和10mg/mL的DF hIL-12-Fc-si的代表性DSF聚集曲线。
图47A-47F显示了代表性DLS迹线，该迹线显示了经受不同应激条件的各种药物配制品中1mg/mL和10mg/mL的DF hIL-12-Fc-si的尺寸分布。
图48A-48H显示了经受不同应激条件的各种药物配制品中1mg/mL和10mg/mL的DFhIL-12-Fc-si的Z-平均尺寸(图48A-48B)、多分散性指数(PDI)(图48C-48D)、单体尺寸(48E-48F)和单体％Pd(图48G-48H)。在图48A-48H中：1代表2-8℃，2代表50℃，3代表冻/融。
图49A-49D的图显示在经受不同应激条件的各种药物配制品中1mg/mL和10mg/mL的DF hIL-12-Fc-si的纯度。图49A-49B显示在50℃孵育后的主峰％。图49C-49D显示在2-8℃孵育或冻融循环后的主峰％。参考图49C-49D：1代表2-8℃，并且2代表冻/融。
图50A-50H的图显示经受不同应激条件的含有DF hIL-12-Fc-si的各种药物配制品中按颗粒尺寸的颗粒计数，如通过高精度液体颗粒(HIAC)分析所测量。图50A-50B显示≥2μm颗粒的计数，图50C-50D显示≥5μm颗粒的计数，图50E-50F显示≥10μm颗粒的计数，以及图50G-50H显示≥25μm颗粒的计数。参考图50A-50H：1代表2-8℃，2代表50℃，3代表冻/融。
图51A和51B是示意图，其显示了1期和2期的研究设计，其中将DF hIL-12-Fc-si用作单一疗法(图51A)以及与派姆单抗的组合疗法(图51B)。
图52A和52B是示意图，其显示了1期和2期的研究设计，其中将DF hIL-12-Fc-si用作单一疗法(图52A)以及与纳武单抗的组合疗法(图52B)。
具体实施方式
本发明提供了对异二聚体Fc融合蛋白、包含此类蛋白的药物配制品以及使用此类蛋白和药物配制品的治疗方法(包括用于治疗癌症)的改进。
为了促进对本发明的理解，下面定义了许多术语和短语。
如本文所用的术语“一个/种(a和an)”意指“一个/种或多个/种”，并且包括复数，除非上下文是不适当的。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指将通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选包括但不限于哺乳动物(例如鼠、猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且更优选包括人。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或期望结果(例如所期望的预防或治疗效果)的化合物(例如本发明的化合物)。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用并且不旨在限于特定的配制品或施用途径。如本文所用，术语“治疗”包括任何作用，例如减轻、减少、调节、改善或消除，导致病症、疾病、障碍等的改善，或改善了其症状。
如本文所用，术语“药物配制品”是指活性剂与载体(惰性的或活性的)的组合，使得该组合物尤其适合体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指任何标准药用载剂，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(例如，例如油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂、和辅助剂的实例，参见例如Martin，Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第15版，麦克出版公司(Mack Publ.Co.)，伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚州(PA)[1975]。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的任何药学上可接受的盐(例如酸或碱)，当给予受试者时，其能够提供本发明的化合物或其活性代谢物或残余物。如本领域的技术人员已知的，本发明的化合物的“盐”可以衍生自无机的或有机的酸和碱。示例性酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、丁二酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、等。其他酸，例如草酸，当其自身不是药学上可接受的时，可以用于制备盐，所述盐用作获得本发明的化合物及其药学上可接受的酸加成盐的中间体。
示例性碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨、以及具有式NW4 +的化合物，其中W是C1-4烷基等。
示例性的盐包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、氟庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(palmoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。盐的其他实例包括与适合的阳离子(例如Na+、NH4 +、和NW4 +(其中W是C1-4烷基基团))等复合的本发明的化合物的阴离子。
对于治疗用途，将本发明的化合物考虑为是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可以找到用途，例如在药学上可接受的化合物的制备或纯化方面。
在整个说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含具体化合物的情况下，或在工艺和方法被描述为具有、包括、或包含具体步骤的情况下，考虑到另外地，存在本发明的组合物，其基本上由或由叙述的化合物组成，并且存在根据本发明的工艺和方法，其基本上由或由叙述的加工步骤组成。
一般而言，除非另外说明，组合物详细说明了按重量计的百分比。另外，如果一个变量未附带一个定义，则对照该变量之前的定义。
(a)蛋白
本发明提供了包含多亚基蛋白的氨基酸序列的Fc融合蛋白构建体。这些融合蛋白构建体可以表现出与天然/自然多亚基蛋白相比更高的血清半衰期，在生产过程中提高的产量，在储存过程中提高的稳定性，和/或在用作治疗剂时提高的功效。
(i)IgG1 Fc融合蛋白
在一个方面，本发明提供了一种异二聚体IgG1 Fc融合蛋白，其包含：包含第一抗体IgG1 Fc结构域多肽的第一多肽和包含与该第一抗体Fc结构域结合的第二抗体IgG1 Fc结构域多肽的第二多肽，其中该第一多肽进一步包含通过接头与该第一抗体Fc结构域多肽融合的多亚基蛋白的第一亚基，该接头包含SEQ ID NO:237或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；该多亚基蛋白的第二不同亚基与该第二抗体Fc结构域多肽融合并且该多亚基蛋白的亚基相互结合；当SEQ ID NO:237或SEQ ID NO:6的X1代表L和/或SEQ ID NO:237或SEQ ID NO:6的X2代表L时，该第一抗体Fc结构域多肽和该第二抗体Fc结构域多肽中的至少一个包含用于促进异二聚化的Q347R突变。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:237或SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头进一步包含间隔子肽。在某些实施例中，接头包含SEQ ID NO:237或SEQ ID NO:6的序列，以及间隔子肽。
在某些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:237或SEQ IDNO:6的序列和间隔子肽的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:237或SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽的接头的氨基酸序列与将多亚基蛋白的亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头的氨基酸序列相同。
可以使用在标题“间隔子肽”下描述的任何间隔子肽。例如，在某些实施例中，间隔子肽包含在SEQ ID NO:107-120中任一个中列出的氨基酸序列。在某些实施例中，间隔子肽由SEQ ID NO:107-120中任一个所示的氨基酸序列组成。在某些实施例中，将多亚基蛋白的亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头由或基本上由本文披露的间隔子肽和具有SEQID NO:237或SEQ ID NO:6的序列的肽组成。在某些实施例中，将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽的接头由或基本上由本文披露的间隔子肽和具有SEQ IDNO:237或SEQ ID NO:6的序列的肽组成。在某些实施例中，间隔子肽在任一或两个接头的N末端。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头包含SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列)。在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头由氨基酸序列SEQ ID NO:239组成。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:244的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:244的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头包含SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基融合至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:238或SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:241的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:241的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:242的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:242的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:243的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:243的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:245的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:245的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:246的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:246的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:240的氨基酸序列。在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基融合至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:240的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:247的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:247的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:248的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:248的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:249的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:249的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在某些实施例中，Fc结构域多肽是IgG1 Fc的多肽。在一些实施例中，本发明的蛋白包括第一抗体Fc结构域多肽和第二抗体Fc结构域多肽，它们都是促进彼此异二聚化的突变的IgG1 Fc结构域多肽。例如，如果Fc结构域衍生自人IgG1的Fc，则Fc结构域可以包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列，并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处不同：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、和K439。
在一些实施例中，抗体恒定结构域可包含以下氨基酸序列，该氨基酸序列与人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同并且差别在于选自由以下组成的组的一个或多个取代：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。本文披露的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置均根据EU编号进行编号。
在一些实施例中，第一抗体IgG1 Fc结构域多肽包括一个或多个选自K360E和K409W的突变，并且第二抗体IgG1 Fc结构域多肽包括一个或多个选自Q347R、D399V和F405T的突变。在一些实施例中，第一抗体IgG1 Fc结构域多肽包括一个或多个选自Q347R、D399V和F405T的突变，并且第二抗体IgG1 Fc结构域多肽包括一个或多个选自K360E和K409W的突变。在一些实施例中，第一抗体IgG1 Fc结构域多肽包括突变K360E和K409W，并且第二抗体IgG1 Fc结构域多肽包括突变Q347R、D399V和F405T。在一些实施例中，第一抗体IgG1 Fc结构域多肽包括突变Q347R、D399V和F405T，并且第二抗体IgG1 Fc结构域多肽包括突变K360E和K409W。
在一些实施例中，本发明的与IgG1 Fc的异二聚体Fc融合蛋白包括一个或多个突变以减少与第一和/或第二多肽中的FcγR(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或补体组分(例如C1q)的结合。此类突变可用于降低效应子功能。例如，本披露的蛋白包括L234A和L235A突变；L234A、L235A、和P329A突变；L234A、L235A、和P329G突变；或L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变。
在一些实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白包括各自含有突变P329G或P329A的第一抗体IgG4或IgG1 Fc结构域多肽和第二抗体IgG4或IgG1 Fc结构域多肽。在具体实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白包含各自包含突变P329A的第一抗体IgG4或IgG1 Fc结构域多肽和第二抗体IgG4或IgG1 Fc结构域多肽。
在一些实施例中，第一IgG1抗体Fc结构域多肽和第二不同IgG1抗体Fc结构域多肽各自包含选自A330S和P331S的突变。在一些实施例中，第一IgG1抗体Fc结构域多肽和第二不同IgG1抗体Fc结构域多肽各自包含突变A330S和P331S。
在某些实施例中，在IgG1 Fc单体之间引入了另外的二硫键，这提高了异二聚体的稳定性。在示例性实施例中，与多亚基蛋白的第一亚基融合的第一抗体Fc结构域多肽包括CH3结构域中的Y349C取代，其与融合至多亚基蛋白的第二不同亚基的第二抗体Fc结构域多肽上的S354C取代形成二硫键。可替代地，与多亚基蛋白的第一亚基融合的第一抗体Fc结构域多肽包括CH3结构域中的S354C取代，其与融合至多亚基蛋白的第二不同亚基的第二抗体Fc结构域多肽上的Y349C取代形成二硫键。
下表2中提供的任何IgG1抗体Fc结构域多肽可以与下表1中提供的任何IgG1铰链序列(其在本发明中是将多亚基蛋白的第一亚基的蛋白序列连接到第一IgG1抗体Fc结构域多肽的接头、或者将另外亚单位连接到第二不同IgG1抗体Fc结构域多肽的接头的一部分或全部)组合使用。示例性IgG1铰链-Fc结构域多肽在下表3中提供。在某些实施例中，Fc融合蛋白的第一和第二多肽分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:212和212；213和214；215和216；217和218；214和213；216和215；或218和217。在某些实施例中，Fc融合蛋白的第一和第二多肽分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:228和228；229和230；231和232；233和234；235和236；230和229；232和231；234和233；236和235；228和250；250和228；250和250；229和252；252和229；251和230；230和251；253和232；232和253；231和254；254和231；255和234；234和255；233和256；256和233；257和236；236和257；258和235；或235和258。
(ii)IgG4 Fc融合蛋白
在一个方面，本发明提供了对多亚基蛋白的改进。在一个方面，本发明提供了一种异二聚体IgG4 Fc融合蛋白，其包含：包含第一抗体IgG4Fc结构域多肽的第一多肽和包含与该第一抗体Fc结构域多肽结合的第二不同抗体IgG4 Fc结构域多肽的第二多肽，其中该第一多肽进一步包含通过接头与该第一抗体IgG4 Fc结构域多肽融合的多亚基蛋白的第一亚基，该接头包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；该多亚基蛋白的第二不同亚基与该第二抗体IgG4 Fc结构域多肽融合并且该多亚基蛋白的亚基相互结合；该第一抗体Fc结构域多肽和该第二抗体IgG4 Fc结构域多肽各自含有不同的促进异二聚化的突变。
在一些实施例中，在异二聚体IgG4 Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，将多亚基蛋白的第一亚基的蛋白序列连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头进一步包含间隔子肽。在某些实施例中，接头包含SEQ ID NO:1的序列，以及间隔子肽。
在某些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:1的序列和间隔子肽的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽的接头的氨基酸序列与将多亚基蛋白的亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头的氨基酸序列相同。
可以使用在标题“间隔子肽”下描述的任何间隔子肽。例如，在某些实施例中，间隔子肽包含在SEQ ID NO:107-120中任一个中列出的氨基酸序列。在某些实施例中，间隔子肽由SEQ ID NO:107-120中任一个所示的氨基酸序列组成。在某些实施例中，将多亚基蛋白的亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头由或基本上由本文披露的间隔子肽和SEQ IDNO:1组成。在某些实施例中，接头由或基本上由本文披露的间隔子肽和SEQ ID NO:1组成。在某些实施例中，间隔子肽在第一接头和/或第二接头的N末端。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，将多亚基蛋白的第一亚基融合至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白内，将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽的接头包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，将多亚基蛋白的第一亚基融合至第一抗体Fc结构域多肽的接头由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:63的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过由SEQ ID NO:64的氨基酸序列组成的接头融合至第二抗体Fc结构域多肽。
在某些实施例中，Fc结构域多肽是IgG4 Fc的多肽。IgG4是不稳定的二聚体，可以进行Fab臂交换并与体内其他IgG4抗体配对。在某些实施例中，在铰链内引入S228P突变(其在本发明中是将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一IgG4抗体Fc结构域多肽的接头、或者将另外亚基连接至第二不同IgG4抗体Fc结构域多肽的接头的一部分或全部)，这增加了铰链区的稳定性并减少了Fab臂交换的机会。在某些实施例中，在Fc结构域多肽单体之间引入了另外的二硫键，这提高了异二聚体的稳定性。在示例性实施例中，与多亚基蛋白的第一亚基连接的第一抗体Fc结构域多肽包括CH3结构域中的Y349C取代，其与连接至多亚基蛋白的第二不同亚基的第二抗体Fc结构域多肽上的S354C取代形成二硫键，该第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽。可替代地，与多亚基蛋白的第一亚基连接的第一抗体Fc结构域多肽包括CH3结构域中的S354C取代，其与连接至多亚基蛋白的第二不同亚基的第二抗体Fc结构域多肽上的Y349C取代形成二硫键。
在一些实施例中，本发明的蛋白包括第一抗体Fc结构域多肽和第二抗体Fc结构域多肽，它们都是促进彼此异二聚化的突变的IgG4 Fc结构域多肽。
在一些实施例中，第一抗体IgG4 Fc结构域多肽包括一个或多个选自K360E、K370E和R409W的突变，并且第二抗体IgG4 Fc结构域多肽包括一个或多个选自E357N、Q347R、D399V和F405T的突变。在一些实施例中，第一抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变K370E和R409W，并且第二抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变E357N、D399V和F405T。在一些实施例中，第一抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变E357N、D399V和F405T，并且第二抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变K370E和R409W。在一些实施例中，第一抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变K360E和R409W，并且第二抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变Q347R、D399V和F405T。在一些实施例中，第一抗体IgG4 Fc结构域多肽包括突变Q347R、D399V和F405T，并且第二抗体IgG4Fc结构域多肽包括突变K360E和R409W。
在一些实施例中，本发明的与IgG4 Fc的异二聚体Fc融合蛋白包括一个或多个突变以减少与一个或多个第一和/或第二多肽中的FcγR(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或补体组分(例如C1q)的结合。此类突变可用于降低效应子功能。例如，本披露的蛋白包括S228P和L235E突变；S228P、L235E、和P329A突变；或S228P、L235E和P329G突变。
表2中提供的任何IgG4抗体Fc结构域多肽可以与表1中提供的任何IgG4铰链序列(其在本发明中是将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一IgG4抗体Fc结构域多肽的接头、或者将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二不同IgG4抗体Fc结构域多肽的接头的部分或全部)组合使用。示例性IgG4铰链-Fc结构域多肽在表3中提供。在某些实施例中，Fc融合蛋白的第一和第二多肽分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:205和205；206和207；208和209；210和211；207和206；209和208；或211和210。在某些实施例中，Fc融合蛋白的第一和第二多肽分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:219和219；220和221；222和223；224和225；226和227；221和220；223和222；225和224；或227和226。
(b)二硫键
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包括多亚基蛋白的第一亚基和多亚基蛋白的第二不同亚基之间的天然异二聚体二硫键。例如，在示例性实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白包括IL-12的p35和p40亚基之间的天然异二聚体二硫键。这种蛋白包括p35的C74和p40的C177之间的天然二硫键。
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包括多亚基蛋白的第一亚基和多亚基蛋白的第二不同亚基之间的人工或工程改造的异二聚体二硫键。例如，在示例性实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白包括IL-12的p35和p40亚基之间的人工或工程改造的异二聚体二硫键。这种蛋白包括p35的V185C和p40的Y292C之间的人工或工程改造的二硫键。
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包括多亚基蛋白的第一亚基和多亚基蛋白的第二不同亚基之间的天然异二聚体二硫键，以及多亚基蛋白的第一亚基和多亚基蛋白的第二不同亚基之间的人工或工程改造的异二聚体二硫键。例如，在示例性实施例中，IL-12的p35和p40亚基之间的天然异二聚体二硫键，并且包括IL-12的p35和p40亚基之间的人工或工程改造的异二聚体二硫键。这种蛋白包括p35的C74和p40的C177之间的天然二硫键，以及p35的V185C和p40的Y292C之间的人工或工程改造的二硫键。
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白被工程改造以去除天然二硫键，并用非天然人工或工程改造的二硫键代替它。例如，在示例性实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白包括其中天然C74突变为丝氨酸的IL-12的p35和其中天然C177突变为丝氨酸的IL-12的p40，从而去除IL-12的p35和p40亚基之间的天然二硫键。对于这种突变的IL-12，引入了两个新的突变，p35上的V185C和p40上的Y292C，从而引入了非天然人工或工程改造的二硫键。
(c)Fc融合多肽的组分的序列
本发明的示例性异二聚体Fc融合蛋白是用任何一种IgG1或IgG4 Fc变体序列和任何一种下表1-2中描述的相应接头序列构建的。本发明的融合蛋白构建体可以赋予与天然/自然多亚基蛋白相比更高的血清半衰期，提高生产过程中的蛋白产量，提高储存过程中的稳定性，和/或提高用作治疗剂时的功效。
下表2中提供的任何IgG4抗体Fc变体结构域多肽可以与下表1中提供的任何IgG4铰链序列组合使用。类似地，下表2中提供的任何IgG1抗体Fc变体结构域多肽可以与下表1中提供的任何IgG1铰链序列组合使用。示例性IgG1铰链-Fc结构域多肽在下表3中提供。
表1：接头变体
铰链 氨基酸序列
IgG4铰链共有 SEQ ID NO:1
IgG4铰链S228P SEQ ID NO:2
IgG4铰链S228P/L235E SEQ ID NO:4
IgG1铰链共有 SEQ ID NO:6
IgG1铰链C220S SEQ ID NO:7
IgG1铰链C220S/L234A/L235A SEQ ID NO:9
IgG1铰链C220S/L234A/L235E/G237A SEQ ID NO:11
IgG1铰链ΔE216 SEQ ID NO:237
IgG1铰链ΔE216/C220S SEQ ID NO:238
IgG1铰链ΔE216/C220S/L234A/L235A SEQ ID NO:239
IgG1铰链ΔE216/C220S/L234A/L235E/G237A SEQ ID NO:240
表2：IgG4 Fc和IgG1 Fc野生型序列；和示例性IgG4抗体Fc变体和IgG1抗体Fc变体序列(氨基酸取代以粗体和下划线表示)
Figure BDA0003996373120000401
Figure BDA0003996373120000411
*氨基酸序列可以进一步在C末端包含赖氨酸(K)。
表3：S228P突变的IgG4铰链-Fc(野生型)；示例性S228P突变的IgG4铰链-Fc变体或铰链部分-Fc变体；C220S突变的IgG1铰链-Fc(野生型)；示例性C220S突变的IgG1铰链-Fc变体或铰链部分-Fc变体
Figure BDA0003996373120000412
Figure BDA0003996373120000421
Figure BDA0003996373120000431
*氨基酸序列可以进一步在C末端包含赖氨酸(K)。
表4：示例性异二聚体Fc融合多肽构建体
Figure BDA0003996373120000432
Figure BDA0003996373120000441
Figure BDA0003996373120000451
Figure BDA0003996373120000461
Figure BDA0003996373120000471
Figure BDA0003996373120000481
Figure BDA0003996373120000491
Figure BDA0003996373120000501
Figure BDA0003996373120000511
Figure BDA0003996373120000521
Figure BDA0003996373120000531
Figure BDA0003996373120000541
Figure BDA0003996373120000551
Figure BDA0003996373120000561
Figure BDA0003996373120000571
Figure BDA0003996373120000581
*氨基酸序列可以进一步在C末端包含赖氨酸(K)。
表5：示例性二聚体Fc融合蛋白
Figure BDA0003996373120000582
Figure BDA0003996373120000591
Figure BDA0003996373120000601
Figure BDA0003996373120000611
Figure BDA0003996373120000621
Figure BDA0003996373120000631
Figure BDA0003996373120000641
Figure BDA0003996373120000651
Figure BDA0003996373120000661
Figure BDA0003996373120000671
Figure BDA0003996373120000681
Figure BDA0003996373120000691
Figure BDA0003996373120000701
Figure BDA0003996373120000711
Figure BDA0003996373120000721
Figure BDA0003996373120000731
Figure BDA0003996373120000741
Figure BDA0003996373120000751
*氨基酸序列可以进一步在C末端包含赖氨酸(K)。
(d)IL-12亚基
IL-12是包括p40亚基和p35亚基的多亚基蛋白。成熟的野生型IL-12p40的氨基酸序列是GenBank登录号NP_002178.2的氨基酸23-328，如下面的SEQ ID NO:127所示。成熟的野生型IL-12p35的氨基酸序列是GenBank登录号NP_000873.2的氨基酸57-253，如下面的SEQ ID NO:128所示。本文使用的p40和p35的氨基酸残基编号对应于成熟的野生型蛋白序列。如本文所用，IL-12p40亚基包含与SEQ ID NO:127至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。如本文所用，IL-12p35亚基包含与SEQ ID NO:128至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。
在任一前述方面的某些实施例中，IL-12的p40和p35亚基分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:121和122；127和128；201和202；203和204；123和124；或125和126。在某些实施例中，第一多肽包含IL-12的p40亚基的氨基酸序列，并且第二多肽包含IL-12的p35亚基的氨基酸序列。在某些实施例中，第一多肽包含IL-12的p35亚基的氨基酸序列，并且第二多肽包含IL-12的p40亚基的氨基酸序列。
在某些实施例中，本披露包括异二聚体Fc融合蛋白，其包含：包含第一抗体Fc结构域多肽的第一多肽和包含第二抗体Fc结构域多肽的第二多肽，其中该第一多肽进一步包含通过接头与该第一抗体Fc结构域多肽融合的IL-12的第一亚基；并且IL-12的第二不同亚基与该第二抗体Fc结构域多肽融合，其中IL-12的该第一和第二不同亚基相互结合，其中该第一抗体Fc结构域多肽和该第二抗体Fc结构域多肽各自含有不同的促进异二聚化的突变，其中该第一抗体Fc结构域多肽和该第二抗体Fc结构域多肽相互结合，并且其中IL-12的该第一亚基是具有Y292C取代的p40亚基，并且IL-12的该第二不同亚基是具有V185C取代的p35亚基。在某些实施例中，IL-12的第一亚基和第二不同亚基分别包含SEQ ID NO:125和126的氨基酸序列。
IL-12的第一亚基和第二不同亚基可以通过本文披露的任何接头与这些抗体Fc结构域多肽中的任一个融合以形成Fc融合蛋白，其具有包括但不限于表4所述的构建体120、120-1、120-2、120-3、120-4、120-5、120-6和120-7以及表5所述的构建体20、20-1、20-2、20-3、20-4、20-5、20-6、20-7、20-8和20-9的序列。
在某些实施例中，IL-12的p40亚基进一步包含C177的替代，并且IL-12的p35亚基进一步包含C74的替代。在某些实施例中，IL-12的p40亚基中的C177被S替代，并且IL-12的p35亚基中的C74被S替代。在某些实施例中，IL-12的p40和p35亚基包含氨基酸SEQ ID NO:123和124的序列。
IL-12的第一亚基和第二不同亚基可以通过本文披露的任何接头与这些抗体Fc结构域多肽中的任一个融合以形成Fc融合蛋白，其具有包括但不限于表4所述的构建体119、119-1、119-2、119-3、119-4、119-5、119-6、119-7和119-8以及表5所述的构建体19、19-1、19-2、19-3、19-4、19-5、19-6、19-7、19-8、19-9和19-10的序列。
表6：人IL-12p40和p35氨基酸序列
Figure BDA0003996373120000761
Figure BDA0003996373120000771
(e)间隔子肽
示例性间隔子肽序列在表7中提供，示例性全长接头序列在表4和5中提供。
在本发明的第一多肽内，在氨基到羧基方向上，多亚基蛋白的第一亚基通过接头融合至第一抗体Fc结构域多肽(例如，IgG4抗体Fc变体序列或IgG1抗体Fc变体序列，如表2中所披露的)。并且在本发明的第二多肽内，在氨基到羧基方向上，多亚基蛋白的第二不同亚基通过接头融合至第一抗体Fc结构域多肽(例如，IgG4抗体Fc变体序列或IgG1抗体Fc变体序列，如表2中所披露的)。
在一些实施例中，本发明的多亚基蛋白的第一亚基通过接头融合至第一抗体Fc结构域序列，其中接头包含以下或由以下组成：间隔子肽L1和SEQ ID NO:1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240的氨基酸序列。在一些实施例中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过接头融合至第二抗体Fc结构域多肽，其中接头包含以下或由以下组成：间隔子肽L2和SEQ IDNO:1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240的氨基酸序列。
在某些实施例中，L1和L2是肽接头，例如，L1和/或L2包括4-50个氨基酸残基。在某些实施例中，L1由4-50个氨基酸残基组成。在某些实施例中，L1由4-20个氨基酸残基组成。在某些实施例中，L2由4-50个氨基酸残基组成。在某些实施例中，L2由约4-20个氨基酸残基组成。在某些实施例中，L1和L2各自独立地由约4-50个氨基酸残基组成。在某些实施例中，L1和L2各自独立地由4-20个氨基酸残基组成。
在一些实施例中，L1和L2具有优化的长度和/或氨基酸组成。在一些实施例中，L1和L2具有相同的长度并且具有相同的氨基酸组成。在其他实施例中，L1和L2是不同的。
在某些实施例中，L1与L2具有相同数量的氨基酸；在某些实施例中，L1比L2长(即，氨基酸数量更多)；在某些实施例中，L1比L2短(即，氨基酸数量更少)。
在某些实施例中，L1和/或L2是“短的”，例如，由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。因此，在某些情况下，间隔子肽由约12个或更少的氨基酸残基组成。在0个氨基酸残基的情况下，间隔子肽是肽键。在某些实施例中，L1和/或L2是“长的”，例如，由15、20或25个氨基酸残基组成。在一些实施例中，间隔子肽由约3至约15个，例如8、9或10个连续氨基酸残基组成。关于L1和L2的氨基酸组成，选择具有以下性质的肽：赋予本发明蛋白的第一和第二多肽灵活性，不干扰第一和第二不同亚基相互结合，以及抵抗蛋白酶的切割。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抗性。适合于将多亚基蛋白的第一亚基连接至SEQ ID NO:1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240的氨基酸序列和/或适合于将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至SEQ ID NO:1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240的氨基酸序列的间隔子肽可以包括作为接头的一部分的(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n和(GGGGS)n序列，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，L1和/或L2独立地包括(GGGGS)4(SEQ ID NO:107)或(GGGGS)3(SEQ ID NO:108)序列作为接头的一部分。在其他实施例中，L1和/或L2独立地包括如选自以下的序列中所列的肽序列作为接头的一部分：SEQ ID NO:111、112、113、114、115、116、117、118、119和120，如表7所列。在一些实施例中，L1和/或L2独立地是SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:110。
表7：接头
接头 SEQ ID NO
G/S接头 SEQ ID NO:111、112、113、114、115、116、117、118、119和120
在某些实施例中，L1包括作为接头的一部分的序列SEQ ID NO:108，并且L2包括作为接头的一部分的SEQ ID NO:109，或SEQ ID NO:110。在某些实施例中，L2包括作为接头的一部分的序列SEQ ID NO:108，并且L1包括作为接头的一部分的SEQ ID NO:109，或SEQ IDNO:110序列。在某些实施例中，L1作为接头的一部分不包括如SEQ ID NO:107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120中所列的序列。
在某些实施例中，仅L2作为接头的一部分包括如SEQ ID NO:107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120中所列的序列。在某些实施例中，作为接头序列的一部分的L1和L2都不包括如SEQ ID NO:107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120中所列的序列。
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽，该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽，其中包含SEQ ID NO:118的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第二多肽，该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽，其中包含SEQ ID NO:118的接头将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中包含SEQ ID NO:118的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中该另外的亚基通过不包含SEQ ID NO:118的接头与第二抗体Fc区多肽连接。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中不包含SEQ ID NO:118的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:118的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽，该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽，其中包含SEQ ID NO:109的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第二多肽，该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽，其中包含SEQ ID NO:109的接头将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。
本披露的一些异二聚体Fc融合蛋白包括包含SEQ ID NO:109的接头，其将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽，以及将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中包含SEQ ID NO:109的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的另外亚基通过不包含SEQID NO:109的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中不包含SEQ ID NO:109的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:109的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽，该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽，其中包含SEQ ID NO:110的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第二多肽，该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽，其中包含SEQ ID NO:110的接头将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。
本披露的一些异二聚体Fc融合蛋白包括包含SEQ ID NO:110的接头，其将多亚基蛋白的第一亚基连接至第一抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽，以及将多亚基蛋白的第二不同亚基连接至第二抗体Fc结构域多肽，例如IgG4抗体的Fc结构域多肽或IgG1抗体的Fc结构域多肽。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中包含SEQ ID NO:110的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的第二不同亚基通过不包含SEQ ID NO:110的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中不包含SEQ ID NO:110的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:110的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中包含SEQ ID NO:110序列的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:109序列的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
在某些实施例中，本发明的一些异二聚体Fc融合蛋白包含第一多肽(该第一多肽包含多亚基蛋白的第一亚基和第一抗体Fc结构域多肽)，其中包含SEQ ID NO:109序列的接头将多亚基蛋白的第一亚基连接至Fc结构域多肽，以及第二多肽(该第二多肽包含多亚基蛋白的第二不同亚基和第二抗体Fc结构域多肽)，其中多亚基蛋白的第二不同亚基通过包含SEQ ID NO:110序列的接头与第二抗体Fc结构域多肽连接。
(f)用于促进异二聚化的Fc结构域和取代
本发明的蛋白的组装可以通过以下来实现：在同一细胞中表达第一多肽和第二多肽，该第一多肽包含与第一抗体Fc结构域多肽(例如，如表2中所披露的IgG4抗体Fc变体序列或IgG1抗体Fc变体序列)融合的多亚基蛋白序列的第一亚基，并且该第二多肽内包含与第二抗体Fc结构域多肽(例如，如表2中所披露的IgG4抗体Fc变体序列或IgG1抗体Fc变体序列)融合的多亚基蛋白序列的第二不同亚基，这导致根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白的装配。组装的蛋白具有异二聚体Fc结构域多肽，其中第一抗体Fc结构域多肽和第二抗体Fc结构域多肽相互结合。促进Fc的异二聚体的优先装配可以通过在每个抗体重链恒定区的CH3结构域中掺入不同的突变来实现，如US 13/494870、US 16/028850、US 11/533709、US12/875015、US 13/289934、US 14/773418、US 12/811207、US 13/866756、US 14/647480和US 14/830336中所示。例如，可以基于人IgG1在CH3结构域中进行突变，并在第一抗体Fc结构域多肽和第二抗体Fc结构域多肽内掺入不同的氨基酸取代对，使这两条链彼此选择性异二聚化。如下所示的氨基酸取代位置均按照Kabat中的EU索引编号。
在一种情况下，第一抗体Fc结构域多肽中的氨基酸取代用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的较大氨基酸替代原始氨基酸，并且第二抗体Fc结构域多肽中的至少一个氨基酸取代用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的较小氨基酸替代一个或多个原始氨基酸，使得较大的氨基酸取代(突起)适合进入较小的氨基酸取代(腔)的表面。例如，一个抗体Fc结构域多肽可以掺入T366W取代，而另一个可以掺入三个取代，包括T366S、L368A和Y407V。
本发明的包含多亚基蛋白序列的第一亚基的第一多肽或包含多亚基蛋白序列的第二不同亚基的第二多肽可以任选地与跟抗体恒定区(例如IgG恒定区，包括铰链、CH2和CH3结构域，有或没有CH1结构域)至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同的氨基酸序列偶联。在一些实施例中，恒定区的氨基酸序列与人抗体恒定区(例如人IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区)至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同。在一些其他实施例中，恒定区的氨基酸序列与来自其他哺乳动物(例如兔、狗、猫、小鼠或马)的抗体恒定区至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。与人IgG1恒定区相比，一个或多个突变可以掺入恒定区，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439。示例性取代包括，例如，Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
在某些实施例中，可掺入人IgG1恒定区的CH1中的突变可以在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施例中，可掺入人IgG1恒定区的Cκ中的突变可以在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。
氨基酸取代可选自表8中所示的下列取代组。
表8：氨基酸取代
第一多肽 第二多肽 第一多肽 第二多肽
组1 S364E/F405A Y349K/T394F 组9 L368D/K370S S364K
组2 S364H/D401K Y349T/T411E 组10 L368E/K370S S364K
组3 S364H/T394F Y349T/F405A 组11 K360E/Q362E D401K
组4 S364E/T394F Y349K/F405A 组12 L368D/K370S S364K/E357L
组5 S364E/T411E Y349K/D401K 组13 K370S S364K/E357Q
组6 S364D/T394F Y349K/F405A 组14 F405L K409R
组7 S364H/F405A Y349T/T394F 组15 K409R F405L
组8 S364K/E357Q L368D/K370S
可替代地，氨基酸取代可选自表9中所示的下列取代组。
表9：氨基酸取代
第一多肽 第二多肽
组1 K409W D399V/F405T
组2 Y349S E357W
组3 K360E Q347R
组4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
组5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
组6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
可替代地，氨基酸取代可选自表10中所示的下列取代组。
表10：氨基酸取代
第一多肽 第二多肽
组1 T366K/L351K L351D/L368E
组2 T366K/L351K L351D/Y349E
组3 T366K/L351K L351D/Y349D
组4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
组5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
组6 E356K/D399K K392D/K409D
可替代地，每条多肽链中的至少一个氨基酸取代可以选自表11。
表11：氨基酸取代
Figure BDA0003996373120000841
可替代地，至少一个氨基酸取代可以选自表12中的以下取代组，其中第一多肽列中指示的一个或多个位置被任何已知的带负电荷的氨基酸替代，并且第二多肽列中指示的一个或多个位置被任何已知的带正电荷的氨基酸替代。
表12：氨基酸取代
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409或K439 D399、E356或E357
可替代地，至少一个氨基酸取代可以选自表13中的以下组，其中第一多肽列中指示的一个或多个位置被任何已知的带正电荷的氨基酸替代，并且第二多肽列中指示的一个或多个位置被任何已知的带负电荷的氨基酸替代。
表13：氨基酸取代
第一多肽 第二多肽
D399、E356或E357 K409、K439、K370或K392
可替代地，氨基酸取代可选自表14中的以下组。
表14：氨基酸取代
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A、和Y407V T350V、T366L、K392L、和T394W
可替代地或另外地，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白的结构稳定性可通过在第一或第二多肽链中的任一个上引入S354C和在相对多肽链上引入Y349C来增加，这在两个多肽的界面内形成人工二硫键。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在位置T366处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自T366、L368和Y407的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自T366、L368和Y407的位置处不同，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在位置T366处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自L351、D399、S400和Y407的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自T366、N390、K392、K409和T411的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自T366、N390、K392、K409和T411的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自L351、D399、S400和Y407的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Q347、Y349、K360和K409的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Q347、E357、D399和F405的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Q347、E357、D399和F405的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Y349、K360、Q347和K409的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自K370、K392、K409和K439的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自D356、E357和D399的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自D356、E357和D399的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自K370、K392、K409和K439的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自L351、E356、T366和D399的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Y349、L351、L368、K392和K409的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自Y349、L351、L368、K392和K409的位置处不同，并且抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列在一个或多个选自L351、E356、T366和D399的位置处不同。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于S354C取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于Y349C取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于Y349C取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于S354C取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于K360E和K409W取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于O347R、D399V和F405T取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于O347R、D399V和F405T取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于K360E和K409W取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T366W取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T366S、T368A和Y407V取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T366S、T368A和Y407V取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T366W取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T350V、T366L、K392L和T394W取代。
在一些实施例中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T350V、T366L、K392L和T394W取代，抗体恒定区另一个多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同之处在于T350V、L351Y、F405A和Y407V取代。
本领域技术人员将理解，在蛋白的生产和/或储存过程中，N末端谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)可以环化形成内酰胺(例如在生产和/或储存过程中自发地或通过存在的酶催化)。因此，在多肽的氨基酸序列的N末端残基是E或Q的一些实施例中，E或Q被焦谷氨酸取代的相应氨基酸序列也在本文中被考虑。
本领域技术人员还将理解，在蛋白的生产和/或储存过程中，蛋白的C末端赖氨酸(K)可以被去除(例如在生产和/或储存过程中自发地或通过存在的酶催化)。对于在其C末端包含Fc结构域的蛋白，经常观察到这种K的去除。因此，在多肽的氨基酸序列(例如，Fc结构域序列)的C末端残基为K的一些实施例中，本文还考虑去除了K的相应氨基酸序列。
(g)降低效应子功能的突变
在一个方面，本发明提供了一种异二聚体Fc融合蛋白，其包含(a)第一多肽，其包含第一抗体Fc结构域多肽和多亚基蛋白的第一亚基；和(b)第二多肽，其包含第二抗体Fc结构域多肽和多亚基蛋白的第二不同亚基，其中该第一和第二抗体Fc结构域多肽各自包含不同的促进异二聚化的突变，中该第一和/或第二抗体Fc结构域多肽包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变，并且其中该多亚基蛋白的该第一亚基和第二不同亚基相互结合。在某些实施例中，本文披露的包含一个或多个降低Fc的效应子功能的突变的异二聚体Fc融合蛋白具有比其不具有一个或多个降低效应子功能的Fc突变的对应物增加的抑制肿瘤生长的活性。本文考虑的突变包括氨基酸残基的取代、插入和缺失。本文披露的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置均根据EU编号进行编号。
在某些实施例中，第一和/或第二抗体Fc结构域多肽包含一个或多个突变，其降低Fc结构域多肽诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的能力。ADCC和ADCP通常由Fc受体介导。例如，在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是人IgG(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4)抗体序列。人IgG的Fc受体，也称为Fcγ受体(FcγR)，包括但不限于激活性Fcγ受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIIA(CD16或CD16A)和FcγRIIIB(CD16B)，和抑制剂Fcγ受体FcγRIIB(CD32B)。因此，在一些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白在第一和/或第二多肽中包括一个或多个突变以减少与激活性FcγR(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA或FcγRIIIB)的结合。在一些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白在第一和/或第二多肽中包括一个或多个突变以增加与抑制性FcγR(例如，FcγRIIB)的结合。
减少与激活性FcγR的结合和/或增加与抑制性FcγR的结合的Fc突变是本领域已知的。例如，在铰链区和Fc区内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1中，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr299、Ala 327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(参见，Sondermann等人,Nature[自然],406(6793):267-273)。基于已知的结构域，可以选择突变以增强或降低与CD16的结合亲和力，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示的cDNA文库，或者可以基于已知的三维结构设计相互作用。
正如Want等人,Protein Cell[蛋白与细胞](2018)9(1):63-73所综述，根据人IgG1 Fc的晶体结构，包括氨基酸位置232-239、265-270、296-299和325-332的区域涉及激活性FcγR结合。Wang等人还披露了人IgG4的L235E和F234A/L235A突变、人IgG1的L234A/L235A突变和IgG抗体的N297突变(例如，N297A、N297Q、N297G、或N297D)减少对FcγR结合的激活。如美国专利第8,969,526号中所披露的，位置329处的突变(例如，P329A、P329G或P329R)也减少对的FcγR结合的激活。在以下中披露了涉及激活FcγR结合的其他氨基酸位置和突变(例如，E233P突变)：美国专利号7,943,743和Isaacs等人,J.Immunol.[免疫学杂志](1998)161:3862-69。
因此，在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽在选自233、234、235、297和329的一个或多个位置处包含突变(例如，相对于野生型人IgG1的取代)。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含一个或多个突变E233P；L234A(人IgG1)或F234A(人IgG4)；L235A或L235E；N297A、N297Q、N297G、或N297D；和/或P329A、P329G或P329R的人IgG1抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变L234A和L235A的人IgG1抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变L234A、L235A和P329A的人IgG1抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变L235E的人IgG4抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变L235E和P329A的人IgG1抗体Fc结构域多肽；
在某些实施例中，第一和/或第二抗体Fc结构域多肽包含一个或多个突变，其降低Fc结构域多肽诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。CDC通常由补体组分(例如，C1q)介导。因此，在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白包括一个或多个突变以减少与第一和/或第二多肽中的补体组分(例如，C1q)的结合。
减少与C1q结合的Fc突变是本领域已知的。例如，如美国专利号5,648,260和5,624,821中所披露的，Fc的在位置234、235、236、237、297、318、320和322处的氨基酸残基与C1q结合有关。正如Tao等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志](1993)178:661-667和Brekke等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志](1994)24:2542-47所披露，位置331处的残基Pro与C1q结合有关。正如Idusogie等人,J.Immunol.[免疫学杂志](2000)164:4178-84所披露，Fc在位置270(例如，D270A)、322(K322A)、329(例如，P329A)和331(例如，P331A、P331S或P331G)处的突变减少C1q结合。
因此，在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽在选自234、235、236、237、270、297、318、320、322、329和331的一个或多个位置处包含突变(例如，相对于野生型人IgG1的取代)。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变G237A、A330S、P331S和/或P329A的人IgG1抗体Fc结构域多肽。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变G237A、A330S和P331S的人IgG1抗体Fc结构域多肽；在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽是包含突变P329A的人IgG1抗体Fc结构域多肽。
可以组合降低ADCC和/或ADCP的突变和降低CDC的突变。在某些实施例中，第一和/或第二抗体Fc结构域多肽包含一个或多个降低Fc结构域多肽诱导ADCC和/或ADCP的能力的突变，并且进一步包含一个或多个降低Fc结构域多肽诱导CDC的能力的突变。在某些实施例中，第一和第二抗体Fc结构域多肽各自包含一个或多个降低Fc结构域多肽诱导ADCC和/或ADCP的能力的突变，并且进一步包含一个或多个降低Fc结构域多肽诱导CDC的能力的突变。
在一些实施例中，本发明的与IgG4 Fc的异二聚体Fc融合蛋白包括一个或多个突变以减少与第一和/或第二多肽中的FcγR(例如、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或补体组分(例如C1q)的结合。此类突变可用于降低效应子功能。例如，本披露的蛋白可以包括S228P和L235E突变；S228P、L235E、和P329A突变；或S228P、L235E和P329G突变。
在一些实施例中，本发明的与IgG1 Fc的异二聚体Fc融合蛋白包括一个或多个突变以减少与第一和/或第二多肽中的FcγR(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或补体组分(例如C1q)的结合。此类突变可用于降低效应子功能。例如，本披露的蛋白可以包括L234A和L235A突变；L234A、L235A、和P329A突变；L234A、L235A、和P329G突变；或L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变。
在一些实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白包括各自含有突变P329G或P329A的第一抗体IgG4或IgG1 Fc结构域多肽和第二抗体IgG4或IgG1 Fc结构域多肽。
在一些实施例中，第一抗体Fc结构域多肽和第二抗体Fc结构域多肽各自包含选自A330S和P331S的突变。
在一些实施例中，第一抗体Fc结构域多肽和第二抗体Fc结构域多肽各自包含突变A330S和P331S。
在某些实施例中，在本发明的异二聚体Fc融合蛋白的第一多肽中，多亚基蛋白的第一亚基通过第一接头与第一抗体Fc结构域多肽融合。在某些实施例中，在本发明的异二聚体Fc融合蛋白的第二多肽中，多亚基蛋白的第二不同亚基通过第二接头与第二抗体Fc结构域多肽融合。适用于此类用途的接头的氨基酸序列在标题“IgG4构建体”和“IgG1构建体”下进行了描述。适用于第一和/或第二多肽中的其他接头序列包括但不限于野生型IgG(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4)铰链序列和其突变体形式。例如，在某些实施例中，第一和第二接头各自包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFXGG，其中X是L或E(SEQ ID NO:280)或SKYGPPCPPCPAPEFXGG，其中X是L或E(SEQ ID NO:281)。在某些实施例中，第一和第二接头各自包含SEQ ID NO:282或SEQ ID NO:283的氨基酸序列。在某些实施例中，第一和第二接头各自包含SEQ ID NO:284或SEQ ID NO:285的氨基酸序列。
(h)血清半衰期
根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白具有适用于治疗用途的药代动力学特性。例如，在某些实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白具有至少约50小时的血清半衰期。在某些实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白具有至少约100小时的血清半衰期。
在某些实施例中，在向受试者静脉内施用后50小时，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白的血清浓度是在所述受试者中施用后1小时本发明的蛋白的血清浓度的至少10％。
在某些实施例中，根据本发明的异二聚体Fc融合蛋白具有比未融合到Fc结构域多肽的多亚基蛋白长至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的血清半衰期。在某些实施例中，包含根据本发明的多亚基蛋白的蛋白序列的异二聚体Fc融合蛋白具有比未融合到Fc结构域多肽的多亚基蛋白长至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的血清半衰期。
(i)肿瘤保留
本发明的异二聚体Fc融合蛋白可以任选地掺入另外的特征以增强蛋在肿瘤部位的保留。例如，在本发明的某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白进一步包含蛋白聚糖结合结构域、胶原结合结构域和/或透明质酸结合结构域。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白进一步包含蛋白聚糖结合结构域，该蛋白聚糖结合结构域结合一种或多种蛋白聚糖(例如，本领域已知的蛋白聚糖，例如的，如Lozzo等人,Matrix Bio[基质生物学](2015)42:11-55；和Nikitovic等人,Frontiers in Endocrinology[内分泌学前沿](2018)9:69中所披露的)，该一种或多种蛋白聚糖存在于肿瘤中(例如，肿瘤细胞表面上、肿瘤中的细胞周基质中或肿瘤中的细胞外基质中)。在某些实施例中，胶原结合结构域结合一种或多种存在于肿瘤中的胶原(例如，肿瘤细胞的表面上、肿瘤的细胞周基质中或肿瘤的细胞外基质中)。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白进一步包含与存在于肿瘤中的一种或多种透明质酸结合的h酸结合结构域。此类异二聚体Fc融合蛋白在肿瘤中具有增强的保留，并且可以以较低剂量和/或频率向受试者进行肿瘤内施用。
在某些实施例中，包含在异二聚体Fc融合蛋白中的蛋白聚糖结合结构域结合一种或多种在肿瘤中特异性表达的蛋白聚糖(例如，肿瘤细胞的表面上、肿瘤的细胞周基质中或肿瘤的细胞外基质中)。在某些实施例中，包含在异二聚体Fc融合蛋白中的胶原结合结构域结合一种或多种在肿瘤中特异性表达的胶原(例如，肿瘤细胞的表面上、肿瘤的细胞周基质中或肿瘤的细胞外基质中)。此类异二聚体Fc融合蛋白在施用(例如，静脉内、皮下或肺部施用)后可在肿瘤中富集并具有增强的肿瘤保留，从而允许以较低剂量和/或频率施用。
在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白进一步包含蛋白聚糖结合结构域，其结合一种或多种选自以下的蛋白聚糖：多配体聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、β蛋白聚糖、磷酸酶蛋白聚糖、磷脂酰肌醇聚糖、基底膜聚糖、集聚蛋白、胶原蛋白(例如，胶原蛋白IX、XII、XV、或XVIII)、透凝蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖、和小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)。与癌症有关的蛋白聚糖包括但不限于胶原蛋白、多配体聚糖(例如，多配体聚糖-1或多配体聚糖-2)、丝甘蛋白聚糖(serglycin)、CSPG4、β蛋白聚糖、磷脂酰肌醇聚糖(例如，磷脂酰肌醇聚糖-1或磷脂酰肌醇聚糖-3)、基底膜聚糖、多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、和SLPR(例如，核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、无孢蛋白、纤调蛋白聚糖(fibrodulin)、和光蛋白聚糖)。因此，在某些实施例中，包含在异二聚体Fc融合蛋白中的蛋白聚糖结合结构域结合一种或多种选自以下的蛋白聚糖：多配体聚糖(例如，多配体聚糖-1或多配体聚糖-2)、丝甘蛋白聚糖、CSPG4、β蛋白聚糖、磷脂酰肌醇聚糖(例如，磷脂酰肌醇聚糖-1或磷脂酰肌醇聚糖-3)、基底膜聚糖、多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、和SLPR。在某些实施例中，包含在异二聚体Fc融合蛋白中的蛋白聚糖结合结构域结合一种或多种选自核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、无孢蛋白、纤调蛋白聚糖和光蛋白聚糖的SLPR。
包含在异二聚体Fc融合蛋白中的蛋白聚糖结合结构域可以是蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、肽(例如，蛋白聚糖结合蛋白的一部分或其变体)、适体、小分子或其组合。蛋白聚糖结合结构域也是本领域已知的。例如，在以下中披露了多配体聚糖结合结构域：美国专利号6,566,489、8,647,828和10,124,038；美国专利申请公开号2009/0297479；和PCT专利申请公开号WO 2018199176 A1。在以下中披露了CSPG4结合结构域：美国专利号9,801,928和10,093,745；以及美国专利申请公开号2016/0032007、2017/0342151和2018/0072811。在以下中披露了β-聚糖结合结构域：美国专利号7,455,839。在以下中披露了磷脂酰肌醇聚糖结合结构域：美国专利号7,919,086、7,776,329、8,680,247、8,388,937、9,260,492、9,394,364、9,790,267、9,522,940和9,409,994；美国专利申请公开号2004/0236080、2011/0123998、2018/0244805、2018/0230230和2018/0346592；欧洲专利号2270509；以及PCT专利申请公开号WO 2017053619 A1、WO 2018026533 A1、WO 2018165344 A1和WO2018199318 A1。在以下中披露了基底膜聚糖结合结构域：美国专利号10,166,304。在以下中披露了核心蛋白聚糖结合结构域：美国专利号6,517,838和PCT专利申请公开号WO2000021989 A1、WO 2000077041 A2和WO 2000078800 A2。
在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白进一步包含胶原结合结构域。胶原蛋白是一类在脊椎动物中鉴定出的至少有28种不同类型的蛋白。每种类型的胶原蛋白都有其独特的结构特征和分布模式，如以下中所披露：Fang等人,Tumor Biol.[肿瘤生物学](2014)35:2871-82和Xiong等人,J.Cancer Metasta.Treat.[癌症转移与治疗杂志](2016)2:357-64。各种类型的胶原蛋白与癌症有关，包括但不限于Col3A1、Col5A2、Col6、Col7A1、Col15A1、Col19A1和Col22A1。胶原结合结构域可以是蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、肽(例如，胶原结合蛋白的一部分或其变体)、适体、小分子或其组合。胶原蛋白结合结构域在本领域已知，并且在以下中披露：例如，美国专利号5,788,966、5,587,360、5,851,794、5,741,670、5,849,701、6,288,214、6,387,663、6,908,994、7,169,902、7,488,792、7,820,401、8,956,612、8,642,728,和8,906,649和美国专利申请出版号2007/0161062、2009/0142345和2012/0100106。
在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白进一步包含透明质酸结合结构域。透明质酸结合结构域可以是蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、肽(例如，透明质酸结合蛋白的一部分或其变体)、适体、小分子或其组合。透明质酸结合结构域是本领域已知的，并且在例如美国专利号6,864,235、8,192,744、8,044,022、8,163,498、8,034,630、9,217,016、9,795,686和9,751,919号以及美国专利申请公开号2002/0055488和2007/0259380中披露。
蛋白聚糖结合结构域、胶原结合结构域和/或透明质酸结合结构域，如果存在的话，可以在异二聚体Fc融合蛋白的任何位置。例如，在IL-12亚基位于抗体Fc结构域多肽的N末端的某些实施例中，本文披露的蛋白聚糖结合结构域、胶原结合结构域和/或透明质酸结合结构域可以融合至第一抗体Fc结构域多肽的C末端和/或第二抗体Fc结构域多肽的C末端。在IL-12亚基位于抗体Fc结构域多肽的C末端的某些实施例中，本文披露的蛋白聚糖结合结构域、胶原结合结构域和/或透明质酸结合结构域可以融合至第一抗体Fc结构域多肽的N末端和/或第二抗体Fc结构域多肽的N末端。
蛋白聚糖结合结构域、胶原结合结构域和/或透明质酸结合结构域，如果存在的话，可以通过接头与异二聚体Fc融合蛋白的其余部分融合。在某些实施例中，蛋白聚糖结合结构域通过肽接头与异二聚体Fc融合蛋白的其余部分融合。在某些实施例中，肽接头包括本文披露的间隔子肽。
示例性异二聚体Fc融合蛋白
在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二多肽。在某些实施例中，包含SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291的本发明的异二聚体Fc融合蛋白在第一抗体Fc结构域多肽的CH3结构域中包含Y349C突变并且在第二抗体Fc结构域多肽的CH3结构域中包含S354C突变。在某些实施例中，包含SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291的本发明的异二聚体Fc融合蛋白在各自的Fc结构域多肽序列中包含不同的突变以促进Fc结构域之间的异源二聚化。
在某些实施例中，第一多肽序列包含含有K360E和K409W取代的第一抗体Fc结构域多肽(人IgG1)序列。在某些实施例中，第二多肽序列包含含有Q347R、D399V和F405T取代的第二抗体Fc结构域多肽(人IgG1)序列。在某些实施例中，第一多肽和第二多肽氨基酸序列包含一个或多个用于降低效应子功能的突变。在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白包含L234A、L235A和P329A突变。
在某些实施例中，在本发明的异二聚体Fc融合蛋白的第一多肽(SEQ ID NO:290)中，人IL-12的p40亚单位通过包含第一氨基酸序列的第一接头与第一抗体Fc结构域多肽融合，并且在本发明的异二聚体Fc融合蛋白的第二多肽(SEQ ID NO:291)中，人IL-12的p35亚单位通过包含第二氨基酸序列的第二接头与第二抗体Fc结构域多肽融合。
SEQ ID NO:290是与人IgG1 Fc结构域多肽融合的人IL-12的p40亚基的序列(下划线氨基酸)。突变以粗体显示。
Figure BDA0003996373120000961
SEQ ID NO:291是与人IgG1 Fc结构域多肽融合的人IL-12的p35亚基的序列(下划线氨基酸)。突变以粗体显示。
Figure BDA0003996373120000962
Figure BDA0003996373120000971
由氨基酸序列SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291分别表示的第一和第二多肽由于在SEQ ID NO:290中的第一抗体Fc结构域多肽序列(人IgG1)的CH3结构域中的Y349C突变(粗体且下划线)和在SEQ ID NO:291中的第二抗体Fc结构域多肽序列(人IgG1)的CH3结构域中的S354C突变(粗体且下划线)而形成二硫键，其赋予异二聚体Fc-融合蛋白稳定性(Fc编号根据EU系统)。
为了促进异二聚体Fc融合蛋白的两个Fc结构域多肽之间的异源二聚化，SEQ IDNO:290中的第一抗体Fc结构域多肽序列(人IgG1)在CH3结构域中包括K360E和K409W取代，并且SEQ ID NO:291中的第二不同Fc结构域多肽序列(人IgG1)结构域包括CH3结构域中的Q347R、D399V和F405T取代(根据EU系统的Fc编号)。
SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291中的第一抗体Fc结构域多肽序列和第二不同Fc结构域多肽序列(人IgG1)还包括L234A、L235A和P329A(LALAPA)突变，以降低效应子功能。
这种异二聚体Fc融合蛋白在本文中称为DF-hIL-12-Fc si。
(j)制备方法和生产方法
本发明的蛋白可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备。例如，可将编码第一多肽的第一核酸序列克隆到第一表达载体中，该第一多肽包含与第一抗体Fc结构域多肽融合的多亚基蛋白序列的第一亚基；可将编码第二多肽的第二核酸序列克隆到第二表达载体中，该第二多肽包含与第二抗体Fc结构域多肽融合的多亚基蛋白序列的第二不同亚基；并且该第一和第二表达载体可以一起稳定转染到宿主细胞中，产生多聚体蛋白。
为了实现蛋白的最高产量，可以探索第一和第二表达载体的不同比例以确定转染到宿主细胞中的最佳比例。转染后，可以使用本领域已知的方法，例如有限稀释、ELISA、FACS、显微镜检查或Clonepix，分离单克隆用于细胞库生成。
可以在适合生物反应器扩大和维持本发明蛋白表达的条件下培养克隆。可以使用本领域已知的方法分离和纯化蛋白，包括离心、深度过滤、细胞裂解、均化、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用交换色谱和混合模式色谱。
(i)原料药制备
在一些实施例中，本披露的异二聚体Fc融合蛋白，例如DF hIL12-Fc si，在真核细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。在某些实施例中，本披露的异二聚体Fc融合蛋白，例如DF hIL12-Fc si，在悬浮培养中的CHO细胞中产生(例如，在摇瓶中)。在某些实施例中，在产生蛋白之前将小瓶的CHO细胞解冻并传代超过一次(例如，两次，三次，四次，五次，六次)。在某些实施例中，在产生蛋白之前将小瓶的CHO细胞解冻并传代四次。在某些实施例中，来自第四代的CHO细胞用于接种第一生物反应器中的培养物。在某些实施例中，第一生物反应器具有约40L、约45L、约50L、约55L或约60L的体积。在某些实施例中，第一生物反应器具有约50L的体积。在某些实施例中，来自第一生物反应器的培养物的CHO细胞用于接种生产生物反应器中的培养物。在某些实施例中，生产生物反应器具有约180L、约185L、约190L、约195L、约200L、约205L、约210L、约215L或约220L的体积。在一些实施例中，生产生物反应器中的最终培养体积为约180L。在某些实施例中，CHO细胞在补充有L-谷氨酰胺(例如，6mM L-谷氨酰胺)的生长培养基中生长。在某些实施例中，CHO细胞在约37℃的温度下生长。在某些实施例中，每天监测培养条件(例如，对于葡萄糖，对于乳酸，对于pH)。
在一些实施例中，生产生物反应器通过补充空气和氧气来调节培养物中的溶解氧。在一些实施例中，生产生物反应器通过添加二氧化碳气体和/或碳酸钠碱来调节pH。在一些实施例中，每天对生产生物反应器进行细胞密度和活力采样，直到达到目标细胞活力。在某些实施例中，靶细胞活力为约10x106个活细胞/mL、约11x106个活细胞/mL、约12x106个活细胞/mL、约13x106个活细胞/mL、约14x106个活细胞/mL、约15x106个活细胞/mL、约16x106个活细胞/mL、约17x106个活细胞/mL、约18x106个活细胞/mL、约19x106个活细胞/mL、或约20x106个活细胞/mL。在某些实施例中，靶细胞活力大于约14×106个活细胞/mL。在某些实施例中，在达到目标细胞活力后，温度从约37℃转移至约33℃以用于培养物收获。在某些实施例中，当活力高于约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％，约90％时，收获培养物。在某些实施例中，当活力高于约85％时收获培养物。在某些实施例中，在培养期间每天监测培养条件(例如，针对葡萄糖，针对乳酸，针对pH)。在某些实施例中，从大约第8天开始(例如，第6天、第7天、第8天、第9天或第10天)，监测培养物中的DF hIL12-Fc si滴度。在某些实施例中，培养物补充有浓缩营养补料、浓缩葡萄糖溶液和/或消泡剂。在一些实施例中，将细胞培养约7-约21天、约8-约20天、约9-约19天、约10-约18天、约11-约17天、约12-约16天、或约11-约15天。在某些实施例中，将细胞培养约14天。
在一些实施例中，生产生物反应器在纯化本披露的蛋白(例如，DF hIL12-Fc si)之前通过深度过滤澄清。在某些实施例中，由DOHC和XOHC过滤器组成的两级一次性深度过滤系统用于澄清。在某些实施例中，在过滤之前，将生产生物反应器温度调节至约18℃并且将溶解氧设定点提高至约70％饱和度。在某些实施例中，将洗收获过滤器用注射用水(WFI)冲，然后用缓冲液平衡。在一些实施例中，使用蠕动泵使细胞悬浮液通过收获过滤器并且冲洗过滤器以收集产物。在某些实施例中，监测压力并将其维持在约小于25psig(例如，约小于25psig、约小于20psig或约小于15psig)。然后将滤液通过0.45/0.2μm膜过滤到储存中，例如无菌袋中。
在一些实施例中，本披露的异二聚体Fc融合蛋白(例如DF hIL12-Fc si)的纯化包括三个色谱步骤和两个病毒清除步骤或由其组成。在某些实施例中，三个色谱步骤包括以下或由以下组成：蛋白A捕获色谱、混合模式色谱和阳离子交换色谱。在某些实施例中，通过蛋白A捕获色谱(例如，使用蛋白A树脂柱)捕获包含本披露的异二聚体Fc融合蛋白(例如DFhIL12-Fc si)的澄清的收获物。在某些实施例中，蛋白A捕获色谱去除工艺相关杂质(例如，DNA、宿主细胞蛋白)、培养基添加剂，并允许体积减少。在某些实施例中，首先用包含20mMTris、150mM NaCl的缓冲液(pH约7.5)平衡蛋白A树脂柱。在某些实施例中，在加载后，将柱用平衡缓冲液洗涤以去除未结合或松散结合的杂质，在某些实施例中，在第一次洗涤后，将柱用包含50mM乙酸盐的缓冲液(pH约5.4)进行第二次洗涤。在某些实施例中，第二次洗涤降低了pH并使柱为洗脱做准备。在某些实施例中，将DF hIL12-Fc si用包含50mM乙酸盐、100mM精氨酸的缓冲液(pH约3.7)洗脱。在某些实施例中，通过280nm UV波长(从1.25AU/cm上升开始并且然后在1.25AU/cm下降结束)收集DF hIL12-Fc si。在某些实施例中，将洗脱液收集在一个池中，并且每个柱循环单独通过低pH病毒灭活处理。
在某些实施例中，病毒清除步骤包括低pH灭活和纳米过滤。在某些实施例中，将蛋白A洗脱液在低pH孵育以使潜在存在的病毒失活。在某些实施例中，洗脱液的pH用乙酸调节，例如0.5M乙酸，并孵育至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少65分钟、至少70分钟、至少75分钟、至少80分钟、至少85分钟或至少90分钟。在某些实施例中，洗脱液的pH用乙酸调节，例如0.5M乙酸，并孵育至少60分钟。在某些实施例中，乙酸将pH调节至约3.55至3.75，例如，约3.60至3.70，或约3.65。在某些实施例中，乙酸将pH调节至约3.65。在某些实施例中，在低pH孵育后，pH升高，例如，在Tris碱基情况下，例如，在2M Tris碱情况下。在某些实施例中，将pH升高至约5.1、约5.2或约5.3的中和pH。在某些实施例中，通过0.2μm过滤组件过滤A蛋白洗脱液。在某些实施例中，低pH灭活在纳米过滤之前。在某些实施例中，纳米过滤在低pH灭活之前。
在一些实施例中，在病毒清除步骤之后，将池通过中间深度过滤器过滤，例如X0SP中间深度过滤器。在某些实施例中，DF hIL12-Fc si在约500-约1000g/m2(例如，约400-约1100g/m2、约450-约1050g/m2、约500-约1000g/m2)的范围内。在某些实施例中，在混合模式色谱之前，用乙酸盐例如pH约5.2的50mM乙酸盐将X0SP池电导率调节至小于6.0mS/cm。
在一些实施例中，进行混合模式色谱以去除高分子量(HMW)种类。在某些实施例中，将柱例如使用包含50mM乙酸盐的缓冲液(pH约5.2)进行平衡，并进行加载。在某些实施例中，在加载后，例如用包含50mM乙酸盐和250mM NaCl的缓冲液(pH约5.2)洗涤柱。在某些实施例中，通过280nm UV检测(在0.625AU/cm上升开始并在1.50AU/cm下降结束)启始收集。在某些实施例中，在收集之后，每个循环通过包含末端0.2μm过滤器的过滤器列。
在一些实施例中，进行阳离子交换色谱以去除与产物相关的杂质(例如，HMW种类、低分子量(LMW)种类)和与工艺相关的杂质。在一些实施例中，对每个产物批次进行多个阳离子交换色谱循环(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个循环)。在某些实施例中，将循环合并并例如用包含50mM Tris的缓冲液(pH 7.4)稀释。在某些实施例中，使用碱溶液(例如Tris，例如2MTris碱)将合并的样品调节至约7.3、约7.4、约7.5、约7.6或约7.7的pH。在某些实施例中，将合并的样品调节至约7.5的pH。在某些实施例中，将柱用包含50mM Tris的缓冲液(pH 7.4)平衡。在某些实施例中，洗脱包括pH约7.4的50mM Tris(缓冲液A)和pH约7.4的50mM Tris和0.5M NaCl(缓冲液B)的梯度。在某些实施例中，通过280nm UV检测(在2.5AU/cm上升开始并在4.5AU/cm下降结束)启始产物收集。在某些实施例中，在收集之后，每个循环通过包含末端0.2μm过滤器的过滤器列。
在一些实施例中，来自阳离子交换色谱的循环的纳米过滤去除病毒。在某些实施例中，洗脱液首先通过预过滤器和标称过滤器(例如，约20nm的标称过滤器)。在某些实施例中，将系统用缓冲液(例如包含50mM Tris和265mM NaCl的缓冲液(pH约7.4))进行平衡。在某些实施例中，加载后，将系统用平衡缓冲液(例如，包含50mM Tris和265mM NaCl的缓冲液(pH约7.4))进行冲洗。在某些实施例中，将滤液通过膜(例如0.2μm膜)进行过滤。
在一些实施例中，滤液经历超滤和渗滤(UF/DF)。在某些实施例中，使用约20kDa、约25kDa、约30kDa、约35kDa或约40kDa的分子量截止膜进行超滤和渗滤。在某些实施例中，使用约30kDa的分子量截止膜进行超滤和渗滤。在某些实施例中，将系统用缓冲液(例如包含50mM Tris和265mM NaCl的缓冲液(pH约7.4))进行平衡。在某些实施例中，将病毒滤液池浓缩至约5.0g/L的目标。在某些实施例中，用至少7个渗滤体积(例如，7、8或9个渗滤体积)的包含20mM柠檬酸盐的缓冲液(pH约6.5)进行缓冲液交换。在一些实施例中，在渗滤之后，进行第二浓缩步骤以达到约11.0g/L的目标。在某些实施例中，将产物在渗滤缓冲液中稀释至约7.5g/L的最终目标浓度。
在一些实施例中，将20mM柠檬酸盐、18％(w/v)蔗糖、3％(w/v)甘露醇、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80储备溶液(pH 6.5)掺入到UF/DF池中以达到20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的最终浓度。
在某些实施例中，将配制的截留物过滤，例如通过0.2μm膜，进入最终的原料药储存器皿。在某些实施例中，最终填充灌装为约1.0L。在某些实施例中，最终原料药储存器皿包括具有聚丙烯封盖的2L聚碳酸酯瓶。在某些实施例中，每个瓶子都经无菌取样，贴标签，并在低于-65℃(例如，-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、或更低)的温度冷冻。
(ii)药物产品制备
在一些实施例中，包含本披露的异二聚体Fc融合蛋白的冷冻原料药，例如，DFhIL12-Fc si在约2-8℃在黑暗中融化超过96小时(例如，96小时、120小时、144小时、168小时、或更多)。在某些实施例中，制备由20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇、0.01％聚山梨醇酯80(w/v)组成的缓冲液(pH 6.0)。在某些实施例中，通过将固体柠檬酸钠二水合物、柠檬酸一水合物、蔗糖和甘露醇添加到注射用水(WFI)中并混合直至溶解来制备缓冲液。在某些实施例中，药物产品中的柠檬酸盐包含固体柠檬酸钠二水合物和/或柠檬酸一水合物或由其组成。在一些实施例中，聚山梨醇酯80储备溶液在WFI中制备并添加到缓冲液中。在某些实施例中，缓冲液的可接受pH为约6.5±0.4(例如，pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8或pH 6.9)。在某些实施例中，将缓冲液用WFI稀释并测试其可接受pH为约6.5±0.4(例如，pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH6.7、pH 6.8或pH 6.9)并测试渗透压。在某些实施例中，将缓冲液通过膜(例如0.2μm膜)进行过滤。
在一些实施例中，原料药的重量用于计算目标批次体积。在某些实施例中，将原料药添加到大玻璃瓶(例如，10L大玻璃瓶)中的缓冲液中至计算的批次体积的约80％并混合。在某些实施例中，测试该80％药物产品溶液的可接受pH为约6.5±0.3(例如，pH 6.2、pH6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7或pH 6.8)。在某些实施例中，使用1.44L/(g*cm)的消光系数通过在280nm处的吸光度测试该80％药物产品溶液的蛋白浓度。
在一些实施例中，缓冲液组分被设计成产生约6.5的pH。在某些实施例中，在缓冲液步骤中，可以使用1N氢氧化钠或1N盐酸进行滴定以使pH在约6.5±0.4(例如，pH 6.1、pH6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8或pH 6.9)的可接受pH内。在某些实施例中，在80％批量药物产品步骤中，可以使用1N氢氧化钠或1N盐酸进行滴定以使pH在约6.5±0.3(例如，pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7或pH 6.8)的可接受pH内。
在一些实施例中，本披露的异二聚体Fc融合蛋白(例如DF hIL12-Fc si)的目标浓度为约1mg/mL。在一些实施例中，通过280nm处的吸光度验证蛋白浓度，接受标准为1.0±0.2mg/mL(例如，0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL)。在一些实施例中，取样以确认约6.5±0.3(例如，pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7或pH 6.8)的可接受pH和渗透压。
在一些实施例中，使复合的批量药物产品溶液通过过滤器，例如，无菌的0.2μm过滤器，进入大玻璃瓶，例如，10L大玻璃瓶，用于减少生物负载，并保持至无菌过滤和灌装。
在一些实施例中，批量药物产品通过两个串联的过滤器胶囊过滤，每个过滤器胶囊由0.45μm聚醚砜(PES)预过滤膜和0.2μm PES灭菌膜组成。在某些实施例中，药物产品被过滤到灌装套件的受控B级区域内的无菌一次性灌装袋中。在某些实施例中，使用WFI在过滤后通过泡点测试两个除菌过滤器胶囊的完整性，接受标准大于3200mbar。
在一些实施例中，批量药物产品溶液从直接位于限制进入屏障系统(RABS)外部的一次性袋中灌装。在某些实施例中，将产品灌装到小瓶中，例如即用型2R硼硅酸盐I型小瓶。
在某些实施例中，小瓶是加塞的，例如用灭菌的13mm血清塞并用13mm铝外封盖盖住。在某些实施例中，小瓶的灌装体积为1.3mL±5％(即，从1.235mL到1.365mL)。在某些实施例中，将小瓶移至2-8℃储存。在某些实施例中，小瓶在2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃储存。
(k)药物配制品
本披露的特征还在于含有有效量的本文所述蛋白的药物组合物。可以配制组合物用于多种药物递送系统。一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载剂也可以包含在组合物中以用于适当的配制。如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到配制品中以提供所期望物理或化学特性(例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放、吸附或渗透的速率)的任何非治疗剂。
(i)赋形剂和pH
本发明药物配制品中的一种或多种赋形剂包含缓冲剂。如本文所用，术语“缓冲剂”是指当添加到水溶液中时能够保护溶液在添加酸或碱时或在用溶剂稀释时免受pH变化的一种或多种组分。除了磷酸盐缓冲液之外，还可以使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、组氨酸缓冲液等，在这种情况下，钠、钾或铵离子可以用作抗衡离子。
在某些实施例中，缓冲液或缓冲液系统包含至少一种缓冲液，其缓冲范围与pH5.5-7.4的范围完全或部分重叠。在某些实施例中，缓冲液具有约6.5±0.5的pKa。在某些实施例中，缓冲液包含柠檬酸盐缓冲液。在具体实施例中，柠檬酸盐缓冲液包含柠檬酸钠二水合物和柠檬酸一水合物。在某些实施例中，柠檬酸盐以约5至约100mM、约10至约100mM、约15至约100mM、约20至约100mM、约5至约50mM、约10至约50mM、约15至约100mM、约20至约100mM、约5至约25mM、约10至约25mM、约15至约25mM、约20至约25mM、约5至约20mM、约10至约20mM或约15至约20mM的浓度存在。在某些实施例中，柠檬酸盐以约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约50mM的浓度存在。在某些实施例中，柠檬酸盐以20mM的浓度存在。
本发明的药物配制品可以具有6.0至7.0的pH。例如，在某些实施例中，药物配制品具有6.0至7.0(即6.5±0.5)、6.1至6.9(即6.5±0.4)、6.2至6.8(即6.5±0.3)、6.3至6.7(即6.5±0.2)、6.4至6.6(即6.5±0.1)、或6.45至6.65(即6.5±0.05)的pH。在某些实施例中，药物配制品具有约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、或约7.0的pH。在某些实施例中，药物配制品具有6.5的pH。在科学四舍五入的规则下，大于等于6.45且小于等于6.55的pH四舍五入为6.0。
在某些实施例中，药物配制品的缓冲系统包含10至25mM的柠檬酸盐(pH 6.5±0.2)。在某些实施例中，药物配制品的缓冲系统包含20mM的柠檬酸盐(pH 6.5±0.2)。在某些实施例中，药物配制品的缓冲系统包含10至25mM的柠檬酸盐(pH 6.5±0.05)。在某些实施例中，药物配制品的缓冲系统包含20mM的柠檬酸盐(pH 6.5±0.05)。
本发明药物配制品中的一种或多种赋形剂进一步包含糖或糖醇。糖和糖醇可作为热稳定剂用于药物配制品中。在某些实施例中，药物配制品包含糖，例如，单糖(例如葡萄糖、木糖或赤藓糖醇)、二糖(例如蔗糖、海藻糖、麦芽糖、或半乳糖)，或寡糖(例如，水苏糖)。在具体实施例中，药物配制品包含蔗糖。在某些实施例中，药物配制品包含糖醇，例如衍生自单糖的糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇或木糖醇)、衍生自二糖的糖醇(例如，乳糖醇或麦芽糖醇)，或衍生自寡糖的糖醇。在具体实施例中，药物配制品包含甘露醇。
配制品中所含的糖或糖醇的量可以根据使用配制品的具体情况和预期目的而变化。在某些实施例中，药物配制品包含0％w/v-约12％w/v、约1％w/v-约11％w/v、约2％w/v-约10％w/v、约3％w/v-约9％w/v、约3％w/v-约12％w/v、约4％w/v-约8％w/v、或约5％w/v-约7％w/v的糖或糖醇。在某些实施例中，药物配制品包含0％w/v-约2％w/v、约0.5％w/v-约1.5％w/v、约0.6％w/v-约1.4％w/v、约0.7％w/v-约1.3％w/v、约0.8％w/v-约1.2％w/v、或约0.9％w/v-约1.1％w/v的糖或糖醇。在某些实施例中，药物配制品包含约0％w/v、约0.5％w/v、约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v、或约10％w/v的糖或糖醇。在具体实施例中，药物配制品包含约6％w/v的糖或糖醇(例如蔗糖)。在具体实施例中，药物配制品包含约1％w/v的糖或糖醇(例如甘露醇)。在具体实施例中，药物配制品包含约6％w/v的糖或糖醇(例如，蔗糖)和约1％w/v的第二糖或糖醇(例如，甘露醇)。
本文披露的药物配制品中的一种或多种赋形剂进一步包含表面活性剂。如本文所用，术语“表面活性剂”是指同时包含疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基和羧酸酯基团)的表面活性分子。表面活性剂可用于药物配制品中以减少治疗性蛋白的聚集。适用于药物配制品中的表面活性剂通常是非离子表面活性剂并且包括但不限于聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；脱水山梨糖醇酯和衍生物；Triton；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂酰基-、肉豆蔻基-、亚油酰基-或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂酰基-、肉豆蔻基-、亚油酰基-或硬脂酰基-肌氨酸；亚油酰基、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基-牛磺酸钠或甲基油烯基牛磺酸二钠；以及MONAQUATTM系列(莫纳工业公司(Mona Industries,Inc.)，帕特森市(Paterson)，新泽西州)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇与丙二醇的共聚物(例如普郎尼克，PF68等)。在某些实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯。在某些实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
本发明的药物配制品中所含的非离子表面活性剂的量可以根据配制品所期望的具体特性以及配制品预期使用的特定环境和目的而变化。在某些实施例中，药物配制品包含0.005％至约0.5％、约0.005％至约0.2％、约0.005％至约0.1％、约0.005％至约0.05％、约0.005％至约0.02％、约0.005％至约0.01％、约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.1％、约0.01％至约0.05％、或约0.01％至约0.02％的非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)。在某些实施例中，药物配制品包含约0.005％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、或约0.5％的非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)。
本发明的药物配制品还可包含一种或多种其他物质，例如填充剂或防腐剂。“填充剂”是向冻干混合物增加质量并有助于冻干饼的物理结构的化合物(例如，有助于生产保持开孔结构的基本均匀的冻干饼)。说明性填充剂包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干配制品可以含有这样的填充剂。防腐剂可减少细菌作用并且例如，可以促进多用途(多剂量)配制品的生产。
(ii)示例性配制品
在某些实施例中，本发明的药物配制品包含异二聚体Fc融合蛋白、柠檬酸盐、糖(例如蔗糖)、糖醇(例如甘露醇)，和聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)，pH为6.0至7.0。
在某些实施例中，药物配制品包含0.5至1.5mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白、10至30mM的柠檬酸盐、4％w/v至8％w/v的糖(例如，蔗糖)、0.5％w/v至1.5％w/v的糖醇(例如，甘露醇)和0.005％至0.05％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为6.5至7.5。在某些实施例中，药物配制品包含0.5至1.5mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白、20mM的柠檬酸盐、6％w/v的糖(例如，蔗糖)、0.5％w/v至1.5％w/v的糖醇(例如，甘露醇)和0.01％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为6.0至7.0。在某些实施例中，药物配制品包含0.5至1.5mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白、20mM的柠檬酸盐、6％w/v的糖(例如，蔗糖)、1％w/v的糖醇(例如，甘露醇)和0.01％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为6.3至6.7。在某些实施例中，药物配制品包含0.5至1.5mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白、20mM的柠檬酸盐、6％w/v的糖(例如，蔗糖)、1％w/v的糖醇(例如，甘露醇)和0.01％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为6.45至6.55。
(iii)异二聚体Fc融合蛋白和配制品的稳定性
本发明的药物配制品表现出高水平的稳定性。当配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在规定条件下储存后保持可接受程度的物理特性、化学结构和/或生物学功能时，药物配制品是稳定的。在某些实施例中，药物配制品是透明液体，不含可见颗粒。在某些实施例中，在5℃、50℃和冻融循环后(例如，5个冻融循环)测试热稳定性。
稳定性可以通过确定配制品中异二聚体Fc融合蛋白在规定温度下储存规定时间后保持天然构象的百分比来测量。天然构象的蛋白的百分比可以通过例如尺寸排阻色谱(例如，尺寸排阻高效液相色谱，SEC-HPLC)来确定，其中天然构象的蛋白不聚集(在高分子量级分中洗脱)或降解(在低分子量级分中洗脱)。在某些实施例中，在2-8℃孵育2周后，多于约95％、多于约96％、多于约97％、多于约98％或多于约99％的异二聚体Fc融合蛋白具有天然构象，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在冻融后，多于约95％、多于约96％、多于约97％、多于约98％或多于约99％的异二聚体Fc融合蛋白具有天然构象，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在50℃孵育2周后，多于约75％、多于约76％、多于约77％、多于约78％、多于约79％、多于约80％、多于约81％、多于约82％、多于约83％、多于约84％或多于约85％的异二聚体Fc融合蛋白具有天然构象，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在2-8℃孵育2周后，少于约0.5％、少于约0.6％、少于约0.7％、少于约0.8％、少于约0.9％或少于约1％的异二聚体Fc融合蛋白形成高分子量复合物(即，具有比天然蛋白更高的分子量)，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在50℃孵育2周后，少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的异二聚体Fc融合蛋白形成高分子量复合物(即，具有比天然蛋白更高的分子量)，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在冻融后，少于约0.5％、少于约0.6％、少于约0.7％、少于约0.8％、少于约0.9％或少于约1％的异二聚体Fc融合蛋白形成高分子量复合物(即，具有比天然蛋白更高的分子量)，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在2-8℃孵育2周后，少于约0.1％、少于约0.2％、少于约0.3％、少于约0.4％、少于约0.5％、少于约0.6％、少于约0.7％、少于约0.8％、少于约0.9％或少于约1％的异二聚体Fc融合蛋白被降解(即，分子量低于天然蛋白)，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在50℃孵育2周后，少于约1％、少于约1.5％、少于约2％、少于约2.5％或少于约3％的异二聚体Fc融合蛋白被降解(即，具有比天然蛋白更低的分子量)，如通过尺寸排阻色谱测定。在某些实施例中，在冻融后，少于约0.1％、少于约0.2％、少于约0.3％、少于约0.4％、少于约0.5％、少于约0.6％、少于约0.7％、少于约0.8％、少于约0.9％或少于约1％的异二聚体Fc融合蛋白被降解(即，分子量低于天然蛋白)，如通过尺寸排阻色谱测定。
SEC-HPLC可以提供通过主峰中蛋白(例如异二聚体Fc融合蛋白)的百分比对药物配制品的纯度的衡量。纯度谱由SEC-HPLC分析中主峰面积占总检测面积的百分比确定。在一些实施例中，药物配制品的纯度谱大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％、或大于约99％。在某些实施例中，药物配制品的纯度谱为约99.0％。在一些实施例中，药物配制品的纯度谱在药物配制品在50℃孵育2周后大于约75％、大于约80％、大于约81％、大于约82％、大于约83％、大于约84％或大于约85％。在某些实施例中，药物配制品的纯度谱为约85.2％。在一些实施例中，在药物配制品经受五个冻融循环之后，药物配制品的纯度谱大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约98.5％。在某些实施例中，药物配制品的纯度谱为约98.9％。
稳定性也可以通过动态光散射确定蛋白溶液的参数来测量。Z平均值和多分散性指数(PDI)值表示溶液中颗粒的平均直径，当溶液中存在聚集体时，这些测量值会增加。单体％Pd值表示检测到的不同单体的扩散，其中较低的值表示单分散溶液，这是优选的。DLS检测到的单体尺寸可用于确认主要群体是单体并表征可能存在的任何更高阶聚集体。在某些实施例中，药物配制品的Z平均值在2-8℃孵育2周后增加不超过5％、10％或15％。在某些实施例中，药物配制品的Z平均值在冻融后增加不超过2倍、3倍、4倍或5倍。在某些实施例中，药物配制品的Z平均值在50℃孵育2周后增加不超过约10％、不超过约20％、不超过约30％、不超过约40％、不超过约50％、不超过约60％、不超过约70％、不超过约80％、不超过约90％、不超过约100％、不超过约150％或不超过约200％。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有小于约15nm、小于约14nm、小于约13nm或小于约12nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在具体实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有小于约11.6nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在药物配制品在50℃孵育2周后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm、小于约16nm、小于约15.5、小于约15nm或小于约14.5的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在具体实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约14.4nm的Z-平均流体动力学直径。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白在药物配制品经受五个冻融循环后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm、小于约16.5nm、小于约16nm或小于约15.5nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白具有约15.3nm的Z-平均流体动力学直径。
在某些实施例中，药物配制品的PDI值在2-8℃孵育2周后增加不超过约2倍、约3倍、约4倍或约5倍。在某些实施例中，药物配制品的PDI值在冻融后增加不超过约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约6倍。在某些实施例中，药物配制品的PDI值在50℃孵育2周后增加不超过约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约6倍。在一些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28、小于约0.27、小于约0.26或小于约0.25，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.26。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在药物配制品在50℃孵育2周后小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28、小于约0.27或小于约0.26，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中的异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.25。在一些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在药物配制品经受五个冻融循环后小于约0.40、小于约0.35、或小于约0.34，如在25℃通过动态光散射测量。在某些实施例中，药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.33。
也可以通过差示扫描荧光法(DSF)确定蛋白溶液的热稳定性来测量稳定性。DSF允许量化蛋白在不同测试条件(例如，缓冲液或pH)下的热变性温度和稳定性的变化。在一些实施例中，DSF提供两个热解折叠温度(也称为解链温度)，Tm1和Tm2。在某些实施例中，药物配制品的Tm1大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃或大于约66℃。在某些实施例中，药物配制品的Tm1大于约70℃、大于约71℃、大于约72℃、大于约73℃、大于约74℃、大于约75℃、大于约76℃或大于约77℃。在具体实施例中，药物配制品具有由约67.0℃的Tm1和约77.3℃的Tm2定义的热稳定性谱。在某些实施例中，当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比，Tm1和/或Tm2变化小于2℃、小于1.5℃、小于1℃。在具体实施例中，当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比，Tm1的变化小于1℃。在具体实施例中，当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比，Tm2的变化小于1℃。
在一些实施例中，DSF提供蛋白聚集开始发生的温度，Tagg。在一些实施例中，药物配制品的Tagg大于60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、大于约66℃，或大于约67℃。在某些实施例中，当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比，Tagg变化小于约2℃、小于1.5℃或小于约1℃。在某些实施例中，当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比，Tagg变化小于约2℃、小于约1.5℃或小于约1℃。在某些实施例中，当药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比，Tagg变化小于约1℃。
在一些实施例中，pH用于确定药物配制品的稳定性。在一些实施例中，药物配制品在5℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.25、约0.2、约0.15或约0.1。在某些实施例中，药物配制品在5℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。在一些实施例中，药物配制品在50℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.25、约0.2、约0.15或约0.1。在某些实施例中，药物配制品在50℃孵育1周后，药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
在本披露的实例24中描述了确定药物配制品中异二聚体Fc融合蛋白的稳定性的示例性方法。
(iv)剂型
药物配制品可以作为液体配制品或冻干形式制备和储存。在某些实施例中，药物配制品是透明无色溶液，不含可见颗粒。在某些实施例中，药物配制品是用于在2℃-8℃(例如，4℃)储存的液体配制品、用于在-20℃或更低储存的冷冻配制品、或在-65℃或更低储存的冷冻配制品。配制品中的糖和/或糖醇用作冻干保护剂。
在药物使用之前，药物配制品可以在适合施用途径的水性载剂中稀释或重构。其他示例性载剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。例如，当制备用于施用的药物配制品时，可以将药物配制品在0.9％氯化钠(NaCl)溶液中稀释。在具体实施例中，将药物配制品在包含0.01％聚山梨醇酯80的0.9％氯化钠(NaCl)溶液中稀释。在某些实施例中，稀释的药物配制品是等渗的并且适合通过皮下注射施用。
药物配制品包含浓度适合储存的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含浓度为约0.1-约2mg/mL、约0.2-约1.8mg/mL、约0.3-约1.7mg/mL、约0.4-约1.6mg/mL、约0.5-约1.5mg/mL、约0.6-约1.4mg/mL、约0.7-约1.3mg/mL、约0.8-约1.2mg/mL、或约0.9-约1.1mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含浓度为0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、或约10mg/mL的异二聚体Fc融合蛋白。
在某些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约1g/L至约10g/L、约2g/L至约8g/L、约4g/L至约6g/升，或约5g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含体积浓度为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L或约10g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在具体实施例中，药物配制品包含体积浓度为约5g/L的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含的用于施用的异二聚体Fc融合蛋白的浓度为约0.5g/L-约2g/L、约0.75g/L-约1.5g/L、或约0.9g/L-约1.1g/L。在某些实施例中，药物配制品包含的用于施用的异二聚体Fc融合蛋白的浓度为约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1g/L、约1.1g/L、约1.2g/L、约1.3g/L、约1.4g/L、约1.5g/L或约2g/L。在具体实施例中，药物配制品包含的用于施用的异二聚体Fc融合蛋白的浓度为约1g/L。
在某些实施例中，药物配制品包装在器皿(例如，小瓶、袋子、笔或注射器)中。在某些实施例中，配制品可以是冻干配制品或液体配制品。在某些实施例中，器皿中异二聚体Fc融合蛋白的量适合作为单剂量施用。在某些实施例中，器皿中异二聚体Fc融合蛋白的量适合以多剂量施用。在某些实施例中，药物配制品包含约0.1至约10mg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含约0-约2mg、约0.2-约1.8mg、约0.3-约1.7mg、约0.4-约1.6mg、约0.5-约1.5mg、约0.6-约1.4mg、约0.7-约1.3mg、约0.8-约1.2mg、或约0.9-约1.1mg量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，药物配制品包含约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、或约10mg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在具体实施例中，药物配制品包含约为1mg的量的异二聚体Fc融合蛋白，例如，DF-hIL-12-Fc si。
(l)剂量方案和治疗用途
在另一个方面，本披露提供了一种用于治疗癌症的方法，该方法包括在初始三周治疗周期中在第1天向有需要的受试者施用本文披露的异二聚体Fc融合蛋白(例如，DF-hIL-12-Fc si)。在某些实施例中，仅在初始三周治疗周期中的第1天将异二聚体Fc融合蛋白施用给受试者。
在某些实施例中，方法包括在初始三周治疗周期中在第1天向有需要的受试者施用与抗PD-1抗体例如派姆单抗组合的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，仅在最初始三周治疗周期中的第1天将异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体施用给受试者。在某些实施例中，PD-1抗体的施用在异二聚体Fc融合蛋白的施用之前。
在某些实施例中，方法进一步包括在初始治疗周期之后在一个或多个随后的三周治疗周期中向受试者施用异二聚体Fc融合蛋白，其中在每个随后的治疗周期中的第1天施用异二聚体Fc融合蛋白。随后的治疗周期(其中受试者每三周一次或每四周一次接受异二聚体Fc融合蛋白的施用)被设计为在受试者体内维持一定水平的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，受试者每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次接受异二聚体Fc融合蛋白的施用。在某些实施例中，受试者每六周一次接受异二聚体Fc融合蛋白的施用，即每隔一个治疗周期一次。在某些实施例中，受试者接受至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个后续治疗周期。在某些实施例中，受试者接受随后的治疗周期直到癌症消退(即，完全缓解)。在某些实施例中，受试者患有晚期(即，不可切除或转移性)黑色素瘤。在某些实施例中，受试者患有晚期(即，不可切除或转移性)肾细胞癌。
在某些实施例中，方法进一步包括在初始治疗周期之后在一个或多个随后的三周治疗周期中向受试者施用与抗PD-1抗体(例如，派姆单抗)组合的异二聚体Fc融合蛋白，其中异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体在每个随后的治疗周期的第1天施用。随后的治疗周期(其中受试者每三周一次接受异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体的施用)被设计为在受试者体内维持一定水平的异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体。在某些实施例中，受试者接受至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个后续治疗周期。在某些实施例中，抗PD-1抗体的施用在异二聚体Fc融合蛋白的施用之前。在某些实施例中，受试者接受随后的治疗周期直到癌症消退(即，完全缓解)。在某些实施例中，受试者患有晚期(即，不可切除或转移性)尿路上皮癌。
在某些实施例中，初始和后续治疗周期中的一个或多个剂量包含0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，初始和后续治疗周期中的一个或多个剂量包含选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或约5μg/kg组成的组的量的异二聚体Fc融合蛋白。
在某些实施例中，初始和后续治疗周期中的每个剂量包含0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，初始和后续治疗周期中的每个剂量包含选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或约5μg/kg组成的组的相同量的异二聚体Fc融合蛋白。
在某些实施例中，初始和后续治疗周期中的每个剂量包含0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，初始和后续治疗周期中的每个剂量包含选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或约5μg/kg组成的组的相同量的异二聚体Fc融合蛋白。
在某些实施例中，皮下施用异二聚体Fc融合蛋白。例如，在某些实施例中，通过皮下注射施用异二聚体Fc融合蛋白，例如，用预灌装笔或预灌装注射器施用。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白以约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约1.1mL或约1.2mL的体积施用。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白以约1mL的体积施用。在某些实施例中，在最多2个注射部位(例如，1个注射部位或2个注射部位)中施用异二聚体Fc融合蛋白。在具体实施例中，以单次注射施用异二聚体Fc融合蛋白。在具体实施例中，以两次注射施用异二聚体Fc融合蛋白。在具体实施例中，分两次注射施用异二聚体Fc融合蛋白，并且在第一注射后10分钟内完成第二注射。
在某些实施例中，静脉内施用抗PD-1抗体，例如派姆单抗。在某些实施例中，在施用异二聚体Fc融合蛋白之前静脉内施用抗PD-1抗体。在某些实施例中，在异二聚体Fc融合蛋白施用前，静脉内施用抗PD-1抗体不超过1小时(例如，5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时)。在某些实施例中，与异二聚体Fc融合蛋白的施用同时静脉内施用PD-1抗体。
可以用本文披露的异二聚体Fc融合蛋白或药物配制品治疗的癌症类型包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、结直肠癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌(RCC)、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、或三阴性乳腺癌。在某些实施例中，癌症是实体瘤。在某些实施例中，癌症是局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施例中，癌症是黑色素瘤。在某些实施例中，癌症是肾细胞癌。在某些实施例中，癌症是尿路上皮膀胱癌。在某些实施例中，受试者具有疾病的临床或放射学证据。在某些实施例中，受试者患有可测量的疾病，如实体瘤缓解评估标准(RECIST)版本1.1所确定的。在某些实施例中，本文披露的药物配制品作为单一疗法施用。在某些实施例中，本文披露的药物配制品作为组合疗法施用。在某些实施例中，除非满足中止标准，否则在确认后用药物配制品治疗具有确认的完全缓解(CR)的受试者至少12个月。在某些实施例中，多剂量疗法的总持续时间等于或小于24个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、18个月、24个月)。在某些实施例中，多剂量疗法的总持续时间超过24个月。
在某些实施例中，通过本文披露的方法治疗的受试者患有晚期黑色素瘤。在某些实施例中，受试者已接受抗PD-1抗体治疗至少6周并已确认疾病进展。在某些实施例中，受试者具有BRAF激活性突变，已接受BRAF抑制剂，并且在最后一线治疗后疾病进展。在某些实施例中，通过放射学或临床观察来确认疾病进展。在某些实施例中，受试者不具有BRAF激活性突变。
在某些实施例中，通过本文披露的方法治疗的受试者患有晚期肾透明细胞癌(RCC)。在某些实施例中，受试者具有透明细胞组织学组分。在某些实施例中，受试者已接受用检查点抑制剂(例如抗PD-1/PD-L1抗体)或VEGF疗法作为单一疗法的治疗。在某些实施例中，受试者已接受检查点抑制剂(例如抗PD-1/PD-L1抗体)和VEGF疗法的组合治疗。在某些实施例中，受试者已接受用检查点抑制剂(例如抗PD-1/PD-L1抗体)和基于铂的化学疗法的组合治疗。在某些实施例中，受试者尚未接受过用检查点抑制剂(例如抗PD-1/PD-L1抗体)的治疗。在某些实施例中，受试者已接受多于3个先前的疗法线。
在某些实施例中，通过本文披露的方法治疗的受试者患有晚期尿路上皮癌。在某些实施例中，晚期尿路上皮癌是转移性的或不可切除的。在某些实施例中，受试者具有经组织学或细胞学证实的尿路上皮(包括但不限于肾盂、输尿管、泌尿道上皮和尿道)的局部晚期或转移性移行细胞癌。在某些实施例中，受试者接受仅一种含铂方案(例如铂加另一种药剂，例如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星等)。在一些实施例中，对于在最后一次施用含铂方案作为辅佐后6个月内具有放射学进展或复发的不能手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌，受试者尚未接受过一种以上的含铂方案。在某些实施例中，受试者尚未接受过检查点抑制剂(CPI)(例如，抗PD-1或抗PD-L1)作为单一疗法或与铂类化学疗法组合使用的治疗。在某些实施例中，受试者已接受≤2个先前的治疗线。在某些实施例中，尿路上皮癌被认为是一线含铂方案的失败。
在一些实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品包含以0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的剂量施用异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品包含以选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或5μg/kg组成的组的剂量施用异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，施用的剂量基于受试者的体重。在某些实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品进一步包括施用抗PD-1抗体，例如派姆单抗或纳武单抗。
在一些实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品包含约0-约2mg、约0.2-约1.8mg、约0.3-约1.7mg、约0.4-约1.6mg、约0.5-约1.5mg、约0.6-约1.4mg、约0.7-约1.3mg、约0.8-约1.2mg、或约0.9-约1.1mg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品包含选自由约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、或约10mg组成的组的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品进一步包括施用抗PD-1抗体，例如派姆单抗或纳武单抗。在具体实施例中，用于治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的药物递送配制品进一步包括施用200mg抗PD-1抗体例如派姆单抗或纳武单抗。
在一些实施例中，用于在患有晚期黑色素瘤的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品以约0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的剂量施用。在某些实施例中，用于在患有晚期黑色素瘤的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品以选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或约5μg/kg组成的组的剂量施用。
在一些实施例中，用于在患有晚期黑色素瘤的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品包含约0-约2mg、约0.2-约1.8mg、约0.3-约1.7mg、约0.4-约1.6mg、约0.5-约1.5mg、约0.6-约1.4mg、约0.7-约1.3mg、约0.8-约1.2mg、或约0.9-约1.1mg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，用于在患有晚期黑色素瘤的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品包含选自由约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、或约10mg组成的组的量的异二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，用于在患有晚期RCC的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品以约0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的剂量施用。在某些实施例中，用于在患有晚期RCC的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品以选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或约5μg/kg组成的组的剂量施用。
在一些实施例中，用于在患有晚期RCC的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品包含约0-约2mg、约0.2-约1.8mg、约0.3-约1.7mg、约0.4-约1.6mg、约0.5-约1.5mg、约0.6-约1.4mg、约0.7-约1.3mg、约0.8-约1.2mg、或约0.9-约1.1mg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，用于在患有晚期RCC的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品包含选自由约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、或约10mg组成的组的量的异二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，用于在患有晚期尿路上皮癌的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品以约0.01-约3μg/kg、约0.01-约0.02μg/kg、约0.01-约0.05μg/kg、约0.05-约0.1μg/kg、约0.05-约0.5μg/kg、约0.05-约0.75μg/kg、约0.05-约1μg/kg、约0.05-约1.5μg/kg、约0.05-约2μg/kg、约0.05-约2.5μg/kg、约0.05-约3μg/kg、约0.1-约3μg/kg、约0.1-约1μg/kg、约0.5-约1μg/kg、约0.1-约2μg/kg、约0.5-约2μg/kg、约0.1-约0.5μg/kg、约0.1-约0.25μg/kg、约0.2-约1μg/kg、约0.2-约2μg/kg、约1-约1.2μg/kg、约1-约1.5μg/kg、约1-约2μg/kg、约1-约2.5μg/kg、约0.5-约2.5μg/kg、约1-约3μg/kg、或约0.5-约3μg/kg的剂量施用。在某些实施例中，用于在患有晚期尿路上皮癌的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品以选自由约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.03μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.15μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.3μg/kg、约0.35μg/kg、约0.4μg/kg、约0.45μg/kg、约0.5μg/kg、约0.6μg/kg、约0.7μg/kg、约0.8μg/kg、约0.9μg/kg、约1μg/kg、约1.2μg/kg、约1.25μg/kg、约1.3μg/kg、约1.4μg/kg、约1.5μg/kg、约1.75μg/kg、约2μg/kg、约2.5μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、或约5μg/kg组成的组的剂量施用。
在一些实施例中，用于在患有晚期尿路上皮癌的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品包含约0-约2mg、约0.2-约1.8mg、约0.3-约1.7mg、约0.4-约1.6mg、约0.5-约1.5mg、约0.6-约1.4mg、约0.7-约1.3mg、约0.8-约1.2mg、或约0.9-约1.1mg的量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，用于在患有晚期尿路上皮癌的受试者中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的药物递送配制品包含选自由约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、或约10mg组成的组的量的异二聚体Fc融合蛋白。
在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者尚未接受过用于治疗癌症的先前疗法。在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者尚未接受过用于治疗癌症的先前化学疗法或免疫疗法。在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者已接受先前疗法(例如，化学疗法或免疫疗法)，但尽管进行了先前疗法，但仍继续经历癌症进展。在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者在接受先前疗法(例如，化学疗法或免疫疗法)后经历了癌症消退，但后来经历了癌症复发。在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者对先前疗法(例如，化学疗法或免疫疗法)不耐受。
在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者满足实例26和29中描述的临床试验队列(例如，剂量增加队列、剂量扩展队列、黑色素瘤队列、肾细胞癌队列、尿路上皮癌队列，或与派姆单抗或纳武单抗的组合疗法队列)的所有纳入标准。在某些实施例中，根据本文披露的方法治疗的受试者不满足实例26和29中描述的任何排除标准。
本文披露的异二聚体Fc融合蛋白可作为单一疗法或与一种或多种疗法组合使用。在某些实施例中，根据本文披露的施用方案，异二聚体Fc融合蛋白作为单一疗法使用。在其他实施例中，异二聚体Fc融合蛋白与一种或多种疗法组合使用，其中根据本文披露的剂量方案施用异二聚体Fc融合蛋白，并且根据已知适于治疗患有特定癌症的特定受试者的剂量方案施用该一种或多种疗法。在某些实施例中，本文披露的治疗方法用作手术去除原发性病灶的辅助手段。在某些实施例中，原发性病灶的手术干预包括在受试者中裂解癌细胞、去除肿瘤或减积肿瘤。
可与异二聚体Fc融合蛋白组合使用的示例性治疗剂包括例如放射、丝裂霉素、维甲酸、ribomustin、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨(cladribine)、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁(pentostatin)、硝基胺(nitracrine)、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素(daunorubicin)、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺(bicalutamide)、长春瑞滨(vinorelbine)、维司力农(vesnarinone)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵(elliptinium acetate)、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸(isotretinoin)、链脲佐菌素、尼妥珠单抗、长春地辛、氟他胺(flutamide)、氟他胺(drogenil)、butocin、卡莫氟、丙亚胺(razoxane)、sizofilan、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼氮芥、沙培林、左旋咪唑、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、氧甲磺隆、它莫西芬(tamoxifen)、黄体酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ(IFN-γ)、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地托-迪尼白介素、白介素-2、促黄体生成素释放因子和上述药剂的变体(其可能表现出与其同源受体的不同结合，或增加或减少血清半衰期)。
可用作治疗癌症的组合疗法的一部分的另一类药剂是免疫检查点抑制剂。示例性免疫检查点抑制剂包括抑制以下中的一种或多种的药剂：(i)细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)已被美国食品和药物管理局批准用于治疗黑色素瘤。
可用作治疗癌症的组合疗法的一部分的其他药剂是靶向非检查点靶标的单克隆抗体药剂(例如，赫赛汀)和非细胞毒性药剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)。
再其他类别的抗癌药剂包括，例如：(i)选自以下的抑制剂：ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、Hedgehog信号传导通路抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂、和WEE1抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；和(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。
在某些实施例中，用单剂量或更多剂量的异二聚体IL-12-Fc融合蛋白(例如，包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二多肽)治疗的癌症是转移性癌症。在某些实施例中，转移性癌症是局部、区域或远处转移性癌症。在某些实施例中，单剂量或多剂量的异二聚体IL-12-Fc融合蛋白(例如，包含含有SEQID NO:290的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二多肽)通过远位效应治疗远处癌症，远处癌症不是源器官或组织的原发性癌症和/或治疗方案的直接靶标。在某些实施例中，异二聚体IL-12-Fc融合蛋白的远位效应在包括放射和/或化学疗法的治疗计划期间和/或之后增强。在某些实施例中，单剂量或多剂量的异二聚体IL-12-Fc融合蛋白(例如，包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二多肽)通过诱导全身性抗肿瘤反应来治疗患者的癌症，所述全身性抗肿瘤反应通过例如患者血清和/或肿瘤中IFNγ、CXCL9和/或CXCL10表达的增加来确定。
组合疗法
本发明的另一方面提供组合疗法。包含本文所述的异二聚体Fc融合蛋白的药物配制品可以与另外的治疗剂组合使用以治疗癌症。
在某些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白)作为组合疗法施用以治疗被诊断患有癌症的受试者。在某些实施例中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、间皮瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、脑癌、肉瘤、成神经细胞瘤、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、梅克尔细胞癌、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、三阴性乳腺癌、或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在某些实施例中，癌症是结肠癌。在某些实施例中，将异二聚体Fc融合蛋白作为组合疗法施用于被诊断患有结肠癌的受试者。在某些实施例中，癌症是黑色素瘤。在某些实施例中，将异二聚体Fc融合蛋白作为组合疗法施用于被诊断患有黑色素瘤的受试者。在某些实施例中，癌症是乳腺癌。在某些实施例中，将异二聚体Fc融合蛋白作为组合疗法施用于被诊断患有乳腺癌的受试者。
在一些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白)与另一种选自以下的治疗剂组合用于治疗晚期恶性肿瘤：细胞毒化学疗法；放射疗法；靶向参与抗肿瘤免疫反应的分子的抗体，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1或TGF-β；通过ADCC作用于肿瘤相关抗原的抗体；结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的多特异性抗体，任选与靶向PD-1或PD-L1的抗体组合施用；个性化癌症疫苗；溶瘤癌症疫苗；以及与靶向PD-1或PD-L1的抗体组合施用的个性化疫苗。
在一些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白)与另一种包括但不限于以下的疗法组合用于治疗恶性肿瘤(例如晚期恶性肿瘤)：NK靶向疗法(例如，CAR-NK疗法)、抗体疗法、检查点抑制剂疗法、另外的细胞因子疗法、先天免疫系统激动剂疗法、化学疗法、靶向剂疗法、放射疗法、过继性NK疗法、干细胞移植(SCT)疗法、激动性抗体、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法、T细胞受体(TCR)工程改造疗法、多特异性结合蛋白(TriNKET)、诱导细胞衰老的药剂、以及疫苗和/或溶瘤病毒疗法。在一些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白与选自以下的两种或更多种另外疗法组合用于治疗恶性肿瘤(例如晚期恶性肿瘤)：NK靶向疗法(例如，CAR-NK疗法)、抗体疗法、检查点抑制剂疗法、另外的细胞因子疗法、先天免疫系统激动剂疗法、化学疗法、靶向剂疗法、放射疗法、过继性NK疗法、干细胞移植(SCT)疗法、激动性抗体、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法、T细胞受体(TCR)工程改造疗法、多特异性结合蛋白(TriNKET)、诱导细胞衰老的药剂、以及疫苗和/或溶瘤病毒疗法。
在一些实施例中，本发明的异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12的异二聚体Fc融合蛋白)与靶向PD-1或PD-L1的癌症疫苗或抗体组合用于治疗可以完全切除的局部晚期恶性肿瘤。
本发明的蛋白也可以用作手术切除原发性病灶的辅助手段。
可以选择本发明的异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12的异二聚体Fc融合蛋白)和另外治疗剂的量和施用的相对时间，以实现期望的组合治疗效果。例如，当向需要这种施用的患者施用组合疗法时，组合中的治疗剂、包含治疗剂的一种或多种药物配制品或包含治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序施用，例如依次、并行、一起、同时等。此外，例如，异二聚体Fc融合蛋白可以在另外的一种或多种治疗剂发挥其预防或治疗作用时的期间施用，或反之亦然。
如本文所披露，本发明的方法包括共同施用异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白)和另外的治疗剂的组合。如本文所披露，本发明的方法包括共同施用包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂的组合。
“共同施用”涵盖以下：其中同时给予异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白)和另外的治疗剂的方法，其中依次给予异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂的方法，以及其中间歇或连续给予异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂之一或两者的方法，或以下的任何组合：同时、依次、间歇和/或连续。本领域技术人员将认识到间歇施用不一定与依次施用相同，因为间歇还包括药剂的第一施用，然后在稍后时间再次施用同样的药剂。此外，本领域技术人员理解在一些实施例中间歇施用还包括依次施用，因为间歇施用确实包括在再次施用第一药剂之前用不同药剂的施用中断药剂的第一施用。此外，本领域技术人员还将知道可以通过多种途径(包括静脉内滴注(IV输注)或饲管等)实现连续施用。
此外，并且以更一般的方式，术语“共同施用”包括在任何时间范围内单独施用异二聚体Fc融合蛋白和单独施用另外的治疗剂至受试者重叠的任何和所有方法。
向受试者施用异二聚体Fc融合蛋白或另外的治疗剂的频率在本领域中称为Qnd或qnd，其中n是连续施用该药剂的频率，以天为单位。例如，Q3d将是每三(3)天一次的药剂施用。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂中之一或两者或其任何组合Qld、Q2d、Q3d、Q4d、Q5d、Q6d、Q7d、Q8d、Q9d、Ql0d、Q14d、Q21d、Q28d、Q30d、Q90d、Q120d、Q240d、或Q365d。
在某些实施例中，间歇地施用异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂之一或两者。在某些实施例中，该方法包括以施用之间至少10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、18小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周或4周的延迟向受试者施用异二聚体Fc融合蛋白或另外的治疗剂中之一或两者。在某些实施例中，延迟施用遵循这样的模式，其中异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂中之一或两者或其任何组合在约10分钟至约365天的给定时间段内持续施用，然后在约10分钟至约30天的给定时间段内不施用。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂中的一种或任意组合被间歇施用，而另一种连续给予。在某些实施例中，第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白的组合与第二有效量的另外的治疗剂依次施用。
在某些实施例中，同时施用异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂。在某些实施例中，第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白的组合与第二有效量的另外的治疗剂依次施用。在此类实施例中，该组合也被称为“共同施用”，因为该术语包括其中受试者暴露于该组合中的两种组分的任何和所有方法。然而，此类实施例不限于仅在一种配制品或组合物中给出的组合。某些浓度的异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂可能更有利于以某些间隔递送，因此，第一有效量和第二有效量可以根据所施用的配制品而改变。
在某些实施例中，同时或依次施用异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂。在某些实施例中，在第二有效量的另外的治疗剂之后依次施用第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，在第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白之后依次施用第二有效量的另外的治疗剂。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白(例如，包含IL-12亚基的异二聚体Fc融合蛋白)和另外的治疗剂的组合在一个配制品中施用。在某些实施例中，该组合以两(2)种组合物施用，其中第一有效量的异二聚体Fc-融合蛋白在与第二有效量的另外的治疗剂的配制品分开的配制品中施用。在某些实施例中，该组合以两(2)种组合物施用，其中第一有效量的异二聚体Fc-融合蛋白在与第二有效量的另外的治疗剂的配制品分开的配制品中施用。在某些实施例中，在第二有效量的另外的治疗剂之后依次施用第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，在第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白之后依次施用第二有效量的另外的治疗剂。在某些实施例中，施用异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂；并且随后异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂两者间歇至少24小时施用。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂以非重叠的每隔一天的时间表施用。
在某些实施例中，在第二有效量的另外的治疗剂之后不少于4小时施用第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，在第二有效量的另外的治疗剂之后不少于10分钟、不少于15分钟、不少于20分钟、不少于30分钟、不少于40分钟、不少于60分钟、不少于1小时、不少于2小时、不少于4小时、不少于6小时、不少于8小时、不少于10小时、不少于12小时、不少于24小时、不少于2天、不少于4天、不少于6天、不少于8天、不少于10天、不少于12天、不少于14天、不少于21天、或不少于30天施用第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白。在某些实施例中，在第一有效量的异二聚体Fc融合蛋白之后不少于10分钟、不少于15分钟、不少于20分钟、不少于30分钟、不少于40分钟、不少于60分钟、不少于1小时、不少于2小时、不少于4小时、不少于6小时、不少于8小时、不少于10小时、不少于12小时、不少于24小时、不少于2天、不少于4天、不少于6天、不少于8)天、不少于10天、不少于12天、不少于14天、不少于21天、或不少于30天施用第二有效量的另外的治疗剂。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂之一或两者通过选自由以下组成的组的途径施用：静脉内、皮下、皮肤、口服、肌肉内和腹膜内。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂之一或两者通过静脉内施用。在某些实施例中，口服施用异二聚体Fc融合蛋白和/或另外的治疗剂之一或两者或它们的任何组合。
本领域技术人员应理解，本披露的单位剂型可以相同或不同的物理形式施用，即通过胶囊或片剂口服和/或通过IV输注的液体等。此外，每次施用的单位剂型可能因特定的施用途径而不同。对于异二聚体Fc融合蛋白和另外的治疗剂的组合中的一种或两种，可能存在几种不同的剂型。因为不同的医学病症可能需要不同的施用途径，所以本文所述的组合的相同组分在组成和物理形式上可能完全相同，但可能需要以不同的方式并且可能在不同的时间给予以缓解病症。例如，持续性恶心，尤其是呕吐等状况可能会导致难以使用口服剂型，在这种情况下，可能需要施用另一种单位剂型，甚至可能是与之前或之后使用的其他剂型相同的剂型，代之以吸入、含服、舌下或栓剂途径或相同途径施用。特定剂型可以是异二聚Fc融合蛋白和另外的治疗剂的某些组合的要求，因为可能存在化学稳定性或药代动力学等各种因素的问题。
(i)NK靶向疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与NK靶向疗法相组合。例如，在实施例中，异二聚体Fc融合蛋白与靶向NKp46的治疗剂共同施用。在某些实施例中，靶向NKp46的治疗剂还结合CD16、一种或多种肿瘤相关抗原或其组合。靶向NKp46的示例性治疗剂在美国申请号US20170198038A1(出于所有目的通过引用并入本文)中有更详细的描述。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与双特异性和三特异性杀伤接合剂(BiKE和TriKE)疗法(包括靶向NK细胞的BiKE和TriKE疗法)组合。BiKE和TriKE由每个目的抗体可变区的单重(VH)和轻(VL)链构建。VH和VL结构域通过短的柔性多肽接头连接以防止解离。BiKE和TriKE在美国申请号US 20180282386 A1和US 20180258396 A1(出于所有目的通过引用并入本文)中有更详细的描述。BiKE和TriKE可以包含NK细胞特异性结合结构域。
在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有高危骨髓增生异常综合征、急性骨髓性白血病、系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病的受试者。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法作为3个每周治疗块的单一疗程施用。在某些实施例中，治疗块包括4个连续的24小时连续输注(大约96小时)，然后是72小时的休息。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以5μg/kg/天、10μg/kg/天、25μg/kg/天、50μg/kg/天、100μg/kg/天或200μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以至少5μg/kg/天、至少10μg/kg/天、至少25μg/kg/天、至少50μg/kg/天，至少100μg/kg/天，或至少200μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以至少1μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以至少5μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以至少200μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以至少500μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以至少1000μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以200μg/kg/天或更少的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以500μg/kg/天或更少的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以1000μg/kg/天或更少的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以1-200μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以5-200μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以1-500μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以1-1000μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以5-500μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以5-1000μg/kg/天的剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以最大耐受剂量施用。在某些实施例中，BiKE和TriKE疗法以小于最大耐受剂量施用。
(ii)多特异性结合蛋白(“TriNKET”)疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与包含多特异性结合蛋白的疗法组合，该多特异性结合蛋白包含：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或结合CD16的第三抗原结合位点(“TriNKET”)(例如，国际公开号WO 2019/157332(其与其中描述的多特异性结合蛋白相关的内容通过引用并入本文)中描述的包含各种NKG2D-结合剂和肿瘤相关抗原结合位点的多特异性结合蛋白)，用于治疗已知或疑似患有癌症的受试者。示例性的肿瘤相关抗原包括但不限于HER2、CD20、CD33、B-细胞成熟抗原(BCMA)、EpCAM、CD2、CD19、CD25、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、CLL1/CLEC12A、FLT3、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4、HLA-E、和PD-L1。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与包含基于体重的多特异性结合蛋白剂量的疗法组合。例如，多特异性结合蛋白的剂量基于体重是约0.01μg至约100mg/kg体重，例如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与包含多个剂量的多特异性结合蛋白(每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至每2至20年给予一次)的疗法组合。本领域普通技术人员可以基于测量的停留时间和可靶向构建体或复合物在体液或组织中的浓度容易地估计给药的重复率。多特异性结合蛋白的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内，通过导管灌注或通过直接病灶内注射。这可以每天一次或多次，每周一次或多次，每月一次或多次，每年一次或多次施用。
(iii)嵌合抗原受体(CAR)疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与CAR疗法组合。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的重组多肽构建体，所述细胞内信号传导结构域包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域(也称为在本文中称为“初级信号传导结构域”)。
因此，在某些实施例中，CAR包含结合肿瘤相关抗原的细胞外抗原结合位点、跨膜结构域和包含初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在某些实施例中，CAR进一步包含一种或多种衍生自至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域(也称为“共刺激信号传导结构域”)。
在一个实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含作为细胞外抗原结合结构域的肿瘤相关抗原结合结构域(其包含重链可变结构域和轻链可变结构域)(例如，肿瘤相关抗原结合scFv结构域)、跨膜结构域和包含初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含作为细胞外抗原结合结构域的肿瘤相关抗原结合结构域(其包含重链可变结构域和轻链可变结构域)(例如，肿瘤相关抗原结合scFv结构域)、跨膜结构域和包含共刺激信号转导结构域和初级信号转导结构域的细胞内信号转导结构域。在某些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含作为细胞外抗原结合结构域的肿瘤相关抗原结合结构域(其包含重链可变结构域和轻链可变结构域)(例如，肿瘤相关抗原结合scFv结构域)、跨膜结构域和包含两个共刺激信号转导结构域和初级信号转导结构域的细胞内信号转导结构域。在一个实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含作为细胞外抗原结合结构域的肿瘤相关抗原结合结构域(其包含重链可变结构域和轻链可变结构域)、跨膜结构域和包含至少两个共刺激信号转导结构域和初级信号转导结构域的细胞内信号转导结构域。
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR被设计成包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施例中，跨膜结构域是与CAR中的结构域之一天然相关联的结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域的结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在另一个实施例中，跨膜结构域能够与CAR T细胞表面上的另一个CAR同二聚化。在另一个实施例中，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同的CART细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自任何天然存在的膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个实施例中，每当CAR结合靶时，跨膜区能够向一个或多个细胞内结构域发出信号。在一些实施例中，跨膜结构域包含一种或多种蛋白的一个或多个跨膜区，所述蛋白选自由以下组成的组TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施例中，跨膜结构域包含一种或多种蛋白的一个或多个跨膜区，所述蛋白选自由以下组成的组：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、和NKG2C。
细胞外肿瘤相关抗原结合结构域(例如，肿瘤相关抗原结合scFv结构域)可以通过铰链区连接至跨膜结构域。可以使用多种铰链，包括但不限于人Ig铰链(例如，IgG4铰链、IgD铰链)、Gly-Ser接头、(G4S)4接头、KIR2DS2铰链和CD8α铰链。
CAR的细胞内信号传导结构域负责激活其中已放置CAR的免疫细胞的特化功能(例如，溶细胞活性或T细胞的辅助活性，包括细胞因子的分泌)中的至少一种。因此，如本文所用，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白部分。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短部分代替完整的链，只要它转导效应功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
CAR的细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域(即衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域(即衍生自至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域)。
如本文所用，“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一个实施例中，信号是初级信号，该初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。
以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在本披露中特别使用的含有ITAM的细胞质信号序列的实例包括衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在一个实施例中，任何一种或多种CAR中的初级信号传导结构域包含衍生自CD3-ζ的细胞质信号传导序列。
在一些实施例中，初级信号传导结构域是TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、4-1BB和/或CD3-ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和/或DAP12的功能性信号传导结构域。在具体的实施例中，初级信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关联的ζ链的功能性信号传导结构域。
如本文所用，术语“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合，从而介导通过T细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的T细胞上的同源结合配偶体。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD11a/CD18)、CD2、CD7、CD258(LIGHT)、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。此类共刺激分子的其他实例包括CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和与CD83特异性结合的配体。在一些实施例中，CAR的共刺激信号传导结构域是本文描述的共刺激分子的功能性信号传导结构域，该共刺激分子是例如OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、与CD83结合的配体、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS和4-1BB(CD137)或其任何组合。
如本文所用，术语“信号传导结构域”是指蛋白的功能部分，该部分通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应此类信使而起到效应子的作用经由限定的信号传导途径调节细胞活性来起作用。
CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以按随机或指定的顺序相互连接。任选地，例如长度在2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以形成连接。
(iv)抗体疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与抗体疗法组合以治疗已知或怀疑患有癌症的受试者。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白与包含抗HER2结合结构域的疗法组合，例如抗HER2抗体或抗HER2抗体平台(例如，包含抗HER2结合结构域、抗HER2抗体-药物缀合物或抗HER2 CAR的双特异性或三特异性抗体)。抗HER2抗体包括但不限于曲妥珠单抗(
Figure BDA0003996373120001341
-罗氏公司/基因泰克公司；Kanjinti-美商安进公司(Amgen))、帕妥珠单抗(
Figure BDA0003996373120001342
-罗氏公司/基因泰克公司)和MGAH22(在美国专利号8,802,093中详细描述，出于所有目的通过引用并入本文)。抗HER2抗体平台包括但不限于厄妥索单抗(ertumaxomab)(
Figure BDA0003996373120001343
-Creative Biolabs)和恩美曲妥珠单抗(trastuzumabemtansine)(ado-恩美曲妥珠单抗/T-DM1；
Figure BDA0003996373120001344
-罗氏公司/基因泰克公司)。在某些实施例中，抗HER2结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有癌症的受试者。在某些实施例中，抗HER2结合结构域疗法通过IV输注施用。在某些实施例中，以1mg/kg/天、2mg/kg/天、3mg/kg/天、4mg/kg/天、5mg/kg/天、6mg/kg/天、7mg/kg/天、8mg/kg/天、9mg/kg/天、10mg/kg/天的剂量施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以至少1mg/kg/天、至少2mg/kg/天、至少3mg/kg/天、至少4mg/kg/天、至少5mg/kg/天、至少6mg/kg/天、至少7mg/kg/天、至少8mg/kg/天、至少9mg/kg/天、至少10mg/kg/天的剂量施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以小于1mg/kg/天的剂量施用抗HER2结合结构域疗法。
在某些实施例中，抗HER2结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或疑似患有乳腺癌的受试者，例如被诊断患有转移性HER2过表达乳腺癌的受试者。在某些实施例中，以4mg/kg/天施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以4mg/kg/天通过IV输注经90分钟施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以2mg/kg/天施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以2mg/kg/天通过IV输注经30分钟施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以4mg/kg/天的初始剂量施用抗HER2结合结构域疗法，然后以2mg/kg/天每周施用。在某些实施例中，以4mg/kg/天的初始剂量施用抗HER2结合结构域疗法，然后以2mg/kg/天每周施用52周。
在某些实施例中，抗HER2结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或疑似患有胃癌的受试者，例如被诊断患有转移性HER2过表达胃癌的受试者。在某些实施例中，以8mg/kg/天施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以8mg/kg/天通过IV输注经90分钟施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以6mg/kg/天施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以6mg/kg/天通过IV输注经30-90分钟施用抗HER2结合结构域疗法。在某些实施例中，以8mg/kg/天的初始剂量施用抗HER2结合结构域疗法，然后以6mg/kg/天每周施用。在某些实施例中，以8mg/kg/天的初始剂量施用抗HER2结合结构域疗法，然后以6mg/kg/天每周施用52周。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与包含抗CD20结合结构域的疗法组合，例如抗CD20抗体或抗CD20抗体平台(例如，包含抗CD20结合结构域、抗CD20抗体-药物缀合物或抗CD20 CAR的双特异性或三特异性抗体)。抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗(
Figure BDA0003996373120001351
-罗氏公司(Roche)/基因泰克公司(Genentech))、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(
Figure BDA0003996373120001352
-罗氏公司/基因泰克公司)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)(
Figure BDA0003996373120001353
-罗氏公司/基因泰克公司)、奥法木单抗(ofatumumab)(
Figure BDA0003996373120001354
-诺华公司(Novartis))和维妥珠单抗(veltuzumab)。在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有癌症的受试者。在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法通过IV输注施用。在某些实施例中，以100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2、700mg/m2、800mg/m2、900mg/m2、或1000mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。在某些实施例中，以375mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。在某些实施例中，以至少100mg/m2、至少200mg/m2、至少300mg/m2、至少400mg/m2、至少500mg/m2、至少600mg/m2、至少700mg/m2、至少800mg/m2、至少900mg/m2、或至少1000mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。在某些实施例中，以小于400mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。在某些实施例中，以小于375mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。
在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者。在某些实施例中，通过IV输注以375mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。在某些实施例中，通过IV输注以小于375mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。
在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)的受试者。在某些实施例中，将抗CD20结合结构域疗法以375mg/m2的剂量通过IV-输注在第一周期中施用，并且在另外的2-6个周期中每周期通过IV输注500mg/m2的剂量施用。在某些实施例中，通过IV输注以小于375mg/m2的剂量施用抗CD20结合结构域疗法。组合的抗CD20结合结构域和异二聚体Fc融合蛋白疗法可与氟达拉滨和环磷酰胺(FC)组合使用。
在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有类风湿性关节炎(RA)的受试者。在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法通过IV输注以1000mg的两个剂量施用，剂量相隔2周。在某些实施例中，抗CD20结合结构域疗法作为1000mg的两个剂量(剂量相隔2周)通过IV输注施用长达24周。在某些实施例中，组合的抗CD20结合结构域和异二聚体Fc融合蛋白疗法与甲氨蝶呤共同施用。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与包含抗体疗法的疗法组合，该抗体疗法包含激动剂抗体。在某些实施例中，激动剂抗体是抗4-1BB抗体、抗CD137抗体、抗FAP抗体、抗OX40抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体或抗CD27抗体。在某些实施例中，激动剂抗体是双特异性抗体。在某些实施例中，激动剂抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体，包含两个或更多个选自抗4-1BB抗体、抗CD137抗体、抗FAP抗体、抗OX40抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体或抗CD27抗体的抗原结合结构域。说明性实例是靶向4-1BB和CD137的双特异性激动剂抗体，例如乌托鲁单抗(utomilumab)(辉瑞公司(Pfizer))。
(v)检查点抑制剂疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法可以与检查点抑制剂疗法组合。可被靶向以阻断或抑制的说明性免疫检查点分子包括但不限于CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并且在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)，CD160(也称为BY55)和CGEN-15049。免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段或其他结合蛋白，它们结合并阻断或抑制CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160、和CGEN-15049中的一种或多种的活性。说明性免疫检查点抑制剂包括纳武单抗(抗PD-1；
Figure BDA0003996373120001371
-BMS)、AMP224(抗PD-1；NCI)、派姆单抗(抗PD-1；
Figure BDA0003996373120001372
-默克公司(Merck))、匹地利珠单抗(抗PD-1抗体；CT-011-梯瓦公司(Teva)/治愈科技公司(CureTech))、阿特珠单抗(抗PD-L1；
Figure BDA0003996373120001376
-罗氏公司(Roche)/基因泰克公司(Genentech))、度伐鲁单抗(抗PD-L1；
Figure BDA0003996373120001373
-英商梅迪缪思公司(Medimmune)/阿斯利康公司(AstraZeneca))、阿维鲁单抗(抗PD-L1；
Figure BDA0003996373120001374
-辉瑞公司)、BMS-936559(抗PD-L1-BMS)、伊匹单抗(抗CTLA-4；
Figure BDA0003996373120001375
-BMS)、曲美利木单抗(抗CTLA-4；英商梅迪缪思公司/阿斯利康公司)、利瑞鲁单抗(抗KIR；BMS)、莫那利珠单抗(抗NKG2A；先天制药公司(Innate Pharma)/阿斯利康公司)、BY55(抗CD160)、抗OX40、抗TIM3、和抗LAG3。
在某些实施例中，本发明的方法进一步包括向受试者施用抗PD-1抗体。许多抗PD-1抗体已被开发用于治疗目的，并在例如Gong等人,(2018)J.ImmunoTher Cancer[癌症免疫治疗杂志](2018)6:8中进行了描述。在某些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗。在某些实施例中，派姆单抗可以通过各种途径施用，例如，静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内。在某些实施例中，静脉内施用派姆单抗。在某些实施例中，可以以约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg或约400mg的剂量施用派姆单抗。在某些实施例中，以每3周约200mg的剂量施用派姆单抗。在某些实施例中，派姆单抗以每6周约400mg的剂量施用。在某些实施例中，在初始治疗周期的第1天施用约200mg的派姆单抗。在某些实施例中，如果受试者接受一个或多个后续治疗周期，则从第一个后续治疗周期的第1天开始，在后续治疗周期中每三周一次施用200mg派姆单抗。在一些实施例中，派姆单抗的施用可以在药物配制品的每次施用之前，可以与药物配制品的每次施用同时，或在药物配制品的每次施用之后。在某些实施例中，派姆单抗的施用在药物配制品的每次施用之前。在一些实施例中，在完成派姆单抗施用后，可在约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时或约5小时内施用药物配制品。在某些实施例中，在完成派姆单抗施用后1小时内施用药物配制品。
在一些实施例中，与派姆单抗组合施用的药物配制品用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定癌症、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、和子宫内膜癌。
在某些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗。在某些实施例中，纳武单抗可以通过各种途径施用，例如，静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内。在某些实施例中，静脉内施用纳武单抗。在一些实施例中，可以以约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg、约500mg、约520mg、约540mg、约560mg、约580mg、或约600mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，以约240mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，约每两周一次以约240mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，以约360mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，约每三周一次以约360mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，以约480mg的剂量施用纳武单抗。在某些实施例中，约每四周一次以约480mg的剂量施用纳武单抗。在一些实施例中，纳武单抗的施用可以在药物配制品的每次施用之前，可以与药物配制品的每次施用同时，或在药物配制品的每次施用之后。在某些实施例中，纳武单抗的施用在药物配制品的每次施用之前。在一些实施例中，在完成纳武单抗施用后，可在约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时或约5小时内施用药物配制品。在某些实施例中，在纳武单抗施用完成后1小时内施用药物配制品。在一些实施例中，药物配制品与纳武单抗组合施用用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、和食管癌。在某些实施例中，癌症是黑色素瘤。在某些实施例中，黑色素瘤是不可切除的或转移性的。在一些实施例中，癌症是结直肠癌。在某些实施例中，结直肠癌是微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。
在某些实施例中，检查点抑制剂疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有癌症的受试者。在某些实施例中，通过IV输注施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，通过IV输注经30分钟施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，每3周施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、或约1000mg的剂量施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，以200mg的剂量施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，以至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg或至少1000mg的剂量施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，以小于200mg的剂量施用检查点抑制剂疗法。在某些实施例中，检查点抑制剂疗法与异二聚体Fc融合蛋白疗法组合使用以治疗已知或怀疑患有如下的受试者：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定癌症、结直肠癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌(RCC)、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、和三阴性乳腺癌。
(vi)另外的细胞因子疗法
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种另外的细胞因子疗法、一种或多种趋化因子疗法或其组合进行组合。在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种另外的细胞因子疗法组合。在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种趋化因子疗法组合。在一些实施例中，细胞因子疗法包括促炎细胞因子、Th1细胞因子或Th2细胞因子。在一些实施例中，细胞因子疗法包括重组人细胞因子或趋化因子。
在一些实施例中，细胞因子疗法包括作为白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21和IL-22)的细胞因子。在一些实施例中，细胞因子疗法包括作为生长因子(例如，肿瘤坏死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF)的细胞因子。在一些实施例中，细胞因子疗法包括抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGF)。
在一些实施例中，趋化因子疗法包括促炎趋化因子(例如，GRO-α、GRO-b、LIX、GCP-2、MIG、IP10、I-TAC、和MCP-1、RANTES、嗜酸性粒细胞趋化因子、SDF-1、和MIP3a)。在一些实施例中，趋化因子疗法包括趋化因子受体。在一些实施例中，趋化因子疗法包括CXC趋化因子受体(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、和CXCR7)、CC趋化因子受体(例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、和CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如，CX3C11)或XC趋化因子受体(例如，XCR1)。在一些实施例中，趋化因子疗法包括G蛋白连接的跨膜受体。
在一些实施例中，细胞因子疗法包括与IL-12信号传导协同作用的细胞因子疗法。在一些实施例中，细胞因子疗法包括IL-2细胞因子或其衍生物。在一些实施例中，IL-2疗法是阿地白介素(Proleukin-普罗米修斯疗法公司(Prometheus Therapeutics))。在一些实施例中，静脉内施用IL-2疗法和/或阿地白介素。在一些实施例中，细胞因子疗法包括IL-15细胞因子或其衍生物。在一些实施例中，IL-15疗法是ALT-803(奥尔特生物科学(AltorBioscience))或NKTR-255(内克塔公司(Nektar))。在一些实施例中，皮下施用IL-15疗法、NKTR-255和/或ALT-803。在一些实施例中，趋化因子疗法包括CXCL9趋化因子、CXCL10趋化因子或其衍生物。
在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括向受试者施用细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括向受试者施用重组细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括工程改造细胞以产生细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括离体、体外或体内工程改造细胞以产生细胞因子或趋化因子。
在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括使用基于病毒载体的递送平台工程改造细胞以产生细胞因子或趋化因子，该基于病毒载体的递送平台是如牛痘、鸡痘、自我复制甲病毒、马拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(参见，例如，Tatsis等人,腺病毒,Molecular Therapy[分子疗法](2004)10,616-629)、慢病毒(包括但不限于第二代、第三代或混合第二/第三代慢病毒和设计用于靶向特定细胞类型或受体的任何世代的重组慢病毒(参见，例如，Hu等人,Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer andInfectious Diseases[通过慢病毒载体递送的用于癌症和传染病的免疫],Immunol Rev.[免疫学综述](2011)239(1):45-61,Sakuma等人,Lentiviral vectors:basic totranslational[慢病毒载体:基础到转化],Biochem J.[生物化学杂志](2012)443(3):603-18,Cooper等人,Rescue of splicing-mediated intron loss maximizesexpression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter[拯救剪接介导的内含子缺失使含有人泛素C启动子的慢病毒载体的表达最大化],Nucl.AcidsRes.[核酸研究](2015)43(1):682-690,Zufferey等人,Self-Inactivating LentivirusVector for Safe and Efficient In vivo Gene Delivery[用于安全有效体内基因递送的自失活慢病毒载体],J.Virol.[病毒学杂志](1998)72(12):9873-9880)、或腺相关病毒(“AAV”)载体(在以下中更详细地描述：美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学]5:3251-3260(1985)；Tratschin等人,Mol.Cell,Biol.[分子与细胞生物学]4:2072-2081(1984)；Hermonat等人,PNAS[美国国家科学院院刊]81:64666470(1984)；和Samulski等人,J.Virol.[病毒学杂志]63:03822-3828(1989))。在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括使用LNP、脂质体或外泌体工程改造细胞以产生细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括使用基因组编辑工程改造细胞以产生细胞因子或趋化因子，例如使用基于核酸酶的基因组编辑系统(例如，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)家族、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和基于归巢核酸内切酶(HE)的基因组编辑系统或其衍生物)。在一些实施例中，细胞因子或趋化因子疗法包括使用电穿孔工程改造细胞以产生细胞因子或趋化因子。
(vii)先天免疫系统激动剂疗法
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种先天免疫系统激动剂组合。
在一些实施例中，先天免疫系统激动剂包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施例中，TLR激动剂包括TLR1/2、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR7/8、或TLR9激动剂。在一些实施例中，TLR2/6激动剂包含脂蛋白，例如细菌脂蛋白或衍生物，例如Pam2CSK4。在一些实施例中，TLR1/2激动剂包含脂蛋白。在一些实施例中，TLR3激动剂包含dsRNA类似物，例如rintatolimod(
Figure BDA0003996373120001421
-半球生物制药公司(Hemispherx Biopharma))或聚IC-LC(例如，
Figure BDA0003996373120001422
)。在一些实施例中，TLR4激动剂包含脂多糖(LPS，也称为内毒素)或衍生物，例如脂质A。在一些实施例中，TLR7激动剂包含ssRNA或衍生物或咪唑喹啉衍生物，包括但不限于瑞喹莫德(resiquimod)。也称为R848)、咪喹莫特(imiquimod)(
Figure BDA0003996373120001423
Aldara-Medicis)和加地喹莫德(gardiquimod)。在一些实施例中，TLR7激动剂也是TLR8激动剂，例如咪喹莫特或Medi-9197(阿斯利康公司(AstraZeneca)/英商梅迪缪思公司(MedImmune))。在一些实施例中，TLR9激动剂包含含有CpG的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)或SD-101(Dynavax公司)。
在一些实施例中，先天免疫系统激动剂包含干扰素基因刺激剂(STING)激动剂。在一些实施例中，STING激动剂包含环状二核苷酸(CDN)。在一些实施例中，CDN包含环状二-AMP、环状-二-GMP或环状-GMP-AMP(cGAMP)。在一些实施例中，STING激动剂包含刺激cGAS的核酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施例中，STING激动剂是ADU-S100(也称为MIW815-Aduro/诺华公司(Novartis))。
(viii)化学疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种化学疗法组合。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种化学疗法组合以治疗被诊断患有癌症的受试者。化学疗法药剂的实例包括阿迪白介素、夫拉平度(alvocidib)、抗瘤酮(antineoplaston)AS2-1、抗瘤酮A10、抗胸腺细胞球蛋白、氨磷汀三水合物、氨基喜树碱、三氧化二砷、β-亚氨酸(beta alethine)、Bcl-2蛋白家族抑制剂ABT-263、ABT-199、BMS-345541、硼替佐米
Figure BDA0003996373120001424
苔藓虫素1、白消安、卡铂、阿仑单抗(campath)-1H、CC-5103、卡莫司汀、醋酸卡泊芬净、氯法拉滨、顺铂、克拉屈滨
Figure BDA0003996373120001425
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003996373120001426
姜黄素、环孢菌素、环磷酰胺(Cyloxan、Endoxan、Endoxana、Cyclostin)、阿糖胞苷、地托-迪尼白介素、地塞米松、DT PACE、多西他赛、尾海兔素10、多柔比星
Figure BDA0003996373120001431
盐酸多柔比星、恩扎妥林(enzastaurin)、阿法依伯汀、依托泊苷、依维莫司(RAD001)、维甲酰酚胺(fenretinide)、非格司亭、美法仑、美司钠、夫拉平度、氟达拉滨
Figure BDA0003996373120001432
格尔德霉素(Geldanamycin)(17-AAG)、异环磷酰胺、盐酸伊立替康、伊沙匹隆、来那度胺(
Figure BDA0003996373120001433
CC-5013)、淋巴因子激活的杀伤细胞、美法仑、甲氨蝶呤、盐酸米托蒽醌、莫特沙芬钆、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、奈拉滨、奥利默森(oblimersen)
Figure BDA0003996373120001434
Obatoclax(GX15-070)、奥利默森、醋酸奥曲肽、ω-3脂肪酸、奥沙利铂、紫杉醇、PD0332991、聚乙二醇化脂质体盐酸多柔比星、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、喷司他丁(Pentstatin)
Figure BDA0003996373120001435
哌立福新、泼尼松龙、泼尼松、R-roscovitine(
Figure BDA0003996373120001436
CYC202)、重组干扰素α、重组白介素-12、重组白介素-11、重组flt3配体、重组人血小板生成素、利妥昔单抗、沙格司亭、西地那非柠檬酸盐、辛伐他汀、西罗莫司、苯乙烯基砜、他克莫司、坦螺旋霉素(tanespimycin)、特罗莫司(CC1-779)、沙利度胺、治疗性同种异体淋巴细胞、噻替派、替吡法尼(ipifarnib)、
Figure BDA0003996373120001437
(
Figure BDA0003996373120001438
或PS-341)、长春新碱
Figure BDA0003996373120001439
长春新碱硫酸盐、长春瑞宾双酒石酸盐、伏立诺他(SAHA)、和FR(氟达拉滨、利妥昔单抗)、CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)、CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)、FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥昔单抗)、hyperCVAD(超分割环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、地塞米松、甲氨蝶呤、阿糖胞苷)、ICE(异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)、MCP(米托蒽醌、苯丁酸氮芥、和泼尼松龙)、R-CHOP(瑞妥昔单抗+CHOP)、R-CVP(瑞妥昔单抗+CVP)、R-FCM(瑞妥昔单抗+FCM)、R-ICE(瑞妥昔单抗-ICE)、和R-MCP(R-MCP)。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种化学疗法组合以治疗被诊断患有结肠癌、直肠癌或结直肠癌(CRC)的受试者。在某些实施例中，化学疗法包括FOLFOX(5-FU、亚叶酸、和奥沙利铂/乐沙定(Eloxatin))、FOLFIRI(亚叶酸、5-FU、和伊立替康/依立替康(Camptosar))、FOLFOXIRI(亚叶酸、5-FU、奥沙利铂、和伊立替康)、CapeOx(卡培他滨和奥沙利铂)、与叶酸共施用的5-FU、单独的卡培他滨
Figure BDA0003996373120001441
或三氟尿苷和替吡拉西
Figure BDA0003996373120001442
在某些实施例中，化学疗法包括VEGF靶向剂，例如贝伐单抗
Figure BDA0003996373120001443
阿柏西普
Figure BDA0003996373120001444
雷莫芦单抗
Figure BDA0003996373120001445
或瑞戈非尼
Figure BDA0003996373120001446
或EGFR靶向剂，例如西妥昔单抗(ERBITUX)或帕尼单抗
Figure BDA0003996373120001447
在某些实施例中，化学疗法与选自以下的化学疗法共施用：FOLFOX、FOLFIRI、FOLFOXIRI、CapeOx、与叶酸共施用的5-FU、单独的卡培他滨、和三氟尿苷/替吡拉西，连同VEGF靶向剂或EGFR靶向剂一起。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种化学疗法组合以治疗被诊断患有乳腺癌的受试者。在某些实施例中，化学疗法包括多柔比星
Figure BDA0003996373120001448
聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星
Figure BDA0003996373120001449
紫杉醇(Taxol)、多西他赛
Figure BDA00039963731200014410
白蛋白结合紫杉醇
Figure BDA00039963731200014411
5-氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺
Figure BDA00039963731200014412
卡铂
Figure BDA00039963731200014413
顺铂、长春瑞滨
Figure BDA00039963731200014414
卡培他滨(XELODA)、吉西他滨
Figure BDA00039963731200014415
伊沙匹隆
Figure BDA00039963731200014416
或艾瑞布林(HALAVEN)。在某些实施例中，化学疗法包括选自以下的两个或更多个的组合：多柔比星
Figure BDA00039963731200014417
聚乙二醇化脂质体多柔比星、表柔比星
Figure BDA00039963731200014418
紫杉醇(Taxol)、多西他赛
Figure BDA00039963731200014419
白蛋白结合紫杉醇
Figure BDA00039963731200014420
5-氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺
Figure BDA00039963731200014421
卡铂
Figure BDA00039963731200014422
顺铂、长春瑞滨
Figure BDA00039963731200014423
卡培他滨
Figure BDA00039963731200014424
吉西他滨
Figure BDA00039963731200014425
伊沙匹隆
Figure BDA00039963731200014426
和艾瑞布林
Figure BDA00039963731200014427
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种化学疗法组合以治疗被诊断患有黑色素瘤/皮肤癌的受试者。在某些实施例中，化学疗法包括达卡巴嗪(也称为DTIC)、替莫唑胺、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、卡铂或长春碱。
(ix)靶向剂疗法
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种靶向剂组合。一般来说，靶向剂作用于特定的分子靶标，例如与癌症相关的靶标。靶向剂与标准化学疗法的区别在于标准化学疗法作用于所有快速分裂的正常细胞和癌细胞。靶向剂包括但不限于激素疗法、信号转导抑制剂、基因表达调节剂、细胞凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、免疫疗法、毒素递送分子(例如，抗体药物偶联物)和激酶抑制剂。在某些实施例中，靶向剂包含受体激动剂或配体。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种靶向剂组合以治疗被诊断患有结肠癌、直肠癌或结直肠癌(CRC)的受试者。在某些实施例中，靶向剂包括西妥昔单抗
Figure BDA0003996373120001451
帕尼单抗
Figure BDA0003996373120001452
贝伐单抗
Figure BDA0003996373120001453
阿柏西普(ziv-aflibercept)
Figure BDA0003996373120001454
瑞戈非尼
Figure BDA0003996373120001455
雷莫芦单抗
Figure BDA0003996373120001456
纳武单抗
Figure BDA0003996373120001457
)或伊匹单抗
Figure BDA0003996373120001458
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种靶向剂组合以治疗被诊断患有乳腺癌的受试者。在某些实施例中，靶向剂包括依维莫司
Figure BDA0003996373120001459
他莫西芬
Figure BDA00039963731200014510
托瑞米芬
Figure BDA00039963731200014511
曲妥珠单抗
Figure BDA00039963731200014512
氟维司群
Figure BDA00039963731200014513
阿那曲唑
Figure BDA00039963731200014514
依西美坦
Figure BDA00039963731200014515
拉帕替尼
Figure BDA00039963731200014516
来曲唑
Figure BDA00039963731200014517
帕妥珠单抗
Figure BDA00039963731200014518
ado-恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)
Figure BDA00039963731200014519
帕柏西利
Figure BDA00039963731200014520
瑞博西尼
Figure BDA00039963731200014521
马来酸来那替尼(NERLYNXTM)、阿贝西利(VERZENIOTM)、奥拉帕尼(LYNPARZATM)、阿特珠单抗
Figure BDA00039963731200014522
或阿培利司
Figure BDA00039963731200014523
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种靶向剂组合以治疗被诊断患有黑色素瘤/皮肤癌的受试者。在某些实施例中，靶向剂包括维莫德吉(vismodegib)
Figure BDA00039963731200014524
索尼地吉(sonidegib)
Figure BDA00039963731200014525
伊匹单抗
Figure BDA00039963731200014526
维莫非尼
Figure BDA00039963731200014527
曲美替尼
Figure BDA00039963731200014528
达拉非尼
Figure BDA00039963731200014529
派姆单抗
Figure BDA00039963731200014530
纳武单抗
Figure BDA00039963731200014531
考比替尼(COTELLICTM)、阿利维A酸
Figure BDA00039963731200014532
阿维鲁单抗
Figure BDA00039963731200014533
恩拉非尼(encorafenib)(BRAFTOVITM)、比美替尼(binimetinib)
Figure BDA00039963731200014534
或西米普利单抗(cemiplimab)-rwlc
Figure BDA00039963731200014535
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与受体激动剂或配体疗法组合。在某些实施例中，受体激动剂或配体疗法包括激动剂抗体。在某些实施例中，受体激动剂或配体疗法包括受体配体，例如4-1BBL或CD40L。
(x)放射疗法
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与放射疗法组合。在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与放射性同位素颗粒如铟In-111、钇Y-90或碘I-131组合。组合疗法的实例包括但不限于碘-131托西莫单抗(tositumomab)
Figure BDA0003996373120001461
钇-90替坦-艾瑞妥莫单抗(ibritumomab tiuxetan)
Figure BDA0003996373120001462
和具有CHOP的
Figure BDA0003996373120001463
在某些实施例中，放射疗法包括外部束放射疗法(EBRT)、内部放射疗法(近距离放射疗法)、腔内放射疗法、间质近距离放射疗法、放射性栓塞、大分割放射疗法、术中放射疗法(IORT)、3D适形放射疗法、立体定向放射外科手术(SRS)或立体定向体部放射疗法(SBRT)。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种放射疗法组合以治疗被诊断患有结肠癌、直肠癌或结直肠癌(CRC)的受试者。在某些实施例中，放射疗法包括外部束放射疗法(EBRT)、内部放射疗法(近距离放射疗法)、腔内放射疗法、间质近距离放射疗法或放射性栓塞。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种放射疗法组合以治疗被诊断患有乳腺癌的受试者。在某些实施例中，放射疗法包括外部束放射疗法、大分割放射疗法、术中放射疗法(IORT)或3D适形放射疗法。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种放射疗法组合以治疗被诊断患有黑色素瘤/皮肤癌的受试者。在某些实施例中，放射疗法包括立体定向放射外科手术(SRS；例如，使用伽玛刀或直线加速器)或立体定向体部放射疗法(SBRT)。
(xi)疫苗和溶瘤病毒疗法
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与一种或多种免疫原性组合物组合，例如疫苗组合物或溶瘤病毒，其能够引起特异性免疫反应，例如肿瘤-特异性免疫反应。
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与疫苗组合物组合。疫苗组合物通常包含对要靶向的肿瘤特异的多种抗原和/或新抗原。疫苗组合物也可以称为疫苗。
在一些实施例中，疫苗组合物进一步包含佐剂和/或载剂。在一些实施例中，疫苗组合物与载剂例如蛋白或抗原呈递细胞(例如能够将肽呈递给T细胞的树突细胞(DC))相关联。在一些实施例中，载剂是支架结构，例如抗原或新抗原能够与之相关联的多肽或多糖。
通常，佐剂是掺入疫苗组合物中的任何物质，其增加或以其他方式改变对抗原或新抗原的免疫反应。任选地，佐剂是共价或非共价缀合的。佐剂增加对抗原的免疫反应的能力通常表现为免疫介导的反应的明显或显著增加，或疾病症状的减轻。例如，体液免疫的增加通常表现为针对抗原产生的抗体滴度的显著增加，并且T细胞活性的增加通常表现为细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌增加。佐剂也可以改变免疫反应，例如，通过将初级体液反应或Th反应改变为初级细胞反应或Th反应。合适的佐剂包括但不限于1018ISS、明矾、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫德、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel载体系统、PLG微粒、雷瑞喹莫、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、阿奎利亚QS21刺激物(Aquila’s QS21 stimulon)(阿奎利亚生物技术改善(Aquila Biotech)，伍斯特市，马萨诸塞州，美国)(其衍生自皂苷、分枝杆菌提取物和合成的细菌细胞壁模拟物)、和其他专有佐剂，例如利比解毒物(Ribi's Detox)、Quil或Superfos。不完全弗氏佐剂或GM-CSF等佐剂是有用的。几种对树突细胞特异的免疫佐剂(例如，MF59)及其制备方法之前已经描述过(Dupuis M,等人,Cell Immunol.[细胞免疫学]1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.[生物标准化研究进展]1998；92:3-11)。也可以使用细胞因子。几种细胞因子与以下直接相关：影响树突状细胞迁移到淋巴组织(例如TNF-α)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利号5,849,589，通过引用以其整体并入本文)以及作为免疫佐剂(例如IL-12)(Gabrilovich D I,等人,J Immunother EmphasisTumor Immunol.[免疫疗法杂志肿瘤免疫]1996(6):414-418)。在一些实施例中，佐剂包含CpG免疫刺激性寡核苷酸。在一些实施例中，佐剂包含TLR激动剂。
其他有用佐剂的实例包括但不限于经化学修饰的CpG(例如CpR、Idera)、聚(I:C)(例如聚i:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，例如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐珠单抗、塞来昔布、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、伊匹单抗、曲美利木单抗、和SC58175，它们可能具有治疗作用和/或作为佐剂。佐剂和添加剂的量和浓度可以由熟练的技术人员容易地确定而无需过度实验。其他佐剂包括集落刺激因子，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙莫司亭(sargramostim))。
在一些实施例中，疫苗组合物包含多于一种不同的佐剂。在一些实施例中，疫苗组合物包含任何佐剂物质，该佐剂物质包括任何上述或其组合。还考虑疫苗和佐剂可以一起或以任何合适的顺序分别施用。
在一些实施例中，载剂(或赋形剂)独立于佐剂而存在。在一些实施例中，载剂的功能是增加分子量、增加活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物活性或增加血清半衰期。在一些实施例中，载剂有助于将肽呈递给T细胞。在一些实施例中、载剂包括本领域技术人员已知的任何合适的载剂，例如蛋白或抗原呈递细胞。载剂蛋白的实例包括，但不限于，钥孔戚血蓝蛋白、血清蛋白(例如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白)、免疫球蛋白、或激素(例如胰岛素或棕榈酸)。对于人的免疫，载剂一般为人可接受且安全的生理上可接受的载剂。然而，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载剂。可替代地，载剂可以是葡聚糖，例如琼脂糖。
在一些实施例中，疫苗包含基于病毒载体的疫苗平台，例如牛痘、鸡痘、自我复制甲病毒、马拉巴病毒、腺病毒(参见，例如，Tatsis等人,腺病毒,Molecular Therapy[分子疗法](2004)10,616-629)、或慢病毒(包括但不限于第二代、第三代或混合第二/第三代慢病毒和设计用于靶向特定细胞类型或受体的任何世代的重组慢病毒(参见，例如，Hu等人,Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and InfectiousDiseases[通过慢病毒载体递送的用于癌症和传染病的免疫],Immunol Rev.[免疫学综述](2011)239(1):45-61,Sakuma等人,Lentiviral vectors:basic to translational[慢病毒载体:基础到转化],Biochem J.[生物化学杂志](2012)443(3):603-18,Cooper等人,Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviralvectors containing the human ubiquitin C promoter[拯救剪接介导的内含子缺失使含有人泛素C启动子的慢病毒载体的表达最大化],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2015)43(1):682-690,Zufferey等人,Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe andEfficient In vivo Gene Delivery[用于安全有效体内基因递送的自失活慢病毒载体],J.Virol.[病毒学杂志](1998)72(12):9873-9880)。通常，在引入宿主后，受感染的细胞表达抗原或新抗原，从而引发针对一种或多种肽的宿主免疫(例如，CTL)反应。
取决于上述基于病毒载体的疫苗平台的包装能力，在一些实施例中，疫苗组合物包含一种或多种病毒载体。在一些实施例中，病毒载体包含侧翼为非突变序列、由接头隔开、或前面有一个或多个靶向亚细胞区室的序列的序列(参见，例如，Gros等人,Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in theperipheral blood of melanoma patients[黑色素瘤患者外周血中新抗原特异性淋巴细胞的前瞻性鉴定],Nat Med.[自然医学](2016)22(4):433-8,Stronen等人,Targeting ofcancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires[用供体来源的T细胞受体库靶向癌症新抗原],Science.[科学](2016)352(6291):1337-41,Lu等人,Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cellsassociated with durable tumor regressions[T细胞识别的突变癌症抗原的有效鉴定与持久的肿瘤消退相关],Clin Cancer Res.[临床癌症研究](2014)20(13):3401-10)。可用于免疫方案的牛痘病毒载体和方法描述于例如美国专利号4,722,848中。另一个载体是BCG(卡介苗(Bacille Calmette Guerin))。BCG载体在Stover等人(Nature[自然]351:456-460(1991))中描述。从本文的描述中，本领域技术人员将清楚用于新抗原的治疗性施用或免疫的多种其他疫苗载体，例如伤寒沙门氏菌载体等。
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与溶瘤病毒疗法组合。一般来说，溶瘤病毒是经工程改造以主要感染和杀伤癌细胞的病毒。在一些实施例中，除了杀伤癌细胞的溶瘤病毒外，溶瘤病毒还诱导对癌细胞的免疫反应。
在某些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与溶瘤病毒疗法组合以治疗被诊断患有黑色素瘤/皮肤癌的受试者。在某些实施例中，溶瘤病毒包含拉-他利莫近(talimogenelaherparepvec)
Figure BDA0003996373120001491
也称为T-VEC。在一些实施例中，包含IL-12的亚基的异二聚体Fc融合蛋白与溶瘤病毒(例如，拉-他利莫近
Figure BDA0003996373120001501
或T-VEC)组合用于治疗癌症(例如晚期恶性肿瘤)。
(xii)手术干预
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与手术干预组合，其中异常组织(例如，肿瘤)被手术切除。在一些实施例中，使用手术刀或其他锋利的工具切割肿瘤和/或周围组织从受试者的身体切下肿瘤。在一些实施例中，激光可用于切割异常组织(例如肿瘤)。在一些实施例中，手术干预可以包括使用热疗，其暴露异常组织(例如肿瘤)以杀伤异常组织的细胞或使它们对放射和某些化学疗法药物更敏感。在一些实施例中，手术干预可以包括使用光动力疗法，其中某些药物被光激活以杀伤癌细胞。手术干预可以涉及开放手术或微创手术。在一些实施例中，手术干预可用于去除整个肿瘤、减积肿瘤或缓解癌症症状。
在一些实施例中，可以在施用异二聚体Fc融合蛋白疗法之前在受试者中进行手术干预。在其他实施例中，可以与异二聚体Fc融合蛋白疗法同时在受试者中进行手术干预。在其他实施例中，可以在异二聚体Fc融合蛋白疗法之后在受试者中进行手术干预。
(xiii)冷冻疗法
在一些实施例中，异二聚体Fc融合蛋白疗法与冷冻疗法(也称为冷冻消融术或冷冻手术)组合。在一些实施例中，通过应用液氮或氩气将冷冻疗法施用于患者以破坏异常组织(例如肿瘤)。在一些实施例中，对于受试者体内的肿瘤，可以使用冷冻探针来施用冷冻疗法，并且可以使用诸如超声或MRI的成像程序来引导冷冻探针和/或监测靶组织的冷冻。
在一些实施例中，冷冻疗法可以在异二聚体Fc融合蛋白疗法之前施用于患者。在其他实施例中，冷冻疗法可以与异二聚体Fc融合蛋白疗法同时施用于患者。在其他实施例中，冷冻疗法可以在异二聚体Fc融合蛋白疗法之后施用给受试者。
在某些实施例中，本文披露的治疗方法导致受试者或患者的疾病缓解或生存改善。例如，在某些实施例中，疾病缓解是完全缓解、部分缓解或疾病稳定。在某些实施例中，生存改善是改善的无进展生存期(PFS)或总生存期。改善(例如，在PFS中)可以相对于开始本披露的治疗之前的时期来确定。确定BTC(例如，晚期BTC、转移性BTC)或胆道肿瘤疗法的疾病缓解(例如，完全缓解、部分缓解或疾病稳定)和患者生存期(例如，PFS、总生存期)的方法是本领域的常规方法，并且在本文中被考虑。在一些实施例中，根据RECIST 1.1，在接受治疗的患者接受受影响区域(例如，胸部/腹部和骨盆，覆盖从胸腔入口上部到耻骨联合的区域)的对比增强计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)后，对疾病缓解进行评估。
在一些实施例中，测量免疫激活的生物标志物以评估生物活性。在某些实施例中，评估细胞参数，例如外周血单核细胞(PBMC)，以通过流式细胞术进行免疫表型分型(IPT)。在某些实施例中，评估可溶性因子，例如血清样品中的细胞因子和趋化因子。在某些实施例中，评估c-反应蛋白(CRP)的血清水平以确定毒性。在某些实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则受试者被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中。在某些实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度大约等于或低于阈值C反应蛋白浓度，则受试者不被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中。在具体实施例中，如果受试者血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则暂停药物配制品的施用；以较低剂量施用异二聚体Fc融合蛋白；或采取补救措施以减少或减轻该配制品在该受试者中的毒性作用。
在某些实施例中，离体IL12反应测定用于评估活性，其中收集PBMC用于离体刺激，然后分析IFNα的产生。在某些实施例中，可以评估循环肿瘤(ct)脱氧核糖核酸(DNA)。在某些实施例中，在治疗前和治疗后活组织检查中评估组织衍生的生物标志物，例如以研究临床功效和分析的标志物之间可能的相关性。在某些实施例中，确定PD-L1表达水平，例如，使用市售试剂盒(例如，Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)。在某些实施例中，作为T细胞浸润测定的CD3阳性通过免疫组织化学(IHC)确定。在某些实施例中，肿瘤浸润性白细胞的频率和/或定位(例如，CD8 T细胞、CD4 T细胞、Treg、NK细胞、巨噬细胞[M1/2谱])由IHC或免疫荧光显微镜(IF)确定。在一些实施例中，进行基因表达谱分析。在一些实施例中，进行药物基因组学分析。
(m)试剂盒
DF hIL12-Fc si的配制品被制备为冻干配制品或液体配制品。为了制备冻干配制品，将冻干的DF hIL12-Fc si灭菌并储存在一次性玻璃小瓶中。然后将几个这样的玻璃小瓶包装在试剂盒中，用于将剂量递送给被诊断患有癌症或肿瘤的受试者。
在一个方面，本披露提供了包括一个或多个容器的试剂盒，该一个或多个容器共同包括约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、或约10mg的异二聚体Fc-融合蛋白的配制品。在某些实施例中，本披露提供了试剂盒，其包括一个或多个容器，该一个或多个容器共同包括约1mg的异二聚体Fc融合蛋白的配制品。在某些实施例中，本披露提供了试剂盒，其包括一个或多个容器，该一个或多个容器共同包括约1mg异二聚体Fc融合蛋白的配制品，该异二聚体Fc融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二多肽
在某些实施例中，配制品被制备和包装为液体配制品并以约0.5mg/小瓶至约1.5mg/小瓶(例如，约0.5mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.1mg/小瓶)储存。在某些实施例中，配制品是液体配制品并且以约1mg/小瓶储存。
在某些实施例中，配制品被制备和包装为冻干配制品并以约0.5mg/小瓶至约1.5mg/小瓶(例如，约0.5mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.5mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.6mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.7mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.8mg/小瓶至约1.1mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.5mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.4mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.3mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.2mg/小瓶、约0.9mg/小瓶至约1.1mg/小瓶)储存。在某些实施例中，配制品是冻干配制品并且以约1mg/小瓶储存。
在某些实施例中，容器可共同包括约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约12mg、约15mg、约20mg、约21mg、约24mg、约25mg、约27mg、约30mg、约35mg、约36mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、或约100mg的本披露的异二聚体Fc融合蛋白(例如，DF hIL12-Fcsi)。在某些实施例中，容器包括约1mg的本披露的异二聚体Fc融合蛋白(例如，DF hIL12-Fcsi)。在某些实施例中，容器包括约1mg的异二聚体Fc融合蛋白，其包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二多肽。
在某些实施例中，容器中的配制品可以是冻干配制品。在某些实施例中，容器中的配制品可以是液体配制品。
在某些实施例中，配制品可以包装在含有合适数量的小瓶的试剂盒中。可以包括药物信息，这些信息与批准的提交文件一致。试剂盒可以在运输冷却器皿(2℃至8℃)中运输，使用温度控制装置监控该运输冷却器皿。
配制品可在2℃至8℃储存直至使用。配制品的小瓶可以是无菌和无热原的，并且可以不含抑菌防腐剂。
以上说明描述了本发明的多个方面和实施例。本申请确切地考虑了这些方面和实施例的所有组合和排列。
实例
现在通过参考以下实例，将更容易理解正总体上描述的本发明，仅出于说明本发明的某些方面和实施例的目的包括这些实例，而不意在限制本发明。
实例1-制备方法
通常使用重组DNA技术制备本发明的蛋白。在一个示例性实施例中，将编码第一多肽的第一核酸序列克隆到第一表达载体中，该第一多肽包含与第一抗体Fc结构域多肽融合的多亚基蛋白的第一亚基(人IL-12的p40亚基)(pET-pSURE-Puro)；将编码第二多肽的第二核酸序列克隆到第二表达载体中，该第二多肽包含与第二抗体Fc结构域多肽融合的多亚基蛋白的第二不同亚基(人IL-12的p35亚基)(pET-pSURE-Puro)；将第一和第二表达载体一起稳定转染到宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞)中，产生异二聚体Fc融合蛋白。
由第一表达载体编码的示例性氨基酸序列显示在SEQ ID NO:292中。第一表达载体编码第一多肽，该第一多肽包含人融合到包含Y349C突变的人IgG1 Fc序列的人IL-12的p40亚基。第一多肽还包括促进异二聚化的K360E和K409W突变，以及降低效应子功能的LALAPA(L234A、L235A和P329A)突变。在SEQ ID NO:292中，前导序列以斜体显示，人IL-12的p40亚基序列加下划线，并且突变以粗体显示。
Figure BDA0003996373120001541
Figure BDA0003996373120001551
由第二表达载体编码的示例性氨基酸序列显示在SEQ ID NO:293中。第二表达载体编码第二多肽，该第二多肽包含人融合到包含S354C突变的人IgG1 Fc序列的人IL-12的p35亚基。第二多肽还包括促进异二聚化的Q347R、D399V和F405T突变，以及降低效应子功能的LALAPA(L234A、L235A和P329A)突变。在SEQ ID NO:293中，前导序列以斜体显示，人IL-12的p35亚基序列加下划线，并且突变以粗体显示。
Figure BDA0003996373120001552
为了实现蛋白的最高产量，探索第一和第二表达载体的不同比例以确定转染到宿主细胞中的最佳比例。转染后，使用本领域已知的方法，例如有限稀释、ELISA、FACS、显微镜检查或Clonepix，分离单克隆用于细胞库生成。
在适合生物反应器扩大和维持蛋白表达的条件下培养克隆。使用本领域已知的方法分离和纯化蛋白，包括离心、深度过滤、细胞裂解、均化、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用交换色谱和混合模式色谱。
实例2-在CT26肿瘤模型中通过与沉默的Fc结构域多肽融合的IL-12进行的肿瘤抑制
本实例描述了重组鼠IL-12(rmIL-12)的两种IL-12-Fc融合构建体在小鼠结肠癌模型中控制肿瘤进展的相对能力。该实例中使用的两种IL-12-Fc融合物变体是mIL-12-Fc野生型(DF-mIL-12-Fc wt)(其包括融合到野生型鼠IgG2a Fc结构域多肽的N末端的野生型鼠IL-12p40和p35亚基)和mIL-12-Fc沉默(DF-mIL-12-Fc si)(其包括与具有突变L234A、L235A和P329G的鼠IgG2a Fc结构域多肽的N末端融合的野生型鼠IL-12p40和p35亚基)。蛋白的氨基酸序列如下所示：
mIL-12-p40-mIgG2A-EW(DF-mIL-12-Fc wt的第一链)
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTEKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSWLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG(SEQ ID NO:286)
mIL-12-p35-mIgG2A-RVT(DF-mIL-12-Fc wt的第二链)
RVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSGGGGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPRVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLVSDGSYTMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG(SEQ IDNO:287)
mIL-12-p40-mIgG2A-EW-LALAPG(DF-mIL-12-Fc si的第一链)
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTEKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSWLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG(SEQ ID NO:288)
mIL-12-p35-mIgG2A-RVT-LALAPG(DF-mIL-12-Fc si的第二链)
RVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSGGGGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPRVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLVSDGSYTMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG(SEQ IDNO:289)
简而言之，将106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠的胁腹。在肿瘤接种后第14天，当肿瘤体积达到270mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10/组)并用1μg rmIL-12、相当于1μg rmIL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc wt、相当于1μg rmIL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过腹膜内进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长60天。
如图2A-2C所示，虽然IL-12(图2A)和DF-mIL-12-Fc wt(图2B)在一些小鼠中控制肿瘤进展是有效的，但只有DF-mIL-12-Fc si诱导稳健的肿瘤消退并产生100％的完全肿瘤消退(图2C)。此外，通过DF-mIL-12-Fc si疗法的治疗显著延长了总生存期-100％的治疗小鼠在第60天仍然活着，而用同种型对照、DF-mIL-12-Fc wt和IL-12治疗的小鼠的中位生存时间分别为27天、33天和46天(图3)。
接下来，比较了不同剂量的DF-mIL-12-Fc wt和DF-mIL-12-Fc si在控制肿瘤进展中的作用。简而言之，将106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠的胁腹。在肿瘤接种后的第14天，当肿瘤体积达到300mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10/组)，并用相当于1g或0.1g rmIL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc wt或相当于1μg或0.1μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si通过腹膜内进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长55天。
如图4A-4D所示，在1μg rmIL-12摩尔当量剂量下，用DF-mIL-12-Fc wt治疗导致一些小鼠的肿瘤进展减少和两只小鼠中的完全消退(图4A)，但在0.1μg IL-12摩尔当量剂量下未观察到肿瘤抑制(图4C)。相比之下，1μg IL-12摩尔当量剂量的DF-mIL-12-Fc si治疗产生100％完全肿瘤消退(图4B)并在0.1μg IL-12摩尔当量的较低剂量下诱导肿瘤生长的稳健延迟(图4D)。用1μg IL-12摩尔当量的DF-mIL-12-Fc wt治疗的小鼠的中位生存期为32天，与用0.1μg IL-12摩尔当量的DF-mIL-12-Fc si治疗的小鼠的中位生存期34天相似，表明DF-mIL-12-Fc si的效力是其野生型变体的10倍(图5)。DF-mIL-12-Fc wt在0.1μg IL-12摩尔当量的剂量下无效，并且显示出与同种型治疗组相同的24天中位生存期。
接下来，比较了不同DF-mIL-12-Fc si施用途径的体内功效。简而言之，将106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠的胁腹。在肿瘤接种后第14天，当肿瘤体积达到270mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10/组)并用相当于1μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si或者mIgG2a的摩尔当量通过腹膜内或皮下进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长超过60天。
如图19A-19B所示，DF-mIL-12-Fc si的腹膜内(图19A)和皮下(图19B)施用均诱导稳健的肿瘤消退并产生100％完全肿瘤消退。因此，DF-mIL-12-Fc si治疗证明了使用各种施用途径的功效。
实例3-在B16F10肿瘤模型中通过与沉默的Fc结构域多肽融合的IL-12进行的肿瘤抑制
该实例描述了DF-mIL-12-Fc wt和DF-mIL-12-Fc si在小鼠黑色素瘤模型中控制肿瘤进展的相对能力。简而言之，将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠中。在肿瘤接种后第8天，当肿瘤体积达到250mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10)并用0.5μg IL-12、相当于0.5μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc wt、相当于0.5μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si或0.5μg mIgG2a同种型对照进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长32天。
如图6A-6C所示，虽然测试的每种IL-12-Fc构建体都延迟了肿瘤进展，但DF-mIL-12-Fc si在控制肿瘤生长方面是最有效的。用DF-mIL-12-Fc si治疗的小鼠的中位生存时间为29天，比用同种型对照、DF-mIL-12-Fc wt和IL-12治疗的小鼠的中位生存时间(分别为16天、26天和22天)更长(图7)。
接下来，比较了不同剂量的DF-mIL-12-Fc wt和DF-mIL-12-Fc si在控制肿瘤进展中的作用。简而言之，将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的胁腹。在肿瘤接种后第8天，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10/组)，并用0.5μg或0.1μg IL-12摩尔当量的DF-mIL-12-Fc wt，或0.5μg或0.1μg IL-12摩尔当量的DF-mIL-12-Fc si通过腹膜内进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长30天。
如图8A-8D所示，在两种剂量下，DF-mIL-12-Fc si在抑制肿瘤生长方面都优于DF-mIL-12-Fc wt。此外，在每个剂量下，用DF-mIL-12-Fc wt治疗的小鼠的中位生存期为20天。相比之下，用0.1μg IL-12摩尔当量的DF-mIL-12-Fc si治疗的小鼠的中位生存期为21天，并且用0.5μg IL-12摩尔当量的DF-mIL-12-Fc si治疗的小鼠的中位生存期为28天(图9)。这些结果表明，与野生型对应物或同种型对照相比，高剂量(0.5μg IL-12摩尔当量)的DF-mIL-12-Fc si显著增加了小鼠的生存期。
接下来，将DF-mIL-12-Fc si治疗的单剂量施用与先前描述的每周治疗进行比较。简而言之，将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠中。在肿瘤接种后第8天，当肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10)并用相当于0.5μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si或者mIgG2a的摩尔当量进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长39天。
如图20所示，DF-mIL-12-Fc si的单次施用导致100％的小鼠中的肿瘤生长减少，尽管与每周施用相比肿瘤生长发生得更快(图6C)。此外，小鼠表现出短暂的体重减轻，但仅在第一次施用后(数据未显示)。因此，DF-mIL-12-Fc si的单次施用在难以治疗的肿瘤模型中表现出初步功效，尽管随后每周施用在该模型中延迟肿瘤生长方面效果更好。
接下来，比较了不同DF-mIL-12-Fc si施用途径的体内功效。简而言之，将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠中。在肿瘤接种后第7天，当肿瘤体积达到260mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10)并用相当于1μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si或者mIgG2a的摩尔当量通过腹膜内或皮下进行治疗，每周一次。评估肿瘤生长40天。
如图21A-21B所示，腹膜内(图21A)和皮下(图21B)施用DF-mIL-12-Fc si在100％小鼠中诱导肿瘤消退。因此，DF-mIL-12-Fc si治疗证明了使用各种施用途径的功效。
实例4-DF-hIL-12-Fc wt和rhIL-12的体外效力
DF-hIL-12-Fc si与rhIL-12相比的效力使用体外生物测定进行评估。
使用HEK-Blue IL-12报告基因测定评估IL-12效力。从培养物中收获IL-12R+HEK-Blue报告细胞(英杰公司(InvivoGen))，并在培养基中调整为1x106个细胞/mL。DF-hIL-12-Fc si(DF IL-12-Fc)和重组人IL-12(rhIL-12；派普泰克公司(PeproTech))在培养基中稀释。将100μL PBMC悬浮液与100μL的稀释的测试品混合并孵育48小时。收获上清液并按照制造商的说明通过测量来自细胞的分泌的胚胎碱性磷酸酶来检测由报告细胞稳定表达的IL-12受体和信号传导组分的结合。简而言之，将25μL样品上清液与200μL QUANTI-Blue试剂混合，并在室温避光孵育10分钟。然后用SpectraMax i3x读板仪在620nM下读取该板，并报告光密度代表相对IL-12活性。
如图10A所示，IL-12R+HEK报告细胞产生的SEAP随着DF-hIL-12-Fc si或rhIL-12浓度的增加而增加。在所检查的浓度下，在HEK-Blue报告基因测定中测得的IL-12反应在DF-hIL-12-Fc si和rhIL-12之间具有可比性。
接下来，通过定量人PBMC产生的IFNγ来评估IL-12效力。使用密度梯度离心从人外周血血沉棕黄层中分离PBMC，并在培养基中调整为1x106个细胞/mL。DF-hIL-12-Fc si和重组人IL-12(rhIL-12)在培养基中稀释。将100μL PBMC悬浮液与100μL的稀释的测试品混合并孵育48小时。收获上清液并使用人IFN-γELISA MAX试剂盒(博奇公司(BioLegend))对IFNγ进行定量。在IFNγELISA板显色后，使用SpectraMax i3x仪器在450nm处读取，并扣除540nm处的背景。样品孔中的IFNγ含量通过从测定标准曲线中插入样品读数来近似。
如图10B所示，当人PBMC与DF-hIL-12-Fc si或rhIL-12一起培养(同时用5μg/mlPHA处理以放大IFNγ反应的幅度)时，IFNγ产生增加。在所检查的浓度下，IL-12刺激后的IFN-γ产生在DF-hIL-12-Fc si和rhIL-12之间相当。
因此，尽管两种细胞类型和刺激条件下的EC50值差异超过一个数量级，但在两种测定中都显示了DF-hIL-12-Fc si和rhIL-12的相当活性，表明DF-hIL-12-Fc si构建体的效力表现出与天然重组人IL-12相似的效力。
实例5-IV输注DF-hIL-12-Fc si或rhIL-12后猴血浆中的IL-12、DF-hIL-12-Fc si和IFNγ浓度
在IV输注DF-hIL-12-Fc si或rhIL-12后，在食蟹猴中评估药效学(PD)和药代动力学(PK)。
通过IV输注以10μg/kg向食蟹猴施用DF-hIL-12-Fc si和重组人IL-12。
免疫测定用于检测DF-hIL-12-Fc si和人IL-12(基于Quantikine ELISA人IL-12p70免疫测定试剂盒)：该测定采用定量夹心酶免疫测定技术。使用对人IL-12p70特异的单克隆抗体作为固相捕获物，并使用抗体HRP标记的报告子完成检测。标准品和掺有rhIL-12或DF-hIL-12-Fc si参考标准品的QC以及测试样品被移液到微量滴定板的孔中，样品中存在的任何IL-12p70都与固相上的固定化抗体结合。洗去未结合的物质，并将人IL-12p70特异性酶联多克隆抗体加入孔中。洗去未结合的抗体-酶试剂，并在每个孔中加入TMB底物。产生的酶反应产生蓝色产物，当添加酸终止溶液时蓝色产物会变成黄色。在每个孔中测量的颜色强度与初始步骤中结合的rhIL-12或DF-hIL-12-Fc si的量成正比。在具有数据收集软件SoftMax Pro Enterprise 4.6版的SpectraMax酶标仪上在450nm处读取板，其中以540nm为参考。数据被转换为文本文件并在Watson LIMS v.7.2.0.02中导入/处理。使用权重因子为1的逻辑(自动估计)曲线拟合进行回归。
还使用免疫测定法(中尺度发现公司(MSD)-ELISA类免疫测定法)检测DF-hIL-12-Fc si，其涉及用猴吸附的山羊抗人IgG涂覆未处理的MSD微量滴定板并在室温下孵育。将板洗涤、封闭、洗涤并且用掺加有DF-hIL-12-Fc si参考标准的标准曲线和质量对照样品、以及测试样品孵育。在该孵育之后，洗涤板并将生物素抗人IL-12/IL-23p40作为第一检测抗体添加到板中。在另一个洗涤步骤后，添加链霉亲和素缀合的Sulfo标签作为第二检测抗体。最后一次洗涤板，将MSD读取缓冲液T添加到板中，并使用MSD Sector Imager S600读取板。原始MSD数据被导出为文本文件，然后使用在Envigo定制设计的编程Excel电子表格将其转换为Watson LIMS兼容文件。在Watson LIMS软件v.7.2.0.02中导入和回归数据。
对食蟹猴血浆中NHP促炎生物标志物的相对定量测量进行了中尺度发现方法。该方法使用夹心免疫测定程序对促炎组1生物标志物进行相对定量测量：食蟹猴K2 EDTA血浆(简称猴血浆)中的IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10。该方法基于V-PLEX和V-PLEXPlus的MSD非人灵长类动物(NHP)试剂盒，货号K15056D-1、K15056D-2、K15056D-4、K15056D-6、K15056G-1、K15056G-2、K15056G-4、K15056G-6。该方法采用与食蟹猴反应的人捕获和检测抗体。该试剂盒提供的板在96孔多点板的每个孔中的独立的经良好限定的点上预涂有捕获抗体。将板与猴血浆样品一起孵育，洗涤，然后与跟电化学发光(ECL)标记(MSD SULFO-TAG)缀合的检测抗体(对每种分析物特异)一起孵育。样品中的分析物结合捕获固定在工作电极表面的抗体；结合的分析物对检测抗体的募集完成了夹心。洗涤板并添加MSD读取缓冲液以创建适合电化学发光(ECL)的化学环境。将该板加载到MSD Sector Imager 600(SI600)仪器中，在该仪器中向板电极施加电压，使捕获的标记发光。该仪器根据相对光单位(RLU)测量发射光的强度，以提供样品中分析物的相对定量测量。原始RLU数据被导出为文本文件，然后使用在Envigo定制设计的编程Excel电子表格将其转换为Watson LIMS兼容文件。随后在Watson LIMS软件v.7.2.0.02中导入和回归数据。
图11显示了IV施用后DF-hIL-12-Fc si和重组人IL-12随时间的相对血浆浓度。数据表明，如预期的那样，DF-hIL-12-Fc si和rhIL-12的浓度随时间降低。然而，与rhIL-12相比，随着时间的推移，DF-hIL-12-Fc si表现出延长的半衰期和更大的总体暴露。
图11还显示了IV施用后猴血浆中IFNγ(PD)的相对浓度。数据表明了通过IFNγ产生评估的DF-hIL-12-Fc si和rhIL-12的药效学，两者在IV施用后均表现出活性。然而，与rhIL-12相比，DF-hIL-12-Fc si表现出更高的峰活性和更长的持续时间。
实例6-小鼠替代物DF-mIL-12-Fc si的药理学表征
检查了半衰期延长的鼠IL-12变体(命名为DF-mIL-12-Fc si)的血清半衰期和体内药效学。
将相应于1μg IL-12的当量摩尔量的DF-mIL-12-Fc si静脉注射到非荷瘤Balb/c小鼠中，并将PK/PD特征与IL-12进行比较。用1μg DF-mIL-12-Fc si和IL-12(1μg IL-12的当量摩尔)静脉内注射初治Balb/c(n＝6)。在注射后0.017、0.5、3、6、24、48、72、96、144和219小时对血液进行取样。如前所述，通过ELISA分析血清中的IL-12和IFNγ水平。
如图12A和12B所示并在表15中定量，DF-mIL-12-Fc si显示延长的血清半衰期，为约30小时(图12B，DF-mIL-12-Fc si T1/2＝29.85小时)，这比IL-12的血清半衰期长5倍(图12A；IL-12T1/2＝6.05小时)。除了延长的半衰期外，与IL-12(AUC＝20304)相比，DF-mIL-12-Fc si介导的IFNγ产生(AUC＝916654)也延长。
接下来，比较了施用DF-mIL-12-Fc si的不同途径的PK/PD特性。将等摩尔量的DF-mIL-12-Fc si(对应于1μg IL-12)作为单剂量通过静脉内、腹膜内或皮下施用注射到非荷瘤Balb/c小鼠中并且对PK/PD特征进行了评估，如所述。
如图12C-12E所示并在表16中定量，静脉内(图12C)、腹膜内(图12D)或皮下(图12E)施用均导致DF-mIL-12-Fc si介导的IFNγ产生在不同施用途径上相当。值得注意的是，皮下施用导致较低的IL-12C最大。因此，DF-mIL-12-Fc si施用的药代动力学特性(例如，IL-12浓度)因施用途径而异，而药效学特性(IFNγ产生)在不同的途径上保持长时间且相对地可比性。
表15：DF-mIL-12-Fc si和rmIL-12的药理学特征
Figure BDA0003996373120001641
表16：经由IV、IP和SC的DF-mIL-12-Fc si的药理学特征
T1/2 跨度 T最大 C最大 AUC
静脉内 31.5 6.4 0.2 257.2 5985.6
腹膜内 34.70 5.19 N/A 75.09 3964.21
皮下 37.5 4.1 36.0 23.1 1938.1
实例7-B16F10小鼠模型中DF-mIL-12-Fc si和PD-1阻断的组合
进行DF-mIL-12-Fc si和PD-1阻断的组合疗法，以分析在已建立的B16F10肿瘤中是否可以放大抗肿瘤免疫反应。
将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的胁腹。在肿瘤接种后的第8天，将小鼠随机分组(n＝10/组)。当平均肿瘤体积达到约245mm3时，用0.5μg同种型对照、0.5μg DF-mIL-12-Fc si、200μg抗-PD-1克隆RMP1-14，或组合的DF-mIL-12-Fc si/抗PD-1通过腹膜内治疗小鼠。动物每周注射一次DF-mIL-12-Fc si，每周注射两次抗PD-1。评估肿瘤生长60天，并监测生存和体重。
如图13A-13C所示，而单独施用DF-mIL-12-Fc si延迟了肿瘤消退(图13A)并且单独的PD-1对肿瘤的生长影响最小(图13B)，DF-mIL-12-Fc si与PD-1阻断的组合进一步延迟了肿瘤生长(图13C)，表明抗PD-1治疗进一步放大了对DF-mIL-12-Fc si治疗的抗肿瘤反应。
如图14A和14B所示，DF-mIL-12-Fc si疗法和与PD-1阻断组合的总生存期延长，显示中位生存期为29天(DF-mIL-12-Fc si单一疗法)和36天(组合)，相比之下，同种型情况下为15天的和200μg抗PD-1治疗的小鼠情况下为17.5天(图14A)。值得注意的是，尽管缓解率高，但DF-mIL-12-Fc si和组合疗法的方案似乎被B16F10荷瘤小鼠良好耐受(图14B)。
因此，DF-mIL-12-Fc si和PD-1阻断的组合疗法与单独的任一治疗相比显示出改善的功效。
实例8-DF-mIL-12-Fc si与mcFAE-C26.99 TriNKET在B16F10小鼠模型中的组合
进行DF-mIL-12-Fc si和mcFAE-C26.99 TriNKET的组合疗法，以分析在已建立的B16F10肿瘤中是否可以放大抗肿瘤免疫反应。
将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的胁腹。在肿瘤接种后的第7天，将小鼠随机分组(n＝10/组)。当肿瘤平均达到200mm3时，用150μg同种型对照或0.5μgDF-mIL-12-Fc si、150μg TriNKET或组合DF-mIL-12-Fc si/TriNKET通过腹膜内治疗小鼠。评估肿瘤生长60天，并监测生存和体重。
如图15A所示，DF-mIL-12-Fc si的单一疗法导致肿瘤生长减少。在起始肿瘤体积为200mm3时，使用mcFAE-C26.99 TriNKET作为单一药剂进行治疗不会导致肿瘤进展延迟(图15B)。相反，与单独的DF-mIL-12-Fc si相比，DF-mIL-12-Fc si与mcFAE-C26.99的组合进一步增强了抗肿瘤反应(图15C)和导致30％完全缓解者(CR)(n＝3)，表明TriNKET治疗进一步放大了对DF-mIL-12-Fc si治疗的抗肿瘤反应。
如图16A所示，DF-mIL-12-Fc si疗法和与mcFAE-C26.99TriNKET组合的总生存期延长，显示中位生存期为29天(DF-mIL-12-Fc si单一疗法)和60天(TriNKET组合)，相比之下，同种型情况下为16天的和TriNKET治疗的小鼠情况下为17天。值得注意的是，尽管缓解率高，但DF-mIL-12-Fc si和组合疗法的方案似乎被B16F10荷瘤小鼠良好耐受(图16B)。
在第一次肿瘤接种后72天，用2x106个B16F10黑色素瘤细胞再次激发三个完全缓解者(来自上述实验的CR和图15C中呈现的数据)。年龄匹配的初治C57BL/6小鼠用作对照组。来自初始DF-mIL-12-Fc si/TriNKET组合治疗组的3只小鼠中有1只保持无肿瘤，另一只小鼠在第95天开始出现肿瘤形成，第三只小鼠的肿瘤进展与年龄匹配的对照组相似(图17)，提示组合疗法形成免疫记忆。
因此，DF-mIL-12-Fc si和TriNKET的组合疗法与单独的任一治疗相比显示出改善的功效，包括在小鼠群体中显示出完全持久缓解。
实例9-用DF-mIL-12-Fc si治疗促进CT26肿瘤模型的完全恢复
该实例表明，用DF-mIL-12-Fc si治疗促进携带CT26肿瘤的小鼠的恢复。
简而言之，将106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠的胁腹。在肿瘤接种后第14天，当肿瘤体积达到270mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组，并以相当于1μgrmIL-12的摩尔剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过腹膜内注射，每周一次。评估肿瘤生长60天。在第一次肿瘤接种后72天，用106个CT26细胞再次激发完全缓解者。年龄匹配的初治Balb/C小鼠用作对照组。
图18A的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用单剂量1μg DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图18B的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用每周剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的体重。图18C的图显示用接种CT26肿瘤细胞再次激发的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
如图18A-B所示，与mIgG2a同种型相比，DF-mIL-12-Fc si的施用导致稳健的肿瘤消退，没有可观察到的影响治疗动物体重的毒性。如图18C所示，初始DF-mIL-12-Fc si处理的小鼠保持无肿瘤，表明用DF-mIL-12-Fc si治疗形成了免疫记忆。
实例10-腹膜内或皮下递送的DF mIL-12-Fc si有效减少CT26肿瘤模型中的肿瘤体积
该实例表明，腹膜内或皮下施用DF-mIL-12-Fc si确保携带CT26肿瘤的小鼠100％完全恢复。
简而言之，将106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠的胁腹。在肿瘤接种后第14天，当肿瘤体积达到270mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组，并以相当于1μgIL-12的摩尔剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过腹膜内注射每周一次，或相当于1μg IL-12的摩尔剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过皮下注射每周一次。评估肿瘤生长超过60天。
图19A的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用通过腹膜内递送的每周剂量1μg DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图19B的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用通过皮下递送的每周剂量1μg DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
如图19A-B所示，DF-mIL-12-Fc si的腹膜内或皮下递送在减少CT26肿瘤体积方面是有效的。
实例11-DF-mIL-12-Fc si的单剂量施用有效减少B16F10小鼠模型中的肿瘤体积
该实例表明，单剂量的DF-mI12-Fc si可有效减少携带B16F10黑色素瘤的小鼠的肿瘤体积。
简而言之，将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的胁腹。在肿瘤接种后的第7天，将小鼠随机分组。当肿瘤平均达到200mm3时，用单剂量的同种型对照或1μgDF-mIL-12-Fc si对小鼠通过腹膜内进行治疗。评估肿瘤生长50天。
如图20所示，单次施用μg DF-mIL-12-Fc si可有效减少B16F10荷瘤小鼠中的肿瘤体积。
实例12-腹膜内或皮下递送的DF-mIL-12-Fc si有效减少B16F10小鼠模型中的肿瘤体积
该实例表明，腹膜内或皮下施用DF-mIL-12-Fc si导致携带B16F10黑色素瘤的小鼠100％完全恢复。
简而言之，将106个B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的胁腹。在肿瘤接种后的第7天，将小鼠随机分组。当肿瘤平均值达到200mm3时，将小鼠以相当于1μg IL-12的摩尔剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过腹膜内注射每周一次，或相当于1μg IL-12的摩尔剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过皮下注射每周一次。评估肿瘤生长40天。
如图21A-B所示，与同种型对照相比，DF-mIL-12-Fc si的腹膜内或皮下递送在减少B16F10肿瘤体积方面是有效的。
实例13-DF-mIL-12-Fc si作为单剂量有效
该实例表明，当作为单剂量施用时，DF-mIL-12-Fc si在减少CT26肿瘤体积方面是有效的，而当通过重复给药施用时，甚至更有效。
简而言之，将106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠的胁腹。在肿瘤接种后第14天，当肿瘤体积达到270mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10/组)，并以相当于0.1μg IL-12的摩尔剂量的单剂量1μg DF-mIL-12-Fc si或1μg mIgG2a同种型对照通过腹膜内注射，每周一次。可替代地，给小鼠通过腹膜内注射相当于1μg IL-12的摩尔剂量的1μg DF-mIL-12-Fc si，或1μg mIgG2a同种型对照，每周一次。评估肿瘤生长超过60天。
图22A的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用单剂量1μg DF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图22B的图显示接种CT26肿瘤细胞并施用每周剂量1μgDF-mIL-12-Fc si或mIgG2a同种型的个体小鼠的肿瘤生长曲线。
如图18A和图22A所示，与mIgG2a同种型相比，单次施用1μg DF-mIL-12-Fc si导致荷瘤小鼠的稳健70％完全恢复。然而，如图2C和图22B所示，与mIgG2a同种型相比，每周重复给予1μg DF-mIL-12-Fc si确保荷瘤小鼠100％完全恢复。如图18B所示，即使是DF-mIL-12-Fc si的重复施用也被良好耐受，没有观察到毒性，如通过体重评估的。
此外，完全缓解者(CR)在另一侧用5x105个CT26-Tyrp1结肠癌细胞再次激发，并将肿瘤进展与以相同肿瘤剂量激发的初治小鼠进行比较。如图18C所示，虽然肿瘤在初治小鼠中生长，但100％的完全缓解者在再次激发后保持无肿瘤。因此，DF-mIL-12-Fc si的单次施用在小鼠群体中表现出完全持久缓解。
实例14-用单次皮下剂量的DF-hIL-12-Fc si治疗的食蟹猴中的药代动力学
在皮下注射1μg/kg(图25A)、2μg/kg(图25B)或4μg/kg(图25C)DF-hIL-12-Fc si后在食蟹猴中使用ELISA样免疫测定-中尺度发现公司(MSD)免疫测定方法来测量药代动力学。简而言之，将未经处理的MSD微量滴定板包被猴吸附的山羊抗人IgG，并在室温孵育。在包被和孵育之后，将板洗涤、封闭、洗涤并且用掺加有DF-hIL-12-Fc si参考标准的标准曲线和质量对照样品以及测试样品孵育。孵育后，洗涤板并将生物素抗人IL-12/IL-23p40作为第一检测抗体添加到板中。在另一个洗涤步骤后，添加链霉亲和素缀合的Sulfo标签作为第二检测抗体。在将MSD读取缓冲液T添加到板之前，最后一次清洗板。使用MSD SectorImager S6000读取板。
图25A-25C是显示用1μg/kg(图25A)、2μg/kg(图25B)，或4μg/kg(图25C)的DF-hIL-12-Fc si的单次皮下剂量治疗的食蟹猴中的药代动力学的线图。
数据表明，如预期的那样，DF-hIL-12-Fc si和rhIL-12的浓度随时间降低，在所有测试剂量下具有相似的药代动力学特征。
实例15-用单次皮下剂量的DF-hIL-12-Fc si治疗的食蟹猴中的细胞因子释放
在食蟹猴中皮下注射1μg/kg(图26A和26B)、2μg/kg(图26C和26D)，或4μg/kg(图26E和26F)的DF-hIL-12-Fc si后使用MSD免疫测定试剂盒进行细胞因子的定量测量。该方法使用夹心免疫测定试剂盒(促炎组1生物标志物和V-PLEX Plus趋化因子组1NHP试剂盒)对促炎组1生物标志物进行相对定量测量：食蟹猴K2 EDTA血浆(简称猴血浆)中的IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10。该方法基于V-PLEX和V-PLEX Plus的MSD非人灵长类动物(NHP)试剂盒，货号K15056D-1、K15056D-2、K15056D-4、K15056D-6、K15056G-1、K15056G-2、K15056G-4、K15056G-6。该方法采用与食蟹猴反应的人捕获和检测抗体。该试剂盒提供的板在96孔多点板的每个孔中的独立的经良好限定的点上预涂有捕获抗体。将板与猴血浆样品一起孵育，洗涤，然后与跟电化学发光(ECL)标记(MSD SULFO-TAG)缀合的检测抗体(对每种分析物特异)一起孵育。样品中的分析物结合捕获固定在工作电极表面的抗体；结合的分析物对检测抗体的募集完成了夹心。洗涤板并添加MSD读取缓冲液以创建适合电化学发光(ECL)的化学环境。将该板加载到MSD Sector Imager 600(SI600)仪器中，在该仪器中向板电极施加电压，使捕获的标记发光。该仪器根据相对光单位(RLU)测量发射光的强度，以提供样品中分析物的相对定量测量。原始RLU数据被导出为文本文件，然后使用在Envigo定制设计的编程Excel电子表格将其转换为Watson LIMS兼容文件。随后在Watson LIMS软件v.7.2.0.02中导入和回归数据。
图26A-26F的线图显示在用1μg/kg(图29A和29B)，2μg/kg(图26C和26D)，或4μg/kg(图26E和26F)DF-hIL-12-Fc si的单次皮下剂量治疗的食蟹猴中的IFNγ浓度(图26A、26C和26E)和IP10/CXCL10(图26B、26D和26F)。
如图26A所示，1μg/kg的DF-hIL-12-Fc si的单次皮下剂量没有导致可检测水平的IFNγ。2μg/kg和4μg/kg的DF-hIL-12-Fc si皮下剂量导致一些动物的IFNγ水平增加，在给药后第4天达到峰值(图26C和26E)。1μg/kg、2μg/kg和4μg/kg的DF-hIL-12-Fc si皮下剂量均导致IP10/CXCL10水平升高，在给药后第4天达到峰值(图26B、26D和26F)。
实例16-在4T1原位小鼠模型中使用放射或化学疗法的DF-mIL-12-Fc si组合疗法
为了显示是否可以放大通过施用DF-mIL-12-Fc si引发的抗肿瘤活性，进行了使用放射或化学疗法的组合研究。简而言之，将5x105个4T1-luc肿瘤细胞原位注射到Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中。在肿瘤接种后的第14天，将小鼠随机分组(n＝10/组)。用同种型、DF-mIL-12-Fc si(均与1μg IL-12等摩尔)、5mg/kg
Figure BDA0003996373120001701
(化学疗法)静脉内皮下或用10Gy辐射作为单一疗法，或DF-mIL-12-Fc si与
Figure BDA0003996373120001702
或辐射相组合对小鼠进行治疗。随着时间的推移评估肿瘤生长。图27的图显示接种乳腺癌细胞并施用每周剂量的同种型对照、DF-mIL-12-Fc si、Doxil(化学疗法)或以10Gy照射作为单一疗法或DF-mIL-12-Fc si与
Figure BDA0003996373120001703
或辐射相组合的个体小鼠的肿瘤生长曲线。图表显示肿瘤生长的组平均值±标准误差平均值。
如图27所示，虽然DF-mIL-12-Fc si的单一疗法本身对4T1荷瘤小鼠有效，但组合疗法放大了抗肿瘤免疫反应，导致10-30％的小鼠肿瘤完全消退。
实例17-DF-mIL-12-Fc si介导的针对大的、PD-1阻断抗性CT26结肠癌肿瘤的抗肿瘤功效
该实例分析DF-mIL-12-Fc是否对PD-1阻断抗性CT26-Tyrp1肿瘤产生有效的抗肿瘤反应。简而言之，将Balb/c小鼠注射0.5x106个CT26-Tyrp1肿瘤细胞。在平均肿瘤体积达到约120mm3时接种后，在第9天随机分配小鼠。用200μg同种型或抗PD-1抗体治疗小鼠(每周两次)。图28A的图显示接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用同种型对照或抗PD-1抗体处理(两周一次)的Balb/c小鼠的肿瘤生长曲线。在第17天，先前用抗PD-1治疗的组(平均肿瘤体积约800mm3)被细分为两个治疗组。第1组继续每周两次接受PD-1阻断治疗，第2组接受PD-1阻断(每周两次)以及DF-mIL-12-Fc si(每周1μg)。图28B的图显示先前用抗PD-1抗体治疗(每两周一次)连同用1μg DF-mIL-12-Fc si每周治疗的经抗PD-1抗体治疗的Balb/c小鼠的肿瘤生长曲线。
如图28A所示，抗PD-1单一疗法未能控制肿瘤进展。然而，如图28B所示，添加DF-mIL-12-Fc si导致有效的肿瘤消退。
实例18-DF-mIL-12-Fc si针对大CT26结肠癌肿瘤的局部治疗诱导远位抗肿瘤反应
该实例显示了DF-mIL-12-Fc si治疗是否可以诱导远位治疗效果。简而言之，Balb/c在左侧(0.8x106个肿瘤细胞)和右侧(0.4x106个肿瘤细胞)胁腹皮下植入CT26-Tyrp1结肠癌细胞。在肿瘤接种后第13天，左侧肿瘤每周一次注射0.1μg同种型对照或0.1μg DF-mIL-12-Fc si，持续2-3周。图29A的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用同种型对照或DF-mIL-12-Fc si治疗一次(每周)的Balb/c小鼠中经治疗的(Tr)肿瘤的肿瘤生长曲线。右侧肿瘤未治疗(NT)。
图29B的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞的Balb/c小鼠中未治疗(NT)肿瘤的肿瘤生长曲线。
如图29A-29B所示，对照同种型治疗的肿瘤在左右部位均进展性生长。如图29A-29B所示，DF-mIL-12-Fc si在局部注射部位(图29A)和远处未治疗的肿瘤引起有效的抗肿瘤反应(图29B)，表明远位治疗效果。
实例19-DF-mIL-12-Fc si介导的针对大CT26结肠癌肿瘤的抗肿瘤功效
该实例显示了DF-mIL-12-Fc si(其包括与具有突变L234A、L235A和P329G的鼠IgG2a Fc结构域多肽的N末端融合的野生型鼠IL-12p40和p35亚基(在实例2中讨论))对较大的肿瘤体积有效。
测试了DF-mIL-12-Fc si介导的针对大CT26结肠癌肿瘤的抗肿瘤功效。简而言之，将Balb/c小鼠皮下注射106个CT26-Tyrp1结肠癌细胞。在肿瘤接种后第18天，当肿瘤体积达到800mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝10/组)并用相当于1μg或2μg IL-12的摩尔剂量的DF-mIL-12-Fc si或者mIgG2a的摩尔当量通过腹膜内进行治疗，每周一次。
评估肿瘤生长65天。图23A的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用2μg mIgG2a同种型对照或1μg DF-mIL-12-Fc si治疗一次(每周)的Balb/c小鼠的肿瘤生长曲线。图23B的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用2μg mIgG2a同种型对照或2μg DF-mIL-12-Fc si治疗一次(每周)的Balb/c小鼠的肿瘤生长曲线。图30A的图显示在接种CT26-Tyrp1肿瘤细胞并用2μg mIgG2a同种型对照或2μg DF-mIL-12-Fc si治疗一次的Balb/c小鼠的肿瘤生长曲线。图30B的图显示用CT26-Tyrp1肿瘤细胞接种并用2μgmIgG2a同种型对照、1μg DF-mIL-12-Fc si(每周施用)、2μg DF-mIL-12-Fc si(每周施用)或2μg DF-mIL-12-Fc si(一次)治疗的Balb/c小鼠的平均肿瘤生长曲线。图23A、23B和30A显示了个体小鼠的肿瘤生长曲线。图30B显示了肿瘤平均值±标准误差平均值。
如图23A、23B和30B所示，DF-mIL-12-Fc si的每周剂量(1μg或2μg)有效控制肿瘤进展，并且100％的小鼠对DF-mIL-12-Fc si治疗有缓解。另外，如图30A所示，2μg DF-mIL-12-Fc si的单次治疗显示肿瘤消退，产生100％缓解率。该实例中描述的数据和图表明，DF-mIL-12-Fc si不仅在减少较大的CT26肿瘤体积方面有效，而且在作为单剂量施用时也有效减少CT26肿瘤体积。
实例20-针对B16F10黑色素瘤的DF-mIL-12-Fc si治疗诱导血清和肿瘤中细胞因子和趋化因子的产生
该实例显示DF-mIL-12-Fc si治疗导致携带B16F10肿瘤的C57BL/6小鼠血液和肿瘤中的IFNγ、CXCL9和CXCL10水平升高。简而言之，将C57BL/6小鼠皮下注射106个B16F10黑色素瘤细胞。在肿瘤接种后第7天(当平均肿瘤体积达到150mm3时)，将小鼠随机分组(每组n＝8)。用同种型对照、IL-12或与1μg IL-12等摩尔的DF-mIL-12-Fc通过腹膜内治疗小鼠。
治疗后72小时后，制备血清和肿瘤裂解物并使用多路复用技术分析IFNγ(图24A)、CXCL9(图24B)和CXCL10(图24C)表达。图31A-C显示小鼠中的平均细胞因子/趋化因子水平。
如图24A-24C所示，单次施用0.5μg DF-mIL-12-Fc si导致IFNγ(图24A)、CXCL9(图24B)和CXCL10(图24C)在血清(左分图)和肿瘤内(右分图)表达增加，而IL-12治疗几乎没有或没有效果。
实例21-具有LALAPA和LALAPG突变的DF hIL-12-Fc si具有相似的IFNγ刺激活性和消除的FcγR结合
该实例显示具有LALAPA(L234A、L235A和P329A)突变或LALAPG(L234A、L235A和P329G)突变的DF hIL-12-Fc si(具有IgG1 Fc)的IFNγ刺激和FcγR结合活性。简而言之，将人PBMC与5μg/ml植物血凝素(PHA)和剂量滴定的具有LALAPA或LALAPG突变的DF hIL-12-Fc-si一起培养2天。刺激2天后，收集上清液并通过ELISA测量IFNγ含量。为了确定FcγR结合活性，通过流式细胞术检测与表达高亲和力FcγR CD32和CD64的THP-1细胞结合的荧光团缀合hIgG1同种型抗体(83nM)。
如图31A所示，同时与PHA一起的情况下hIL-12-Fc-LALAPA和hIL-12-Fc-LALAPG具有相似的刺激PBMC产生IFNγ的能力，远高于单独使用PHA产生的量。
如图31B所示，在与标记的hIgG1同种型抗体的混合物中同时包含16倍摩尔过量的hIL-12-Fc-wt(1.3μM)导致结合信号显著降低，可能是由于IgG1与CD32和CD64的竞争结合。相反，在相同浓度下，与hIL-12-Fc-LALAPA和hIL-12-Fc-LALAPG孵育均未导致可检测到的IgG1同种型结合，表明两种蛋白的FcγR接合被消除，这可归因于LALAPA和LALAPG突变。
实例22：DF hIL12-Fc si的制造工艺和工艺控制
DF hIL12-Fc si在悬浮培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。来自主细胞库(MCB)的细胞用于接种含有化学成分确定的不含动物组分的培养基的摇瓶。然后将细胞用于接种体积逐渐增大的培养物，以扩增细胞数量，从而能够接种生产生物反应器。
生产生物反应器以分批补料模式运行，以增加DF hIL12-Fc si蛋白的表达。大约14天后，通过深度过滤收集培养物，以在初始纯化之前去除细胞和细胞碎片。使用一系列色谱和过滤步骤从CHO收获培养基中纯化DF hIL12-Fc si，包括蛋白A捕获色谱、混合模式色谱和阳离子交换色谱(CEX)。
包括两个专用的正交病毒灭活和去除步骤-低pH灭活和纳米过滤。病毒灭活步骤包括向过滤的DF hIL12-Fc si溶液中添加乙酸盐以将pH调节至约3.65，并孵育至少60分钟。
最后，将DF hIL12-Fc si浓缩并配制成20mM柠檬酸盐、6％蔗糖、1％甘露醇和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的最终组合物。然后将配制的原料药通过0.2μm膜过滤到聚碳酸酯瓶中，然后在≤-65℃储存。图32提供了整个DF hIL12-Fc si原料药制造工艺的示意图。
批量规模和定义
将单个小瓶的DF hIL12-Fc si MCB扩展至一个生产生物反应器，并将每个收获物纯化为一批原料药。
细胞培养和上游制造工艺
DF hIL12-Fc si的上游原料药制造工艺示于图33并且提供每个单元操作的其他详细信息。
摇瓶传代
将一小瓶主细胞库在37℃水浴中解冻，用移液管将内容物缓慢混合，然后添加到125mL摇瓶中，该摇瓶中含有补充了6mM L-谷氨酰胺的预平衡生长培养基(BalanCD CHO生长培养基A，伊文科学公司(Irvine Scientific))。接种后进行细胞计数，如有必要，将细胞密度稀释至0.30x106至0.50x106个活细胞/mL的目标。然后将烧瓶放在具有温度和％CO2(g)控制的培养箱中的轨道摇床上。在第2代之前的第3天检查细胞密度和活力。
对于第2代，将500mL摇瓶用补充有6mM L-谷氨酰胺的生长培养基进行预平衡。然后用来自第1代的细胞接种烧瓶，并将其放在具有温度和％CO2(g)控制的培养箱中的轨道摇床上。测量细胞密度和活力，一旦满足工艺处理标准，细胞就用于接种第3代。
对于第3代，将三个1000mL摇瓶用补充有6mM L-谷氨酰胺的生长培养基进行预平衡。然后用来自第2代的细胞接种烧瓶，并然后将其放在具有温度和％CO2(g)控制的培养箱中的轨道摇床上。测量细胞密度和活力，一旦满足工艺处理标准，细胞就用于接种第4代。
对于第4代，将四个5000mL摇瓶用补充有6mM L-谷氨酰胺的生长培养基进行预平衡。然后用来自第2代的细胞接种烧瓶，并然后将其放在具有温度和％CO2(g)控制的培养箱中的轨道摇床上。测量细胞密度和活力，一旦满足工艺处理标准，细胞就用于接种50L Wave生物反应器。表17总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表17：摇瓶传代-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001741
Figure BDA0003996373120001751
Wave物反应器
设置50L Wave物反应器TM平台(GE集团生命健康科学部(GE HealthcareLifeSciences))并用补充有6mM L-谷氨酰胺的生长培养基(BalanCD CHO生长培养基A，伊文科学公司)接种。将培养基在36.5℃和5％ CO2(g)下进行预处理，然后用第4代的培养物接种。每天对生物反应器进行采样以了解细胞密度和活力，一旦达到转移细胞密度标准，将培养物用于接种200L生产生物反应器。还每天监测代谢物浓度(例如葡萄糖和乳酸)和pH值以获取信息。表18总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表18：Wave生物反应器-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001752
生产生物反应器
设置200L一次性生物反应器，并用补充有6mM L-谷氨酰胺的生长培养基接种。将培养基在37℃预平衡，然后接种来自50L Wave生物反应器的培养物。初始接种体积约为130L，最终培养体积约为180L。通过补充空气和氧气来控制溶解氧，并且通过添加二氧化碳气体和/或碳酸钠碱来控制pH。每天对生物反应器进行采样以了解细胞密度和活力，一旦活细胞密度≥14x106个活细胞/mL，温度设定点从37℃转移到33℃并保持在33℃直到满足收获标准。当活力≤85％活力或培养第14天时(以先到者为准)收获培养物。在培养期间监测代谢物浓度(例如，葡萄糖和乳酸)和DF hIL12-Fc si滴度(从第8天开始)。
从培养的第3天开始，每天添加浓缩营养料，直到第13天。此外，根据需要添加浓缩葡萄糖溶液，以在进料后保持生物反应器中葡萄糖的最低浓度。从第3天开始，每天将消泡剂添加到生物反应器中，以尽量减少泡沫积聚。在收获当天，采集生物反应器培养物的样品用于外来因子测试。表19总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表19：生产生物反应器-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001761
收获物澄清
将生物反应器通过深度过滤进行澄清，以去除细胞和细胞碎片，为进一步的纯化步骤做准备。由DOHC和XOHC过滤器组成的两级一次性深度过滤系统用于澄清。在开始过滤之前，将生产生物反应器温度调节至18℃并且将溶解氧设定点提高至70％饱和度。
将洗收获过滤器用注射用水(WFI)冲，然后用缓冲液平衡。使用蠕动泵使细胞悬浮液通过收获过滤器并且冲洗过滤器以收集产物。压力被监控并保持在≤15psig。然后将滤液通过0.45/0.2μm膜过滤到无菌袋中。表20总结了工艺参数范围和工艺中测试。
除非立即处理，否则在捕获色谱步骤之前将澄清的收获物储存在2-8℃。
表20：收获物澄清-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001762
下游纯化制造工艺
DF hIL12-Fc si的下游原料药制造工艺示于图32并且在下面的文本中提供每个单元操作的其他详细信息。下游纯化由以下组成：三个色谱步骤和两个专门的病毒清除步骤，低pH灭活和纳米过滤。对于每个工艺中间体，已经进行了保持时间研究以确定允许的保持时间和温度。
蛋白A捕获色谱
用Amsphere 3蛋白A(JSR生命科学公司(JSR Life Sciences))树脂捕获澄清的收获物，以去除与工艺相关的杂质(例如DNA和宿主细胞蛋白)、培养基添加剂，并用作后续纯化之前的减体积步骤。根据需要对每个批次执行多个循环。在每次加载之前，首先用20mMTris、150mM NaCl、pH 7.5平衡树脂。加载后，用平衡缓冲液清洗柱以去除未结合或松散结合的杂质，然后用50mM乙酸盐(pH 5.4)进行第二次清洗，以降低pH值并准备柱进行洗脱。将DF hIL12-Fc si用50mM乙酸盐、100mM精氨酸(pH 3.7)洗脱，并通过280nm UV波长(从1.25AU/cm上升开始并在1.25AU/cm下降结束)进行收集。将洗脱液收集在一个池中，并且每个柱循环单独通过低pH病毒灭活处理。表21总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表21：蛋白A捕获色谱-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001771
低pH病毒灭活
将蛋白A洗脱液在低pH孵育以使潜在存在的病毒灭活。必要时用0.5M乙酸调节捕获洗脱液的pH值，并孵育至少60分钟。孵育期结束后，灭活的池用2M Tris碱中和，并且使材料通过0.2μm过滤组件。表22总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表22：低pH病毒灭活-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001772
X0SP深度过滤
将病毒灭活中和(VIN)池通过X0SP中间深度过滤器进行处理，以去除与工艺相关的杂质(例如宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA)。在加载500-1000g/m2范围内的DF hIL12-Fc si之前，用WFI冲洗系统。加载后，将系统用50mM乙酸盐，pH 5.2进行追洗，以完成产物滞留回收。随后在加载到第一色谱步骤之前使用50mM乙酸盐(pH 5.2)将X0SP池电导率调整为≤6.0mS/cm。表23总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表23：X0SP深度过滤
Figure BDA0003996373120001781
混合模式色谱
以结合-洗脱模式进行CaptoAdhere ImpRes(通用健康医疗集团(GEHealthcare))的混合模式色谱，以去除高分子量(HMW)种类。如上所述，使用50mM乙酸盐(pH5.2)将X0SP滤液电导率调整为≤6.0mS/cm，并根据需要分成多个加载循环。加载前，用50mM乙酸盐(pH 5.2)平衡柱并加载。加载后，用50mM乙酸盐(pH 5.2)洗涤柱，然后用50mM乙酸盐250mM NaCl(pH 5.2)洗脱。通过280nm UV检测(在0.625AU/cm上升开始并在1.50AU/cm下降结束)启始收集。在收集之后，每个循环通过包含末端0.2μm过滤器的过滤器列。表24总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表24：混合模式色谱-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001782
阳离子交换色谱
使用Eshmuno CPX树脂(EMD密理博公司(EMD Millipore))进行阳离子交换色谱以去除与产物相关的杂质(例如，高分子量种类、低分子量种类)，以及另外的工艺相关杂质清除。根据需要对每个批次执行多个循环。在加载之前，CaptoAdhere ImpRes循环被汇集并用50mM Tris pH 7.4缓冲液稀释，并用2M Tris碱调节pH至7.50±0.20。在加载经稀释和pH调节的CaptoAdhere ImpRes池之前，用50mM Tris pH 7.4平衡柱。然后用50mM Tris pH 7.4洗涤柱，然后用50mM Tris pH 7.4(缓冲液A)和50mM Tris，0.5M NaCl(pH 7.4)(缓冲液B)的梯度进行洗脱。
通过280nm UV检测(在2.5AU/cm上升开始并在4.5AU/cm下降结束)启始产物收集。在收集之后，每个循环通过包含末端0.2μm过滤器的过滤器列。表25总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表25：Eshmuno CPX-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001791
纳米过滤
进行纳米过滤以根据大小去除任何可能存在的病毒。Eshmuno CPX洗脱液通过预过滤器(Viresolve Prefilter Pod，EMD密理博公司)，然后通过20nm标称过滤器(Viresolve Pro Modus，EMD密理博公司)。在加载之前，将系统用WFI冲洗并用50mM Tris、265mM NaCl(pH 7.4)平衡。加载后，用平衡缓冲液冲洗系统以恢复系统滞留。然后在下一步之前使滤液通过0.2μm膜。表26总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表26：纳米过滤-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001792
超滤和渗滤(UF/DF)
使用Pellicon Ultracel D Screen再生纤维素30kDa分子量截留膜进行超滤和渗滤。该步骤在最终过滤和装瓶之前以预期浓度浓缩和交换DF hIL12-Fc si到最终配制缓冲液中。将系统首先用50mM Tris、265mM NaCl(pH 7.4)平衡，然后将病毒滤液池浓缩至5.0g/L的目标。然后用最少7倍渗滤体积的20mM柠檬酸盐(pH 6.5)进行缓冲液交换。渗滤后，以11.0g/L为目标进行第二次浓缩，然后用渗滤缓冲液将产物稀释至7.5g/L的最终截留物目标浓度。
将20mM柠檬酸盐、18％(w/v)蔗糖、3％(w/v)甘露醇、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80储备溶液(pH 6.5)掺入到UF/DF池中以达到20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯80的最终浓度。表27总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表27：UF/DF-工艺参数和工艺中测试
Figure BDA0003996373120001801
批量原料药的过滤、装瓶和储存
配制的UF/DF截留物通过0.2μm膜过滤到最终的原料药储存器皿中，即2L的带有聚丙烯封盖的聚碳酸酯瓶(Nalgene Biotainer)。过滤在ISO 5/A级区域进行。过滤后，对每个瓶进行无菌取样、贴标签并在≤-65℃冷冻。表28总结了工艺参数范围和工艺中测试。
表28：过滤、装瓶和BDS储存-工艺参数和工艺中测试
单元操作 参数目标/范围 工艺中测试
过滤、装瓶和BDS储存 1.0L灌装体积在≤-65℃储存 过滤器完整性测试
实例23：DF hIL12-Fc si的配制、包装和储存
DF hIL12-Fc si药物产品制造工艺流程图(其显示了制造步骤和工艺中控制(IPC))显示在图32中。过滤和灌装按照符合ICH指南和当前良好生产规范中描述的适用标准的无菌程序进行。
解冻批量原料药
DF hIL12-Fc si原料药(DS)在2-8℃黑暗中解冻≤96小时。通过对瓶的目视检查确认DS完全解冻。
稀释至目标批次体积的80％
在10L大玻璃瓶中制备由20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇、0.01％聚山梨醇酯80(w/v)组成的缓冲液(pH 6.0)。将固体柠檬酸钠二水合物、柠檬酸一水合物、蔗糖和甘露醇称重，添加至WFI，并混合至溶解。聚山梨醇酯80储备溶液在WFI中制备并添加到缓冲液中。测试缓冲液的pH(接受标准6.5±0.4)。将缓冲液用WFI稀释至目标体积，混合，测试以确认pH(6.5±0.4)和渗透压，并通过0.2μm膜过滤。
原料药的重量用于计算目标批次体积。将原料药添加到干净的10L大玻璃瓶中的缓冲液中至计算的批次体积的约80％并混合。使用1.44L/(g*cm)的消光系数，通过280nm处的吸光度测试80％药物产品溶液的pH(接受标准6.5±0.3)和蛋白浓度。
缓冲液组分被设计成产生6.5的pH。如果在缓冲液或80％批量原料药步骤中pH不符合接受标准，则可以使用1N氢氧化钠或1N盐酸进行滴定以使pH在接受标准范围内。
将DF hIL12-Fc si稀释至1mg/mL
上一步的蛋白浓度结果用于计算达到1mg/mL的DF HIL12-FC SI浓度所需的缓冲液量。通过280nm处的吸光度(接受标准1.0±0.2mg/mL)验证浓度，并取样以确认pH值(接受标准6.5±0.3)和渗透压。
使复合的批量药物产品溶液通过无菌的0.2μm过滤器，进入干净的10L大玻璃瓶，用于减少生物负载，并保持至无菌过滤和灌装。从10L大玻璃瓶中取出用于预过滤生物负载的样品。
无菌过滤
批量药物产品通过两个串联的过滤器胶囊过滤，每个过滤器胶囊由0.45μm聚醚砜(PES)预过滤膜和0.2μm PES灭菌膜组成。药物产品被过滤到灌装套件的受控B级区域内的无菌一次性灌装袋中。在过滤后通过泡点测试两个除菌过滤器胶囊的完整性(接受标准≥3200mbar，使用WFI)。
灌装入小瓶
批量药物产品溶液从直接位于限制进入屏障系统(RABS)外部的一次性袋中灌装。产品被灌装到灌装套件的受控的A级RABS区域内的即用型2R硼硅酸盐I型小瓶中。
小瓶是用灭菌的13mm血清塞加塞的并用13mm铝外封盖盖住。在灌装操作期间，通过对批次100％的重量检查来验证小瓶的灌装体积(接受标准1.3mL±5％)。灌装后，将小瓶移至2-8℃储存。
目视检查、包装和储存
灌装后的小瓶经过100％手动目视检查器皿、封盖和产品缺陷，然后进行接受质量限检查(AQL)。经检查的小瓶被批量包装并在装运前储存在2℃-8℃。
实例24：配制品分析
缓冲液分析
评估表29中列出的配制品以评估各种缓冲液和pH条件对DF hIL12-Fc si稳定性的影响。使用离心超滤装置(Amicon Ultra-4 30k MWCO)将DF hIL12-Fc si缓冲液交换到表29中列出的缓冲液中，以达到1mg/mL的靶蛋白浓度。在最终的缓冲液交换后，使用具有赞助商提供的消光系数(1.43mL/cm*mg)的UV-可见光谱测量蛋白浓度。然后将样品分成三个大小相等的等分试样。一个等分试样储存在2-8℃，另外两个等分试样储存在50℃。在2-8℃下储存的等分试样和在50℃下储存的等分试样之一在1周时均取出用于测试，如表30中所列。2周后取出在50℃的另一个小瓶并储存在-75℃。
表29：针对DF hIL12-Fc si预配制筛选的缓冲液
Figure BDA0003996373120001821
表30：测定组
Figure BDA0003996373120001822
Figure BDA0003996373120001831
结果
将DF hIL12-Fc si的样品进行缓冲液交换到12种缓冲液/pH条件下。立即评估样品的pH和浓度。之后，将样品等分并储存在2-8℃和50℃。孵育一周后，然后根据表30中的测定组评估样品。结果如下以及图34A-42B中所示。
表31：DF hIL12-Fc si浓度(缓冲液交换)
Figure BDA0003996373120001832
请注意：浓度＝((A280-A320)/1.43)*1.0(cm路径长度)*稀释因子(如果适用)
表32：pH值(缓冲液交换)
Figure BDA0003996373120001841
目视外观(孵育1周)
在将样品在5℃或50℃孵育1周后评估所有样品的目视外观。所有样品都是无色透明液体，不含可见颗粒(参见图35A-35B)。
差示扫描荧光法(DSF)(孵育1周)
使用Unchained Labs UNcle进行DSF实验。评估样品的热稳定性。DF hIL12-Fc si热解折叠(Tm)和聚集开始(Tagg)分别通过评估内在蛋白荧光和静态光散射(在266nm的SLS)的作为温度的函数的变化进行监测。一式三份评估样品，并对一式三份的结果进行平均。在25℃-95℃的温度斜坡上以0.5℃/min的恒定线性斜坡速率分析样品。参见下表33-36和图36A-37D。
表33：确定的DSF Tm温度(在5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001842
Figure BDA0003996373120001851
1一式三份的孔之一被排除在分析之外。在Tm1附近出现低强度读数，对微分产生负面影响并妨碍对Tm1进行正确分析。
表34：确定的DSF Tm温度(在50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001852
1一式三份的孔之一被排除在分析之外。对该孔采集的数据表明存在气泡或误读，从而妨碍了正确的分析。
2在Tm1和Tm2之间确定了另外的Tm(67.4℃)。没有报告作为Tm2的Tm，因为它的温度低以及微分不良和与Tm1分离。
表35：确定的DSF Tagg 266温度(在5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001861
表36：确定的DSF Tagg 266温度(在50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001862
在5℃和50℃孵育1周后，评估各种缓冲液配制品中DF hIL12-Fc si的浓度和pH。参见表37-40和图38A-39B。
表37：DF hIL12-Fc si浓度(5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001871
请注意：浓度＝((A280-A320)/1.43)*1.0(cm路径长度)*稀释因子(如果适用)
表38：DF hIL12-Fc si浓度(50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001872
Figure BDA0003996373120001881
请注意：浓度＝((A280-A320)/1.43)*1.0(cm路径长度)*稀释因子(如果适用)
表39：pH值(5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001882
表40：pH值(50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001883
Figure BDA0003996373120001891
动态光散射(DLS)(1周孵育)
使用Malvern Zeta粒度仪进行DLS实验。对于每个样品测量，在25℃进行五次连续扫描。Z平均流体动力学直径和多分散性指数(PDI)由累积量分析和斯托克斯爱因斯坦(Stokes Einstein)方程确定。多分散性是样品中不均匀性的量度。如果颗粒尺寸不均匀，则将测量到更高的多分散性。低多分散性指数(PDI)(≤0.200)表明颗粒尺寸更均匀。参见表41-42和图40A-40L。
表41：确定的DLS尺寸(在5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001892
表42：确定的DLS尺寸(在50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001893
Figure BDA0003996373120001901
尺寸排阻色谱高效液相色谱(SEC-HPLC)
使用TOSOH G3000SWxl(7.8x300mm)进行SEC实验。对于每个样品，注射90μL以达到90μg的柱上样量(鉴于1mg/mL的低浓度，无法实现100μg的目标柱上样量)。由于缺乏历史数据，最大的峰被定义为主峰。主峰之前的峰定义为高分子量(HMW)种类，而主峰之后的峰定义为低分子量(LMW)种类。参见表43-44和图41。对于5℃孵育一周测试的所有条件，主峰的纯度均大于93％。
表43：SEC-HPLC纯度(5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001902
Figure BDA0003996373120001911
表44：SEC-HPLC纯度(50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001912
毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)(还原)
使用Beckman Coulter PA 800plus毛细管电泳系统进行CE-SDS实验。由于缺乏历史数据，最大的峰被定义为主峰(峰7)。主峰之前的峰定义为LMW种类，之后的峰定义为HMW种类。参见表45-46和图42。对于5℃孵育一周测试的所有条件，主峰的纯度均大于49％。
表45：CE-SDS纯度(5℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001913
Figure BDA0003996373120001921
表46：CE-SDS纯度(50℃孵育1周)
Figure BDA0003996373120001922
总结和结论
通过视觉外观、pH、A280、DLS、DSF、SEC和CE-SDS分析所有样品。通过视觉外观和pH进行的评估表明，各种样品之间没有显著差异。孵育1周后，所有样品的浓度均略有下降(下降0.1或0.2mg/mL)。在5℃孵育1周后，琥珀酸盐样品(pH 5.5和6.5)的浓度下降幅度更大(从1.1mg/mL降至0.8mg/mL)。CE-SDS数据显示主峰纯度变化很小(磷酸盐pH 6.5缓冲液除外，其在50℃孵育1周后平均峰纯度显著降低)。
热稳定性数据表明低pH(5.5)和组氨酸缓冲液对分子产生负面影响。柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5除外)和磷酸盐缓冲液显示出最高的热稳定性(对于5℃和50℃孵育1周的样品)。
5℃孵育1周后的光散射数据表明，柠檬酸盐缓冲液样品(pH5.5除外)具有最小的平均尺寸和低多分散性。磷酸盐和琥珀酸盐缓冲液类似地具有小平均尺寸和低多分散性。在50℃孵育1周后，柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5除外)、磷酸盐缓冲液(pH 6.5除外)和琥珀酸盐pH 6.5缓冲液均具有小平均尺寸。
5℃孵育1周的样品的SEC数据显示主峰纯度变化很小。50℃孵育1周的样品的SEC数据显示出更大程度的变异，范围从51.0％到94.3％。最理想的缓冲液还是柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5除外)和磷酸盐缓冲液
柠檬酸盐pH 6.0缓冲液或柠檬酸盐pH 7.0缓冲液的性能比上文所述测定中测试的替代缓冲液更理想。
赋形剂分析
评估表47中列出的配制品以评估各种赋形剂和表面活性剂在20mM柠檬酸盐(pH6.5)中缓冲时对DF-hIL-12-Fc si稳定性的影响。使用离心超滤装置(Amicon Ultra-1530k MWCO)将DF-hIL-12-Fc si进行缓冲液交换到表47中列出的缓冲液中，以达到1mg/mL或10mg/mL的靶蛋白浓度。在最终的缓冲液交换后，使用具有赞助商提供的消光系数(1.43mL/cm*mg)的UV-可见光谱(UV-Vis)测量蛋白浓度。然后使用带有Durapore膜(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)Cat.#UFC40GV0S)的0.22μm EMD Millipore Ultrafree-CL离心过滤装置对样品进行无菌过滤。在无菌过滤之后，将每种配制品在层流罩中无菌处理。如表47中所述，配制的样品中要么掺入聚山梨醇酯80(PS80)在最终浓度为0.01％，要么不掺入表面活性剂。然后将样品分成六个大小相等的等分试样。两个等分试样在2-8℃储存，三个等分试样在50℃储存，最后一个等分试样经历5次冻融循环。对于冻融等分试样，将样品在-75±10℃冷冻至少一个小时，然后在室温解冻，目测确认没有冰。储存在2-8℃的两个等分试样在2周时取出。一个等分试样用于测试，另一个等分试样冷冻在-75±10℃。在2周时取出50℃的单个等分试样进行测试。在3周时取出50℃的另外两个等分试样并在-75±10℃冷冻，如表48所示。测试组如表49所示。还进行了通过高精度液体颗粒计数(HIAC)对颗粒物质的评估，以评估表面活性剂。
表47：针对DF-hIL-12-Fc si赋形剂DOE筛选而筛选的缓冲液
Figure BDA0003996373120001941
表48：小瓶分布
Figure BDA0003996373120001942
Figure BDA0003996373120001951
表49：测定组
测试组 测定体积(μL)
视觉外观 在小瓶中
A280 100
DLS 100
SEC-HPLC，ATM-2606 100
DSF(2-8℃小瓶1或样品制备期间保留)1 1001
HIAC2 100
1DSF在1周时进行，用样品制备中剩余的材料
2使用0.1mL皮重体积和0.3mL样品体积进行HIAC(单次抽取/读取)
结果
将DF-hIL-12-Fc si样品进行缓冲液交换入14种配制品。立即评估样品的pH和浓度。之后，将样品等分并储存在2-8℃、50℃或进行5次冻融循环。在两周孵育后，然后根据表49中的测定组评估样品。如前所述，将未经测试的样品取出并冷冻。
表50和图43A-43B显示UV-Vis浓度确定(零时间样品和2周样品)。
表50：DF-hIL-12-Fc si的浓度
Figure BDA0003996373120001952
Figure BDA0003996373120001961
请注意：浓度＝((A280-A320)/1.43)*1.0(cm路径长度)*稀释因子(如果适用)
表51显示了零时间和2周样品的pH测定。
表51：pH值
Figure BDA0003996373120001962
Figure BDA0003996373120001971
视觉外观(2周样品)
所有样品均为无色透明液体。如表52中所述，在一些样品中观察到颗粒。
表52：外观：可见颗粒
Figure BDA0003996373120001972
差示扫描荧光法(DSF)(1周样品)
使用Unchained Labs UNcle进行DSF实验。评估样品的热稳定性。DF-hIL-12-Fcsi热解折叠(Tm)和聚集开始(Tagg)分别通过评估内在蛋白荧光和静态光散射(在266nm的SLS)的作为温度的函数的变化进行监测。一式三份评估样品，并对一式三份的结果进行平均。在25℃-95℃的温度斜坡上以0.5℃/min的恒定线性斜坡速率分析样品。结果示于表53和图44A-46F中。
表53：确定的DSF Tm1、Tm2和Tagg 266温度(1周材料)
Figure BDA0003996373120001981
1由于采集的数据存在差异，其中一式三份中之一被排除在分析之外动态光散射(DLS)(2周样品)
使用Malvern Zeta粒度仪进行DLS实验。对于每个样品测量，在25℃进行五次连续扫描。Z平均流体动力学直径和多分散性指数由累积量分析和斯托克斯爱因斯坦(StokesEinstein)方程确定。多分散性是样品中不均匀性的量度。如果颗粒尺寸不均匀，则将测量到更高的多分散性。低多分散性(≤0.200)表明颗粒尺寸更均匀。结果示于表54-62和图47A-48H中。
表54：DLS平均尺寸
Figure BDA0003996373120001991
表55：DLS多分散性
Figure BDA0003996373120001992
Figure BDA0003996373120002001
表56：DLS单体尺寸
Figure BDA0003996373120002002
Figure BDA0003996373120002011
表57：DLS单体％Pd
Figure BDA0003996373120002012
表58：DLS种类2尺寸(200d.nm至1500d.nm)
Figure BDA0003996373120002013
Figure BDA0003996373120002021
表59：DLS种类3尺寸(>1500d.nm)
Figure BDA0003996373120002022
Figure BDA0003996373120002031
表60：2-8℃样品种类
Figure BDA0003996373120002032
表61：50℃样品种类
Figure BDA0003996373120002041
表62：冻融样品种类
Figure BDA0003996373120002042
Figure BDA0003996373120002051
尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)(2周样品)
使用TOSOH G3000SWxl(7.8x300mm)进行SEC实验。1mg/mL样品以90μL纯注射，以达到90μg的柱上样量(鉴于1mg/mL的低浓度，无法实现100μg的目标柱上样量)。10mg/mL样品以10μL纯进样，以达到100μg的柱上样量。主峰被定义为具有最大峰面积的峰，并且跨所有样品的保留时间一致。主峰之前洗脱的峰定义为高分子量(HMW)种类，而主峰之后洗脱的峰定义为低分子量(LMW)种类。测绘方法的LOQ定义为总峰面积的0.1％峰面积。
表63：SEC-HPLC％主
Figure BDA0003996373120002052
Figure BDA0003996373120002061
表64：SEC-HPLC％HMW
Figure BDA0003996373120002062
表65：SEC-HPLC％LMW
Figure BDA0003996373120002071
HIAC(2周样品)
使用HIAC 9703+进行颗粒物实验。对于分析，在评估0.3mL样品体积之前，先用0.1mL样品对仪器进行配衡。在每次运行之间，将仪器用水洗涤。除样品外，还分析了缓冲液和起始材料，并且没有显示出显著数量的颗粒。结果示于表66-69中。
表66：HIAC≥2μm颗粒/mL
Figure BDA0003996373120002072
Figure BDA0003996373120002081
表67：HIAC≥5μm颗粒/mL
Figure BDA0003996373120002082
Figure BDA0003996373120002091
表68：HIAC≥10μm颗粒/mL
Figure BDA0003996373120002092
表69：HIAC≥25μm颗粒/mL
Figure BDA0003996373120002093
Figure BDA0003996373120002101
总结和结论
所有样品均通过视觉外观(2周)、pH(缓冲液交换和2周)、A280(缓冲液交换和2周)、DLS(2周)、DSF(1周)、SEC(2周)和HIAC(2周)进行分析。
在缓冲液交换结束时，大多数样品的浓度在目标浓度的10％以内。两种样品E(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，pH 6.5)和F(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，0.01％ PS80 pH 6.5)在缓冲液交换结束时的浓度都是0.89mg/mL。在各自条件(2-8℃、50℃)下孵育结束后，评估的14种配制品中的10种具有与其起始浓度一致的浓度。配制品A(20mM柠檬酸盐，8％蔗糖，pH 6.5)、B(20mM柠檬酸盐，8％蔗糖，0.01％ PS80，pH 6.5)、E(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，pH 6.5)和F(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，0.01％ PS80)的所有3个样品的浓度范围为0.87mg/mL至0.79mg/mL。
通过pH进行的评估表明，各种样品之间没有显著差异。
通过视觉外观评估显示样品的颜色和澄清度没有显著差异。根据视觉外观，大多数样品不含可见颗粒。配制品A(20mM柠檬酸盐，8％蔗糖，pH 6.5)的50℃样品，配制品D(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，pH 6.5)的冻融样品，配制品I(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，pH 6.5)的冻融样品和配制品L(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，2％甘露醇，pH 6.5)的冻融样品都具有一些可见的小圆形颗粒。配制品H(20mM柠檬酸盐，2％甘露醇，pH 6.5)的冻融样品具有许多可见的小圆形颗粒。值得注意的是，所有这4种配制品都缺少表面活性剂(0.01％P80)。
通过缓冲液交换后剩余材料的差示扫描荧光法评估(在2-8℃储存1周)表明配制品E(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，pH 6.5)和I(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖)，1％甘露醇，pH 6.5)对于1mg/mL样品具有最高的Tm1，而配制品G(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，0.01％ PS80，10mg/mL)、K(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇、0.01％ PS80 pH 6.5，10mg/mL)和N(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，2％甘露醇，0.01％ PS80，pH 6.5，10mg/mL)对于10mg/mL样品具有最高的Tm1。配制品I(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，pH 6.5)、J(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，0.01％ PS80，pH 6.5)和L(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，2％甘露醇，pH 6.5)对于1mg/mL样品具有最高的Tm2并且配制品K(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，0.01％ PS80，pH6.5，10mg/mL)对10mg/mL样品具有最高的Tm2。与其他1mg/mL样品相比，配制品F(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，0.01％ PS80)具有显著更高的Tagg。10mg/mL样品在Tagg方面一致。总体而言，所有样品显示Tm1值>66℃。
通过SEC-HPLC对2周材料的评估显示2-8℃样品以及冻融样品之间的差异最小。1mg/mL 50℃样品的％主峰范围为68.8％至88.9％。配制品D(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，pH6.5)，E(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，pH 6.5)、I(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，pH6.5)和J(20mM柠檬酸盐、6％蔗糖、1％甘露醇、0.01％ PS80、pH 6.5)都具有高于80％的％主峰。10mg/mL 50℃样品的％主峰范围为57.4％至76.5％。配制品C(20mM柠檬酸盐，8％蔗糖，0.01％ PS80，pH 6.5，10mg/mL)、N(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，2％甘露醇，0.01％ PS80，pH 6.5，10mg/mL)具有高于70％的％主峰，而配制品K(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，0.01％ PS80，pH 6.5，10mg/mL)具有最低的％主峰，为57.4％。
光散射数据表明配制品I(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，pH 6.5)和J(20mM柠檬酸盐，6％蔗糖，1％甘露醇，0.01％ PS80，pH 6.5)通常在3个测试条件下具有最小平均尺寸以及最小单体尺寸。在一些1mg/mL样品(配制品A、B、I、J、L和M)中检测到小种类，很可能来自蔗糖和甘露醇。小种类在10mg/mL样品中未检测到，并且很可能被较高浓度所掩盖。由于自动分析，该种类的存在使关于样品多分散性的结论复杂化。关于平均尺寸，对于3种条件中的每一个，配制品I和J具有一致地小于大多数1mg/mL样品的平均尺寸。对于2-8℃条件和50℃条件，配制品I和J也具有小于大多数1mg/mL样品的单体尺寸。对于冻融条件，配制品D(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，pH 6.5)、E(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，pH 6.5)、F(20mM柠檬酸盐，6％甘露醇，0.01％ PS80)和H(20mM柠檬酸盐，2％甘露醇，pH 6.5)具有小于其余1mg/mL样品的单体尺寸。对于10mg/mL样品，所有样品在3个测试条件下基本一致。10mg/mL 50℃样品展示出显著增加的平均尺寸和单体尺寸。在许多样品中检测到第二种类(200d.nm至1200d.nm)，在大多数样品中检测到第三种类(1500d.nm至5500d.nm)。这些较大的种类主要在所有3种条件下在1mg/mL样品中检测到。
HIAC的评估在很大程度上证实了视觉外观数据。配制品A(20mM柠檬酸盐，8％蔗糖，pH 6.5)的50℃样品、配制品D(20mM柠檬酸盐，4％蔗糖，pH 6.5)的冻融样品和配制品H(20mM柠檬酸盐，2％甘露醇，pH 6.5)的冻融样品均具有较高的≥2μm颗粒计数、≥5μm颗粒计数和≥10μm颗粒计数。除这三个样品外，其余样品相对一致。所有样品均未超过USP<787>规范。
确定配制品J(20mM柠檬酸盐，6％w/v蔗糖，1％w/v甘露醇，0.01％ PS80，pH 6.5)的性能是最理想的。在50℃孵育2周后，这种10mg/mL的较高浓度的缓冲液/赋形剂/表面活性剂组合(配制品K)在SEC-HPLC中表现不佳。此外，1mg/mL样品的性能通常更好或与10mg/mL样品一样好。
实例25：DF hIL12-Fc si的药代动力学(PK)分析
DF hIL12-Fc si是单价人IL12-Fc融合蛋白，旨在增强IL12的功效，而不会成比例地增加不良反应。与rhIL12相比，DF hIL12-Fc si具有显著更长的半衰期。DF hIL12-Fc si的延长的半衰期能够延长药效学谱，而无需频繁重复施用和随后IL12暴露中重复掺入，这会导致毒性。在小鼠模型中，较长的半衰期可以显著提高抗肿瘤活性，减少给药频率，这表明在患者中不频繁施用，例如每3周一次(Q3W)可能是有效的，并提供可接受的安全性。
皮下(SC)途径被选为最适合DF hIL12-Fc si施用的途径，因为它具有更好的药代动力学(PK)谱，避免了在给药后观察到的最大血清浓度(Cmax)时药物浓度中的掺入，这可能会导致更好的耐受性。
体外药理学
体外结合特征
DF hIL12-Fc si保留了天然IL12和人IgG1 Fc对其各自受体IL12R和FcRn的结合亲和力。相反，DF hIL12-Fc si的人IgG1 Fc部分被突变以消除与FcγR的结合。
体外细胞活性
为了比较DF hIL12-Fc si与rhIL12的效力，在体外分析了用植物血凝素(PHA)或抗CD3抗体刺激的人初级免疫细胞的IFNγ产生。DF hIL12-Fc si和rhIL12在用激活的人PBMC、分离的人T细胞或分离的人NK细胞进行的IFNγ产生测定中始终表现出相当的效力。
用临床级DF hIL12-Fc si在未受刺激的人PBMC中进行了一项单独的体外研究，以评估诱导细胞因子释放综合征(CRS)的潜力。在这项研究中，DF hIL12-Fc si仅导致IFNγ的剂量依赖性增加，与预期的药理学一致，但未诱导其他7种评估的细胞因子的分泌。
体外物种交叉反应性
分析了DF hIL12-Fc si在刺激小鼠、大鼠和食蟹猴免疫细胞释放IFNγ方面的体外活性，以评估用于毒理学研究的适当物种。
食蟹猴(Macaca fascicularis)被选为进行非临床安全性研究的唯一药理学相关物种，这是基于：IL12的氨基酸序列的跨物种比较；与人PBMC亚群上的结合模式相比，DFhIL12-Fc si相对于PBMC中食蟹猴免疫细胞亚群上IL12Rβ1表达的结合模式；以及与人相比，DF hIL12-Fc si刺激食蟹猴初级免疫细胞中的IFNγ释放。
与文献一致(Schoenhaut DS,Chua AO,Wolitzky AG,Quinn PM,Dwyer CM,McComas W,等人,J Immunol.[免疫学杂志]1992；148(11):3433-40)，人DF hIL12-Fc si和rhIL12都没有增强小鼠脾细胞或大鼠PBMC的IFNγ产生。
体内药理学
小鼠体内药理学
由于人IL12在小鼠细胞中没有功能，因此产生了替代性鼠IL12-Fc，它反映了人DFhIL12-Fc si候选药物，允许在同系小鼠体内肿瘤模型中检查PK/PD谱和功效。与在具有天然IL12的人中观察到的相比，小鼠IL12被认为在小鼠中具有相似的表达模式和功能(Car1999)。
称为DF-mIL-12-Fc si的替代性分子利用鼠IL12，其中p35和p40亚基融合到2个不同Fc变体的N末端。小鼠IgG2a Fc片段被突变以消除FcγR结合，同时保留与FcRn的结合(Schoenhaut DS,Chua AO,Wolitzky AG,Quinn PM,Dwyer CM,McComas W,等人,JImmunol.[免疫学杂志]1992；148(11):3433-40)，已发现这与DF hIL12-Fc si中使用的人Fc变体(人IgG1 Fc沉默)最相似。
DF-mIL-12-Fc si的离体生物学效力
DF-mIL-12-Fc si的效力(平均50％有效浓度[EC50]＝2.07±0.8pM)与rmIL12的效力(平均EC50＝0.69±0.14pM)相当。人DF hIL12-Fc si和rhIL12均未增强小鼠脾细胞的IFNγ产生，证实缺乏物种交叉反应性。
DF-mIL-12-Fc si的体内表征和药代动力学
在BALB/c或C57BL/6小鼠中单剂量施用DF-mIL-12-Fc si后，评估了该分子的PK/PD谱和生物利用度。
DF-mIL-12-Fc si显示延长的血清t1/2为29.85小时，比rmIL12(t1/2＝6.05小时)长约5倍。DF-mIL-12-Fc si的这种5倍延长的t1/2导致介导的IFNγ产生增加约40倍(从给药时间到最后一次观察时间的浓度-时间曲线下面积[AUC0-219h]＝916,654h*pg/mL)，与相对于rmIL12的结果(AUC0-219h＝20,304h*pg/mL)相比，该结果更加持久和持续。单次施用DF-mIL-12-Fc si后200多小时内IFNγ水平保持升高，这种IFNγ暴露的增加是由于DF-mIL-12-Fcsi的施用量与rmIL12组的等摩尔所致，这产生大致相同的C最大。
在BALB/c小鼠中，当IP和SC给药时，DF-mIL-12-Fc si的生物利用度分别为66％和32％。在C57BL/6小鼠中获得了73％和44％(分别为IP和SC)的相当生物利用度。
与BALB/c小鼠相比，在C57BL/6小鼠中观察到大约4倍更高的IFNγ分泌(C57BL/6和BALB/c小鼠中IFNγ的C最大分别为约25,000和约6,000pg/mL)。
重要的是，无论施用途径如何，通过血清IFNγ水平测量的PD反应相似，尽管在SC施用后观察到生物利用度差异和较低的C最大。这些结果表明，IL12-Fc形式能够通过SC途径实现完全的PD功效，而暴露仅是IV途径的C最大的1/10。虽然某些IL12毒性由IFNγ介导，因此在IV或SC施用后可能相似，但据报道，其他副作用与IFNγ无关(Leonard JP,Sherman ML,Fisher GL,Buchanan LJ,Larsen G,Atkins MB,等人,Blood.[血液学]1997；90(7):2541-8)，并且在SC施用后由于IL12 C最大较低可能不太明显。
总之，当在C57BL/6和BALB/c小鼠品系中IP和SC给药时，与rmIL12相比，DF-mIL-12-Fc si表现出延长的血清t1/2和延长的IFNγ产生，具有良好的生物利用度。然而，两种施用途径都产生了与IV给药相似的血清IFNγ水平，并且与BALB/c相比，在C57BL/6小鼠中观察到4倍更高的IFNγ分泌。
DF-mIL-12-Fc si治疗指数
在B16F10黑色素瘤模型中，IL12变体DF-mIL-12-Fc si和rmIL12的给药剂量与它们的IL12血清暴露水平(每周DF-mIL-12-Fc si和每天rmIL12)相匹配，其中对PD缓解、耐受性和体内功效进行分析以确定DF-mIL-12-Fc si与rmIL12相比的益处-风险谱。
与每周注射的DF-mIL-12-Fc si相比，在初治C57BL/6中重复SC给予rmIL12导致血清IFNγ在6天内显著积累；rmIL12治疗的动物的AUC IFNγ比DF-mIL-12-Fc si治疗的小鼠增加了2.8-4.5倍。此外，随后的rmIL12剂量导致几乎没有或没有IFNγ产生，这表明强烈的负反馈限制了反应。相比之下，每周施用的DF-mIL-12-Fc si导致持续和适度的IFNγ分泌，其中第二剂显示与第一剂相似的PD谱。此外，每天给予inn B16F10荷瘤C57BL/6小鼠0.5或1μg rmIL12是致命的，所有小鼠在治疗一周后均被安乐死。与每周以与1μg rmIL12等摩尔水平给药的DF-mIL-12-Fc si相比，每天给予0.25μg rmIL12(MTD)在控制肿瘤进展方面的效果较差。
这些发现支持在使用rhIL12进行的临床试验中观察到的毒性至少部分是频繁施用计划的结果。
DF-mIL-12-Fc si单一疗法在小鼠肿瘤模型中的功效
选择两种不同的小鼠模型，B16F10黑色素瘤(衍生自C57BL/6)和CT26-20.7结肠癌(衍生自BALB/c)来分析体内DF-mIL-12-Fc si功效。B16F10是“冷”肿瘤模型，据报道它对检查点阻断和作为单一药剂的具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的单克隆抗体具有抗性(Mosely SI,Prime JE,Sainson RC,Koopmann JO,Wang DY,Greenawalt DM等人,CancerImmunol Res.[癌症免疫学研究]2017；5(1):29-41)。CT26是经良好表征的结肠癌模型，已知其表现出炎性肿瘤微环境。CT26-20.7是CT26的通过鼠Tyrp1转基因转导而衍生的亚系，与亲本系具有相似的生长和特征。
进行药理学研究以(1)比较DF-mIL-12-Fc si和rmIL12的体内活性；(2)评估DF-mIL-12-Fc si在已建立的和大800mm3肿瘤中的剂量反应和频率；(3)确定DF-mIL-12-Fc si的IP和SC施用是否介导相似的抗肿瘤反应；和(4)评估不同给药频率对肿瘤负荷的影响。
DF-mIL-12-Fc si在CT26结肠癌模型中的功效
在CT26-20.7荷瘤BALB/c小鼠中，在平均肿瘤体积(MTV)达到270mm3后，用DF-mIL-12-Fc si、mIgG2a同种型对照或与1μg rmIL12等摩尔剂量的rmIL12每周一次进行IP治疗持续5周。用DF-mIL-12-Fc si治疗导致抗肿瘤反应增加(p<0.0001)，与rmIL12治疗组中的10％ CR相比，产生100％完全缓解(CR)。
在CT26-20.7荷瘤BALB/c小鼠中检查DF-mIL-12-Fc si剂量水平和频率，观察到单剂量DF-mIL-12-Fc si诱导100％缓解率。尽管所有小鼠都对DF-mIL-12-Fc si治疗有反应，但反应不太持久，20％的肿瘤在后期进展。当小鼠每周给药一次持续2周时，获得了类似的结果。
对潜在剂量效应的检查揭示了在1或0.1μg治疗组之间抗肿瘤作用的显著(p<0.05)剂量依赖性滴定；然而，用低10倍的DF-mIL-12-Fc si剂量浓度(0.1μg)治疗的小鼠中有80％对治疗有反应并且生存期延长。
此外，在平均肿瘤体积为230mm3且以与1μg rmIL12等摩尔的剂量通过不同途径(IP或SC)QW施用DF-mIL-12-Fc si持续7周的荷瘤BALB/c小鼠中观察到针对CT26-20.7肿瘤的类似抗肿瘤功效(图19A-B)。这些发现与已发表的数据一致，表明IFNγ是抗肿瘤功效的主要介质，这些使用DF-mIL-12-Fc si的研究表明，在IV、IP或SC施用后IFNγ水平相似，尽管在各种途径下C最大不同。
为了分析DF-mIL-12-Fc si单一疗法是否可以诱导针对较大的终末期肿瘤的有效免疫反应，接种后18天在肿瘤体积达到平均815mm3后，对CT26-20.7荷瘤小鼠进行治疗。每周一次SC施用DF-mIL-12-Fc si，剂量水平与1或2μg rmIL12等摩尔，持续7周，或与2μg等摩尔给药一次。在该具有较大肿瘤体积的模型中，单剂量2μg DF-mIL-12-Fc si足以诱导有效的抗肿瘤反应，CR率为80％。此外，每周给予1或2μg可维持肿瘤控制，导致100％(每周1μg)或90％(每周2μg)的CR率。DF-mIL-12-Fc si耐受性良好，没有对体重的临床观察或影响，同时介导较大肿瘤的消退。
DF-mIL-12-Fc si与PD1阻断的组合疗法在B16F10黑色素瘤模型中的功效
已知PD1阻断对已建立的B16F10肿瘤几乎没有功效或没有功效(Mosely 2017)。在2项研究中，在B16F10肿瘤模型中进行了DF-mIL-12-Fc si和PD1阻断的组合疗法，以分析是否可以放大抗肿瘤免疫反应。一旦平均肿瘤体积达到约215mm3或约200mm3(分别为研究1和研究2)，将C57BL/6小鼠用DF-mIL-12-Fc si或抗PD1作为单一药剂和组合进行治疗。以与0.5μg rmIL12等摩尔的剂量向荷瘤小鼠施用DF-mIL-12-Fc si IP(QW，研究1中8周)或SC(QW，在研究2中7周)，以200μg每周两次IP施用抗PD1(每周两次，在研究1或2中分别19或13剂)。
虽然单独施用DF-mIL-12-Fc si延迟了肿瘤消退，但与PD1阻断组合进一步延长了抗肿瘤反应的持续时间。与任一单一疗法所观察到的相比，DF-mIL-12-Fc si与PD1阻断组合延长生存期。尽管具有协同功效，但DF-mIL-12-Fc si和抗PD1组合疗法的方案似乎被B16F10荷瘤小鼠良好耐受。DF-mIL-12-Fc si和抗PD1的组合没有累加或协同毒性的迹象，也没有对体重的临床观察和影响。
猴体内药理学
在非临床毒理学研究中，在食蟹猴中IV(1.9至40μg/kg)或SC(1至20μg/kg)施用DFhIL12-Fc si。施用后，PD标志物IFNγ和干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)出现明显的二次峰，这是剂量依赖性的。
在非GLP研究和GLP研究中，用DF hIL12-Fc si治疗的猴表现出IFNγ通常呈剂量依赖性增加，峰水平出现在给药后48至72小时。IP10也类似地增加。在等摩尔剂量水平与rhIL-12和DF hIL12-Fc si的头对头非GLP比较中，DF hIL12-Fc si通常导致IFNγ的更大增加，持续时间长于rhIL12产生的IFNγ反应。DF hIL12-Fc si产生的IFNγ反应在施用后120-168小时仍可检测到，而摩尔当量的rhIL12 IFNγ在相似的时间点恢复到基线。与rhIL12相比，DF hIL12-Fc si的更持久的IFNγ反应很可能是由于DF hIL12-Fc si的t1/2延长。在与rhIL12的非GLP头对头比较中未评估IP10。
在GLP研究中，峰IFNγ水平在≥8μg/kg SC和12μg/kg IV时通常相似，尽管组内存在一些个体动物变异性。重复给药后观察到IFNγ和IP10反应有所减弱，但GLP研究中的一些猴对第一次和第二次施用表现出显著的IFNγ反应。在GLP研究的第三次施用后，由于抗药物抗体(ADA)的减弱或可能的影响，IFNγ的增加很少甚至没有增加。第三剂DF hIL12-Fcsi后的IP10反应比IFNγ反应更显著，这可能反映了IP10的更大t1/2。
次要药理学
与FcγR结合
通过表面等离子共振(SPR)评估DF hIL12-Fc si与FcγR结合的潜力。BiacoreTM8KSPR系统用于评估DF hIL12-Fc si与通过位点特异性生物素化被捕获在芯片上的重组人(CD64、CD32a H131和R131等位基因、CD16a V158和F158等位基因、CD32b、CD16b)和食蟹猴(CD64和CD16)受体的结合。曲妥珠单抗是一种成熟的IgG1生物药物，被用作同种型特异性实验对照。数据的定性评估得出结论，DF hIL12-Fc si没有显示出与任何测试的FcγR的有意义的结合。相比之下，IgG1对照曲妥珠单抗在相同的受体特异性、生理相关浓度下的滴定显示了跨FcγR的全范围剂量依赖性结合，正如预期的那样。
此外，已知人IgG1 Fc结构域与C1q结合，C1q是介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的经典补体级联的组分(Idusogie 2000)。为了证实DF hIL12-Fc si不会引发CDC，在0.0823至20nM的DF hIL12-Fc si存在下，将用PHA刺激3天的人PBMC与5％人补体血清一起孵育。血清的添加不会触发CDC。相反，抗MHC1抗体(用作阳性对照)诱导T细胞的补体血清依赖性死亡。
C-反应蛋白作为IFNγ分泌的替代物
C反应蛋白(CRP)是早期炎症的标志物，用于监测疑似患有严重感染的患者。增加的CRP水平在食蟹猴研究中用作测量IFNγ分泌的替代物，这是因为IFNγ半衰期短，因此将其用作临床生物标志物更具挑战性。基于这些研究，CRP的测量代表了在临床环境中检测DFhIL12-Fc si的PD活性的更可靠的生物标志物。
与FcRn结合
对DF hIL12-Fc si与食蟹猴和人FcRn结合的潜力的评估表明，正如预期的那样，人和食蟹猴FcRn结合不受FcγR沉默突变的影响。DF hIL12-Fc si和IgG1同种型对照曲妥珠单抗在pH 6.0下对食蟹猴和人FcRn的结合亲和力值具有可比性(<1.5×差异)。同样，在pH 7.4的测试浓度下，两种分子在缺乏可量化的结合方面是相似的。
安全性药理学
安全性药理学终点(例如，细胞因子评估、体温、呼吸速率、血压、心率、ECG评估和FOB评估)被纳入食蟹猴GLP 3周重复剂量毒理学研究。
给猴QW施用DF hIL12-Fc si(以SC多达20μg/kg或以IV 12μg/kg)3周后，对体温、血压或中枢神经系统(通过FOB评估测量)、呼吸系统(通过呼吸频率测量)或心血管系统(通过ECG和心率测量)没有DF hIL12-Fc si相关的影响。
在GLP 3周重复剂量毒理学研究中，在施用DF hIL12-Fc si后，IFNγ和IP10显著增加，这与其预期的药理学一致。在一些DF hIL12-Fc si治疗的猴中，IL-6也有零星的和最小的增加。在猴的非GLP研究中，除了预期的IFNγ和IP10增加外，IL6、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、MIP-1α、MIP-1β和胸腺-和激活-调节型趋化因子(TARC)也有最小且主要是短暂的增加，而其他测量的细胞因子不受影响。这些在猴中的体内结果与在未受刺激的人PBMC中细胞因子释放测定的体外结果一致，其中仅观察到IFNγ的浓度依赖性增加，并且其他细胞因子不受影响。因此，DF hIL12-Fc si对CRS而言潜力较低，但由于DF hIL12-Fc si的预期药理学，预计选择的细胞因子(例如IFNγ，IP-10)会增加。
动物的药代动力学和药物代谢
概述
在4个非GLP毒理学研究和1个GLP毒理学研究中，在对食蟹猴进行单次、重复和/或交叉SC(21至20μg/kg)和IV(1.9至40μg/kg)施用后研究DF hIL12-Fc si的毒代动力学(TK)谱。使用通过酶联免疫吸附测定(ELISA)(通过检测每个IL12亚基测量DF hIL12-Fc si的IL-12p70)和MSD(测量DF hIL12-Fc si的IL12p40和Fc)获得的DF hIL12-Fc si浓度评估血浆TK。来自合格ELISA方法的数据是DF hIL12-Fc si暴露评估的首选来源。还开发了一种抗药物抗体(ADA)方法来检测SC给药后食蟹猴血清中的抗DF hIL12-Fc si抗体；该方法经验证可用于GLP 3周毒理学研究。
SC或IV施用后DF hIL12-Fc si的主要TK谱以剂量无关(线性)动力学为特征，尽管非GLP研究中的动物数量少和ADA可能促成观察到的变异性。DF hIL12-Fc si的血浆TK中似乎没有总体的性别相关差异。
在非GLP研究中，SC施用后，基于ELISA数据的生物利用度约为60％。在4个非GLP研究中，单次或重复SC施用后，个体动物的估计t1/2范围为12.4至56.4小时。个体动物的t最大范围为SC施用后4至36小时，最常见的是给药后8小时。IV施用后个体动物的估计t1/2范围为16.2至82.4小时，t最大范围为给药后0.25至1小时。
DF hIL12-Fc si的TK谱在GLP毒理学研究中得到证实。一般而言，DF hIL12-Fc si平均C最大、从给药时的时间到给药后24小时的浓度-时间曲线下面积(AUC0-24)和AUC0-168值的性别相关差异小于2倍。SC给药后，如通过DF hIL12-Fc si平均C最大和AUC0-168评估的暴露量通常随着剂量水平从4μg/kg DF hIL12-Fc si增加而增加。平均C最大和AUC0-168的增加与剂量成比例。在多个剂量的DF hIL12-Fc si后没有观察到DF hIL12-Fc si的积累。DF hIL12-Fcsi的皮下生物利用度约为40％。SC施用的平均t1/2在第1天和第15天范围为17.5至35.8小时，而IV施用的平均t1/2在第1天为22.2小时，在第15天为45.3小时。
在猴的单剂量非GLP SC研究中，针对DF hIL12-Fc si的ADA在第8天得到证实，经确认的ADA一直到第22天；然而，ADA的总体滴度仍然相对较低，并且在值方面与低阳性对照接近。在另一个非GLP研究中，初始SC剂量和随后的IV剂量显示低于预期的IV暴露谱，这可以由ADA解释，尽管没有测量滴度。总体而言，来自非GLP研究的数据表明，猴的SC途径可以比IV途径更容易产生ADA，这在GLP研究中也得到了证实。例如，20μg/kg SC的10只猴中有9只和12μg/kg IV的10只猴中有3只在GLP研究的第15天产生ADA。大多数确认的ADA样品出现在第15天(第三剂前)，一些动物的最大浓度(C最大)受到影响，表明存在中和抗体。在非GLP和GLP研究中，ADA影响个体猴的暴露，但在足够长的持续时间内实现了合适的暴露，以可信赖地定义DF hIL12-Fc si的毒理学特征。然而，猴的ADA不能预测人的免疫原性。由于这些原因，DF hIL12-Fc si-001首次人体(FIH)研究将在整个研究过程中评估抗DF hIL12-Fc si抗体的血清滴度。
此外，通过IFNγ反应测量的对DF hIL12-Fc si的药理学反应在个体动物之间是可变的，没有明显的性别相关差异，但在比较耐受剂量时显示出一些剂量依赖性。在非GLP和GLP研究中，动物的峰IFNγ反应范围为给药后3至5天。在GLP研究中，IFNγ反应随着重复施用而减弱，尽管一小百分比的动物在第一剂和第二剂后都表现出IFNγ反应。此外，在第一剂和第三剂后可检测到IP-10的剂量依赖性增加，并伴有减弱。施用途径似乎不会影响峰药理反应的时间。
尚未进行评估代谢和排泄的研究，因为这些通常用于小分子药物的研究被认为对单克隆抗体等生物制剂没有必要或没有用。尚未进行专门的研究来评估药物-药物相互作用(DDI)，因为没有理由相信DF hIL12-Fc si(一种IL12-Fc融合蛋白)被细胞色素P450(CYP)酶代谢。因此，抑制或诱导CYP酶的小分子不太可能影响DF hIL12-Fc si的PK，因此认为DF hIL12-Fc si的PK DDI潜力较低。
吸收和药代动力学
单剂量药代动力学
作为单剂量或重复剂量毒理学研究的一部分，施用单剂量DF hIL12-Fc si后的暴露可提供急性毒性评估的信息。跨研究，DF hIL12-Fc si作为单SC剂量高达20μg/kg可耐受。单剂量IV最大耐受剂量(MTD)在雌性中是≤19μg/kg，在雄性中是≤20μg/kg；在DFhIL12-Fc si施用后8天，雌性或雄性中的单IV剂量分别≥20或≥40μg/kg导致早期安乐死。
第1天暴露(通过C最大和从给药时的时间到最后一个可量化样品的时间的浓度-时间曲线下面积[AUC0-t]测量)以及t最大和t1/2(从单剂量和重复剂量毒理学研究获得的ELISA数据得出)总结在表70中。
Figure BDA0003996373120002221
单剂量施用后所有毒理学研究的急性毒性和暴露比较
在重复剂量毒性研究(研究TD36MM、QW56LH、DQ81GX和NF37DV)中，施用初始第1剂后的耐受性评估和暴露为急性毒性评估提供了信息。单剂量IV MTD在雌性中是≤19μg/kg，在雄性中是≤20μg/kg；在DF hIL12-Fc si施用后8天，雌性或雄性中的单IV剂量分别≥20或≥40μg/kg导致早期安乐死(研究DQ81GX)。19和20μg/kg IV时的暴露与类似的IFNγ药理学重叠，表明免疫系统对DF hIL12-Fc si治疗反应的动物间差异，这可能导致不同的耐受性。这与免疫系统作为靶器官的已知变异性是一致的(Brodin P,Davis MM.,Nat RevImmunol.[自然免疫学评论]2017；17(1):21-9)。
重复剂量药代动力学
通过交叉设计重复皮下/静脉内施用DF hIL12-Fc si后的毒代动力学(研究TD36MM和DX81GX)
在一项非GLP研究(研究TD36MM)中，给食蟹猴施用DF hIL12-Fc si，首先是SC，然后是IV，每次给药后有14天的清除期，并在给药后336小时内收集TK样品。
在SC施用后，雄性和雌性猴对DF hIL12-Fc si的全身暴露似乎在4至8μg/kg的剂量范围内具有剂量依赖性(线性)动力学特征。雌性中的DF hIL12-Fc si全身暴露往往略高于雄性。
在对先前通过SC途径接受DF hIL12-Fc si的猴进行IV施用后，雄性和雌性猴对DFhIL12-Fc si的全身暴露似乎在2至4μg/kg的剂量范围内具有剂量独立性(非线性)动力学特征，使得DF hIL12-Fc si的剂量增加到2μg/kg以上时在雄性中导致比从线性关系预测的更低的全身暴露，但是在雌性中导致更高的全身暴露。这些结果将与2个雄性和1个雌性中在施用IV剂量之前产生针对DF hIL12-Fc si的ADA一致。因此，必须谨慎解释IV施用后的结果。
DF hIL12-Fc si的SC生物利用度似乎为60％至70％(基于4个动物)；然而，应该注意的是，在一些动物中观察到异常高的生物利用度估计值(从这里给出的范围中省略)，这与影响IV施用后暴露的ADA产生一致，尽管在本研究中没有测量ADA。
在另一项非GLP研究(DQ81GX)中，首先通过IV推注然后SC施用DF hIL12-Fc si给食蟹猴，两次施用之间有14天的清除期。单独一组动物以相同的施用途径和频率接受rhIL12以进行比较。获得给药后240小时内的血样用于TK分析。DF hIL12-Fc si和rhIL12的血浆浓度通过合格的ELISA(靶向IL12的p70[即测量rhIL12和DF hIL12-Fc si])和MSD(靶向DF hIL12-Fc si的p40和Fc[即测量DF hIL12-Fc si和不测量rhIL12])方法测量。由于在IV施用DF hIL12-Fc si后观察到的毒性，SC施用的TK谱仅针对DF hIL12-Fc si(仅限雄性)和rhIL12进行表征。
当通过MSD方法测量时，IV施用后DF hIL12-Fc si的血浆浓度较低(正如预期的那样，鉴于ELISA方法检测到IL12异二聚体)。虽然源自MSD数据的C最大值比源自ELISA方法的值低约54％，但AUC0-t值与源自ELISA方法的值相比在雄性中相似，在雌性中高出18％。在IV施用后雌性猴DF hIL12-Fc si的AUC0-t值当使用ELISA方法测量时与雄性的那些相似，但通过MSD法测量时略高。IV施用后AUC0-t和剂量水平之间的关系(基于ELISA数据)表明，在20至40μg/kg的剂量范围内，暴露以略大于剂量比例的方式增加。正如预期的那样，IV施用后的t最大为给药后0.25小时(第一次采样时间)，而SC施用后个体动物的t最大范围为4至24小时。
在以20或40μg/kg IV施用后t1/2变化很大(个体动物的范围从16.2到82.4小时)，但只能在SC施用后对1只动物进行充分估计(14.9小时基于ELISA数据并且62.0小时基于MSD数据)。DF hIL12-Fc si以20μg/kg的皮下生物利用度似乎是可变的，基于ELISA数据的平均值为53.5％(范围为38.8％至68.2％)并且基于MSD结果为89.0％(范围为62.8％至115.3％)。
IV施用后雌性猴rhIL12的C最大和AUC0-t值与雄性的那些相似；然而，SC施用后，C最大和AUC0-t值低于雄性的那些。IV施用后t最大也是给药后0.25小时，而SC施用后t最大是给药后8小时。个体动物的t1/2在IV施用后为9.1至17.5小时并且在SC施用后为18.9至22.9小时。10μg/kg rhIL12的皮下生物利用度在雄性中为约31％，在雌性中为约18％(总体范围为18.0％至35.2％)。
重复静脉内施用DFhIL12-Fcsi后的毒代动力学(研究QW56LH)
在一项非GLP研究中，在第1天和第8天通过IV推注施用DF hIL12-Fc si或rhIL12给食蟹猴，并在给药后168小时收集TK样品。血浆浓度通过合格的ELISA(靶向IL12的p70[即测量rhIL12和DF hIL12-Fc si])和MSD(靶向DF hIL12-Fc si的p40和Fc[即测量DF hIL12-Fc si和不测量rhIL12])方法测量。
在重复IV推注DF hIL12-Fc si后，没有DF hIL12-Fc si的积累。在雄性中在第1天和第8天，DF hIL12-Fc si的AUC0-168在1.9至19μg/kg的剂量范围内以大致与剂量成比例的方式增加，但在雌性中趋于以大于剂量比例的方式增加。在19μg/kg时，雌性AUC0-168比从线性关系预测的高约1.8倍。DF hIL12-Fc si在雌性中的AUC0-168与雄性中的基本相似，尽管在第1天和第8天在1.9μg/kg时从MSD数据得出的雌性AUC0-168似乎低于雄性。
无法对所有动物充分估计终末t1/2，但它可以在17.4至30.5小时的范围内估计，并且通常似乎与剂量和性别无关。DF hIL12-Fc si的血浆清除率低，分布容量略低于血容量(73.4mL/kg)并且远低于全身水容量(693mL/kg)(Davies B,Morris T.,Pharm Res.[药物研究]1993；10(7):1093-5)。
在重复IV推注施用rhIL12后，没有rhIL12的积累。在第1天和第8天，rhIL12的AUC0-168在1至10μg/kg的剂量范围内通常以大致与剂量成比例的方式增加，但在第1天在雄性中趋于以大于剂量比例的方式增加。在10μg/kg时，在第1天雄性AUC0-168比从线性关系预测的高约1.8倍。雄性和雌性对rhIL12的全身暴露似乎没有任何差异。终末t1/2(7.2至17.0小时)比DF hIL12-Fc si更短，血浆清除率低，分布容量与血容量相似，并且远低于全身水容量。
与DF hIL12-Fc si相比，rhIL12的半衰期更短，这解释了用DF hIL12-Fc si观察到的更大(约4.5×至7.4×)AUC0-168。
表71：在3周研究中对食蟹猴皮下或静脉内施用后DF hIL12-Fc si的平均血浆毒代动力学(研究NF37DV)
Figure BDA0003996373120002251
Figure BDA0003996373120002261
来源：研究NF37DV。
AUC0-168：从给药时的时间到给药后168小时的浓度-时间曲线下面积；ADA：抗药物抗体；C最大：最大血浆浓度；ELISA：酶联免疫吸附测定；F：雌性；M：雄性；NA：不适用；NR：由于ADA阴性动物数量不足而未报告；TK：毒代动力学。
注意：所有TK参数均源自通过验证的ELISA定量的浓度。动物数量/性别/组在脚注中表示。在第15天，仅针对没有ADA的动物提供暴露，即使在这些ADA阳性动物中存在可定量的暴露。由于DF hIL12-Fc si预期每3周在患者中给药一次，因此猴研究的第1天暴露被用作与预期的人给药方案的最佳比较。
a中位值；b n＝第1天5个/性别/组，4μg/kg SC除外(n＝3个/性别)；c n＝2个/性别；d n＝3个/性别；e n＝1个/性别；f n＝5个/性别。
一般而言，DF hIL12-Fc si平均C最大、AUC0-24和AUC0-168值的性别相关差异小于2倍。SC给药后，如通过DF hIL12-Fc si平均C最大和AUC0-168评估的暴露量通常随着剂量水平从4μg/kg DF hIL12-Fc si增加而增加。平均C最大和AUC0-168的增加与剂量成比例。在猴中在多个剂量的DF hIL12-Fc si后没有观察到DF hIL12-Fc si的积累。DF hIL12-Fc si的皮下生物利用度约为40％。SC施用的平均t1/2在第1天和第15天范围为17.5至35.8小时，而IV施用的平均t1/2在第1天为22.2小时，在第15天为45.3小时。
针对DF hIL12-Fc si的ADA的诱导发生率在0μg/kg时为0％(10个中有0个)，在4μg/kg SC时为33％(6个中有2个)，在8μg/kg SC时为80％(10个中有8个)，在20μg/kg SC时为90％(10个中有9个)，以及在12μg/kg IV时为30％(10个中有3个)。在第15天，ADA阳性动物中DF hIL12-Fc si的血浆浓度总体上低于ADA阴性动物中的浓度，但通常仍可定量。ADA的影响是可变的，ADA阳性动物中的血浆浓度范围是在某些情况下与ADA阴性动物中的那些相似，而在另一些情况下则显著更低。然而，这表明，一般而言，ADA阳性动物在第15天仍暴露于DF hIL12-Fc si。因此，ADA不会对毒理学研究的解释产生负面影响，因为在大部分给药期间都有足够的暴露。
生物利用度
在非GLP研究TD36MM和DQ81GX中在食蟹猴中SC施用后，DF hIL12-Fc si通常表现出约60％的生物利用度，尽管观察到一些变异性。尽管没有得到证实，但据信ADA的产生可能影响了研究TD36MM中的第二IV剂量，这随后会影响生物利用度计算；因此，在考虑跨动物的总体平均生物利用度时，这些值被排除在外。表72显示了这些研究中跨动物的生物利用度。
在GLP研究NF37DV中，基于AUC0-168的DF hIL12-Fc si的SC生物利用度跨个体雄性和雌性动物的范围内为18.2％至52.8％，其中以4、8和20μg/kg SC在第一剂后平均值分别为35.4％、35.1％和38.2％。
表72：DF hIL12-Fc si生物利用度的评估
Figure BDA0003996373120002271
Figure BDA0003996373120002281
来源：研究TD36MM、DQ81GX和NF37DV。
ADA：抗药物抗体；AUC0-t：从最后一个可量化样品的时间的浓度-时间曲线下面积；ID：鉴定；IV：静脉内；SC：皮下。
a尽管没有得到证实，但据信ADA的产生可能影响了研究TD36MM中的第二IV剂量，这影响生物利用度计算。因此，在计算平均生物利用度时，这些值是不相关的。
分布
稳态分布容量(Vss)只能在非GLP研究，研究QW56LH中计算。第一IV剂量后平均Vss为37.6mL/kg，第二IV剂量后为47.55mL/kg。在随后的猴非GLP研究中，无法计算Vss，因为IV输注后的终末期表征不足。
在GLP研究中，雄性和雌性在第一IV剂量后的平均Vss分别为91.9和71.1mL/kg，跨所有10只动物的总体平均Vss为81.5mL/kg。第15天，雄性(n＝2)的平均Vss为107mL/kg，评估的单个雌性为108mL/kg，跨3只动物的总体平均Vss为108mL/kg。
代谢
尚未进行DF hIL12-Fc si的代谢研究。对常规为小分子药物进行的标准代谢研究被认为对抗体等生物制剂没有必要或没有用。
排泄
尚未进行DF hIL12-Fc si的排泄研究。对常规对小分子药物进行的标准清除研究被认为对DF hIL12-Fc si等生物制剂没有必要或没有用。
药物相互作用
迄今为止，尚未进行药物-药物相互作用(DDI)研究。治疗性蛋白(例如细胞因子或作为细胞因子调节剂的单克隆抗体)可能通过影响特定细胞因子p450(CYP)酶和药物转运蛋白的表达和稳定性而与小分子药物展现相互作用(Huang SM,Zhao H,Lee JI,ReynoldsK,Zhang L,Temple R,等人,Clin Pharmacol Ther.[临床药理学与治疗学]2010；87(4):497-503)。在细胞因子中，已知IL6可下调CYP表达。建模显示IL-6可在给药后约48小时将CYP3A4的内在清除率降低28％(Xu Y,Hijazi Y,Wolf A,Wu B,Sun YN,Zhu M.,CPTPharmacometrics Syst Pharmacol.[CPT药理学与系统药理学]2015；4(9):507-15)。在耐受剂量下，DF hIL12-Fc si在猴中诱导了IL6的最小和零星增加。鉴于CYP酶的从头合成(t1/2为24至36小时)和掺加DF hIL12-Fc si的IL6细胞因子的短暂持续时间，DDI的风险被认为不显著。
因为没有理由相信DF hIL12-Fc si(一种IL12-Fc融合蛋白)被CYP酶代谢，抑制或诱导CYP酶的小分子不太可能影响DF hIL12-Fc si的PK。基于这些考虑，DF hIL12-Fc si的PK DDI潜力被认为是低的。
免疫原性
在猴的单剂量毒理学研究中，12只接受治疗的动物中有7只被发现抗药物抗体(ADA)呈阳性。此外，虽然没有评估ADA，但在食蟹猴4周重复剂量研究中，TK的变异性和异常高的生物利用度估计值被认为与针对DF hIL12-Fc si的ADA的产生一致。在非GLP和GLP研究中，ADA影响个体猴的暴露，但在足够长的持续时间内实现了合适的暴露，以可信赖地定义DF hIL12-Fc si的毒理学特征。猴的ADA不能预测人的免疫原性。由于这些原因，将在临床研究中评估抗DF hIL12-Fc si抗体的血清滴度。
实例26：使用DF hIL12-Fc si治疗癌症
目标
该临床研究设计有以下期：1期、1b期和2期。
1期的主要目标是评估DF hIL12-Fc si作为单一疗法的安全性和耐受性，并确定DF hIL12-Fc si在晚期(不可切除、复发或转移)实体肿瘤患者中的最大耐受剂量(MTD)。
1b期的主要目标是评估DF hIL12-Fc si与派姆单抗组合的安全性和耐受性，并确定DF hIL12-Fc si与派姆单抗组合在晚期(不可切除、复发或转移)实体肿瘤患者中的最大耐受剂量(MTD)。
2期的主要目标是针对所有功效扩展队列(其测试DF hIL12-Fc si作为单一疗法或组合疗法的临床活性)根据独立终点审查委员会(IERC)的实体瘤缓解评估标准1.1版(RECIST 1.1)评估客观缓解率(ORR)。
1期和1b期的次要目标，其中DF hIL12-Fc si作为单一疗法和与派姆单抗组合，是：表征DF hIL12-Fc si的PK；评估DF hIL12-Fc si的免疫原性，并将其暴露和临床活性关联；评估最佳总体缓解(BOR)，如由研究者针对DF hIL12-Fc si使用RECIST 1.1确定；使用RECIST 1.1评估DF hIL12-Fc si的缓解持续时间(DOR)；使用RECIST 1.1评估DF hIL12-Fcsi的无进展生存期(PFS)；并评估总生存期(OS)时间。
2期的次要目标，其中DF hIL12-Fc si作为单一疗法和与派姆单抗组合，是：表征DF hIL12-Fc si的PK；使用RECIST 1.1根据IERC，评估DF hIL12-Fc si的缓解持续时间(DOR)；使用RECIST 1.1评估DF hIL12-Fc si的临床受益率(CBR)。CBR定义为具有完全缓解(CR)、部分缓解(PR)或疾病稳定(SD)的患者的百分比作为最佳缓解；评估DF hIL12-Fc si的安全性；评估DF hIL12-Fc si的免疫原性，并与暴露和临床活性关联；使用RECIST 1.1根据IERC评估DF hIL12-Fc si的无进展生存期(PFS)；并评估总生存期(OS)时间。
探索性目的
探索性目的，其中DF hIL12-Fc si作为单一疗法和与派姆单抗组合，是：评估肿瘤和外周生物标志物相对于基线的变化，以及与PK的关系；评估派姆单抗的PK(仅限1b期和队列2C)；根据研究者评估(ORR、DOR、CBR和BOR，RECIST)评估DF hIL12-Fc si在功效扩展队列部分(2期)中的活性；并评估肿瘤和外周生物标志物与肿瘤缓解率之间的关联。
研究设计综述
本研究是一项1/2期、开放标签、剂量递增研究，具有连续的平行组功效扩展研究，旨在确定DF hIL12-Fc si作为单一疗法以及与派姆单抗组合的安全性、耐受性、PK、药效学和初步抗肿瘤活性。图51A(针对单一疗法)和51B(针对与派姆单抗组合疗法)显示了研究设计的示意图。
该研究由3个部分组成：1期：剂量递增，作为单一疗法，使用3+3设计，具有1期队列扩展；1b期：剂量递增，与派姆单抗组合，使用3+3设计，具有1b期队列扩展；和2期：使用组顺序设计的功效扩展。
在以下适应症中在功效扩展队列中评估作为单一疗法的DF hIL12-Fc si：队列2A：晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤；和队列2B：晚期(不可切除或转移性)肾细胞癌(RCC)
在以下适应症中在功效扩展队列中评估与派姆单抗组合的DF hIL12-Fc si：队列C：晚期(不可切除或转移性)尿路上皮癌
在每个研究阶段，患者每3周(Q3W)在第1天接受DF hIL12-Fc si。患者接受DFhIL12-Fc si直到确认疾病进展(PD)、不可接受的毒性(即，剂量限制性毒性[DLT])或任何退出研究或研究性药物产品(IMP)的原因发生。
1期剂量递增DF hIL12-Fc si单一疗法
该研究的1期剂量递增阶段旨在使用标准3+3设计确定DF hIL12-Fc si作为单一疗法的剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)。
除非由于DLT，否则递增到下一个剂量水平(DL)的决定是基于队列的所有患者在第2周期第1天(C2D1)进行安全性评价后的安全性评估。为了评估DF hIL12-Fc si的安全性，成立了负责剂量递增决策的安全监测委员会(SMC)。
在确定剂量水平“n”的安全性后，SMC可以选择允许该DL的多达10名患者纳入1期扩展队列；此过程最多可纳入30名患者。
MTD定义为6名可评估患者中≤1名患者经历DLT的最高DL。
1b期：与派姆单抗组合的剂量递增
该研究的1b期剂量递增阶段旨在使用如1期所述的标准3+3设计确定DF hIL12-Fcsi与派姆单抗组合给予时的DLT和MTD。
根据其美国包装插页，每3周(在每个周期的第1天)施用派姆单抗一次。派姆单抗的施用先于DF hIL12-Fc si的施用。
与派姆单抗组合测试的DF hIL12-Fc si剂量水平与作为单一疗法测试的剂量水平相同。
在DF hIL12-Fc si单一疗法满足以下任何标准后，1b期开始：在DLT观察期间以任何剂量水平发生2级药物相关毒性；在未定义为MTD的剂量水平发生DLT；并且剂量递增完成，没有定义MTD。
在满足这些标准之一后，1b期(DF hIL12-Fc si与派姆单抗组合)开始使用比满足任何上述标准的剂量低两个剂量水平的DF hIL12-Fc si剂量，或者如果在DL1或DL2时满足这些标准中的任何，则在确定DL1的安全性(定义为在DL2治疗的3名患者或在DL1治疗的6名患者，在DL1观察到不超过一个DLT)后，组合的开始剂量是DL1。
在确定剂量水平“n”的安全性后，SMC可以选择允许该剂量水平的多达10名患者纳入1b期扩展队列；此过程最多可纳入30名患者。
2期功效扩展
在推荐的2期剂量(RP2D)下，以下肿瘤类型被纳入：
作为单一疗法：队列2A：晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤；和队列2B：晚期(不可切除或转移性)肾细胞癌。
与派姆单抗组合：队列2C：晚期(不可切除或转移性)尿路上皮癌。
纳入和排除标准
进入研究时年龄≥18岁、东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1且估计预期寿命至少为3个月的男性或女性患者被纳入。
每个研究期/队列的主要纳入标准如下：
1/1b期的剂量递增队列：疾病的临床或放射学证据
1/1b期的剂量扩展队列：具有以下肿瘤类型之一：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、或三阴性乳腺癌；患有可测量的疾病，如由研究者使用实体瘤缓解评估标准(RECIST)1.1版确定；
队列2A
晚期黑色素瘤患者，其：接受抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体治疗至少6周；在PD的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1的同时确认PD。PD的确认可以基于放射学或临床观察；如果肿瘤携带BRAF激活性突变并且在最后一个治疗线后进展，则必须接受BRAF抑制剂。
队列2B
晚期RCC瘤患者，其：有任何透明细胞组织学组分；接受了抗PD-1/PD-L1抗体和抗血管内皮生长因子疗法作为单一疗法或组合疗法进行治疗；接受了≤3个先前的治疗线
队列2C
晚期尿路上皮癌患者，其：具有经组织学或细胞学证实的尿路上皮(包括肾盂、输尿管、泌尿道上皮、尿道)的局部晚期或转移性移行细胞癌；已接受一种(且不超过一种)含铂方案(例如，铂加另一种药剂，如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星等)，用于不能手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌(其在作为辅佐的含铂方案的最后一次施用后6个月内具有放射影像学进展或复发，这将被认为是一线含铂方案的失败)；已接受不超过2个疗法线(包括含铂方案)用于治疗转移性疾病；未接受过检查点抑制剂(CPI)(即，抗PD-1或抗PD-L1)作为单一疗法或与铂类化学疗法组合使用的治疗。
剂量/施用方式/施用方案
DF hIL12-Fc si作为皮下(SC)注射剂Q3W(即每个周期的第1天)施用。患者在最多2个注射部位接受体积不超过1mL的药物SC。如果适用，在第一施用完成后10分钟内完成第二施用。
在1/1b期，患者在DF hIL12-Fc si的第一施用后住院过夜。
DF hIL12-Fc si DL(μg/kg)如下表73所示。
表73：DF hIL12-Fc si DL(μg/kg)
Figure BDA0003996373120002341
DF hIL12-Fc si的剂量是根据患者在基线时的体重计算的。仅当自上次计算剂量后患者的体重变化10％或更多时，才会重新计算患者的计算剂量。
探索性生物标志物
外周生物标志物
在所有患者的外周中评估外周生物标志物，包括：细胞参数：通过流式细胞术进行免疫表型分型(IPT)的外周血单核细胞(PBMC)；可溶性因子：血清样品中的细胞因子和趋化因子；离体IL12反应测定：PBMC，其用于离体刺激，然后分析IFNγ产生；循环肿瘤(ct)脱氧核糖核酸(DNA)。
在施用DF hIL12-Fc si C1至C3之前2小时以及在以下每次研究就诊时，对衍生自全血样品的PBMC进行IPT评估：C1D3、C1D8、C2D8和C3D3。
在每个治疗周期的D1和在C1D2、C1D3、C1D5、C1D8、C1D15、C2D3、C3D3和C4D3以及在EOT和SFU就诊时在DF hIL12-Fc si施用前2小时内采集的血清样品中确定可溶性因子。
为了完成对肿瘤材料的所有评估，从患者采集血液(例如，全血、血浆和血清样品)。
衍生自肿瘤组织的生物标志物
在参与剂量递增阶段(任选活检)、1/1b期扩展队列部分(强制活检)和2期功效扩展队列阶段(强制活检)的患者的治疗前和治疗中活检中评估组织衍生的生物标志物。
在基线时从存档的肿瘤组织(或新鲜的肿瘤活检，如果有)、全血和血清样品中分析一组推定的标志物，包括分子标志物、可溶性标志物和细胞标志物，以研究临床功效和分析的标志物之间可能的相关性。
对于纳入剂量递增阶段的患者，使用市售试剂盒(Dako PD-L1IHC 22C3 pharmDx)确定PD-L1表达水平，通过免疫组织化学(IHC)确定CD3阳性分析(T细胞浸润)。
对于纳入1/1b期扩展队列和功效扩展队列的患者，在筛选时(即，在第一研究药物剂量前30天内)和在治疗期间的预先指定的时间点进行新的强制性肿瘤活检。
评估的其他生物标志物包括：肿瘤浸润白细胞(例如，根据IHC或IF，CD8、CD4 T细胞、Treg、NK细胞、巨噬细胞[M1/2谱])的频率和定位、基因表达谱和药物基因组学(PGx)。
参考疗法：剂量/施用方式/施用方案
根据美国包装插页，在1b期和队列2C中，派姆单抗的施用剂量为200mg，每3周通过静脉内(IV)输注施用一次。派姆单抗的施用先于DF hIL12-Fc si的施用。在完成派姆单抗施用后1小时内施用DF hIL12-Fc si。
每位患者的计划治疗持续时间
患者接受研究治疗，直到出现疾病进展(PD)或不可接受的毒性，或出现任何退出研究或DF hIL12-Fc si的标准。
任何经历经确认的完全缓解(CR)的患者在确认后至少接受12个月的治疗，除非符合中止标准，这由研究者自行决定。如果研究者认为这样的患者可能会从超过12个月的治疗中受益，则在与赞助商医疗监察员讨论后可能允许继续治疗。最长治疗持续时间为24个月。
统计方法(包括样品量计算)
本研究的可评估患者数量来自剂量递增“3+3”设计和扩展队列规模。最终样品量可能会有所不同，具体取决于评估的DL总数、用于DLT评估的患者替代(如果适用)以及如果观察到DLT，则从3名患者扩展到6名患者。
如果扩展阶段的快速招募影响IMP的供应，任何队列的新患者筛查可以暂时暂停，并在24小时内通知研究者。
最终样品量可能会有所不同，具体取决于评估的DL总数、用于DLT评估的患者替代(如果适用)以及如果观察到DLT，则从3名患者扩展到6名患者。
作为单一疗法的功效扩展(队列2A和2B)
此阶段的主要终点是ORR。对于这些队列中的每一个，零假设是客观缓解率(ORR)不超过5％(H0:ORR<5％)，可替代的假设是ORR大于10％(H1:ORR≥5％)。
DF hIL12-Fc si作为单一疗法的目标ORR为20％。预计这些队列中的每个将纳入40名患者(即总共约80名患者)。
采用组顺序设计，每个适应症队列中有40名患者，假设DF hIL12-Fc si的目标ORR为20％，则功效队列提供约90％的研究把握度，以0.025的1侧总体I型错误率检测15％差异。
对于队列2A和2B中的每一个，计划以50％的信息分数(即约20名患者的)进行具有Lan-DeMets O’Brien Fleming边界的无效期中分析。
一旦20名患者完成3个月的随访或退出研究，如果纳入的患者根据RECIST 1.1都没有达到PR或CR的未确认BOR，则可能会因无效而停止纳入。在研究结束时，如果至少5名患者根据RECIST 1.1达到PR或CR的确认BOR，则宣布队列成功。
与派姆单抗组合的功效扩展(队列2C)
与派姆单抗组合的功效扩展的2期部分确定了在接受一个基于铂的化学疗法线后进展的UBC病患者中组合使用DF hIL12-Fc si的临床活性。
主要终点是ORR。该研究纳入了40名患者，因此在40名患者中观察到15名缓解(CR或PR)将导致95％ CI(0.2317；0.5419)不包括KEYNOTE-045中纳入的相似人群中报告的派姆单抗缓解百分比值。在该研究中，ORR为21.7％(Bellmunt J,de Wit R,Vaughn DJ,FradetY,Lee JL,Fong L,等人,N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2017；376(11):1015-1026.)。
至少4周的指标用于确定SD并确认CR、PR或PD。DOR定义为从首次观察到CR或PR到疾病进展之间的时间。PFS，根据RECIST 1.1定义，定义为从首次施用研究治疗到首次观察到疾病进展或死亡，以先到者为准。OS定义为从首次施用研究治疗到死亡的时间。
安全性分析通过描述性统计呈现、队列和/或跨队列进行总结。
实例27：使用单剂量DF hIL12-Fc si治疗癌症
本研究的主要目标是评估当以单剂量施用时DF hIL12-Fc si作为单一疗法的安全性和耐受性，并确定DF hIL12-Fc si在晚期(不可切除、复发或转移)实体肿瘤患者中的最大耐受剂量(MTD)。DF hIL12-Fc si以单剂量皮下(SC)注射施用。患者在最多2个注射部位接受体积不超过1mL的药物SC。如果适用，在第一施用完成后10分钟内完成第二施用。患者仅接受单剂量的DF hIL12-Fc si。
实例28：使用DF hIL12-Fc si治疗癌症
这是一项1/2期、开放标签、剂量递增研究，具有连续的平行组功效扩展研究，旨在确定DF-hIL-12-Fc si作为单一疗法以及与派姆单抗组合的安全性、耐受性、PK、药效学和初步抗肿瘤活性。
表74：1/2期，开放标签，剂量递增研究
Figure BDA0003996373120002371
该研究由3个部分组成：1期：剂量递增，作为单一疗法，使用3+3设计，具有1期队列扩展；1b期：剂量递增，与派姆单抗组合，使用3+3设计，具有1b期队列扩展；2期：使用组顺序设计的功效扩展。
在2期，在以下适应症中评估作为单一疗法的DF-hIL-12-Fc si：队列2A：晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤；队列2B：晚期(不可切除或转移性)肾细胞癌(RCC)。
在2期，在以下适应症中评估与派姆单抗组合的DF-hIL-12-Fc si：队列C：晚期(不可切除或转移性)尿路上皮癌。
在每个研究阶段，患者每3周(Q3W)在第1天接受DF-hIL-12-Fc si。患者接受DF-hIL-12-Fc si直到确认疾病进展(PD)、不可接受的毒性(即，剂量限制性毒性[DSL])或任何退出研究或研究性药物产品(IMP)的原因发生。
下表75列出了组和干预。
表75：组和干预
Figure BDA0003996373120002381
Figure BDA0003996373120002391
主要结果测量包括：1.根据研究方案中的标准定义的单一疗法DF-hIL-12-Fc si的研究中所经历的剂量限制性毒性的数量的评估[时间范围：每个受试者治疗的前3周]；评估单一疗法DF-hIL-12-Fc si治疗期间经历的符合研究方案中剂量限制性毒性标准的不良事件的数量；2.根据研究方案中的标准定义的DF-hIL-12-Fc si和派姆单抗的组合疗法的研究中所经历的剂量限制性毒性的数量的评估[时间范围：组合疗法队列中每个受试者治疗的前3周]；评估DF-hIL-12-Fc si和派姆单抗组合疗法期间经历的满足剂量限制性毒性的不良事件的数量；根据研究方案的标准；3.评估总体缓解率[时间范围：完成研究后90天，平均1年]；根据RECIST 1.1版标准评估2期扩展队列中患者的总体缓解率(ORR)。
次要结果测量包括：1.评估整个研究期间治疗中出现的不良事件的数量[时间范围：直到研究的第2期部分中纳入的最后一名受试者最后一次治疗后30天]；通过评估DF-hIL-12-Fc si治疗期间发生的不良事件的数量来表征DF-hIL-12-Fc si的安全性；2.确定不同时间点DF-hIL-12-Fc si的血清浓度[时间范围：从治疗开始到最后一次治疗后28天]；DF-hIL-12-Fcsi的浓度与时间的关系将使用研究中不同时间点采集的血样进行测量；3.评估缓解持续时间[时间范围：从疗法开始的时间到首次记录肿瘤进展之日，评估长达24个月]；使用RECIST 1.1标准评估缓解持续时间；4.评估最佳总体缓解[时间范围：完成研究后90天，平均1年]；使用RECIST 1.1标准评估最佳总体缓解；5.评估总体生存期[时间范围：从纳入研究到死亡的时间，测量到研究的最后一次治疗后长达2年]；评估治疗后的总生存期；6.评估总体缓解率[时间范围：从纳入研究到研究的最后一次治疗后长达2年的时间]；根据研究者的判断评估总体缓解率。
资格标准
纳入标准(一般1期)是：1.签署书面知情同意书；2.年龄≥18岁的男性或女性患者；3.经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，对其尚无标准疗法，或标准疗法失败；4.进入研究时ECOG体能状态为0或1，估计预期寿命至少为3个月；5.疾病的临床或放射学证据；6.存档的肿瘤活检可用，不超过6个月，至少8张切片可用；或在筛选窗口内获得的任选新鲜活检；7.白细胞(WBC)计数≥3x109/L、中性粒细胞绝对计数(ANC)≥1.5x109/L、淋巴细胞计数≥0.5x109/L、血小板计数≥75x109/L以及血红蛋白≥9g/dL(可能已输注)定义的充分的血液学功能；8.由以下定义的充分的肝功能：总胆红素水平≤1.5x正常上限(ULN)、AST水平≤2.5x ULN和ALT水平≤2.5x ULN，或者对于已证实有肝脏转移性疾病的患者，AST和ALT水平≤5x ULN；9.根据Cockcroft-Gault公式，由估计的肌酐清除率50ml/min定义的充分的肾功能；10.根据NCI CTCAE v5.0，最近一次既往抗癌疗法的一种或多种毒性作用消退至≤1级(脱发除外)如果患者接受了大手术或>30Gray的放射疗法，则患者必须已经从干预的毒性和/或并发症中恢复(有≤2级神经病变或≤2级脱发的患者是该标准的例外并且可以有资格参加研究。)；11.根据世界卫生组织(WHO)指南定义的1“高效”方法或2“有效”方法，有生育能力的女性(WOCBP)患者的有效避孕；12.有资格根据其批准的标签接受派姆单抗。(仅限组合队列。)。
另外的1期单一疗法扩展纳入标准是：1.具有以下肿瘤类型之一：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、或三阴性乳腺癌；2.由研究者使用RECIST 1.1版确定的可测量疾病；3.同意进行治疗前活检和在治疗期间的另一次活检；4.其疾病的临床/放射学表现与治疗前活检和治疗期间的另一次活检一致。
另外的1b期组合疗法扩展队列标准是：1.由研究者使用RECIST 1.1版确定的可测量疾病；2.同意进行治疗前活检和在治疗期间的另一次活检；3.其疾病的临床/放射学表现与治疗前活检和治疗期间的另一次活检一致。
纳入标准(一般2期)是：1.签署书面知情同意书；2.年龄≥18岁的男性或女性患者；3.进入研究时ECOG体能状态为0或1，估计预期寿命至少为3个月；4.由研究者使用RECIST1.1版确定的可测量疾病；5.同意进行治疗前活检和在治疗期间的另一次活检；6.WBC计数≥3x109/L、ANC≥1.5x109/L、淋巴细胞计数≥0.5x109/L、血小板计数≥75x109/L以及血红蛋白≥9g/dL(可能已输注)定义的充分的血液学功能；7.由以下定义的充分的肝功能：总胆红素水平≤1.5x ULN、AST水平≤2.5x ULN和ALT水平≤2.5x ULN，或者对于已证实有肝脏转移性疾病的患者，AST和ALT水平≤5x ULN；8.根据Cockcroft-Gault公式，由估计的肌酐清除率>50ml/min定义的充分的肾功能；9.根据NCI CTCAE v5.0，最近一次既往抗癌疗法的一种或多种毒性作用消退至≤1级(脱发除外)如果患者接受了大手术或>30Gray的放射疗法，则患者必须已经从干预的毒性和/或并发症中恢复(有≤2级神经病变或≤2级脱发的患者是该标准的例外并且可以有资格参加研究。)；10.其疾病的临床/放射学表现与治疗前活检和治疗期间的另一次活检一致；11.根据WHO指南定义的1“高效”方法或2“有效”方法，WOCBP患者的有效避孕。
另外的2期纳入标准(仅限黑色素瘤)是：1.接受抗PD-1抗体治疗至少6周；2.在PD的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1的同时确认PD。PD的确认可以基于放射学或临床观察；3.如果肿瘤携带BRAF激活性突变并且在最后一个治疗线后进展，则必须接受BRAF抑制剂。
另外的2期纳入标准(仅限肾细胞)是：1.任何透明细胞组织学组分；2.接受了抗PD-1/PD-L1抗体或抗血管内皮生长因子疗法作为单一疗法或组合疗法进行治疗；3.接受了≤3个先前的治疗线。
另外的2期纳入标准(仅限尿路上皮癌)是：1.经组织学或细胞学证实的尿路上皮(包括肾盂、输尿管、泌尿道上皮、尿道)的局部晚期或转移性移行细胞癌；2.必须已接受一种(且不超过一种)含铂方案(例如，铂加另一种药剂，如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星)，用于不能手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌(其在作为辅佐的含铂方案的最后一次施用后6个月内具有放射影像学进展或复发，这将被认为是一线含铂方案的失败)；3.已接受不超过2个疗法线(包括含铂方案)用于治疗转移性疾病；4.必须还未接受CPI(即，抗PD-1或抗PD-L1)作为单一疗法或与铂类化学疗法组合使用的治疗。
排除标准是：1.同时使用未经许可的药物进行治疗；2.先前用rhIL2或任何含有IL2部分的重组长效药物治疗；3.同时进行抗癌治疗(例如，细胞减灭疗法、放射疗法(姑息性骨定向放射疗法除外)、免疫疗法或除促红细胞生成素外的细胞因子疗法)、大手术(不包括先前的诊断活检)、同时使用类固醇或其他免疫抑制剂进行的全身疗法，或在研究治疗开始前28天内使用任何研究药物。允许短期使用全身性类固醇(即用于过敏反应或管理irAE)；注意：如果在第一剂DF-hIL-12-Fc si前至少14天开始治疗，则接受双膦酸盐的患者符合条件；4.过去3年内除本研究要调查的目标恶性肿瘤以外的既往恶性疾病，其中皮肤基底细胞癌或鳞状细胞癌、局限性前列腺癌或宫颈原位癌除外；5.快速进展的疾病；6.在使用抗PD-1或PD-L1药剂作为单一疗法施用进行治疗期间出现任何2级或更高级别的神经毒性或肺毒性；7.中枢神经系统(CNS)转移活动或病史。患有一个或多个脑转移的黑色素瘤患者如果在治疗后稳定4周，则符合条件；8.接受任何器官移植，包括自体或同种异体干细胞移植；9.严重的急性或慢性感染(包括在筛查窗口期间对人免疫缺陷病毒[HIV]进行的历史阳性检测，或活动性或潜伏性乙型肝炎或活动性丙型肝炎检测)；10.在过去3年内需要全身免疫抑制剂治疗超过28天的已有自身免疫性疾病(白癜风患者除外)或临床相关免疫缺陷(例如异常丙种球蛋白血症或先天性免疫缺陷)或在第1天的7天内发热；11.对单克隆抗体(mAb)的已知严重超敏反应(≥3级NCI CTCAE v5.0)、任何过敏反应史或未控制的哮喘(即部分地控制的哮喘的3个或更多个特征)；12.与先前疗法相关的持续毒性≥2级NCI CTCAEv5.0，但脱发和感觉神经病变≤2级是可以接受的；13.研究期间女性怀孕或哺乳；14.已知的酒精或药物滥用；15.严重的心脏病或医疗病症，包括但不限于：a.纽约心脏协会III或IV级心力衰竭或收缩功能障碍(左心室射血分数[LVEF]<55％)病史；b.高危不受控制的心律失常，即静息时心率>100/min的心动过速；c.明显的室性心律失常(室性心动过速)或更高级别的房室(AV)阻滞(二级AV阻滞2型[Mobitz 2)或三级AV阻滞)；d.需要抗心绞痛药物的心绞痛；e.有临床意义的心脏瓣膜病；f.ECG上透壁性梗塞的证据；g.控制不佳的高血压(定义为：收缩压>180mm Hg或舒张压>100mmHg)；h.临床相关的不受控制的心脏危险因素、临床相关的肺部疾病或研究者认为可能限制参与本研究的任何临床相关的医疗病症；16.研究者认为可能损害患者参与能力的所有其他重大疾病(例如炎症性肠病)；17.任何会禁止理解或提供知情同意的精神病症；18.无法律行为能力或有限的法律行为能力；19.无法签署知情同意书，包括遵守知情同意书(ICF)和本方案中列出的要求和限制。
实例29：使用DF hIL12-Fc si治疗癌症
目标
该临床研究设计有以下期：1期、1b期和2期。
1期的主要目标是评估DF hIL12-Fc si(也称为DF6002)作为单一疗法的安全性和耐受性，并确定DF hIL12-Fc si在晚期(不可切除、复发或转移)实体肿瘤患者中的最大耐受剂量(MTD)。
1b期的主要目标是评估DF hIL12-Fc si与纳武单抗组合的安全性和耐受性，并确定DF hIL12-Fc si与纳武单抗组合在晚期(不可切除、复发或转移)实体肿瘤患者中的最大耐受剂量(MTD)。
2期的主要目标是针对所有功效扩展队列(其测试DF hIL12-Fc si作为单一疗法或组合疗法的临床活性)根据独立终点审查委员会(IERC)的实体瘤缓解评估标准1.1版(RECIST 1.1)评估客观缓解率(ORR)。
1期和1b期的次要目标，其中DF hIL12-Fc si作为单一疗法和与纳武单抗组合，是：表征DF hIL12-Fc si的PK；评估DF hIL12-Fc si的免疫原性，并将其暴露和临床活性关联；评估最佳总体缓解(BOR)，如由研究者针对DF hIL12-Fc si使用RECIST 1.1确定；评估最佳总体缓解(BOR)，如由研究者针对DF hIL12-Fc si使用RECIST 1.1确定；使用RECIST1.1评估DF hIL12-Fc si的缓解持续时间(DOR)；使用RECIST 1.1评估DF hIL12-Fc si的无进展生存期(PFS)；评估总生存期(OS)时间。
2期的次要目标，其中DF hIL12-Fc si作为单一疗法和与纳武单抗组合，是：表征DF hIL12-Fc si的PK；使用RECIST 1.1根据IERC，评估DF hIL12-Fc si的缓解持续时间(DOR)；使用RECIST 1.1评估DF hIL12-Fc si的临床受益率(CBR)。CBR定义为具有完全缓解(CR)、部分缓解(PR)或疾病稳定(SD)的患者的百分比作为最佳缓解；评估DF hIL12-Fc si的安全性；评估DF hIL12-Fc si的免疫原性，并与暴露和临床活性关联；使用RECIST 1.1根据IERC评估DF hIL12-Fc si的无进展生存期(PFS)；并评估总生存期(OS)时间。
下表76列出了组和干预：
表76：组和干预
Figure BDA0003996373120002431
Figure BDA0003996373120002441
主要结果测量包括：
1.根据研究方案中的标准定义的单一疗法DF6002的研究中所经历的剂量限制性毒性的数量的评估[时间范围：每个受试者治疗的前3周。]评估单一疗法DF6002治疗期间经历的符合研究方案中剂量限制性毒性标准的不良事件的数量；
2.根据研究方案中的标准定义的DF6002和纳武单抗的组合疗法的研究中所经历的剂量限制性毒性的数量的评估[时间范围：组合疗法队列中每个受试者治疗的前3周。]评估DF6002和纳武单抗组合疗法治疗期间经历的符合研究方案中剂量限制性毒性标准的不良事件的数量；和
3.评估总体缓解率[时间范围：完成研究后90天，平均1年。]根据RECIST 1.1版标准评估2期扩展队列中患者的总体缓解率(ORR)。次要结果测量包括：1.评估整个研究期间治疗中出现的不良事件的数量[时间范围：直到研究的第2期部分中纳入的最后一名受试者最后一次治疗后30天。]通过评估DF6002治疗期间发生的不良事件的数量来表征DF6002的安全性；2.确定不同时间点DF6002的血清浓度[时间范围：从治疗开始到最后一次治疗后28天]DF6002的浓度与时间的关系将使用研究中不同时间点采集的血样进行测量；
4.评估缓解持续时间[时间范围：从疗法开始的时间到首次记录肿瘤进展之日，评估长达24个月]使用RECIST 1.1标准评估缓解持续时间；
5.评估最佳总体缓解[时间范围：完成研究后90天，平均1年]使用RECIST 1.1标准评估最佳总体缓解；
6.评估总体生存期[时间范围：从纳入研究到死亡的时间，测量到研究的最后一次治疗后长达2年]评估治疗后的总生存期；和
7.评估总体缓解率[时间范围：从纳入研究到研究的最后一次治疗后长达2年的时间]根据研究者的判断评估总体缓解率。
纳入标准(一般1期和1b期)包括：1.年龄≥18岁的男性或女性患者；2.在以下肿瘤类型中，经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，对其尚无标准疗法，或标准疗法失败：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮癌、胃癌、食道癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、和前列腺癌；3.ECOG体能状态为0或1；4.疾病的临床或放射学证据；5.充分的血液、肝和肾功能；6.将先前抗癌疗法的一种或多种毒性作用消退至≤1级(患有≤2级神经病变、≤2级内分泌病或≤2级脱发的患者除外)；和7.根据世界卫生组织指南定义的1“高效”方法或2“有效”方法，有生育能力的女性的有效避孕。
另外的1期单一疗法和1b期组合纳武单抗扩展纳入标准包括：1.具有以下肿瘤类型之一：黑色素瘤、非小细胞肺癌或三阴性乳腺癌；和2.同意进行治疗前活检和在治疗期间的另一次活检。
黑色素瘤特有的扩展纳入标准包括：1.按照美国癌症联合委员会分期系统的规定，组织学证实的、不可切除的III期或IV期黑色素瘤；2.患有眼部或葡萄膜黑色素瘤的参与者不符合资格；3.如果可用，必须记录PD-L1状态；4.必须知道BRAF(V600)突变状态。该队列允许BRAF突变型和野生型参与者；5.BRAF突变的参与者必须已接受批准的靶向疗法；6.必须具有根据RECIST 1.1标准在抗PD-(L)1疗法(作为单一疗法或作为组合的一部分施用)进行时或中止后记录的疾病进展或复发；和7.在辅助情况下接受抗PD-(L)1的参与者必须具有根据RECIST 1.1标准在抗PD-(L)1疗法(作为单一疗法或作为组合的一部分施用)进行时或中止6个月内记录的疾病进展或复发。
NSCLC特有的扩展纳入标准包括：1.组织学确认的NSCLC符合IIIB期、IV期或疾病复发的分期标准；2.参与者必须在针对晚期或转移性疾病的基于双重铂的化学疗法或至少有两个先前全身疗法线期间或之后疾病复发或进展，或者必须在完成针对局部疾病的基于铂的化学疗法后6个月内疾病复发或进展；3.参与者必须接受抗PD-(L)1疗法(如果有)并在其进行时或之后进展；和4.必须知道可起作用的突变(例如，EGFR、ALK、ROS1、RET等)的状态(当根据国家/地区护理实践标准提供检测时)；具有可起作用的突变的参与者必须已经接受标准酪氨酸激酶抑制剂(根据国家/地区的护理实践标准提供)，并且进展、对其不能耐受或不是其候选者。
TNBC特有的扩展纳入标准包括：1.组织学确认的不可切除、局部晚期或转移性三阴性乳腺癌。PD-L1状态、HER2阴性、雌激素受体阴性和孕激素受体阴性状态必须由当地机构根据美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院的指南在纳入前进行评估；2.患者必须没有未接受抗PD-1/PD-L1治疗转移性疾病，但在辅助情况下中施用抗PD-1/PD-L1是可以接受的；3.患者必须已接受一个化学疗法线治疗其转移性疾病，并且在该化学疗法线期间或之后经历进展；和4.患者必须未接受一个以上的化学疗法线治疗其不可切除、复发或转移的疾病。
2期(一般)的纳入标准包括：1.年龄≥18岁的男性或女性患者；2.ECOG体能状态为0或1；3.可测量疾病的临床或放射学证据；4.充分的血液、肝和肾功能；5.先前抗癌疗法的一种或多种毒性作用消退至≤1级。(≤2级神经病变、≤2级内分泌病变或≤2级脱发的患者除外。)；6.参与者必须接受抗PD-(L)1疗法并在其进行时或之后进展；和7.根据世界卫生组织指南定义的1“高效”方法或2“有效”方法，有生育能力的女性的有效避孕。
2期(晚期黑色素瘤患者)的另外纳入标准包括：1.在晚期/转移情况下接受抗PD-(L)1的参与者必须具有在抗PD-(L)1疗法进行时或中止3个月内记录的疾病进展或复发；2.在辅助情况下接受抗PD-(L)1的参与者必须具有在抗PD-(L)1疗法进行时或中止6个月内记录的疾病进展或复发；3.在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1抗体的同时确认疾病进展；4.必须了解BRAF突变状态并使用经批准的靶向疗法进行治疗；5.如果肿瘤携带BRAF激活性突变并且在最后一个治疗线后进展，接受了BRAF抑制剂；6.患有眼部或葡萄膜黑色素瘤的参与者不符合资格；和7.需要在初始进展后至少4周通过扫描确认进展，以确认先前抗PD-(L)1疗法的放射学进展。
2期(非小细胞肺癌)的另外纳入标准包括：1.参与者必须在针对晚期或转移性疾病的基于双重铂的化学疗法或至少有两个先前全身疗法线期间或之后疾病复发或进展，或者必须在完成针对局部疾病的基于铂的化学疗法后6个月内疾病复发或进展；和2.必须知道可起作用的突变的状态；具有可起作用的突变的参与者必须已经接受标准酪氨酸激酶抑制剂，并且进展、对其不能耐受或不是其候选者。
所有患者(所有期)的排除标准：1.先前用rhIL2或任何含有IL2部分的重组长效药物治疗；2.同时进行抗癌治疗(姑息性骨定向放射疗法除外)、免疫疗法或除促红细胞生成素外的细胞因子疗法)、大手术(不包括先前的诊断活检)、同时使用类固醇或其他免疫抑制剂进行的全身疗法，或在研究治疗开始前28天内使用任何研究药物；3.过去3年内除当前目标恶性肿瘤外的既往恶性疾病，其中皮肤基底细胞癌或鳞状细胞癌、局限性前列腺癌或宫颈原位癌除外；4.快速进展的疾病；5.在使用抗PD-1或PD-L1药剂作为单一疗法施用进行治疗期间出现任何2级或更高级别的神经毒性或肺毒性；6.中枢神经系统(CNS)转移的活动性或病史，除非满足以下所有标准：a.CNS病变无症状且先前已治疗；b.患者不需要每天进行持续的类固醇治疗来作为肾上腺功能不全的替代；c.成像显示在最后一次治疗CNS转移后28天疾病稳定；7.接受任何器官移植，自体或同种异体干细胞移植；8.显著的急性或慢性感染，或活动性或潜伏性乙型肝炎或活动性丙型肝炎；9.在过去3年内需要全身免疫抑制剂治疗超过28天的已有自身免疫性疾病、临床相关免疫缺陷或在第1天的7天内发热；10.已知对单克隆抗体的严重超敏反应和任何过敏反应史或不受控制的哮喘；11.严重的心脏病或医疗病症；和12.与先前的免疫疗法相关的危及生命的毒性史，除了用标准对策时不太可能再次发生的那些。
探索性目的
探索性目的，其中DF hIL12-Fc si作为单一疗法和与纳武单抗组合，是：评估肿瘤和外周生物标志物相对于基线的变化，以及与PK的关系；评估纳武单抗的PK(仅限1b期和队列2C)；根据研究者评估(ORR、DOR、CBR和BOR，RECIST)评估DF hIL12-Fc si在功效扩展队列部分(2期)中的活性；评估肿瘤和外周生物标志物与肿瘤缓解率之间的关联。
研究设计综述
本研究是一项1/2期、开放标签、剂量递增研究，具有连续的平行组功效扩展研究，旨在确定DF hIL12-Fc si作为单一疗法以及与纳武单抗组合的安全性、耐受性、PK、药效学和初步抗肿瘤活性。图52A(针对单一疗法)和52B(针对与纳武单抗组合疗法)显示了研究设计的示意图。
该研究由3个部分组成：1期：剂量递增，作为单一疗法，使用3+3设计，具有1期队列扩展；1b期：剂量递增，与纳武单抗组合，使用3+3设计，具有1b期队列扩展；2期：使用组顺序设计的功效扩展。
在以下适应症中在功效扩展队列中评估作为单一疗法的DF hIL12-Fc si：队列2A：晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤；队列2B：晚期(不可切除或转移性)肾细胞癌(RCC)。
在以下适应症中在功效扩展队列中评估与纳武单抗组合的DF hIL12-Fc si：队列2C：晚期(不可切除或转移性)尿路上皮癌。
在每个研究阶段，患者每4周(Q4W)在第1天接受DF hIL12-Fc si。患者接受DFhIL12-Fc si直到确认疾病进展(PD)、不可接受的毒性(即，剂量限制性毒性[DLT])或任何退出研究或研究性药物产品(IMP)的原因发生。
1期剂量递增DF hIL12-Fc si单一疗法
该研究的1期剂量递增阶段旨在使用标准3+3设计确定DF hIL12-Fc si作为单一疗法的剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)。
除非由于DLT，否则递增到下一个剂量水平(DL)的决定是基于队列的所有患者在第1周期第21天(C1D21)进行安全性评价后的安全性评估。为了评估DF hIL12-Fc si的安全性，成立了负责剂量递增决策的安全监测委员会(SMC)。
在确定剂量水平“n”的安全性后，SMC可以选择允许纳入I期扩展队列直至该剂量水平；；此过程最多可纳入50名患者。
MTD定义为6名可评估患者中≤1名患者经历DLT的最高DL。
1b期：与纳武单抗组合的剂量递增
该研究的1b期剂量递增阶段旨在使用如1期所述的标准3+3设计确定DF hIL12-Fcsi与纳武单抗组合给予时的DLT和MTD。
根据其美国包装插页，每4周(在每个周期的第1天)施用纳武单抗一次。纳武单抗的施用先于DF hIL12-Fc si的施用。
与纳武单抗组合测试的DF hIL12-Fc si剂量水平与作为单一疗法测试的剂量水平相同。
1b期在SMC确定DL2单一疗法治疗的安全性后开始(定义为同意开始纳入DL3)。1b期开始于DF hIL12-Fc si剂量比1b期开始时单一疗法确定的安全剂量低1个至少水平时。
在确定剂量水平“n”的安全性后，SMC可以选择允许纳入1b期扩展队列；跨剂量水平此过程最多可纳入50名患者。
2期功效扩展
在推荐的2期剂量(RP2D)下，以下肿瘤类型被纳入：作为单一疗法：队列2A：晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤；队列2B：晚期(不可切除或转移性)肾细胞癌。与纳武单抗组合，队列2C：晚期(不可切除或转移性)尿路上皮癌。
安全性监督
进入研究时年龄≥18岁、东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1且估计预期寿命至少为3个月的男性或女性患者被纳入。每个研究期/队列的主要纳入标准如下：
1/1b期的剂量递增队列：在以下适应症中，经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，对其尚无标准疗法，或标准疗法失败：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、和前列腺癌；疾病的临床或放射学证据。
1/1b期的剂量扩展队列：经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，对其尚无标准疗法，或标准疗法失败；患有可测量的疾病，如由研究者使用实体瘤缓解评估标准(RECIST)1.1版确定。
队列2A
晚期黑色素瘤患者，其：接受抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体治疗至少6周；在PD的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1的同时确认PD。PD的确认可以基于放射学或临床观察；如果肿瘤携带BRAF激活性突变并且在最后一个治疗线后进展，则必须接受BRAF抑制剂。
队列2B
晚期RCC瘤患者，其：有任何透明细胞组织学组分；接受了抗PD-1/PD-L1抗体和抗血管内皮生长因子疗法作为单一疗法或组合疗法进行治疗；接受了≤3个先前的治疗线。
队列2C
晚期尿路上皮癌患者，其：具有经组织学或细胞学证实的尿路上皮(包括肾盂、输尿管、泌尿道上皮、尿道)的局部晚期或转移性移行细胞癌；已接受一种(且不超过一种)含铂方案(例如，铂加另一种药剂，如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星等)，用于不能手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌(其在作为辅佐的含铂方案的最后一次施用后6个月内具有放射影像学进展或复发，这将被认为是一线含铂方案的失败)；已接受不超过2个疗法线(包括含铂方案)用于治疗转移性疾病；未接受过检查点抑制剂(CPI)(即，抗PD-1或抗PD-L1)作为单一疗法或与铂类化学疗法组合使用的治疗。
剂量/施用方式/施用方案
在单一疗法和组合疗法队列中DF hIL12-Fc si作为皮下(SC)注射剂Q4W(即每个周期的第1天)施用。患者在最多2个注射部位接受体积不超过1mL的药物SC。如果适用，在第一施用完成后10分钟内完成第二施用。
在1/1b期，患者在DF hIL12-Fc si的第一施用后住院过夜。
DF hIL12-Fc si DL(μg/kg)如下表77所示。
表77：DF hIL12-Fc si DL(μg/kg)
Figure BDA0003996373120002511
DF hIL12-Fc si的剂量是根据患者在基线时的体重计算的。仅当自上次计算剂量后患者的体重变化10％或更多时，才会重新计算患者的计算剂量。
根据包装插页，在1b期和队列2C中，纳武单抗的施用剂量为480mg，每4周(Q4W)通过静脉内(IV)输注施用一次。纳武单抗的施用先于DF hIL12-Fc si的施用。在完成纳武单抗施用后1小时内施用DF hIL12-Fc si。
作为单一疗法的功效扩展(队列2A和2B)
此阶段的主要终点是ORR。对于这些队列中的每一个，零假设是客观缓解率(ORR)不超过5％(H0:ORR<5％)，可替代的假设是ORR大于5％(H1:ORR≥5％)。
DF hIL12-Fc si作为单一疗法的目标ORR为20％。预计这些队列中的每个将纳入40名患者(即总共约80名患者)。
采用组顺序设计，每个适应症队列中有40名患者，假设DF hIL12-Fc si的目标ORR为20％，则功效队列提供约90％的研究把握度，以0.025的1侧总体I型错误率检测15％差异。
对于队列2A和2B中的每一个，计划以50％的信息分数(即约20名患者的)进行具有Lan-DeMets O’Brien Fleming边界的无效期中分析。
与纳武单抗组合的功效扩展(队列2C)
与纳武单抗组合的功效扩展的2期部分确定了在接受一个基于铂的化学疗法线后进展的UBC病患者中组合使用DF hIL12-Fc si的临床活性。
该研究纳入了40名患者，因此在40名患者中观察到14名缓解(CR或PR)将导致95％CI(0.206；0.517)不包括Checkmate 275中纳入的相似人群中报告的纳武单抗缓解百分比值。在该研究中，ORR为19.6％(Sharma P,Retz M,Siefker-Radtke A,Baron A,Necchi A,Bedke J,等人Nivolumab in metastatic urotheilal carcinoma after platin therapy[纳武单抗在铂治疗后转移性尿尾癌中的应用](CheckMate 275):Checkmate 275是一项多中心、单组2期试验。Lancet Oncol.[柳叶刀肿瘤学]2017年1月25日；S1470-2045(17):30065-7)。
探索性生物标志物
外周生物标志物
在所有患者的外周中评估外周生物标志物，包括：细胞参数：通过流式细胞术进行免疫表型分型(IPT)的外周血单核细胞(PBMC)；可溶性因子：血清样品中的细胞因子和趋化因子；离体IL12反应测定：PBMC，其用于离体刺激，然后分析IFNγ产生；循环肿瘤(ct)脱氧核糖核酸(DNA)。-使用Nanostring进行的基因表达谱：从筛选期间和在C1D15收集的外周血中分离的总RNA；在施用DF hIL12-Fc si C1至C3之前2小时以及在以下每次研究就诊时，对衍生自全血样品的PBMC进行IPT评估：C1D3、C1D8、C2D8和C3D3；在每个治疗周期的D1和在C1D2、C1D3、C1D5、C1D8、C1D15、C2D3、C3D3和C4D3以及在EOT和SFU就诊时在DF hIL12-Fc si施用前2小时内采集的血清样品中确定可溶性因子。
为了完成对肿瘤材料的所有评估，从患者采集血液(例如，全血、血浆和血清样品)。
衍生自肿瘤组织的生物标志物
在参与剂量递增阶段(任选活检)、1/1b期扩展队列部分(强制活检)和2期功效扩展队列阶段(强制活检)的患者的治疗前和治疗中活检中评估组织衍生的生物标志物。
在基线时从存档的肿瘤组织(或新鲜的肿瘤活检，如果有)、全血和血清样品中分析一组推定的标志物，包括分子标志物、可溶性标志物和细胞标志物，以研究临床功效和分析的标志物之间可能的相关性。
对于纳入剂量递增阶段的患者，使用市售试剂盒(Dako PD-L1IHC 22C3 pharmDx)确定PD-L1表达水平，通过免疫组织化学(IHC)确定CD3阳性分析(T细胞浸润)。
对于纳入1/1b期扩展队列和功效扩展队列的患者，在筛选时(即，在第一研究药物剂量前30天内)和在治疗期间的预先指定的时间点进行新的强制性肿瘤活检。
评估的其他生物标志物包括：肿瘤浸润白细胞(例如，根据IHC或IF，CD8、CD4 T细胞、Treg、NK细胞、巨噬细胞[M1/2谱])的频率和定位、基因表达谱和药物基因组学(PGx)。
可以对从全血和/或归档肿瘤中提取的DNA进行种系DNA研究。这种提取的DNA用于全外显子组测序和/或基因分型。为此，在基线(即，在首次施用研究治疗之前)针对所有适应症收集另外的6mL全血；不需要另外的肿瘤样品，因为归档的肿瘤样品的一部分用于提取DNA以研究肿瘤遗传学(如果需要)。
通过引用并入
出于所有目的，将在此所提到的这些专利文件和科学论文的每一个的全部披露内容通过引用结合在此。
等效内容
在不脱离本披露的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。因此，前述实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明内容。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述说明书来指示，并且在权利要求的等效含义和范围内的所有变化旨在包含在其中。

Claims (303)

1.一种药物配制品，其包含：
(a)异二聚体Fc融合蛋白，该异二聚体Fc融合蛋白包含：
(i)第一多肽，该第一多肽包含第一抗体Fc结构域多肽和多亚基细胞因子的第一亚基；以及
(ii)第二多肽，该第二多肽包含第二抗体Fc结构域多肽和该多亚基细胞因子的第二不同亚基，
(b)柠檬酸盐；
(c)糖；
(d)糖醇；以及
(e)非离子表面活性剂，
pH为6.0至7.0，
其中该第一和第二抗体Fc结构域多肽各自包含不同的促进异二聚化的突变，并且
其中该多亚基细胞因子的该第一亚基和第二不同亚基相互结合。
2.如权利要求1所述的药物配制品，其中该第一和/或第二抗体Fc结构域多肽包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变。
3.如权利要求1或2所述的药物配制品，其中该药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约10mM至约30mM。
4.如权利要求3所述的药物配制品，其中该药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约20mM。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中该糖的浓度为约3％至约12％(w/v)。
6.如权利要求5所述的药物配制品，其中该药物配制品中该糖的浓度为约6％(w/v)。
7.如权利要求5或6所述的药物配制品，其中该糖是二糖。
8.如权利要求7所述的药物配制品，其中该二糖是蔗糖。
9.如权利要求1-8中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中该糖醇的浓度在约0.5％至约6％(w/v)之间。
10.如权利要求9所述的药物配制品，其中该药物配制品中该糖醇的浓度为约1％(w/v)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的药物配制品，其中该糖醇衍生自单糖。
12.如权利要求11所述的药物配制品，其中该糖醇是甘露醇。
13.如权利要求1-12中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中该非离子表面活性剂的浓度在约0.005％至约0.02％(w/v)之间。
14.如权利要求13所述的药物配制品，其中该药物配制品中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)。
15.如权利要求13或14所述的药物配制品，其中该非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。
16.如权利要求15所述的药物配制品，其中该聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。
17.如权利要求1-16中任一项所述的药物配制品，其中该pH在约6.1和约6.9之间。
18.如权利要求17所述的药物配制品，其中该pH在约6.2和约6.8之间。
19.如权利要求18所述的药物配制品，其中该pH在约6.3和约6.7之间。
20.如权利要求19所述的药物配制品，其中该pH在约6.4和约6.6之间。
21.如权利要求20所述的药物配制品，其中该pH为约6.5。
22.如权利要求1-21中任一项所述的药物配制品，其进一步包含水。
23.如权利要求22所述的药物配制品，其中该水是注射用水，USP。
24.如权利要求1-23中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品包含体积浓度为约1g/L至约10g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
25.如权利要求24所述的药物配制品，其中该药物配制品包含体积浓度为约2g/L至约8g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
26.如权利要求25所述的药物配制品，其中该药物配制品包含体积浓度为约4g/L至约6g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
27.如权利要求26所述的药物配制品，其中该药物配制品包含体积浓度为约5g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
28.如权利要求1-27中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品包含用于施用的浓度为约0.5g/L至约1.5g/L的该蛋白。
29.如权利要求28所述的药物配制品，其中该药物配制品包含用于施用的浓度为约0.75g/L至约1.25g/L的该蛋白。
30.如权利要求29所述的药物配制品，其中该药物配制品包含用于施用的浓度为约1g/L的该蛋白。
31.如1-30中任一项所述的药物配制品，其中该配制品被设计为在约2℃和约8℃之间的温度储存。
32.如权利要求1-31中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品是透明无色溶液并且不含可见颗粒。
33.如权利要求1-32中任一项所述的药物配制品，其中该配制品具有如下定义的热稳定性谱：
(a)大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、或大于约66℃的Tm1；和/或
(b)大于约70℃、大于约71℃、大于约72℃、大于约73℃、大于约74℃、大于约75℃、大于约76℃、或大于约77℃的Tm2，
如通过差示扫描荧光法测量。
34.如权利要求33所述的药物配制品，其中该配制品具有由约67.0℃的Tm1和约77.3℃的Tm2定义的热稳定性谱。
35.如权利要求34所述的药物配制品，其中由Tm1和/或Tm2定义的该药物配制品的热稳定性谱当该药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
36.如1-35中任一项所述的药物配制品，其中该配制品具有由大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、大于约66℃、或大于约67℃的Tagg定义的热稳定性谱，如通过差示扫描荧光法测量。
37.如权利要求36所述的药物配制品，其中由Tagg定义的该药物配制品的热稳定性谱当该药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
38.如权利要求1-37中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品在5℃孵育1周后，该药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
39.如权利要求1-38中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品在50℃孵育1周后，该药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
40.如权利要求1-39中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有小于约15nm、小于约14nm、小于约13nm或小于约12nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。
41.如权利要求40所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有约11.6nm的Z-平均流体动力学直径。
42.如权利要求1-41中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白在该药物配制品在50℃孵育2周后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm、小于约16nm或小于约15nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。
43.如权利要求42所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有约14.4nm的Z-平均流体动力学直径。
44.如权利要求1-43中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白在该药物配制品经受五个冻融循环后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm或小于约16nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。
45.如权利要求44所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有约15.3nm的Z-平均流体动力学直径。
46.如权利要求1-45中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28或小于约0.27，如在25℃通过动态光散射测量。
47.如权利要求1-46中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.26。
48.如权利要求1-47中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在该药物配制品在50℃孵育2周后小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28、小于约0.27或小于约0.26，如在25℃通过动态光散射测量。
49.如权利要求1-48中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.25。
50.如权利要求1-49中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在该药物配制品经受五个冻融循环后小于约0.40、小于约0.35、或小于约0.34，如在25℃通过动态光散射测量。
51.如权利要求1-50中任一项所述的药物配制品，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.33。
52.如权利要求1-51中任一项所述的药物配制品，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％。
53.如权利要求52所述的药物配制品，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱为约99.0％。
54.如权利要求1-53中任一项所述的药物配制品，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱在该药物配制品在50℃孵育2周后大于约75％、大于约80％、大于约81％、大于约82％、大于约83％、大于约84％或大于约85％。
55.如权利要求54所述的药物配制品，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱为约85.2％。
56.如权利要求1-55中任一项所述的药物配制品，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱在该药物配制品经受五个冻融循环后大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％或大于约98％。
57.如权利要求56所述的药物配制品，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱为约98.9％。
58.一种方法，其包括将如权利要求1-57中任一项所述的药物配制品作为单剂量疗法施用给有需要的受试者。
59.一种方法，其包括将如权利要求1-57中任一项所述的药物配制品以多剂量疗法以这些剂量之间至少三周或这些剂量之间至少四周的间隔施用给有需要的受试者。
60.如权利要求59所述的方法，其中该药物配制品每三周一次施用给该受试者。
61.如权利要求59所述的方法，其中该药物配制品每四周一次施用给该受试者。
62.如权利要求59所述的方法，其中该药物配制品每六周一次施用给该受试者。
63.如权利要求59-62中任一项所述的方法，其进一步包括如果该受试者发展为疾病进展、不可接受的毒性或满足退出标准，则停止该多剂量疗法。
64.如权利要求59-63中任一项所述的方法，其中如果该受试者在该多剂量疗法期间经历完全缓解(CR)，则在确认该完全缓解后进一步施用该多剂量疗法至少12个月。
65.如权利要求64所述的方法，其中该多剂量疗法的总持续时间等于或小于24个月。
66.如权利要求64所述的方法，其中总治疗持续时间大于24个月。
67.如权利要求58-66中任一项所述的方法，其中通过皮下注射施用该药物配制品。
68.如权利要求58-67中任一项所述的方法，其中将该药物配制品施用给该受试者，其量足以提供基于该受试者的体重在约0.05μg/kg至约1.75μg/kg之间的剂量的该异二聚体Fc融合蛋白。
69.如权利要求58-68中任一项所述的方法，其中将该药物配制品施用给该受试者，其量足以提供基于该受试者的体重约0.05μg/kg、约0.10μg/kg、约0.20μg/kg、约0.40μg/kg、约0.60μg/kg、约0.80μg/kg、约1.00μg/kg、约1.20μg/kg、约1.40μg/kg、或约1.75μg/kg的剂量的该异二聚体Fc融合蛋白。
70.如权利要求58-67中任一项所述的方法，其中将该药物配制品施用给该受试者，其量足以提供基于该受试者的体重大于0.00μg/kg且小于约0.05μg/kg的剂量的该异二聚体Fc融合蛋白。
71.如权利要求58-67中任一项所述的方法，其中将该药物配制品施用给该受试者，其量足以提供基于该受试者的体重大于约1.75μg/kg的剂量的该异二聚体Fc融合蛋白。
72.如权利要求58-71中任一项所述的方法，其中该受试者患有癌症。
73.如权利要求72所述的方法，其中该受试者患有局部晚期或转移性实体瘤。
74.如权利要求72或73所述的方法，其中使用实体瘤缓解评估标准(RECIST)1.1版确认该受试者中该癌症的存在。
75.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定性癌症、结直肠癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌(RCC)、子宫内膜癌、皮肤T细胞淋巴瘤、和三阴性乳腺癌。
76.如权利要求72-75中任一项所述的方法，其中该受试者是抗PD-1难治性的。
77.如权利要求75所述的方法，其中该受试者患有黑色素瘤。
78.如权利要求77所述的方法，其中该受试者先前已经用抗PD-1抗体治疗至少6周。
79.如权利要求78所述的方法，其中该受试者在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受抗PD-1抗体的同时被确认具有疾病进展。
80.如权利要求79所述的方法，其中通过放射学或临床观察来确认疾病进展。
81.如权利要求77所述的方法，其中，如果该受试者具有包含BRAF激活性突变的肿瘤，则该受试者先前已用BRAF抑制剂治疗。
82.如权利要求75所述的方法，其中该受试者患有RCC。
83.如权利要求82所述的方法，其中该RCC具有透明细胞组织学。
84.如权利要求82所述的方法，其中该患者先前已用抗PD-1/PD-L1抗体和/或抗血管内皮生长因子疗法治疗。
85.如权利要求82所述的方法，其中该受试者先前已接受三个或更少的疗法线。
86.如权利要求75所述的方法，其中该受试者患有尿路上皮癌。
87.如权利要求86所述的方法，其中该受试者患有局部晚期或转移性尿路上皮移行细胞癌。
88.如权利要求86所述的方法，其中该受试者先前已用包含含铂方案的单一治疗进行治疗，并且在最后一次施用该含铂方案后6个月内显示放射学进展复发。
89.如权利要求86所述的方法，其中该受试者先前已接受两个或更少的疗法线。
90.如权利要求86所述的方法，其中该受试者先前没有接受过作为单一疗法或与基于铂的化学疗法的组合的检查点抑制剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)疗法。
91.如权利要求58-90中任一项所述的方法，其中将该药物配制品作为单一疗法施用给该受试者。
92.如权利要求58-90中任一项所述的方法，其中将该药物配制品作为组合疗法施用给该受试者。
93.如权利要求92所述的方法，其进一步包括向该受试者施用抗PD-1抗体。
94.如权利要求93所述的方法，其中该抗PD-1抗体是派姆单抗。
95.如权利要求94所述的方法，其中静脉内施用派姆单抗。
96.如权利要求94或95所述的方法，其中以200mg的剂量施用派姆单抗。
97.如权利要求94-96中任一项所述的方法，其中派姆单抗的施用在该药物配制品的每次施用之前。
98.如权利要求97所述的方法，其中在完成派姆单抗施用后1小时内施用该药物配制品。
99.如权利要求92所述的方法，其中该抗PD-1抗体是纳武单抗。
100.如权利要求99所述的方法，其中静脉内施用纳武单抗。
101.如权利要求99或100所述的方法，其中以480mg的剂量施用纳武单抗。
102.如权利要求99-101中任一项所述的方法，其中纳武单抗的施用在该药物配制品的每次施用之前。
103.如权利要求102所述的方法，其中在完成纳武单抗施用后1小时内施用该药物配制品。
104.如权利要求99-103中任一项所述的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、NSCLC、SCLC、RCC、经典型霍奇金淋巴瘤、HNSCC、尿路上皮癌、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌和食管癌。
105.如权利要求104所述的方法，其中该癌症是黑色素瘤。
106.如权利要求105所述的方法，其中该黑色素瘤是不可切除的。
107.如权利要求104所述的方法，其中该癌症是结直肠癌。
108.如权利要求107所述的方法，其中该结直肠癌是微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷转移性(dMMR)结直肠癌。
109.如权利要求92-98中任一项所述的方法，其进一步包括进行手术干预以在该受试者中裂解癌细胞、去除肿瘤或减积肿瘤。
110.如权利要求109所述的方法，其中该手术干预包括冷冻疗法。
111.如权利要求109所述的方法，其中该手术干预包括超热疗法。
112.如权利要求109所述的方法，其中该手术干预包括向该受试者施用放射疗法。
113.如权利要求112所述的方法，其中该放射疗法是立体定向体部放射疗法(SBRT)。
114.如权利要求92-113中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用NK细胞靶向疗法。
115.如权利要求114所述的方法，其中向该受试者施用多特异性结合蛋白。
116.如权利要求92-115中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用嵌合抗原受体疗法。
117.如权利要求92-116中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用细胞因子疗法。
118.如权利要求92-117中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用先天免疫系统激动剂疗法。
119.如权利要求92-118中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用化学疗法。
120.如权利要求92-119中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用靶向抗原疗法。
121.如权利要求92-120中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用溶瘤病毒疗法。
122.一种在接受药物配制品的受试者中检测毒性的方法，该方法包括测量该受试者的血液中C反应蛋白(CRP)的浓度，其中该药物配制品包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂，并且其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
123.如权利要求122所述的方法，其中
(1)如果该受试者的血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则该受试者被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中；并且
(2)如果该受试者的血液中的CRP浓度大约等于或低于阈值C反应蛋白浓度，则该受试者不被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中。
124.如权利要求122所述的方法，其中如果该受试者的血液中的CRP浓度高于该阈值CRP浓度，则(1)暂停该药物配制品的施用；(2)以较低剂量施用该异二聚体Fc融合蛋白；或(3)采取补救措施以减少或减轻该配制品在该受试者中的毒性作用。
125.如权利要求1-57中任一项所述的药物配制品或如权利要求58-124中任一项所述的方法，其中该第一和第二抗体Fc结构域多肽是人IgG1 Fc结构域多肽。
126.如权利要求125所述的药物配制品或方法，其中该多亚基细胞因子是人IL12。
127.如权利要求126所述的药物配制品或方法，其中该人IgG1 Fc结构域多肽包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变。
128.如权利要求127所述的药物配制品或方法，其中该第一和第二抗体Fc结构域多肽包含选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A或L235E、G237A、P329A、A330S、和P331S的突变。
129.如权利要求128所述的药物配制品或方法，其中该第一和第二抗体Fc结构域多肽各自包含突变L234A、L235A和P329A。
130.如权利要求129所述的药物配制品或方法，其中多亚基细胞因子的该第一亚基是IL12的p40亚基并且多亚基细胞因子的该第二亚基是IL12的p35亚基。
131.如权利要求130所述的药物配制品或方法，其中多亚基细胞因子的该第一亚基包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列并且多亚基细胞因子的该第二亚基包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。
132.如权利要求131所述的药物配制品或方法，其中多亚基细胞因子的该第二亚基通过包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的接头与该第二抗体Fc结构域融合。
133.如权利要求132所述的药物配制品或方法，其中
(a)该第一抗体Fc结构域包含突变L234A、L235A、P329A、Y349C、K360E和K409W，并且
(b)该第二抗体Fc结构域包含突变L234A、L235A、P329A、Q347R、S354C、D399V和F405T。
134.如权利要求133所述的药物配制品或方法，其中
(a)该第一抗体Fc结构域包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列，并且
(b)该第二抗体Fc结构域包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。
135.如权利要求134所述的药物配制品或方法，其中该第一抗体Fc结构域肽包含SEQID NO:290的氨基酸序列并且该第二抗体Fc结构域肽包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列。
136.一种试剂盒，其包含一个或多个包含药物配制品的容器，其中该药物配制品包含：
(a)异二聚体Fc融合蛋白，该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变；以及
(b)药学上可接受的载剂，
并且其中该一个或多个容器共同包含约0.1mg-约2mg的异二聚体Fc融合蛋白。
137.如权利要求136所述的试剂盒，其中该一个或多个容器共同包含约0.5mg至约2mg的异二聚体Fc融合蛋白。
138.如权利要求137所述的试剂盒，其中该一个或多个容器共同包含约1mg的异二聚体Fc融合蛋白。
139.如权利要求138所述的试剂盒，其中该试剂盒包含一个容器，该容器包含约1mg的异二聚体Fc融合蛋白。
140.如权利要求136-139中任一项所述的试剂盒，其中该药物配制品是冻干配制品或液体配制品。
141.如权利要求140所述的试剂盒，其中该药物配制品是以1mL的体积供应的液体配制品。
142.异二聚体Fc融合蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该药物被制造成包含含在一个或多个容器中的约0.5g/L至约1.5g/L的该异二聚体Fc融合蛋白的液体药物配制品，
其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
143.如权利要求142所述的异二聚体Fc融合蛋白的用途，其中该液体药物配制品包含约1.0g/L的该异二聚体Fc融合蛋白。
144.异二聚体Fc融合蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该药物被制造成包含含在一个或多个容器中的约0.1mg-约2mg的异二聚体Fc融合蛋白的液体药物配制品，
其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
145.如权利要求144所述的异二聚体Fc融合蛋白的用途，其中该液体药物配制品包含约1mg的异二聚体Fc融合蛋白。
146.如权利要求142-145中任一项所述的异二聚体Fc融合蛋白的用途，其中该药物包含在一个容器中。
147.如权利要求142-146中任一项所述的异二聚体Fc融合蛋白的用途，其中每个容器含有1mg的异二聚体Fc融合蛋白。
148.如权利要求146-147中任一项所述的用途，其中在每3周第1天将该药物施用给该受试者。
149.如权利要求146-147中任一项所述的用途，其中在每4周第1天将该药物施用给该受试者。
150.如权利要求146-148中任一项所述的用途，其中皮下施用该药物。
151.如权利要求146-150中任一项所述的用途，其中以约0.1mL至约1mL的体积施用该药物。
152.如权利要求151所述的用途，其中以约1mL的体积施用该药物。
153.如权利要求146-152中任一项所述的用途，其中将该药物施用至最多两个注射部位。
154.如权利要求153所述的用途，其中在第一注射后10分钟内完成第二注射。
155.如权利要求146-154中任一项所述的用途，其中以约0.05mg/kg至约1.75mg/kg的剂量施用该药物。
156.如权利要求155所述的用途，其中以约1mg/kg的剂量施用该药物。
157.如权利要求146-156中任一项所述的用途，其中在施用之前将该药物稀释在0.9％盐水(注射用氯化钠)和0.01％聚山梨醇酯80的溶液中。
158.一种制造异二聚体Fc融合蛋白以制备其药物配制品的方法，该方法包括向含有该异二聚体Fc融合蛋白的溶液中添加乙酸保持30分钟至90分钟，该异二聚体Fc融合蛋白得自表达该异二聚体Fc融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物，其中乙酸盐将该溶液的pH调节并维持在pH 3.55至3.75，并且
其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
159.如权利要求158所述的方法，其中将该乙酸添加到包含该异二聚体Fc融合蛋白的溶液中保持约60分钟。
160.如权利要求158或159所述的方法，其中该乙酸将该溶液的pH调节并维持在约3.65。
161.如权利要求158所述的方法，其中表达该异二聚体Fc融合蛋白的该CHO细胞培养物维持在悬浮液中。
162.如权利要求161所述的方法，其中表达该异二聚体Fc融合蛋白的该CHO细胞培养物在生物反应器中培养7-21天。
163.如权利要求161或162所述的方法，其中表达该异二聚体Fc融合蛋白的该CHO细胞培养物在生物反应器中培养14天。
164.如权利要求158-163中任一项所述的方法，其中通过深度过滤收获表达该异二聚体Fc融合蛋白的该CHO细胞培养物以产生CHO收获培养基。
165.如权利要求164所述的方法，其中该深度过滤是由DOHC和XOHC过滤器组成的两级一次性深度过滤。
166.如权利要求164或165所述的方法，其中使用蛋白A捕获色谱、混合模式色谱和阳离子交换色谱从该CHO收获培养基中纯化该异二聚体Fc融合蛋白以产生包含该异二聚体Fc融合蛋白的溶液。
167.如权利要求166所述的方法，其中蛋白A捕获色谱包括：
用20mM Tris、150mM NaCl在pH 7.5平衡蛋白A树脂；
将CHO收获培养基加载到该蛋白A树脂上；
用20mM Tris、150mM NaCl在pH 7.5洗涤该加载的蛋白A树脂；
用pH 5.4的50mM乙酸盐洗涤该加载的蛋白A树脂；以及
用50mM乙酸盐、100mM精氨酸在pH 3.7从该蛋白A树脂中洗脱该异二聚体Fc融合蛋白，并通过280nm UV从1.25AU/cm上升开始并在1.25AU/cm下降结束进行收集。
168.如权利要求167所述的方法，其中将该乙酸以0.5M的浓度添加到包含从该蛋白A树脂洗脱的该异二聚体Fc融合蛋白的溶液中，其中该乙酸将该溶液的pH酸化至pH 3.65保持60分钟，然后通过添加2M Tris将该溶液中和至pH 5.2。
169.如权利要求168所述的方法，其中在酸化和中和该溶液之后，使包含该异二聚体Fc融合蛋白的该溶液通过0.2μm过滤器。
170.如权利要求169所述的方法，其中使包含从该蛋白A树脂洗脱的该异二聚体Fc融合蛋白的过滤溶液通过X0SP深度过滤。
171.如权利要求170所述的方法，其中混合模式色谱包括：
用pH 5.2的50mM乙酸盐平衡混合模式色谱柱；
将通过X0SP过滤的该溶液加载到该混合模式色谱柱上；
用pH 5.2的50mM乙酸盐洗涤该加载的混合模式色谱柱；以及
用50mM乙酸盐、250mM NaCl在pH 5.2从该混合模式色谱柱中洗脱该异二聚体Fc融合蛋白，并通过280nm UV从0.625AU/cm上升开始并在1.50AU/cm下降结束进行收集。
172.如权利要求171所述的方法，其中使包含从该混合模式色谱柱洗脱的该异二聚体Fc融合蛋白的溶液通过0.2μm过滤器。
173.如权利要求172所述的方法，其中阳离子交换色谱包括：
用pH 7.4的50mM Tris平衡阳离子交换色谱树脂；
将从该混合模式色谱柱洗脱的过滤溶液加载到该阳离子交换色谱树脂上；
用pH 7.4的50mM Tris洗涤该加载的阳离子交换色谱树脂；以及
用50mM Tris在pH 7.4和50mM Tris、0.5M NaCl在pH 7.4的梯度从该阳离子交换色谱树脂中洗脱该异二聚体Fc融合蛋白，并通过280nm UV从2.5AU/cm上升开始并在4.5AU/cm下降结束进行收集。
174.如权利要求173所述的方法，其中使包含从该阳离子交换色谱树脂洗脱的该异二聚体Fc融合蛋白的溶液通过0.2μm过滤器。
175.如权利要求174所述的方法，其中使包含从该阳离子交换色谱树脂洗脱的该异二聚体Fc融合蛋白的过滤溶液通过预过滤器、20nm标称过滤器和0.2μm膜进行纳米过滤。
176.如权利要求175所述的方法，其中对包含该异二聚体Fc融合蛋白的纳米过滤溶液进行超滤和渗滤，其中超滤和渗滤包括：
用50mM Tris、265mM NaCl在pH 7.4平衡超滤系统；
将包含该异二聚体Fc融合蛋白的纳米过滤溶液浓缩至约5.0g/L的浓度；
使用pH 6.5的20mM柠檬酸盐的7个渗滤体积交换缓冲液；
将包含该异二聚体Fc融合蛋白的渗滤溶液浓缩至约11.0g/L的浓度；
用pH 6.5的20mM柠檬酸盐将包含该异二聚体Fc融合蛋白的浓缩溶液稀释至约5g/L至约10g/L的浓度；以及
添加20mM柠檬酸盐、18％(w/v)蔗糖、3％(w/v)甘露醇、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80在pH6.5以实现超滤/渗滤截留物溶液的最终浓度，该溶液包含20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80的该异二聚体Fc融合蛋白。
177.如权利要求176所述的方法，其中使包含该异二聚体Fc融合蛋白的超滤/渗滤溶液通过0.2μm膜以产生批量原料药。
178.如权利要求177所述的方法，其中将该批量原料药在包含20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80的pH 6.5的0.2μm过滤缓冲液中稀释至80％药物产品溶液。
179.如权利要求177或178所述的方法，其中将该批量原料药或80％药物产品在包含20mM柠檬酸盐、6％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甘露醇和0.01％(w/v)聚山梨醇酯-80的pH 6.5的0.2μm过滤缓冲液中稀释至用以施用1mg/mL的该异二聚体Fc融合蛋白的浓度。
180.一种在已接受检查点抑制剂抗体治疗至少6周的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
181.如权利要求180所述的方法，其中该检查点抑制剂抗体是抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体。
182.如权利要求180或181所述的方法，其中该癌症是黑色素瘤。
183.如权利要求182所述的方法，其中该黑色素瘤是不可切除的或转移性的。
184.如权利要求182或183所述的方法，其中该受试者在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受该抗PD-1抗体的同时被确认具有疾病进展。
185.如权利要求182-184中任一项所述的方法，其中该受试者在疾病进展的最初诊断后至少4周在接受该抗PD-1抗体的同时被确认具有疾病进展。
186.如权利要求184或185中任一项所述的方法，其中通过放射学或临床观察来确认疾病进展。
187.一种在已接受检查点抑制剂抗体或抗血管内皮生长因子疗法作为单一疗法或组合疗法治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
188.如权利要求187所述的方法，其中该检查点抑制剂抗体是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
189.如权利要求187或188所述的方法，其中该癌症是晚期肾细胞癌(RCC)。
190.如权利要求189所述的方法，其中该RCC是不可切除的或转移性的。
191.如权利要求189或190所述的方法，其中该RCC具有透明细胞组分。
192.如权利要求189-191中任一项所述的方法，其中该受试者接受不超过3个先前的疗法线。
193.如权利要求189-192中任一项所述的方法，其中该受试者尚未接受过检查点抑制剂的治疗。
194.如权利要求193所述的方法，其中该检查点抑制剂包含作为单一疗法或与基于铂的化学疗法组合的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
195.一种在已接受仅一种含铂方案治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
196.如权利要求195所述的方法，其中该含铂方案是铂与选自吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱和多柔比星的药剂组合。
197.如权利要求195或196所述的方法，其中该癌症是局部晚期或转移性移行细胞尿路上皮癌。
198.如权利要求197所述的方法，其中该尿路上皮癌包括由肾盂、输尿管、尿路上皮和尿道组成的组中的一种或多种。
199.如权利要求197或198所述的方法，其中该尿路上皮癌是不能手术的。
200.如权利要求197-199中任一项所述的方法，其中该尿路上皮癌的特征是在最后一次施用作为辅佐的含铂方案后6个月内放射学进展或复发。
201.如权利要求197-200中任一项所述的方法，其中该尿路上皮癌被认为是一线含铂方案的失败。
202.如权利要求197-201中任一项所述的方法，其中该受试者在施用该药物配制品之前已接受不超过2个疗法线(包括该含铂方案)用于治疗该尿路上皮癌。
203.如权利要求197-202中任一项所述的方法，其中该受试者尚未接受过用检查点抑制剂(CPI)作为一线疗法的治疗。
204.如权利要求203所述的方法，其中该检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
205.如权利要求203或204所述的方法，其中该检查点抑制剂是单一疗法或与基于铂的化学疗法组合。
206.如权利要求195-205中任一项所述的方法，其中该药物配制品与派姆单抗组合施用。
207.如权利要求206所述的方法，其中每3周施用一次派姆单抗。
208.如权利要求206或207所述的方法，其中在该药物配制品施用之前施用派姆单抗。
209.如权利要求208所述的方法，其中在完成派姆单抗施用后一小时内施用该药物配制品。
210.如权利要求206-209中任一项所述的方法，其中以200mg的剂量施用派姆单抗。
211.如权利要求206-210中任一项所述的方法，其中静脉内施用派姆单抗。
212.如权利要求206-211中任一项所述的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高度不稳定癌症、胃癌、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、梅克尔细胞癌、肾细胞癌、和子宫内膜癌。
213.如权利要求195-205中任一项所述的方法，其中该药物配制品与纳武单抗组合施用。
214.如权利要求213所述的方法，其中在该药物配制品施用之前施用纳武单抗。
215.如权利要求214所述的方法，其中在完成纳武单抗施用后一小时内施用该药物配制品。
216.如权利要求213-215中任一项所述的方法，其中以约480mg的剂量施用纳武单抗。
217.如权利要求213-216中任一项所述的方法，其中静脉内施用纳武单抗。
218.如权利要求213-217中任一项所述的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、和食管癌。
219.如权利要求218所述的方法，其中该癌症是黑色素瘤。
220.如权利要求219所述的方法，其中该黑色素瘤是不可切除的或转移性的。
221.如权利要求218所述的方法，其中该癌症是结直肠癌。
222.如权利要求221所述的方法，其中该结直肠癌是微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。
223.如权利要求180-211中任一项所述的方法，其中在每3周第1天将该药物配制品施用给该受试者。
224.如权利要求180-222中任一项所述的方法，其中在每4周第1天将该药物配制品施用给该受试者。
225.如权利要求180-223中任一项所述的方法，其中皮下施用该药物配制品。
226.如权利要求180-225中任一项所述的方法，其中以约0.1mL至约1mL的体积施用该药物配制品。
227.如权利要求226所述的方法，其中以约1mL的体积施用该药物配制品。
228.如权利要求180-227中任一项所述的方法，其中将该药物配制品施用至最多两个注射部位。
229.如权利要求228所述的方法，其中在第一注射后10分钟内完成第二注射。
230.如权利要求180-229中任一项所述的方法，其中以约0.05mg/kg至约1.75mg/kg的剂量施用该药物配制品。
231.如权利要求230所述的方法，其中以约1mg/kg的剂量施用该药物配制品。
232.如权利要求180-231中任一项所述的方法，其中在施用之前将该药物配制品稀释在0.9％盐水(注射用氯化钠)和0.01％聚山梨醇酯80的溶液中。
233.如权利要求180-232中任一项所述的方法，其中使用实体瘤缓解评估标准(RECIST)1.1版确认该癌症的存在。
234.如权利要求180-233中任一项所述的方法，其中除非满足中止标准，否则在确认后用该药物配制品治疗具有确认的完全缓解的受试者至少12个月。
235.一种治疗其血液C反应蛋白(CRP)浓度被监测的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变。
236.如权利要求235所述的方法，其中
(1)如果该受试者的血液中的CRP浓度高于阈值CRP浓度，则该受试者被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中；并且
(2)如果该受试者的血液中的CRP浓度大约等于或低于阈值C反应蛋白浓度，则该受试者不被鉴定为处于发生药物不良反应的风险中。
237.如权利要求235所述的方法，其中如果该受试者的血液中的CRP浓度高于该阈值CRP浓度，则(1)暂停该药物配制品的施用；(2)以较低剂量施用该异二聚体Fc融合蛋白；或(3)采取补救措施以减少或减轻该配制品在该受试者中的毒性作用。
238.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者皮下施用包含异二聚体Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物配制品，
其中该异二聚体Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc(可结晶片段)对的第一Fc区和第二Fc区以及IL-12的p40和p35亚基，其中IL-12的该p40和p35亚基分别单独地与该第一Fc区和该第二Fc区，或该第二Fc区和该第一Fc区连接，其中该p40和p35亚基各自连接到这些Fc区的N末端或C末端，并且其中该第一Fc区和该第二Fc区的CH3结构域各自包含一个或多个促进异二聚化的突变；并且该药物配制品包含柠檬酸盐；糖；糖醇；和非离子表面活性剂，并且该配制品的pH值在5.5和7.0之间。
239.如权利要求136-141中任一项所述的试剂盒、如权利要求142-157中任一项所述的用途、或如权利要求158-238中任一项所述的方法，其中该第一Fc区和第二Fc区是人IgG1Fc区。
240.如权利要求239所述的试剂盒、用途或方法，其中人IgG1 Fc区包含一个或多个降低Fc效应子功能的突变。
241.如权利要求240所述的试剂盒、用途或方法，其中该第一Fc区和第二Fc区包含一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A或L235E、G237A、P329A、A330S和P331S的突变。
242.如权利要求241所述的试剂盒、用途或方法，其中该第一Fc区和第二Fc区各自包含突变L234A、L235A和P329A。
243.如权利要求242所述的试剂盒、用途或方法，其中IL12的该p40亚基包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列并且IL-12的该p35亚基包含SEQ IDNO:128的氨基酸序列。
244.如权利要求243所述的试剂盒、用途或方法，其中IL-12的该p35亚基通过包含SEQID NO:108的氨基酸序列的接头融合至该第二Fc区。
245.如权利要求244所述的试剂盒、用途或方法，其中
(a)该第一Fc区包含突变L234A、L235A、P329A、Y349C、K360E和K409W，并且
(b)该第二Fc区包含突变L234A、L235A、P329A、Q347R、S354C、D399V和F405T。
246.如权利要求245所述的试剂盒、用途或方法，其中
(a)该第一Fc区包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列，并且
(b)该第二Fc区包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。
247.如权利要求246所述的试剂盒、用途或方法，其中与IL12的该p40亚基连接的该第一Fc区包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列，并且与IL-12的该p35亚基连接的该第二Fc区包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列。
248.如权利要求239-247中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含：(a)柠檬酸盐；(b)糖；(c)糖醇；和(d)非离子表面活性剂，进一步其中该配制品的pH在约6.0和约7.0之间。
249.如权利要求248所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约10mM至约30mM。
250.如权利要求249所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中柠檬酸盐的浓度为约20mM。
251.如权利要求248-250中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中该糖的浓度为约3％至约12％(w/v)。
252.如权利要求251所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中该糖的浓度为约6％(w/v)。
253.如权利要求251或252所述的试剂盒、用途或方法，其中该糖是二糖。
254.如权利要求253所述的试剂盒、用途或方法，其中该二糖是蔗糖。
255.如权利要求248-254中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中该糖醇的浓度在约0.5％至约6％(w/v)之间。
256.如权利要求255所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中该糖醇的浓度为约1％(w/v)。
257.如权利要求248-256中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该糖醇衍生自单糖。
258.如权利要求257所述的试剂盒、用途或方法，其中该糖醇是甘露醇。
259.如权利要求248-258中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中该非离子表面活性剂的浓度在约0.005％至约0.02％(w/v)之间。
260.如权利要求259所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)。
261.如权利要求259或260所述的试剂盒、用途或方法，其中该非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。
262.如权利要求261所述的试剂盒、用途或方法，其中该聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。
263.如权利要求248-262中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该pH在约6.1和约6.9之间。
264.如权利要求263所述的试剂盒、用途或方法，其中该pH在约6.2和约6.8之间。
265.如权利要求264所述的试剂盒、用途或方法，其中该pH在约6.3和约6.7之间。
266.如权利要求265所述的试剂盒、用途或方法，其中该pH在约6.4和约6.6之间。
267.如权利要求266所述的试剂盒、用途或方法，其中该pH为约6.5。
268.如权利要求248-267中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品进一步包含水。
269.如权利要求268所述的试剂盒、用途或方法，其中该水是注射用水，USP。
270.如权利要求248-269中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含体积浓度为约1g/L至约10g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
271.如权利要求270所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含体积浓度为约2g/L至约8g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
272.如权利要求271所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含体积浓度为约4g/L至约6g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
273.如权利要求272所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含体积浓度为约5g/L的异二聚体Fc融合蛋白。
274.如权利要求248-273中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含用于施用的浓度为约0.5g/L至约1.5g/L的该蛋白。
275.如权利要求274所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含用于施用的浓度为约0.75g/L至约1.25g/L的该蛋白。
276.如权利要求275所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品包含用于施用的浓度为约1g/L的该蛋白。
277.如248-276中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该配制品被设计为在2℃和8℃之间的温度储存。
278.如权利要求248-277中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品是透明无色溶液并且不含可见颗粒。
279.如权利要求248-278中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品具有如下定义的热稳定性谱：
(a)大于约60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、或大于约66℃的Tm1；和/或
(b)大于约70℃、大于约71℃、大于约72℃、大于约73℃、大于约74℃、大于约75℃、大于约76℃、或大于约77℃的Tm2，
如通过差示扫描荧光法测量。
280.如权利要求279所述的试剂盒、用途或方法，其中该配制品具有由约67.0℃的Tm1和约77.3℃的Tm2定义的热稳定性谱。
281.如权利要求280所述的试剂盒、用途或方法，其中由Tm1和/或Tm2定义的该药物配制品的热稳定性谱当该药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
282.如248-281中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该配制品具有由大于60℃、大于约61℃、大于约62℃、大于约63℃、大于约64℃、大于约65℃、大于约66℃、或大于约67℃的Tagg定义的热稳定性谱，如通过差示扫描荧光法测量。
283.如权利要求282所述的试剂盒、用途或方法，其中由Tagg定义的该药物配制品的热稳定性谱当该药物配制品在50℃孵育1周时与在5℃孵育1周的相同药物配制品相比变化小于约2℃或小于约1℃，如通过差示扫描荧光法测量。
284.如权利要求248-283中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品在5℃孵育1周后，该药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
285.如权利要求248-284中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品在50℃孵育1周后，该药物配制品的pH在pH值方面变化不超过约0.2或约0.1。
286.如权利要求248-285中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有小于约15nm、小于约14nm、小于约13nm或小于约12nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。
287.如权利要求286所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有约11.6nm的Z-平均流体动力学直径。
288.如权利要求248-287中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白在该药物配制品在50℃孵育2周后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm、小于约16nm或小于约15nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。
289.如权利要求288所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有约14.4nm的Z-平均流体动力学直径。
290.如权利要求248-289中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白在该药物配制品经受五个冻融循环后具有小于约20nm、小于约19nm、小于约18nm、小于约17nm或小于约16nm的Z-平均流体动力学直径，如在25℃通过动态光散射测量。
291.如权利要求290所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白具有约15.3nm的Z-平均流体动力学直径。
292.如权利要求248-291中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28或小于约0.27，如在25℃通过动态光散射测量。
293.如权利要求248-292中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.26。
294.如权利要求248-293中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在该药物配制品在50℃孵育2周后小于约0.30、小于约0.29、小于约0.28、小于约0.27或小于约0.26，如在25℃通过动态光散射测量。
295.如权利要求248-294中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.25。
296.如权利要求248-295中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数在该药物配制品经受五个冻融循环后小于约0.40、小于约0.35、或小于约0.34，如在25℃通过动态光散射测量。
297.如权利要求248-296中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中该药物配制品中的该异二聚体Fc融合蛋白的多分散性指数为约0.33。
298.如权利要求248-297中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％。
299.如权利要求298所述的试剂盒、用途或方法，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱为约99.0％。
300.如权利要求248-299中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱在该药物配制品在50℃孵育2周后大于约75％、大于约80％、大于约81％、大于约82％、大于约83％、大于约84％或大于约85％。
301.如权利要求300所述的试剂盒、用途或方法，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱为约85.2％。
302.如权利要求248-301中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱在该药物配制品经受五个冻融循环后大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％或大于约98％。
303.如权利要求302所述的试剂盒、用途或方法，其中如在SEC-HPLC分析中通过主峰面积占总检测面积的百分比测量，该药物配制品的纯度谱为约98.9％。
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