CN116042609A - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测技术领域,具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性的检测试剂和方法。本发明提供了尾巴引物、对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测的加尾引物对和检测体系,所述尾巴引物与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测引物的结合提高了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的特异性和扩增效率高,同时检测灵敏度高,实验结果稳定准确,可用于临床样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测,为耐甲氧西林葡萄球菌的体外诊断提供了快速、可靠的检测方法,克服传统检测方法的窗口期及常规PCR方法中引物二聚体的问题,对及时了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染情况及耐药性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域,具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂和方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sau)为革兰氏阳性球菌,镜检常呈葡萄串状排列而名葡萄球菌,致病性强,可产生各种毒素和胞外酶,获得位于染色体上的mecA基因而具有耐药性,除对甲氧西林耐药外,对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistantStaphylococcus aureus,MRSA)因其对抗生素的高度耐药性及其诊治的复杂性令广大临床医生感到异常棘手,自发现至今已成为全球院内感染的重要病原菌之一;中国细菌耐药性监测(CHINET)2013年的资料显示,金黄色葡萄球菌占分离总菌株数的9.61%,其中MRSA在金黄色葡萄球菌中的平均检出率为45.2%,MRSA分离率最高的医院达72.0%,应选用准确的检测手段,发现MRSA,及时向临床报告,以便控制感染和隔离治疗。
传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类,需要分离培养、生化反应鉴定、血清学鉴定、肠毒素鉴定等步骤,该方法耗时耗力。荧光PCR技术实现了对致病菌的快速检测,更加节约时间和成本,是快速检测致病菌的重要研究方向,但PCR由于易形成引物二聚体,造成扩增效率下降。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂和方法。
本发明提供了尾巴引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步的,本发明提供了引物探针组合,其包括检测mecA特异性区段的引物对和探针及本发明所述的尾巴引物;所述引物对的上游引物的5’端连接有尾巴引物,下游引物的5’端连接有尾巴引物。
更进一步的,本发明所述引物探针组合中,
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明中,所述探针的5’端连接荧光报告基团,3’端连接荧光淬灭基团。
进一步的,所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的任意一种。
本发明中,所述的尾巴引物是通过无数尝试获得的不与任何已知的基因匹配,无稳定的二级结构,其自身或和其他引物之间不会形成引物二聚体的引物,其可与其他任意的引物进行组合用于提高检测的扩增效率。
进一步的,本发明所述的引物探针组合主要用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测,本发明所述的引物探针组合包括了所述的尾巴引物。本发明中,在针对mecA特异性区扩增的上下游引物的5’端均添加加尾引物,形成检测mecA特异性区段的加尾引物对,由于加尾引物对的5’端加有尾巴引物,可大大减少引物二聚体的形成,提高扩增效率。对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测结果表明,尾巴引物从第二个循环参与扩增反应,高浓度尾巴引物的存在可获得最佳扩增效果,其中尾巴引物添加浓度为1.2μmol/L时检测效果最佳;并且加尾引物对替换上下游扩增引物序列和/或尾巴引物均会对检测的效率和检测特异性产生影响。以上结果证明,以本发明所述的引物探针组合对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测效果显著优于其他引物探针组合,本发明所述的引物探针组合对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行检测时具有特异性好,扩增效率高,稳定性强,重复性好和灵敏高的特点。
本发明提供了所述的尾巴引物和所述的引物探针组合在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测产品中的应用。
进一步的,所述产品包括但不限于包括所述尾巴引物和/或所述引物探针组合的试剂盒和/或试剂等。
本发明提供了检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂,其包括PCR反应缓冲液、Mn2+溶液、Mg2+溶液、dNTP和rTth聚合酶。
进一步的,
所述PCR反应缓冲液的成分包括1M Tricine、10M醋酸钾和体积分数为80%的甘油;
所述Mn2+溶液的溶剂为水,其中Mn2+的使用浓度为3mM;
所述Mg2+溶液的溶剂为水,其中Mg2+的使用浓度为1.6mM;
dNTPs溶液的溶剂为水,其中各dNTP的使用浓度为0.2mM;
rTth聚合酶的使用浓度为8U/80μL。
本发明提供了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法,其为利用如下I)~III)所示中的至少一项对样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行检测:
I)、本发明所述的尾巴引物;
I)、本发明所述的引物探针组合;
I)、本发明所述的试剂。
进一步的,本发明所述的检测方法中,所述样品包括但不限于痰液和/或肺泡灌洗液中的至少一种。
进一步的,本发明所述的检测方法的步骤包括:
在实时荧光PCR扩增过程中检测荧光信号,得到检测结果。
本发明所述检测方法的反应程序包括:获得样本核酸、PCR扩增和结果分析。
所述的PCR扩增的程序为:50℃2min;94℃5min;94℃变性10sec,60℃退火30sec,45个循环,每个循环在退火阶段采集荧光信号。
所述结果分析时以荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准,Ct值小于等于35时为阳性,Ct值大于35时为阴性;所述阴性表示检测结果为非甲氧西林耐药的病原菌;所述非甲氧西林耐药的病原菌包括铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、溶血葡萄球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和/或金黄色葡萄球菌中的至少一种;所述阳性表示检测结果为甲氧西林耐药菌。本发明的结果显示,其他病原微生物存在的条件下,用本发明的引物探针组合和扩增体系仍可对金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药性进行检测,检测结果准确,无非特异性扩增。
本发明中,所述的尾巴引物是通过无数尝试获得的不与任何已知的基因匹配,无稳定的二级结构,其自身或和其他引物之间不会形成引物二聚体的引物,其可与其他任意的引物进行组合用于提高检测的扩增效率。进一步的,本发明设计了针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性引物,其与本发明所述的尾巴引物结合用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测,进一步提高了检测的效率和特异性。同时本发明对检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的扩增体系成分及所述成分的浓度进行了优化,进一步提高了检测的效果。
本发明提供了尾巴引物、对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测的加尾引物对和检测体系,所述尾巴引物与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测引物的结合提高了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的特异性和扩增效率高,同时检测灵敏度高,实验结果稳定准确,可用于临床样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测,为耐甲氧西林葡萄球菌的体外诊断提供了快速、可靠的检测方法,克服传统检测方法的窗口期及常规PCR方法中引物二聚体的问题,对及时了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染情况及耐药性具有重要意义。
附图说明
图1示同源加尾引物组合筛选;
图2示同源加尾引物浓度筛选;
图3示灵敏度验证;
图4示特异性验证;
图5示其他引物探针组合检测效果;
图6示低检测菌浓度下尾巴引物浓度对扩增的影响;
图7示检测的重复性。
具体实施方式
本发明提供了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂和方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA引物探针系统建立一、引物探针序列设计
1、靶序列选择
从NCBI数据库下载mecA基因序列,经过Blast比对,初步筛选出相对保守区段,再将筛选出的保守区段进一步进行Blast比对,筛选出特异性检测mecA的靶序列。
2、引物探针设计
针对上述筛选出的mecA特异性区段,用Primer5设计多条引物序列及配对探针序列;针对尾巴引物的核苷酸序列随机设置碱基顺序,与NCBI数据库进行比对,无配对序列,可添加至特异性引物的5’端,构成加尾引物,具体序列信息如下表:
表1.本发明候选加尾引物对和配对荧光探针
序列名称 | 序列信息(5’-3’) | 编号 |
mecA-F1 | tctgccatgcctgcctggtttggtctttctgcattcctgg | SEQ ID NO:1 |
mecA-F2 | tctgccatgcctgcctgggatctttctgcattcctggaataa | SEQ ID NO:2 |
mecA-F3 | tctgccatgcctgcctgggctatcgtgtcacaatcgttgacg | SEQ ID NO:3 |
mecA-R1 | tctgccatgcctgcctgggtgcttacaagtgctaataattca | SEQ ID NO:4 |
mecA-R2 | tctgccatgcctgcctggtttggtctttctgcattcctgg | SEQ ID NO:5 |
mecA-R3 | tctgccatgcctgcctggggtctttctgcattcctggaataa | SEQ ID NO:6 |
mecA-P | tggctcaggtactgctatccaccct | SEQ ID NO:7 |
尾巴引物1 | tctgccatgcctgcctgg | SEQ ID NO:8 |
注:引物中下划线部分为添加的尾巴引物;探针5’端标记ROX,3’端标记BHQ2。
二、引物探针筛选
1、引物组合筛选
对以上设计的靶标引物、探针组合进行筛选,用相同浓度样品(1000CFU/mL)进行验证筛选(如图1),选择同源加尾引物探针组合具体如下:
mecA-F3:tctgccatgcctgcctgggctatcgtgtcacaatcgttgacg(SEQ ID NO:3);
mecA-R3:tctgccatgcctgcctggggtctttctgcattcctggaataa(SEQ ID NO:4);
mecA-P:tggctcaggtactgctatccaccct(SEQ ID NO:7);
尾巴引物1:tctgccatgcctgcctgg(SEQ ID NO:8)。
且此组合用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测的重复性良好,结果如图7所示,在不同初始菌浓度(按出峰早到慢的菌浓度依次为2×105CFU/mL、2×104CFU/mL、2×103CFU/mL、2×102CFU/mL)下进行多次检测,检测结果稳定,重复性好。
2、尾巴引物浓度筛选
针对尾巴引物的添加浓度进行筛选(菌浓度为5000CFU/mL),经过稳定性、特异性、灵敏度评估(如图2),最终确定尾巴引物添加浓度为1.2μmol/L。
3、低菌浓度下尾巴引物不同浓度的对比情况
在菌量在750CFU/mL时,表1所示所示加尾引物对(mecA-F3;mecA-R3)尾巴引物1和其探针,将尾巴引物1浓度分别调整为0.2μmol/L(绿色)、0.4μmol/L(紫色)、0.8μmol/L(红色)、1.2μmol/L(蓝色)进行检测验证,结果如图6所示,当尾巴引物1的浓度为1.2μmol/L时,低菌浓度扩增效率最优。
实施例2基于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同源加尾引物检测方法灵敏度验证
以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300为模板,将其浓度分别稀释至10000CFU/mL、1000CFU/mL、100CFU/mL,用上述检测方法进行验证,具体步骤如下:
1、样本核酸提取:
(1)将30μL蛋白酶K、600μL待测样本、100μL磁珠混悬液(吸前混匀磁珠)、1.2mL裂解液加入1.5mL灭菌离心管中,混匀,于37℃培养箱中孵育2min;
(2)将孵育后的上述混合液磁吸1min 30s,弃废液;
(3)去磁,添加2mL洗液A,混匀,磁吸1min 30s,弃废液;
(4)去磁,添加2mL洗液B,混匀,磁吸1min 30s,弃废液(尽量减少残留);
(5)加100~300μL(按照后续实验要求添加)洗脱液,混匀,于80℃干式恒温器中解离5min;
(6)磁吸2min后,取提取或纯化产物用于后续实验。
2、PCR扩增体系构建:将上述成套试剂配制成混合液,加入40μL核酸提取物,充分混匀。本实例提供的成套试剂如下表所示:
表2.PCR扩增体系
组份名称 | 每一个反应中的体积或浓度 |
<![CDATA[Mn<sup>2+</sup>]]> | 3mM |
<![CDATA[Mg<sup>2+</sup>]]> | 1.6mM |
dNTP(100mM) | 0.2mM |
Tth酶(5U/μl) | 8U |
SEQ ID NO:3 | 0.5μmol/L |
SEQ ID NO:6 | 0.5μmol/L |
SEQ ID NO:7 | 0.2μmol/L |
SEQ ID NO:8 | 1.2μmol/L |
模板量 | 40μL |
PCR buffer(1×) | 10μL |
灭菌纯化水 | Up to 80μL |
3、扩增检测及结果分析:将步骤2配制好的混合液转移至扩增区进行扩增检测,试验结果以Ct值进行判断,Ct≤35为阳性,Ct>35为阴性;
本实例提供的扩增程序是:50℃2min;94℃5min;94℃变性10sec,60℃退火30sec,45个循环,每个循环在退火阶段采集荧光信号。
4、同时用相同浓度样本为模板,用非同源加尾引物检测方法进行PCR扩增,比较本发明检测方法与非同源加尾引物检测方法的灵敏度。
灵敏度验证结果如图3所示:同源加尾引物检测方法与非同源加尾检测方法虽然检测梯度一致,但是低浓度样本检测,同源加尾引物检测方法显著优于非同源加尾检测方法,且扩增曲线斜率优于非同源加尾检测方法,说明其扩增效率要高于非同源加尾检测方法。
实施例3基于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同源加尾引物检测方法特异性验证
按照实例2中检测方法进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因检测,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、8种非甲氧西林耐药的病原菌和ddH2O为模板,对本发明提供检测方法进行特异性评价。
结果如图4所示,所有检测均重复两次,针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测,具有明显扩增曲线(红色曲线),且Ct<35,以非耐甲氧西林的病原菌及ddH2O为模板的检测,无扩增曲线(绿色曲线);非耐甲氧西林的病原菌由8种病原菌组成,即铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、溶血葡萄杆菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌提取的核酸。结果表明针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性的同源加尾引物检测方法特异性较好,与其他8种致病菌均无非特异性反应。
对比例1加尾引物的筛选
其他加尾引物序列检测结果
表3.本发明候选加尾引物对和配对荧光探针
序列名称 | 序列信息(5’-3’) | 编号 |
mecA-F4 | gcaagccctcacgtagcgaagctatcgtgtcacaatcgttgacg | SEQ ID NO:9 |
mecA-R4 | gcaagccctcacgtagcgaaggtctttctgcattcctggaataa | SEQ ID NO:10 |
尾巴引物2 | gcaagccctcacgtagcgaa | SEQ ID NO:11 |
mecA-F5 | taggtcgtgcgtatgtgcaggctatcgtgtcacaatcgttgacg | SEQ ID NO:12 |
mecA-R5 | taggtcgtgcgtatgtgcaggggtctttctgcattcctggaataa | SEQ ID NO:13 |
尾巴引物3 | taggtcgtgcgtatgtgcagg | SEQ ID NO:14 |
注:引物中下划线部分为添加的尾巴引物;探针5’端标记ROX,3’端标记BHQ2。
以表1所示的mecA-F3;mecA-R3的相同引物部分序列的引物对序列加上尾巴引物2,组成mecA-F4;mecA-R4的引物对;加上尾巴引物3,组成引物对mecA-F5;mecA-R5的引物对,对其中gc含量稍作调整。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300为模板,将其浓度分别稀释至10000CFU/mL、1000CFU/mL、100CFU/mL,结果如图5所示,其中蓝色曲线为所述SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8加尾引物组合检测结果,绿色曲线为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14加尾引物组合检测结果,红色曲线为SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11加尾引物组合检测结果。检测结果显示SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8组合检测结果扩增效率最优。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.尾巴引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.引物探针组合,其包括:
权利要求1所述的尾巴引物;和
靶向mecA特异性区段的引物对和探针;
其中,
上游引物5’端连接如SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的尾巴引物;
下游引物5’端连接如SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的尾巴引物。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合,其特征在于,
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合,其特征在于,所述探针的5’端连接荧光报告基团,3’端连接荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合,其特征在于,所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的任意一种。
6.权利要求1所述的尾巴引物和权利要求2~5任一项所述的引物探针组合在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性检测产品中的应用。
7.检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂,其包括PCR反应缓冲液、Mn2+溶液、Mg2+溶液、dNTP和rTth聚合酶。
8.根据权利要求7所述的试剂,其特征在于,
所述PCR反应缓冲液包括1M Tricine、10M醋酸钾和体积分数为80%的甘油;
所述Mn2+溶液的溶剂为水,其中Mn2+的使用浓度为3mM;
所述Mg2+溶液的溶剂为水,其中Mg2+的使用浓度为1.6mM;
dNTPs溶液的溶剂为水,其中各dNTP的使用浓度为0.2mM;
rTth聚合酶的使用浓度为8U/80μL。
9.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法,其特征在于,其为利用如下I)~III)所示中的至少一项对样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行检测:
I)、权利要求1所述的尾巴引物;
I)、权利要求2~5任一项所述的引物探针组合;
I)、权利要求7或8所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,所述样品包括痰液和/或肺泡灌洗液中的至少一种。
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