CN118345022A - 一种唾液中外泌体的富集提取方法及在筛查结核性潜伏感染中的应用 - Google Patents
一种唾液中外泌体的富集提取方法及在筛查结核性潜伏感染中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种唾液中外泌体的富集提取方法及在筛查结核性潜伏感染中的应用。本发明使用超速离心和微孔过滤的组合步骤进行富集及纯化，保证外泌体的数量及纯度；并通过微孔过滤和差速离心循环可以大大降低其他微泡的干扰；同时改进了超过滤膜法对外泌体破坏小的外泌体分离方法，避免外泌体膜结构破坏，耗时短，操作简单、特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种唾液中外泌体的富集提取方法及在筛查结核性潜伏感染中的应用。
背景技术
潜伏性结核感染(LTBI)人群是一个庞大的潜在“结核病患者库”。寻找潜伏性结核感染者发病机制，阻止其发展成为活动性结核病是关键所在。目前对LTBI的诊断是间接的,尚缺乏公认的“金标准”。目前最广泛使用的诊断试验是纯化蛋白衍生物(PPD)结核菌素皮肤试验(TST)和干扰素γ释放试验(IGRA)。由于环境中非分枝杆菌和卡介苗疫苗致敏，可能导致TST产生假阳性结果，在免疫抑制人群中的敏感性也会降低。IGRA同时具有测试程序标准化和客观性、不易受主观因素影响、出现错误的概率低、试验结果等待时间短、可以重复进行测试等优点，因此成为目前最主要的LTBI筛查方法。但IGRA平台的运行成本更高，且作为创伤性检测限制了该法的大规模筛查。
中国发明专利申请(公开号:CN114480691A，公开日：2022.05.13)提供了一种多重引物，其包括结核分枝杆菌插入序列IS6110、MPB64基因、rpoB基因、katG基因、inhA基因和gyrA基因的特异性引物对和特异性探针。该专利的检测方法可快速鉴别结核杆菌复合菌群，可以同时判定其对异烟肼、利福平和氟喹诺酮类药物的耐药性，但是未公开该方法能否适用于潜伏性结核感染的筛查检测。
外泌体(exosome)是外泌体是一种由细胞衍生的囊泡类结构，含有多种生物活性物质.如各种蛋白质、脂质、核酸等，参与各种生理与病理过程，典型外泌体的大小为50–100nm。宿主细胞产生的外泌体的数量可能与感染的传播有关。已有的文献报道认为外泌体对病原体感染通过传递相关内容起到双向调节作用，由唾液腺分泌的唾液中含有外泌体可作为体液生物标志物的，既往有研究报道唾液直接检测检测结核分枝杆菌，但检测效能低下；也有报道外泌体中检测结核分枝杆菌，但检测样本通常为血液，尚未有唾液作为检测样本的相关报道；唾液中富集提取检测外泌体筛查结核性潜伏感染也未见报道。
目前多种方法可以有效地从生物液和细胞培养上清中分离外泌体。常用外泌体分离技术可分为超高速离心、密度梯度离心、超滤沉淀和免疫分离等(如中国发明专利申请CN115678832A、CN116287112A等)，但是每种方法均各有优势和局限性。超速离心法比较耗时；密度梯度离心法步骤繁琐；沉淀法存在于分离物中的聚合物物质可能干扰下游分析；试剂盒提取法特异性低，常用的超滤膜用于过滤允许小颗粒和可溶性分子分离自外泌体，在外泌体的富集过程中，由于材料表面的功能基团、表面电荷、亲水性或疏水性基团等影响，外泌体不易洗脱，会有大量的吸附损耗。且由于待分析的液体通过膜时施加了额外的力，外泌体可能变形或损坏。以上这些缺点限制外泌体作为生物标志物的进一步应用。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种唾液中外泌体的富集提取方法，使用超速离心和微孔过滤的组合步骤进行富集及纯化，保证外泌体的数量及纯度；并通过微孔过滤和差速离心循环可以大大降低其他微泡的干扰；同时改进了超过滤膜法对外泌体破坏小的外泌体分离方法，避免外泌体膜结构破坏，耗时短，操作简单、特异性强。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种唾液中外泌体的富集提取方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1)吸取唾液置于消毒后的离心管内离心，至无絮状物；
2)汲取上清液转于另一带双层滤过膜的离心管内，离心；所述的双层滤过膜的上层滤过膜的过滤精度为150-250nm，下层滤过膜的过滤精度为15-25nm，下层滤过膜经外泌体吸附抑制液处理；
3)移去离心管的液体，取出下层过滤膜；
4)然用洗脱液洗脱，将外泌体富集于另一离心管内。
作为优选，所述步骤1)的离心5000-7000转/分，离心8-12min；如果第一次离心后仍有絮状物，再次离心，5000-7000转/分，1-5℃，4-6min。
作为优选，所述步骤2)的离心8000-120000转/分，8-12分钟。
作为优选，所述下层滤过膜采用亲水性聚砜超滤膜，过滤孔径20nm；下层滤过膜采用FUJIFILM外泌体吸附抑制剂EV-Save进行处理。
作为优选，洗脱液为TE buffer(10mmol/L Tris—HCl,0.1mmol/L EDTA,pH8.0)
进一步，本发明还公开了一种唾液中外泌体的富集提取试剂盒，该试剂盒包括：
带双层滤过膜的离心管，所述的双层滤过膜的上层滤过膜的过滤精度为150-250nm，下层滤过膜的过滤精度为15-25nm，下层滤过膜经外泌体吸附抑制液处理；
以及，用于洗脱下层过滤膜上的外泌体的洗脱液。
作为优选，所述下层滤过膜采用亲水性聚砜超滤膜，过滤孔径20nm；下层滤过膜采用FUJIFILM外泌体吸附抑制剂EV-Save进行处理；洗脱液为TE Buffer(10mmol/L Tris—HCl,0.1mmol/L EDTA,pH8.0)。
进一步，本发明再使用熔解曲线法检测rpoB和IS6110双基因的检测方法用于结核分枝杆菌的潜伏感染的筛查。本发明新型的筛查结核性潜伏感染筛查方法具有无创伤性、敏感性高、特异性高、受个体基础免疫差别影响小等方面的优点。
进一步，本发明还公开了上述的方法采用的一种筛查结核性潜伏感染的诊断试剂盒，该试剂盒包括检测所述的方法提取的外泌体DNA的试剂，所述的外泌体DNA为rpoB和IS6110基因。
作为优选，所述试剂包括：
1)引导rpoB和IS6110基因特异性扩增的引物；
2)内含荧光素SYBRgreen，dATP，dGTP，dCTP，dUTP，qPCRDNA聚合酶；
3)阳性对照品：含rpoB和IS6110基因片段的质粒；
4)阴性对照品：不含上述任何物质的PCR反应配制溶液；
5)质量内控品：看家基因(house-keepinggene)GAPDH的引物和质粒；
6)样品稀释液：配制PCR反应的溶液。
作为优选，所述rpoB和IS6110基因正、反引物的寡核苷酸序列如下：
IS6110F1：cgaactcaaggagcacatca
IS6110R1：cagccgttcgacggtgcat
rpoBF1:cgagctgatccaaaaccagat
rpoBR1:atcaacgtctgcggtgtgat。
本发明的创新点如下：(1)唾液样本采集方便无创伤性，必要时可反复取材，既往无报道使用唾液筛查结核性潜伏感染；(2)外泌体富集以及提取方法不同于既往方法，无需昂贵的超高速离心机或昂贵的进口外泌体提取试剂，配合核酸检测法后更为经济高效；(3)经过纯化的外泌体继续联合使用一种自行设计引物的熔解曲线法检测rpoB和IS6110双基因的检测方法用于结核分枝杆菌核酸的筛查诊断，而非传统的免疫学检测，有敏感性高、特异性高、受个体基础免疫差别影响小等方面的优点。我们使用了rpoB和IS6110双基因作为靶序列，能达到更低的检测限。IS6110的最低检测限可达2个CFU/mL，rpoB的最低检测限是4个CFU/mL，显著优于现有普通结核分枝杆菌核酸检测试剂盒的检测敏感性。
综上所述，本发明提供的试剂盒通过无创伤性检测唾液中外泌体核酸的新型筛查方法，应用于检测结核分枝杆菌相关基因，进一步提高结核性潜伏感染的早期筛查效率。无创伤性、操作简单、费用效价比高，对于结核性潜伏感染的筛查具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1-2为本发明试剂盒内相关试剂的以及相关名称介绍。
图3为本发明的检测流程图。
图4为本发明的双层滤过膜的结构示意图。
图5为含有EV-SaveTM及不含EV-SaveTM处理后的过滤膜超滤后CD63信号的比较。
图6为电镜检测照片。
图7-8为本发明双基因熔解曲线法原理图。
图9-10为本发明根据标准NIH的H37Rv菌株的IS6110基因溶解曲线检测图(浓度由低到高)。
图11-12为本发明根据标准NIH的H37Rv菌株的ropB基因溶解曲线检测图(浓度由低到高)。
图13为使用结核分枝杆菌PCR检测试剂用国家参考品(批号230030-201703)经熔解曲线检测IS6110特异性。
图14为使用结核分枝杆菌PCR检测试剂用国家参考品(批号230030-201703)经熔解曲线检测rpob特异性。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，将实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1rpoB和IS6110基因扩增引物设计
DNA寡核苷酸引物PCR扩增DNA寡核苷酸引物的设计基于MTB株H37Rv的基因组序列。设计了两对用于MTBrpoB和IS6110基因检测的引物。rpoB和IS6110基因正、反引物的寡核苷酸序列见下：
IS6110F1：cgaactcaaggagcacatca
IS6110R1：cagccgttcgacggtgcat
rpoBF1:cgagctgatccaaaaccagat
rpoBR1:atcaacgtctgcggtgtgat。
实施例2唾液中外泌体的富集提取方法
1)吸取唾液2ml(避免含粘液和痰液)，置于高温高压消毒后的2mL离心管内，离心6000转/分，离心10min。
注意:如果第一次离心后仍有絮状物，再次离心，6000转，4℃，5min。
2)汲取1.5mL上清液，注意不要混入沉淀物，转于另一2mL带上下双层滤过膜的离心管内。离心10000转，10分钟。
3)移去离心管的液体，取出下层过滤膜(膜事先经外泌体吸附抑制液处理)。
4)然用洗脱液5mL洗脱两遍，将外泌体富集于1.5mL的离心管内。
5)用核酸提取试剂将外泌体核酸DNA提取。
其中，利用串联配制的超滤办法，基于超滤的外泌体分离示意图(图3-4)。
1)串联配置的超滤。当生物流体通过两层膜时，包括细胞碎片、凋亡小体和细胞在内的大囊泡被困在200nm的膜中，而直径在20-200nm范围内的囊泡则保留在下方20nm筛选。
2)亲水性聚砜超滤膜(科氏滤膜公司KOCH中空纤维超滤膜型号V1048-35-PMX，过滤孔径20nm)。
3)采用FUJIFILM外泌体吸附抑制剂EV-Save(超滤用)5μl制成溶液，将亲水性聚砜超滤膜滤过膜浸入1小时，采用高分子聚合物在外泌体与膜表面之间形成一定的阻隔，有效减少材料对外泌体的吸附损耗。
4)将超滤膜从管子中取出。
5)最后利用洗脱液TE buffer(10mmol/L Tris—HCl,0.1mmol/L EDTA,pH8.0)将外泌体从膜表面洗脱下来。外泌体粒径分布约为30-150nm左右。
6)外泌体纯化。
此方法可最大限度抑制耗材对外泌体的吸收，增加外泌体回收率，尤其适用于外泌体分泌量较少的细胞及样本，如唾液。
7)以上方法通过外泌体鉴定：
(1)唾液上清液，加入本产品后，使用细胞上清外泌体提取试剂盒提取外泌体。外泌体鉴定与分析，测定外泌体浓度为4.25x10^10p/mL。
(2)将超滤前的CD63信号设定为相对值的100％使用EV-Save浸泡后过滤膜后，外泌体没有损失。见图5。
(3)电镜检测照片见图6。
实施例3溶解曲线检测
荧光PCR扩增方法：用经核酸纯化仪提取的唾液外泌体核酸作检测模板，进行rpoB及IS6110双靶标基因的荧光定量PCR扩增的操作。图7-14为rpoB及IS6110双靶标基因熔解曲线工作原理图。
1.1.试剂准备
1.1.1取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用。
1.1.2将14μL试剂盒中荧光PCR反应酶混合液加入各PCR反应管中，将待测样本、阴性对照、阳性对照和内控参照品各11μL分别加入各PCR反应管内，短暂离心混匀后PCR扩增。
1.2PCR扩增
1.2.1将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按设定的PCR程序进行扩增。
1.2.2荧光检测通道选择。
1.2.3循环参数设定:(Gene9660仪器参数设计)：
扩增程序(两步法)
1.3.反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值，进行分析并记录Ct值。我们通过对比临床诊断、痰培养、XPERT、影像学检查等结果来筛选确认结核分枝杆菌特异的熔解曲线的特征，由此建立我们双基因熔解曲线法结果判定标准，并设计了电脑程序用于检测结果的自动判定。
2.检测结果的判定标准：
满足以下任一条件判定为检测阳性：
1)熔解曲线(meltingcurve)值：IS6110及rpoB两个基因之一的熔点介于85.8℃和88.4℃之间；
2)IS6110基因和rpoB基因的扩增CT值<35循环。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种唾液中外泌体的富集提取方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1)吸取唾液置于消毒后的离心管内离心，至无絮状物；
2)汲取上清液转于另一带双层滤过膜的离心管内，离心；所述的双层滤过膜的上层滤过膜的过滤精度为150-250nm，下层滤过膜的过滤精度为15-25nm，下层滤过膜经外泌体吸附抑制液处理；
3)移去离心管的液体，取出下层过滤膜；
4)然用洗脱液洗脱，将外泌体富集于另一离心管内。
2.根据权利要求1所述的一种唾液中外泌体的富集提取方法，其特征在于，步骤1)的离心5000-7000转/分，离心8-12min；如果第一次离心后仍有絮状物，再次离心，5000-7000转/分，1-5℃，4-6min。
3.根据权利要求1所述的一种唾液中外泌体的富集提取方法，其特征在于，步骤2)的离心8000-120000转/分，8-12分钟。
4.根据权利要求1所述的一种唾液中外泌体的富集提取方法，其特征在于，下层滤过膜采用亲水性聚砜超滤膜，过滤孔径20nm；下层滤过膜采用FUJIFILM外泌体吸附抑制剂EV-Save进行处理。
5.根据权利要求1所述的一种唾液中外泌体的富集提取方法，其特征在于，洗脱液为TEbuffer，10mmol/L Tris—HCl,0.1mmol/L EDTA,pH8.0。
6.一种唾液中外泌体的富集提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
带双层滤过膜的离心管，所述的双层滤过膜的上层滤过膜的过滤精度为150-250nm，下层滤过膜的过滤精度为15-25nm，下层滤过膜经外泌体吸附抑制液处理；
以及，
用于洗脱下层过滤膜上的外泌体的洗脱液。
7.根据权利要求6所述的富集提取试剂盒，其特征在于，下层滤过膜采用亲水性聚砜超滤膜，过滤孔径20nm；下层滤过膜采用FUJIFILM外泌体吸附抑制剂EV-Save进行处理；洗脱液为TE buffer，10mmol/L Tris—HCl,0.1mmol/L EDTA,pH8.0。
8.一种筛查结核性潜伏感染的诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测权利要求1-5任意一项权利要求所述的方法提取的外泌体DNA的试剂，所述的外泌体DNA为rpoB和IS6110基因。
9.根据权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂包括：
1)引导rpoB和IS6110基因特异性扩增的引物；
2)内含荧光素SYBR green，dATP，dGTP，dCTP，dUTP，qPCR DNA聚合酶；
3)阳性对照品：含rpoB和IS6110基因片段的质粒；
4)阴性对照品：不含上述任何物质的PCR反应配制溶液；
5)质量内控品：看家基因(house-keeping gene)GAPDH的引物和质粒；
6)样品稀释液：配制PCR反应的溶液。
10.根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，rpoB和IS6110基因正、反引物的寡核苷酸序列如下：
IS6110 F1：cgaactcaaggagcacatca
IS6110 R1：cagccgttcgacggtgcat
rpoB F1:cgagctgatccaaaaccagat
rpoB R1:atcaacgtctgcggtgtgat。
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