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CN118267470A - 抗SIRPα抗体 - Google Patents

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CN118267470A
CN118267470A CN202410388177.7A CN202410388177A CN118267470A CN 118267470 A CN118267470 A CN 118267470A CN 202410388177 A CN202410388177 A CN 202410388177A CN 118267470 A CN118267470 A CN 118267470A
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seq
acid sequence
amino acid
variable region
chain variable
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H·范伊讷恩纳姆
A·范埃尔莎
E·维特斯
P·文柯
D·L·胡尔西克
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Siropa Pte Ltd
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Siropa Pte Ltd
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Abstract

本发明涉及抗SIRPα抗体，以及这些抗体在诸如癌症和传染病的疾病治疗中的用途。

Description

抗SIRPα抗体
本申请是申请号为201880033048.9、申请日为2018年04月13日、发明名称为“抗SIRPα抗体”的中国专利申请的分案申请。
本申请要求2017年4月13日提交的荷兰专利申请2018708和2017年7月3日提交的荷兰专利申请2019166的权益，所述专利申请的每一项由此通过引用整体(包括所有表格、附图和权利要求)并入。
发明领域
本发明涉及抗SIRPα抗体，以及这些抗体在疾病治疗中的用途。
发明背景
信号调节蛋白α(SIRPα)是来自SIRP家族的膜糖蛋白。SIRP家族的成员共有某些共同的结构基序。这些包括跨膜区段和N末端细胞外结构域，所述N末端细胞外结构域包含通过三对二硫键连接的三个Ig样环。然而，C末端细胞内结构域在SIRP家族成员之间不同。SIRPα具有含有形成两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的四个酪氨酸残基的延伸的细胞内结构域，而SIRPβ1在跨膜结构域中含有赖氨酸残基，随后是用作DAP12受体的缺乏ITIM的短细胞内尾。已经鉴定了8种SIRPα单核苷酸多态性，其中最普遍的是SIRPαV1和SIRPαV2(Takenaka等，Nat.Immunol.2007,8:1313-23)。
“吃掉我(Eat-me)”信号(即“改变的自身”)是由凋亡细胞而非健康细胞特异性产生并在凋亡细胞表面上展示的细胞外参与者，并且对于通过激活吞噬细胞受体和随后的信号传导级联启动的吞噬作用是至关重要的。吃掉我信号需要细胞外运输以在凋亡细胞上展示。特定种类的吃掉我信号由膜锚定蛋白诸如磷脂酰丝氨酸(PtdSer)和钙网蛋白(CRT)提供。外化的PtdSer与吞噬细胞上的其受体结合，以促进凋亡细胞的清除(称为胞葬的过程)。同样地，CRT在凋亡细胞的表面上上调并且与吞噬细胞上的LDL-受体相关蛋白1(LRP1)结合，从而介导吞噬。
SIRPα广泛表达于吞噬细胞(例如，巨噬细胞、粒细胞和树突细胞)上，并通过其与跨膜蛋白CD47的相互作用而起抑制性受体的作用。这种相互作用介导了称为“不要吃我”信号的响应。这种相互作用负调节先天免疫细胞的效应物功能，诸如宿主细胞吞噬作用。由于CD47通常存在于肿瘤细胞上，因此认为这种“不要吃我”的信号有助于肿瘤对吞噬细胞依赖性清除的抗性。尽管SIRPα和SIRPβ1的细胞外结构域存在相似性，但SIRP家族成员之间存在功能差异。例如，SIRPβ1不能以可检测的水平结合CD47，并因此不会介导“不要吃我”的信号。相反，SIRPβ1参与骨髓样细胞的活化。
据报道，破坏CD47-SIRPα信号传导(例如，通过与CD47或SIRPα结合的拮抗性单克隆抗体)导致实体瘤细胞和造血肿瘤细胞的吞噬作用增强，包括体外成胶质母细胞瘤细胞的吞噬作用增强和体内显著的抗肿瘤活性。
发明内容
在第一方面，本发明提供了抗SIRPα抗体及其抗原结合片段，其包含下文所述的结构和功能特征。
在各种实施方案中，本发明提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)、(ii)和(iii)中的一个，两个或全部三个：(i)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(ii)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(iii)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列。
在各种实施方案中，本发明提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)、(ii)和(iii)中的一个、两个或全部三个：(i)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(ii)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(iii)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：
SEQ ID NO:75或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:78或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:82或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:84或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:86或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:88或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:102或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:7或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:10或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:12或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:14或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:16或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:18或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:30或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列。
在各种实施方案中，本发明还提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)、(ii)和(iii)中的一个、两个或全部三个：(i)轻可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(ii)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(iii)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列。
在各种其它实施方案中，本发明还提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)、(ii)和(iii)中的一个、两个或全部三个：(i)轻可变区CDR1，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(ii)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(iii)轻链可变区CDR3，其包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：
SEQ ID NO:76或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:90或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:92或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:94或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:96或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:98或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:100或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:104或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:8或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:24或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:26或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:28或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:32或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列。
在各种实施方案中，本发明还提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(ii)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(iii)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；
以及
(iv)轻可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(v)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(vi)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列。
在各种实施方案中，本发明提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(ii)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(iii)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；
以及
(iv)轻可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；(v)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列；和/或(vi)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74相异在于1个、2个、3个或更多个保守取代的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本发明提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：
SEQ ID NO:7或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:10或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:12或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:14或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:16或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:18或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:30或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列；
以及
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：
SEQ ID NO:8或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:24或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:26或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:28或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:32或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本发明提供了与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：
SEQ ID NO:75或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:78或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:82或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:84或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:86或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:88或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列；以及
SEQ ID NO:102或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
以及
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：
SEQ ID NO:76或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:90或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:92或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:94或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:96或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:98或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:100或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:104或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本说明书中，“序列相似性”基于同一性的程度与保守变化的程度的结合。“序列相似性”的百分比是相同或保守地改变的氨基酸或核苷酸的百分比(即,“序列相似性”＝序列同一性百分比+保守性变化百分比)。因此，出于本发明的目的，“保守性变化”和“同一性”被认为是更广泛的术语“相似性”的种类。因此，每当使用术语序列“相似性”时，其包含序列“同一性”和“保守性变化”。根据某些实施方案，忽略保守性变化，并且序列相似性百分比是指序列同一性百分比。在某些实施方案中，由所引用的序列同一性百分比允许的序列的变化全部是或几乎全部是保守性变化；也就是说，当序列90％相同时，剩余的10％全部是或几乎全部是保守性变化。在本说明书中，术语“几乎全部”是指至少75％的允许的序列变化，更优选至少85％，还更优选至少90％，最优选至少95％是保守性变化。在抗体重链和/或轻链的某些实施方案中，允许的序列变化在框架区内而不在CDR中。
优选地所述抗体具有根据SEQ ID NO:7的重链。进一步优选地所述抗体具有根据SEQ ID NO:8的轻链。更优选地，所述重链选自SEQ ID NO:10、12、14、16、18或30中的任一个。更优选地，所述轻链选自SEQ ID NO:20、22、24、26、28或32中的任一个。
或者，所述抗体具有根据SEQ ID NO:75的重链。进一步优选地所述抗体具有根据SEQ ID NO:76的轻链。更优选地，所述重链选自SEQ ID NO:78、80、82、84、86、88或102中的任一个。更优选地，所述轻链选自SEQ ID NO:90、92、94、96、98、100或104中的任一个。
在任何上述实施方案中，可以分离抗体或其抗原结合片段，如该术语在本文中定义。
在任何上述实施方案中，抗体或其抗原结合片段是重组抗体，如该术语在本文中所定义的。
在任何上述实施方案中，抗体或其抗原结合片段是全长抗体，如该术语在本文中所定义的。
本发明的抗体或抗原结合片段可以从多种物种中获得。例如，本发明的抗体可包含免疫球蛋白序列，其是兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物的序列，或此类序列的组合(所谓的嵌合抗体)。最优选地，抗体或抗原结合片段是人抗体或人源化抗体或抗原结合片段。
术语抗体包括保持结合抗原的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也通过引用包括在术语“抗体”中。优选的治疗性抗体是完整的IgG抗体。如本文中所用，术语“完整的IgG”是指属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人中，该类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。IgG类抗体中的已知Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
在任何上述实施方案中，抗体或其抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人或人源化抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG。在优选实施方案中，抗体是IgG1、IgG2或IgG4，以及优选地人IgG1、IgG2或IgG4。
在任何上述实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可包含上述任何轻链可变区和人κ或λ轻链恒定结构域以及IgG1、IgG2或IgG4重链恒定结构域。可根据本发明使用的示例性轻(κ)和重(IgG2和IgG4)恒定区序列以SEQ ID NO:63、65、67(各自为核苷酸序列)、64、66和68(各自为多肽序列)表述。
仅通过举例的方式，在各种实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段包含以下重链序列/轻链可变区序列组合之一：
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L1)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L2)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L3)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L4)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L5)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L1)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L2)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L3)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L4)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L5)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L1)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L2)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L3)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L4)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L5)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L1)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L2)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L3)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L4)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L5)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L1)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L2)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L3)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L4)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L5)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L1)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L2)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L3)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L4)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L5)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L6)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L1)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L2)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L3)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L4)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L5)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L6)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L1)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L2)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L3)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L4)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L5)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L6)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L1)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L2)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L3)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L4)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L5)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L6)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L1)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L2)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L3)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L4)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L5)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L6)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L1)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L2)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L3)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L4)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L5)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L6)
或者，在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性。
在一些优选实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:10并且每条轻链核酸序列包含SEQ ID NO:20，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性，最优选每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在其它优选实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:16并且每条轻链核酸序列包含SEQ ID NO:28，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性，最优选每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在其它优选实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:18并且每条轻链核酸序列包含SEQ ID NO:20，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性，最优选每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在一些优选实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:80并且每条轻链核酸序列包含SEQ ID NO:90，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性，最优选每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在一些优选实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:80并且每条轻链核酸序列包含SEQ ID NO:92，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性，最优选每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在一些优选实施方案中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:80并且每条轻链核酸序列包含SEQ ID NO:96，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性，最优选每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在一个实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体包含具有如上所述的两条轻链和两条重链的全长抗体结构，其中每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1恒定区。
在一个实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体包含具有如上所述的两条轻链和两条重链的全长抗体结构，其中每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG2恒定区。
在一个实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体包含具有如上所述的两条轻链和两条重链的全长抗体结构，其中每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG4恒定区。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段具有一个、两个、三个、四个或更多个以下功能特征，优选每个以下功能特征：
结合具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1蛋白，其中EC50<1nM；并且针对具有SEQID NO:62的序列的SIRPαV1(P74A)表现出高至少100倍的EC50；并且任选地针对具有SEQ IDNO:38的序列的人SIRPβ1蛋白也表现出高至少100倍的EC50(在其中降低的EC50是相对于针对具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1蛋白的EC50的每种情况下，以及在优选当通过如下文所述的细胞ELISA(CELISA)测量时的每种情况下)；
与表达人SIRPαV1蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至更优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
与表达人SIRPαV2蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至最优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
在50nM，优选67nM，更优选100nM的抗体浓度下，或者在为抗体针对SIRPαV1或SIRPαV2的EC50的10倍，优选50倍，更优选100倍，且仍然更优选200倍的浓度下不与SIRPβ1蛋白明显地结合；
抑制人SIRPα与CD47之间的结合，其中IC50<10.0nM，更优选<5.0nM，仍然更优选<2.5nM，且最优选约1.0nM或更低；以及
表现出至少79，更优选85的T20“人源性”评分。
优选地，本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段在100nM的抗体浓度下，或者在为抗体针对SIRPαV1或SIRPαV2的EC50的200倍的抗体浓度下不与SIRPαV1(P74A)和SIRPβ1蛋白之一或两者明显地结合，但与表达人SIRPαV1蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM。最优选地，每条轻链包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在某些实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段可以与至少一种治疗剂缀合。在一个实施方案中，治疗剂是第二抗体或其片段、免疫调节剂、激素、细胞毒性剂、酶、放射性核素或与至少一种免疫调节剂、酶、放射性标记物、激素、反义寡核苷酸或细胞毒剂缀合的第二抗体，或其组合。
本发明还提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、76、90、92、94、96、98、100、102、104、7、10、12、14、16、18、30、8、20、22、24、26、28和32中的任一个的氨基酸序列或任何所述序列的片段、或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
本发明还提供了编码任一种本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段的分离的核酸。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：
SEQ ID NO:75或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:78或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:82或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:84或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:86或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:88或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:102或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:10或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:12或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:14或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:16或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:18或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:30或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:9的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:11的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:13的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:15的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:17的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:29的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:78的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:77的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:80的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:79的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:82的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:81的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:84的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:83的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:86的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:85的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:88的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:87的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:102的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:101的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：
SEQ ID NO:76或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:90或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:92或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:94或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:96或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:98或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:100或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:104或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:8或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:24或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:26或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:28或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:32或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:19的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:21的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:23的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:25的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:27的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:31的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:90的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:89的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:92的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:91的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:93的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:96的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:95的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:98的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:97的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:100的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:99的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％相似性或同一性的氨基酸序列由SEQ ID NO:103的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本发明的分离的核酸可任选地包含前导序列。
此类核酸可包含以下核酸序列中的一种或多种：
SEQ ID NO:77的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:79的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:81的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:83的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:85的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:87的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:101的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:89的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:91的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:93的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:95的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:97的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:99的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:101的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:103的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:9的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:11的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:13的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:15的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:17的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:29的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:19的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:21的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:23的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:25的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:27的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或
SEQ ID NO:31的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在某些实施方案中，核酸可编码人或人源化抗体，并且包括重链和轻链两者的核酸序列。在一个实施方案中，抗体是IgG。在优选实施方案中，抗体是IgG1、IgG2或IgG4，优选地为人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施这群中，轻链序列包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域；并且每条重链序列包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
优选地，此类核酸包含以下重链和轻链可变区核酸序列的组合：SEQ ID NO:9/SEQID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L1)SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L2)SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L3)SEQ IDNO:9/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L4)SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L5)SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L1)SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L2)SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L3)SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L4)SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L5)SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L1)SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L2)SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L3)SEQID NO:13/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L4)SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L5)SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L1)SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L2)SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L3)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L4)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L5)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L1)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L2)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L3)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L4)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L5)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L1)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L2)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L3)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L4)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L5)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L6)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L1)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L2)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L3)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L4)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L5)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L6)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L1)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L2)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L3)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L4)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L5)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L6)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L1)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L2)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L3)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L4)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L5)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L6)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L1)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L2)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L3)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L4)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L5)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L6)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L1)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L2)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L3)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L4)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L5)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L6)
或者，在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:19，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:89，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:91，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:79和SEQ IDNO:95，或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
本发明还提供了包含本发明的一种或多种核酸的表达载体。表达载体是包含在宿主细胞中转录靶核酸所必需的调控元件的DNA分子。通常，将靶核酸置于某些调控元件(包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子元件)的控制下。当调控元件控制基因的表达时，这种靶核酸被认为与调控元件“可操作地连接”。
这些分离的核酸和包含它们的表达载体可用于在重组宿主细胞中表达本发明的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞。
此类表达载体可包含一种或多种与调控元件可操作地连接的下列核酸序列：
SEQ ID NO:77的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:79的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:81的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:83的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:85的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:87的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:101的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:89的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:91的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:93的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:95的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:97的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:99的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:103的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:11的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:13的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:15的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:17的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:29的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:19的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:21的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:23的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:25的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:27的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或
SEQ ID NO:31的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在某些实施方案中，表达载体包含编码本发明的抗SIRPα抗体的重链序列和轻链序列的核酸序列。优选地，此类核酸包含以下重链和轻链可变区核酸序列组合：
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L1)
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L2)
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L3)
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L4)
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L5)
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L1)
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L2)
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L3)
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L4)
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L5)
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L1)
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L2)
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L3)
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L4)
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L5)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L1)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L2)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L3)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L4)
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L5)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:19(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L1)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:21(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L2)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:23(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L3)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:25(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L4)
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:27(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L5)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L1)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L2)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L3)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L4)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L5)
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L6)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L1)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L2)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L3)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L4)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L5)
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L6)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L1)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L2)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L3)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L4)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L5)
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L6)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L1)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L2)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L3)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L4)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L5)
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L6)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L1)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L2)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L3)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L4)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L5)
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L6)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:89(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L1)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:91(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L2)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:93(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L3)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:95(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L4)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:97(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L5)
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:99(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L6)
或者，在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在任何上述实施方案中，表达载体可编码人或人源化抗体，并且包括重链和轻链两者的核酸序列。在一个实施方案中，抗体是IgG。在优选实施方案中，抗体是IgG1、IgG2或IgG4，优选地为人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施这群中，轻链序列包含人κ轻链或人λ轻链恒定结构域序列；并且每条重链序列包含人IgG4恒定区序列。
在一些优选实施方案中，表达载体编码表达人或人源化抗体，其中重链核酸序列包含SEQ ID NO:9并且轻链核酸序列包含SEQ ID NO:19，或者在每种情况下，与相应的SEQID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，最优选为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一些优选实施方案中，表达载体编码表达人或人源化抗体，其中重链核酸序列包含SEQ ID NO:15并且轻链核酸序列包含SEQ ID NO:27，或者在每种情况下，与相应的SEQID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，最优选为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一些优选实施方案中，表达载体编码表达人或人源化抗体，其中重链核酸序列包含SEQ ID NO:17并且轻链核酸序列包含SEQ ID NO:19，或者在每种情况下，与相应的SEQID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，或者在每种情况下，与相应的SEQ IDNO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，最优选为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一些优选实施方案中，表达载体编码表达人或人源化抗体，其中重链核酸序列包含SEQ ID NO:79并且轻链核酸序列包含SEQ ID NO:89，或者在每种情况下，与相应的SEQID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，最优选为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一些优选实施方案中，表达载体编码表达人或人源化抗体，其中重链核酸序列包含SEQ ID NO:79并且轻链核酸序列包含SEQ ID NO:91，或者在每种情况下，与相应的SEQID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，最优选为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一些优选实施方案中，表达载体编码表达人或人源化抗体，其中重链核酸序列包含SEQ ID NO:79并且轻链核酸序列包含SEQ ID NO:95，或者在每种情况下，与相应的SEQID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性，最优选为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞诸例如HEK293细胞、仓鼠细胞，诸如CHO细胞等)、细菌细胞(例如，大肠埃希氏菌(E.coli)细胞)、酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞等)、植物细胞(例如本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana))。由于为最有利的糖基化方式，哺乳动物细胞是优选的。
本发明还提供了包含本发明的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗CD27抗体或其抗原结合片段；抗LAG3抗体或其抗原结合片段；抗APRIL抗体或其抗原结合片段；抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗VISTA抗体或其抗原结合片段；抗BTLA抗体或其抗原结合片段；抗TIM3抗体或其抗原结合片段；抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗HVEM抗体或其抗原结合片段；抗CD70抗体或其抗原结合片段；抗CD137抗体或其抗原结合片段；抗OX40抗体或其抗原结合片段；抗CD28抗体或其抗原结合片段；抗PD1抗体或其抗原结合片段；抗PDL1抗体或其抗原结合片段；抗PDL2抗体或其抗原结合片段；抗GITR抗体或其抗原结合片段；抗ICOS抗体或其抗原结合片段；抗ILT2抗体或其抗原结合片段；抗ILT3抗体或其抗原结合片段；抗ILT4抗体或其抗原结合片段；以及抗ILT5抗体或其抗原结合片段；抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗TSLP抗体或其抗原结合片段；抗IL-10抗体或其抗原结合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、Toll样受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3)、SLAM7、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体的激动剂(例如，激动抗体或其抗原结合片段，或可溶性融合物)；CD47、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如，CEACAM-1、-3和/或-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIRl、IDO、TDO、CD160、TGFR的抑制剂；和环状二核苷酸或其它STING途径激动剂。
本发明还包括包含本发明的抗体或抗原结合片段和诱导ADCC的第二抗体的组合，其中本发明的所述抗体或抗原结合片段增强了通过第二抗体进行的抗体介导的细胞破坏。抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是细胞介导的免疫防御机制，其中免疫系统的效应细胞可主动裂解靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体结合。通常认为ADCC是由天然杀伤(NK)细胞介导的，但树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和粒细胞也可以介导ADCC。
本发明还包括包含本发明的抗体或抗原结合片段和诱导ADCP的第二抗体的组合，其中本发明的所述抗体或抗原结合片段增强了通过第二抗体的抗体介导的细胞吞噬作用。抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)是细胞介导的免疫防御机制，其中可通过粒细胞、单核细胞、树突状细胞或巨噬细胞介导的吞噬作用杀死靶细胞。
天然杀伤(NK)细胞在涉及通过单克隆抗体(mAb)靶向肿瘤抗原的癌症免疫疗法中起主要作用。在靶向细胞的情况下，NK细胞可以通过在其细胞表面上表达的某些Fc受体“特异性活化”。NK细胞可表达FcγRIIIA和/或FcγRIIC，其可与免疫球蛋白的Fc部分结合，从而在NK细胞内传递活化信号。一旦被结合到靶细胞的抗体通过Fc受体活化，NK细胞就能够在不引发的情况下裂解靶细胞，并分泌如干扰素γ的细胞因子来募集适应性免疫细胞。同样，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)表达结合抗体的Fc片段的表面受体，并使它们能够参与Ab依赖性细胞的细胞毒性/吞噬作用(ADCC/ADCP)。因为SIRPα/CD47信号传导诱导降低ADCC/ADCP的“不要吃我”响应，所以通过本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段阻断该信号传导可增强具有治疗性抗体所针对的抗原决定簇的肿瘤细胞的ADCC。
该ADCC/ADCP作为一种作用方式可用于治疗各种癌症和传染病。可与本发明的抗体或抗原结合片段组合的ADCC/ADCP诱导抗体和抗体缀合物的示例性列表包括但不限于利妥昔单抗、乌妥昔单抗、马格妥昔单抗、IMGN-529、SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、达妥昔单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13和(CD20)2xCD16、厄洛替尼(Tarceva)、达雷木单抗、阿伦珠单抗、帕妥珠单抗、布妥昔单抗、埃罗妥珠单抗、替伊莫单抗、依法妥珠单抗、法勒珠单抗、奥特托珠单抗、卡罗图西单抗、依帕珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、白妥昔单抗、伊沙妥昔单抗、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奥妥珠单抗、恩司昔单抗、vedotin(Adcetris)、替坦异贝莫单抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC和阿多-曲妥珠单抗美坦新(Kadcyla)。用于此类ADCC/ADCP诱导抗体的靶抗原的示例性列表包括但不限于AMHR2、AXL、BCMA、CAIX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、Endoglin、EPHA2、EphA3、FGFR2b、叶酸受体α、岩藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受体、TA-MUC1和PSMA。
在某些实施方案中，第二抗体或其抗原结合片段诱导ADCP。仅通过举例的方式，此类抗体可以选自由以下组成的组：利妥昔单抗、乌妥昔单抗、马格妥昔单抗、IMGN-529、SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、阿伦珠单抗、替伊莫单抗、法勒珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、GM102、GSK-2857916、PankoMab-GEX、chKM-4927、MDX-1097、MOR202和MOR-208。
在其中本发明的抗体或抗原结合片段与一种或多种ADCC/ADCP诱导抗体和抗体缀合物组合的实施方案中，还可任选地将此类组合与其它治疗剂或治疗程序结合使用。在一个实施方案中，另一种治疗剂选自由以下组成的组：抗LAG3抗体或其抗原结合片段；抗APRIL抗体或其抗原结合片段；抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗VISTA抗体或其抗原结合片段；抗BTLA抗体或其抗原结合片段；抗TIM3抗体或其抗原结合片段；抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗HVEM抗体或其抗原结合片段；抗CD70抗体或其抗原结合片段；抗CD137抗体或其抗原结合片段；抗OX40抗体或其抗原结合片段；抗CD28抗体或其抗原结合片段；抗PD1抗体或其抗原结合片段；抗PDL1抗体或其抗原结合片段；抗PDL2抗体或其抗原结合片段；抗GITR抗体或其抗原结合片段；抗ICOS抗体或其抗原结合片段；抗ILT2抗体或其抗原结合片段；抗ILT3抗体或其抗原结合片段；抗ILT4抗体或其抗原结合片段；抗ILT5抗体或其抗原结合片段；以及抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗TSLP抗体或其抗原结合片段；抗IL-10抗体或其抗原结合片段；以及IL-10或聚乙二醇化的IL-10。
本发明还提供了包含本发明的抗抗SIRPα抗体或抗原结合片段中的任一种的容器或注射装置。
本发明还提供了产生本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段的方法，其包括：在有利于多核苷酸表达的条件下培养包含编码本发明的抗体(或其抗原结合片段)的重链和/或轻链的多核苷酸的宿主细胞；以及任选地，从宿主细胞和/或培养基中回收抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸存在于单个载体中。在另一个实施方案中，编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸存在于不同的载体中。
本发明还提供了治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段(任选地与其它治疗剂或治疗程序结合)。
在一个实施方案中，待治疗的受试者是人受试者。在一个实施方案中，另一种治疗剂选自由以下组成的组：抗LAG3抗体或其抗原结合片段；抗APRIL抗体或其抗原结合片段；抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗VISTA抗体或其抗原结合片段；抗BTLA抗体或其抗原结合片段；抗TIM3抗体或其抗原结合片段；抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗HVEM抗体或其抗原结合片段；抗CD70抗体或其抗原结合片段；抗CD137抗体或其抗原结合片段；抗OX40抗体或其抗原结合片段；抗CD28抗体或其抗原结合片段；抗PD1抗体或其抗原结合片段；抗PDL1抗体或其抗原结合片段；抗PDL2抗体或其抗原结合片段；抗GITR抗体或其抗原结合片段；抗ICOS抗体或其抗原结合片段；抗ILT2抗体或其抗原结合片段；抗ILT3抗体或其抗原结合片段；抗ILT4抗体或其抗原结合片段；抗ILT5抗体或其抗原结合片段；以及抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗TSLP抗体或其抗原结合片段；抗IL-10抗体或其抗原结合片段；以及IL-10或聚乙二醇化的IL-10。
本发明还提供了治疗受试者的感染或传染病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段(任选地与其它治疗剂或治疗程序结合)。在一个实施方案中，待治疗的受试者是人受试者。
在一个实施方案中，另一种治疗剂选自由以下组成的组：抗LAG3抗体或其抗原结合片段；抗APRIL抗体或其抗原结合片段；抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗VISTA抗体或其抗原结合片段；抗BTLA抗体或其抗原结合片段；抗TIM3抗体或其抗原结合片段；抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗HVEM抗体或其抗原结合片段；抗CD70抗体或其抗原结合片段；抗CD137抗体或其抗原结合片段；抗OX40抗体或其抗原结合片段；抗CD28抗体或其抗原结合片段；抗PD1抗体或其抗原结合片段；抗PDL1抗体或其抗原结合片段；抗PDL2抗体或其抗原结合片段；抗GITR抗体或其抗原结合片段；抗ICOS抗体或其抗原结合片段；抗ILT2抗体或其抗原结合片段；抗ILT3抗体或其抗原结合片段；抗ILT4抗体或其抗原结合片段；抗ILT5抗体或其抗原结合片段；以及抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗TSLP抗体或其抗原结合片段；抗IL-10抗体或其抗原结合片段；以及IL-10或聚乙二醇化的IL-10。
本发明还提供了检测样品中SIRPα肽或其片段的存在的方法，其包括使样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触，并检测抗体或片段与肽之间的复合物的存在；其中复合物的检测表明SIRPα肽的存在。
附图说明
图1描绘了商购可得的抗hSIRPα抗体与hSIRPβ1的交叉反应性以及与hSIRPαV1和hSIRPαV2的等位基因特异性结合。
图2描绘了KWAR23抗体与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1和hSIRPγ的反应性。
图3描述了抗体克隆hSIRPα.50A针对各种hSIRPα等位基因的反应性。
图4描绘了hSIRPα.50A抗体阻断重组hCD47/Fc蛋白与细胞表面表达的hSIRPα结合的能力。
图5A和图5B描绘了hSIRPα.50A抗体与原代富含人CD14+的单核细胞的结合。
图5C和图5D描绘了hSIRPα.50A抗体阻断hCD47与富含原代富含人CD14+的单核细胞的结合的能力。
图6A描绘了hSIRPα.50A抗体与原代人粒细胞的结合。
图6B描绘了在利妥昔单抗加上或减去hSIRPα.50A抗体存在的情况下原代人粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图6C描绘了在达雷木单抗加上或减去hSIRPα.50A抗体存在的情况下原代人粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图6D描绘了在阿仑珠单抗加上或减去hSIRPα.50A抗体存在的情况下原代人粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图6E描绘了在西妥昔单抗加上或减去hSIRPα.50A抗体存在的情况下原代人粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图7描绘了在指定的抗体(利妥昔单抗或达雷木单抗)加上或减去hSIRPα.50A抗体存在的情况下原代人巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图8描绘了针对hSIRPα的小鼠hSIRPα.50A和人源化hSIRPα.50A对hSIRPα/hCD47相互作用的阻断。
图9描绘了与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPα-VβC1αC2α、hSIRPα-VαC1βC2α和hSIRPα-VαC1αC2β结合的hSIRPα.50A抗体。
图10A描述了hSIRPα与hSIRPβ1IgV结构域氨基酸序列的比对。
图10B描绘了与hSIRPαV1(P74A)结合的hSIRPα.50A抗体的损失。
图11描绘了hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL和hSIRPγ的结合。
图12描绘了hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPαV3、hSIRPαV4、hSIRPαV5、hSIRPαV6、hSIRPαV8和hSIRPαV9的结合。
图13描绘了hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体阻断重组hCD47/Fc蛋白与细胞表面表达的hSIRPα结合的能力。
图14A和图14B描绘了hSIRPα.40A抗体与原代富含人CD14+的单核细胞的结合。
图14C和图14D描绘了hSIRPα.40A抗体阻断hCD47与原代富含人CD14+的单核细胞的结合的能力。
图15A描绘了hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体与原代人粒细胞的结合。
图15B描绘了在利妥昔单抗加上或减去hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体存在的情况下原代人粒细胞对Ramos细胞的吞噬作用。
图16描绘了hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体对利妥昔单抗诱导的Raji细胞吞噬作用的增强。
图17描绘了小鼠hSIRPα.40A和人源化hSIRPα.40A抗体与hSIRPα的结合。
图18描绘了在人源化hSIRPα.40A抗体变体存在的情况下对hCD47与hSIRPα的结合的阻断。
图19描绘了hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRP-VγC1βC2β、hSIRP-VβC1γC2β和hSIRP-VβC1βC2γ的结合。
图20描绘了与hSIRPαV1(P74A)结合的hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体的损失。
图21描绘了嵌合hSIRPα.40A抗体变体影响利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
图22描绘了人源化hSIRPα.40A抗体变体影响利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
图23A描述了小鼠hSIRPα.50A和嵌合hSIRPα.50A hIgG2和hIgG4抗体变体影响利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
图23B描述了嵌合hSIRPα.50A hIgG2和hIgG4抗体变体影响利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
图23C描绘了嵌合hSIRPα.50AIgG2和hIgG4抗体变体影响达雷木单抗介导的吞噬作用的能力。
图23D描绘了小鼠hSIRPα.50A和嵌合hSIRPα.50A hIgG2抗体变体影响粒细胞中利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
图24A描绘了小鼠hSIRPα.50A和嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A.hIgG4.N297Q或hSIRPα.50A.hIgG2抗体变体影响利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
图24B描绘了小鼠hSIRPα.50A和嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A.hIgG4.N297Q或hSIRPα.50A.hIgG2抗体变体影响达雷木单抗介导的吞噬作用的能力。
图25描绘了嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50AhIgG1.L234A.L235A.P329G和hSIRPα.50A hIgG2或hIgG4抗体变体影响利妥昔单抗介导的吞噬作用的能力。
具体实施方式
缩写
在本发明的详细描述和实施例中，将使用以下缩写：
ADCC 抗体依赖性细胞的细胞毒性
ADCP 抗体依赖性细胞吞噬作用
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 使用Kabat编号系统定义的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
CHO 中国仓鼠卵巢
EC50 在其下观察到总结合信号的50％的浓度
ELISA 酶联免疫吸附测定
FR 抗体框架区：除CDR区外的免疫球蛋白可变区。
HRP 辣根过氧化物酶
IFN 干扰素
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)开创的免疫球蛋白比对和编码系统
mAb或Mab或MAb 单克隆抗体
SEB 葡萄球菌属(素Staphylococcus)肠毒素B
TT 破伤风类毒素
V区 在不同抗体之间顺序可变的Ig链的区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的113。
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
VL 免疫球蛋白轻链可变区
定义
为了使本发明更容易理解，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文的其它地方特别定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文中(包括所附权利要求书)所用，除非上下文另外明确指出，单词的单数形式，诸如“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括其对应的复数引用。
“施用”和“治疗”，当其用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物液时，是指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物液的接触。细胞的处理包括剂与细胞的接触以及剂与液体的接触，其中所述液体与细胞接触。“施用”和“治疗”还指例如剂、诊断、结合化合物或另一细胞对细胞的体外和离体治疗。
“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”意指向具有一种或多种疾病症状或被怀疑患有疾病的受试者或患者内部或外部施用治疗剂(诸如含有本发明的任何抗体或抗原结合片段的组合物)，所述剂对于所述疾病具有治疗活性。通常，以有效减轻被治疗的受试者或人群中的一种或多种疾病症状的量施用所述剂，无论是通过以任何临床可测量的程度诱导一种或多种此类症状的消退还是抑制其进展。有效减轻任何特定疾病症状的治疗剂的量可以根据诸如疾病状态、患者的年龄和体重以及药物在受试者中引发期望的响应的能力等因素而变化。可通过由医师或其它熟练的医疗保健提供者通常使用的任何临床测量来评估疾病症状是否得到缓解，以评估该症状的严重程度或进展状态。
蛋白质的“重组表达”意指外源基因在宿主生物中的转录和翻译以产生在本文中称为“重组蛋白质”的蛋白质。
SIRPα和相关蛋白
SIRPα属于一类称为“配对受体”的膜蛋白，其包含几个编码具有类似细胞外区域但具有相反(激活或抑制)信号传导能力的不同跨膜和/或细胞质区域的蛋白(例如，SIRPα、SIRPβ1和SIRPγ)的基因。与SIRPα一样，NK细胞和髓样细胞上有成对受体的几个例子，包括SIRP和CD200受体家族(Hatherley等,Mol Cell.2008；31:266-277)。
SIRPα包含细胞外区域，该区域可细分为三个独立的结构域：Ig样(免疫球蛋白样)V型(IgV)、Ig样C1型(IgC1)和Ig样C2型(IgC2)结构域。IgV结构域也称为SIRPα的配体结合N端结构域。与SIRPα一样，相关蛋白SIRPβ1和SIRPγ包含细胞外区域，其可细分为IgV、IgC1和IgC2结构域。然而，SIRPα、SIRPβ1和SIRPγ具有不同的胞质区域。SIRPβ1具有仅6个氨基酸的非常短的胞质区域，并且缺乏与磷酸酶缔合的信号传导基序。相反，该蛋白与DNAX激活蛋白12(DAP12)缔合，所述DAP12是二聚体衔接蛋白，其可结合SIRPβ1的跨膜区中具有碱性侧链的氨基酸，并且能够通过其免疫受体的基于酪氨酸的激活基序(ITAM)传递激活信号。SIRPγ还具有4个氨基酸的短的细胞质区域，但其在跨膜区域中缺少带电荷的氨基酸侧链，因此不与DAP12缔合。因此，将SIRPγ注释为非信号传导蛋白(Barclay,A.N.和Brown,M.H.,Nat Rev Immunol.2006；6:457-464)。
SIRPα的主要配体是CD47，其由一个细胞外IgV结构域、五次跨膜跨越结构域(fivetimes transmembrane-spanning domain)和短的胞质尾部组成。CD47充当具有通过SIRPα的NH2末端IgV结构域介导的结合的细胞配体。CD47有助于自我识别的证据来自以下观察结果：源表达CD47的小鼠的脾巨噬细胞清除了来自CD47-/-小鼠的输注血细胞(Oldenborg等，Science.2000；288:2051-2054)。
除了CD47以外，还报道了两种其它SIRPα配体，称为表面活性剂蛋白A和D(Sp-A和Sp-D)，两者均属于胶原凝集素家族。据报道，Sp-D以钙和糖依赖性方式与SIRPα的膜近端IgC2结构域结合。据认为，Sp-A和Sp-D可通过刺激肺泡巨噬细胞上的SIRPα来帮助维持肺部的抗炎环境(Gardai等，Cell.2003；115:13-23)。
8种人SIRPα变体的氨基酸序列列于SEQ ID NO:34、36、44、46、48、50、52和54中；编码这些变体的示例性核酸序列分别列于SEQ ID NO:33、35、43、45、47、49、51和53中。
为了比较，将人SIRPβ1和SIRPγ的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:38和40中，并且示例性核酸分别列于SEQ ID NO:37和39中。
人CD47的氨基酸序列列于SEQ ID NO:42中，并且示例性核酸列于SEQ ID NO:41中。
下文中论述的经修饰的SIRPα多肽hSIRPα-VβC1αC2α、hSIRPα-VαC1βC2α、hSIRPα-VαC1αC2β和hSIRPαV1(P74A)分别列于SEQ ID NO:56、58、60和62中；编码这些变体的示例性核酸序分别列于SEQ ID NO:55、57、59和61中。
抗SIRPα抗体及其抗原结合片段
本发明提供了结合人SIRPα的抗体或其抗原结合片段，以及此类抗体或片段的用途。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体是分离的。
抗体是否与多肽序列(例如人SIRPα、hSIRPβ1等)特异性结合可使用本领域已知的任何测定来确定。本领域已知的用于测定结合亲和力的测定法的实例包括表面等离振子体共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)。
如本文中所用，术语“抗体”是指表现出所需生物学活性的任何形式的抗体。术语抗体包括保持结合抗原的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也通过引用包括在术语“抗体”中。优选治疗性抗体是完整的IgG抗体。如本文中所用，术语“完整的IgG”是指属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人中，该类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG类抗体中的已知Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
本发明包括抗SIRPα抗原结合片段及其使用方法。
如本文中所用，就IgG而言，“全长抗体”是包含两条重链和两条轻链的二价分子。每条重链包含VH结构域，接着恒定结构域(CH1)、铰链区和另外两个恒定结构域(CH2和CH3)；每条轻链包含VL结构域和一个恒定(CL)域。在IgM的情况下，全长抗体是包含5或6个连接的免疫球蛋白的十价或十二价分子，其中免疫球蛋白的每个单体具有由重链和轻链形成的两个抗原结合位点。
如本文中所用，除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即，保留与全长抗体所结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
本发明包括抗SIRPαFab片段及其使用方法。“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是抗体的木瓜蛋白酶切割产物。
本发明包括抗SIRPα抗体和其包含Fc区的抗原结合片段及其使用方法。“Fc”区含有两个重链片段，所述重链片段包含抗体的CH3和CH2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
本发明包括抗SIRPαFab’片段及其使用方法。“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的部分或片段，所述重链的部分或片段包含VH结构域和CH1结构域以及CH1与CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab'片段的两个重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
本发明包括抗SIRPαF(ab’)2片段及其使用方法。"F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，所述重链含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，所述两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键结合在一起。“F(ab')2片段”可以是抗体的胃蛋白酶切割产物。
本发明包括抗SIRPαFv片段及其使用方法。“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
本发明包括抗SIRPαscFv片段及其使用方法。术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag,New York，第269-315页。另见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和5,260,203号。
本发明包括抗SIRPα结构域抗体及其使用方法。“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
本发明包括抗SIRPα二价抗体及其使用方法。“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(见下文)。
本发明包括抗SIRPα双链抗体及其使用方法。如本文中所用，术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段与同一条多肽链中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双链抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中。双抗体(Duobodies)描述于Labrijn等，2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13):5145-5150中。有关工程化抗体变体的综述，通常参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
通常，当以摩尔为基础表达该活性时，以某种方式修饰的本发明的抗体或抗原结合片段保留其结合活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高的作为亲本抗体的SIRPα结合亲和力。本发明的抗体或抗原结合片段还意图可包括基本上不改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
本发明包括分离的抗SIRPα抗体和其抗原结合片段以及其使用方法。在本文中，术语“分离的”无意指此类生物分子的完全不存在，或无意指水、缓冲液或盐的不存在或无意指包括抗体或片段的药物制剂的组分。“分离的”抗体、抗原结合片段、核酸等是已经从其天然环境的一种或多种组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。在优选实施方案中，将抗体、抗原结合片段、核酸等纯化至75重量％或更多，更优选至90重量％或更多，仍然更优选至95重量％或更多，仍然更优选至98重量％或更高。因此，“分离的”生物分子至少部分地不含来自产生它们的细胞或细胞培养物中的其它生物分子。此类生物分子包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其它材料诸如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体或抗原结合片段还可至少部分地不含表达系统组分，诸如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。
本发明包括抗SIRPα嵌合抗体(例如，人恒定结构域/小鼠可变结构域)及其使用方法。如本文中所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中所述第一和第二抗体来自不同物种。(美国专利第4,816,567号；以及Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。通常，可变结构域获自实验动物(诸如啮齿动物)的抗体(“亲本抗体”)，而恒定结构域序列获自人抗体，使得所得嵌合抗体相比于亲本(例如，小鼠)抗体将不太可能引发人受试者的不利免疫响应。
本发明包括抗SIRPα人源化抗体和其抗原结合片段(例如，已被人源化的大鼠或小鼠抗体)及其使用方法。如本文中所用，术语“人源化抗体”是指包含来自人和非人(例如，小鼠或大鼠)抗体的序列的抗体形式。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的可变结构域，以及所有或基本上所有框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可任选地包含人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。有关人源化抗体的更多细节，参见，例如，Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等，Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)；以及Clark,Immunol.Today 21:397-402(2000)。
一般地，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”(约25kDa)一条“重”链(50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，人轻链被分为κ和λ轻链。此外，人重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个以上的氨基酸的“D”区。通常参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.编辑，第2版Raven Press,N.Y.(1989)。
每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整的抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中外，两个结合位点通常相同。
通常，重链和轻链的可变结构域均包含位于相对保守的框架区(FR)的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过框架区对齐，从而使得能够与特定表位结合。通常，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等；NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD；第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等，(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等，(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等，(1989)Nature 342:878-883的定义将氨基酸分配给每一个结构域。
如本文中所用，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体或其抗原结合片段的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(即，轻链可变结构域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变结构域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。参见Kabat等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(通过序列定义抗体的CDR区)；另见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。如本文中所用，术语“框架”或“FR”残基是指除本文定义为CDR残基的高变区残基外的那些可变结构域残基。
“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”意指这样的基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其某种组合，其不与所述分离的多核苷酸天然地存在于其中的多核苷酸的全部或部分结合，或与不与其天然连接的多核苷酸连接。为了本公开的目的，应当理解，“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不包括完整的染色体。除以特定序列以外，“包含”所述特定核酸序列的分离的核酸分子可包括多达10个或甚至多达20个或更多个其它蛋白质或其部分或片段的编码序列，或可包括可操作地连接的调控序列(其控制所引述的核酸序列的编码区表达)，和/或可包括载体序列。
短语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸或多核苷酸与另一核酸序列处于功能性关系时，其被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该序列可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地与其连接；或者如果核糖体结合位点被定位成促进翻译，则其被可操作地连接至编码序列。通常，但并非总是如此，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
如本文中所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称均包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和从其衍生而与转移次数无关的培养物。还应理解，由于有意或无意的突变，并非所有后代都具有完全相同的DNA含量。包括具有与原始转化细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的经突变的后代。如果打算使用不同的名称，则可根据上下文清楚地看出。
如本文中所用，“种系序列”是指非重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用非重排的免疫球蛋白序列的任何合适来源。人种系序列可例如从美国国立卫生研究院的国立关节炎和肌肉骨骼与皮肤病研究所的网站上的JOINSOLVER种系数据库获得。可以例如如Giudicelli等(2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261中所述获得小鼠种系序列。
示例性抗SIRPα抗体的物理和功能特性
本发明提供了具有特定结构和功能性质的抗SIRPα抗体及其抗原结合片段，以及该抗体或其抗原结合片段在治疗或预防疾病(例如，癌症或传染病)中的使用方法。
如上所述，与本发明的任何抗SIRPα抗体或其抗原结合片段结合相同表位的抗体和片段也形成本发明的一部分。在一个实施方案中，本发明提供了与包含以下重链序列/轻链序列(或在每种情况下与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸序列)的组合之一的抗体结合人SIRPα的相同表位的抗体或其抗原结合片段：
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L1)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L2)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L3)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L4)
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H1L5)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L1)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L2)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L3)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L4)
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H2L5)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L1)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L2)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L3)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L4)
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H3L5)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L1)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L2)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L3)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L4)
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H4L5)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:20(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L1)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L2)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:24(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L3)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:26(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L4)
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:28(在本文中称为hSIRPα.50A.H5L5)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L1)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L2)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L3)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L4)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L5)
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H1L6)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L1)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L2)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L3)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L4)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L5)
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H2L6)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L1)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L2)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L3)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L4)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L5)
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H3L6)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L1)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L2)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L3)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L4)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L5)
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H4L6)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L1)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L2)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L3)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L4)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L5)
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H5L6)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:90(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L1)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:92(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L2)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:94(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L3)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:96(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L4)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:98(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L5)
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:100(在本文中称为hSIRPα.40A.H6L6)。
有几种方法可用于将抗体表位定位在靶抗原上，包括：H/D-Ex质谱、交联偶联质谱、X射线晶体学、肽扫描分析和定点诱变。例如，与蛋白水解和质谱联用的HDX(氢氘交换)可用于确定特定抗原Y上的抗体的表位。HDX-MS依赖于抗原在只有其自身在D2O中孵育和在其抗体在不同时间间隔存在的情况下在D2O中孵育时的氘掺入程度的准确测量和比较。氘与暴露区域中的蛋白质酰胺主链上的氢交换，而与抗体结合的抗原区域将受到保护，并且在通过LC-MS/MS分析蛋白水解片段后，将显示较少交换或没有交换。交联与质谱联用始于将抗体和抗原与质量标记的化学交联剂结合。接下来，使用高质量MALDI检测确认复合物的存在。因为在交联化学之后，Ab/Ag复合物非常稳定，所以可将多种酶和消化条件应用于复合物以提供许多不同的重叠肽。使用高分辨率质谱和MS/MS技术对这些肽进行鉴定。使用与交联剂连接的质量标签确定交联肽的身份。在MS/MS片段化和数据分析后，在同一实验中确定了表位和互补位。
本发明的范围还包括分离的抗SIRPα抗体及其抗原结合片段(例如，人源化抗体)，其包含本文所示的免疫球蛋白链的变体，其中所述变体表现出以下性质中的一种或多种：
结合具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1蛋白，其中EC50<1nM；并且针对具有SEQID NO:62的序列的SIRPαV1(P74A)表现出高至少100倍的EC50；并且任选地针对具有SEQ IDNO:38的序列的人SIRPβ1蛋白也表现出高至少100倍的EC50(在其中降低的EC50是相对于针对具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1蛋白的EC50的每种情况下，以及在优选当通过如下文所述的细胞ELISA(CELISA)测量时的每种情况下)；
与表达人SIRPαV1蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至更优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
与表达人SIRPαV2蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至最优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
在50nM，优选67nM，更优选100nM的抗体浓度下，或者在为抗体针对SIRPαV1或SIRPαV2的EC50的10倍，优选50倍，更优选100倍，且仍然更优选200倍的浓度下不与SIRPβ1蛋白明显地结合；
抑制人SIRPα与CD47之间的结合，其中IC50<10.0nM，更优选<5.0nM，仍然更优选<2.5nM，最优选约1.0nM或更低；以及
表现出至少79，更优选85％的T20“人源性”评分。
在其它实施方案中，本发明提供了结合人SIRPα(例如，人源化抗体)并且具有与以下序列具有至少90％序列同一性的VH结构域和VL结构域的抗体或其抗原结合片段：SEQ IDNO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30；以及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32。在其它实施方案中，本发明提供了结合人SIRPα(例如，人源化抗体)并且具有与以下序列具有至少95％序列同一性的VH结构域和VL结构域的抗体或其抗原结合片段：SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30；以及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32。在其它实施方案中，本发明提供了结合人SIRPα(例如，人源化抗体)并且具有与以下序列具有至少97％序列同一性的VH结构域和VL结构域的抗体或其抗原结合片段：SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30；以及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32。在其它实施方案中，本发明提供了结合人SIRPα(例如，人源化抗体)并且具有与以下序列具有至少98％序列同一性的VH结构域和VL结构域的抗体或其抗原结合片段：SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30；以及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32。在其它实施方案中，本发明提供了结合人SIRPα(例如，人源化抗体)并且具有与以下序列具有至少99％序列同一性的VH结构域和VL结构域的抗体或其抗原结合片段：SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30；以及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32。优选地，在每种情况下，SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30以及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32与变体之间的序列差异由保守取代组成，并且优选地限定于框架残基内的取代。
以下参考文献涉及通常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Camacho,C.等(2009):BMC Bioinformatics 10:421；Altschul等(2005)FEBS J.272(20):5101-5109；Altschul,S.F.等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等，(1993)NatureGenet.3:266-272；Madden,T.L.等，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等，(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等，(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等，(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等，"Amodelof evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequence andStructure,(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(编辑)，第345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等，"Matrices for detectingdistant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷，增刊3.”M.O.Dayhoff(编辑)，第353-358页，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等，(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.等，(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877；Dembo,A.等，(1994)Ann.Prob.22:2022-2039和Altschul,S.F."Evaluatingthe statistical significance of multipledistinct local alignments."inTheoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai，编辑),(1997)第1-14页，Plenum,New York。在本申请中，同一性百分比比较优选地通过BLAST算法执行，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配(例如，期望阈值：10；字长：6；查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；空位成本：存在11，扩展1；条件成分评分矩阵调整)。
“保守修饰的变体”或“保守取代”是指蛋白质中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得通常可以在不改变蛋白质生物活性的情况下进行所述改变。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本不会改变生物活性(参见，例如，Watson等(1987)MolecularBiology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版))。另外，结构或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。下表1列出了示例性的保守取代。
表1.示例性保守氨基酸取代
原始残基 保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
本发明还设想了本发明抗体的功能保守变体。如本文中所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被改变但未改变期望的性质的抗体或片段。此类变体包括但不限于具有相似特性的氨基酸对氨基酸的替换，诸如表1中的保守氨基酸替换。还提供了包含本发明的抗SIRPα抗体的VL结构域(例如，SEQ ID NO:76、90、92、94、96、98、100、8、20、22、24、26、28和32)的分离的多肽，以及包含本发明的抗SIRPα抗体的VH结构域(例如，SEQID NO:75、78、80、82、84、86、88、7、10、12、14、16、18和30)的分离的多肽，所述VH结构域具有多至0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸取代，优选保守取代。
本发明还包含编码本发明的抗SIRPα抗体及其抗原结合片段的任何多肽或免疫球蛋白链的多核苷酸。例如，本发明包括编码SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18和30以及SEQ ID NO:76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28和32中的任一个中所述的氨基酸的多核苷酸。
在一个实施方案中，提供了编码本文所示的分离的抗体或抗原结合片段的多肽链的分离的多核苷酸，例如DNA。在一个实施方案中，分离的多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个根据本发明的成熟免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域和/或至少一个根据本发明的成熟免疫球蛋白重链可变(VH)结构域。在一些实施方案中，分离的多核苷酸在单个多核苷酸分子上编码轻链和重链，在其它实施方案中，在分开的多核苷酸分子上编码轻链和重链。在另一个实施方案中，多核苷酸还编码信号序列。
本发明还提供了载体，例如包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，诸如质粒，其中当用载体转染宿主细胞时，该多核苷酸与被宿主细胞识别的控制序列可操作地连接。还提供了包含本发明载体的宿主细胞和用于产生本文公开的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，包括在培养基中培养具有表达载体或编码抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的核酸的宿主细胞，并从宿主细胞或培养基中分离抗原或其抗原结合片段。
结合亲和力
通过举例而非限制的方式，本文公开的抗体和抗原结合片段可以二价地结合人SIRPα，其中如通过表面等离振子体共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如KinExa或生物层干涉仪(OCTET))所测定的，KD值为10x 10-9M或更低。在一个实施方案中，本文公开的抗体和抗原结合片段可以二价地结合人SIRPα，其中如通过表面等离振子体共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)所测定的，KD值为为约5-10x 10-9M。将亲和力计算为KD＝koff/kon(koff是解离速率常数，Kon是缔合速率常数，KD是平衡常数)。可在平衡时通过在各种浓度(c)下测量标记配体的结合评分(r)来测定亲和力。使用Scatchard方程式：r/c＝K(n-r)绘制数据：其中，r＝平衡时结合的配体的摩尔数/受体的摩尔数；c＝平衡时游离配体的浓度；K＝平衡缔合常数；n＝每个受体分子的配体结合位点数。通过图形分析，将r/c绘制在Y轴上，而r绘制在X轴上，从而生成Scatchard图。通过Scatchard分析的抗体亲和力测量是本领域公知的。参见，例如，van Erp等，J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson和Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988。
人源性(Humanness)
出于本文件的目的，如Gao SH,Huang K,Tu H,AdlerAS.Monoclonal antibodyhumanness score and its applications.BMC Biotechnology.2013:13:55.doi:10.1186/1472-6750-13-55)中所述，使用T20评分分析仪来测量“人源性”，以定量单克隆抗体可变区的人源性。
基于web的工具被提供来使用T20 Cutoff Human数据库：http://abAnalyzer.lakepharma.com计算抗体序列的T20评分。在计算T20评分时，首先为输入VH、VK或VL可变区蛋白序列分配Kabat编号，并鉴定CDR残基。使用blastp蛋白质-蛋白质BLAST算法，将全长序列或仅有框架的序列(已去除CDR残基)与相应抗体数据库中的每个序列进行比较。分离每个成对比较之间的序列同一性，并且在分析了数据库中的每个序列之后，将根据与输入序列的序列同一性从高到低对序列进行排序。对前20个匹配序列的同一性百分比取平均值，以获得T20评分。
对于“全人数据库”中的每种链类型(VH、VK、VL)和序列长度(全长或仅有框架)，使用T20评分分析仪通过其各自的数据库对每种抗体序列进行评分。在排除输入序列本身后，获得了前20个匹配序列的T20评分(由于序列1始终是输入抗体本身，因此对序列2至21的同一性百分比进行了平均)。将每个组的T20评分从高到低排序。对于大多数序列，评分的下降大致是线性的。然而，最低～15％的抗体的T20评分开始急剧下降。因此，删除了序列底部的15％，其余序列形成了T20 Cutoff Human数据库，其中T20评分截止值表示新数据库中序列的最低T20评分。
如本文中所用，“人”抗体是具有至少79％，更优选至少85％的T20人源性评分的抗体。
抗hSIRPα抗体阻断与CD47结合的能力
在一些实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段能够阻断人SIRPα与人CD47的结合。可使用本领域已知的任何方法来测定阻断人SIRPα与人CD47结合的能力。在一个实施方案中，使用ELISA测定法测定抗体阻断人SIRPα与人CD47结合的能力。
制备抗体及其抗原结合片段的方法
因此，本发明包括制备本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段的方法，包括在有利于此类表达的条件下培养表达该抗体或片段的杂交瘤细胞，以及任选地从杂交瘤和/或生长培养基(例如细胞培养基)分离该抗体或片段。
本文公开的抗SIRPα抗体也可以重组产生(例如，在大肠埃希氏菌/T7表达系统、哺乳动物细胞表达系统或低等真核表达系统中)。在该实施方案中，可将编码本发明的抗体免疫球蛋白分子(例如，VH或VL)的核酸插入基于pET的质粒中，并在大肠埃希氏菌/T7系统中表达。例如，本发明包括用于在宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，诸如大肠埃希氏菌，诸如BL21或BL21DE3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，包括在细胞中表达T7RNA聚合酶，所述细胞还包含与T7启动子可操作连接的编码免疫球蛋白链的多核苷酸。例如，在本发明的实施方案中，细菌宿主细胞，诸如大肠埃希氏菌，包含与lac启动子可操作地连接的编码T7 RNA聚合酶基因的多核苷酸，并且通过用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)孵育宿主细胞来诱导该聚合酶和链的表达。
存在几种本领域已知的籍以产生重组抗体的方法。美国专利第4,816,567号中公开了一个用于重组产生抗体的方法的实例。
转化可通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法进行。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域公知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、一种或多种多核苷酸在脂质体中的包封、生物射弹注射(biolistic injection)和DNA至细胞核中的直接显微注射。另外，可通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞。转化细胞的方法是本领域公知的。参见例如，美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号和4,959,455号。
因此，本发明包括用于制备本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，其包括引入编码所述抗体或片段的一个或多个免疫球蛋白链(例如，重和/或轻免疫球蛋白链)的多核苷酸；在有利于这种表达的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母属(Pichia)或巴斯德毕赤酵母)，以及任选地从宿主细胞和/或生长宿主细胞的培养基中分离抗体或片段或链。
抗SIRPα抗体还可通过美国专利第6,331,415号中所示的任何方法来合成。
作为用于表达本文公开的抗体或片段或免疫球蛋白链的真核和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞)是本领域公知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些细胞系，除其它以外，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪此细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可使用的其它细胞系是昆虫细胞系诸如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、考拉姆毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichiaminuta)(微小毕赤酵母(Ogataea minuta)、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌有孢毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热克鲁维酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤氏酵母(Pichia salictaria)、松栋毕赤酵母(Pichia guercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichiapijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属某种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌属某种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属某种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candidaalbicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属某种(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusariumgramineum)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属某种(Pichia sp.)、任何酵母属某种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、任何克鲁维酵母属某种(Kluyveromyces sp.)、白色假丝酵母、任何曲霉菌属某种(Aspergillus sp.)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰刀菌属某种(Fusarium sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉孢菌。当将编码重链或其抗原结合部分或片段和/或其轻链或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体或片段或链在宿主细胞中表达或分泌到其中生长宿主细胞的培养基中的一段时间来产生抗体。
可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链。另外，可使用多种已知技术来增强从生产细胞系表达本发明的抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链(或来自其的其它部分)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在某些条件下增强表达的常用方法。结合欧洲专利第0216846号、第0256055号以及第0323997号和第0338841号整体或部分地讨论了GS系统。因此，在本发明的实施方案中，哺乳动物宿主细胞(例如,CHO)缺乏谷氨酰胺合成酶基因，并且将其在培养基中不存在谷氨酰胺的情况下生长，然而，其中编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含谷氨酰胺合成酶基因，这互补了充宿主细胞中该基因的缺乏。
本发明包括用于纯化本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将包含抗体或片段的样品引入纯化介质(例如，阳离子交换介质、阴离子交换介质、疏水性交换介质、亲和纯化介质(例如,蛋白-A、蛋白-G、蛋白-A/G、蛋白-L))，并从所述样品的不与介质结合的流通级分中收集纯化的抗体或片段；或者，弃去流通级分，并从介质中洗脱结合的抗体或片段，并收集洗脱物。在本发明的实施方案中，所述介质存在于向其施加样品的柱中。在本发明的实施方案中，在于宿主细胞中重组表达抗体或片段后进行纯化方法，例如，其中首先裂解宿主细胞，并且任选地，将裂解物从不溶性物质中纯化出来，然后在介质上进行纯化。
通常，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有为在细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白的特征的糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体均独立于抗体可能具有的糖基化模式而构成本发明。类似地，在特定实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化的N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为在体外和体内，均已显示这些抗体通常表现出比其岩藻糖基化的对应物更强效的功效(参见例如Shinkawa等，J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利第6,946,292号和第7,214,775号)。这些具有非岩藻糖基化的N聚糖的抗体不太可能具有免疫原性，因为它们的糖类结构是存在于人血清IgG中的群体的正常组分。
本发明包括对SIRPα和另一种抗原具有结合特异性的双特异性和双功能抗体和抗原结合片段及其使用方法，所述另一种抗原是诸如，例如CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD117、CD123、c-Met、CEA、EGFR、EpCAM、HER2、HER3、PSMA、PTHR2、间皮素、PD-1、PD-L1、TIM3。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法(包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接)产生。参见，例如，Songsivilai等，(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321,Kostelny等，(1992)J Immunol.148:1547-1553。另外，可将双特异性抗体形成为“双链抗体”(Holliger等，(1993)PNAS USA 90:6444-6448)或"Janusins"(Traunecker等，(1991)EMBO J.10:3655-3659和Traunecker等，(1992)Int.J.Cancer增刊7:51-52)。包括了“双抗体”，其为具有正常IgG结构的双特异性抗体(Labrijn等，2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13):5145-5150)。
本发明还包括本文公开的抗SIRPα抗体的抗SIRPα抗原结合片段。抗体片段包括F(ab)2片段，其可通过例如胃蛋白酶酶切IgG而产生。Fab片段可通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2来产生。
免疫球蛋白可根据其重链恒定结构域的氨基酸序列分为不同的类别。在一些实施方案中，可将不同的恒定结构域附加至从本文提供的CDR衍生的人源化的VL和VH区。免疫球蛋白至少有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。本发明包括抗体的这些类别或亚类中的任一种的抗体和抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如人恒定区，诸如γ1个、γ2个、γ3个或γ4个人重链恒定区或其变体。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，诸如λ或κ人轻链区或其变体。例如但不限于，人重链恒定区可以是γ4，并且人轻链恒定区可以是κ。在替代实施方案中，抗体的Fc区是具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman，J等，Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含IgG1亚型的重链恒定区。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含IgG2亚型的重链恒定区。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含IgG4亚型的重链恒定区。
抗体工程化
还包括其中抗SIRPα抗体及其抗原结合片段是工程化抗体，以包括对抗体的可变结构域内的框架残基的修饰，例如以改善抗体或片段的特性的实施方案。通常，进行此类框架修饰以降低抗体或片段的免疫原性。这通常通过用来自将在其中使用抗体的物种的免疫库的类似残基(例如在人治疗剂的情况下为人残基)替换亲本(例如啮齿类动物)抗体或片段的可变结构域中的非CDR残基(即框架残基)来实现。这样的抗体或片段被称为“人源化”抗体或片段。在一些情况下，需要增加亲和力或改变工程化(例如人源化)抗体的特异性。一种方法是将一个或多个框架残基突变为相应的种系序列。更具体地，经历了体细胞突变的抗体或片段可包含框架残基，所述框架残基与抗体所源自的种系序列不同。可通过将抗体或片段的框架序列与所述抗体或片段所源自的种系序列进行比较来鉴定此类残基。另一种方法是在工程化(例如人源化)抗体的一个或多个位置还原为原始亲本(例如啮齿动物)残基，例如以恢复在替换框架残基的过程中可能已经失去的结合亲和力。(参见，例如，美国专利第5,693,762号，美国专利第5,585,089号和美国专利第5,530,101号)。
在某些实施方案中，将抗SIRPα抗体及其抗原结合片段工程化(例如人源化)以在框架和/或CDR中包含修饰来改善其性质。此类工程变化可基于分子建模。可构建亲本(非人)抗体序列的可变区的分子模型以了解抗体的结构特征，并用于鉴定抗体上可以与抗原相互作用的潜在区域。常规CDR基于免疫球蛋白序列的比对和鉴定可变区。Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等；National Institutesof Health,Bethesda,MD；第5版；NIH Publ.No.91-3242；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等，(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616.Chothia及其同事仔细检查了抗体的晶体结构中环的构象，并提出了高变环。Chothia等，(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等，(1989)Nature 342:878-883。在分类为“CDR”和“高变环”的区域之间存在差异。后来的研究(Raghunathan等，(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)分析了几种抗体-抗原晶体复合物，发现抗体中的抗原结合区不一定严格符合“CDR”残基或“高变”环。非人抗体可变区的分子模型可用于指导可潜在地与抗原结合的区域的选择。实际上，基于模型的潜在抗原结合区不同于常规“CDR”或“高变”环。诸如Discovery Studio(BIOVIA,DassaultSystems))之类的商业科学软件可用于分子建模。可基于在框架和CDR中与非人序列的最佳匹配来选择人框架。对于VH中的FR4(框架4)，将人种系的VJ区域与相应的非人区域进行比较。在VL中的FR4(框架4)的情况下，将人种系序列的J-κ和J-λ区域与相应的非人区域进行比较。一旦鉴定出合适的人框架，就将CDR移植到所选的人框架中。在一些情况下，可以如在非人(亲本)序列中一样保留VL-VH界面中的某些残基。分子模型也可用于鉴定可以潜在改变CDR构象并因此与抗原结合的残基。在一些情况下，如在非人(亲本)序列中一样保留这些残基。分子模型也可用于鉴定暴露于溶剂的氨基酸，所述氨基酸可导致不想要的效应诸如糖基化、脱酰胺和氧化。可在设计阶段的早期就引入可展性过滤器(Developabilityfilter)，以消除/最小化这些潜在问题。
框架修饰的另一种类型涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“脱免疫”，并在美国专利第7,125,689号中进行了进一步地详细描述。
在特定的实施方案中，期望将某些含有暴露的侧链的氨基酸改变为另一个氨基酸残基，以便提供最终抗体的更大的化学稳定性，从而避免脱酰胺或异构化。天冬酰胺的脱酰胺作用可发生在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上，并导致异天冬氨酸残基的产生，所述异天冬氨酸残基将纽结引入多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。异构化可发生在DG、DS、DA或DT序列上。在某些实施方案中，本公开的抗体不含脱酰胺或天冬酰胺异构位点。
例如，可将天冬酰胺(Asn)残基改变为Gln或Ala以降低在任何Asn-Gly序列上，特别是在CDR内形成异天冬氨酸的可能性。类似的问题可以发生在Asp-Gly序列上。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:1281。异天冬氨酸形成可使抗体与其靶抗原的结合变弱或完全消除。参见，Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731at 734。在一实施方案中，将天冬酰胺变为谷氨酰胺(Gln)。还可能需要改变与天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基相邻的氨基酸，以减少脱酰胺的可能性，当小氨基酸与天冬酰胺或谷氨酰胺相邻时，脱酰胺的发生率更高。参见，Bischoff&Kolbe(1994)J.Chromatog.662:261。另外，可将CDR中的任何甲硫氨酸残基(通常为暴露于溶剂的Met)改变为Lys、Leu、Ala或Phe或其它氨基酸，以便减少甲硫氨酸的硫被氧化的可能性，这可降低抗原结合亲和力并且还促成最终抗体制剂中的分子异质性。Id.另外，为了防止或最小化潜在的易切断的Asn-Pro肽键，可能需要将存在于CDR中的任何Asn-Pro组合改变为Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类取代的抗体，以确保所述取代不会将抗体对SIRPα的亲和力或特异性或其它所需生物活性降低至不可接受的水平。
表2.示例性稳定CDR变体
框架修饰的另一种类型涉及使框架区域内的一个或多个残基突变以防止聚集。可使用空间聚集倾向来评估抗体聚集的风险-参见，Chennamsetty，N等(2010)J.Phys.Chem.114,6614-6624。该方法需要计算每个原子的溶剂可及面积(SAA)。然后将分子聚集评分计算为所有原子评分的总和。对于给定的分子半径和大小，这是其总体聚集趋势的近似指示。用具有较低评分的残基(例如，亲水性更高的氨基酸)替换具有高聚集评分的残基。
Fc区的抗体工程化
本文公开的抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段也可以被工程化以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种性质，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞的细胞毒性)。此外，本文公开的抗体及其抗原结合片段可被化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接至抗体)或修饰以改变其糖基化，再次改变抗体或片段的一种或多性质。这些实施方案中的每一个在下面进一步详细描述。Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引编号。
本文公开的抗体及其抗原结合片段还包括具有修饰的(或封闭的)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体和片段。参见，例如，美国专利第5,624,821号；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种响应，在诊断和治疗中可能具有有益作用。Fc区的改变包括氨基酸变化(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc区。对Fc的改变还可改变治疗性抗体的抗体半衰期，使得能够减少给药频率，从而增加便利性并减少材料的使用。参见，Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol.116:731,734-35。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是IgG4同种型抗体或片段，其在对应于重链恒定区的铰链区中的位置228(S228P；EU索引；SEQ ID NO:66)的位置处包含丝氨酸至脯氨酸的突变。据报道这种突变消除了铰链区中重链间二硫桥的异质性(Angal等(1993).Mol.Immunol.30:105-108；位置241基于Kabat编号系统)。
在本发明的一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量增加或减少。在美国专利第5,677,425号中进一步描述了该方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量，例如，以促进轻链和重链的组装或增强或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对本发明的抗体或抗原结合片段的Fc铰链区进行突变以降低抗体或片段的生物半衰期。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得相对于天然Fc-铰链域SpA结合，抗体或片段具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在美国专利第6,165,745号中更详细地描述了该方法。
在另一个实施方案中，对本发明的抗体或抗原结合片段进行修饰以延长其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，如美国专利第6,277,375号中所述，可以引入以下突变中的一种或多种突变：T252L、T254S、T256F。或者，为了增加生物半衰期，可以如美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中所述，在CH1或CL区域内改变抗体，以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获取的补救受体结合表位。
在其它实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体或抗原结合片段的一种或多种效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，以使得抗体对效应子配体的亲和力改变并且保留亲本抗体的抗原结合能力。针对其改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1成分。在美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中更详细地描述了该方法。
在另一个实例中，可用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在美国专利第6,194,551号中更详细地描述了该方法。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。在PCT公开WO 94/29351中进一步描述了该方法。
本发明的蛋白质(其优选为抗体，最优选为IgG抗体或其片段)可具有改变的(例如，相对于未修饰的抗体而言)FcγR结合特性(结合特性的例子包括但不限于，结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和缔合速率(分别为koff和kon)、结合亲和力和/或亲合力)并且某些改变或多或少是期望的。在本领域中已知平衡解离常数(KD)被定义为koff/kon，Ka是KD的倒数。
Fc区与其配体的亲和力和结合特性可通过本领域已知的用于测定Fc-FcγR相互作用(即，Fc区对FcγR的特异性结合)的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，所述体外测定方法包括但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如或分析)，以及其它方法，诸如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可在被检查的一个或多个组分上利用标记物和/或采用各种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。
在某些实施方案中，本发明的蛋白质与选自由FcγRI、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA-F158和FcγRIIIA-V158组成的组的一种或多种人FcγR结合，其中亲和力为具有野生型人IgG1重链恒定结构域(SEQ ID NO:119)Fc区或野生型人IgG4重链恒定结构域(SEQID NO:66)Fc区的等同蛋白质的至多1/10，优选至多1/30，更优选至多1/100。
在各种实施方案中，本发明的蛋白质包含免疫球蛋白Fc区域，其包含免疫球蛋白C2区和免疫球蛋白C3区以及免疫球蛋白铰链区。举例来说，免疫球蛋白Fc区可以是IgG Fc区、IgE Fc区或IgAFc区。在某些优选实施方案中，所述蛋白质包含两个免疫球蛋白Fc区，每个免疫球蛋白Fc区包含免疫球蛋白C2区和免疫球蛋白C3区以及免疫球蛋白铰链区，其中所述免疫球蛋白Fc区之一的铰链区与另外的免疫蛋白Fc区的铰链区结合以形成二聚体Fc结构。最优选地，这样的蛋白质是人或人源化IgG蛋白。
在某些实施方案中，本发明的蛋白质包含突变的IgG4 Fc区，并且优选地，该蛋白质是包含两个突变的IgG4 Fc区以形成二聚体Fc结构的IgG。举例来说，突变的IgG4 Fc区可包含表3中列举的突变或突变组合之一。该表中提及的恒定区编号系统是Kabat等(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所示的EU索引的编号系统。在该表中，第一个字母和数字代表未修饰的氨基酸及其位置，第二个字母代表在所述位置处的取代氨基酸。对于包含不止一个突变的组合的那些条目，组合中的每个突变均用“/”分隔。
表3：
在某些实施方案中，本发明的蛋白质包含突变的IgG1 Fc区，并且优选地，该蛋白质是包含两个突变的IgG1 Fc区以形成二聚体Fc结构的IgG。举例来说，突变的IgG1 Fc区可包含表4中列举的突变之一。该表中提及的恒定区编号系统是Kabat等(1991,NIHPublication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所示的EU索引的编号系统。在该表中，第一个字母和数字代表未修饰的氨基酸及其位置，第二个字母代表在所述位置处的取代氨基酸。
表4：
在某些实施方案中，突变的IgG1 Fc区可包含表5中列举的突变组合之一。该表中提及的恒定区编号系统是Kabat等(1991,NIH Publication 91-3242,National TechnicalInformation Service,Springfield,VA)中所示的EU索引的编号系统。在该表中，第一个字母和数字代表未修饰的氨基酸及其位置，第二个字母代表在所述位置处的取代氨基酸。对于每个不止一个突变的组合，组合中的每个突变均用“/”分隔，并且缺失用“Δ”表示。
表5：
在某些实施方案中，本发明的蛋白质包含野生型或经突变的IgG2 Fc区，并且优选地，该蛋白质是包含两个野生型或经突变的IgG2 Fc区以形成二聚体Fc结构的IgG。经突变的IgG2 Fc区可包含表6中列举的突变或突变组合之一。该表中提及的恒定区编号系统是Kabat等(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所示的EU索引的编号系统。在该表中，第一个字母和数字代表未修饰的氨基酸及其位置，第二个字母代表在所述位置处的取代氨基酸。对于包含不止一个突变的组合的那些条目，组合中的每个突变均用“/”分隔。
表6：
具有修饰糖基化的抗体的产生
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含特定的糖基化模式。例如，可以制备无岩藻糖基化的或无糖基化的抗体或片段(即，抗体分别缺乏岩藻糖或糖基化)。可改变抗体或片段的糖基化模式以例如增加抗体或片段对SIRPα抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可通过例如改变抗体或片段序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，所述取代导致去除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体或片段对抗原的亲和力或亲合力。参见，例如，美国专利第5,714,350号和第6,350,861号。
本文公开的抗体和抗原结合片段还可包括在低等真核生物宿主细胞中，特别是在已经过基因工程改造以产生具有哺乳动物-样或人-样糖基化模式的糖蛋白的真菌宿主细胞(诸如酵母和丝状真菌)中产生的抗体和抗原结合片段(参见例如，Choi等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027；Hamilton等，(2003)Science 301:1244-1246；Hamilton等，(2006)Science 313:1441-1443；Nett等，Yeast 28(3):237-52(2011)；Hamilton等，Curr Opin Biotechnol.18(5):387-92(2007))。这些经遗传修饰的宿主细胞相对于目前使用的哺乳动物细胞系的特殊有利方面是控制细胞中产生的糖蛋白的糖基化谱，使得可产生其中特定N-聚糖结构占主导的糖蛋白组合物的能力(参见，例如，美国专利第7,029,872号和美国专利第7,449,308号)。这些经遗传修饰的宿主细胞已用于产生主要具有特定N-聚糖结构的抗体(参见例如Li等，(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215)。
在特定实施方案中，本文公开的抗体及其抗原结合片段还包括在低等真核宿主细胞中产生的抗体，其包含岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的杂合且复合的N-聚糖，包括两分型和多触角的种类，包括但不限于N-聚糖，诸如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3Glc NAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在特定的实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段可包含具有至少一种选自由GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2组成的组的杂合N-聚糖的抗体或片段。在特定方面，杂合N-聚糖是组合物中的占主导的N-聚糖种类。
在特定的实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包括具有至少一种选自由以下组成的组的复合N-聚糖的抗体和片段：GlcN AcMan3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2Gl cNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面，复合N-聚糖是组合物中的占主导的N-聚糖种类。在其它方面，复合N-聚糖是在组合物中包含约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖的特定N-聚糖种类。在一个实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含复合N-聚糖，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖包含结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中这种结构是无岩藻糖基化的。此类结构可以例如在工程化巴斯德毕赤酵母宿主细胞中产生。
在特定的实施方案中，N-聚糖是岩藻糖基化的。通常，岩藻糖与N-聚糖的还原端处的GlcNAc处于α1,3-键联中，与N-聚糖的还原端处GlcNAc处于α1,6-键联中，与N-聚糖的非还原端处的Gal处于α1,2-键联中，与N-聚糖的非还原端处的GlcNac处于α1,3-键联中，或与N-聚糖的非还原端处的GlcNAc处于α1,4-键联中。
因此，在上述糖蛋白组合物的特定方面，糖型存在于α1,3-键联或α1,6-键联岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：Man5GlcN Ac2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcM an3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3Glc NAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；存在于α1,3-键联或α1,4-键联岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：Glc NAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或存在于α1,2-键联岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNA c2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其它方面，抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2，或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。
在上述的其它方面，复合N-聚糖还包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化的两分型和多触角的种类。
如本文中所用，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用，并且是指N-连接的寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺键联连接至多肽的天冬酰胺残基的寡糖。N-连接的糖蛋白包含与蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰基葡糖胺残基。存在于糖蛋白上的主导糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基神经氨酸(NANA))。糖基团的加工在ER内腔中与翻译同时发生，并在高尔基体中在翻译后继续进行以产生N连接的糖蛋白。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰基葡糖胺)的共同五糖核心。通常，N-聚糖结构的非还原端在左侧，还原端在右侧。N-聚糖的还原端是连接至包含蛋白质上糖基化位点的Asn残基的末端。N-聚糖之间的区别在于包含添加到Man3GlcNAc2("Man3")核心结构的外围糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角)的数量，所述核心结构也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。N-聚糖根据其分支成分(例如，复合的或杂合的高甘露糖)分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常具有至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,3-甘露糖臂的GlcNAc和至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖还可具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基，所述残基任选地可用唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)进行修饰。复合N-聚糖还可具有链内取代，其包括“两分型”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合N聚糖还可在“三甘露糖核心”上具有多个触角，通常被称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1,3-甘露糖臂的末端上具有至少一个GlcNAc，在三甘露糖核心的1,6-甘露糖臂上具有零个或更多个甘露糖。各种N-聚糖也被称为“糖型”。
对于复合N-聚糖，术语“G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1"和"A2”表示以下含义。“G-2”是指可表征为Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G-1”是指可表征为GlcNAcMan3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G0”是指可表征为GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G1”是指可表征为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G2”是指可表征为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“A1”是指可以表征为NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“A2”是指可表征为NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。除非另有说明，否则术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、“A1”和“A2”是指缺少连接至N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基的岩藻糖的N-聚糖种类。当术语包括“F”时，“F”表示N-聚糖种类在N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基上包含岩藻糖残基。例如，当G0F、G1F、G2F、A1F和A2F均表示N-聚糖还包含连接至N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基的岩藻糖残基。低等真核生物(诸如酵母和丝状真菌)通常不产生产生岩藻糖的N-聚糖。
关于多触角N-聚糖，术语“多触角N-聚糖”是指在包含N-聚糖的1,6臂或1,3臂的非还原端的甘露糖残基上还包含GlcNAc残基或者在包含N-聚糖的1,6臂和1,3臂的非还原端的每个甘露糖残基上还包含GlcNAc残基的N-聚糖。因此，多触角N-聚糖可由以下化学式表征：GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2。术语“1-4”是指1个、2个、3个或4个残基。
关于两分型N-聚糖，术语“两分型N-聚糖”是指其中GlcNAc残基与N-聚糖的还原端处的甘露糖残基连接的N-聚糖。两分型N-聚糖可由式GlcNAc3Man3GlcNAc2表征，其中每个甘露糖残基在其非还原端与GlcNAc残基连接。相反，当将多触角N-聚糖被表征为GlcNAc3Man3GlcNAc2时，该化学式表明，两个GlcNAc残基与N-聚糖的两个臂之一的非还原端处的甘露糖残基连接，并且一个GlcNAc残基与N-聚糖的另一臂的非还原端处的甘露糖残基连接。
在某些实施方案中，本发明的蛋白质包含无糖基化的Fc区。举例来说，可通过删除或取代残基N297来对IgG1 Fc区进行糖基化。
抗体的物理性质
本文公开的抗体及其抗原结合片段还可在轻链或重链免疫球蛋白可变区中包含一个或多个糖基化位点。由于改变的抗原结合，此类糖基化位点可导致抗体或片段的免疫原性增强或抗体的pK改变(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等(1985)Nature 316:452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。
每个抗体或抗原结合片段将具有独特的等电点(pI)，其通常落在6与9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7至9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI通常落在6至8的pH范围内。
每个抗体或抗原结合片段将具有特征解链温度，其中更高的解链温度表明其在体内的整体稳定性更高(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。通常，TM1(初始解折叠温度)可以高于60℃，高于65℃或高于70℃。抗体或片段的解链温度可使用差示扫描量热法(Chen等(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等(1999)Immunol Lett 68:47-52)或圆二色性(Murray等(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)来测量。
在另外的实施方案中，选择不会迅速降解的抗体及其抗原结合片段。抗体或片段的降解可使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem67:3626-32))来测量。
在另外的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体及其抗原结合片段，所述聚集效应可导致触发不希望的免疫响应和/或改变的或不利的药代动力学性质。通常，可接受的抗体和片段的聚集为25％或更少，20％或更少，15％或更少，10％或更少或5％或更少。可通过几种技术来测量聚集，所述技术包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射。
抗体缀合物
还可将本文公开的抗SIRPα抗体及其抗原结合片段与化学部分缀合。化学部分尤其可以是聚合物、放射性核苷酸或细胞毒性因子。在特定的实施方案中，化学部分是延长抗体或片段在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括但不限于亲水聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如，分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等，(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等，(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开了用PEG缀合抗体，所述PEG与放射性金属螯合剂(二亚乙基三氨基五乙酸(DTPA))连接。
还可用诸如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th以及40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe之类的标记物缀合本文公开的抗体及其抗原结合片段。
还可对本文公开的抗体和抗原结合片段进行聚乙二醇化，例如以延长其生物(例如，血清)半衰期。为使抗体或片段聚乙二醇化，通常在其中一个或多个PEG基团变成连接至抗体或抗体片段的条件下，使抗体或片段与聚乙二醇(PEG)的反应性形式(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。在特定的实施方案中，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文中所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其它蛋白质的任何PEG形式，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳基氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体或片段是无糖基化的抗体或片段。使使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可应用于本发明的抗体。参见，例如，EP 0 154 316和EP 0 401 384。
还可将本文公开的抗体和抗原结合片段与荧光或化学发光标记物缀合，所述标记物包诸如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰基、伞形酮、萤光素、发光标记物、等发光(isoluminal)标记物、芳族吖啶酯标记物、咪唑标记物、吖啶盐标记物(acridimium saltlabel)、草酸酯标记物、水母发光蛋白标记物、2,3-二氢邻苯二嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、旋转标记物和稳定的自由基的括荧光团。
还可将本发明的抗体及其抗原结合片段与细胞毒性因子(诸如白喉毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A链)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素(α-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白和化合物(例如，脂肪酸)、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(saponaria officinalis)抑制剂、米托林、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素缀合。
可以采用本领域已知的将本发明的抗体及其抗原结合片段与各种部分缀合的任何方法，包括由Hunter等，(1962)Nature 144:945；David等，(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等，(1981)J.Immunol.Meth.40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.andCytochem.30:407描述的那些方法。缀合抗体和片段的方法是常规的并且在本领域中是公知的。
抗SIRPα抗体的治疗用途
还提供了用于治疗需要用本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段进行治疗的受试者，包括人受试者的方法。在本发明的一个实施方案中，这种受试者患有感染或传染病。
在本发明的另一个实施方案中，这种受试者患有癌症。在一个实施方案中，癌症是例如骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、维尔姆氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾横纹肌样瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性肌纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本发明的实施方案中，癌症是转移性癌症，例如上述不同种类的癌症。
可通过本发明的抗体或抗原结合片段、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管癌(鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道：食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤(vipoma))、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)结肠直肠；泌尿生殖道：肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌)、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)；肝脏：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨瘤纤维瘤、类骨质骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、变形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、脑(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前期子宫颈发育不良(pre tumor cervical dysplasia))、卵巢[卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌]、粒层-卵囊膜细胞瘤(granulosa thecal cell tumor)、塞-莱细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)、乳腺；血液学：血液(髓细胞样白血病[急性]和慢性]、急性淋巴终细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、痣发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、银屑病；和肾上腺：成神经细胞瘤。因此，本文提供的术语“癌细胞”包括受任何一种上述疾患折磨的细胞。
在一个实施方案中，可通过本文公开的抗体或其抗原结合片段、本发明的组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：乳腺癌、胃癌、食道癌、胃食管结合部癌、结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、肾癌、肾细胞癌、甲状腺癌、多形性胶质母细胞瘤、输卵管癌、腹膜癌、血管肉瘤、肝细胞癌、绒毛膜癌、软组织肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓细胞白血病、T细胞淋巴瘤、天然杀伤细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤。
在一个实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于治疗感染和传染病。如本文中所用，术语“感染”是指生物体(即，受试者)的至少一个细胞中的任何状态都被传染剂感染(例如，受试者具有细胞内病原体感染，例如慢性细胞内病原体感染)。如本文中所用，术语“传染剂”是指在被感染生物的至少一个细胞中诱导CD47表达(例如，增加的CD47表达)的外来生物实体(即，病原体)。例如，传染剂包括但不限于细菌、病毒、原生动物和真菌。
细胞内病原体是特别令人感兴趣的。传染病是由传染剂引起的病症。一些传染剂在某些条件下不会引起可识别的症状或疾病，但在改变的条件下有可能引起症状或疾病。本发明的方法可用于治疗慢性病原体感染，例如包括但不限于病毒感染，例如。逆转录病毒、慢病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、痘病毒、人乳头瘤病毒等；细胞内细菌感染，例如分枝杆菌属(Mycobacterium)、衣原体属(Chlamydophila)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、立克次体属(Rickettsia)、布鲁氏菌属(BruceIla)、军团菌属(Legionella)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、李斯特菌属(Listeria)、柯克斯体属(Coxiella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属某种(Yersinia sp,)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)等；以及细胞内原生动物病原体，例如疟原虫属某种(Plasmodiumsp)、锥虫属某种(Trypanosoma sp.)、贾第虫属某种(Giardia sp.)、弓形虫属某种(Toxoplasma sp.)、利什曼原虫属某种(Leishmania sp.)等。
在实施方案中，本发明提供了用于使用本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中所述受试者患有病毒感染。在一个实施方案中，病毒感染是选自由以下组的组的病毒的感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦-巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软体动物病毒(molluscum virus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒。
在实施方案中，本发明提供了用于使用本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中所述受试者患有细菌感染。在一个实施方案中，细菌感染是选自由以下组成的组的细菌的感染：衣原体属(Chlamydia)、立克次体细菌(rickettsialbacteria)、分枝杆菌属、葡萄球菌属(staphylococci)、链球菌属(streptococci)、肺炎球菌属(pneumonococci)、脑膜炎球菌属(meningococci)和淋病双球菌属(gonococci)、克雷伯杆菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷氏菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团菌属、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthricis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)和包柔氏螺旋体属(Borriella)。
在实施方案中，本发明提供了用于使用本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中所述受试者患有真菌感染。在一个实施方案中，真菌感染是选自由以下组成的组的真菌的感染：假丝酵母属(Candida)(白假丝酵母(Candidaalbicans)、克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)等)、毛霉目(Mucorales)的属(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia))、根霉菌属(rhizopus)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
在实施方案中，本发明提供了用于使用抗本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中所述受试者患有寄生虫感染。在一个实施方案中，寄生虫感染是选自由以下组成的组的寄生虫的感染：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)、布氏维虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
“受试者”可以是哺乳动物诸如人、狗、猫、马、牛、小鼠、大鼠、猴(例如，食蟹猴，例如，食蟹猕猴)或兔子。在本发明的优选实施方案中，受试者是人受试者。
术语“与...缔合”表示可将在本发明的方法中施用的组分(例如，抗SIRPα抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段与抗癌剂一起配制成用于同时递送的单一组合物或单独配制成两种或多种组合物(例如，试剂盒)。可在与施用另外的组分不同的时间向受试者施用每种组分；例如，可在给定的时间段内，以几个间隔非同时地(例如，分别地或顺次地)给予每种施用。此外，可通过相同或不同的途径向受试者施用单独的组分。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以单独使用，或与其它另外的治疗剂和/或治疗程序结合使用，以治疗或预防需要这种治疗或预防的受试者的任何疾病(诸如癌症)，例如，如本文所论述的。组合物，例如包含药学上可接受的载体，包含与另外的治疗剂结合的此类抗体和片段的药物组合物，也是本发明的部分。
因此，本发明提供了治疗人受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段(任选地与另外的治疗剂或治疗程序结合)。本发明提供了治疗人受试者的感染或传染病的方法，所述法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段(任选地与其它治疗剂或治疗程序结合)。本发明还提供了增加免疫细胞活性的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，所述方法用于：癌症的治疗；感染或传染病的治疗；或作为疫苗佐剂。
在特定的实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以单独使用，或与肿瘤疫苗结合使用。肿瘤疫苗的实例包括但不限于用于人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的癌症的疫苗，诸如 和预防乙型肝炎病毒引起的肝癌的疫苗，诸如和触发免疫响应的溶瘤病毒疗法，诸如DNA疫苗，诸如Synchotrope MA2M质粒DNA疫苗和ZYC101；乳房珠蛋白-DNA疫苗(参见Clinical Cancer Res.201420(23):5964-75)；基于载体的疫苗，诸如PSA-TRICOM(prostvac)、PANVAC-VF、基于单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的疫苗(参见，例如Therapeutic Advances in Vaccines,2014,2(5)137-148)、基于李斯特菌属的疫苗(表达一种或多种癌症疫苗(诸如李斯特菌-间皮素(例如，CRS-207)、ADXS-HPV、Axalimogene Filolisbac、Listeria-HER2/Neu、Listeria-EGFRvIII)的李斯特菌属)、Adeno-CEA；同种异体疫苗，诸如GVAX、BLP-25(抗安卡拉粘蛋白1)、Belagenpumatucel-L、TG4010、CIMAvax表皮生长因子疫苗、NY-ESO、GM.CD40L-CCL21；自体疫苗，诸如：Adeno-CD40L、BCG、INGN-225、树突状细胞疫苗(诸如(Sipuleucel-T)、rF-CEA-MUC1-TRICOM(panvac-DC))；抗原疫苗，诸如MUC-1(stimuvax)、NY-ESO-1、GP-100、MAGE-A3(黑色素瘤抗原编码基因A3)、INGN-225(参见Pharmacology&Therapeutics 153(2015)1-9)。
吃我信号可通过放射疗法或化学治疗剂等细胞毒性疗法来增强，所述化学治疗剂包括但不限于蒽环类(多柔比星、表柔比星、柔红霉素、伊达比星、米托蒽醌)、奥沙利铂、硼替佐米、环磷酰胺、博来霉素、伏立诺他、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、泼尼松龙、多西他赛、丝裂霉素C、托泊替康/喜树碱、依托泊苷、唑来膦酸、甲氨蝶呤、依鲁替尼、阿柏西普、贝伐珠单抗、托瑞米芬、长春碱、长春新碱、依拉利西、巯嘌呤、沙利度胺、索拉非尼。因此，在某些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可与化学治疗剂联合使用，与放射疗法等联合使用。在特定实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可单独使用，或与靶向疗法结合使用。靶向疗法的实例包括：激素疗法、信号传导抑制剂(例如，EGFR抑制剂，诸如西妥昔单抗(Erbitux)和厄洛替尼(Tarceva))；CD20抑制剂(例如，利妥昔单抗(Rituxan)和奥法木单抗(Arzerra))；CD38抑制剂(例如，达雷木单抗(DARZALEX))；CD52抑制剂(例如，阿仑珠单抗(Campath))；HER2抑制剂(例如，曲妥珠单抗(赫赛汀)和帕妥珠单抗(Perjeta))；BCR-ABL抑制剂(诸如伊马替尼(Gleevec)和达沙替尼(Sprycel))；ALK抑制剂(如克唑替尼(Xalkori)和色瑞替尼(Zykadia))；BRAF抑制剂(例如维罗非尼(Zelboraf)和达拉菲尼(Tafinlar))、基因表达调节剂(例如地西他滨(Dacogen)和伏立诺他(Zolinza))、细胞凋亡诱导剂(例如硼替佐米(Velcade)和卡非佐米(Kyprolis))、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗(Avastin)和拉莫西鲁单抗(Cyramza))、免疫调节性酰亚胺药物(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马利度胺和阿米司特)、连接于毒素的单克隆抗体(例如布妥昔单抗韦多汀(Adcetris)和阿多曲妥珠单抗Kadcyla))。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以优选与靶向疗法联合使用，在靶向疗法中，抗体被用来介导ADCC/ADCP。功能性生物测定可用于分析抗体药物的作用方式，并将ADCP作为作用方式与ADCC区别开来。例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定通常利用正常人外周血单核细胞(PBMC)或其分离的效应细胞。通过使用利用定义的Fcγ受体IIa(FcγRIIa/CD32a)、IIIa(FcγRIIIa/CD16a)或IIIb(FcγRIIIb/CD16b)基因拷贝数变异(CNV)或基因型(诸如FcγRIIIa-158V/V对比V/F或F/F、FcγRIIIa-131H/H对比H/R或R/R以及FcγRIIIb-NA1和-NA2多态性变体的选择性供体工具减少测定变异(Assayvariation)。或者，可用表达FcγRIIIa的细胞系(例如，工程化NK92)替换效应细胞，诸如PBMC、PBMC衍生的天然杀伤(NK)细胞、粒细胞、单核细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞或树突状细胞(DC)。靶细胞的杀伤可通过使用51铬(Cr51)或荧光染料诸如钙黄绿素-乙酰氧基甲基(钙黄绿素-AM)、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、2',7'-双-(2-羧基乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素(BCECF)、铕(Eu)或碘化丙啶(PI)测量特定探针从预标记的靶细胞释放，或通过测量胞浆酶(cytosolic enzymes)诸如乳酸脱氢酶(LDH)的释放或核苷三磷酸(ATP)的释放来评估靶细胞的杀伤。
相反，可通过测量通过粒细胞、单核细胞、树突状细胞或巨噬细胞介导的吞噬作用对靶细胞的破坏来评估抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。ADCP测定使用分化为巨噬细胞或粒细胞的PBMC衍生的细胞或骨髓样细胞系(诸如HL-60、THP-1和U937细胞)。通常用于在单核细胞系中诱导巨噬细胞分化的刺激物包括佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、1,25-二羟基维生素D3(VD3)和视黄酸(RA)。还已知RA诱导例如HL-60细胞的终末粒细胞分化。可通过监测效应细胞的来自靶细胞的特定探针的内化评估对靶细胞的吞噬作用，所述特定探针用荧光染料(诸如细胞增殖染料eFluor450、CFSE)和pH敏感染料(包括pHrodo和CypHer5E)预先标记。通过使用流式细胞术或荧光显微镜术检测荧光标记的效应细胞的增加来测量吞噬作用。还可使用“报告基因”测定来评估ADCP。为了在报告基因测定中测量ADCP功能，首先将靶细胞与滴定的目标抗体一起孵育。一旦抗体与靶细胞表面上的其同源靶标结合，就可以添加工程化Jurkat效应细胞。如果随后发生ADCP途径激活，则Jurkat细胞通过报告基因NFAT-RE-luc2的表达产生荧光素酶产物。然后在添加荧光素酶测定试剂之后的4-24小时的诱导期之后测量荧光素酶活性。基于微量滴定板的测定中的剂量依赖性响应可用于定量治疗性抗体相较于合适参考项目的剂量响应曲线的相对生物活性。
在特定的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段可以与抗癌治疗剂或免疫调节药物(诸如免疫调节受体抑制剂，例如与所述受体特异性结合的抗体或其抗原结合片段)组合使用。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与以下的一种或多种缔合：
TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导性淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、Toll样受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM-1、LFA-1(CDlla/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAM7、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、CD19a以及与CD83特异性结合的配体的激动剂(例如激动性抗体或其抗原结合片段或可溶性融合物)；或CD47、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如CEACAM-1、-3和/或-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIRl、IDO、TDO、Cd160和/或TGFRβ的抑制剂。
在本发明的实施方案中、本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与一种或多种环状二核苷酸或其它STING途径激动剂缔合。STING(干扰素基因的刺激物，也称为TMEM173、MITA、ERIS和MPYS)是位于ER的跨膜蛋白，其响应于环状二核苷酸(CDN)的直接结合而发生构象变化，从而导致涉及TBK1激活、IRF-3磷酸化以及IFN-β和其它细胞因子的产生的下游信号传导级联。肿瘤驻留宿主抗原呈递c3ellss中的STING途径参与诱导针对肿瘤源性抗原的自发性CD8+T细胞响应。据报道，该途径的激活和随后IFN-β的产生也有助于辐照的抗肿瘤作用。STING激动剂及其用途描述于例如US20060040887、US20080286296、US20120041057、US20140205653、WO2014179335、WO 2014179760、US20150056224、WO2015185565、WO 2016096174、WO 2016145102、WO 2017011444、WO 2017027645、WO2017027646、WO 2017123657、WO 2017123669、WO 2017175147、WO 2017175156、WO2018045204、WO 2018009648、WO 2018006652、WO 2018013887、WO 2018013908、US20180002369、US20180092937和US20180093964中。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与以下的一种或多种缔合：抗CD47抗体、抗PD-1抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗、抗PDL1抗体、抗TIGIT抗体、抗APRIL抗体、抗CTLA4抗体、抗CS1抗体(例如，埃罗妥珠单抗)、抗KIR2DL1/2/3抗体(例如，立鲁单抗(lirilumab)、抗CD137抗体(例如，乌瑞鲁单抗)、抗GITR抗体(例如，TRX518)、抗PD-L1抗体(例如，BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗PD-L2抗体、抗ILT1抗体、抗ILT2抗体、抗ILT3抗体、抗ILT4抗体、抗ILT5抗体、抗ILT6抗体、抗ILT7抗体、抗ILT8抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、抗ICOS、抗KIR2DL1抗体、抗KIR2DL2/3抗体、抗KIR2DL4抗体、抗KIR2DL5A抗体、抗KIR2DL5B抗体、抗KIR3DL1抗体、抗KIR3DL2抗体、抗KIR3DL3抗体、抗NKG2A抗体、抗NKG2C抗体、抗NKG2E抗体、抗4-1BB抗体(例如，PF-05082566)、抗TSLP抗体、抗IL-10抗体、IL-10或聚乙二醇化的IL-10或此类靶标的任何小的有机分子抑制剂。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、阿托珠单抗、奥卡拉妥珠单抗、乌妥昔单抗、维妥珠单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、BVX-20、SCT-400或PRO131921)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD38抗体(例如，达雷木单抗或MOR202)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗、CetuGEX、帕木单抗、尼妥珠单抗、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)或AFM-21)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗、TrasGEX、帕妥珠单抗、马格妥昔单抗或ADCT-502)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗HER3抗体(例如，鲁姆妥珠单抗、帕曲妥单抗或LJM716)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD19抗体(例如，依那利珠单抗、兰妥莫单抗、DI-B4、MDX-1342、MEDI-551、MOR208或4-G7SDIE)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD52抗体(例如，阿伦珠单抗)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗EpCAM抗体(例如，阿德木单抗、卡妥索单抗、依决洛单抗或ING-1)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗SLAMF7抗体(例如，埃罗妥珠单抗或ABBV-838)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗PD-1抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗PD-L1抗体(例如，BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CTLA4抗体(例如，伊匹木单或曲美木单抗)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD137抗体(例如，乌瑞鲁单抗)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗GITR抗体(例如，TRX518或FPA154)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗OX40抗体(例如，MEDI6469、MOXR0916或INCAGN1949)缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD40抗体(例如，鲁卡木单抗、达西妥珠单抗(dacetuzmumab)、APX005M、ChiLob7/4、CP-870、893或JNJ-64457107)缔合。在本发发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CS1抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL1/2/3抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD137(例如，乌瑞鲁单抗)抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗GITR(例如，TRX518)抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗PD-L2抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL1抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL2抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL3抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL4抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL5抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL6抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL7抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ITL8抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗CD40抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗OX40抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL1抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL2/3抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL4抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL5A抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR2DL5B抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR3DL1抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR3DL2抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗KIR3DL3抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗NKG2A抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗NKG2C抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗ICOS抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗4-1BB抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗IL-10抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗TSLP抗体缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与IL-10或聚乙二醇化的IL-10缔合。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与诸如以下抑制剂的一种或多种抑制剂(例如，小的有机分子或抗体或其抗原结合片段)缔合：MTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂、细胞毒性剂、铂剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、微管稳定剂、紫杉烷、CD20抑制剂、CD52抑制剂、CD30抑制剂、RANK(核因子κB的受体激活剂)抑制剂、RANKL(核因子κ-B配体的受体激活剂)抑制剂、ERK抑制剂、MAP激酶抑制剂、AKT抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂、HER1抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、Bcl2抑制剂、CD22抑制剂、CD79b抑制剂、ErbB2抑制剂或法呢基蛋白转移酶抑制剂。
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与以下的任一种或多种缔合：13-顺式-视黄酸、3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、4-羟基他莫昔芬、5-脱氧尿苷、5'-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、7-羟基星形孢菌素、A-443654、乙酸阿比特龙、阿普拉克西纳(abraxane)、ABT-578、阿可必吩、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺、氨磷汀、氨基谷氨酰胺、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管抑素、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬、AS-252424、AS-605240、天冬酰胺酶、AT-9263、阿曲生坦、阿昔替尼、AZD1152、卡介苗(BCG)疫苗、巴塔布林、BC-210、贝索托克斯、贝伐单抗、比卡鲁胺、Bio111、BIO140、博来霉素、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、骨化三醇、喜树碱、卡奈替尼、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、CC8490、西地尼布、CG-1521、CG-781、克林霉素、苯丁酸氮芥、氯毒素、西仑吉肽、西咪替丁、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、COL-3、CP-724714、环磷酰胺、环丙孕酮、乙酸环丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、达卡巴嗪、达西司他、更生霉素、达洛妥珠单抗、达鲁色替、达沙他尼、柔红霉素、德卡他尼、鱼藤素(deguelin)、地尼白介素、脱氧助间型霉素、缩酚酸肽、二芳基丙腈、二乙基甲噻烯酚、介素(diftitox)、多西他赛、多韦替尼、多柔比星、屈洛昔芬、艾特咔林、钇-90标记的依度曲肽、依度曲肽、EKB-569、EMD121974、内皮抑素、恩扎鲁胺、恩扎妥林、表柔比星、埃博霉素B、ERA-923、爱必妥、厄洛替尼、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、芬克拉妥珠单抗、非那雄胺、夫拉平度、氟尿苷、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、FOLFOX方案、氟维司群、盖乐特龙、吉非替尼、吉西他滨、吉美替康、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、棉酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羟孕酮、羟基脲、IC87114、伊达柔比星、碘昔芬(idoxyfene)、异环磷酰胺、IM862、伊马替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干扰素、白细胞介素-12、伊匹单抗、伊立替康、JNJ-16241199、酮康唑、KRX-0402、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿普斯特、拉帕替尼、拉索昔芬、来曲唑、亚叶酸钙、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体包埋的紫杉醇、洛莫司汀、洛那法尼、硫恩酮、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、马立马司他、氮芥、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、美法仑、巯基嘌呤、梅斯纳、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、托扎塞替尼、MLN8054、新伐他汀、奈拉替尼、纳拉度布、尼洛替尼、尼鲁替米特、诺拉曲坦、NVP-BEZ235、奥利美生、奥曲肽、奥法木单抗(ofatumumab)、奥戈伏单抗、奥特罗那(orteronel)、奥沙利铂、紫杉醇、帕布昔利布(palbociclib)、帕米膦酸盐(pamidronate)、帕尼单抗、帕唑帕尼、PD0325901、PD184352、PEG-干扰素、培美曲塞、喷司他丁、哌立福辛、苯丙氨酸、PI-103、哌替昔布、PIK-75、哌喷昔芬、PKI-166、普利霉素、卟菲尔钠、泼尼松、丙卡巴肼、孕激素、PX-866、R-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷珠辛、地磷莫司、利妥昔单抗、罗米地辛、RTA744、鲁贝替康、scriptaid、Sdx102、塞利西利、司美替尼、司马尼布、SF1126、西罗莫司、SN36093、索拉非尼、螺内酯、角鲨胺、SR13668、链脲菌素、SU6668、异戊酰内酯异羟肟酸、舒尼替尼、合成雌激素、他仑帕奈、泰利莫齐拉赫帕雷、它莫西芬、替莫唑胺、替西罗莫司、替尼泊苷、替米利芬、睾丸素、粉防己碱、TGX-221、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、曲美木单抗、替比法尼、替沃扎尼、TKI-258、TLK286、拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、曲贝替定、曲妥珠单抗、维A酸、曲古抑菌素A、单水磷酸曲西瑞宾、双羟萘酸曲普瑞林、TSE-424、乌拉莫司汀、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼、VEGF trap、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、维他辛、维特斯潘、伏林司他、VX-745、渥曼青霉素、Xr311、扎木单抗、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。
与本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段结合使用的合适的抗癌药的非限制性实例包括细胞生长抑制剂、免疫调节酰亚胺药物、细胞毒性剂、针对癌症和肿瘤性疾病的靶向治疗剂(分子、物制剂、siRNA和微RNA)，
1)抗代谢物(诸如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、氟达拉滨、卡培他滨)；
2)烷基化剂，诸如替莫唑胺、环磷酰胺，
3)DNA相互作用和DNA破坏剂，诸如顺铂、奥沙利铂、多柔比星，
4)电离辐射，诸如放射疗法，
5)拓扑异构酶II抑制剂，诸如依托泊苷、多柔比星，
6)拓扑异构酶I抑制剂，诸如伊立替康、托泊替康，
7)微管蛋白相互作用剂，例如紫杉醇、多西紫杉醇、Abraxane、埃博霉素，
8)驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂，
9)纺锤体检查点抑制剂，
10)聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，例如奥拉帕利、MK-4827和维利帕尼
11)基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂
12)蛋白酶抑制剂，例如组织蛋白酶D和组织蛋白酶K抑制剂
13)蛋白质体或泛素化抑制剂，例如硼替佐米，
14)突变体p53的激活剂可恢复其野生型p53活性
15)腺病毒P53
16)Bcl-2抑制剂，诸如ABT-263
17)热激蛋白(HSP)调节剂，诸如格尔德霉素和17-AAG
18)组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂，诸如伏立诺他(SAHA)，
19)性激素调节剂，
a.抗雌激素，如他莫昔芬、氟维司群，
b.选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如雷洛昔芬，
c.抗雄激素，例如比卡鲁胺、氟他胺
d.LHRH激动剂，例如亮丙瑞林，
e.5-还原酶抑制剂，例如非那雄胺，
f.细胞色素P450 C17裂解酶(CYP450c17，也称为17αC)；
g.芳香酶抑制剂，如来曲唑、阿那曲唑、依西美坦，
20)EGFR激酶抑制剂，诸如吉非替尼、厄洛替尼、拉普替尼
21)双重erbB1和erbB2抑制剂，诸如拉帕替尼
22)多靶点激酶(丝氨酸/苏氨酸和/或酪氨酸激酶)抑制剂，
a.ABL激酶抑制剂，伊马替尼和尼洛替尼、达沙替尼
b.VEGFR-1、VEGFR-2、PDGFR、KDR、FLT、c-Kit、Tie2、Raf、MEK和ERK抑制剂，诸如舒尼替尼、索拉非尼、凡得他尼、帕唑帕尼、PLX-4032、阿昔替尼、PTK787、GSK-1120212
c.马球样激酶抑制剂
d.极光激酶抑制剂
e.JAK抑制剂
f.c-MET激酶抑制剂
g.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如CDK1和CDK2抑制剂地纳利布SCH 727965(参见Parry等，Molecular Cancer Therapeutics9(8)：2344–53(2010))和CDK4/6抑制剂，例如瑞博西尼、帕布昔利布、阿贝马西比(Abemaciclib)和特雷来昔布。
h.PI3K和mTOR抑制剂，例如GDC-0941，BEZ-235，BKM-120和AZD-8055
i.雷帕霉素及其类似物，如特罗罗莫司、依维莫司和地福莫司
23)和其它抗癌药(也称为抗肿瘤药)包括但不限于ara-C、阿霉素、环磷酰胺、卡铂、尿嘧啶芥子油、氯甲碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙撑密胺、三亚乙基硫代磷胺、白消安、卡莫司汀、洛莫斯汀、链脲佐菌素、达卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他汀、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、诺维本、博来霉素、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、替尼泊苷、阿糖胞苷、培美曲塞、依达比星、光神霉素、脱氧福美霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、替尼泊苷、炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼松龙、甲睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、氟他胺、醋酸甲羟孕酮、托瑞米芬、戈舍瑞林、卡铂、羟基脲、安吖啶、丙卡巴嗪、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、德罗沙芬、六甲三聚氰胺(Hexamethylmelamine)、Bexxar、泽娃灵、Trisenox、Profimer、噻替派、六甲蜜胺、Doxil、Ontak、Depocyt、Aranesp、Neupogen、Neulasta、Kepivance。
24)法呢基蛋白转移酶抑制剂，如SARASARTM(4-[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]环庚[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-氧乙基]-哌啶甲酰胺、替吡法尼
25)干扰素，诸如Intron A、Peg-Intron，
26)抗erbB1抗体，诸如西妥昔单抗、帕尼单抗，
27)抗erbB2抗体，诸如曲妥珠单抗，
28)抗CD52抗体，诸如阿仑珠单抗，
29)抗CD20抗体，诸如阿利妥昔单抗，
30)抗CD33抗体，诸如吉妥珠单抗奥佐米星
31)抗VEGF抗体，诸如阿瓦斯丁，
32)TRIAL配体，诸如来沙莫单抗、马帕木单抗和AMG-655
33)抗CTLA-4抗体，诸如伊匹木单抗
34)针对CTA1、CEA、CD5、CD19、CD22、CD30、CD44、CD44V6、CD55、CD56、EpCAM、FAP、MHCII、HGF、IL-6、MUC1、PSMA、TAL6、TAG-72、TRAILR、VEGFR、IGF-2、FGF的抗体，
35)抗IGF-1R抗体，例如达洛妥珠单抗(MK-0646)和罗妥木单抗(SCH 717454)。
“雌激素受体调节剂”是指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，无论其机理如何。雌激素受体调节剂的实例包括但不限于他莫昔芬、雷洛昔芬、伊多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯、4,4'-二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”是指无论机制如何都干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他米特、比卡鲁胺、利拉唑和乙酸阿比特龙。
“类视黄醇受体调节剂”是指无论机制如何，都干扰或抑制类视黄醇与受体结合的化合物。这种类视黄醇受体调节剂的实例包括贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4'-羟基苯基)视黄酰胺和N-4-羧基苯基视黄酰胺。
“细胞毒性剂/细胞抑制剂”是指主要通过直接干扰细胞功能或抑制或干扰细胞肌病而导致细胞死亡或抑制细胞增殖的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、缺氧可激活化合物、微管抑制剂/微管稳定剂、有丝分裂驱动蛋白抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、参与有丝分裂进程的激酶抑制剂、参与生长因子和细胞因子信号传导途径的激酶抑制剂、抗代谢物、生物响应调节剂、激素/抗激素治疗剂、造血剂生长因子、单克隆抗体靶向治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、遍在蛋白连接酶抑制剂和极光激酶抑制剂。
细胞毒性剂/细胞抑制剂的实例包括但不限于铂配位化合物、色特奈福、恶液质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、泼尼莫司汀、二溴调节醇(dibromodulcitol)、雷莫司汀、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、肝素铂、雌莫司汀、甲苯磺酸英丙舒凡、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵(dibrospidium chloride)、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、地西磷酰胺、顺式-胺二氯(2-甲基-吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式,反式,反式)-双-mu-(己烷-1,6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、二嗪基精胺(diarizidinylspermine)、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、双蒽、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3'-脱氨基-3'-吗啉代-13-脱氧-10-羟基卡柔比星、安那霉素、加拉比星、依那那肽、MEN10755、4-去甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲基磺酰基-柔红霉素(参见WO 00/50032)。
缺氧可激活化合物的一个实例是替拉扎明。
蛋白质体抑制剂的实例包括但不限于乳胞素和MLN-341(Velcade)。
微管抑制剂/微管稳定剂的实例通常包括紫杉烷类。特定的化合物包括紫杉醇硫酸长春地辛、3',4'-二脱氢-4'-脱氧-8'-去甲长春碱(norvincaleukoblastine)、多西紫杉醇根瘤菌素、多拉司汀、羟乙基磺酸米伏布林(mivobulin isethionate)、奥里斯他汀、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、念珠藻环肽、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱、N,N-二甲基-L-缬胺酰基-L-缬胺酰基-N-甲基-L-缬胺酰基-L-脯氨酰基-L-脯氨酸-叔-丁基酰胺、TDX258、埃博霉素(参见例如美国专利第6,284,781号和第6,288,237号)和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的一些实例是托泊替康、海卡帕明、伊立替康、鲁贝替康、6-乙氧基丙酰基-3',4'-O-外-苯亚甲基-教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':b,7]-吲哚嗪并[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)二酮、卢托替康、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2'-二甲基氨基-2'-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-9-羟基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲酰胺、芥子碱、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并(3',4':6,7)萘并(2,3-d)-1,3-二氧杂环戊烯-6-酮、2,3-(亚甲基二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶鎓、6,9-双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5,10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7,10-二羟基-2-(2-羟基乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙基氨基)乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)吖啶-4-甲羧酰胺、6-[[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。
在以下出版物中描述了有丝分裂驱动蛋白，特别是人有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的实例：WO03/039460、WO03/050064、WO03/050122、WO03/049527、WO03/049679、WO03/049678、WO04/039774、WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、WO05/017190、US2005/0176776。在实施方案中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括但不限于KSP抑制剂、MKLP1抑制剂、CENP-E抑制剂、MCAK抑制剂和Rab6-KIFL抑制剂。
“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的实例包括但不限于SAHA、TSA、澳沙福拉定、PXD101、MG98和scriptaid。对于其它组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的进一步参考可见于以下手稿中；Miller,T.A.等J.Med.Chem.46(24):5097-5116(2003)。
“参与有丝分裂进程的激酶抑制剂”包括但不限于极光激酶抑制剂、Polo样激酶抑制剂(PLK；特别是PLK-1抑制剂)、bub-1抑制剂和bub-抑制剂R1。“极光激酶抑制剂”的实例是VX-680。
“抗增殖剂”包括反义RNA和DNA寡核苷酸，诸如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001以及抗代谢物，诸如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他汀、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷烷磷酯、福斯特滨钠水合物(fosteabine sodiumhydrate)、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷、2'-氟亚甲基-2'-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基]磺酰基]-N'-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油-B-L-甘露-七吡喃糖基]腺嘌呤、阿普立定、海鞘素、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四碳-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆素、洛美曲索、右雷佐生、甲硫氨酸酶、2'-氰基-2'-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲和曲妥珠单抗。
靶向单克隆抗体的治疗剂的实例包括具有与癌细胞特异性或靶细胞特异性单克隆抗体连接的细胞毒剂或放射性同位素的那些治疗剂。实例包括Bexxar。
“异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂”是指抑制异戊二烯基蛋白质转移酶的任何一种或任何组合的化合物，包括法呢基蛋白转移酶(FPT酶)，I型牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶(GGPTase-I)和II型牻牛儿基牻牛儿基蛋白转移酶(GGPT酶-II，也称为Rab GGPT酶)。
异戊二烯蛋白转移酶抑制剂的实例可见于以下出版物和专利中：WO 96/30343、WO97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美国专利第5,420,245号、美国专利第5,523,430号、美国专利第5,532,359号、美国专利第5,510,510号、美国专利第5,589,485号、美国专利第5,602,098号、欧洲专利公开0618 221，欧洲专利公开0 675 112，欧洲专利公开0 604 181，欧洲专利公开0 696 593、WO94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美国专利第5,661,152号、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO 95/25086、WO96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美国专利第5,571,792号、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436和美国专利第5,532,359号。关于异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂对血管生成的作用的实例，参见EuropeanJ.of Cancer，第35卷，第9期，第1394-1401页(1999)。
“血管生成抑制剂”是指无论机制如何均抑制新血管形成的化合物。血管生成抑制剂的实例包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂，诸如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制剂、表皮来源的、成纤维细胞来源的或血小板来源的生长因子的抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白细胞介素12、硫酸戊聚糖聚酯、环加氧酶抑制剂，包括非甾体类抗炎药(NSAID)(如阿司匹林和布洛芬)以及选择性环加氧酶2抑制剂如塞来昔布和罗非昔布(PNAS，第89卷，第7384页(1992年)；JNCI，第69卷，第475页(1982)；Arch.Opthalmol.，第108卷，第573页(1990)；Anat.Rec.第238卷，第68页(1994)；FEBS Letters，第372卷，第83页(1995)；Clin,Orthop.第313卷，第76页(1995)；J.Mol.Endocrinol.，第16卷，第107页(1996)；Jpn.J.Pharmacol.，第75卷，第105页(1997)；Cancer Res.，第57卷，第1625页(1997)；Cell，第93卷，第705页(1998)；Intl.J.Mol.Med.，第2卷，第715页(1998)；J.Biol.Chem.，第274卷，第9116页(1999))、甾体类抗炎药(诸如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松)、羧基酰胺基三唑、考布他汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基)-烟曲霉醇、沙利度胺、血管他汀、肌钙蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂(参见Fernandez等，J.Lab.Clin.Med.105:141-145(1985))以及针对VEGF的抗体(参见，Nature Biotechnology，第17卷，第963-968页(1999年10月)；Kim等，Nature,362,841-844(1993)；WO 00/44777和WO 00/61186)。
血管生成抑制剂的其它实例包括但不限于内皮抑素、乌克林、豹蛙酶、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2,5]辛-6-基(氯乙酰基)氨基甲酸酯、乙酰地那林(acetyldinanaline)、5-氨基-1-[[[3,5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苯基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、考布他汀、RPI4610、NX31838、硫酸甘露戊糖磷酸酯、7,7-(羰基-双[亚氨基-N-甲基-4,2-吡咯并羰基亚氨基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亚氨基]-双-(1,3-萘二磺酸酯)和3-[((2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚二酮(SU5416)。
调节或抑制血管生成并且还可以与本发明的化合物组合使用的其它治疗剂包括调节或抑制凝血及纤溶系统的剂(参见Clin.Chem.La.Med.38:679-692(2000))。调节或抑制凝血和纤溶途径的此类剂的实例包括但不限于肝素(参见Thromb.Haemost.80:10-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(也称为活性凝血酶可激活的纤溶抑制剂[TAFIa]的抑制剂)(参见Thrombosis Res.101:329-354(2001))。TAFIa抑制剂已描述于美国系列号60/310,927(2001年8月8日提交的)和60/349,925(2002年1月18日提交的)中。
“干扰细胞周期检查点的试剂”是指抑制转换细胞周期检查点信号的蛋白激酶，从而使癌细胞对DNA破坏剂敏感的化合物。此类试剂包括ATR、ATM、CHK11和CHK12激酶的抑制剂以及cdk和cdc激酶抑制剂，并且具体地以7-羟基星形孢菌素、夫拉平度、CYC202(Cyclacel)和BMS-387032为例。
“干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的试剂”是指抑制RTK并因此抑制参与肿瘤发生和肿瘤进展的机制的化合物。此类试剂包括c-Kit、Eph、PDGF、Flt3和c-Met的抑制剂。其它试剂包括RTK的抑制剂，如Bume-Jensen和Hunter，Nature,411:355-365,2001所述的。
“细胞增殖和存活信号通路的抑制剂”是指抑制细胞表面受体下游的信号传导级联的化合物。此类试剂包括丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(包括但不限于Akt的抑制剂，诸如WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US2004-0116432、WO 02/083138、US2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO2005/100356、WO 2005/100344、US2005/029941、US2005/44294、US2005/43361、60/734188、60/652737、60/670469中所述的)、Raf激酶的抑制剂(例如PLX-4032)、MEK的抑制剂(例如Arry-162、RO-4987655和GSK-1120212)、mTOR的抑制剂(例如AZD-8055、BEZ-235和依维莫司)和PI3K的抑制剂(例如GDC-0941、BKM-120)。
如上文所用，“整联蛋白阻断剂”是指选择性拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ3整联蛋白结合的化合物，选择性地拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ5整联蛋白的结合的化合物，拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ3整联蛋白和αvβ5整联蛋白两者的结合的化合物，以及拮抗、抑制或抵消在毛细血管内皮细胞上表达的一种或多种特定整联蛋白的活性的化合物。该术语还指αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1、和α6β4整联蛋白的拮抗剂。该术语还指αvβ3、αvβ5、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1、和α6β4整联蛋白的任意组合的拮抗剂。
酪氨酸激酶抑制剂的一些具体实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[((2,4-二甲基吡咯-5-基)次甲基)吲哚啉-2-酮、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-(羟基甲基)-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-1-酮、SH268、染料木黄酮、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶甲烷磺酸盐、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4'-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺和EMD121974。
立即要求保护的抗体或抗原结合片段与PPAR-γ(即，PPAR-gamma)激动剂和PPAR-δ(即，PPAR-delta)激动剂的组合可用于治疗某些恶性肿瘤。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧化物酶体增殖物激活的受体γ和δ。PPAR-γ在内皮细胞上的表达及其参与血管生成的过程已报导于文献(参见J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31:909-913；J.Biol.Chem.1999；274:9116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000；41:2309-2317)中。最近，已显示PPAR-γ激动剂在体外抑制对VEGF的血管生成响应；曲格列酮和马来酸罗格列酮均抑制小鼠的视网膜新血管形成的发展。(Arch.Ophthamol.2001；119:709-717)。PPAR-γ激动剂和PPAR-γ/α激动剂的实例包括但不限于 尼拉帕尼、噻唑烷二酮(诸如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮)、非诺贝特、吉非贝齐、氯贝特、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926,2-[(5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并异噁唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸和2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基色烷-2-羧酸。
本发明的抗体或抗原结合片段也可以与芳香酶抑制剂组合用于治疗或预防乳腺癌。芳香酶抑制剂的实例包括但不限于：阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
本发明的抗体或抗原结合片段也可与以下化学治疗剂组合用于治疗癌症：阿巴瑞克阿地白介素阿地白介素阿伦珠单抗阿利维甲酸别嘌呤醇六甲蜜胺氨磷汀阿那曲唑三氧化二砷天冬酰胺酶阿扎胞苷盐酸苯达莫司汀贝伐珠单抗贝沙罗汀胶囊贝沙罗汀凝胶博来霉素硼替佐米布雷菲德菌素A；静脉内白消安口服白消安卡普睾酮卡培他滨卡铂卡莫司汀卡莫司汀具有聚苯丙生20移植物的卡莫司汀(Gliadel)；塞来考昔西妥昔单抗苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨氯法拉滨环磷酰胺环磷酰胺(Cytoxan)；环磷酰胺阿糖胞苷阿糖胞苷脂质体达卡巴嗪更生霉素,放线菌素达肝素钠注射液达雷木单抗达贝泊汀达沙替尼柔红霉素脂质体柔红霉素、道诺霉素柔红霉素、道诺霉素地加瑞克地尼白介素(Denileukin diftitox)右雷佐生盐酸右雷佐生代代宁B；17-DMAG；多西他赛多柔比星(Adriamycin)；多柔比星多柔比星(Adriamycin PFS)；多柔比星脂质体丙酸屈他雄酮丙酸屈他雄酮依库珠单抗注射液Elliott氏B溶液艾曲泊帕表柔比星促红细胞生成素厄洛替尼雌莫司汀乙炔基雌二醇；磷酸依托泊苷依托泊苷，依维莫司片剂依西美坦多聚糖超顺磁氧化铁(Feraheme)；非格司亭氟尿苷(动脉内)氟达拉滨氟尿嘧啶、氟维司群吉非替尼格尔德霉素；吉西他滨吉姆单抗奥佐米星醋酸戈舍瑞林(Zoladex)；醋酸戈舍瑞林醋酸组胺瑞林羟基脲替坦异贝莫单抗伊达比星异环磷酰胺甲磺酸伊马替尼干扰素干扰素α-2b碘苄胍I 123注射液伊立替康伊沙匹隆拉帕替尼片剂来那度胺来曲唑亚叶酸醋酸亮丙瑞林左旋咪唑洛莫司汀，二氯甲基二乙胺、氮芥醋酸甲地孕酮美法仑、巯嘌呤，美司钠美司钠甲氨蝶呤甲氧沙林8-甲氧补骨脂素；丝裂霉素米托坦米托蒽醌光神霉素；苯丙酸南诺龙奈拉滨尼洛替尼若莫单抗奥法木单抗奥普瑞白介素奥沙利铂紫杉醇紫杉醇结合有紫杉醇蛋白的颗粒帕利夫明帕米膦酸酯帕尼单抗帕唑帕尼片剂培加酶 培门冬酶Peg非格司亭培美曲塞二钠喷司他丁哌泊溴烧普乐沙福普利霉素、光神霉素卟吩姆钠普拉曲沙注射甲基苄肼奎纳克林雷帕霉素；拉布立酶盐酸雷洛昔芬利妥昔单抗罗米地新罗米司亭沙格司亭沙格司亭索拉非尼链脲佐菌素苹果酸舒尼替尼滑石他莫昔芬替莫唑胺坦罗莫司替尼泊苷、睾内酯硫鸟嘌呤、巯基嘌呤；噻替哌托泊替康托瑞米芬托西莫单抗托西莫单抗/I-131托西莫单抗反式视黄酸；曲妥珠单抗维甲酸，三乙撑蜜胺；乌拉莫司汀(Uracil Mustard)；戊柔比星长春碱长春新碱长春瑞滨伏立诺他渥曼青霉素(wortmannin)和唑来膦酸盐
在本发明的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与一种或多种止吐药相关，所述止吐药包括但不限于：卡索匹坦(GlaxoSmithKline)、奈妥匹坦(MGI-Helsinn)和其它NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(由MGIPharma以Aloxi销售)、阿瑞匹坦(由Merck andCo.；Rahway,NJ以Emend销售)、苯海拉明(由Pfizer；New York,NY以销售)、羟嗪(由Pfizer；New York,NY以销售)、甲氧氯普胺(由AH Robins Co,；Richmond,VA以销售)、劳拉西泮(由Wyeth；Madison,NJ以销售)、阿普唑仑(由Pfizer；New York,NY以销售)、哌啶醇(由Ortho-McNeil；Raritan,NJ以销售)、氟哌利多屈大麻酚(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.；Marietta,GA以销售)、地塞米松(由Merck and Co.；Rahway,NJ以销售)、甲泼尼龙(由Pfizer；New York,NY以销售)、丙氯拉嗪(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC以销售)、格拉司琼(由Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley,NJ以销售)、昂丹司琼(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC以销售)、多拉司琼(由Sanofi-Aventis；New York,NY以销售)、托烷司琼(由Novartis；East Hanover,NJ以销售)。
癌症治疗的其它副作用包括红细胞和白细胞缺乏。因此，在本发明的实施方案中，将抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与治疗或预防这种缺乏症的药剂(诸如例如非格司亭、PEG-非格司亭、促红细胞生成素、依泊汀α或达比泊汀α)联合。
在本发明的实施方案中，将本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段与抗癌放射疗法联合施用。例如，在本发明的实施方案中，放射疗法是外部束疗法(EBT)：一种用于将高能X射线束传递至肿瘤位置的方法。光束在患者体外产生(例如，通过线性加速器)，并对准肿瘤部位。这些X射线会破坏癌细胞，并且精心的治疗计划允许保留周围的正常组织。患者体内没有放射源。在本发明的实施方案中，放射疗法是质子束疗法：一种用质子而不是X射线轰击患病组织的适形疗法(conformal therapy)。在本发明的实施方案中，放射疗法是适形外部束放射疗法：一种使用先进技术使放射疗法适应个体身体结构的方法。在本发明的实施方案中，放射疗法是近距离放射疗法：放射性物质在体内的临时放置，通常用于向区域提供额外剂量的辐照射或增强的辐照。
在本发明的实施方案中，将外科手术程序与抗SIRPα抗体或其抗原结合片段结合施用是外科手术肿瘤切除术。
实验和诊断用途
本文公开的抗SIRPα抗体及其抗原结合片段可用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域公知的方法将抗SIRPα抗体及其抗原结合片段固定在固相(诸如Sephadex、玻璃或琼脂糖树脂或滤纸)上。使固定的抗体或片段与含有要纯化的SIRPα蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持物，所述溶剂将除去样品中除SIRPα蛋白外的基本上所有物质，所述SIRPα蛋白与固定的抗体或片段结合。最后，用洗脱结合的SIRPα的溶剂洗涤支持物(例如蛋白A)。此类固定的抗体和片段构成本发明的一部分。
还提供了用于产生第二抗体的抗原，所述第二抗体用于例如进行蛋白质印迹和本文讨论的其它免疫测定。
抗SIRPα抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段也可用于SIRPα蛋白的诊断测定，例如，检测其在特定细胞、组织或血清(例如髓样细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞)中的表达。此类诊断方法在各种疾病诊断中可能是有用的。
本发明包括结合使用本文公开的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段的ELISA测定法(酶联免疫吸附测定法)。
例如，这种方法包括以下步骤：
(a)用抗SIRPα抗体或其抗原结合片段涂覆基底(例如，微量滴定板孔的表面，例如塑料板)；
(b)将要测试其是否存在SIRPα的样品施加到基底上；
(c)清洗板，使得除去样品中未结合的材料；
(d)施加对SIRPα抗原也具有特异性的可检测标记的抗体(例如,酶联抗体)；
(e)洗涤基底，以除去未结合的标记的抗体；
(f)如果标记的抗体是酶连接的，则使用被该酶转化为荧光信号的化学试剂；以及
(g)检测标记的抗体的存在。
与基底缔合的标记的检测表明SIRPα蛋白的存在。
在另外的实施方案中，标记的抗体或其抗原结合片段用与ABTS(例如2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应以产生可检测的颜色变化的过氧化物酶标记。或者，标记的抗体或片段用可检测的放射性同位素(例如，3H)标记，该放射性同位素可以在闪烁剂存在下通过闪烁计数器检测。
本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段可以用于蛋白质印迹法或免疫蛋白印迹法。这样的过程构成了本发明的一部分，并且包括例如：
(1)任选地使用本领域已知的方法(例如，半干印迹(semi-dry blotting)或槽式印迹(tank blotting))，将蛋白质从待测试其中是否存在SIRPα的样品中(例如，从样品中蛋白质的PAGE或SDS-PAGE电泳分离)转移到膜或其它固体基质上；使待测试其中是否存在结合的抗SIRPα或其片段的膜或其它固体基质与本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段接触。
(2)洗涤膜一次或多次以除去未结合的抗SIRPα抗体或片段以及其它未结合的物质；以及
(3)检测结合的抗SIRPα抗体或片段。
这种膜可采取硝酸纤维素膜或乙烯基膜(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF))的形式，要在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中检测其中是否存在SIRPα的蛋白质已被转移(例如，在凝胶中进行电泳分离之后)至所述硝酸纤维素膜或乙烯基膜。在使膜与抗SIRPα抗体或片段接触之前，任选地用例如脱脂奶粉等将膜封闭，以结合膜上的非特异性蛋白质结合位点。
结合抗体或片段的检测表明SIRPα蛋白存在于膜或基质上以及样品中。结合的抗体或片段的检测可以通过将抗体或片段与被可检测地标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合，然后检测第二抗体的存在来进行。
本文公开的抗SIRPα抗体及其抗原结合片段也可以用于免疫组织化学。这样的方法形成了本发明的一部分，并且包括例如：
(1)使待测试其中是否存在抗SIRPα抗体的细胞(例如，含有髓样细胞(诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞)的样品)与本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段接触；以及
(2)检测细胞上或细胞内的所述抗体或片段。
如果抗体或片段本身被可检测地标记，则可以直接检测其。或者，抗体或片段可被被检测到的可检测地标记的第二抗体结合。
文公开的某些抗SIRPα抗体及其抗原结合片段也可用于体内肿瘤成像。这样的方法可包括将放射性标记的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段注射到待测试其中是否存在与SIRPα表达相关的肿瘤(例如，其例如在肿瘤细胞表面上表达SIRPα)的患者体内，然后对患者身体进行核成像，以检测标记的抗体或片段例如在包含高浓度结合至肿瘤的抗体或片段的位置处的存在。所述位置的检测表明SIRPα+肿瘤和肿瘤细胞的存在。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层扫描)或PET成像(正电子发射断层扫描)。标记物包括例如碘123(123I)和锝-99m(99mTc)(例如，与SPECT成像结合)或11C、13N、15O或18F(例如，与PET成像结合)或铟111(参见，例如，Gordon等，(2005)InternationalRev.Neurobiol.67:385-440)。
药物组合物和施用
为了制备本发明的抗SIRPα抗体和抗原结合片段的药物或无菌组合物，将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉剂、浆剂、水溶液或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，Hardman等(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,NY；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定单独或与另一种治疗剂组合施用的本发明抗体的毒性和治疗功效，例如，用于测定LD50(50％的群体是致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。从这些细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选在几乎没有或没有毒性的循环浓度的范围内，该循环浓度包括ED50。剂量可以根据所采用的剂型和施用途径在该范围内变化。
在另外的实施方案中，根据Physicians'Desk Reference 2003(ThomsonHealthcare；第57版(2002年11月1日))，与本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段结合向受试者施用的另外的治疗剂。
施用模式可变化。施用途径包括口服、经直肠、透粘膜、经肠、肠胃外；肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮肤或动脉内。
在特定的实施方案中，本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段可以通过侵入性途径(诸如通过注射)来施用。在本发明的另外的实施方案中，抗SIRPα抗体或其抗原结合片段或其药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、动脉内、肿瘤内或通过吸入、气雾剂递送施用。通过非侵入性途径(例如，口服；例如，以丸剂、胶囊剂或片剂的形式)的施用也在本发明的范围内。
本发明提供了包含本发明的任何抗体或抗原结合片段或其药物组合物的容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、空心针或注射器筒)。本发明还提供了注射装置，其包含本发明的任何抗体或抗原结合片段或其药物组合物。注射装置是通过肠胃外途径例如肌内、皮下或静脉内将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，诸如自动注射器)，所述注射器例如包括用于容纳待注射流体(例如抗体或片段或其药物组合物)的圆筒或圆桶、用于将皮肤和/或血管穿刺以注射流体的针；以及用于将流体推出圆筒并通过针孔的柱塞。在本发明的实施方案中，包含本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。这样的装置在套管或套管针/针中包含抗体或其片段或药物组合物，所述套管或套管针/针可以连接到管，所述管可以连接到用于容纳流体(例如，盐水；或包含NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl2和任选地包括葡萄糖的乳酸林格氏液)通过套管或套管针/针引入患者体内的袋或储存器。在本发明的实施方案中，一旦将套管针和套管插入受试者的静脉中并且从所插入的套管中取出套管针，就可以将抗体或其片段或药物组合物引入装置中。IV装置可以例如被插入到外周静脉中(例如，手或手臂中)。上腔静脉或下腔静脉，或心脏右心房内(例如中枢静脉)；或进入锁骨下静脉、颈内静脉或股静脉以及例如向心脏前进直至其到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉线路)。在本发明实施例中，注射装置是自动注射器、射流注射器或外部输液泵。射流注射器使用高压窄液体射流穿透表皮，将抗体或其片段或药物组合物引入患者体内。外部输液泵是将抗体或其片段或药物组合物以受控量输送到患者体内的医疗装置。外部输液泵可以电或机械驱动的。不同的泵以不同的方式运行，例如，注射泵将流体保持在注射器的储液器中，可移动的柱塞控制流体的输送，弹性泵将流体保持在可拉伸的球囊储液器中，来自球囊弹性壁的压力驱动流体输送。在蠕动泵中，一组滚子在一段挠性管上向下挤压，将流体向前推动。在多通道泵中，流体可以多种速率从多个储液器中输送出来。
本文公开的药物组合物还可以与无针皮下注射装置一起施用；诸如美国专利第6,620,135号、第6,096,002号、第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中公开的装置。这种包含药物组合物的无针装置也是本发明的一部分。本文公开的药物组合物也可通过输注施用。用于施用药物组合物的公周知的植入物和模块的实例包括在以下文献中公开的那些：美国专利第4,487,603号，其公开了可用于以受控的速率分配药物的植入的微输注泵；美国专利第4,447,233号，其公开了用于以精确的输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开了用于连续药物输送的可变流量可植入输注器械；美国专利第4,439,196号，其公开了具有多腔室的渗透药物输送系统。许多其它此类植入物、输送系统和模块是本领域技术人员公知的，并且包含本发明的药物组合物的那些植入物、递送系统和模块也在本发明的范围内。
或者，可以以局部而非全身性方式施用本发明的抗SIRPα抗体或抗原结合片段，例如，通过将抗体或片段直接注射到肿瘤中。此外，可以在靶向药物输送系统中(例如在用靶向例如肿瘤的组织特异性抗体包被的脂质体中)施用抗体或片段。脂质体将被靶向患病组织并被患病组织选择性吸收。此类方法和脂质体是本发明的一部分。
施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案输送足够的治疗性抗体或片段以实现靶疾病状态的改善，同时最小化不希望的副作用。因此，所输送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重性。可获得选择合适剂量的治疗性抗体或片段的指南(参见例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编辑)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编辑)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,NY；Baert等(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等(1999)NewEngl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.3 44:783-792；Beniaminovitz等(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
临床医生例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素来确定合适的剂量。通常，剂量以比最佳剂量稍小的量开始，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用达到期望或最佳效果为止。重要的诊断度量包括那例如炎症的症状或所产生的炎性细胞因子的水平中的那些度量。通常，期望将要使用的生物制品与靶向用于治疗的动物源自相同的物种，从而使对该试剂的任何免疫响应减至最小。在人受试者的情况下，例如，人源化和完全人抗体可能是理想的。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以通过连续输注或通过例如每天1次、每周1-7次、每周1次、每两周1次、每月1次、每两个月1次、每季度1次、每半年1次、每年1次等施用的剂量来提供。可例如通过静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、经直肠、肌内、脑内、脊髓内或通过吸入提供剂量。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/mL、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多(参见，例如，Yang，等(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144)。还可以提供剂量以在受试者血清中达到抗SIRPα抗体的预定目标浓度，诸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/mL或更高。在其它实施方案中，可将本发明的抗SIRPα抗体以例如每周1次、每两周1次、“每四周1次”、每月1次、每两个月1次或每季度1次以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者皮下或静脉内施用。
如本文中所用，术语“有效量”是当将本发明的抗SIRPα或其抗原结合片段单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，可以有效地引起疾病(例如癌症或癌症进展)的一种或多种症状的可测量的改善的所述抗SIRPα或其抗原结合片段的量。有效剂量还指抗体或片段足以导致至少症状的部分改善(例如，肿瘤的收缩或消除、肿瘤生长的缺乏、增加的存活时间)的量。当应用于单独施用的单种活性成分时，有效剂量是指单独的该成分。当应用于组合时，有效剂量是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合、连续还是同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断度量或参数改善至少10％；通常至少增加20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观度量评估疾病严重度的情况下，有效量还可导至主观度量的改善。
试剂盒
还提供了包含与一种或多种其它组分(包括但不限于药学上可接受的载体和/或治疗剂，如本文所述的)结合的一种或多种组分(所述组分包括但不限于本文所论述的抗SIRPα抗体或抗原结合片段)的试剂盒。可将抗体或片段和/或治疗剂配制为纯组合物或与药学上可接受的载体组合配制于药物组合物中。
在一个实施方案中，试剂盒在一个容器(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)包含本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段或其药物组合物和/或在另一个容器中中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)包含治疗剂和其药物组合物。
在另一个实施方案中，试剂盒在单个共同的容器中包含本发明的组合，包括任选地在药物组合物中的任选地与一种或多种配制在一起的治疗剂组合的本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
如果试剂盒包括用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，则试剂盒可包括用于进行这种施用的装置。例如，试剂盒可包括一个或多个皮下注射针或如上所述的其它注射装置。
试剂盒可包括包装插页，其包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，这样的信息帮助患者和医生有效且安全地使用封装的药物组合物和剂型。例如，以下关于本发明的组合的信息可以在插页中提供：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、超剂量、适当的剂量和施用、如何提供、适当的储存条件、参考文献、制造商/分销商信息和专利信息。
试剂盒还包含第二治疗剂，例如以下治疗剂中的一种或多种：抗CD47抗体、抗APRIL抗体、抗PD-1抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、抗PDL1抗体、抗TIGIT抗体、抗CTLA4抗体、抗CS1抗体(例如，埃罗妥珠单抗)、抗-KIR2DL1/2/3抗体(例如，立鲁单抗)、抗CD137抗体(例如，乌鲁单抗(urelumab))、抗GITR抗体(例如，TRX518)、抗PD-L1抗体(例如，BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗PD-L2抗体、抗ILT1抗体、抗ILT2抗体、抗ILT3抗体、抗ILT4抗体、抗ILT5抗体、抗ILT6抗体、抗ILT7抗体、抗ILT8抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、抗ICOS、抗KIR2DL1抗体、抗KIR2DL2/3抗体、抗KIR2DL4抗体、抗KIR2DL5A抗体、抗KIR2DL5B抗体、抗KIR3DL1抗体、抗KIR3DL2抗体、抗KIR3DL3抗体、抗NKG2A抗体、抗NKG2C抗体、抗-NKG2E抗体、抗4-1BB抗体(例如，PF-05082566)、抗TSLP抗体、抗IL-10抗体、IL-10或聚乙二醇化IL-10，或此类靶标的任何小的有机分子抑制剂；与选自由以下组成的组的抗原结合的抗体或其抗原结合片段：AMHR2、AXL、BCMA、CAIX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、内皮因子(Endoglin)、EPHA2、EphA3、FGFR2b、叶酸受体α、岩藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受体、TA-MUC1和PSMA；利妥昔单抗、乌妥昔单抗(ublituximab)、马格妥昔单抗、IMGN-529,SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、达妥昔单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13和(CD20)2xCD16、厄洛替尼(Tarceva)、达雷木单抗、阿伦珠单抗、帕妥珠单抗、布妥昔单抗(brentuximab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、替坦异贝莫单抗、依法妥珠单抗、法勒珠单抗、奥特托珠单抗、卡罗图西单抗、依帕珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、白妥昔单抗、伊沙妥昔单抗、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、莫奥珠单抗、恩司昔单抗、vedotin(Adcetris)、替坦异贝莫单抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC和阿多-曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla)；放射疗法或包括但不限于蒽环类(多柔比星、表柔比星、柔红霉素、伊达比星、米托蒽醌)、奥沙利铂、硼替佐米、环磷酰胺、博来霉素、伏立诺他、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、泼尼松龙、多西他赛、丝裂霉素C、托泊替康/喜树碱、依托泊苷、唑来膦酸、甲氨蝶呤、依鲁替尼、阿柏西普、贝伐珠单抗、托瑞米芬、长春碱、长春新碱、依拉利西、巯嘌呤、沙利度胺、索拉非尼；环状二核苷酸或其它STING途径激动剂等的化学治疗剂。
检测试剂盒和治疗试剂盒
为了方便起见，可在试剂盒(即，预定量的试剂与用于进行诊断或检测测定的说明书的包装组合)中提供本发明的抗SIRPα抗体或其抗原结合片段。在用酶标记抗体或片段的情况下，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供大大优化测定的灵敏度的试剂的溶液浓度。特别地，试剂可以以干燥粉末提供，所述干燥粉末通常是冻干的，包括赋形剂，其一旦溶解就将提供具有适当浓度的试剂溶液。
还提供了诊断或检测试剂以及试剂盒，所述试剂盒包含用于多种检测测定(包括例如免疫测定，诸如ELISA(夹心型或竞争性形式))的一种或多种此类试剂。可将试剂盒的组分预先连接到固体支持物上，或者可以在使用该试剂盒时将其施加至固体支持物的表面。在本发明的一些实施方案中，在使用之前，信号产生装置可以与本发明的抗体或片段预先结合，或者可能需要与一种或多种组分例如缓冲液、抗体-酶-缀合物、酶底物等组合。试剂盒还可包括其它试剂，例如用于减少与固相表面的非特异性结合的封闭试剂、洗涤试剂、酶底物等。固相表面可以是管、珠、微量滴定板、微球或适合于固定蛋白质、肽或多肽的其它材料的形式。在特定方面，催化化学发光或生色产物的形成或化学发光或生色底物的还原的酶是信号生成装置的组分。此类酶是本领域公知的。试剂盒可包含本文所述的任何捕获剂和检测试剂。任选地，试试剂盒还可包含用于实施本发明方法的说明书。
还提供了试剂盒，其包含包装在诸如小瓶或瓶子的容器中的抗SIRPα抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，并且还包含附于该容器或与该容器一起包装的标签，该标签描述容器的内容物，并提供关于使用容器的内容物治疗一种或多种本文所述的疾病状态的指示和/或说明书。
在一个方面，试剂盒用于治疗癌症，并且包含抗SIRPα抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段以及其它治疗剂或疫苗。试剂盒可以任选地还包括用于肠胃外例如静脉内施用的注射器。在另一方面，试剂盒包含抗SIRPα抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段以及附于容器或与容器一起包装的标签，其描述抗体或片段与疫苗或其它治疗剂的用途。在另一方面，试剂盒包含疫苗或其它治疗剂和附于容器或与容器一起包装的标签，其描述疫苗或其它治疗剂与抗SIRPα抗体或片段的用途。在某些实施方案中，抗SIRPα抗体和疫苗或其它治疗剂存在于单位的小瓶中或组合在同一药物组合物中。
如上文在联合治疗部分中所讨论的，两种治疗剂的同时施用不需要同时或通过相同途径施用所述剂，只要在所述剂发挥其治疗作用的时间段内存在重叠即可。设想同时或顺序施用，如在不同天或周施用。
还可制备本文公开的治疗和检测试剂盒，其包含本文公开的抗体、肽、抗原结合片段或多核苷酸中的至少一种，以及使用该组合物作为检测试剂或治疗剂的说明书。用于这种试剂盒的容器通常可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它合适的容器，可将一种或多种检测和/或治疗性组合物放入其中，以及优选地适当地进行等分。在还提供第二治疗剂的情况下，试剂盒还可包含第二种不同的容器，可将第二检测和/或治疗性组合物可放入其中。或者，可在单一药物组合物中制备多种化合物，并且可将其包装在单个容器装置,诸如小瓶、烧瓶、注射器、瓶子或其它合适的单个容器中。本文所公开的试剂盒通常还将包括用于紧密封闭地容纳一个或多个小瓶以进行商业销售的装置，例如将所需的一个或多个小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。在于试剂盒中包括放射性标记物、生色标记物、荧光标记物或其它类型的可检测标记物或检测手段的情况下，可将标记试剂与检测或治疗性组合物本身放在同一容器中提供，或者可选地放置在第二不同的容器装置中，可将该第二组合物放入所述第二容器中并适当地等分。或者，可在单个容器装置中制备检测试剂和标记物，并且在大多数情况下，试剂盒通常还将包括用于紧密封闭地容纳一个或多个小瓶以用于商业销售和/或方便的包装和运输的工具。
还提供了用于执行本文描述的检测或监视方法的装置或器械。这种器械可包括可将样品输入其中的腔室或管、任可选地包括阀门或泵以引导样品流过该装置的流体处理系统、任选地从血液中分离血浆或血清的过滤器、用于添加捕获剂或检测试剂的混合腔室，以及任选地用于检测与捕获剂免疫复合物结合的可检测标记物的量的检测装置。样品流可以是被动的(例如，通过毛细管力、静水力或施加样品后无需进一步操作装置的其它力)，也可以是主动的(例如，通过施加通过机械泵、电渗泵、离心力或增加的气压产生的力)或通过主动力和被动力的组合。
在另外的实施方案中，还提供了处理器、计算机可读存储器以及存储在计算机可读存储器上并且适于在处理器上执行以执行本文描述的任何方法的例程。合适的计算系统、环境和/或配置的实例包括个人计算机、服务器计算机、手持式或膝上型计算机设备、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程消费电子产品、网络PC、小型计算机、大型计算机、分布式计算环境(其包括以上系统或装置的任一种)或本领域已知的任何其它系统。
优选实施方案
实施方案1.与人SIRPα结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含以下的一种或多种，任选地以下的每一种:
a.重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
b.重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
c.重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
d.轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
e.轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，以及
f.轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
或者其中所述抗体或抗原结合片段包含以下的一种或多种，任选地以下的每一种：
g.重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
h.重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
i.重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
j.轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，
k.轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列，以及
l.轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列。
实施方案2.实施方案1的抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段包含
每个含有以下序列的重链序列：SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与SEQ ID NO:70相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；和SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与SEQID NO:71相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；
和/或
每个含有以下序列的轻链序列：SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与SEQ ID NO:72相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；和SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQID NO:74相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；
或者其中所述抗体或抗原结合片段包含
每个含有以下序列的重链序列：SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；
和/或
每个含有以下序列的轻链序列：SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列；和SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ IDNO:6相异在于1个、2个或3个保守取代的氨基酸序列。
实施方案3.实施方案2的抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段包含以下之一或两者：
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：
SEQ ID NO:75或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:78或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:82或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:84或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:86或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:88或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:102或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
以及
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：
SEQ ID NO:76或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:90或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:92或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:94或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:96或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:98或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:100或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:104或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
或者其中所述抗体或抗原结合片段包含以下之一或两者：
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：
SEQ ID NO:7或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:10或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:12或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:14或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:16或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:18或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:30或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
以及
含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：
SEQ ID NO:8或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:24或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
SEQ ID NO:26或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:28或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及
SEQ ID NO:32或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案4.实施方案3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段具有以下特征：
与表达人SIRPαV1蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至更优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
与表达人SIRPαV2蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至最优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更小；
在50nM，优选67nM，更优选100nM的抗体浓度下，或者在为抗体针对SIRPαV1或SIRPαV2的EC50的10倍，优选50倍，更优选100倍，且仍然更优选200倍的浓度下不与SIRPβ1蛋白明显地结合；
抑制人SIRPα与CD47之间的结合，其中IC50<10.0nM，更优选<5.0nM，仍然更优选<2.5nM，且最优选约1.0nM或更低；以及
表现出至少79，更优选85的T20“人源性”评分。
实施方案5.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下重链序列/轻链序列组合之一：
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:90，
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:92，
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:94，
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:96，
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:98，
SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:100，
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:90，
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:92，
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:94,
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:96，
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:98，
SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:100，
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:90，
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:92，
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:94，
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:96，
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:98，
SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:100，
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:90，
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:92，
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:94，
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:96，
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:98，
SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:100，
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:90，
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:92，
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:94，
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:96，
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:98，
SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:100，
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:90，
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:92，
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:94，
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:96，
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:98，
SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:100，
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:20，
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:22，
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:24，
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:26，
SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:28，
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:20，
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:22，
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:24，
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:26，
SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:28，
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:20，
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:22，
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:24，
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:26，
SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:28，
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:20，
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:22，
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:24，
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:26，
SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:28，
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:20，
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22，
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:24，
SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:28，
或者在每种情况下，与相应的SEQ ID具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
实施方案6.实施方案1-5中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是完整的IgG。
实施方案7.实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括野生型或经突变的IgG2 Fc区。
实施方案8.实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括经突变的IgG1 Fc区。
实施方案9.实施方案1-6中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括经突变的IgG4 Fc区。
实施方案10.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与根据实施方案5的抗体结合人SIRPα的相同表位。
实施方案11.实施方案1-10中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段被人源化。
实施方案12.实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:10并且每条轻链包含SEQ ID NO:20。
实施方案13.实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:16并且每条轻链包含SEQ ID NO:28。
实施方案14.实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:18并且每条轻链包含SEQ ID NO:20。
实施方案15.实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:80并且每条轻链包含SEQ ID NO:90。
实施方案16.实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:80并且每条轻链包含SEQ ID NO:92。
实施方案17.实施方案1-11中任一项的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，其中每条重链包含SEQ ID NO:80并且每条轻链包含SEQ ID NO:95。
实施方案18.实施方案1-17中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含特征在于哺乳动物细胞表达的糖基化模式，并且任选地通过从CHO细胞表达而糖基化。
实施方案19.一种分离的多肽，其包含以下中的任一个的氨基酸序列：SEQ ID NO:75、78、80、82、84、86、88、76、90、92、94、96、98、100、102、104、7、10、12、14、16、18、30、8、20、22、24、26、28和32中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案20.一种分离的核酸，其编码实施方案1-18的任一种抗体或抗原结合片段，或实施方案19的任一种多肽。
实施方案21.实施方案20的分离的核酸，其包含：
SEQ ID NO:77的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:79的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:81的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:83的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:85的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:87的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:101的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:89的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:91的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:93的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:95的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:97的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:99的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:103的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:9的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:11的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:13的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:15的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:17的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:29的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:19的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:21的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:23的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:25的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
SEQ ID NO:27的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或
SEQ ID NO:31的核酸序列或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
实施方案22.一种表达载体，其包含实施方案22或21的分离的核酸。
实施方案23.实施方案22的表达载体，其编码抗SIRPα抗体的重链序列和轻链序列，所述表达载体包含以下选自由以下组成的组的第一核酸序列/第二核酸序列：
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:89，
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:91，
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:93，
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:95，
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:97，
SEQ ID NO:77/SEQ ID NO:99，
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:89，
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:91，
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:93，
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:95，
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:97，
SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:99，
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:89，
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:91，
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:93，
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:95，
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:97，
SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:99，
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:89，
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:91，
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:93，
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:95，
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:97，
SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:99，
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:89，
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:91，
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:93，
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:95，
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:97，
SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:99，
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:89，
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:91，
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:93，
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:95，
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:97，
SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:99，
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:19，
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:21，
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:23，
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:25，
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:27，
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:19，
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:21，
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:23，
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:25，
SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:27，
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:19，
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:21，
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:23，
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:25，
SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:27，
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:19，
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:21，
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:23，
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:25，
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:27，
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:19，
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:21，
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:23，
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:25，和
SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:27，
或者在每种情况下，与相应的SEQ ID NO具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性。
实施方案24.一种宿主细胞，其包含实施方案22或23的表达载体。
实施方案25.实施方案24的宿主细胞，其产生全长抗SIRPα抗体。
实施方案26.实施方案24或25中任一项的宿主细胞，其为细菌细胞、人细胞、哺乳动物细胞、毕赤酵母属细胞、植物细胞、HEK293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
实施方案27.一种组合物，其包含实施方案1-18中任一项的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂。
实施方案28.实施方案27的组合物，其还包含诱导ADCC和/或ADCP的第二抗体或其抗原结合片段，其中本发明的所述抗体或抗原结合片段增强了第二抗体进行的抗体介导的细胞破坏。
实施方案29.根据实施方案28的组合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的抗原结合：AMHR2、AXL、BCMA、CAIX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、Endoglin、EPHA2、EphA3、FGFR2b、叶酸受体α、岩藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受体、TA-MUC1和PSMA。
实施方案30.根据实施方案29的组合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：利妥昔单抗、乌妥昔单抗、马格妥昔单抗、IMGN-529、SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、达妥昔单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13和(CD20)2xCD16、厄洛替尼(Tarceva)、达雷木单抗、阿伦珠单抗、帕妥珠单抗、布妥昔单抗、埃罗妥珠单抗、替伊莫单抗、依法妥珠单抗、法勒珠单抗、奥特托珠单抗、卡罗图西单抗、依帕珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、白妥昔单抗、伊沙妥昔单抗、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奥妥珠单抗、恩司昔单抗、vedotin(Adcetris)、替坦异贝莫单抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC和阿多-曲妥珠单抗美坦新(Kadcyla)。
实施方案31.根据实施方案28的组合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段诱导ADCP。
实施方案32.根据实施方案31的组合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：利妥昔单抗、乌妥昔单抗、马格妥昔单抗、IMGN-529、SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、阿伦珠单抗、替伊莫单抗、法勒珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、GM102、GSK-2857916、PankoMab-GEX、chKM-4927、MDX-1097、MOR202和MOR-208。
实施方案33.实施方案27的组合物，其还包含一种或多种选自由以下组成的组的剂：抗CD27抗体、抗CD47抗体、抗APRIL抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗CTLA4抗体、抗CS1抗体、抗KIR2DL1/2/3抗体、抗CD137抗体、抗GITR抗体、抗PD-L2抗体、抗ILT1抗体、抗ILT2抗体、抗ILT3抗体、抗ILT4抗体、抗ILT5抗体、抗ILT6抗体、抗ILT7抗体、抗ILT8抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、抗ICOS、抗KIR2DL1抗体、抗KIR2DL2/3抗体、抗KIR2DL4抗体、抗KIR2DL5A抗体、抗KIR2DL5B抗体、抗KIR3DL1抗体、抗KIR3DL2抗体、抗KIR3DL3抗体、抗NKG2A抗体、抗NKG2C抗体、抗NKG2E抗体、抗4-1BB抗体、抗TSLP抗体、抗IL-10抗体、IL-10、聚乙二醇化IL-10；TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、Toll样受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM-1、LFA-1(CDlla/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAM7、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段或可溶性融合物)；CD47抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA4抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、CEACAM(例如，CEACAM-1、-3和/或-5)抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、LAIRl抑制剂、IDO抑制剂、TDO抑制剂、CD160抑制剂、TGFRβ抑制剂以及环状二核苷酸或其它STING途径激动剂。
实施方案34.一种产生抗体或抗原结合片段的方法，其包括：
在有利于多核苷酸表达的条件下培养包含编码实施方案1-18的抗体或抗原结合片段的任一种的重链和/或轻链的多核苷酸的宿主细胞；以及任选地，从宿主细胞和/或培养基中回收抗体或抗原结合片段。
实施方案35.一种用于检测样品中SIRPα肽或其片段的存在的方法，其包括使样品与实施方案1-18中任一项的抗体或片段接触，并检测抗体或片段与肽之间的复合物的存在；其中复合物的检测表明SIRPα肽的存在。
实施方案36.根据实施方案1-18中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案21-25中任一项所述的组合物，其用于治疗癌症或传染病。
实施方案37.根据实施方案1-18中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案27-33中任一项所述的组合物，其用减少人受试者中的SIRPα/CD47信号传导。
实施方案38.一种治疗人受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用其有效量的实施方案1-18中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据实施方案22或23中任一项的表达载体，或根据实施方案24-26中任一项的宿主细胞或根据实施方案27-33中任一项的组合物，任选地与其它治疗剂或治疗程序结合。
实施方案39.一种治疗人受试者的癌症的方法，其包括：
向受试者施用有效量的
(i)诱导ADCC和/或ADCP的抗体或其抗原结合片段；以及
(ii)实施方案1-18中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据实施方案22或23中任一项的表达载体，或根据实施方案24-26中任一项的宿主细胞或根据实施方案27-33中任一项的组合物，任选地与其它治疗剂或治疗程序结合，
其中(ii)的施用增强了诱导ADCC和/或ADCP的抗体或其抗原结合片段进行的抗体介导的细胞破坏。
实施方案40.根据实施方案39的组合物，其中诱导ADCC和/或ADCP的所述第二抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的抗原结合：AMHR2、AXL、BCMA、CA IX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、Endoglin、EPHA2、EphA3、FGFR2b、叶酸受体α、岩藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受体、TA-MUC1和PSMA。
实施方案41.根据实施方案40的组合物，其中诱导ADCC和/或ADCP的所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：利妥昔单抗、乌妥昔单抗、马格妥昔单抗、IMGN-529、SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、达妥昔单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13和(CD20)2xCD16、厄洛替尼(Tarceva)、达雷木单抗、阿伦珠单抗、帕妥珠单抗、布妥昔单抗、埃罗妥珠单抗、替伊莫单抗、依法妥珠单抗、法勒珠单抗、奥特托珠单抗、卡罗图西单抗、依帕珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、白妥昔单抗、伊沙妥昔单抗、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奥妥珠单抗、恩司昔单抗、vedotin(Adcetris)、替坦异贝莫单抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC和阿多-曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Kadcyla)。
实施方案42.根据实施方案39或40的组合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段诱导ADCP。
实施方案43.根据实施方案42的组合物，其中所述第二抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：利妥昔单抗、乌妥昔单抗、马格妥昔单抗、IMGN-529、SCT400、维妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、阿伦珠单抗、替伊莫单抗、法勒珠单抗、依那利珠单抗、鲁姆妥珠单抗、4G7SDIE、BMS-986012、BVX-20、莫加母丽珠单抗、ChiLob-7/4、GM102、GSK-2857916、PankoMab-GEX、chKM-4927、MDX-1097、MOR202和MOR-208。
实施方案44.一种治疗人受试者的癌症或传染病的方法，其包括向受试者施用有效量的实施方案1-18中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据实施方案22或23中任一项的表达载体，或根据实施方案24-26中任一项的宿主细胞或根据实施方案27-33中任一项的组合物，任选地与其它治疗剂或治疗程序结合。
实施方案45.一种具有以下特征的一种或多种的抗体：
结合具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1蛋白，其中优选地当通过细胞ELISA测量时，EC50<1nM；针对具有SEQ ID NO:62的序列的SIRPαV1(P74A)表现出高至少100倍的EC50；并且针对具有SEQ ID NO:38的序列的人SIRPβ1蛋白表现出高至少100倍的EC50；
与表达人SIRPαV1蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至更优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
与表达人SIRPαV2蛋白的细胞结合，其中EC50<10nM，优选<5nM，更优选<1.5nM，仍然更优选<1.0nM，甚至最优选<0.5nM，且最优选约0.3nM或更低；
在50nM，优选67nM，更优选100nM的抗体浓度下；或者在为抗体针对SIRPαV1或SIRPαV2的EC50的10倍，优选50倍，更优选100倍，且仍然更优选200倍的浓度下不与SIRPβ1蛋白明显地结合；
抑制人SIRPα与CD47之间的结合，其中IC50<10.0nM，更优选<5.0nM，仍然更优选<2.5nM，且最优选约1.0nM或更低；以及
表现出至少79，更优选85的T20“人源性”评分。
实施方案46.实施方案45的抗体或抗原结合片段，其结合具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1蛋白，其中EC50<1nM；针对具有SEQ ID NO:62的序列的SIRPαV1(P74A)表现出高至少100倍的EC50；并且针对具有SEQ ID NO:38的序列的人SIRPβ1蛋白表现出高至少100倍的EC50。
实施方案47.实施方案45或46的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条轻链，以及含有SEQ ID NO:10或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条重链。
实施方案48.实施方案45或46的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:28或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条轻链，以及含有SEQ ID NO:16或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条重链。
实施方案49.实施方案45或46的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条轻链，以及含有SEQ ID NO:18或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条重链。
实施方案50.实施方案45或46的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:90或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条轻链，以及含有SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条重链。
实施方案51.实施方案45或46的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:92或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条轻链，以及含有SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条重链。
实施方案52.实施方案45或46的抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:96或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条轻链，以及含有SEQ ID NO:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的一条或两条重链。
实施方案53.实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是完整的IgG。
实施方案54.实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括野生型或经突变的IgG2 Fc区。
实施方案55.实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括经突变的IgG1 Fc区。
实施方案56.实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括经突变的IgG4 Fc区。
实施方案57.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与根据实施方案45-52中任一项的抗体结合人SIRPα的相同表位。
实施方案58.实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段被人源化。
实施方案59.一种组合物，其包含实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂。
实施方案60.根据实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段或根据实施方案59的组合物，其用于治疗癌症或传染病。
实施方案61.根据实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段或根据实施方案59的组合物，其用于减少人受试者中的SIRPα/CD47信号传导。
实施方案62.一种治疗人受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的根据实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据实施方案59的组合物，任选地与其它治疗剂或治疗程序结合。
实施方案63.一种治疗人受试者的感染或传染病的方法，其包括向受试者施用有效量的根据实施方案45-52中任一项的抗体或抗原结合片段，或根据实施方案59的组合物，任选地与其它治疗剂或治疗程序结合。
一般方法
分子生物学中的一般方法描述于Sambrook、Fritsch和Maniatis(1982&1989第2版，2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA)。标准方法也出现在Ausbel,等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley和Sons,Inc.New York,NY，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)中。
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley和Sons,Inc.,NewYork)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley和Sons,Inc.,New York；Ausubel等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley和Sons,Inc.,NY,NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham PharmaciaBiotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.，第384-391页)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等(2001)Current Protcols in Immunology,第1卷,John Wiley和Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow和Lane，同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可得的(参见，例如，Coligan等(2001)Current Protocolsin Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,New York)。
可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见，例如，Sheperd和Dean(编辑)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann和Dubel(编辑)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY，第139-243卷；Carpenter等(2000)J.Immunol.165:6205；He等(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等(1989)Nature 342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利第6,329,511号)。
人源化的替代方法是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等(2001)Phage Display:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:ALaboratory Manual,AcademicPress,San Diego,CA；de Bruin等(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)等。
描述了单链抗体和双抗体(参见，例如，Malecki等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218；Conrath等(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350；Desmyter等(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189；以及美国专利第4,946,778号)。提供了双功能抗体(参见，例如，Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15；Volkel等(2001)Protein Engineering 14:815-823；Segal等(2001)J.Immunol.Methods 248:1-6；Brennan等(1985)Science 229:81-83；Raso等(1997)J.Biol.Chem.272:27623；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Traunecker等(1991)EMBO J.10:3655-3659；和美国专利第5,932,448号、第5,532,210号和第6,129,914号)。
提供了双特异性抗体(参见，例如，Azzoni等(1998)J.Immunol.161:3493；Kita等(1999)J.Immunol.162:6901；Merchant等(2000)J.Biol.Chem.74:9115；Pandey等(2000)J.Biol.Chem.275:38633；Zheng等(2001)J.Biol Chem.276:12999；Propst等(2000)J.Immunol.165:2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875)。
抗原的纯化不是抗体的产生所必需的。可用具有目标抗原的细胞免疫动物。然后可从被免疫的动物中分离脾细胞，并且可将脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如，Meyaard等(1997)Immunity 7:283-290；Wright等(2000)Immunity 13:233-242；Preston等，同上；Kaithamana等(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
可将抗体与例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)缀合。抗体可用于治疗、诊断试剂盒或其它目的，并且包括例如与染料、放射性同位素、酶或金属(例如，胶体金)偶联的抗体(参见，例如Le Doussal等(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选(FACS)是可用的(参见，例如，Owens等(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,JohnWiley和Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley和Sons,Hoboken,NJ)。适合用于修饰核酸(包括用作例如诊断剂的核酸引物和探针、多肽和抗体)的荧光剂是可用的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于测定例如抗原性片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的(参见，例如，GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等(2000)Bioinformatics16:741-742；Menne等(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
实施例
以下实施例用于举例说明本发明。这些实施例绝不旨在限制本发明的范围。
实施例1：商业hSIRPα抗体的特异性
各种商购可得的单克隆抗hSIRPα抗体(表7)对于hSIRPα变体1(hSIRPαV1；GenBank登录：NM_001040022.1)(SEQ ID NO:34)、hSIRPα变体2(hSIRPαV2；GenBank登录：D86043.1)(SEQ ID NO:36)、hSIRPβ1(GenBank登录：NM_006065.4)(SEQ ID NO:38)、hSIRPβ1转录物变体3/hSIRPβL(NCBI登录：NM_001135844.3)(SEQ ID NO:117)和hSIRPγ(NCBI登录：NM_018556.3)(SEQ ID NO:40)的结合特异性通过细胞ELISA(CELISA)进行评价。使用CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)确认反应性，所述细胞已使用Lipofectamine 2000，利用亚克隆到pCI-neo载体(Promega,Madison,WI)中的编码hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL和hSIRPγ的全长开放阅读框的cDNA瞬时转染。将CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1、CHO-K1.hSIRPβL和CHO-K1.hSIRPγ细胞接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有5％新生小牛血清(BioWest)和Pen/Strep(Gibco)的(DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育24小时。随后，除去培养基，并将细胞与纯化的hSIRPα抗体(以10μg/mL及其稀释液使用)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用PBS-T洗涤，并在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使针对hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL和hSIRPγ的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)计算EC50值，即观察到总结合信号的50％时的浓度。
表7：用于与本文产生的抗体比较的商购可得的hSIRPα抗体。
如图1和下表8所示，商购可得的hSIRPα抗体与至少hSIRPβ1、hSIRPβL或hSIRPγ发生交叉反应，或显示与hSIRPαV2的等位基因特异性结合。KWAR23抗体与所测试的SIRP受体家族的所有成员发生交叉反应：其与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL和hSIRPγ结合。
表8：
*表示的值是外推的；nd，未检测到
实施例2：抗hSIRPα抗体的免疫和选择
为了产生与所有已知SIRPα等位基因结合但不结合SIRPβ1的SIRPα抗体，用编码hSIRPαV1和hSIRPαV2的pCI-neo表达构建体免疫小鼠。按照制造商的说明，使用Helios基因枪(BioRad,Hercules,Ca)和涂覆有DNA的金子弹(BioRad)通过基因枪免疫对小鼠进行免疫。简言之，用pCI-neo-hSIRPαV1或pCI-neo-hSIRPαV2 cDNA以及用于小鼠Flt3L和小鼠GM-CSF的商业表达载体(两者均来自Aldevron,Fargo,ND)以2:1:1的比例包被1μm金颗粒。将总共1μg质粒DNA用于包被500μg金颗粒。具体地，用基因枪在耳朵中免疫7-8周龄的雌性BALB/C小鼠(Harlan)，在两只耳朵中接受3个施用周期。
为了进行阳性和阴性B细胞选择和CELISA目的，通过用分别编码hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1和hCD47(NCBI登录：NM_001777.3)(SEQ ID NO:42)的全长开放阅读框的pCI-neo载体转染CHO-K1细胞来产生CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1和CHO-K1.hCD47稳定细胞系。通过有限稀释获得稳定的克隆。
使用CHO-K1.hSIRPαV1和CHO-K1.hSIRPαV2稳定细胞系，通过CELISA评估抗体滴度。将这些表达hSIRPα的CHO-K1细胞系维持在补充有10％胎牛血清(Hyclone)和80U Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco)中。将细胞以8x104个细胞/孔接种到96孔平底组织培养板中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下培养直至细胞层汇合。将细胞与稀释的小鼠血清的每个样品在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤，并与山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(Southern Biotech)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使抗hSIRPα免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。如在两次DNA免疫后检测到的，每个单独的小鼠血清样品中的抗hSIRPα滴度均高于1:2,500。对所有表现出针对hSIRPαV1和hSIRPαV2的反应性的小鼠进行最后的第三次免疫，并在14天后处死小鼠。如先前所述(Steenbakkers等，1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等，1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134)制备贫红细胞的脾和淋巴结细胞群并将其于-180℃下冷冻。
为了选择产生抗hSIRPα抗体的B细胞，设计并开发了选择策略，其优先结合表达与hSIRPαV1和hSIRPαV2结合的抗体的B细胞。从经hSIRPαV1/V2免疫的小鼠中收获脾细胞和淋巴结，并将分离的细胞与CHO-K1.hSIRPβ1一起孵育，将其接种到T25培养瓶中并以30Gray进行辐照。1小时后，通过前后移动烧瓶轻轻地除去未结合的细胞。然后将包含未结合细胞的培养基转移到新的T25烧瓶中，该烧瓶中含有经照射的CHO-K1.hSIRPβ1细胞。在冰上总共进行了三遍此程序，以便阴性选择hSIRPβ1反应性B细胞。接着，将含有未结合的B细胞的培养基与以3,000Gray辐照的CHO-K1.hSIRPαV1和CHO-K1.hSIRPαV2细胞一起孵育。在冰上孵育1.5小时后，使用培养基通过多个洗涤步骤除去未结合的细胞。随后，用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)收获含有结合了淋巴细胞的CHO-K1.hSIRPαV1和CHO-K1.hSIRPαV2细胞的T25烧瓶。如由Steenbakkers等，1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134中所述，培养结合的B细胞。简言之，将所选的B细胞与10％(v/v)T细胞上清液和50,000个经辐照(25Gray)的EL-4B5饲养细胞在96孔平底组织培养中板于终体积为200μl的培养基中混合。在第8天，如下所述通过CELISA筛选上清液的hSIRPαV1和hSIRPαV2反应性。
将CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2和CHO-K1.hSIRPβ1接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有10％胎牛血清(Hyclone)和80U Pen/Strep(Gibco)的(DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下和95％湿度下进行培养直至它们汇合。随后，除去培养基，并将细胞与来自B细胞培养物的上清液在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使抗hSIRPαV1、抗hSIRPαV2和抗hSIRPβ1的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。
使用重组hSIRPγ/Fc蛋白(R&D Systems，目录号4486-SB-050；SEQ ID NO:108)包被的96孔MaxiSorp平底板通过ELISA评估了对人SIRPγ的免疫反应性。在室温(RT)下，将蛋白包被的96孔板在PBS/1％牛血清白蛋白(BSA)中封闭1小时。除去PBS/1％BSA，并将板用来自B细胞培养物的上清液在室温下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤板，并将其在室温下用山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(Southern Biotech)孵育1小时。随后，将孔用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使抗hSIRPγ的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。
遵循已公布的程序(Steenbakkers等，1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-34)(但有一些细微的偏差(例如，省略了链霉蛋白酶反应))，通过微型电融合使来自hSIRPα反应性上清液的B细胞克隆(其对hSIRPβ1不具有反应性或对hSIRPβ1具有最小反应性)永生化。简言之，将B细胞与106Sp2/0-Ag14鼠骨髓瘤细胞(ATCC CRL-1581)在电融合等摩尔缓冲液(Electrofusion Isomolar Buffer)(Eppendorf)中混合。在50μL融合室中通过15s,1MHz,23Vrms AC的交变电场，然后通过10μs,180伏DC的方形高场DC脉冲，以及再次通过15s,1MHz,23Vrms AC的交变电场进行电融合。将腔室的内容物转移到杂交瘤选择培养基，并在有限的稀释条件下将其铺板在96孔板中。如上所述，在电融合后的第10天，通过CELISA和ELISA筛选杂交瘤上清液的hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1和hSIRPγ结合活性。将在上清液中分泌特异性结合hSIRPαV1和hSIRPαV2的杂交瘤均在在-180℃(-1批)下冷冻，并通过有限稀释进行亚克隆以保护其完整性和稳定性。将稳定的杂交瘤细胞在-180℃下冷冻(-LD1批)，直至到细胞层汇合。
通过以CELISA形式评估hSIRPαV1/hCD47相互作用的阻断能力来进行杂交瘤的进一步选择。为了评估hCD47的阻断，将CHO-K1.hCD47细胞接种在384孔平底组织培养板中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下于培养基中孵育。将重组hSIRPα/Fc蛋白(R&D Systems，目录号4546-SA-050；SEQ ID NO:107)在37℃、5％CO2和95％湿度下，用含有hSIRPα反应性抗体和对照抗体(10μg/mL及其稀释液)的杂交瘤细胞上清液的系列稀释液预孵育30分钟。将汇合的CHO-K1.hCD47细胞用PBS-T洗涤，并在37℃、5％CO2和95％湿度下与含有hSIRPα反应性抗体和重组hSIRPα/Fc蛋白的混合物孵育1小时。接着，将细胞用PBS-T洗涤，然后将山羊抗人IgG-HRP缀合物(Jackson Immuno Research)添加至细胞，将其在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使hSIRPα/Fc-蛋白的结合可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。
将所选择的稳定杂交瘤在无血清培养基中培养7天；收集上清液，并根据制造商的说明(GE Healthcare)使用MabSelect Sure蛋白A树脂纯化抗体。使用分光光度法定量抗体浓度。使用杂交瘤培养物的上清液对杂交瘤进行同种型分型。简言之，使用小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Biorad)，基于具有针对每种常见小鼠同种型和轻链的固定的山羊抗小鼠抗体条带的浸渍片进行同种型分型。回收的抗体均被鉴定为小鼠IgG1。使用以下方法，通过在LakePharma进行的小鼠IgG1杂交瘤材料的可变区测序来阐明抗体序列：提取杂交瘤细胞的总RNA，所述RNA允许cDNA合成。进行了cDNA末端的快速扩增(RACE)，这允许将阳性片段克隆到TOPO(Thermo Fisher Scientific)载体中。对TOPO克隆进行测序，并使用VBASE2(Retter等，VBASE2,an integrative V gene database.Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(Database issue):D671-4)对序列进行注释。
实施例3：hSIRPα抗体的表征
以CELISA形式将抗体hSIRPα.50A与hSIRPα的结合特异性与抗体KWAR23(加拿大专利2939293A1)进行比较。用hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1和hSIRPγ(GenBank目录号：NM_018556.3)(SEQ ID NO:39)cDNA瞬时转染CHO-K1细胞。随后，使用CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1和CHO-K1.hSIRPγ细胞通过CELISA评估hSIRPα结合。用针对小鼠抗体的山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)(包括hSIRPα.50A)和对照抗体或者，可选地利用针对KWAR23抗体的山羊抗人IgG-HRP缀合物(Jackson Immuno Research)检测结合的抗体。KWAR23(SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:131)在CHO细胞中被表达为嵌合人IgG4κ抗体。如图2和下表9中所示，KWAR23抗体与所测试的SIRP受体家族的所有成员交叉反应：其与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1和hSIRPγ结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算出的)。
表9：
空方块表示n＝1个测量值。nd，未检测到
另外，使用与上述策略相同的策略，通过CELISA进一步研究了hSIRPα.50A对所有已知的hSIRPα等位基因(如由Takenaka等，2007,Nat Immunol.8:1313-1323描述的等位基因变体)的特异性。为此，使用用编码全长hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPαV3(NA07056_V3)(SEQID NO:43)、hSIRPαV4(NA11832_V4)(SEQ ID NO:45)、hSIRPαV5(NA18502_V5)(SEQ ID NO:47)、hSIRPαV6(NA18507_V6)(SEQ ID NO:49)、hSIRPαV8(NA18570_V8)(SEQ ID NO:51)和hSIRPαV9(NA18943_V9)(SEQ ID NO:53)的cDNA瞬时转染的CHO-K1细胞评估hSIRPα.50A结合。图3和下表10展示了抗体克隆hSIRPα.50A对这些hSIRPα等位基因中的每一种的反应性。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算得出的)。
表10：
实施例4：hSIRPα.50A的hCD47阻断能力
通过流式细胞术分析了hSIRPα.50A抗体阻断重组hCD47/Fc蛋白(R&D Systems，目录号4670-CD-050；SEQ ID NO:109)与细胞表面表达的hSIRPα结合的能力。为此，将THP-1(ATCC TIB-202)和U-937(ATCC CRL-1593.2)单核细胞细胞系在测定中用作hSIRPα的来源。将THP-1和U-937细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与FcR封闭试剂(MiltenyiBiotec)和hSIRPα.50A抗体(200μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育45分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与DyLight 488标记的重组hCD47/Fc-蛋白在4℃下孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJoV10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
如图4和下表11所述，在递增量的hSIRPα.50A抗体存在的情况下监测与人IgG1的Fc结构域融合的重组hCD47的结合。通过使用上述基于流式细胞术的方法，抗体hSIRPα.50A阻断了hSIRPα/hCD47的相互作用。从该数据计算出对hCD47的阻断的IC50值。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
表11：
接着，研究了hSIRPα.50A与在原代人CD14+单核细胞上表达的hSIRPα的结合。另外，评估了hSIRPα.50A阻断hSIRPα与重组hCD47/Fc-蛋白之间相互作用的能力。为此，使用RosetteSep人单核细胞富集混合物(Stemcell)从Ficoll纯化的人外周血单核细胞(PBMC)中分离CD14+单核细胞。使用缀合有APC-Cy7的小鼠抗人CD14检测抗体(BD Biosciences)，在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术基于CD14染色来测定富集后存在的单核细胞百分比。随后，将富集CD14+的PBMC接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与包含hSIRPα.50A抗体(25μg/mL及其稀释液)的FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)在PBS/1％BSA中孵育40分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并在4℃下与FITC标记的山羊抗小鼠Ig(BD Biosciences)检测抗体一起在PBS/1％BSA中孵育40分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BDBiosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
图5A和5B以及下表12表明hSIRPα.50A与富集原代人CD14+的单核细胞结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度。为了评估hSIRPα.50A的阻断能力，将富集CD14+的单核细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与FcR阻断试剂(Miltenyi Biotec)和hSIRPα.50A抗体(200μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育45分钟。随后，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与10μg/mL DyLight 488标记的重组hCD47/Fc-蛋白在4℃下孵育45分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。图5C和图5D以及以下表12证明了抗体hSIRPα.50A阻断hSIRPα/hCD47相互作用的能力。从该数据计算出对hCD47的阻断的IC50值。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
表12：
实施例5：hSIRPα.50A mAb在人粒细胞吞噬测定中的功能
为了确认hSIRPα.50A在原代免疫细胞中的功能，从健康的人供体EDTA血液中分离了粒细胞(例如，效应细胞)。首先，合并每个供体的EDTA血液，并在20℃下以300g离心6分钟。接着，通过抽吸除去血浆，并将剩余的血细胞轻轻地重悬。在红细胞(RBC)裂解缓冲液(155mM NH4Cl；10mM KHCO3)中回收细胞，并在冰上孵育10分钟。接着，将细胞以300g离心7分钟。通过抽吸去除含有裂解的RBC的上清液，并将剩余的血细胞轻轻重悬于RBC裂解缓冲液中，并在冰上保持1分钟。通过添加测定培养基(补充有10％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的IMDM(Gibco))中和RBC裂解。将血细胞以300g离心6分钟，并通过抽吸去除上清液，以尽可能多地去除残留的RBC。随后，将红细胞裂解的血细胞重悬于含有10ng/mLIFNγ的测定培养基中，并将细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。通过用测定培养基温和洗涤组织培养板来收集含有人粒细胞的非贴壁血细胞(单核细胞由于粘附到塑料表面而被消耗掉)。基于高前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)，在FACSCanto II(BDBiosciences)上通过流式细胞术测定存在于细胞悬液中的粒细胞的百分比。通过将细胞在4℃下与hSIRPα.50A抗体(25μg/mL及其稀释液)在含有10％自体血清的PBS/1％BSA(PBS/1％BSA/10％血清)中孵育30分钟来评估hSIRPα.50A与人粒细胞的结合。接着，将细胞用PBS/1％BSA/10％血清洗涤3次，并在4℃下与FITC标记的山羊抗小鼠Ig(BD Biosciences)检测抗体一起孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于PBS/1％BSA/10％血清中，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJoV10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。图6A显示hSIRPα.50A与原代人粒细胞结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度。
接着，在Raji(ECACC 85011429)、Daudi(ECACC 85011437)、Ramos(ECACC85030802)和BJAB(DSMZ ACC-757)淋巴瘤细胞的情况下用细胞增殖染料eFluor450(eBioscience)或者，可选地对于FaDu细胞用Vybrant DiD细胞标记溶液(Thermo FisherScientific)对靶细胞进行荧光标记。根据制造商的说明进行标记。在0.1μg/mL利妥昔单抗(抗hCD20)存在的情况下，将标记的靶细胞与分离的原代人粒细胞以1:1的比例(96孔圆底组织培养板的每个孔中7.5*104个每种靶细胞和效应细胞)在37℃、5％CO2和95％湿度下共培养2-3小时。另外，将细胞与0.1μg/mL利妥昔单抗在10μg/mL hSIRPα.50A存在下共培养。通过在FACSCanto II(BD Biosciences)上使用流式细胞术测定对eFluor450(或DID)呈阳性的粒细胞的百分比来测定吞噬作用。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
与小鼠IgG1同种型对照相比，hSIRPα.50A强效地增强了利妥昔单抗诱导的肿瘤细胞吞噬作用(图6B)。对于其它现有的治疗性抗体，诸如0.05μg/mL达雷木单抗(抗hCD38)、0.1μg/mL阿伦珠单抗(抗hCD52)和0.1μg/mL西妥昔单抗(抗hEGFR)，遵循相同的程序(图6C-E)。这些数据证明hSIRPα.50A增强抗体介导的人粒细胞的肿瘤细胞吞噬。
实施例6：hSIRPα.50A mAb在人粒细胞吞噬测定中的功能性
hSIRPα.50A阻断CD47增强了人巨噬细胞对人类淋巴瘤细胞肿瘤细胞的吞噬作用。通过首先使用RosetteSep人单核细胞富集混合物(Stemcell)，从Ficoll纯化的人外周血单核细胞(PBMC)中富集CD14+单核细胞来产生人巨噬细胞。将单核细胞接种到CellCarrier96孔平底微孔板(Perkin Elmer)中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下在含有50ng/mL人单核细胞集落刺激因子(M-CSF)的巨噬细胞培养基(补充有8.5％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的IMDM(Gibco))中进行培养7天，以促进分化为巨噬细胞。这些单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)变得可粘附，从而允许其它细胞被洗掉。根据制造商的说明，对人Raji、Daudi、Ramos和BJAB淋巴瘤细胞进行计数并用细胞增殖染料eFluor450(eBioscience)进行标记。标记后，将淋巴瘤细胞与含有10μg/mL抗hSIRPα抗体、各自同种型对照和0.1μg/mL利妥昔单抗(抗hCD20)或0.05μg/mL达雷木单抗(抗hCD38)的测定培养基(补充有10％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的RPMI(Gibco))混合。然后将淋巴瘤细胞以2.5:1的肿瘤细胞/吞噬细胞的比例添加到含有MDM的各个孔中，混合并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育2小时。孵育后，将孔用PBS洗涤以除去大部分未吞噬的肿瘤细胞，并在室温下用2％甲醛固定细胞10分钟。然后将孔洗涤，并在黑暗中于4℃下在PBS/3％BSA中保持过夜。将孔中存在的淋巴瘤细胞在室温下用生物素缀合的抗人CD19克隆HIB19(eBioscience)染色1小时，然后在室温下用Alexa Fluor 488缀合的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)复染1小时。接着，在室温下用DRAQ5(Thermo Fisher Scientific)将细胞核染色10分钟，除去混合物，并向每个孔中加入PBS。用Operetta自动荧光显微镜(Perkin Elmer)分析细胞。使用Columbus V2.6软件处理和分析数据。
如图7所示，hSIRPα.50A增强了利妥昔单抗和达雷木单抗介导的吞噬活性。如下使用吞噬指数对人淋巴瘤细胞的吞噬进行定量：(巨噬细胞内的肿瘤细胞数/巨噬细胞数)*100；每个样品至少计数200个巨噬细胞。
实施例7：人源化抗体设计和CDR移植
使用CDR移植技术(参见，例如，美国专利第5,225,539号和Williams,D.G.等，2010,Antibody Engineering，第1卷，第21章)将小鼠hSIRPα.50A抗体人源化。
首先，使用IgBLAST(Ye J.等，2013,Nucleic Acids Res.41:W34-40)鉴定人种系序列。对于hSIRPα.50A VH人种系序列，鉴定出V基因IGHV1/OR15-2*02(75.2％同一性)，以及对于VL人种系序列，鉴定出IGKV1-27*01(74.0％同一性)。这两个种系序列用于直接移植小鼠CDR，从而产生以下两种cDNA构建体：SEQ ID NO:17(VH)和SEQ ID NO:25(VL)。
接着，构建数据库，其包含鉴定了85,848条独立序列的IMGT数据库(Lefranc,M.-P.等，1999,Nucleic Acid Res.27:209-212)中可用的所有人序列。使用TBLASTN(2.2.31+)查询这些序列，以鉴定对hSIRPα.50A VH和VL序列的框架具有最高同一性的模板序列。鉴定出三条VH和三条VL序列，所述序列显示出75％或更高的相似性评分并显示出相似的CDR长度，优选分别与hSIRPα.50A VH CDR1、CDR2、CDR3和VL CDR1、CDR2和CDR3中的那些同一。
对于重链，由GenBank(Benson，D.A.等，2013,Nucleic Acids Res.41(D1):D36-42)登录号AB066948、AB067235和U84168编码的框架被选择作为用于hSIRPα.50A VH CDR的直接移植的模板，分别得到以下cDNA构建体：SEQ ID NO:55、9、11和13。对于轻链，由GenBank登录号JF894288、AB363321和L12101编码的框架被选择作为用于hSIRPα.50A VLCDR的直接移植的模板，分别得到以下cDNA构建体：SEQ ID NO:19、21和23。框架和CDR定义是如Kabat等所述的那些("Sequences of Proteins of Immunological Interest",Kabat,E等，USDepartment of Health and Human Services,(1983))。
为了了解人源化框架残基对Fv结构的影响，使用Discovery Studio 4.5中的'抗体建模级联'(默认参数)制备了小鼠hSIRPα.50A Fv的同源性模型。同源性模型基于轻链和Fv的PDB ID 1CIC和重链的PDB ID 4Q0X建立。在计算机上移植了CDR，以研究接近任何CDR并可能影响环构象的残基，所述残基称为游标残基(Vernier residues)。鉴定了可能影响环构象且与CDR表面相距的残基，并在该位置处用小鼠氨基酸对其进行取代。使用Discovery Studio 4.5检查所得模板的翻译后修饰(PTM)基序的存在，并在可能的情况下(即非CDR，非游标残基)进行更改以防止PTM。对于重链，hSIRPα.50A VH中预测的序列PTM基序的去除和结构考虑因素(即骨架的刚性)导致另一种构建体的设计：SEQ ID NO:15。对于轻链，PTM的去除导致以下构建体：SEQ ID NO:27。
将CDR移植到每个鉴定的模板上，表达为人IgG4(SEQ ID NO:65)、κ(SEQ ID NO:63)抗体，被克隆在pcDNA3.1(+)载体(Thermo Fisher Scientific)中并用于在FreeStyle293-F人胚肾细胞(HEK293T/17,ATCC CRL-11268)中进行瞬时转染。在每种情况下，使用携带稳定的Adair突变的IgG4形式(Angal S.等，1993,Mol Immunol.30:105-108)，其中丝氨酸228被转换为脯氨酸。
实施例8：人源化构建体的合成、表达和纯化
将编码重链和轻链构建体的质粒以1:1的比例混合(总计30μg)，并按照制造商的说明通过使用293fectin转染试剂(Invitrogen)转染到FreeStyle 293-F细胞中进行瞬时表达。7天后收获上清液(30ml)，并按照制造商的说明(GE Healthcare)使用MabSelectSure蛋白A树脂纯化抗体。使用Zeba脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)将缓冲液换成10mM组氨酸，100mM NaCl pH 5.5缓冲液。基于OD280(Nanodrop ND-1000)测定纯化的抗体的浓度。按照制造商的说明(Lonza)通过LAL测试测定内毒素水平。
实施例9：人源化SIRPα抗体的结合
以CELISA形式研究了人源化抗体与hSIRPα的结合。hSIRPα抗体与人SIRPαV1、SIRPαV2、hSIRPβ1和hSIRPγ的结合已使用CHO-K1细胞确认，所述CHO-K1细胞已被cDNA瞬时转染，所述cDNA编码亚克隆入pCI-neo载体的这些各个靶标的全长开放阅读框。将CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1和CHO-K1.hSIRPγ细胞接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有5％新生小牛血清(BioWest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育直至细胞层汇合。随后，除去培养基，并将细胞与纯化的hSIRPα抗体(10μg/mL及其稀释液)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗人IgG-HRP缀合物(Jackson Immuno Research)或山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使抗hSIRPα的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。使用GraphPad Prism6(GraphPad Software,Inc.)计算EC50值，即观察到总结合信号的50％时的浓度。在表13中，描述了人源化hSIRPα抗体的EC50值。
表13：人源化和亲本hSIRPα.50A抗体与CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1和CHO-K1.hSIRPγ细胞的结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算得出的)。
表13：
注意，具有H2重链的变体无法在FreeStyle 293-F细胞中表达；*表示的值是外推的；nd，未检测到
使用NK-92MI细胞(ATCC CRL-2408)(一种源自NK-92细胞系的非白细胞介素-2(IL-2)依赖性天然杀伤细胞系)进一步评估了亲本和人源化的hSIRPα抗体与hSIRPγ的结合。将NK-92MI细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与人源化hSIRPα.50A抗体变体(100μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育30分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并在4℃下与FITC标记的小鼠抗人IgG4(Abcam)或驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)检测抗体一起在PBS/1％BSA中孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于PBS/1％BSA中，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
实施例10：人源化hSIRPα.50A抗体阻断hCD47与hSIRPα的结合
通过流式细胞术评估人源化hSIRPα.50A抗体的完全小组的hCD47阻断作用。为此，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用编码人SIRPαV1的全长开放阅读框的pCI-neo载体瞬时转染HEK293细胞(ATCC CRL-1573)。将转染的细胞在培养基(含有10％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中于37℃、5％CO2和95％湿度下培养直至汇合。随后，将细胞解离并接种在96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与人源化的hSIRPα.50A抗体变体(100μg/mL及其稀释液)于PBS/1％BSA中孵育30分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与重组hCD47/Fc-蛋白(ModiQuest；SEQ ID NO:42)在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并在4℃下与小鼠抗人IgG1铰链-FITC(SouthernBiotech)检测抗体一起孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于PBS/1％BSA中，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据，并使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)进行绘图(图8)。
如图8所述，在递增量的人源化hSIRPα.50A抗体变体存在的情况下监测与人IgG1的Fc结构域融合的重组hCD47的结合。所有抗体变体均阻断了hSIRPα/hCD47相互作用。
实施例11：hSIRPα.50A的结合结构域
为了鉴定hSIRPα.50A的结合区，基于人SIRPαV1和hSIRPβ1氨基酸序列设计了几种SIRPα交换突变体。基于SIRPα的折叠，该细胞外区域可细分为三个单独的结构域：Ig样(免疫球蛋白样)V型(IgV)、Ig样C1型(IgC1)和Ig样C2型(IgC2)结构域。IgV结构域也称为SIRPα的配体结合N端结构域(其与CD47结合)。基于全长hSIRPαV1序列(SEQ ID NO:33)设计人SIRPαV1/β1突变体，并且用每个单独的Ig样结构域都取代了人SIRPβ1的等效结构域(SEQID NO:37)。合成(GeneArt)编码构建体hSIRPα-VβC1αC2α(SEQ ID NO:55)、hSIRPα-VαC1βC2α(SEQ ID NO:57)和hSIRPα-VαC1αC2β(SEQ ID NO:59)的cDNA并将其亚克隆到pCI-neo载体中。使用CELISA测试了hSIRPα.50A与交换突变体的结合。为此，使用Lipofectamine 2000，用分别编码hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPα-VβC1αC2α、hSIRPα-VαC1βC2α和hSIRPα-VαC1αC2β的pCI-neo载体瞬时转染CHO-K1细胞。将转染的细胞在培养基(含有5％新生牛血清(Biowest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中于37℃、5％CO2和95％湿度下培养直至汇合。随后，用胰蛋白酶消化细胞并将其接种在96孔平底组织培养板中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下于培养基中培养直至汇合。随后，除去培养基，并将细胞与hSIRPα.50A和抗hSIRPα克隆SE5A5抗体在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使抗hSIRPα免疫响应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。
本发明的抗体显示出与hSIRPα-VβC1αC2α突变体的结合丧失，表明hSIRPα.50A与hSIRPα的IgV结构域结合(图9；表14)。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算得出的)。
表14：
为了精确定位hSIRPα.50A与IgV结构域相互作用的氨基酸，基于hSIRPαV1/V2和hSIRPβ1之间的单个氨基酸差异，产生了hSIRPαV1的几个点突变体。图10A显示hSIRPα与hSIRPβ1IgV结构域的比对。通过使用QuikChange II定点诱变试剂盒(Stratagene)和全长hSIRPαV1序列(SEQ ID NO:33)(作为供体cDNA)，对在hSIRPβ1中发生改变的hSIRPαIgV结构域中的氨基酸进行突变。使用CELISA测试了hSIRPα.50A与hSIRPαV1点突变体的结合。为此，使用Lipofectamine 2000，用亚克隆到pCI-neo载体中的编码hSIRPαV1及其突变体以及hSIRPβ1的全长开放阅读框的cDNA瞬时转染CHO-K1细胞。将转染的细胞接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有5％新生牛血清(BioWest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育24小时。随后，除去培养基，并将细胞与纯化的hSIRPα抗体(以10μg/mL及其稀释液使用)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使针对hSIRPαV1、hSIRPαV1突变体和hSIRPβ1的免疫反应性可视化。用0.5MH2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。使用GraphPad Prism 6(GraphPadSoftware,Inc.)计算EC50值(观察到总结合信号的50％时的浓度)(平均值和SD是由两个独立实验的值计算得出的)。如图10B和下表15所示，在位置74(P74)处的脯氨酸构成了用于hSIRPα.50A与hSIRPαV1的特异性结合的关键氨基酸。hSIRPαV1(P74A)(SEQ ID NO:61)(其中P74转换为丙氨酸)在CHO-K1细胞上的表达导致hSIRPα.50A抗体结合丢失。在hSIRPβ1的IgV结构域序列中不存在该脯氨酸。
表15：
实施例12：hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体的表征
以CELISA形式比较了抗体hSIRPα.40A和hSIRPα.50A与hSIRPα的结合特异性。简言之，用hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL和hSIRPγcDNA瞬时转染CHO-K1细胞。随后，使用CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1、CHO-K1.hSIRPβL和CHO-K1.hSIRPγ细胞通过CELISA评估hSIRPα结合。用山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)进行结合抗体的检测。如图11和下表16所示，hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体与hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβL和hSIRPγ结合，但未显示可检测的hSIRPβ1结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算得出的)。
表16：
nd,未被检测到
另外，使用与上述策略相同的策略，通过CELISA进一步研究了hSIRPα.40A对所有已知的hSIRPα等位基因(如由Takenaka等，Nat Immunol.8:1313-1323(2007)描述的等位基因变体)的特异性。为此，使用用编码全长hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPαV3(NA07056_V3)(SEQID NO:44)、hSIRPαV4(NA11832_V4)(SEQ ID NO:46)、hSIRPαV5(NA18502_V5)(SEQ ID NO:48)、hSIRPαV6(NA18507_V6)(SEQ ID NO:50)、hSIRPαV8(NA18570_V8)(SEQ ID NO:52)和hSIRPαV9(NA18943_V9)(SEQ ID NO:54)的cDNA瞬时转染的CHO-K1细胞评估hSIRPα.40A结合。图12和下表17显示抗体克隆hSIRPα.40A对这些hSIRPα等位基因中的每一种的反应性。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算得出的)。
表17：
实施例13：hSIRPα.40A的hCD47阻断能力
通过流式细胞术分析了hSIRPα.40A抗体阻断重组hCD47/Fc蛋白(R&D Systems，目录号4670-CD-050；SEQ ID NO:109)与细胞表面表达的hSIRPα结合的能力。为此，将THP-1(ATCC TIB-202)和U-937(ATCC CRL-1593.2)单核细胞系在测定中用作hSIRPα的来源。将THP-1和U-937细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与FcR封闭试剂(MiltenyiBiotec)和hSIRPα.40A抗体(100μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育45分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与DyLight 488标记的重组hCD47/Fc-蛋白在4℃下孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJoV10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
如图13和下表18所述，在递增量的hSIRPα.40A抗体存在的情况下监测与人IgG1的Fc结构域融合的重组hCD47的结合。通过使用上述基于流式细胞术的方法，抗体hSIRPα.40A阻断了hSIRPα/hCD47相互作用。从该数据计算出对hCD47的阻断的IC50值。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
表18：
接着，研究了hSIRPα.40A与在原代人CD14+单核细胞上表达的hSIRPα的结合。另外，评估了hSIRPα.40A阻断hSIRPα与重组hCD47/Fc-蛋白之间相互作用的能力。为此，使用RosetteSep人单核细胞富集混合物(Stemcell)从Ficoll纯化的人外周血单核细胞(PBMC)中分离CD14+单核细胞。使用缀合有APC-Cy7的小鼠抗人CD14检测抗体(BD Biosciences)，在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术基于CD14染色来测定富集后存在的单核细胞的百分比。随后，将富含CD14+的PBMC接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与含有hSIRPα.40A抗体(20μg/mL和其稀释液)的FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)一起在PBS/1％BSA中孵育40分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并在4℃下与Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)检测抗体一起在PBS/1％BSA中孵育40分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
图14A和图14B表明hSIRPα.40A与富集原代人CD14+的单核细胞结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度。为了评估hSIRPα.40A的阻断能力，将富集CD14+的单核细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与FcR阻断试剂(Miltenyi Biotec)和hSIRPα.40A抗体(20μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育45分钟。随后，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与10μg/mL DyLight488标记的重组hCD47/Fc-蛋白在4℃下孵育45分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。图14C和图14D证明了抗体hSIRPα.40A阻断hSIRPα/hCD47相互作用的能力。从该数据计算出对hCD47的阻断的IC50值。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
实施例14：hSIRPα.40A mAb在人粒细胞吞噬测定中的功能性
为了确认hSIRPα.40A在原代免疫细胞中的功能性，从健康的人供体EDTA血液中分离了粒细胞(例如，效应细胞)。首先，合并每个供体的EDTA血液，并在20℃下以300g离心6分钟。接着，通过抽吸除去血浆，并将剩余的血细胞轻轻地重悬。在红细胞(RBC)裂解缓冲液(155mM NH4Cl；10mM KHCO3)中回收细胞，并在冰上孵育10分钟。接着，将细胞以300g离心7分钟。通过抽吸去除含有裂解的RBC的上清液，并将剩余的血细胞轻轻重悬于RBC裂解缓冲液中，并在冰上保持1分钟。通过添加测定培养基(补充有10％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的IMDM(Gibco))中和RBC裂解。将血细胞以300g离心6分钟，并通过抽吸去除上清液，以尽可能多地去除残留的RBC。随后，将红细胞裂解的血细胞重悬于含有10ng/mLIFNγ的测定培养基中，并将细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。通过用测定培养基温和洗涤组织培养板来收集含有人粒细胞的非贴壁血细胞(单核细胞由于粘附到塑料表面而被消耗掉)。基于高前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)，在FACSCanto II(BDBiosciences)上通过流式细胞术测定存在于细胞悬液中的粒细胞的百分比。通过将细胞在4℃下与hSIRPα.40A抗体(25μg/mL及其稀释液)在含有10％自体血清的PBS/1％BSA(PBS/1％BSA/10％血清)中孵育30分钟来评估hSIRPα.40A与人粒细胞的结合。接着，将细胞用PBS/1％BSA/10％血清洗涤3次，并在4℃下与FITC标记的山羊抗小鼠Ig(BD Biosciences)检测抗体一起孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于PBS/1％BSA/10％血清中，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJoV10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。图15A和下表19表明hSIRPα.40A与原代人粒细胞结合。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度。
表19：
接着，用细胞增殖染料eFluor450(eBioscience)对Ramos(ECACC 85030802)靶细胞进行荧光标记。根据制造商的说明进行标记。在0.1μg/mL利妥昔单抗(抗hCD20)存在的情况下，将标记的靶细胞与分离的原代人粒细胞以1:1的比例(96孔圆底组织培养板的每个孔中7.5*104个每种靶细胞和效应细胞)在37℃、5％CO2和95％湿度下共培养2-3小时。另外，将细胞与0.1μg/mL利妥昔单抗在10μg/mL hSIRPα.40A存在下共培养。通过在FACSCanto II(BD Biosciences)上使用流式细胞术测定对eFluor450呈阳性的粒细胞的百分比来测定吞噬作用。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。
与小鼠IgG1同种型对照相比，hSIRPα.40A强效地增强了利妥昔单抗诱导的肿瘤细胞吞噬作用(图15B)。
实施例15：hSIRPα.40A mAb在人巨噬细胞吞噬测定中的功能性
hSIRPα.40A阻断CD47增强了人巨噬细胞对人淋巴瘤细胞肿瘤细胞的吞噬作用。通过首先使用RosetteSep人单核细胞富集混合物(Stemcell)，从Ficoll纯化的人外周血单核细胞(PBMC)中富集CD14+单核细胞来产生人巨噬细胞。将单核细胞接种到CellCarrier 96孔平底微孔板(Perkin Elmer)中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下在含有50ng/mL人单核细胞集落刺激因子(M-CSF)的巨噬细胞培养基(补充有8.5％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的IMDM(Gibco))中进行培养7天，以促进分化为巨噬细胞。这些单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)变得可粘附，从而允许其它细胞被洗掉。根据制造商的说明，对人Raji淋巴瘤细胞进行计数并用细胞增殖染料eFluor450(eBioscience)进行标记。标记后，将淋巴瘤细胞与含有100μg/mL抗hSIRPα抗体及其稀释液、各自同种型对照抗体和1μg/mL利妥昔单抗(抗hCD20)的测定培养基(补充有10％胎牛血清(Gibco)和Pen/Strep(Gibco)的RPMI(Gibco))混合。然后将淋巴瘤细胞以2.5:1的肿瘤细胞/吞噬细胞的比例添加到含有MDM的各个孔中，混合并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育2小时。孵育后，将孔用PBS洗涤以除去大部分未吞噬的肿瘤细胞，并在室温下用2％甲醛固定细胞10分钟。然后将孔洗涤，并在黑暗中于4℃下在PBS/3％BSA中保持过夜。将孔中存在的淋巴瘤细胞在室温下用生物素缀合的抗人CD19克隆HIB19(eBioscience)染色1小时，然后在室温下用Alexa Fluor 488缀合的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)复染1小时。接着，在室温下用DRAQ5(ThermoFisher Scientific)将细胞核染色10分钟，除去混合物，并向每个孔中加入PBS。用Operetta自动荧光显微镜(Perkin Elmer)分析细胞。使用Columbus V2.6软件处理和分析数据。
如图16所示，hSIRPα.40A增强了利妥昔单抗介导的吞噬活性。如下使用吞噬指数对人淋巴瘤细胞的吞噬作用进行定量：(巨噬细胞内的肿瘤细胞数/巨噬细胞数)*100；每个样品至少计数200个巨噬细胞。
实施例16：人源化抗体设计和CDR移植
使用CDR移植技术(参见，例如，美国专利第5,225,539号和Williams,D.G.等，2010,Antibody Engineering，第1卷，第21章)将小鼠hSIRPα.40A抗体人源化。首先，使用IgBLAST(Ye J.等，Nucleic Acids Res.41:W34-40(2013)鉴定人种系序列。对于hSIRPα.40A VH人种系序列，鉴定出V基因IGHV1-46*01(62.2％同一性)，以及对于VL人种系序列，鉴定出IGKV1-39*01(68.4％同一性)。这两个种系序列用作移植小鼠CDR的模板，从而产生以下两种cDNA构建体：SEQ ID NO:87(VH)和SEQ ID NO:99(VL)。
接着，构建数据库，其包含鉴定了85,848条独立序列的IMGT数据库(Lefranc,M.-P.等，Nucleic Acid Res.27:209-212(1999))中可用的所有人序列。使用TBLASTN(2.2.31+)查询这些序列，以鉴定与hSIRPα.40A VH和VL序列的框架具有最高同一性的模板序列。鉴定出四条VH和四条VL序列，所述序列显示出80％或更高的相似性评分并显示出相似的CDR长度，优选分别与hSIRPα.40A VH CDR1、CDR2、CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3中的那些同一。
对于重链，选择由GenBank(Benson,D.A.等，Nucleic Acids Res.41(D1):D36-42(2013))登录号L39130、DJ031925、DJ326840和EF177968编码的框架作为用于hSIRPα.40AVH CDR移植的模板，从而分别产生以下cDNA构建体：SEQ ID NO:77、79、81和83。对于轻链，选择由GenBank登录号AY731031、DQ840993、AY942002和DQ535171编码的框架作为用于hSIRPα.40A VL CDR直接移植的模板，从而分别产生以下cDNA构建体：SEQ ID NO:89、91、93和95。另外，构建了包含公共领域中可用的所有人源化抗体序列、从而鉴定了300条序列的数据库。使用BLASTP(2.2.31+)查询这些序列，以鉴定对hSIRPα.40A VH和VL序列的框架显示出最高同一性的模板序列。对于重链，选择吉妥珠单抗的框架作为用于hSIRPα.40A VHCDR移植的模板，从而产生以下cDNA构建体：SEQ ID NO:85。对于轻链，选择阿珠单抗的框架作为用于hSIRPα.40A VL CDR移植的模板，从而产生以下cDNA构建体：SEQ ID NO:97
框架和CDR定义是如Kabat等所述的那些("Sequences of Proteins ofImmunological Interest",Kabat,E等，USDepartment of Health and Human Services,(1983))。
为了了解人源化框架残基对Fv结构的影响，使用Discovery Studio 4.5中的“抗体建模级联”(默认参数)制备了小鼠hSIRPα.40A Fv的同源性模型。基于PDB ID 3UMT(对于轻链)、PDB ID 1EHL(对于重链)和PDB ID 3BGF(对于Fv)建立同源性模型。在计算机上移植了CDR，以研究接近任何CDR并可能影响环构象的残基，所述残基称为游标残基。鉴定了可能影响环构象且与CDR表面相距的残基，并在该位置用小鼠氨基酸对其进行取代。使用Discovery Studio 4.5检查所得模板的翻译后修饰(PTM)基序的存在，并在可能的情况下(即非CDR，非游标残基)进行更改以防止PTM。VH CDR2包含糖基化位点，该位点被天冬酰胺至丝氨酸的突变除去。
将CDR移植到每个鉴定的模板上，表达为人IgG2(SEQ ID NO:68)、κ(SEQ ID NO:64)抗体，被克隆在pcDNA3.1(+)载体(Thermo Fisher Scientific)中并用于在FreeStyle293-F人胚肾细胞(HEK293T/17,ATCC CRL-11268)中进行瞬时转染。
实施例17：嵌合和人源化构建体的合成、表达及纯化
将编码重链和轻链人源化构建体的质粒以1:1的比例混合(总计30μg)，并按照制造商的说明使用293fectin转染试剂(Invitrogen)将其转染到FreeStyle 293-F细胞中进行瞬时表达。7天后收获上清液(30ml)，经0.22μm过滤器过滤，并按照制造商的说明(GEHealthcare)使用MabSelect Sure蛋白A树脂纯化抗体。使用Zeba脱盐柱(Thermo FisherScientific)将缓冲液换成10mM组氨酸，100mM NaCl pH 5.5缓冲液。基于OD280(NanodropND-1000)测定纯化的抗体的浓度。按照制造商的说明(Lonza)通过LAL测试测定内毒素水平。
实施例18：人源化SIRPα抗体的结合
使用CHO-K1.hSIRPαV1稳定细胞系通过流式细胞术评估亲本和人源化抗体与hSIRPα的结合。将CHO-K1.hSIRPαV1细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与人源化hSIRPα.40A抗体变体(20μg/mL及其稀释液)一起在PBS/1％BSA中孵育40分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并在4℃下与Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)或Alexa Fluor 647标记的驴抗人IgG(Jackson Immuno Research)检测抗体一起在PBS/1％BSA中孵育40分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)计算EC50值，即观察到总结合信号的50％时的浓度(图17和表20)。
表20：
nd,未被检测到
实施例19：人源化hSIRPα.40A抗体阻断hCD47与hSIRPα的结合
通过流式细胞术评估人源化hSIRPα.40A抗体的完全小组的hCD47阻断。为此，将U-937(ATCC CRL-1593.2)单核细胞系在测定中用作hSIRPα的来源。将U-937细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)和亲本或人源化hSIRPα.40A抗体变体(20μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育45分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与10μg/mL DyLight 488标记的重组hCD47/Fc-蛋白在4℃下孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据，并使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)进行绘图。
如图18和下表21所述，在递增量的人源化hSIRPα.40A抗体变体存在的情况下监测与人IgG1的Fc结构域融合的重组hCD47的结合。通过使用上述基于流式细胞术的方法，人源化抗体hSIRPα.40A阻断了hSIRPα/hCD47的相互作用。从该数据计算出对hCD47的阻断的IC50值。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
表21：
*表示的值是外推的；nd，未检测到
实施例20：hSIRPα.40A的结合结构域
为了鉴定hSIRPα.40A的结合区，基于人SIRPβ1和SIRPγ氨基酸序列设计了几种SIRPβ1交换突变体。基于SIRPα/β1/γ的折叠，该细胞外区域可细分为三个独立的结构域：Ig样(免疫球蛋白样)V型(IgV)、Ig样C1型(IgC1)和Ig样C2型(IgC2)结构域。IgV结构域也称为SIRPα和SIRPγ的配体结合N端结构域(其与CD47结合)。基于全长hSIRPβ1序列(SEQ IDNO:38)设计人SIRPβ1/γ突变体，并且用每个单独的Ig样结构域都取代了人SIRPγ(SEQ IDNO:40)的等效结构域。合成(GeneArt)编码构建体hSIRP-VγC1βC2β(SEQ ID NO:110)、hSIRP-VβC1γC2β(SEQ ID NO:112)和hSIRP-VβC1βC2γ(SEQ ID NO:114)的cDNA并将其亚克隆到pCI-neo载体中。使用CELISA测试了hSIRPα.40A与交换突变体的结合。为此，使用Lipofectamine 2000，用分别编码hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRP-VγC1βC2β、hSIRP-VβC1γC2β和hSIRP-VβC1βC2γ的pCI-neo载体瞬时转染CHO-K1细胞。将转染的细胞在培养基(含有5％新生牛血清(Biowest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中于37℃、5％CO2和95％湿度下培养直至汇合。随后，用胰蛋白酶消化细胞并将其接种在96孔平底组织培养板中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下于培养基中培养直至汇合。随后，除去培养基，并将细胞与hSIRPα.40A、hSIRPα.50A和抗hSIRPα克隆SE5A5抗体在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使抗hSIRPα的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。
本发明的抗体显示出与hSIRP-VγC1βC2β突变体的结合增加，表明hSIRPα.40A与hSIRPα和hSIRPγ的IgV结构域结合(图19和表22)。EC50值表示观察到总结合信号的50％时的浓度(平均值和SD是根据两个独立实验的值计算得出的)。
表22：
nd,未被检测到
为了精确定位hSIRPα.40A与IgV结构域相互作用的氨基酸，基于hSIRPαV1/V2和hSIRPβ1之间的单个氨基酸差异，产生了hSIRPαV1的几个点突变体。以下序列比对显示hSIRPα与hSIRPβ1IgV结构域的比对。
IgV结构域的序列比对：
通过使用QuikChange II定点诱变试剂盒(Stratagene)和全长hSIRPαV1序列(SEQID NO:33)(作为供体cDNA)，对在hSIRPβ1中发生改变的hSIRPαIgV结构域中的氨基酸进行突变。使用CELISA测试了hSIRPα.40A与hSIRPαV1点突变体的结合。为此，使用Lipofectamine 2000，用亚克隆到pCI-neo载体中的编码hSIRPαV1及其突变体以及hSIRPβ1的全长开放阅读框的cDNA瞬时转染CHO-K1细胞。将转染的细胞接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有5％新生牛血清(BioWest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育24小时。随后，除去培养基，并将细胞与纯化的hSIRPα抗体(以10μg/mL及其稀释液使用)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(SouthernBiotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使针对hSIRPαV1、hSIRPαV1突变体和hSIRPβ1的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)计算EC50值(观察到总结合信号的50％时的浓度)(平均值和SD是由两个独立实验的值计算得出的)。
如图20和下表23所示，在位置74(P74)处的脯氨酸构成了用于hSIRPα.40A与hSIRPαV1的特异性结合的关键氨基酸。hSIRPαV1(P74A)(SEQ ID NO:61)(其中P74转换为丙氨酸)在CHO-K1细胞上的表达导致hSIRPα.40A抗体结合丢失。该脯氨酸不存在于hSIRPβ1的IgV结构域序列中，并可能在IgV结构域的正确构象中起作用。
表23：
nd,未被检测到
实施例21：嵌合hSIRPα.40A mAb变体在人巨噬细胞吞噬测定中的功能性
使用人巨噬细胞通过体外吞噬测定评估了移植在不同Fc恒定域上的hSIRPα.40A可变结构域的功能性。人巨噬细胞吞噬测定的实验条件与上文实施例15中所解释相似。将标记的Raji杂交瘤细胞与含有10μg/mL或1μg/mL嵌合hSIRPα.40A抗体变体和1μg/mL利妥昔单抗的测定培养基混合，然后将其以2.5:1的肿瘤细胞/吞噬细胞的比率加入到MDM中。将细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育2小时。
使用Operetta自动荧光显微镜(Perkin Elmer)进行分析，并使用Columbus V2.6软件处理和分析数据。如下使用吞噬指数对人淋巴瘤细胞的吞噬作用进行定量：(巨噬细胞内的肿瘤细胞数/巨噬细胞数)*100；每个样品至少计数200个巨噬细胞。
如图21所示，野生型(WT)嵌合hSIRPα.40A.hIgG4抗体不增强利妥昔单抗介导的吞噬作用，而含有N297Q(SEQ ID NO:126)、L234A.L235A (LALA)(SEQ ID NO:123)或L234A.L235A.P329G(LAL APG)(SEQ ID NO:125)突变的惰性嵌合hSIRPα.40A.hIgG1(SEQID NO:119)以浓度依赖性方式增强利妥昔单抗介导的吞噬活性。同样，hSIRPα.40A.hIgG2和包含V234A.G237A.P238S.H268A.V309L.A330S.P331S(Sigma)(SEQ ID NO:122)突变的惰性嵌合hSIRPα.40A.hIgG2抗体变体以浓度依赖性方式增强利妥昔单抗介导的吞噬活性。
实施例22：人源化hSIRPα.40A mAb变体在人巨噬细胞吞噬测定中的功能性
使用人巨噬细胞通过体外吞噬测定评估了一组选择的人源化hSIRPα.40A抗体变体的功能性。人巨噬细胞吞噬测定的实验条件与实施例6中解释的相似。
如图22中所示，人源化hSIRPα.40A抗体变体以与移植在hIgG2Fc上的抗体KWAR23类似的浓度依赖的方式增强了利妥昔单抗介导的吞噬活性。
实施例23：嵌合hSIRPα.50A mAb变体在人巨噬细胞吞噬测定中的功能性
使用人巨噬细胞通过体外吞噬测定评估了移植在不同Fc恒定结构域上的hSIRPα.50A可变结构域的功能性。如图23A所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG4抗体略微增强了利妥昔单抗介导的吞噬，而嵌合hSIRPα.50A.hIgG2抗体则与鼠hSIRPα.50A.mIgG1(SEQ ID NO:120)抗体类似地增强了利妥昔单抗介导的吞噬活性。图23B表明，与人IgG2同种型对照相比，嵌合hSIRPα.50A.hIgG2抗体以浓度依赖性方式强效地增强了利妥昔单抗诱导的肿瘤细胞吞噬作用。类似地，hSIRPα.50A.hIgG2增强达雷木单抗介导的吞噬作用(抗hCD38，以0.05μg/mL使用)(图23C)。
另外，hSIRPα.50A.hIgG2还在人粒细胞中增强了利妥昔单抗介导的吞噬作用。如图23D所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG2抗体增强利妥昔单抗诱导的吞噬活性，其程度与鼠hSIRPα.50A.mIgG1抗体相似。同样，如图24A所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A.hIgG4.N297Q(SEQ ID NO：127)或hSIRPα.50A.hIgG2抗体增强利妥昔单抗介导的人MDM的吞噬作用，其程度与鼠hSIRPα.50A.mIgG1抗体(以1μg/mL使用利妥昔单抗)相似。当由达雷木单抗(0.05μg/mL)诱导吞噬作用时，在图24B中获得了类似的观察结果。如图25中所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q和hSIRPα.50AhIgG1.L234A.L235A.P329G抗体也增强利妥昔单抗介导的人MDM的吞噬作用，其程度与hSIRPα.50A.hIgG2抗体(以1μg/mL使用的利妥昔单抗)相似。含有野生型hIgG1或hIgG4 Fc区的hSIRPα.50A mAb的嵌合变体不会增强肿瘤细胞的吞噬作用。
实施例24：KWAR23、克隆18D5、hSIRPα.50A和hSIRPα.40A抗体的比较
单克隆抗hSIRPα抗体KWAR23、克隆18D5(SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:129)(来自WO2017/178653)、hSIRPα.50A和hSIRPα.40A对于与hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)、hSIRPαV2和hSIRPβ1的结合的特异性的直接比较通过CELISA来进行评价。使用CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)确认反应性，所述细胞表达亚克隆到pCI-neo载体(Promega,Madison,WI)中的编码hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)、hSIRPαV2和hSIRPβ1的全长开放阅读框的cDNA。将CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV1(P74A)、CHO-K1.hSIRPαV2和CHO-K1.hSIRPβ1细胞接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有5％新生牛血清(BioWest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育24小时。随后，除去培养基，并将细胞与纯化的hSIRPα抗体(以10μg/mL及其稀释液使用)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使针对hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)、hSIRPαV2和hSIRPβ1的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)计算EC50值，即观察到总结合信号的50％时的浓度。
使用Jurkat E6.1 T细胞白血病细胞系(ECACC 88042803)通过流式细胞术评估与hSIRPγ的结合。将Jurkat细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与抗hSIRPα抗体(20μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育40分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并在4℃下与Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)检测抗体一起在PBS/1％BSA中孵育40分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据。使用GraphPad Prism 6(GraphPadSoftware,Inc.)计算EC50值，即观察到总结合信号的50％时的浓度。
如表24所述，KWAR23和克隆18D5抗体与至少hSIRPβ1和hSIRPαV1的P74A变体交叉反应。在测试条件下，本发明的hSIRPα.50A和hSIRPα.40A抗体不与hSIRPβ1或hSIRPαV1的P74A变体结合。就这一点而言，本发明的hSIRPα.50A和hSIRPα.40A抗体类似地与WO2013/056352的抗体克隆SIRP29相区分。WO2017/178653的图7A和图7B比较了克隆SIRP29和KWAR23与SIRPβ1(被称为“sirp-b”，来自antibodies-online.com的产品编号ABIN3077231)的结合，表明克隆SIRP29和KWAR23中的每一种均具有对SIRPβ1的纳摩尔亲和力。
表24：
nd，未检测到；-，未测试的
通过流式细胞术评估了KWAR23、克隆18D5和hSIRPα.40A抗体的hCD47阻断。为此，将THP-1(ATCC TIB-202)和U-937(ATCC CRL-1593.2)单核细胞细胞系在测定中用作hSIRPα的来源。将THP-1和U-937细胞接种到96孔圆底组织培养板中，并在4℃下与FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)和指定的抗hSIRPα抗体(20μg/mL及其稀释液)在PBS/1％BSA中孵育45分钟。接着，将细胞用PBS/1％BSA洗涤3次，并与10μg/mL DyLight 488标记的重组hCD47/Fc-蛋白在4℃下孵育30分钟。在该标记程序之后，将细胞洗涤两次，重悬于含有0.1μg/mLDAPI(BioLegend)的PBS/1％BSA中，并在FACSVerse(BD Biosciences)上通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo V10软件(FlowJo,LLC)处理和分析数据，并使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)进行绘图。在递增量的抗hSIRPα抗体存在的情况下监测与人IgG1的Fc结构域融合的重组hCD47的结合。从该数据计算出对hCD47的阻断的IC50值。IC50值表示观察到一半抑制时的浓度。
如表18和表25中所述，hSIRPα.40A、hSIRPα.50A和KWAR23抗体阻断rhCD47/Fc与分别表达hSIRPαV2和hSIRPαV1等位基因的THP-1和U-937单核细胞系的结合。抗体克隆18D5阻断rhCD47/Fc与U-937单核细胞系的结合，但不阻断rhCD47/Fc与THP-1单核细胞细胞系的结合，这与18D5不与hSIRPαV2结合的观察一致(表24)。就这一点而言，本发明的hSIRPα.50A和hSIRPα.40A抗体类似地与抗体克隆18D5相区分。
表25
nd，未被检测到
实施例25：作图hSIRPα-hSIRPα.40A与hSIRPα–hSIRPα.50A之间的相互作用界面
通过包括氘化化学交联，随后酶促消化和使用质谱进行的检测的程序阐明了hSIRPα.40A或hSIRPα.50A所结合的hSIRPα上的氨基酸。首先，将抗体hSIRPα.40A和抗原rhSIRPα-HIS(SinoBiological11612-H08H-100,SEQ ID NO:132)，或将抗体hSIRPα.50A和抗原rhSIRPα-HIS孵育以促进结合，并通过配备了HM4相互作用模块(CovalX)的UltraflexIII MALDI TOF质谱仪(Bruker)验证完整性和聚集水平。对于这些对照实验，制备了一系列10μL抗体或抗原样品的稀释液(稀释度为1至128倍，起始为1mg/mL)。根据制造商的说明(CovalX)，使用K200 MALDI MS分析试剂盒将各自9μL的样品进行交联，并孵育180分钟，同时将1μL直接用于质谱分析(High-Mass MALDI)。质谱分析显示抗体和抗原具有预期的分子量：hSIRPα.40A＝151.68kDa(带交联剂的152.78kDa)，hSIRPα.50A＝151.80kD(带交联剂的153.17kDa)和rhSIRPα-HIS＝46.05kDa(带交联剂的48.67kDa)。为了表征抗原-抗体复合物，利用过量的抗原制备了混合物(rhSIRPα-HIS:hSIRPα.40A的抗原:抗体比率为10.8μM:8.5μM，并且rhSIRPα-HIS:hSIRPα.50A的抗原:抗体比为5.4μM:2.13μM)。根据制造商的说明，使用K200 MALDI MS分析试剂盒将9μL抗原-抗体混合物样品进行交联，同时将1μL直接用于质谱分析。检测到的抗体和抗原质量(hSIRPα.40A：151.18kDa、rhSIRPα-HIS45.93kDa、hSIRPα.50A:151.69kDa、rhSIRPα-HIS46.18kDa)对应于先前检测到的分子量。交联后，抗原-抗体复合物被检测为两种非共价复合物，其中rhSIRPα-HIS:hSIRPα.40A的化学计量为1:1(195.24kDa)和2:1(240.48kDa)，以及被检测为一种非共价复合物，其中rhSIRPα-HIS:hSIRPα.50A的化学计量为1:1(198.24kDa)。抗体和抗原非共价结合；未检测到非共价聚集体或非特异性多聚体。
接着，进行rhSIRPα-HIS的肽质量指纹图谱。按照制造商的说明，将样品进行ASP-N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶(Roche Diagnostic)蛋白水解，然后使用与LTQ Orbitrap XL质谱仪(Thermo Scientific)联机的Ultimate 3000(Dionex)系统进行nLC-LTQ Orbitrap MS/MS分析。该蛋白水解阵列导致98％的序列被所鉴定的肽覆盖。
为了以高分辨率确定抗体hSIRPα.40A和hSIRPα.50A在rhSIRPα-HIS抗原上的相互作用氨基酸，将抗原-抗体复合物(rhSIRPα-HIS:hSIRPα.40A比例为10.8μM:8.5μM，rhSIRPα-HIS:hSIRPα.50A比例为5.4μM:2.13μM)与氘代交联剂d0/d12(K200 MALDI试剂盒)一起孵育180分钟，并用酶ASP-N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶进行多酶促裂解。富集交联肽后，通过高分辨率质谱(nLC-Orbitrap MS)分析样品，并使用XQuest(Jin Lee,Mol.Biosyst.4:816-823(2008))和Stavrox(等，J.Am.Soc.MassSpectrom.23:76-87(2012))分析生成的数据。将hSIRPα.40A和hSIRPα.50A与rhSIRPα-HIS的相互作用氨基酸作图至人SIRPαV1(SEQ ID NO：34)。hSIRPα.40A的交联残基以粗体加框表示，并且hSIRPα.50A则以粗体加下划线表示：
使用SIRPα(PDB ID 4CMM)的晶体结构，在Discovery Studio中测量了残基P74与鉴定出的交联残基之间的C-α距离。针对hSIRPα.50A鉴定的交联残基与残基P74相距在14.0至21.4埃C-α原子内；针对hSIRPα.40A鉴定的交联残基与残基P74相距在16.2至33.5埃C-α原子内。对于的表位-对位表面积，C-α距离符合预期范围(Rowley等，Biotech.Ann.Rev.10:151-188(2004))。鉴定的残基和表面积与抗hSIRPα抗体KWAR23的结合表位明显不同(Ring等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 114:E10578-E10585(2017))。
实施例26：hSIRPα抗体与hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)和hSIRPβ1结合的比较
单克隆抗hSIRPα抗体(例如，包括本领域已知的hSIRPα抗体、KWAR23(美国专利CA2939293 A1)、18D5(专利WO2017/178653 A2)和各种商购可得的hSIRPα抗体)对于与hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)和hSIRPβ1的结合的特异性通过CELISA来评价。使用CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)确认反应性，所述细胞表达亚克隆到pCI-neo载体(Promega,Madison,WI)中的编码hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)和hSIRPβ1的全长开放阅读框的cDNA。将CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV1(P74A)和CHO-K1.hSIRPβ1细胞接种在96孔平底组织培养板中的培养基(补充有5％新生牛血清(BioWest)和Pen/Strep(Gibco)的DMEM-F12(Gibco))中，并在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育24小时。随后，除去培养基，并将细胞与纯化的hSIRPα抗体(以10μg/ml及其稀释液使用)在37℃、5％CO2和95％湿度下孵育1小时。接着，用PBS-T洗涤细胞，并将其在37℃、5％CO2和95％湿度下与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)、山羊抗人IgG-HRP(Jackson Immuno Research)或山羊抗兔IgG-HRP(Southern Biotech)一起孵育1小时。随后，将细胞用PBS-T洗涤3次，并用TMB稳定色原(Invitrogen)使针对hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)和hSIRPβ1的免疫反应性可视化。用0.5M H2SO4终止反应，并在450nm和610nm处读取吸光度。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)计算EC50值，即观察到总结合信号的50％时的浓度。
如表26所述，KWAR23、克隆18D5和所有商购可得的单克隆抗hSIRPα抗体能够与hSIRPαV1的P74A变体结合，而本发明的hSIRPα.40A和hSIRPα.50A抗体在测试条件下不与hSIRPαV1的P74A变体结合。
表26：
nd，未被检测到
实施例27：本说明书中提及的序列
本文引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利具体地和单独地表示为通过引用并入。通过引用并入的该声明是根据申请人意图按照37C.F.R.§1.57(b)(1)涉及每一个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其中每一项均按照37C.F.R.§1.57(b)(2)来明确地鉴定，即使这种引用与通过引用并入的专用声明并不紧邻。说明书中包括通过引用并入的专用声明(如果有的话)丝毫不削弱该通过引用并入的一般性声明。本文引用的参考文献无意承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。在一定程度上，所述参考文献提供了与本说明书中提供的定义相冲突的所要求保护的术语的定义，在本说明书中提供的定义应用于解释所要求保护的发明。
本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前述描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
上述书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文显示和描述的那些之外，根据前述描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。

Claims (13)

1.结合具有SEQ ID NO:34的序列的人SIRPαV1的抗体或抗原结合片段以及CD47、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如，CEACAM-1、-3和/或-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、IDO、TDO、CD160或TGFRβ的抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，
其中抗体或抗原结合片段包含以下的每一种：
a.氨基酸序列SYWMH(SEQ ID NO:69)的重链可变区CDR1，
b.氨基酸序列AIYPVNNDTTYNQKFKG(SEQ ID NO:70)或AIYPVNSDTTYNQKFKG的重链可变区CDR2，
c.氨基酸序列SFYYSLDAAWFVY(SEQ ID NO:71)的重链可变区CDR3，
d.氨基酸序列RASQDIGSRLN(SEQ ID NO:72)的轻链可变区CDR1，
e.氨基酸序列ATSSLDS(SEQ ID NO:73)的轻链可变区CDR2，和
f.氨基酸序列LQYASSPFT(SEQ ID NO:74)的轻链可变区CDR3；或其中抗体或抗原结合片段包含以下的每一种：
g.氨基酸序列NYYIH(SEQ ID NO:1)的重链可变区CDR1，
h.氨基酸序列WIYPGNVNTKYNEKFKA(SEQ ID NO:2)的重链可变区CDR2，
i.氨基酸序列PTIIATDFDV(SEQ ID NO:3)的重链可变区CDR3，
j.氨基酸序列KASQGVGTAVG(SEQ ID NO:4)的轻链可变区CDR1，
k.氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:5)的轻链可变区CDR2，和
l.氨基酸序列QQYSTYPFT(SEQ ID NO:6)的轻链可变区CDR3；其中抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的CDR、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、纳米抗体或多特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列和轻链可变区序列的以下组合之一：
含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:96的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区，
含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区，和
含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区序列。
3.根据权利要求2所述的用途，其中抗体是完整的IgG。
4.根据权利要求3所述的用途，其中抗体包括野生型或经突变的IgG2 Fc区。
5.根据权利要求3所述的用途，其中抗体包括经突变的IgG1 Fc区。
6.根据权利要求3所述的用途，其中抗体包括经突变的IgG4 Fc区。
7.根据权利要求1所述的用途，其中重链可变区CDR1是SEQ ID NO:69的氨基酸序列，重链可变区CDR2是SEQ ID NO:70或AIYPVNSDTTYNQKFKG的氨基酸序列,重链可变区CDR3是SEQID NO:71的氨基酸序列,轻链可变区CDR1是SEQ ID NO:72的氨基酸序列,轻链可变区CDR2是SEQ ID NO:73的氨基酸序列，以及轻链可变区CDR3是SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
8.根据权利要求2所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。
9.根据权利要求2所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
10.根据权利要求2所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区。
11.根据权利要求2所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区。
12.根据权利要求2所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链可变区。
13.根据权利要求2所述的用途，其中抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链可变区。
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