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CN118108843A - 抗人vista抗体及其用途 - Google Patents

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CN118108843A
CN118108843A CN202310960305.6A CN202310960305A CN118108843A CN 118108843 A CN118108843 A CN 118108843A CN 202310960305 A CN202310960305 A CN 202310960305A CN 118108843 A CN118108843 A CN 118108843A
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nos
cdrs
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M·莫洛伊
J·罗思坦
D·佩切尼克
L·斯奈德
G·鲍尔斯
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Immunext Inc
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Janssen Pharmaceuticals Inc
Immunext Inc
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Abstract

本发明提供了拮抗性和激动性抗人VISTA抗体和抗体片段。这些拮抗性抗体和抗体片段可用于抑制或阻断VISTA对T细胞免疫的抑制作用，从而促进T细胞免疫。这些激动性抗体和抗体片段可用于增强或提高或模拟VISTA对T细胞免疫的抑制作用，从而抑制T细胞免疫。这些拮抗性抗体和抗体片段尤其可用于治疗癌症和感染性病症。这些激动性抗体和抗体片段尤其可用于治疗自体免疫、变态反应、炎病症、GVHD、败血症和移植受体。本发明还提供了用于鉴定这些激动剂的筛选测定法。

Description

抗人VISTA抗体及其用途
本申请是申请日为2017年4月14日、申请号为201780037522.0、发明名称为“抗人VISTA抗体及其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2016年4月15日提交的美国临时申请No.62/323,193、2016年5月31日提交的美国临时申请No.62/343,355、2016年8月9日提交的美国临时申请No.62/372,362、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,627、2016年11月22日提交的美国临时申请No.62/425,184、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,929、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,085、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,805、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,931、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,102、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,871、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,917、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,081、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,888、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/364,073、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,166、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,893、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,925、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,087、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,785、2016年10月11日提交的美国临时申请No.62/406,632号的优先权，这些专利的每一者据此以引用方式全文并入。本申请涉及2017年4月___提交的PCT申请____，“ANTI-HUMANVISTA ANTIBODIES AND USE THEREOF(抗人VISTA抗体及其用途)”(代理人案卷号43260.2214)，将其以引用方式并入并主张其优先权。
技术领域
本发明涉及鉴定新型抗人VISTA抗体及抗体片段，即抗人VISTA(T细胞活化的含V区免疫球蛋白抑制因子(V-region Immunoglobulin-containing Suppressor of T cellActivation)(1))(“VISTA”)抗体及抗体片段。更具体地讲，本申请提供新型的人VISTA激动剂，即可激发或促进人VISTA对免疫(尤其是对T细胞免疫)的抑制作用的抗人VISTA抗体及抗体片段。另外，本发明还涉及此类激动剂用于增强或模拟VISTA对免疫的抑制作用，诸如其对CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化的抑制作用以及其对免疫细胞因子(尤其是促炎细胞因子)产生的抑制作用的用途。另外，本发明还涉及此类激动性抗体及抗体片段作为预防剂或治疗剂的特定用途，尤其是用于治疗其中预防或抑制T细胞免疫和促炎细胞因子的表达具有治疗益处的病症(诸如自体免疫、炎症、变应性障碍、败血症、GVHD)或用于缓解某些病症(诸如癌症)的炎性副作用。
本申请还提供新型拮抗剂，即可拮抗或抑制人VISTA对免疫的抑制作用(尤其是VISTA对T细胞免疫的抑制作用)的抗人VISTA抗体及抗体片段。另外，本发明还涉及此类新型拮抗剂阻断或抑制VISTA对免疫的抑制作用，即其对CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化及免疫细胞因子产生的抑制作用的用途。另外，本发明还涉及这些拮抗性抗体及抗体片段作为预防剂或治疗剂的特定用途，尤其是用于治疗其中促进T细胞免疫具有治疗益处的病症，诸如用于治疗癌症及感染性疾病。
背景技术
负向免疫检查点调节因子(NCR)路径已被证明在治疗人类免疫相关疾病中是特别优异的临床靶点。使用单克隆抗体(mAb)阻断两种NCR(CTLA-4和PD-1)以增强肿瘤免疫正在革新癌症的治疗方法，并且已将这些路径确立为人类疾病中经临床验证的靶点。触发NCR路径的可溶形式的NCR配体也已作为免疫抑制药物进入临床用来治疗自体免疫(即，用于类风湿性关节炎的AMP-110/B7-H4-Ig)。
VISTA(参见参考文献1)是一种NCR配体，其在系统分类上最接近的亲缘物是PD-L1。VISTA与PD-L1具有同源性，但表现出一种仅限于造血室的独特表达模式。具体地说，VISTA在高CD11b髓样细胞上组成型高度表达，而在CD4+及CD8+T细胞上以较低水平表达。如同PD-L1，VISTA是一种深度抑制免疫的配体(参考文献1)，并且如同PD-L1，阻断VISTA使得能在临床前肿瘤模型中发展出针对癌症的治疗性免疫(参见参考文献2)。鉴于阻断VISTA可以增强免疫，尤其是CD8+和CD4+介导的T细胞免疫，用VISTA胞外结构域的可溶性Ig融合蛋白(VISTA-Ig)治疗可以抑制免疫，并且已显示可阻滞多种自体免疫疾病小鼠模型的进展。
明确的科学证据显示，VISTA是一种可诱导深度T细胞抑制的配体。包括达特茅斯学院(Dartmouth College)和詹森公司(Jannsen)在内的不同团体已报导过多种拮抗性抗人VISTA抗体。此类抗体可用于治疗其中期望抑制VISTA对T细胞免疫的免疫抑制作用的病症，诸如癌症和感染。然而，就发明人所知，此前尚未鉴定出可激发人VISTA的作用的抗人VISTA抗体或抗体片段。此类激动性抗人VISTA抗体及抗体片段将有利于治疗其中需要抑制免疫、尤其是T细胞免疫的病症和/或其中VISTA表达被异常下调的病症。
发明内容
本发明的目的之一在于提供特异性地结合至人VISTA及其变体的新型抗体及抗体片段，如能特异性地结合至人VISTA，并且能促进或模拟人VISTA对免疫的作用的嵌合型、人型、人源化型或多特异性型的抗人VISTA抗体。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段与具有图4所示的CDR及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体中的任一者结合到相同或重叠的表位。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区的分离的抗体或其抗体片段，其中该抗体或抗体片段可激发或促进VISTA对免疫的一种或多种作用，例如，任选包含人IgG2恒定区或人IgG2 Fc区，其中所述人IgG2恒定区或Fc区结合至包括人CD32A在内的Fcγ受体，和/或含有构成结合至Fcγ受体的天然人IgG2的人IgG2恒定区或Fc区，和/或结合至包括hFcγRI(CD64)、FcγRIIA或hFcγRIIB(CD32或CD32A)及FcγRIIIA(CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)中一者或多者在内的FcγR的IgG2。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段可结合至包括由具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体所结合的表位或与该表位重叠的VISTA表位。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段可与包含LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH的残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段与包含79EVQTCSERRPIR90、48NVTLTCRLLGPV60、153HHHSEHRVHGAM164、52LTCRLLGPV60、56LLGPVDKGHDVTFYK70、113LAQRHGLESASDHHG127、153HHHSEHRVHGAM164、93TFQDLHLHHGGHQAA107、146CLVVEIRHHHSEH158、53TCRLLGPVDKG63、123SDHHG127和/或153HHHSEHRVHGAM164的一或多个残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段与包含79EVQTCSERRPIR90的一或多个残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对以下任一者或多者的抑制作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖诱导；细胞因子表达的诱导或抑制、单核细胞的存活增加、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的诱导；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的诱导。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段包含能特异性地结合至人VISTA的抗原结合区，其中该抗体或抗体片段包含与具有图4所示的CDR及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体中的任一者具有相同CDR多肽的可变重链序列和可变轻链序列，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中若该激动性抗体或抗体片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽具有至少90％序列同一性的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列如图4所示，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区，其中该激动性抗体或抗体片段包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽具有至少95％序列同一性的可变重链和/或可变轻链多肽，其中上述可变重链多肽和可变轻链多肽序列如图4所示，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽具有至少96％至99％序列同一性的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列如图4所示，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或其抗体片段包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽相同的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列在图4中示出，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的拮抗性抗体或其抗体片段，其可拮抗或阻断人VISTA对免疫的至少一种作用。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其可激发或促进人VISTA对免疫的至少一种作用。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其包含人恒定结构域。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定结构域，所述人恒定结构域任选经修饰，例如通过缺失突变、置换突变或添加突变或前述的任何组合进行修饰。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中所述抗体片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗体片段或者是Fab、F(ab')2或scFv抗体片段。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的拮抗性抗体或其抗体片段，该拮抗性抗体或抗体片段可阻断或抑制人VISTA对免疫的至少一种作用，例如选自其对T细胞免疫、单核细胞活化、或T细胞增殖的抑制作用；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的抑制；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的抑制。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，该激动性抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如选自其对T细胞免疫、单核细胞活化的抑制作用、T细胞增殖的抑制；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的抑制；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的抑制。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，该激动性抗体或其抗体片段包含人IgG2恒定区或Fc区。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，该激动性抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的抑制作用，例如其对以下任一者或多者的作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖；细胞因子表达、单核细胞存活、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其可抑制T细胞免疫和/或促炎细胞因子表达。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，所述抗体为包含人Fc区，如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或前述任一者的嵌合体的人型、人源化型或嵌合型抗体。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其为嵌合型、人型或人源化型。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其包含可潜在进行突变的人IgG2恒定结构域或Fc区。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其包含人IgG2恒定结构域或其片段或者hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链结构域和CH1结构域以及任选整个或基本上整个轻链恒定区已用hIG2的相应的整个或基本上整个轻链以及铰链结构域和CH1结构域(“H2区”或“H2结构域”)置换。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其(i)包含IgG2 Fc区，其中第127位的重链半胱氨酸残基和第214位的轻链半胱氨酸残基(其中编号方式是根据Kabat)中的一者或二者缺失或改变成不同的氨基酸残基，从而导致所得的经修饰的抗体的激动特性相对于其中这些残基未改变的抗体增加，(ii)所述抗体的H2区中第214位的半胱氨酸残基被突变或用另一个氨基酸置换和/或重链的第127、232或233位的半胱氨酸残基中的一者或多者缺失或用另一个氨基酸置换；(iii)其包含人IgG2恒定结构域，其中至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一个氨基酸；(iv)其与VSTB95(图4所示的可变重链序列和可变轻链序列)竞争或与VSTB95结合至人VISTA上的相同表位。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR以及SEQ ID NO:103、104和105的VLCDR；
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(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR以及SEQ ID NO:683、684和685的VLCDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR以及SEQ ID NO:693、694和695的VLCDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR以及SEQ ID NO:703、704和705的VLCDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR以及SEQ ID NO:713、714和715的VLCDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR以及SEQ ID NO:723、724和725的VL CDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR以及SEQ ID NO:733、734和735的VLCDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR以及SEQ ID NO:743、744和745的VLCDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR以及SEQ ID NO:753、754和755的VLCDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR以及SEQ ID NO:763、764和765的VL CDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR以及SEQ ID NO:773、774和775的VL CDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR以及SEQ ID NO:783、784和785的VLCDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR以及SEQ ID NO:793、794和795的VLCDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR以及SEQ ID NO:803、804和805的VLCDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR以及SEQ ID NO:813、814和815的VL CDR。
本发明的目的之一是提供根据上述任一者的VISTA激动剂，其：
(i)包含SEQ ID NO:106的VH多肽以及SEQ ID NO:108的VL多肽；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽以及SEQ ID NO:118的VL多肽；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽以及SEQ ID NO:128的VL多肽；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽以及SEQ ID NO:138的VL多肽；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽以及SEQ ID NO:148的VL多肽；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽以及SEQ ID NO:158的VL多肽；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽以及SEQ ID NO:168的VL多肽；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽以及SEQ ID NO:178的VL多肽；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽以及SEQ ID NO:188的VL多肽；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽以及SEQ ID NO:198的VL多肽；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽以及SEQ ID NO:208的VL多肽；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽以及SEQ ID NO:218的VL多肽；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽以及SEQ ID NO:228的VL多肽；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽以及SEQ ID NO:238的VL多肽；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽以及SEQ ID NO:248的VL多肽；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽以及SEQ ID NO:258的VL多肽；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽以及SEQ ID NO:268的VL多肽；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽以及SEQ ID NO:278的VL多肽；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽以及SEQ ID NO:288的VL多肽；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽以及SEQ ID NO:298的VL多肽；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽以及SEQ ID NO:308的VL多肽；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽以及SEQ ID NO:318的VL多肽；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽以及SEQ ID NO:328的VL多肽；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽以及SEQ ID NO:338的VL多肽；
(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽以及SEQ ID NO:348的VL多肽；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽以及SEQ ID NO:358的VL多肽；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽以及SEQ ID NO:368的VL多肽；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽以及SEQ ID NO:378的VL多肽；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽以及SEQ ID NO:388的VL多肽；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽以及SEQ ID NO:398的VL多肽；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽以及SEQ ID NO:408的VL多肽；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽以及SEQ ID NO:418的VL多肽；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽以及SEQ ID NO:428的VL多肽；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽以及SEQ ID NO:438的VL多肽；
(xxxv)包含SEQ ID NO:446的VH多肽以及SEQ ID NO:448的VL多肽；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽以及SEQ ID NO:458的VL多肽；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽以及SEQ ID NO:468的VL多肽；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽以及SEQ ID NO:478的VL多肽；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽以及SEQ ID NO:488的VL多肽；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽以及SEQ ID NO:498的VL多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽以及SEQ ID NO:508的VL多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽以及SEQ ID NO:518的VL多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽以及SEQ ID NO:528的VL多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽以及SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽以及SEQ ID NO:548的VL多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽以及SEQ ID NO:558的VL多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽以及SEQ ID NO:568的VL多肽；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽以及SEQ ID NO:578的VL多肽；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽以及SEQ ID NO:588的VL多肽；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽以及SEQ ID NO:598的VL多肽；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽以及SEQ ID NO:608的VL多肽；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽以及SEQ ID NO:618的VL多肽；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽以及SEQ ID NO:628的VL多肽；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽以及SEQ ID NO:638的VL多肽；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽以及SEQ ID NO:648的VL多肽；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽以及SEQ ID NO:658的VL多肽；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽以及SEQ ID NO:668的VL多肽；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽以及SEQ ID NO:678的VL多肽；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽以及SEQ ID NO:688的VL多肽；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽以及SEQ ID NO:698的VL多肽；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽以及SEQ ID NO:708的VL多肽；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽以及SEQ ID NO:718的VL多肽；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽以及SEQ ID NO:728的VL多肽；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽以及SEQ ID NO:738的VL多肽；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽以及SEQ ID NO:748的VL多肽；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽以及SEQ ID NO:758的VL多肽；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽以及SEQ ID NO:768的VL多肽；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽以及SEQ ID NO:778的VL多肽；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽以及SEQ ID NO:788的VL多肽；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽以及SEQ ID NO:798的VL多肽；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽以及SEQ ID NO:808的VL多肽；以及(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽以及SEQ ID NO:818的VL多肽。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其包含人IgG2恒定或Fc区，其中任选至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一氨基酸。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其可介导以下免疫抑制作用中的任一者或以下免疫抑制作用中的至少一种的组合：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
本发明的具体目的之一在于提供药物组合物或诊断组合物，所述药物组合物或诊断组合物包含根据前述任一者的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段。
本发明的具体目的之一在于提供治疗和/或诊断方法、或含有至少一种根据前述任一者的拮抗性抗体或抗体片段的组合物用于诊断或治疗用途的用途，所述方法或用途包括给有需要的受试者施用至少一剂量的包含治疗或诊断有效量的至少一种根据上述任一者的拮抗性抗体或抗体片段的组合物，如癌症或感染性障碍，任选其中所述癌症是血癌或实体瘤，如被包含髓样细胞、T细胞或髓样细胞和T细胞的组合的肿瘤基质包围的实体瘤，或选自以下的癌症：白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征或骨髓瘤、肺癌或它们的组合或者包含急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓样(髓性)白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)；毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病或成人T细胞白血病在内的白血病。
本发明的具体目的之一在于提供治疗和/或诊断方法、或含有至少一种根据前述任一者的激动性抗体或抗体片段的组合物用于诊断或治疗用途的用途，所述方法或用途包括给有需要的受试者施用至少一剂量的包含治疗或诊断有效量的至少一种根据前述任一者的激动性抗体或抗体片段的组合物或含有根据上述任一者的组合物。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的任何激动性抗体或抗体片段用于在体外和/或体内实现以下免疫抑制作用任一种或以下免疫抑制作用至少一种的组合的方法或用途：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
本发明的具体目的之一在于提供根据前述任一者的任何激动性抗体或抗体片段用于在人受试者中治疗或预防变态反应、自体免疫、移植、基因疗法、炎症、癌症、GVHD或败血症，或者用于治疗或预防与前述任一者相关的炎症、自体免疫或变应性副作用的方法或用途。
根据前述任一者的抗VISTA抗体或抗原结合片段或组合物、或者方法或用途，还包含另一免疫调节抗体或融合蛋白，其选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
前述任一者的方法或用途，其包括在治疗之前、治疗同时和/或治疗之后测定个体的细胞中或体液中的VISTA蛋白。
前述任一者的方法或用途，其包括测定造血细胞上的VISTA水平。
前述任一者的方法或用途，其包括测定选自髓系细胞和/或淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞中的任何一种或多种的造血细胞上的VISTA水平。
前述任一者的方法或用途，其中所述激动性抗人VISTA抗体或片段包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR和人IgG2 Fc区，所述人IgG2 Fc区可任选经突变或者其中IgG2恒定区或Fc区保留天然FcR结合和/或结合CD32A的能力。
前述任一者的抗体、组合物、方法或用途，其中抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，所述KD在37℃下通过表面等离振子共振测定为50M或更低。
前述任一者的抗体、组合物、方法或用途，其中抗人VISTA抗体或片段包含对人VISTA的亲和力或KD，所述KD在37℃下通过表面等离振子共振测定为1nM或更低。
本发明的具体目的之一在于提供分离的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的拮抗性和激动性抗人VISTA抗体和激动性抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列拥有具有图4所示序列的抗人VISTA抗体任一者的CDR多肽，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供分离的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的拮抗性和激动性抗人VISTA抗体和激动性抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列具有选自VSTB49-VSTB116的抗人VISTA抗体的CDR多肽，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗人VISTA抗体片段，则该抗人VISTA抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供分离的包含选自VSTB49-VSTB116的抗人VISTA抗体的CDR的拮抗性和激动性抗体和抗体片段，其包含的可变重链和/或可变轻链多肽与VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列具有至少90％、95％或96-99％序列同一性，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的具体目的之一在于提供分离的包含与VSTB49-VSTB116任一者相同的CDR的拮抗性和激动性抗体和抗体片段，其包含的可变重链和/或可变轻链多肽与VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列相同，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的另一具体目的在于提供分离的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的拮抗性或激动性嵌合型、人型、人源化型、多特异性型(如双特异性型)抗人VISTA抗体或抗体片段，其包含的可变重链序列和可变轻链序列与包含图4中所公开的CDR及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体中的任一者具有相同CDR多肽，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则该抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
本发明的另一个具体目的在于提供新型的免疫抑制剂，即抗人VISTA抗体和抗体片段，例如含有人IgG2恒定结构域或IgG2 Fc区的那些，任选其中与野生型人IgG2恒定结构域或IgG2 Fc区相比所述人IgG2恒定结构域或IgG2 Fc区的FcR结合能力得以维持或增强，其可激发、引发或模拟人VISTA对免疫的作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖的抑制作用以及其对促炎细胞因子表达的抑制作用。
本发明的另一个具体目的在于提供新型的拮抗剂，即新型的抗人VISTA抗体和抗体片段，其可拮抗或阻断人VISTA对免疫的作用，特别是其对T细胞活性、分化和增殖的抑制作用以及其对促炎细胞因子表达的抑制作用。
本发明的另一个具体目的在于提供新型的免疫抑制性抗体和抗体片段，该免疫抑制性抗体和抗体片段可增强或模拟VISTA对T细胞免疫的抑制作用(即其抑制CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化)和其对免疫细胞因子，特别是促炎细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α和/或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的产生的抑制，以及其对趋化因子或化学引诱物诸如KC(角化细胞化学引诱物)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白2)的表达的促进作用。
本发明的另一个具体目的在于提供新型的抗体和抗体片段，该抗体和抗体片段可阻断或降低VISTA对T细胞免疫的抑制作用(即其增强CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化)和其对促炎免疫细胞因子，特别是促炎细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α和/或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的产生的抑制作用，以及其对趋化因子或化学引诱物诸如KC(角化细胞化学引诱物)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白2)的表达的促进作用。
本发明的另一个具体目的在于提供新型的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体和抗体片段，其具有特异性的表位特异性或者其与特异性抗人VISTA抗体竞争结合至人VISTA。
本发明的另一个具体目的在于提供新型的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体和抗体片段，其具有特异性的表位特异性或者其与特异性抗人VISTA抗体竞争结合至人VISTA，所述抗体和抗体片段激发(增强、引发或模拟)VISTA对免疫的抑制作用，例如其对T细胞免疫(即CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化)的抑制作用，和/或其抑制促炎性免疫细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α和/或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的产生，以及其对趋化因子或化学引诱物如KC(角化细胞化学引诱物)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白2)的表达的促进作用。
本发明还涉及这些激动性抗人VISTA抗体和抗体片段作为预防剂或治疗剂的具体用途，特别是用于治疗其中预防或抑制或减少免疫反应在治疗上是可取的，更具体地说其中预防或抑制或减少T细胞免疫(或更具体而言CD4+或CD8+介导的T细胞免疫)在治疗上是有益的的病症，诸如自体免疫、炎症、变应性障碍、败血症、GVHD，和/或用于治疗移植或细胞疗法受体，例如CAR-T受体，或者用于缓解某些病症诸如癌症的炎症副作用。
本发明还涉及新型拮抗性抗人VISTA抗体和抗体片段作为预防剂或治疗剂的用途，特别是用于治疗所需促进免疫的病症，例如T细胞免疫或CD4+或CD8+介导的T细胞免疫有益于治疗诸如癌症和感染性疾病的病症。
本发明的另一个具体目的在于提供根据本发明的激动性或拮抗性抗人VISTA抗体，其附接至可检测的标记、接头或治疗结构。
本发明的另一个具体目的在于提供诊断或治疗组合物，其包含诊断或治疗有效量的根据本发明的激动性或拮抗性抗人VISTA抗体，例如含有与具有图4所示序列的抗体任一者相同的CDR的抗体，其适用于人类疗法，诸如可静脉内、皮下或肌肉内施用的组合物。
本发明的另一个具体目的在于提供一种诊断或治疗方法，其联合使用根据本发明的激动性抗体和另一种免疫激动剂，例如PD-1或PD-L1激动剂，例如其中PD-1或PD-L1激动剂选自抗PD-1抗体或抗体片段、抗PD-L1抗体或抗体片段、PD-L1多肽或其片段(其可以其是单价的或多聚体)、PD-1多肽或其片段(其可以是单价的或多聚体)，或包含前述任一者的复合物或融合蛋白。
本发明的另一个具体目的是提供诊断或治疗方法，其联合使用根据本发明的拮抗性抗体和另一种免疫拮抗剂，例如PD-1或PD-L1拮抗剂，例如其中PD-1或PD-L1激动剂选自拮抗性抗PD-1抗体或抗体片段、拮抗性抗PD-L1抗体或抗体片段。
本发明的另一个具体目的是提供使体外或体内免疫细胞与根据本发明的拮抗性或激动性抗体接触的方法，例如人免疫细胞，例如其中将所述经接触的细胞输注进人受试者，诸如患有癌症或感染性疾病的受试者，或患有炎性病症、变应性病症或自体免疫病症的受试者。
附图说明
图1A-D.该图示出了可用于鉴定抑制性VISTA单克隆抗体(mAb)的体外和体内筛选测定法。A)在存在指定mAb的情况下将纯化的T细胞涂铺在抗CD3的上面72小时。通过H3掺入测量增殖。B)在存在指定抗体的情况下通过ISQ脉冲的APC刺激纯化的DO11.10 T细胞6天。通过使用CTV稀释染料测量增殖。C)通过将C57BL/6细胞转移到经照射的BALB/c受体中来诱导GVHD。转移后第0、2和4天给小鼠腹膜内注射200μg抗体并分析存情况。D)在施用ConA(15毫克/千克)之前3小时以10毫克/千克的指定抗体处理小鼠并通过Luminex在6下分析血浆中的IL-2。
图2A-F.该图显示激动性VISTA抗体在多种自体免疫疾病模型中是免疫抑制性的。VISTA抑制多种自体免疫疾病模型。A)从25周开始直至实验结束用8G8或仓鼠Ig(200μg)处理NZB/W F1小鼠3次/周。“X”表示对照处理组全部被处死的时间点。B)在施用15mg/kg(mpk)ConA前3小时用200μg抗体处理小鼠3小时并跟踪存活情况80小时。C)先用胶原II mAb、然后用LPS依次处理小鼠，通过测量足肿胀来测量关节炎。每隔一天施用8G8和仓鼠Ig(200μg)3次。D)每天将咪喹莫特(Imiquimod)施至小鼠的耳朵。在第14天时，每隔一天施用8G8或仓鼠Ig(200μg)，并用卡尺测量耳厚度。E、F)每天将咪喹莫特施至小鼠背部。在第9天，对小鼠实施安乐死，将其皮肤做成切片并染色以通过免疫组织化学(IHC)针对CD3表达进行分析。
图3.该图示出了野生型(WT)和hV-KI小鼠中VISTA的表达。从WT和VISTA KI小鼠的淋巴结中分离CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs(CD4+FoxP3+)和单核细胞CD11b+,Ly6C+,Ly6G-并分别用针对小鼠或人蛋白的αVISTA抗体染色。
图4含有不同抗人VISTA抗体的序列，包括INX800、INX801和INX900-INX919的序列。
图5示出了示例性抗人VISTA抗体(即INX800和INX801)在ConA肝炎模型中的作用，该模型评估了其对不同细胞因子、趋化因子和化学引诱物的表达的影响。
图6示出了示例性激动性抗人VISTA抗体(即INX800和INX801)在体内移植物抗宿主病(GVHD)动物模型中的作用。
图7示出了示例性激动性抗人VISTA抗体(即INX800或INX801)对CD3驱动的T细胞免疫应答的作用。激动性VISTA抗体抑制CD3驱动的T细胞免疫应答。
图8示出了示例性激动性抗人VISTA抗体(即INX800或INX801)对特定T细胞群体数量或对总T细胞数量的作用。
图9比较了示例性抗人VISTA抗体在ConA测定法中的作用以及对选定促炎细胞因子和炎症标志物(即IL-2、γ干扰素和IL-12p70)的表达的作用。
图10A-C：示出了不同的IgG2亚型。(A)二硫键改组导致亚型A和B，以及A/B的过渡状态(图来自Zhang,A.等，2015)。(B)可通过RP-HPLC区分各亚型(图来自Zhang,A.等人，2015)。(C)所观察到的INX901的RP-HPLC色谱图。
图11：示出了IgG2 A亚型或B亚型的化学富集。(黑线，顶部)色谱图示出了定义B型的明显的最左边的峰。(红线，底部)色谱图示出了定义A型的明显的右边的峰。
图12：就二硫键改组对INX901 Fc沉默变体进行比较。(顶部)IgG2骨架上的INX901表现出预期的A亚型、A/B亚型和B亚型的混合物。(中间)沉默的IgG1骨架上的INX901Si作为单一亚型存在。(底部)INX901HSi具有IgG1沉默Fc区，其中CH1/铰链来自IgG2，其使得二硫键改组等同于天然IgG2。
图13.经生化偏斜的INX901形式仍然可以减少MLR中细胞因子的产生。通过Luminex分析法在72小时时间点分析来自两个独立MLR的上清液的细胞因子产生。INX901亲本、A偏斜形式和B偏斜形式都以剂量依赖的方式减少了TNFα和IL-2的产生。
图14.经基因锁定的INX901形式仍然可以减少MLR中的细胞因子产生，但Fc沉默变体不能。通过Luminex分析法在72小时时间点分析来自每个MLR的上清液的细胞因子产生。INX901亲本、A锁定形式和B锁定形式都以剂量依赖的方式减少了TNFα和IL-2的产生。含有使Fc结构域沉默的突变的Si和HSi变体不能一致地抑制细胞因子的产生。
图15.经基因锁定的INX908形式仍然可以减少MLR中的细胞因子产生，但Fc沉默变体不能。通过Luminex分析法在72小时时间点分析来自每个MLR的上清液的细胞因子产生。INX908亲本、A锁定形式和B锁定形式都以剂量依赖的方式减少了TNFα和IL-2的产生。含有使Fc结构域沉默的突变的Si和HSi变体不能一致地抑制细胞因子的产生。
图16.该图示意性地描述了用于鉴定激动性抗人VISTA抗体所结合的线性表位和非连续表位的技术。Pepscan使用肽阵列来测定线性表位和非连续表位二者。
图17：该图显示激动性抗人VISTA抗体结合至相同的核心序列。所有抑制性INX抗体结合至相同的核心序列。
图18：该图汇总了根据本发明的不同抗人VISTA抗体的表位分析。该图涉及表位作图汇总。
图19：该图示出了激动性抗人VISTA抗体所结合的表位，并进一步鉴定了与结合有关的重要残基。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所述的那些类似或等效的方法和材料均可用于本发明中或本发明的测试，但是本文描述合适的方法和材料。材料、方法和实例仅为说明性的，并且无意进行限制。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相结合使用的命名法以及这些化学的实验室程序和技术在本领域众所周知且常用。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
如本文描述和随附权利要求书通篇所用，除非上下文另外明确规定，否则“一个(种)(a,an)”和“该(所述)(the)”的含义包括多个指代物。
如本文所用，“活化受体”泛指结合抗原、复合抗原(例如在MHC分子的情形下)、Ig-融合蛋白、配体或抗体的免疫细胞受体。活化受体但不限于T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、细胞因子受体、LPS受体、补体受体和Fc受体。例如，T细胞受体存在于T细胞上并与CD3分子缔合。T细胞受体受MHC分子背景下的抗原(以及受多克隆T细胞活化试剂)刺激。经由TCR进行的T细胞活化可导致许多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质改变、离子通量、环核苷酸改变、RNA转录改变、蛋白质合成改变和细胞体积改变。例如，T细胞受体存在于T细胞上并与CD3分子缔合。T细胞受体受MHC分子背景下的抗原(以及受多克隆T细胞活化试剂)刺激。经由TCR进行的T细胞活化可导致许多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质改变、离子通量、环核苷酸改变、RNA转录改变、蛋白质合成改变和细胞体积改变。
如本文所用，“佐剂”指用于刺激免疫系统和增加对疫苗的应答的试剂，其本身没有任何特异性抗原作用。
如本文所用，“激动剂”指可增强或模拟特定分子对免疫的作用的分子，通常是抗体或融合蛋白。一般而言，在本申请中，这将指可增强或模拟人VISTA对免疫的作用，特别是VISTA对T细胞免疫(CD4+和/或CD8+T细胞免疫)、促炎细胞因子的表达的抑制作用以及其对特定趋化因子和化学引诱物表达的作用的抗人VISTA激动性抗体和抗体片段。
如本文所用，“有助于诊断”或“有助于检测”疾病指特定的标志多肽或表达的RNA的表达水平被单独地或与一种或多种其他标志物相结合检测以评估个体是否具有特定疾病病症的细胞特征或特定疾病病症的发作或者具有免疫功能失调，诸如表征为VISTA表达的免疫抑制或表征为细胞具有降低的VISTA水平的异常免疫上调，例如在自体免疫、炎症或变应性应答期间，如在患有慢性和非慢性疾病的个体中。
如本文所用，“变应性疾病”泛指涉及变态反应的疾病。更具体而言，“变应性疾病”被定义为鉴别到其变应原的疾病，其中暴露于该变应原与发生病理变化之间存在强相关性，并且其中该病理变化已证明具有免疫学机制。在本实施方式中，免疫学机制意指白细胞显示出对变应原刺激的免疫应答。
如本文所用，“氨基酸”泛指天然存在的和合成的氨基酸，以及以于天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸(如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指基本化学结构与天然存在的氨基酸相同(即，碳结合至氢、羧基、氨基)并且具有R基团(如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍)的化合物。类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但仍保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指不同于氨基酸的一般化学结构，但以以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
如本文所用，“无反应性”或“耐受性”或“延长的抗原特异性T细胞抑制”或“延长的免疫抑制”泛指对活化受体介导的刺激的抵抗性(Reflectivity)。抵抗性通常是抗原特异性的，并且在停止暴露于耐受性抗原后持续存在。例如，T细胞中的无反应性(与无应答性相对)表征为缺乏细胞因子产生，例如IL-2。当T细胞暴露于抗原并在不存在第二信号(共刺激信号)时接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时，发生T细胞无反应性。在这些条件下，细胞再次暴露于相同的抗原(即使是在存在共刺激分子的情况下发生再暴露)会导致不能产生细胞因子，并因此不能增殖。然而，无反应性T细胞可对无关抗原发生反应，并且可在用细胞因子(如IL-2)培养时增殖。例如，T细胞无反应性也可通过T淋巴细胞缺乏IL-2产生而观测到，如通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖测定法来测量。作为另一种选择，可使用报告基因构建体。例如，无反应性T细胞不能引发由异源启动子在5'IL-2基因增强子控制下诱导的或由可见于增强子内的API序列的多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等(1992)Science 257:1134)。共刺激信号的调节可导致免疫细胞的效应功能的调节。
如本文所用，“拮抗剂”指可阻断或降低特定分子对免疫的作用的分子，通常是抗体或融合蛋白。一般来说，在本申请中，这将指可阻断或降低人VISTA对免疫的作用，特别是VISTA对T细胞免疫(CD4+和/或CD8+T细胞免疫)、促炎细胞因子的表达的抑制作用以及VISTA对特定趋化因子和化学引诱物表达的作用的抗人VISTA拮抗性抗体和抗体片段。
如本文所用，“抗体”泛指抗体的“抗原结合部分”(也可与“抗体部分”、“抗原结合片段”、“抗体片段”互换使用)，以及完整的抗体分子。如本文所用，术语“抗原结合部分”是指抗体保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段(例如，VISTA或其特定部分)。本文所提及的术语“抗体”包括完整的多克隆和单克隆抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链以及双特异性和多特异性抗体，例如结合多种抗原或多种抗原表位的抗体。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由至少一个重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、Cm和Cm-)组成。每条轻链由至少一个轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL-)组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。更通常而言，术语“抗体”旨在包括具有匹配并识别表位的特定形状的任何含多肽链的分子结构，其中一个或多个非共价结合相互作用可稳定该分子结构与表位之间的复合物。原型抗体分子是免疫球蛋白，并且来自所有来源(人类、啮齿动物、兔、牛、绵羊、猪、狗、其他哺乳动物、鸡、其他禽类等)的所有类型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)均视为“抗体”。
抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的抗原结合片段的非限制性实例包括(a)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(b)F(ab’)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(c)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(d)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(e)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(f)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但它们可以利用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够作为单个蛋白质链制备，其中VL和VH区配对而形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；以及Osbourn等(1998)Nat.Biotechnol.16:778。单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。也可以将任何特异性scFv的VH和VL序列与人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列连接以产生编码完整IgG分子或其他同种型的表达载体。VH和VL也可以利用蛋白质化学或重组DNA技术用于产生免疫球蛋白的Fab、Fv或其他片段。还涵盖其他形式的单链抗体，诸如双体。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。参见例如Holliger等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等(1994)Structure 2:1121-1123。更进一步地，抗体或其抗原结合部分(抗原结合片段、抗体片段、抗体部分)可以是较大免疫粘附分子的一部分，免疫粘附分子通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合而形成。免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov等(1995)Hum.AntibodiesHybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子。Kipriyanov等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058。抗体部分，诸如Fab和F(ab’)2片段，可以使用常规技术(诸如分别对完整的抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)从完整抗体制备。此外，如本文所述，可以使用标准的重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、异种抗体、同种异体抗体、同基因抗体或它们经修饰的形式，例如人源化抗体、嵌合型抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，“识别抗原的抗体”和“抗原特异的抗体”“特异性地结合至抗原的抗体”互换使用，并且是指特异性地结合抗原的免疫球蛋白或其片段。
如本文所用，“抗原”泛指能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其另外能够诱导动物产生能够结合至该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个表位或者具有一个以上的表位。本文提及的特异性反应表示抗原将以高度选择性的方式与其相应抗体而非与众多可能由其他抗原激发的其他抗体反应。在对所关注的特定抗原有所需增强的免疫应答的情况下，抗原包括但不限于示例性的感染性疾病抗原，针对其可引发保护性免疫应答。
如本文所用，“抗原递呈细胞”泛指专职性抗原递呈细胞(例如B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell))以及其他抗原递呈细胞(例如角质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞)。
如本文所用，“反义核酸分子”泛指与编码蛋白质的“有义”核酸互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补)、与mRNA序列互补或与基因的编码链互补的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可以通过氢键结合至有义核酸分子。
如本文所用，“细胞凋亡”泛指程序性细胞死亡，其可使用本领域已知的技术表征。凋亡性细胞死亡可表征为在细胞分裂中以细胞收缩、膜起泡和染色质凝聚告终。正经历凋亡的细胞还显示核小体间DNA裂解的特征模式。
如本文所用，“自体免疫”或“自体免疫疾病或病症”泛指由个体自身组织引起或针对个体自身组织而产生的疾病或病症，或其共分离或表现、或由其产生的病症。本文中的自体免疫病症包括炎性或变应性病症，例如表征为针对潜在与组织破坏相关的自身抗原的宿主免疫反应的慢性疾病，诸如类风湿性关节炎。
如本文所用，“B细胞受体(BCR)”泛指见于B细胞上的在膜Ig(mIg)与其他跨膜多肽(如IgA和Ig)之间的复合物。mIg的信号转导功能由受体分子通过低聚抗原或多聚抗原交联触发。B细胞也可通过抗免疫球蛋白抗体活化。在BCR活化时，在B细胞中发生许多变化，包括酪氨酸磷酸化。
如本文所用，“癌症”泛指表征为细胞分裂异常且不受控制从而导致恶性生长或肿瘤(例如细胞生长不受调节)的任何肿瘤疾病(无论是浸润性的还是转移性的)。本文所用的术语“癌症”或“癌性”应理解为涵盖表征为引起恶性生长或肿瘤的异常且不受控制的细胞分裂的任何肿瘤性疾病(无论是浸润性的、非浸润性的还是转移性的)，本文描述了其非限制性实例。这包括哺乳动物中通常表征为不受调节的细胞生长的任何生理状况。在工作实施例中举例说明了癌症的实例。另外的癌症包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括：鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞NHL；肿块性NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性障碍(PTLD)。适合于通过本发明治疗的其他癌症包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴性恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括：结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞NHL；肿块性疾病；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性障碍(PTLD)，以及瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯综合征(Meigs’syndrome)。优选地，癌症选自：结肠直肠癌、乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一个示例性实施方案中，癌症是早期或晚期(包括转移性)膀胱癌、卵巢或黑素瘤。在另一个实施方案中，癌症是结肠直肠癌。依从本发明的治疗的癌性病症包括表达或不表达VISTA的癌症，并且还包括其中免疫细胞、基质细胞或患病细胞的VISTA表达抑制抗肿瘤应答和抗浸润免疫应答的非转移性或非浸润性以及浸润性或转移性癌症。本发明的方法特别适用于血管化肿瘤的治疗。根据本发明的癌症包括表达或不表达VISTA的癌症，并且还包括其中免疫细胞、基质细胞或患病细胞的VISTA表达抑制抗肿瘤应答和抗浸润免疫应答的非转移性或非浸润性以及浸润性或转移性癌症，以及表征为血管化肿瘤的那些癌症。
如本文所用，“嵌合抗体”泛指这样一种抗体分子，其中恒定区或其部分被改变、置换或交换以使得抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变类别、效应功能和/或物种的恒定区，或赋予该嵌合抗体以新的性质的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物，可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、置换或交换。
如本文所用，“编码区”泛指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区，而术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列区域(例如，5’和3’非翻译区)。
如本文所用，“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者，并且对于特定核酸序列，泛指保守修饰的变体：其是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不编码基本上相同的序列的氨基酸序列。因为遗传密码的简并性，大量在功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。“沉默变异”是一种保守修饰的核酸变异。在本文中编码多肽的每一核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除通常作为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG)以及通常作为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)以得到在功能上相同的分子。
如本文所用，“互补决定区”、“高变区”或“CDR”泛指见于抗体轻链或重链可变区中的高变区或互补决定区(CDR)中的一者或多者。参见Kabat等(1987)Sequences ofProteins of Immunological Interest National Institutes of Health,Bethesda,Md。这些表述包括如Kabat等(1983)在Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.of Health and Human Services中定义的的高变区，或抗体3维结构中的高变环。Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。各链中的CDR都保持在框架区的邻近处，并且与来自另一条链的CDR一起促成形成抗原结合位点。在CDR内，存在已被称为选择性决定区(SDR)的选择氨基酸，其表示在抗体-抗原相互作用中被CDR使用的关键接触残基。(Kashmiri(2005)Methods 36:25-34)。
如本文所用，“对照量”泛指标志物可为待相对于标志物的测试量加以比较的任何量或一定范围的量。例如，标志物的对照量可为患有特定疾病或病症的患者或不患有这种疾病或病症的人的体内标志物的量。对照量可为绝对量(如微克/毫升)或相对量(如相对信号强度)。
如本文所用，“共刺激受体”泛指将共刺激信号传送至免疫细胞的受体，如CD28或ICOS。如本文所用，术语“抑制性受体”包括将负信号传送至免疫细胞(如T细胞或NK细胞)的受体。
如本文所用，“共刺激”泛指共刺激分子能够提供诱导增殖或效应功能的第二非活化受体介导的信号(“共刺激信号”)的能力。例如，共刺激信号可导致细胞因子分泌(例如在收到了T细胞受体介导的信号的T细胞中)。已经收到细胞受体介导的信号(例如经由活化受体)的免疫细胞在本文中可称为“活化的免疫细胞”。关于T细胞，将共刺激信号传送至T细胞涉及不受环孢菌素A(cyclosporinΑ)抑制的信号传导路径。此外，共刺激信号可诱导T细胞中的细胞因子分泌(如IL-2和/或IL-10)和/或可防止在T细胞中诱导抗原无应答性、诱导无反应性、或诱导细胞死亡。
如本文所用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”指在与T细胞上的细胞表面分子相互作用后调节T细胞应答的多肽。
如本文所用，“共刺激信号传导”是由在抗原特异性T细胞应答期间抗原递呈细胞上的共刺激多肽与它们在T细胞上的受体之间的相互作用所致的信号传导活性。在不希望受单一假设的限制下，抗原特异性T细胞应答据信由以下两种信号介导：1)T细胞受体(TCR)与在MHC的情形下递呈的抗原肽接合(信号1)，和2)通过不同共刺激受体/配体对之间的接触来递送的第二抗原非依赖性信号(信号2)。在不希望受单一假设限制下，这个“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化还是抑制)以及该应答的强度和持续时间方面至关重要，并且由来自共刺激分子诸如B7家族的蛋白质的正信号与负信号两者调节。
如本文所用，“B7”多肽意指B7蛋白质家族的成员，所述蛋白质共刺激T细胞，包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3及它们的生物活性片段和/或变体。代表性生物活性片段包括共刺激T细胞的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。
如本文所用，“细胞质结构域”泛指蛋白质的延伸至细胞的细胞质中的部分。
如本文所用，“诊断”泛指鉴定病理状况的存在或性质。诊断方法的灵敏性和特异性存在差异。诊断测定法的“灵敏性”是测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。测定法未检测出的患病个体是“假阴性”。未患病以及在测定法中测试阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定法的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为测试阳性的无疾病者的比例。虽然特定的诊断方法可能不提供对病症的明确诊断，但若所述方法提供有助于诊断的阳性指示，那么则足够。
如本文所用，“诊断”或“有助于诊断”泛指将疾病或症状分类和/或确定个体具有疾病病症的可能性(例如基于不存在或存在VISTA表达，和/或由免疫细胞、基质细胞和/或推定患病细胞达成的表达增加或降低)；确定疾病的严重性、监测疾病进展、预测疾病的结果和/或恢复前景。术语“检测”也可任选涵盖任何前述事项。在一些实施方案中，根据本发明来诊断疾病可通过测定从受试者获得的生物样品中本发明的多核苷酸或多肽的水平来实现，其中可使测定的水平与疾病易感性或疾病的存在与否相关联。应注意，“从受试者获得的生物样品”也可任选包括尚未从受试者身体上取出的样品。
如本文所用，“有效量”泛指化合物、抗体、抗原或细胞的当向患者施用以治疗疾病时足以实现对所述疾病的治疗的量。有效量可为有效用于预防的量和/或有效用于预防的量。有效量可为有效减轻征象/症状的量、有效预防征象/症状的出现、降低征象/症状出现的严重性、消除征象/症状出现、减缓征象/症状出现的发展、防止征象/症状出现的进展和/或实现对征象/症状出现的预防的量。“有效量”可视待治疗患者的疾病及其严重性以及年龄、体重、病史、易感性和预先存在的病症而变化。为了本发明的目的，术语“有效量”与“治疗有效量”同义。
如本文所用，“细胞外结构域”或“ECD”泛指蛋白质的延生出细胞的表面的部分。
如本文所用，“表达载体”泛指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中在体外或体内组成型或诱导型表达本发明的核酸序列的目的的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持游离或整合至宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可具有自我复制的能力或不具有该能力，即仅驱动在细胞中的瞬时表达。该术语包括仅含有为重组核酸的转录所需的最少元件的重组表达盒。
如本文所用，“家族”泛指本发明的多肽和核酸分子，意指具有共同结构域或基序并且具有足够氨基酸或核苷酸序列同源性(如本文所定义)的两个或更多个多肽或核酸分子。家族成员可为天然或非天然存在的并且可来自相同或不同物种。例如，家族可含有第一来源以及其他来源的第一多肽、人来源的不同多肽，或者可含有非人源同系物(如猴多肽)。家族的成员也可具有共同功能特征。
如本文所用，“Fc受体”(FcR)泛指免疫球蛋白分子(Ig)的Fc部分的细胞表面受体。Fc受体见于参与免疫应答的许多细胞上。在迄今为止已鉴定的人FcR之中，有识别IgG(命名为FcγR)、IgE(FceRl)、IgA(FcaR)和聚合IgM/A(FcεμR)的那些。FcR见于以下细胞类型中：FceRI(肥大细胞)、FceRII(许多白细胞)、FcaR(嗜中性粒细胞)和FcμR(腺上皮、肝细胞)。(Hogg(1988)Immunol.Today 9:185-86)。广泛研究的FcγR为细胞免疫防御中的核心，并且负责刺激自体免疫性疾病的发病机理中涉及的炎症和水解酶的介体的释放。(Unkeless(1988),Annu.Rev.Immunol.6:251-87)。FcγR在效应细胞与分泌Ig的淋巴细胞之间的提供重要联系，因为巨噬细胞/单核细胞、多形核白细胞和天然杀伤(NK)细胞FcγR赋予由IgG介导的特异性识别的元件。人白细胞具有IgG的至少三种不同类型的FcγR受体：hFcγRI(CD64)(见于单核细胞/巨噬细胞上)、hFcγRIIA或hFcγRIIB(CD32或CD32A)(见于单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、可能还有B细胞、以及K562细胞系上)和FcγRIIIA(CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)(见于NK细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞上)。
如本文所用，“框架区”或“FR”泛指抗体的轻链和重链的可变区内的框架区的一个或多个。参见Kabat等(1987)Sequences of Proteins of Immunological InterestNational Institutes of Health,Bethesda,Md。这些表述包括插入抗体轻链和重链的可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区。
如本文所用，“异源”泛指核酸的多个部分，其表明该核酸包含两条或更多条在自然界中不以相同关系存在的子序列。例如，通常经重组而产生具有两个或更多个来自不相关基因、被布置成产生新功能性核酸的序列(例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区)的核酸。类似地，异源蛋白质指示蛋白质包含两条或更多条在自然界中不以相同关系存在的子序列(例如融合蛋白)。
如本文所用，“高亲和力”泛指抗体或融合蛋白对靶标抗原或受体具有的KD为至少10-6M、更优选地10-7M、甚至更优选地至少10-8M、甚至更优选地至少10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。IgG抗体或融合蛋白的“高亲和力”在本文中是指抗体对靶标抗原或受体具有的KD为至少10-6M、更优选地至少10-7M或、优选地至少10-8M、更优选地至少10-9M，并且甚至更优选地至少10-10M、10 -11M或10-12M。具体关于抗体而言，“高亲和力”结合可针对其他抗体同种型而变化。例如，对IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为至少10-7M、更优选地至少10- 8M。
如本文所用，“同源性”泛指核酸序列与参照核酸序列之间或多肽序列与参照多肽序列之间的类似性程度。同源性可为部分的或完全的。完全同源性指核酸或氨基酸序列是相同的。部分同源的核酸或氨基酸序列是与参照核酸或氨基酸序列不相同的核酸或氨基酸序列。可通过例如美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)的BlastP软件，利用默认参数进行序列比较来确定同源性程度。术语“序列同一性”可与“同源性”互换使用。
如本文所用，“宿主细胞”泛指已引入了本发明的核酸分子诸如本发明的重组表达载体的细胞。宿主细胞可为原核细胞(如大肠杆菌)，或真核细胞诸如酵母、昆虫(如SF9)、两栖动物或哺乳动物细胞诸如CHO、HeLa、HEK-293，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应了解，这些术语不仅指特定的受试者细胞，而且还指这种细胞的子代或潜在子代。因为后代中可能因突变或环境影响而出现某些改变，所以子代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍然被包括在如本文所用的该术语的范围内。
“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架区与CDR区两者均源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，由杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的B细胞，所述B细胞从转基因非人动物例如转基因小鼠获得，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。这包括完全人单克隆抗体及其缀合物和变体，例如其结合于诸如治疗剂或诊断剂之类的效应子。
如本文所用，“人源化抗体”泛指包括通过具有可变区和恒定区的非人细胞产生的抗体，所述可变区和恒定区已发生改变从而与将通过人细胞产生的抗体更加密切相似。例如，通过改变非人抗体氨基酸序列以并入见于人种系免疫球蛋白序列中的氨基酸。本发明的人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。如本文所用，术语“人源化抗体”也包括这样的的抗体，其中已将来源于另一种哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列移植于人框架序列上。
如本文所用，“杂交”泛指互补(包括部分互补)的多核苷酸链通过在所述链彼此反平行布置时在互补核苷酸之间形成氢键而产生的物理相互作用。
如本文所用，“IgV结构域”和“IgC结构域”泛指Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有称为Ig折叠的不同折叠样式的结构单元。Ig折叠包含两个β折叠的夹心结构，各β折叠由5-10个氨基酸的反平行β链组成与大多数但非全部结构域中的两个折叠之间的保守二硫键组成。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共有相同类型的序列模式，并且被称为Ig超家族内的CI组。其他IgC结构域属于其他组。IgV结构域也共有序列模式，并且被称为V组结构域。IgV结构域长于C结构域，并且形成另外一对β链。
如本文所用，“免疫细胞”泛指具有造血来源且在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括但不限于：淋巴细胞诸如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；树突细胞，以及髓样细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文所用，“免疫测定法”泛指使用抗体来特异性结合抗原的测定法。免疫测定法可表征为使用特定抗体的特异性结合性质来分离、靶向和/或定量抗原。
如本文所用，“免疫相关疾病(或障碍或病症)”应理解为涵盖选自包括但不限于以下的组的任何疾病、障碍或病症：自体免疫性疾病、炎性疾病和与移植物移植排斥相关的免疫障碍，诸如急性和慢性器官移植排斥、同种异体干细胞移植排斥、自体干细胞移植排斥、骨髓移植排斥和移植物抗宿主疾病。
如本文所用，“免疫应答”泛指受T细胞共刺激的调节的影响的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括B细胞应答(例如抗体产生)、T细胞应答(例如细胞因子产生和细胞细胞毒性)以及细胞因子应答性细胞(例如巨噬细胞)的活化。如本文所用，关于免疫应答的术语“下调”包括任何一种或多种免疫应答的降低，而关于免疫应答的术语“上调”包括任何一种或多种免疫应答的提高。应当了解，一种类型的免疫应答的上调可导致另一类型的免疫应答的相应下调。例如，某些细胞因子(例如IL-10)的产生的上调可导致细胞免疫应答的下调。
如本文所用，“免疫的”、“免疫学的”、“免疫”应答指在接受患者中产生针对肽的体液应答(抗体介导)和/或细胞应答(由抗原特异性T细胞或它们的分泌产物介导)。这种应答可为通过施用免疫原来诱导的主动应答或通过施用抗体或致敏T细胞来诱导的被动应答。在不希望受单一假设限制下，细胞免疫应答通过递呈与II类或I类MHC分子缔合的多肽表位以分别活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引发。应答也可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化、嗜中性粒细胞或先天免疫的其他组分的活化或募集。可通过增殖测定法(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定法来确定存在细胞介导的免疫应答。可通过从经免疫同基因动物分别分离抗体和T细胞，并在第二受试者中测量保护性或治疗性作用来区分体液应答和细胞应答对针对免疫原的保护性或治疗性作用的相对贡献。
“免疫原性试剂”或“免疫原”是在任选与佐剂联合向哺乳动物施用时能够诱导针对它自身的免疫应答的部分。
如本文所用，可互换使用的“炎性障碍”、“炎性病症”和/或“炎症”泛指慢性或急性的炎性疾病，并且明确包括炎性自体免疫性疾病和炎性变应性病症。这些病症例如包括表征为对有害刺激诸如病原体、受损细胞或刺激物的免疫应答调节异常的炎性异常。炎性障碍是种类繁多的人疾病的根本。病因起源于炎性过程中的非免疫疾病包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病。与炎症相关的障碍的实例包括：慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、超敏反应、骨盆炎性疾病、再灌注损伤、类肉瘤病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝塞特氏综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征(Blau’s Syndrome)、痛风、成人和青少年斯蒂尔氏病(Still’s disease)、冷吡啉病(cryropyrinopathy)、马克尔-韦尔斯综合征(Muckle-Wellssyndrome)、家族性寒冷诱发的自体炎性综合征、新生儿发作型多系统炎性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、全身性青少年特发性关节炎、高IgD综合征、史尼兹勒氏综合征(Schnitzler’s syndrome)、TNF受体相关的周期综合征(TRAPSP)、齿龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎以及选自由牛皮癣、特应性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹和粉刺的炎性皮肤障碍。
如本文所用，“抑制性信号”泛指通过免疫细胞上的抑制性受体分子传送的信号。信号经由活化受体(例如经由TCR、CD3、BCR或Fc分子)拮抗信号并可导致例如以下方面的抑制：第二信使产生；增殖；或免疫细胞中的效应功能，例如减少吞噬作用、减少抗体产生或降低细胞毒性，或免疫细胞无法产生介体(例如细胞因子(例如IL-2)和/或变应性应答的介体)；或发生无反应性。
如本文所用，“分离的”泛指物质从其天然存在的原始环境移除，从而从其天然环境人为地改变，并且包括“重组”多肽。分离的物质可为例如包括载体系统包括的外源性核酸、宿主细胞内所含的外源性核酸、或已从其原始环境移出从而被人为地改变的任何物质(例如“分离的抗体”)。例如，如本文所用，“分离的”或“纯化的”泛指蛋白质、DNA、抗体、RNA或其生物活性部分，它们基本上不含来自生物物质所源于的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染性蛋白，或当通过化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。如本文所用，术语“分离的”是指所关注的化合物(例如多核苷酸或多肽)处于与所述化合物天然存在的环境不同的环境中，例如诸如通过将肽浓缩至其不在自然界中被发现的浓度而从其天然环境分离。“分离的”包括化合物处于基本上富集所关注的化合物和/或其中所关注的化合物被部分或基本上纯化的样品内。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合VISTA的分离的抗体基本上不含特异性结合除VISTA以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgGl)。
如本文所用，“K缔合”或“Ka”泛指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用，术语“K解离”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所用，术语“KD”意指解离常数，其从Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。可使用本领域中良好确立的方法诸如等离子体共振ELISA和KINEXA来确定抗体的KD值。一种优选用于确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子体共振、优选利用生物传感器系统诸如系统或通过ELISA来进行。通常，这些方法在25°或37℃下进行。用于治疗用途的抗体在25℃或37℃下通过表面等离子体共振测定时通常具有50nM或更低、或更通常1nM或更低的KD。
如本文所用，“标记”或“可检测部分”泛指可通过光度法、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。
如本文所用，“低严格度”、“中等严格度”、“高严格度”或“极高严格度条件”泛指用于核酸杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Ausubel等(2002)ShortProtocols in Molecular Biology(第5版)John Wiley&Sons,NY中。示例性的特异性杂交条件包括但不限于：(1)低严格性杂交条件，在约45℃下于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行，随后至少在50℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中洗涤两次(对于低严格度条件，洗涤温度可增加至55℃)；(2)中等严格性杂交条件，在约45℃下于6×SSC中进行，随后在60℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件，在约45℃下于6×SSC中进行，随后在65℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中洗涤一次或多次；以及(4)极高严格性杂交条件是在65℃下0.5M磷酸钠、7％ SDS，随后在65℃下以0.2×SSC和1％ SDS洗涤一次或多次。
如本文所用，“哺乳动物”泛指哺乳纲的表征为在皮肤上覆有毛发以及雌性有用于养育幼仔的产乳乳腺的任何及所有温血脊椎动物(包括人)。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼、犰狳、水豚、猫、骆驼、黑猩猩、灰鼠、牛、狗、山羊、大猩猩、仓鼠、马、人、狐猴、美洲驼、小鼠、非人灵长类动物、猪、大鼠、绵羊、鼩鼱、松鼠、貘和田鼠。哺乳动物包括但不限于牛科动物、犬科动物、马科动物、猫科动物、鼠科动物、羊科动物、猪科动物、灵长类动物和啮齿动物物种。哺乳动物还包括任何及所有由华盛顿哥伦比亚特区美国国家自然历史博物馆史密森尼学会(National Museum of Natural History,Smithsonian Institution inWashington D.C.)列在世界哺乳动物物种(Mammal Species of the World)上的那些哺乳动物。
“多特异性抗体”是指具有2个或更多个抗原结合区的抗体。这包括双特异性抗体。这些抗原结合区可结合至不同抗原或结合至同一抗原的不同表位。
如本文所用，“天然存在的核酸分子”泛指具有在自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白)。
如本文所用，“核酸”或“核酸序列”泛指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语涵盖核酸，即寡核苷酸，其含有天然核苷酸的已知类似物。该术语也涵盖具有合成主链的核酸样结构。除非另外指明，否则特定核酸序列也暗中涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确指明的序列。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
如本文所用，“有效连接”泛指当使两个DNA片段接合时，使由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
如本文所用，“互补位”泛指抗体的识别抗原的部分(例如抗体的抗原结合位点)。互补位可为抗体的Fv区的小区域(例如15-22个氨基酸)并且可含有抗体重链和轻链的部分。参见Goldsby等的Antigens(第3章)Immunology(第5版)New York:W.H.Freeman andCompany，第57-75页。
如本文所用，“患者”或“受试者”或“受体”、“个体”或“所治疗的个体”可互换使用，并且泛指需要治疗以缓解疾病状态或预防疾病状态的发生或复发的任何动物。另外，如本文所用的“患者”泛指具有风险因素、疾病史、易感性、症状和征象、先前被诊断、处于疾病风险中或是疾病患者群体的成员的任何动物。患者可为临床患者诸如人，或兽医学患者诸如伴侣动物、驯化动物、家畜动物、外来动物或动物园动物。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且泛指任何长度的氨基酸残基的聚合物，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。该术语适用于以下氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。该术语适用于以下氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的的氨基酸聚合物。可例如通过添加碳水化合物残基以形成糖蛋白来修饰多肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”明确包括糖蛋白以及非糖蛋白。
如本文所用，“启动子”泛指引导核酸转录的一系列核酸序列。如本文所用，启动子包括在起始转录位点附近的必要的核酸序列，诸如在聚合酶Π型启动子的情况下是TATA元件。启动子也任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对之处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。
如本文所用，“预防有效量”泛指化合物当向患者施用以预防疾病或防止疾病复发时足以对疾病或复发实现这种预防的量。预防有效量可为有效预防征象和/或症状的发生的量。“预防有效量”可视待治疗患者的疾病及其严重性以及年龄、体重、病史、病症倾向性和先前存在的病症而变化。
“预防性疫苗”和/或“预防性疫苗接种”指用于预防疾病或与疾病相关的症状诸如癌症或感染性病症的疫苗。
如本文所用，“预防”泛指其中征象和/或症状不存在于患者中、处于缓解的情况下、或先前存在于患者中的疗程。预防包括防止在治疗患者的疾病之后出现疾病。此外，防止包括治疗可能会发生疾病的患者，尤其是易患疾病的患者(例如患者群体的成员、具有风险因素或处于发生疾病的风险下的那些患者)。
如本文所用，“重组”泛指产物，例如指细胞或核酸、蛋白质或载体，指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质得到修饰，或所述细胞源于经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达该细胞的初始(非重组)形式中未见的基因，或表达以别的方式异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
如本文所用，“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从人免疫球蛋白基因转基因性或转染色体性动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体(以下进一步描述)，(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体具有其中框架区和CDR区源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可使所述重组人抗体经受体外诱变(或当使用人Ig序列转基因性动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：尽管源于人种系VH和VL序列以及与人种系VH和VL序列相关，但可不天然存在于体内人抗体种系谱系内。
如本文所用，“信号序列”或“信号肽”泛指含有约15个或更多个氨基酸的肽，其存在于分泌性多肽和膜结合多肽的N末端，并且含有大量疏水性氨基酸残基。例如，信号序列含有至少约10-30个氨基酸残基，优选约15-25个氨基酸残基，更优选地约18-20个氨基酸残基，并且甚至更优选约19个氨基酸残基，并且具有至少约35％-65％，优选约38％-50％，并且更优选约40％-45％疏水性氨基酸残基(例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)。“信号序列”在本领域中也称为“信号肽”，用于将含有这种序列的多肽引导至脂质双层，并且在分泌性和膜结合多肽中裂解。
如本文所用，“特异性(或选择性)结合”至抗体或“对…具有特异性(或选择性)免疫活性”或“与…特异性相互作用或结合”泛指蛋白质或肽(或其他表位)，在一些实施方案中，指可确定所述蛋白质在蛋白质和其他生物物质的异质群体中存在的结合反应。例如，在指定免疫测定法条件下，指定的抗体结合至特定蛋白质，结合量比背景(非特异性信号)大至少两倍，并且基本上不会与样品中存在的其他蛋白质大量结合。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍，并且更通常为背景的约10至100倍以上。
如本文所用，“可特异性杂交的”和“互补的”泛指核酸可通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)类型或其他非传统类型来与另一核酸序列形成氢键。核酸分子与其互补序列的结合自由能足以使得核酸的相关功能得到发挥，例如RNAi活性。本领域熟知核酸分子的结合自由能的测定。(参见例如Turner等(1987)的CSH Symp.Quant.Biol.LII:123-33；Frier等(1987)PNAS 83:9373-77 1986)；Turner等的J.Am.Chem.Soc.109:3783-85)。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如在10个中有约至少5、6、7、8、9、10个，即有约至少50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补性(包括所述值))。“完全互补”或100％互补性泛指核酸序列的所有连续残基都与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键合。
“基本互补性”是指排除被选择为具有非互补性的多核苷酸链区域，诸如突出，多核苷酸链表现出约至少90％的互补性。特异性结合需要足够程度的互补性以避免寡聚化合物与非目标序列在需要特异性结合所处的条件下，即在体内测定法或治疗性治疗的情况下的生理条件下，或在体外测定法的情况下在进行测定法所处的条件下，发生非特异性结合。非目标序列通常可相差至少5个核苷酸。
如本文所用，疾病的“征象”泛指指示疾病、在检查患者时发现的任何异常；与症状相反的客观的疾病指示，而症状是主观的疾病指示。
如本文所用，“固体载体”、“载体”和“基材”泛指提供固体或半固体结构，另一材料可与其附接的任何材料，其包括但不限于光滑载体(例如金属、玻璃、塑料、硅和陶瓷表面)以及纹理化和多孔的材料。
如本文所用，VISTA的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“可溶性VISTA蛋白/分子”意指非细胞表面结合的VISTA分子或其任何部分，包括但不限于：VISTA融合蛋白或VISTA ECD-Ig融合蛋白(其中使VISTA的细胞外结构域或其片段融合于免疫球蛋白(Ig)部分，从而致使融合分子可溶)或其片段和衍生物；其中VISTA的细胞外结构域与生物活性或化学活性蛋白质(诸如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关的抗原p97或HIV包膜蛋白)的一部分融合或接合的蛋白质或其片段和衍生物；杂合(嵌合)融合蛋白(诸如VISTA-Ig)或其片段和衍生物。以下更详细描述所述融合蛋白。
如本文所用，“可溶性VISTA蛋白/分子”也包括跨膜结构域被移除以致使蛋白质可溶的VISTA分子或其片段和衍生物；其片段、部分或衍生物以及可溶性VISTA突变分子。用于根据本发明至少一些实施方案的方法中的可溶性VISTA分子可以或可不包括信号(前导)肽序列。
如本文所用，在疗法或诊断的情形下的“受试者”或“患者”或“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等，即适于根据本发明进行治疗的任一个，包括但不限于禽类和哺乳动物受试者，并且优选地为哺乳动物。需要根据本发明进行治疗的任何哺乳动物受试者都是适合的。两种性别以及处于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、青少年、青年和成人)的人受试者都可根据本发明进行治疗。本发明也可对动物受试者，特别是哺乳动物受试者诸如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、山羊、绵羊和马进行以用于兽医学目的，以及用于药物筛选和药物开发目的。“受试者”可与“个体”和“患者”互换使用。
如本文所用，“基本上不含化学前体或其他化学物质”泛指VISTA蛋白的制剂，其中蛋白质与蛋白质的合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。在一个实施方案中，用语“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括具有少于约30％(以干重计)的化学前体或非VISTA化学物质、更优选少于约20％化学前体或非VISTA化学物质、还更优选少于约10％化学前体或非VISTA化学物质以及最优选少于约5％化学前体或非VISTA化学物质的VISTA蛋白制剂。
如本文所用，疾病的“症状”泛指由患者所感受并且指示疾病的在结构、功能或感觉方面的任何病态现象或与正常情况的偏离。
如本文所用，“T细胞”泛指CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞也包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞两者。
如本文所用，“疗法”、“治疗性”或“治疗”泛指治疗疾病，停滞或减轻疾病或其临床症状的发展、和/或缓解疾病，使疾病或其临床症状消退。疗法涵盖预防、治疗、补救、减少、减轻和/或使得疾病、疾病的征象和/或症状缓解。疗法涵盖减轻具有进行中疾病征象和/或症状(例如炎症、疼痛)的患者的征象和/或症状。疗法还涵盖“预防”。出于疗法的目的，术语“减轻”泛指征象和/或症状的临床显著的减轻。疗法包括治疗复发或复发性征象和/或症状(例如炎症、疼痛)。疗法涵盖但不限于阻止任何时候出现征象和/或症状以及减轻现有征象和/或症状以及消除现有征象和/或症状。疗法包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或预防征象和/或症状(例如炎症、疼痛)的复发。
如本文所用，“Treg细胞”(有时也被称为抑制T细胞或诱导型Treg细胞或iTreg)指T细胞亚群，其调节免疫系统并维持对自身抗原的耐受性并且可消除自体免疫疾病。Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在正常生理条件下维持外周耐受性方面是关键性的。
如本文所用，“跨膜结构域”泛指长度是约15个氨基酸残基的跨越质膜的氨基酸序列。更优选地，跨膜结构域包括约至少20个、25个、30个、35个、40个或45个氨基酸残基，并且跨越质膜。跨膜结构域富含疏水性残基，并且通常具有a螺旋结构。在一个实施方案中，跨膜结构域的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的氨基酸具有疏水性，例如亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。跨膜结构域例如描述于Zagotta等(1996)Annu.Rev.Neurosci.19:235-263中。
如本文所用，“转基因动物”泛指非人动物，优选地为哺乳动物，更优选地地为小鼠，其中动物细胞的一个或多个包括“转基因”。术语“转基因”是指以下外源性DNA：其被整合至转基因动物从其发育的细胞的基因组中，以及保留在成熟动物的基因组中，例如指导所述转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中编码基因产物的表达的外源性DNA。
如本文所用，“无应答性”泛指免疫细胞对刺激，例如以及经由活化受体或细胞因子达成的刺激的抵抗性。无应答性可例如由于暴露于免疫抑制剂或高剂量的抗原而发生。
如本文所用，“可变区”或“VR”泛指抗体中各对轻链和重链内直接涉及所述抗体结合抗原的结构域。各重链在一端具有可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域。各轻链具有在一端的可变结构域(VL)和在其另一端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。
如本文所用，“载体”泛指能够转运其已与之连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可向其中连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中可将另外的DNA片段连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时整合至宿主细胞的基因组，并因而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其所有效连接的基因的表达。载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这些发挥等效功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。所述技术和程序通常根据本领域熟知的常规方法并且如本说明书通篇所引用和讨论的多个一般且较特定的的参考文献中所述来进行。参见例如Sambrook等(2001)Molec.Cloning:Lab.Manual[第3版]Cold SpringHarbor Laboratory Press。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成，以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。可根据制造商说明书，或如本领域中通常所实现，或如本文所述来进行酶促反应和纯化技术。
已定义了本申请中所用的某些术语和短语，下面进一步描述本发明所包括的抗VISTA多肽和抗原结合抗体片段及其产生和使用方法。
本发明涉及包含结合至T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)的抗原结合区的抗体和抗体片段。VISTA是负面抑制免疫应答的检查点调节物。参见Wang等(2011)"VISTA,anovel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cellresponses,"J.Exp.Med.,208(3)577-92。该蛋白质在正常人嗜中性粒细胞、单核细胞和T细胞亚群上表达。此外，食蟹猴细胞以与正常人细胞相似的模式表达VISTA。VISTA也在(例如癌症)患者的外周血细胞中表达。
根据本发明的拮抗性抗VISTA抗体或抗体片段与VISTA的结合将会拮抗VISTA对免疫的至少一种作用，从而抑制VISTA对免疫的抑制作用，例如T细胞免疫和/或细胞因子表达。相反，根据本发明的激动性抗VISTA抗体或抗体片段与VISTA的结合将会激发、引发或模拟VISTA对免疫的至少一种作用，从而促进VISTA对免疫的至少一种抑制作用，例如，抑制T细胞免疫或抑制特定促炎细胞因子的表达或其对某些化学引诱物和趋化因子的表达的促进作用。
此类抗体片段包括例如Fab、F(ab’)2和scFv抗体片段。这些抗体或抗体片段可包含抗体恒定区或其片段或变体。此类抗体和抗体片段包括与在造血细胞和其他细胞，例如髓样细胞和/或淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肿瘤细胞上和/或肿瘤微环境(TME)中表达的VISTA蛋白结合的那些。肿瘤微环境是肿瘤的细胞环境。它可以包括周围的免疫细胞、成纤维细胞、血管、其他细胞、信号分子和细胞外基质。
阻断或抑制VISTA作用的抗体可用于增强人免疫应答，特别是对恶性肿瘤和感染的免疫应答。相比之下，激发VISTA的分子诸如可溶性VISTA，例如VISTA-Ig和主题激动性抗人VISTA抗体及片段，可用于抑制不希望的人免疫应答诸如自体免疫应答、变应性应答、GVHD、败血症或不良炎症免疫应答。
本申请提供了新型的拮抗性和激动性抗人VISTA抗体，包括包含与具图4所示序列的抗人VISTA抗体任一者相同的CDR的抗体。虽然在本发明之前许多拮抗性抗人VISTA抗体已在文献中有所报道，但是激动性抗人VISTA抗体或抗体片段尚未被报道。
如在随后的实验实施例中所公开的，最初产生了两种嵌合型抗人VISTA抗体，其源自鼠抗人VISTA抗体(具有图4中的序列的1E8)，它们分别含有未经修饰的IgG2人恒定区或者其中κ链第127位的半胱氨酸残基变为丝氨酸残基的IgG2恒定区。如实施例及其中所引用的附图所示，发现两种抗体可激发或模拟VISTA对免疫的抑制作用，至少基于(i)它们降低某些促炎细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达以及减少某些趋化因子或化学引诱物诸如KC(角质化细胞衍生的趋化因子)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白-2)的表达的能力；(ii)在GVHD模型中抑制T细胞活性；以及(iii)抑制CD3驱动的T细胞应答。
此外，在分离这两种激动性抗体后，使用类似方法获得另外10种含有人IgG2恒定区或Fc区的嵌合型激动性抗人VISTA抗体。这些抗体衍生自在本文中称为GG8、VSTB95(INX903)、VSTB103(INX904)、VSTB53(INX905)、VSTB92(INX908)、VSTB50(INX900)、VSTB56(INX901)、VSTB63(INX902)、VSTB54(INX906)和VSTB66(INX907)(具有图4中的序列)的抗体。
特别地，这些嵌合型抗人VISTA抗体具有图4所示的可变序列和人IgG2恒定区。如下文汇总表1和2中所报告的，当通过使用抗体表位鉴定(antibody binning)进行评估时，发现这些抗人VISTA抗体结合至指定为第1组和第2组的2个不同表位组。如图4所示，对应于第2组的表位包括存在于人VISTA中的两种不同肽(即NLTLLDSGL和VQTGKDAPSNC)中的残基。
如下表1和表2所示，发现这12种不同的抗人VISTA抗体在至少一种免疫抑制模型中具有免疫抑制作用，并且许多在数种免疫抑制模型中具有免疫抑制作用。特别是INX905、INX908、INX901、INX902和INX906在两种不同的测定形式中显示出免疫抑制。虽然所有这些抗体都具有免疫抑制作用，并且似乎可引发、促进或激发VISTA的免疫抑制作用，但INX901、INX902和INX906以及INX908似乎是最具免疫抑制性。
此外，将针对它们的免疫抑制特性以及它们激发或模拟人VISTA的免疫抑制作用及其他作用的能力筛选包含人IgG2恒定域的其他嵌合型抗人VISTA抗体，该恒定域含有图4所示的其他抗VISTA抗体的可变序列。基于迄今为止获得的结果，该筛选应鉴定其他激动性抗人VISTA抗体，特别是结合相同表位的抗体。另外，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体已显示在许多自体免疫和炎性动物疾病模型，包括关节炎、狼疮或SLE、GVHD、炎性肠病(IBD)或结肠炎、慢性和急性感染性疾病或肝毒性和牛皮癣动物模型中是有效的(免疫抑制)。基于此，本主题抗人VISTA激动性抗体应该非常适合用于治疗和预防自体免疫病症、变应性病症和炎性病症。
如上所述，具有图4所示序列的嵌合型IgG2抗人VISTA抗体显示在不同免疫抑制模型中具有免疫抑制性。此外，这些抗体以特异性的免疫调节方式引发这些免疫抑制作用，而不是通过实现特定类型T细胞的耗竭或通过耗竭一般的T细胞。
如实施例中进一步显示的，在铰链区含有突变的嵌合型IgG2激动性抗人VISTA抗体引发了基本上相同的免疫抑制作用，即IgG2恒定区内的突变在测试实验条件下似乎没有引起抑制的增强。相反，IgG2A形式和IgG2B形式二者以及它们混合物都引发相同的免疫抑制作用。另外，基于实施例中公开的实验，似乎FcγR结合可能有助于主题抗人VISTA抗体的激动剂特性。特别地，据发现包含沉默IgG2恒定区消除了所测激动性抗体的免疫抑制性质。基于这些结果，假设一种或多种FcγR可能会影响这些抗体的激动性质，并且特别是假设FcγRIIA(CD32或CD32A)或FcγRIIB(CD32B)结合可能涉及主题激动性抗体的激动剂性质。
使用这些相同的方法，预期可以获得其他激动性抗人VISTA IgG2抗体，例如，源自具有图4所示序列的抗人VISTA抗体的其他抗体。如上所述，迄今已获得12种激动性抗人VISTA抗体，包括具有图4中所含序列的抗体。基于这些结果，预计可以产生其他激动性抗人VISTA抗体并显示其具有免疫抑制性。还预期可以产生这样的其他激动性抗人VISTA抗体：该抗体与含有图4所示序列的任何抗体结合相同或重叠的表位和/或与之竞争。在示例性实施方案中，这些抗体将结合对应于第1组或第2组抗体的表位，或将与这些抗体竞争结合至人VISTA。
鉴别与抗体结合的特定表位的方法是本领域已知的。在工作实施例中，申请人公开了对许多根据本发明的抗VISTA抗体所结合的表位的阐明。因此，在示例性实施方案中，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体将包含A型、B型或前述类型的混合物的IgG2恒定区或其片段。在示例性实施方案中，这些抗体将结合一种或多种FcγR，例如它们将与完整的或野生型的人IgG2 Fc区结合相同的FcγR。在其他示例性实施方案中，该抗体将结合CD32(CD32A和/或CD32B)。这可以通过使用可结合CD32(CD32A和/或CD32B)的野生型的或经修饰的IgG2恒定区来实现。此外，可以修饰该激动性抗体以掺入另一多肽，诸如结合FcγR如CD32A和/或CD32B的另一Fc多肽或抗原结合区。
本发明的激动性抗人VISTA抗体中所含的IgG2 Fc或恒定区任选可以被修饰，例如，以便改变效应功能，例如改变FcR结合、FcRN结合、补体结合、糖基化等等。特别地，本发明的激动性抗人VISTA抗体中所含的IgG2 Fc或恒定区任选可以通过27位半胱氨酸的转换或者进一步任选通过例如铰链区中的另一半胱氨酸残基或其他残基转换成另一氨基酸如丝氨酸来修饰。下文公开了其他潜在的Fc修饰。
这些VISTA激动性抗体可用于治疗或预防疾病病症或用于治疗或减轻、缓解与其相关的病理学作用，例如炎症，用于治疗或预防其中抑制T细胞免疫或促炎细胞因子的表达和或趋化因子和化学引诱物的表达增加在治疗上或预防上是有益的的病症。这些病症特别包括自体免疫、变态反应、炎性疾病、败血症、GVHD和用于抑制针对移植细胞、组织或器官诸如CAR-T细胞或基因疗法构建体或含有细胞的不需要的T细胞免疫应答。
如上所述，可以使用根据本发明的激动性抗人VISTA抗体治疗性或预防性治疗的示例性病症包括自体免疫病症、变态反应病症、炎性病症、GVHD、移植和败血症。如上所述，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体已显示出治疗有效性并且在许多动物疾病模型，包括关节炎、炎性肠病(IBD)、狼疮、GVHD、慢性急性感染/肝毒性和牛皮癣疾病模型中具有免疫抑制性。因此，本发明的抗体应该非常适合用于治疗其中在治疗上期望抑制免疫、尤其是T细胞免疫的病症。
A.激动性或拮抗性抗人VISTA抗体及片段在治疗和诊断中的用途
含有根据本发明的激动剂的组合物可用于抑制T细胞免疫以及用于治疗其中在治疗上期望抑制T细胞免疫的病症，诸如自体免疫病症、变态反应病症或炎性病症。这些组合物将包含一定量的本发明的激动性抗体或抗体片段，其在有需要的受试者中有效抑制T细胞活化或增殖或细胞因子表达或VISTA的其他作用。此类自体免疫病症、炎性病症和变应性病症包括例如关节炎病症，诸如RA、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、硬皮病、多发性硬化、狼疮、IBD、ITP、糖尿病、GVHD、肉样瘤病、变应性哮喘、肝炎相关的肝毒性，以及用于抑制不需要的针对移植细胞、组织或器官的T细胞免疫应答诸如CAR-T细胞或基因疗法，构建体或含有的细胞等。
其中可单独使用本发明抗体或与其他治疗剂、尤其是其他免疫抑制剂分子联合使用本发明抗体的具体病症包括：获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、获得性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风性关节炎、急性坏死性出血性脑白质炎、急性或慢性窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其他中枢神经系统炎性疾病)、急性严重炎症、阿狄森氏病(Addison’s disease)、肾上腺炎、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、成人发作型特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)、无γ球蛋白血症、粒性白细胞缺乏症、血管病(包括血管炎，任选大血管血管炎，任选风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu’s))关节炎)、变应性病症、变应性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性肉芽肿性血管炎、变应性超敏感性障碍、变应性神经炎、变应性反应、弥漫性脱发、全部脱发、阿尔波特氏综合征(Alport’s syndrome)、肺泡炎(任选变应性肺泡炎或纤维性肺泡炎)、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌萎缩性侧索硬化(ALS；路格里克氏病(Lou Gehrig’s disease))、嗜酸性粒细胞相关障碍(任选嗜酸性粒细胞增多)、过敏症、僵直性脊椎炎、血管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、口疮性口炎、再生障碍性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性病症、关节炎(任选类风湿性关节炎诸如急性关节炎或慢性类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎)、蛔虫病、曲霉肿、含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲霉病、无精子发生、哮喘(任选支气管哮喘(asthma bronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)或自体免疫哮喘)、共济失调性毛细血管扩张症、运动失调性硬化、动脉粥样硬化、自闭症、自体免疫性血管性水肿、自体免疫再生障碍性贫血、自体免疫性萎缩性胃炎、自体免疫性糖尿病、睾丸和卵巢的自体免疫性疾病(包括自体免疫睾丸炎和卵巢炎)、与胶原性疾病相关的自体免疫障碍、自体免疫性自主神经异常、自体免疫性耳病(任选自体免疫性内耳病(AGED))、自体免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎诸如自体免疫性甲状腺炎)、自体免疫性肠病综合征、自体免疫性腺衰竭、自体免疫性听觉损失、自体免疫性溶血、自体免疫性肝炎、自体免疫性血液学障碍、自体免疫性高脂质血症、自体免疫性免疫缺陷、自体免疫性内耳病性(AIED)、自体免疫心肌炎、自体免疫嗜中性白细胞减少症、自体免疫胰腺炎、自体免疫多内分泌病变、I型自体免疫多腺性综合征、自体免疫视网膜病变、自体免疫血小板减少性紫癜(ATP)、自体免疫甲状腺疾病、自体免疫性荨麻疹、自体免疫介导的胃肠疾病、轴突和神经元神经病变、巴洛病(Balo disease)、贝塞特氏病( disease)、良性家族性和缺血再灌注损伤、良性淋巴细胞性血管炎、伯杰氏病(Berger’s disease)(IgA肾病变)、养鸟人肺(bird-fancier’s lung)、失明、伯克氏病(Boeck’s disease)、闭塞性细支气管炎(非移植)相对于NSIP、支气管炎、支气管肺炎曲霉病、布鲁顿氏综合征(Bruton’s syndrome)、大疱性类天疱疮、卡普兰氏综合征(Caplan’s syndrome)、心肌病变、心血管性缺血、卡斯尔曼氏综合征(Castleman’ssyndrome)、乳糜泻、乳糜泻口炎性腹泻(麸质肠病)、小脑变性、脑缺血和伴随血管化的疾病、查加斯病(Chagas 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disease)、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、血色素沉着病、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(包括自体免疫溶血性贫血(AIHA)、溶血性贫血)、甲型血友病、亨诺克-舍恩来因紫癜(Henoch-purpura)、妊娠疱疹、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低γ球蛋白血症、性腺低能症、甲状旁腺机能减退、特发性尿崩症、特发性面神经麻痹、特发性甲状腺功能不足、特发性IgA肾病变、特发性膜性GN或特发性膜性肾病变、特发性肾脏综合征、特发性肺纤维化、特发性口炎性腹泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病变、IgE介导的疾病(任选过敏和变应性或特应性鼻炎)、IgG4相关的硬化性病、区域性回肠炎(ileitis regionalis)、免疫复合物性肾炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应、免疫介导的GN、免疫调节性脂蛋白相关的免疫应答(包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS))、包涵体肌炎、感染性关节炎、归因于抗精子抗体的不育症、全部或部分葡萄膜的炎症、炎性肠病(IBD)、炎性过度增生性皮肤疾病、炎性肌病变、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、间质性肺纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注障碍、关节炎症、青少年关节炎、青少年皮肤肌炎、青少年糖尿病、青少年发作型(I型)糖尿病(包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))、青少年发作型类风湿性关节炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、干燥性角膜结膜炎、锥虫病(kypanosomiasis)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、利什曼病(leishmaniasis)、麻风病、白细胞减少、白细胞粘附缺乏症、白细胞破裂性血管炎、白血球减少症、扁平苔癣(lichenplanus)、硬化性苔癣、木质性结膜炎、线性IgA皮肤病、线性IgA疾病(LAD)、吕弗勒氏综合征(Loffler’s syndrome)、狼疮样肝炎、狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、莱姆病、淋巴性间质性肺炎、疟疾、男性和女性自体免疫性不育症、上颌血管血管炎、中等血管血管炎(包括川崎氏病和多发性结节性动脉炎)、膜或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型以及快速进行性GN、膜性GN(膜性肾病变))、美尼尔氏病(Meniere’s disease)、脑膜炎、显微性结肠炎、显微性多血管炎、偏头痛、最小变化肾病变、混合结缔组织疾病(MCTD)、感染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)、莫伦氏溃疡(Mooren’s ulcer)、慕夏-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病变、多内分泌腺衰竭、多器官损伤综合征诸如继发于败血病、创伤或出血的那些)、多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)诸如脊髓-视觉MS、多发性硬化症、腮腺炎、肌肉病症、重症肌无力诸如胸腺瘤相关的重症肌无力、重症肌无力、心肌炎、肌炎、嗜睡病、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎以及自体免疫炎性肠病、坏死性血管炎、皮肤血管炎或超敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾变病、肾病综合征、神经疾病、视神经脊髓炎(德维克氏病(Devic's))、视神经脊髓炎、神经性肌强直、嗜中性白细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼和眼眶炎性病症、眼瘢痕性类天疱疮、卵巢炎、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、斜视眼阵挛或斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全部血球減少症、PANDAS(与链球菌相关的儿科自体免疫性神经精神性障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征(包括神经副肿瘤综合征，任选兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征)、寄生虫性疾病诸如利什曼原虫病、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕里龙伯格综合征(Parry Romberg syndrome)、扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)、帕森尼奇-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、细小病毒感染、类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常天疱疮)、红斑性天疱疮、落叶状天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、外周神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(pernicious anemia)(恶性贫血(anemia perniciosa))、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺变硬、POEMS综合征、I、II和III型多发性结节性动脉炎、慢性原发性多发性关节炎、多软骨炎(如难治性或复发的多软骨炎)、多内分泌腺自体免疫性疾病、多内分泌腺衰竭、多腺性综合征(任选自体免疫多腺性综合征(或多腺性内分泌病变综合征))、风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多发性神经病变、急性多神经根炎(polyradiculitis acuta)、心切开术后综合征、后葡萄膜炎或自体免疫性葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌感染后肾炎、疫苗接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性硬化、原发性甲状腺功能不足、原发性特发性粘液性水肿、原发性淋巴细胞增多(其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多)、任选良性单克隆γ球蛋白病和意义未确定的单克隆γ球蛋白病MGUS、原发性粘液性水肿、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、进行性全身性硬化、增生性关节炎、牛皮癣诸如斑块牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣性关节炎)、肺泡蛋白沉着病、肺浸润嗜酸粒细胞增多、纯红细胞贫血或再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、脓性或非脓性窦炎、脓疱性牛皮癣和甲牛皮癣、肾盂炎、坏疽性脓皮病、奎尔万氏甲状腺炎(Quervain’s thyroiditis)、雷诺氏现象、反应性关节炎、反复流产、血压应答降低、反射交感性营养不良、难治性口炎性腹泻、莱特尔氏病(Reiter’sdisease)或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其他组织的再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、多动腿综合征、视网膜自体免疫、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征(Reynaud’ssyndrome)、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、风疹病毒感染、桑普特氏综合征(Sampter’s 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相反，含有根据本发明的VISTA拮抗性抗体的组合物可用于促进T细胞免疫以及用于治疗其中在治疗上期望促进T细胞免疫的病症，诸如癌症和感染性病症如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物和寄生虫感染。这些组合物将包含一定量的本发明拮抗剂，其在有需要的受试者中有效促进T细胞活化或增殖或细胞因子表达或VISTA的其他作用。此类癌症病症包括例如血癌和实体瘤，诸如白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、肺癌和本文确定的其他癌症。
应当了解，本文鉴定的疾病病症旨在是示例性的而非穷举性的。
主题激动剂和拮抗剂可以与其他治疗剂组合，所述其他治疗剂可以在相同或不同的时间在相同或不同的组合物中施用。例如，主题激动剂可以以治疗方案施用，所述治疗方案包括施用PD-1或PD-L1激动剂、CTLA4-Ig、细胞因子、细胞因子激动剂或拮抗剂、或另一种受体激动剂或拮抗剂。
免疫应答的下调
上调或增强VISTA多肽的抑制功能可用于下调免疫应答。下调可以是抑制或阻断已经在进行中的免疫应答的形式，或者可以涉及阻止免疫应答的诱导。活化的免疫细胞的功能可以通过下调免疫细胞应答或通过在免疫细胞中诱导特异性无反应性或这两种方式来抑制。例如，VISTA激动性抗体可以与在各种免疫细胞上表达的VISTA多肽结合，从而下调免疫应答。该激动性抗体可以是单特异性的或多特异性的，例如，其可以包含双特异性抗体诸如BiTE。例如，这种抗体可以包含VISTA抗原结合部分和另一种抗原结合部分，例如，其靶向免疫细胞(如T细胞、B细胞或髓样细胞)上的细胞表面受体。除了包含VISTA抗原结合位点之外，这种抗体可还包含结合至B细胞抗原受体、T细胞抗原受体、或者Fc或其他受体的结合位点，以便使该分子靶向特定的细胞群。选择用于双特异性抗体的该第二抗原可提供选择待靶向的细胞群的灵活性。促进或模拟VISTA活性的VISTA激动性抗体可以增强VISTA与其天然结合配偶体的相互作用。如本文所公开的，其他人VISTA活化性或激动性抗体可通过其抑制T细胞活性或增殖的能力和/或基于其体外或炎性疾病、变应性疾病或自体免疫疾病模型的免疫抑制作用来鉴定。
许多本领域公认的细胞活化读数可用于在存在活化剂的情况下测量例如细胞增殖或效应功能(例如抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。测试抗体激发或促进人VISTA的作用从而阻断这种活化的能力可容易地通过测量该作用剂影响被测量的增殖或效应功能的降低来测定。因此，测试抗体具有免疫抑制性的能力以及阻断免疫活化的能力可以通过测量不同抗原浓度下的细胞因子产生和/或增殖来测定。
通过将抗原与根据本发明的VISTA激动性抗体共同施用，可以诱导针对特定抗原的耐受性。例如，可以诱导对特定多肽的耐受性，可以抑制对变应原或不期望对其产生免疫应答的外来多肽的免疫应答。例如，接受因子VIII的患者经常产生针对该凝血因子的抗体。将可刺激或模拟VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的根据本发明的VISTA激动性抗体与重组因子VIII共同施用可以抑制这种非期望的免疫应答。
可将根据本发明的VISTA激动性抗体与另一种作用剂组合使用以下调免疫应答，所述作用剂可阻断免疫细胞上的共刺激受体的活性或者可激发免疫细胞上表达的另一种免疫抑制受体或配体的活性。示例性的分子包括：PD-1、PDL-1激动剂、CTLA-4的可溶形式、抗B7-1抗体、抗B7-2抗体、靶向LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7H3等中的一者或多者的拮抗性抗体和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或它们的组合。这些部分可以组合在单一组合物或化合物中，例如，含有根据本发明的VISTA激动性抗体并且还包含另一种免疫激动性抗体的双特异性抗体，或者其可以包含融合多肽，该融合多肽含有与另一种免疫抑制性多肽或其他活性剂融合的根据本发明的VISTA激动性抗体。作为另一种选择，可将这些部分作为相同或不同的组合物中的单独的或离散的实体(同时或相继)施用，以下调受试者中的免疫细胞介导的免疫应答。
可以与根据本发明的VISTA激动性抗体组合的特异性免疫抑制分子的实例包括阻断共刺激信号(例如，针对CD28或ICOS)的抗体、经由CTLA4活化抑制性信号的抗体、和/或针对其他免疫细胞标志物(例如，针对CD40、CD40配体或细胞因子)的抗体、融合蛋白(例如CTLA4-Fc或PD-1-Fc)和免疫抑制性药物(例如雷帕霉素、环孢菌素A或FK506)。
在另一个实施方案中，含有根据本发明的VISTA激动性抗体的双特异性抗体可用于靶向特定细胞群体，例如，利用仅见于某种类型细胞，例如B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞或朗格汉斯细胞上的标志物。通过激活VISTA活性或VISTA-免疫细胞相互作用来下调免疫应答(从而刺激VISTA的负信号传导功能)可用于下调免疫应答，例如，在组织、皮肤和器官移植的情况下，在移植物抗宿主疾病(GVHD)、或变态反应、或自体免疫和炎性疾病诸如全身性红斑狼疮、IBD、RA、牛皮癣和多发性硬化症中。例如，免疫细胞功能的阻断导致组织移植中组织破坏减少。通常，在组织移植中，移植物的排斥是通过由免疫细胞识别为外来物、然后是破坏移植物的免疫反应而起始。在移植之前或移植时单独或与另一种下调剂一起施用促进VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的分子可抑制共刺激信号的产生。此外，促进VISTA活性也可足以激动免疫细胞，从而在受试者中诱导耐受性。
为了在某些疾病或在某些受试者中获得足够的免疫抑制或耐受性，可能需要阻断其他分子的共刺激功能。例如，通过在移植之前或移植时施用可溶形式的以下组合来阻断B7-1和B7-2的功能可为可取的：具有这些抗原每一者的活性的肽或阻断针对这些抗原的抗体(单独地或一起在单种组合物中)。或者，促进VISTA的抑制活性以及进一步抑制B7-1和/或B7-2的共刺激活性可为可取的。
主题抗人VISTA激动性抗体尤其可用于治疗自体免疫疾病。许多自体免疫疾病是免疫细胞的不适当活化的结果，所述免疫细胞对自身组织具有反应性并且促进该疾病病理学所涉及的细胞因子和自身抗体的产生。防止自身反应性免疫细胞的活化可以减少或消除疾病症状。施用可促进VISTA或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的主题抗人VISTA激动性抗体可以诱导自身反应性免疫细胞的抗原特异性耐受，这可以长期缓解疾病。另外，共同施用通过破坏B7分子与共刺激受体的受体-配体相互作用来阻断免疫细胞的共刺激的药剂可用于抑制免疫细胞活化以防止产生可能涉及疾病过程的自身抗体或细胞因子。
通过使用主题抗人VISTA激动性抗体激发VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用来下调免疫应答也可用于治疗自体组织的自体免疫攻击。因此，通过增加VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的结合，可以减轻或改善由自体免疫攻击引起或加剧的病症(例如，心脏病、心肌梗死或动脉粥样硬化)。因此，通过使用主题抗人VISTA激动性抗体激发VISTA活性或VISTA与其反受体的相互作用来调节由自体免疫攻击加剧的病症，诸如自体免疫障碍(以及诸如心脏病、心肌梗死和动脉粥样硬化之类的病症)在本发明的范围内。
如前所述，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体用于预防或缓解自体免疫和炎性疾病的功效可使用许多经充分表征的人自体免疫疾病和炎性疾病的动物模型来确定。实例包括鼠实验性自体免疫性脑炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB杂交小鼠中的全身性红斑狼疮、鼠自体免疫胶原关节炎、NOD小鼠和BB大鼠中的糖尿病，以及鼠实验性重症肌无力。参见Paul(编辑)Fundamental Immunology,Raven Press，纽约，1989年，第840-856页。
免疫细胞活化的抑制进一步在治疗上可用于治疗变态反应和变应性反应，例如通过抑制IgE产生。可以将促进或模拟VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体相互作用的主题抗人VISTA激动性抗体施用给变应性受试者以抑制受试者中免疫细胞介导的变应性应答。VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的刺激可伴随着与适当的MHC分子一起暴露于变应原。变应性反应在本质上可以是全身性或局部性的，这取决于变应原的进入途径以及IgE在肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的沉积模式。因此，通过施用主题抗人VISTA激动性抗体，可以局部或全身抑制免疫细胞介导的变应性应答。
结合相同表位的抗VISTA抗体的选择
在某些实施方案中，根据本发明的激动性抗VISTA抗体具有所需的功能性质，诸如调节免疫刺激及相关的功能。如图4所示并在工作实施例中公开的，已经阐明了许多根据本发明的抗人VISTA激动性抗体的表位特异性。由于已经发现许多已显示可与相同表位结合的抗体具有免疫抑制性，因此预期可鉴定出与相同或重叠表位结合的其他VISTA激动性抗体，即它们将与示例性VISTA激动性抗体所结合的人VISTA多肽的一个或多个氨基酸残基相互作用。可以选择具有相同表位特异性的其他抗体和/或具有与所需抗体交叉竞争结合VISTA抗原的能力的抗体。例如，可以使用构成整个VISTA多肽的重叠肽(例如15个氨基酸)的文库或构成含有VISTA的所需表位的部分的重叠肽文库来确定所需抗体的表位特异性，并且确定结合所述文库中相同肽或其一个或多个残基的抗体结合相同线性表位或构象表位。在实施例中，使用方法确定表位特异性，所述方法可用于鉴定线性表位和构象表位。
根据本发明的激动性抗体的修饰
除在框架区或CDR区内进行的修饰之外或替代所述修饰，可对根据本发明至少一些实施方案的抗体进行工程改造以在Fc区内包括修饰，通常用以改变抗体的一种或多种功能性质，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞细胞毒性。此外，可对根据本发明至少一些实施方案的抗体进行化学修饰(例如可使一个或多个化学部分附接至抗体)或修饰以改变其糖基化，同样用以改变抗体的一种或多种功能性质。下文进一步描述这类实施方案。Fc区中残基的编号方式是Kabat的EU索引的编号方式。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区以使得铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或减少。这个方法进一步描述于Bodmer等的美国专利No.5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如助于轻链和重链的装配或用以提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地讲，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中以使得相对于天然的Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SpA)结合，抗体具有受损的SpA结合。这个方法进一步详细描述于Ward等的美国专利No.6,165,745中。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S和T256F，如颁给Ward的美国专利No.6,277,375中所述。作为另一种选择，为增加生物半衰期，可在CHI区或CL区内改变抗体以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环区的补救受体结合表位，如Presta等的美国专利No.5,869,046和No.6,121,022中所述。
在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应功能。例如，可用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸以使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其的亲和力被改变的效应子配体可为例如Fc受体或补体的Cl组分。这个方法进一步详细描述于两者均由Winter等所完成的美国专利No.5,624,821和No.5,648,260中。
在另一个实例中，可用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这个方法进一步详细描述于Idusogie等的美国专利No.6,194,551中。
在另一个实例中，改变在氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基以由此改变抗体固定补体的能力。这个方法进一步描述于Bodmer等的PCT公布WO 94/29351中。
在另一个实例中，通过修饰在以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体对Fγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这个方法进一步描述于Presta的PCT公布WO 00/42072中。此外，已对人IgGl上对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点进行作图，并且已描述了具有改善结合的变体(参见Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变会改善与FcγRIII的结合。另外，显示以下组合突变体可改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，诸如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S之类的突变可改善与FcRn的结合，并且可增加抗体循环半衰期(参见Chan CA和Carter PJ(2010)Nature Rev Immunol10:301-316)。
在另一个实施方案中，可修饰抗体以消除体内Fab臂交换。具体来说，该方法涉及在其他IgG4抗体之间交换IgG4半分子(一个重链加一个轻链)，所述交换有效产生在功能上是单价的双特异性抗体。对重链的铰链区和恒定结构域的突变可消除这种交换(参见Aalberse,RC,Schuurman J.(2002)Immunology 105:9-19)。
在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可制备无糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。所述碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个可导致一个或多个可变区框架糖基化位点消除的氨基酸置换以由此消除在该位点处的糖基化。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。这种方法进一步详细描述于Co等的美国专利No.5,714,350和6,350,861中。
另外地或作为另外一种选择，可制备具有改变类型的糖基化的抗体，诸如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。已证明这种改变的糖基化样式会增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞已在本领域中描述并且可用作宿主细胞，在该宿主中表达根据本发明至少一些实施方案的重组抗体以由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α-(1,6)岩藻糖基转移酶)，以致在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏岩藻糖。通过使用两种置换载体在CH0/DG44细胞中靶向破坏FUT8基因来产生Ms704、Ms705和Ms709 FUT8细胞系(参见由Yamane等的美国专利公布No.20040110704以及Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。又如，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有在功能上被破坏的FUT8基因(编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，以致由于降低或消除了该α-1,6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Hanai等还描述了用于向结合抗体的Fc区的N-乙酰基葡萄糖胺添加岩藻糖的酶活性较低，或不具有该酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公布WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的使岩藻糖附接于Asn(297)连接的碳水化合物的能力，从而也导致在该宿主细胞中表达的抗体具有低岩藻糖基化(还可参见Shields,R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公布WO 99/54342描述了经工程改造以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如P(l,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，以致在该工程细胞系中表达的抗体展现出增加的平分型GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还可参见Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。作为另外一种选择，可使用岩藻糖苷酶来裂解掉抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶可从抗体移除岩藻糖基残基(Tarentino,A.L.等(1975)Biochem.14:5516-23)。
本发明所设想的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化或添加其他水溶性部分，通常是聚合物，例如用以增强半衰期。可使抗体聚乙二醇化以例如，增加该抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)诸如PEG的反应性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得附接于所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(Ci-Cio)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并且可应用于根据本发明至少一些实施方案的抗体。参见例如Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
工程改造抗体的方法
在某些实施方案中，根据本发明的具有VH序列和VL序列的抗VISTA抗体可分别通过修饰VH序列和/或VL序列或与之连接的恒定区来用于产生新型抗VISTA抗体。因此，在根据本发明至少一些实施方案的另一方面，将根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体的结构特征用于产生保留根据本发明至少一些实施方案的抗体的至少一种功能性质(诸如与人VISTA结合)的结构相关的抗VISTA抗体。例如，可将一种VISTA抗体的一个或多个CDR区或其突变形式与已知框架区和/或其他CDR重组组合以产生另外的、根据本发明至少一些实施方案的重组工程改造的抗VISTA抗体，如上所论述的。其他类型的修饰包括先前章节中所述的那些。用于工程改造方法的起始物质是一条或多条本文所提供的VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为产生工程抗体，不必实际制备(即表达成蛋白质)具有一个或多个本文所提供的VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。而是，序列中所含的信息用作起始物质来产生源于原始序列的“第二代”序列，接着制备所述“第二代”序列并表达成蛋白质。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。优选地，由改变的抗体序列编码的抗VISTA抗体是通过各种方法以及用本文提供的序列来产生的分别保留抗VISTA抗体的一种、一些或全部功能性质的抗体，所述功能性质包括：以特定KD水平或更小的KD水平与VISTA抗原结合和/或调节免疫应答和/或选择性结合至所需靶标细胞诸如像表达VISTA抗原的细胞。
可使用本领域中可用和/或本文所述的标准测定法来评估改变的抗体的功能性质。在工程改造根据本发明至少一些实施方案的抗体的方法的某些实施方案中，可随机或选择性沿抗VISTA抗体编码序列的全部或一部分引入突变，并且可针对结合活性和/或其他所需功能性质对所得经修饰的抗VISTA抗体进行筛选。
本领域中已描述了突变方法。例如，Short的PCT公布WO 02/092780描述了用于使用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合来产生和筛选抗体突变的方法。作为另一种选择，Lazar等的PCT公布WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
编码抗体的核酸分子
本发明还提供编码根据本发明的抗VISTA抗体或其片段或缀合物的核酸。核酸可存在于完整细胞中、细胞溶解产物中，或呈部分纯化或基本上纯化的形式。核酸在通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其他技术)纯化而离开其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质时，核酸被“分离”或“致使基本上纯化”。参见F.Ausubel等(编辑)(1987)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。根据本发明至少一些实施方案的核酸可为例如DNA或RNA，并且可含有或可不含有内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
可使用标准分子生物学技术来获得根据本发明至少一些实施方案的核酸。对于由杂交瘤(例如如下文进一步描述的，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得(例如，使用噬菌体展示技术)的抗体，可从文库回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH区段和VL区段的DNA片段，即可进一步通过标准重组DNA技术来操作这些DNA片段，例如以使可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，使编码VL或VH的DNA片段有效连接至编码另一蛋白质诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。如先前所定义的，“有效连接”意指使两个DNA片段接合以致由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
可通过使分离的编码VH区的DNA有效连接于编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子来使编码VH区的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可为IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl、IgG2或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可使编码VH的DNA有效连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过使编码VL的DNA有效连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来使分离的编码VL区的DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。
为产生scFv基因，使编码VH和VL的DNA片段有效连接至编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得VH序列和VL序列可表达成连续单链蛋白质，其中VL区和VH区通过所述柔性接头接合(参见例如Bird等的Science 242:423-426(1988)；Huston等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:5879-5883(1988)；McCafferty等的Nature 348:552-554)。
抗VISTA单克隆抗体的产生
可通过多种技术来产生根据本发明的抗VISTA单克隆抗体(mAb)和抗原结合片段，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein的Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选的，但在原则上可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一优选动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是一种极其完善建立的程序。用于分离供融合用的经免疫脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。可基于如上所述制备的鼠类单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合或人源化抗体。可从所关注的鼠类杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并且使用标准分子生物学技术工程改造成含有非鼠类(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可使用本领域中已知的方法来使鼠类可变区连接于人恒定区(参见例如颁给Cabilly等的美国专利No.4,816,567)。为产生人源化抗体，可使用本领域中已知的方法来将鼠类CDR区插入人框架中(参见例如颁给Winter的美国专利No.5,225,539以及颁给Queen等的美国专利No.5,530,101、No.5,585,089、No.5,693,762和No.6,180,370)。
根据本发明的至少一些实施方案，抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的各部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对VISTA的所述人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb MouseTM和KM MouseTM的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。HuMAb MouseTM(Medarex Inc.)含有编码未重排的人重链μ和γ以及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变的人免疫球蛋白基因小型基因座(参见例如Lonberg等(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，所述小鼠展现出小鼠IgM或κ的表达降低，以及应答于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg，N.等(1994)，出处同上；综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546中)。HuMab的制备和使用以及由所述小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等(1994)International Immunology 6:579-591；以及Fishwild,D.等(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中，特此将它们的全部内容以引用的方式整体明确并入本文。进一步参见：全都颁给Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806、No.5,569,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,789,650、No.5,877,397、No.5,661,016、No.5,814,318、No.5,874,299和No.5,770,429；颁给Surani等美国专利No.5,545,807；全部颁给Lonberg和Kay的PCT专利公布No.WO 92/03918、No.WO 93/12227、No.WO 94/25585、No.WO97/13852、No.WO 98/24884和No.WO 99/45962；以及颁给Korman等的PCT专利公布No.WO01/14424。
在另一实施方案中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生根据本发明至少一些实施方案的人抗体。在本文中称为“KM miceTM”的所述小鼠详述于颁给Ishida等的PCT公布WO 02/43478中。
更进一步，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统在本领域中是可用的，并且可用于产生根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统；这种小鼠例如描述于颁给Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598、No.6,075,181、No.6,114,598、No.6,150,584和No.6,162,963中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统在本领域中是可用的，并且可用于产生根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠；这种小鼠描述于Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad Sci.USA 97:722-727中。此外，已在本领域中描述了携带人重链和轻链转染色体的母牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，并且可用于产生根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体。
可使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法来制备根据本发明至少一些实施方案的人单克隆抗体。本领域中确立了用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法。参见例如：颁给Ladner等的美国专利No.5,223,409、No.5,403,484和No.5,571,698；颁给Dower等的美国专利No.5,427,908和No.5,580,717；颁给McCafferty等的美国专利No.5,969,108和No.6,172,197；以及颁给Griffiths等的美国专利No.5,885,793、No.6,521,404、No.6,544,731、No.6,555,313、No.6,582,915和No.6,593,081。
也可使用已将人免疫细胞重构至其中以使得在免疫后可产生人抗体应答的SCID小鼠来制备根据本发明至少一些实施方案的人单克隆抗体。这种小鼠例如描述于颁给Wilson等的美国专利No.5,476,996和No.5,698,767中。
人IG小鼠的免疫
在一些实施方案中，人Ig小鼠用于产生根据本发明的人抗VISTA抗体，例如通过用VISTA抗原和/或重组VISTA或VISTA融合蛋白的纯化或富集的制剂使这种小鼠免疫，如由Lonberg,N.等的Nature 368(6474):856-859(1994)；Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology 14:845-851；以及PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述。优选地，在首次输注时，小鼠将为6-16周龄。例如，VISTA抗原的纯化或重组的制剂(剂量范围为0.5-500μg)可用于经腹膜内使人Ig小鼠免疫。
—般来讲，当初始用含抗原的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant)腹膜内(IP)免疫，随后用含抗原的不完全弗氏佐剂每隔一周IP免疫(直至总计6次)时，转基因小鼠起应答。然而，除弗氏佐剂以外的佐剂也发现是有效的。此外，发现在不存在佐剂下的完整细胞具有高度免疫原性。在免疫方案的过程中，用通过眶后放血获得的血浆样品监测免疫应答。可通过ELISA来筛选血浆(如下所述)，可将具有足够抗VISTA人免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。可在处死以及移除脾之前3天用抗原对小鼠经静脉内加强免疫。预期对于各免疫可能需要进行2-3次融合。对于各抗原，通常使6只至24只之间的小鼠免疫。通常，使用HCo7品系与HCol2品系两者。此外，可将HCo7转基因与HCol2转基因二者一起育种，从而获得具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo 12)的单一小鼠。作为另外一种选择或除此之外，可使用KM MouseTM品系。在一个示例性实施方案中，将这些小鼠工程化以选择性地产生人IgG2抗体。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的产生
在某些实施方案中，可使用脾细胞来产生杂交瘤，所述杂交瘤产生根据本发明的人单克隆抗VISTA抗体，和/或可分离来自经免疫小鼠的淋巴结细胞，并且使其融合于适当永生化细胞系诸如小鼠骨髓瘤细胞系。可筛选产生抗原特异性抗体的所得杂交瘤。例如，可用50％ PEG，使来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞混悬液融合于六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1580)。将细胞以约2×105涂铺在平底微量滴定板中，随后在含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％三甲氧唑辛(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；在融合之后24小时添加HAT)的选择性培养基中温育两周。在大约两周之后，可在其中用HT替换HAT的培养基中培养细胞。可接着通过ELISA针对人单克隆IgM和IgG抗体来筛选独立的孔。一旦发生广泛杂交瘤生长，即可通常在10-14天之后观察培养基。可再涂铺分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且若仍然是人IgG阳性，那么可通过有限稀释来进行至少两次单克隆抗体亚克隆。可接着在组织培养基中在体外培养稳定的亚克隆以产生少量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱法。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换成PBS，并且可使用1.43消光系数，通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
在某些实施方案中，可使用例如如本领域中所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生根据本发明的抗VISTA抗体(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。例如，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达所关注抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)来获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可将该DNA插入表达载体中以使得基因有效连接至转录和翻译控制序列。在该语境中，术语“有效连接”意指将抗体基因连接至载体中以使得所述载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节所述抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列以可与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独载体中，或更通常地，将两个基因均插入同一表达载体中。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或若不存在限制位点，则为平末端连接)来将抗体基因插入表达载体中。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可用于通过以下方式来产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得VH区段有效连接至载体内的CH区段，并且VL区段有效连接至载体内的CL区段。另外地或作为另外一种选择，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中以使得信号肽同框连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源性信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
抗体与抗原结合的表征
在某些实施方案中，通过已知的抗体结合测定法技术诸如ELISA来测定根据本发明的激动性抗VISTA抗体的结合特异性。在示例性ELISA中，用纯化的抗原(在本文中是于PBS中的0.25μg/ml的VISTA)包被微量滴定板，接着用含5％牛血清白蛋白的PBS封闭。添加抗体的稀释液(例如来自经免疫小鼠的血浆的稀释液)至各孔中，并且在37℃下温育1-2小时。将板用PBS/吐温(Tween)洗涤，接着与缀合至碱性磷酸酶的二级试剂(例如对于人抗体是山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下温育1小时。在洗涤之后，用pNPP底物(1mg/ml)使板显色，并且以OD 405-650加以分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将用于融合。
如上所述的ELISA测定也可用于筛选显示出与VISTA免疫原的阳性反应性的杂交瘤。对以高亲合力结合VISTA的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。可选择来自各杂交瘤的一个保留亲本细胞的反应性(根据ELISA)的克隆用于制备5-10小瓶细胞储库储存在-140℃下，以及用于抗体纯化。
为纯化抗VISTA抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱法。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换成PBS，并且可使用1.43消光系数，通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
为确定所选抗VISTA单克隆抗体是否结合至独特表位，可使用可商购获得的试剂(Pierce,Rockford,Il.)使各抗体生物素化。可如上所述使用VISTA包被的ELISA板进行使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。可用链霉素-亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb结合。
为确定纯化抗体的同种型，可使用对特定同种型(如IgG2)的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为确定人单克隆抗体的同种型，可用^g/ml的抗人免疫球蛋白在4℃下将微量滴定板的各孔包被过夜。在用1％BSA封闭之后，使板与1mug/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。可接着使各孔与人IgGl或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。如上所述来使板显色并加以分析。
可通过蛋白质印迹(Western blotting)来进一步分别测试抗VISTA人IgG与VISTA抗原的反应性。简而言之，可制备VISTA抗原，并且使其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳之后，将分离的抗原转移至硝化纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，并且用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并且用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)显色。
在另一方面，本发明的特征在于抗体-药物缀合物(ADC)，其由连接至有效载荷药物(常具有细胞毒性)的抗体(或抗体片段诸如单链可变片段(scFv))组成。抗体导致ADC结合至靶标癌细胞。通常，ADC接着由细胞内化，药物被释放至细胞中。由于具有靶向性，所以副作用较低，并且产生较宽的治疗窗。亲水性接头(例如PEG4Mal)有助于防止药物通过MDR(多重药物抗性)转运体被泵出抗性癌细胞。
在另一方面，本发明的特征在于免疫缀合物，其包含缀合至治疗剂诸如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素的抗VISTA抗体或其片段。这种缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括泰素(Taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因(tetracaine)、利多卡因、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素以及它们的类似物或同源物。治疗剂也包括例如抗代谢剂(例如甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如二氯甲基二乙胺、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺式二氯二胺合铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素类(例如柔红霉素(先前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(先前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))、以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
可缀合至根据本发明至少一些实施方案的抗体的治疗性细胞毒素的其他实例包括倍癌霉素(duocarmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素和澳瑞他汀(auristatins)以及它们的衍生物。卡奇霉素抗体缀合物的一个实例可通过商购获得(MylotargTMWyeth)。
可使用本领域中可用的接头技术来使细胞毒素缀合至根据本发明至少一些实施方案的抗体。已用于使细胞毒素缀合至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫醚和含肽接头。可选择例如易经受由于溶酶体区室内的低pH达成的裂解或易经受蛋白酶裂解的接头，所述蛋白酶为诸如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶诸如组织蛋白酶(cathepsin)(例如组织蛋白酶B、C、D)。对于各种类型的细胞毒素、接头和用于使治疗剂缀合至抗体的方法的进一步论述，还可参见Saito,G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
也可使本发明的抗体缀合至放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射免疫缀合物。可缀合至抗体以进行诊断或治疗使用的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中确立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物可商购获得，包括(BiogenlDEC)和(Corixa Pharmaceuticals)，并且类似方法可用于使用根据本发明至少一些实施方案的抗体来制备放射免疫缀合物。
根据本发明至少一些实施方案的激动性抗人VISTA抗体和缀合物可用于修饰给定的生物应答，并且药物部分不应理解为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可为具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，诸如相思豆毒素(abrin)、篦麻毒素A(ricin A)、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物应答调节剂诸如像淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于使所述治疗性部分(moiety)缀合至抗体的技术是熟知的，参见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，载于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，载于ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，载于Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；”Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，载于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，以及Thorpe等，"The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
根据至少一些实施方案，本发明也涵盖多特异性抗VISTA激动性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在另一方面，本发明的特征在于双特异性分子，其包含根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体或其片段。根据本发明至少一些实施方案的抗体或其抗原结合部分可被衍生或连接至另一功能性分子例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或针对受体的配体)以产生结合至少两个不同结合位点或靶标分子的双特异性分子。根据本发明至少一些实施方案的抗体实际上可被衍生或连接至不止一个其他功能性分子以产生结合不止两个不同结合位点和/或靶标分子的多特异性分子；这类多特异性分子也旨在由本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为产生根据本发明至少一些实施方案的双特异性分子，可将抗体功能连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其他方式)至一个或多个其他结合分子，诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以使得产生双特异性分子。在某些实施方案中，双特异性抗体的其中一种结合特异性是针对VISTA,并且另一结合特异性是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合VISTA的两个不同表位。双特异性抗体也可用于使细胞毒性剂定位于表达VISTA的细胞。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段。
根据本发明至少一些实施方案的双特异性抗体是可同时结合至两个具有不同结构的靶标的抗体。根据本发明至少一些实施方案的双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个特异性结合至B细胞抗原或表位的臂和至少一个特异性结合可靶向缀合物的其他臂。
根据至少一些实施方案，本发明也涵盖一种融合抗体蛋白质，其是重组产生的抗原结合分子，其中连接了具有相同或不同特异性的两个或更多个不同单链抗体或抗体片段区段。可使用分子工程改造来产生多种双特异性融合抗体蛋白质。在一种形式中，双特异性融合抗体蛋白质是单价的，由例如具有针对一种抗原的单一结合位点的sent和具有针对第二抗原的单一结合位点的Fab片段组成。在另一形式中，双特异性融合抗体蛋白质是二价的，由例如具有两个针对一种抗原的结合位点的IgG和具有两个针对第二抗原的结合位点的两个scFv组成。
本发明还涵盖具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576A1)和“双重作用性FAb”或“DAF”抗体，其包含结合VISTA以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见例如US2008/0069820。因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一个针对VISTA的第一结合特异性和针对第二靶标表位的第二结合特异性。根据本发明的至少一些实施方案，第二靶标表位是Fc受体例如人FcγRI(CD64)或人FcαR受体(CD89)。因此，本发明包括能够分别结合至FcγR、FcαR或FcsR表达性效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达VISTA的靶标细胞两者的双特异性分子。这些双特异性分子使VISTA表达性细胞靶向效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，诸如吞噬VISTA表达性细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或产生超氧化物阴离子。
根据本发明的其中双特异性分子是多特异性的至少一些实施方案，除抗Fc结合特异性之外，分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如结合至细胞毒性活性中涉及的表面蛋白质并由此增加针对靶标细胞的免疫应答的分子。
“抗增强因子部分”可为结合至给定分子例如抗原或受体并由此导致结合决定簇对Fc受体或靶标细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶标细胞抗原。作为另一种选择，抗增强因子部分可结合至与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶标细胞的免疫应答增加的其他免疫细胞)。
根据本发明的至少一些实施方案，双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。抗体也可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段诸如Fv或单链构建体，如Ladner等的美国专利No.4,946,778中所述，所述专利的内容以引用的方式明确并入本文。
在一个实施方案中，针对Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，所述单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文所用，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的八个γ链基因中的任一者。这些基因编码总计12个跨膜或可溶性受体亚型，其被分组成3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是一72kDa的分子，其显示出对单体IgG的高亲和力。某些优选的抗Fcγ单克隆抗体的产生和表征由Fanger等在PCT公布WO 88/00052中以及在美国专利No.4,954,617中描述，所述专利的教导内容以引用的方式完全并入本文。这些抗体结合至FcγRI、FcγRII或FcγRIII的在与受体的Fey结合位点不同的位点处的表位，并且因此，它们的结合基本上不被生理水平的IgG阻断。已知的抗FcγRI抗体包括mAb 22、mAb32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得(ATCC登记号为HB9469)。在其他实施方案中，抗Fcγ受体抗体是人源化形式的单克隆抗体22(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol.155(10):4996-5002以及PCT公布WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系以标号HA022CLI寄存在美国典型培养物保藏中心，登记号为CRL 11177。
在其他优选实施方案中，针对Fc受体的结合特异性由结合至人IgA受体例如Fc-α受体(FcαRI(CD89))的抗体提供，所述抗体的结合优选不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的一个a-基因(FcαRI)的基因产物。已知这个基因编码55至10kDa的若干选择性剪接跨膜亚型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞上，而非在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1与IgA2两者均具有中等亲和力(大约5X10-7 M-1)，所述亲和力在暴露于细胞因子诸如G-CSF或GM-CSF后得以增加(Morton,H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。已描述四种标识为A3、A59、A62和A77的FcαRI特异性单克隆抗体，其在IgA配体结合结构域的外部结合FcaRI(Monteiro,R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。
尽管人单克隆抗体是优选的，但可用于根据本发明至少一些实施方案的双特异性分子中的其他抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。本发明的双特异性分子可通过使用本领域中已知的方法使组成结合特异性例如抗FcR和抗VISTA结合特异性缀合来制备。例如，可单独产生各双特异性分子的结合特异性，接着彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、S-乙酰基-硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SATA)、5,5’-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯撑二马来酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶基-二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等的J.Exp.Med.160:1686(1984)；Liu,M A等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648(1985))。其他方法包括Paulus的Behring Ins.Mitt.No.78,118-132(1985)；Brennan等的Science229:81-83(1985)，以及Glennie等的J.Immunol.139:2367-2375(1987))中所述的那些。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从伊利诺伊州罗克福德市的Pierce Chemical公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,Il.)获得。当结合部分是抗体时，它们可经由两条重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在一特别优选的实施方案中，在缀合之前，对铰链区进行修饰以含有奇数个巯基残基，优选一个。
作为另一种选择，两个结合特异性均可在同一载体中编码，以及在相同宿主细胞中表达和装配。若双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab’)2或配体XFab融合蛋白时，这个方法特别适用。根据本发明至少一些实施方案的双特异性分子可为包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如描述于美国专利No.5,260,203、美国专利No.5,455,030、美国专利No.4,881,175、美国专利No.5,132,405、美国专利No.5,091,513、美国专利No.5,476,786、美国专利No.5,013,653、美国专利No.5,258,498和国专利No.5,482,858中。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829，以及Traunecker等，EMBO J.10:3655(1991))和“突起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利No.5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备:工程改造静电牵引效应以制备抗体Fc异二聚分子(WO 2009/089004A1)；控制Fab臂交换(参见Labrijn等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13):5145-50(2013))；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980以及Brennan等，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
可通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法来确认双特异性分子与它们的特定靶标的结合。这些测定法各自通常通过采用对所关注的复合物具有特异性的经标记试剂(例如抗体)来检测特别关注的蛋白质-抗体复合物的存在性。例如，可使用例如识别并特异性结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。作为另一种选择，可使用多种其他免疫测定法中的任一种来检测复合物。例如，可放射性标记抗体，并且用于放射免疫测定法(RIA)中(参见例如Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society，1986年3月，将其以引用的方式并入本文)。可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器之类的手段或通过放射自显影来检测放射性同位素。
激动性抗体及含有其的药物组合物的用途
癌症免疫疗法
不同于旨在抑制对肿瘤生长和发育至关重要的分子路径，和/或耗竭肿瘤细胞的肿瘤靶向疗法，癌症免疫疗法目的在于刺激患者的自体免疫系统来消除癌细胞，从而提供长期肿瘤破坏。各种方法可用于癌症免疫疗法中，在它们之中的是用以诱导肿瘤特异性T细胞应答的治疗性癌症疫苗和用以移除免疫抑制性路径的免疫刺激性抗体(即抑制性受体＝免疫检查点的拮抗剂)。
在靶向疗法或常规抗癌疗法的情况下的临床响应往往是短暂的，因为癌细胞会产生抗性，并且发生肿瘤复发。然而，在过去数年中临床使用癌症免疫疗法已显示这种类型的疗法可具有持久临床反应，从而显示对长期存活的显著影响。然而，尽管反应是长期的，但仅少数患者起反应(与其中大量患者起反应、但反应是短暂的常规或靶向疗法相反)。
当在临床上检测到肿瘤时，其已通过各种机理和多种免疫细胞来获得免疫抗性和免疫抑制性质以及产生免疫抑制性肿瘤微环境而逃避免疫防御系统。因此，在癌症免疫疗法中，变得日益明确的是疗法的组合是达成临床功效所需的。
需要组合方法并预期其会增加受益于免疫疗法的患者的数目，并且扩大具有反应性的癌症的数目和类型，从而使检查点药剂的潜在癌症适应症充分扩大超出当前显示作为单药疗法的免疫检查点阻断剂的功效的初始适应症。免疫调节方法的组合旨在使结果最大化，并且克服大多数肿瘤对单一方法的抗性机理。因此，在传统上被认为非免疫原性的肿瘤可能变得具有免疫原性，并且通过共同施用被设计成增加患者的抗肿瘤免疫应答的促免疫原性疗法而对免疫疗法起反应。本文在以下详述潜在致敏剂。
联合疗法功效的显著增加的根本科学原理认为，作为单一疗法的免疫检查点阻断剂将仅在有预先存在的强烈抗肿瘤免疫应答时才诱导肿瘤消退，所述免疫应答将在路径被阻断时“松开”。根据本发明的至少一些实施方案，将VISTA特异性抗体、抗体片段、包含其的缀合物和组合物在联合疗法中以癌症免疫疗法治疗所有类型的癌症。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗与预防性或防治性措施两者，其在这个实例的情况下涉及治疗癌症的炎性副作用；然而，也如下所述的，还提供抗体和药物组合物用于治疗感染性疾病、败血症和/或自体免疫病症，和/或用于抑制在基因疗法之后不合需要的免疫活化的用途。需要治疗者包括已患有癌症者以及将预防癌症者。因此，本文中待治疗的哺乳动物可已被诊断为患有癌症，或可易感于癌症或易患癌症。如本文所用，术语“治疗”是指预防上述癌性疾病、障碍或病症，延迟其发作，治愈、逆转、减弱、缓和、最小化、抑制上述癌性疾病、障碍或病症，停止其有害影响，或使其可辨别症状稳定。其还包括管理如上所述的癌症。所谓“管理”，其意指减轻疾病的严重性，降低疾病的发作频率，降低所述发作的持续时间，减轻所述发作的严重性，减缓/降低癌细胞生长或增殖，减缓至少一种症状的进展，改善至少一种可测量身体参数等。例如，免疫刺激性抗VISTA抗体应促进针对靶标细胞例如癌细胞、受感染细胞或病原体细胞的T细胞或NK或细胞因子免疫性，并且由此通过耗竭疾病病症中所涉及的细胞来治疗癌症或感染性疾病。激动性抗VISTA抗体应降低一些免疫疾病(诸如自体免疫病症、炎性病症或变应性病症)的疾病病理学中涉及的T细胞或NK活性和/或促炎细胞因子分泌，由此治疗或改善可与所述病症相关的疾病病理和组织破坏(例如与类风湿性关节炎病症相关的关节破坏)。
出于治疗的目的，“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。优选地，哺乳动物是被诊断有一种上文所述的疾病、障碍或病症的人，或者易感于至少一种类型的癌症者。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的药剂的有效治疗哺乳动物的疾病或障碍的量。本发明的治疗剂可单独或作为药物组合物的一部分向受试者提供，在所述药物组合物中，它们与药学上可接受的载体混合。
根据本发明至少一些实施方案的如本文所述的抗VISTA抗体、其片段、缀合物和/或含有它们的药物组合物也可以联合疗法施用，即与其他增效剂和/或其他疗法组合。根据至少一些实施方案，本文公开的抗VISTA抗体可与任何本领域中已知的护理标准癌症治疗(如可例如于http://www.cancer.gov/cancertopics中所见)组合使用。
例如，联合疗法可包括抗VISTA抗体、其片段、缀合物和/或含有它们的药物组合物与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂、其他化合物或免疫疗法、或如本文所述的免疫刺激性策略组合。
可将拮抗性抗VISTA抗体与以下抗体组合使用：靶向免疫检查点的激动性抗体，包括抗CTLA4 mAb，诸如易普利单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)；抗PD-1，诸如尼鲁单抗(nivolumab)BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、AMP224、CT-011、MK-3475；抗PDL-1拮抗剂，诸如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A；抗LAG-3诸如IMP-321)、抗TIM-3、抗BTLA、抗B7-H4、抗B7-H3；靶向免疫刺激性蛋白质的激动性抗体，包括抗CD40 mAb，诸如CP-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)；抗CD137 mAb，诸如BMS-663513乌瑞鲁单抗(urelumab)、PF-05082566；抗OX40 mAb，诸如抗-OX40；抗GITR mAb诸如TRX518；抗CD27 mAb，诸如CDX-1127；以及抗ICOS mAb。
细胞因子是允许免疫系统的细胞彼此通信以产生对靶标抗原的协调、稳健但自我限制的应答的分子信使。基于细胞因子的疗法体现了直接试图刺激患者的自体免疫系统以排斥癌症。在过去20年间对利用免疫系统来根除癌症的日益增长的关注伴随着增加的尝试来表征细胞因子并利用它们的巨大信号传导网络来开发癌症治疗法。细胞因子直接刺激在肿瘤部位处的免疫效应细胞和基质细胞，并且增强由细胞毒性效应细胞对肿瘤细胞识别。众多动物肿瘤模型研究已证明细胞因子具有广泛抗肿瘤活性，并且这已被转换为许多基于细胞因子的用于癌症疗法的方法(Lee和Margolin 2011,Cancers 3(4):3856-93)。许多细胞因子作为用于癌症免疫疗法的加强抗肿瘤免疫应答的药剂处于临床前或临床开发中，尤其包括：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNβ和IFNγ。
还可以将拮抗性抗VISTA抗体和含有其的药物组合物与其他化合物或免疫疗法联合施用。例如，联合疗法可包括本发明化合物与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂或免疫刺激性策略组合，包括但不限于肿瘤疫苗、过继性T细胞疗法、Treg消减、抗体(例如贝伐单抗、爱必妥(Erbitux))、肽、肽体(peptibody)、小分子、化学治疗剂诸如细胞毒性剂和细胞抑制剂(例如紫杉醇、顺铂、长春瑞滨、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺(temozolomide)、伊立替康、5FU、卡铂)、免疫调节剂诸如干扰素和白介素、免疫刺激性抗体、生长激素或其他细胞因子、叶酸、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂等等。
根据至少一些实施方案，可在体内或离体使免疫细胞，优选T细胞，与主题治疗剂接触以调节免疫应答。与治疗剂接触的T细胞可为表达T细胞受体(包括α/β和γ/δΤ细胞受体)的任何细胞。T细胞包括表达CD3的所有细胞，包括也表达CD4和CDS的T细胞亚群。T细胞包括天然和记忆细胞以及效应细胞诸如CTL。T细胞还包括诸如Th1、Tel、Th2、Th2、Th3、Thl7、Th22、Treg和Trl细胞之类的细胞。T细胞还包括NKT细胞和T细胞谱系的类似独特类别。
激动性抗VISTA抗体及含有其的药物组合物用于治疗自体免疫性疾病的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的充当VISTA刺激性治疗剂的抗VISTA抗体、其片段、缀合物或含有它们的药物组合物可用于治疗免疫系统相关疾病。
任选地，免疫系统相关病症包括免疫相关病症、如本文所述的自体免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病，和/或用于阻断或促进由VISTA介导的免疫刺激，如本文所述的免疫相关疾病，和/或用于免疫疗法(促进或抑制免疫刺激)。
任选地，免疫病症选自自体免疫性疾病、移植排斥、炎性疾病、过敏性疾病或移植物抗宿主病。任选地，将治疗与用于治疗免疫相关病症的另一部分组合。
因此，使用根据本发明至少一些实施方案的药剂治疗多发性硬化症可与例如任选如本文所述的用于治疗多发性硬化症的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗类风湿性关节炎或其他关节炎病症可与例如任选如本文所述的用于治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗IBD可与例如任选如本文所述的用于治疗IBD的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗牛皮癣可与例如任选如本文所述的用于治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗1型糖尿病可与例如任选如本文所述的用于治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗葡萄膜炎可与例如任选如本文所述的用于治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗牛皮癣可与例如任选如本文所述的用于治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗休格连氏综合征( syndrome)可与例如任选如本文所述的用于治疗休格连氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗全身性红斑狼疮可与例如任选如本文所述的用于治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗GVHD可与例如任选如本文所述的用于治疗GVHD的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗慢性或急性感染和/或与其相关的肝毒性，例如肝炎，可与例如任选如本文所述的治疗慢性或急性感染和/或与其相关的肝毒性的任何已知治疗剂或方法组合。
在上述疗法中，优选地，患有其中一种以上提及的或其他自体免疫性病症或炎性病症的受试者将被施用根据本发明的本文公开的免疫抑制性抗VISTA抗体或抗原结合片段，所述抗体模拟或激动至少一种VISTA介导的对免疫的作用，例如其抑制疾病病理学中涉及的细胞毒性T细胞或NK活性和/或促炎细胞因子产生，由此预防或改善疾病症状，并且潜在导致疾病缓解延长，例如由于诱导了可引发T细胞耐受性或延长的免疫抑制的Treg。
根据本发明的至少一些实施方案，如本文所述的治疗剂和/或含有其的药物组合物可作为唯一活性成分施用或在免疫调节方案中连同其他药物或例如用于治疗或预防同种异体移植物或异种移植物急性或慢性排斥或炎性疾病或自体免疫性障碍或用以诱导耐受性的其他抗炎剂一起施用。
激动性抗VISTA抗体及含有其的药物组合物用于治疗败血症的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的VISTA抗体、其片段、缀合物和/或药物组合物可用于治疗败血症。败血症是潜在危及生命的感染并发症。败血症代表复杂的临床综合征，其在针对感染的初始宿主应答变得不适当地放大和调节异常，从而变得对宿主有害时显现。败血症的初始高炎症期(“细胞因子风暴”)之后是免疫抑制状态(Hotchkiss等2013Lancet Infect.Dis.13:260-268)。该后一种免疫性受损(也被称为“免疫麻痹”)期显现为不能清除原发性感染，诸如HSV和巨细胞病毒之类的病毒的再活化，以及显现新的继发性感染，常伴有对具有免疫能力的患者不特别具有毒力的生物体。绝大多数的败血症患者当今仅存活于他们的初始高炎性伤害，直至在重病监护室中历经随后数日至数周以败血症诱发的多器官功能异常而告终。败血症诱导的免疫抑制日益被认定为这些易受影响的患者中的首要免疫功能异常。在原发性感染之后病原体清除受损和/或对继发性感染的易感性促成与败血症相关的高致病率和致死率。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或含有其的药物组合物与有效用于治疗败血症的已知治疗剂的组合的用途。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或含有其的药物组合物可与以下进行组合所达成的组合的用途：针对败血症的护理标准治疗或新型治疗、阻断败血症的初始高炎症期的细胞因子风暴的疗法、和/或具有免疫刺激作用以克服败血症诱导的免疫抑制期的疗法。
与如由“国际重度败血症和败血性休克管理指导方针(InternationalGuidelines for Management of Severe Sepsis and Septic Shock)(Dellinger等2013Intensive Care Med 39:165-228)推荐的针对败血症的护理标准治疗进行组合，以下描述所述护理标准治疗中的一些。
1.具有针对所有可能病原体的活性的广谱抗生素(当败血症被诊断，但未鉴定特定病原体时开始细菌和/或真菌治疗)-实例：头孢噻肟替卡西林(Ticarcillin)和克拉维酸盐哌拉西林(Piperacillin)和他唑巴坦(tazobactam)亚胺培南(Imipenem)和西司他丁(cilastatin)美罗培南(Meropenem)克林霉素(Clindamycin)(氯洁霉素(Cleocin))、甲硝哒唑(Metronidazole)头孢曲松(Ceftriaxone)环丙沙星头孢吡肟左氧氟沙星万古霉素或所列药物的任何组合。
2.血管加压剂：实例：去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、血管加压素
3.类固醇：实例：氢化可的松、地塞米松或氟氢可的松，静脉内或另外的变力性疗法：实例：用于具有心肌功能异常的败血症患者的多巴酚丁胺(Dobutamine)
4.重组人经活化蛋白C(rhAPC)，诸如阿法多曲考津(drotrecogin alfa)(活化)(DrotAA)
5.β-阻断剂另外可减轻局部和全身性炎症。
6.代谢干预诸如丙酮酸盐、琥珀酸盐或高剂量胰岛素替代。
抗VISTA抗体和含有其的药物组合物用于降低在基因或细胞疗法或移植之后不合需要的免疫活化的用途
如本文所用，术语“基因疗法”涵盖任何类型的基因疗法、载体介导的基因疗法、基因转移、病毒介导的基因转移，并且还涵盖某些细胞疗法，例如CAR T和CAR NK细胞疗法。根据本发明的至少一些实施方案，如本文所述的靶向VISTA，并且对免疫应答具有抑制活性的激动性VISTA抗体、其片段、缀合物和/或药物组合物可作为治疗剂用于降低在用于治疗各种遗传疾病的基因疗法之后不合需要的免疫活化。不希望受限于单一假设，这类抗体对免疫应答具有VISTA样抑制活性，和/或可增强VISTA免疫抑制活性，任选通过抑制病原性T细胞和/或NK细胞。
用于治疗遗传疾病的许多基因疗法产品当前处于临床试验中。新近的研究用文件记载了使用基因疗法载体对若干遗传疾病的治疗成功。基因疗法策略表征为3个关键要素，即待转移的基因、将向其中引入基因的靶标组织、和用于促进基因进入靶标组织中的载体(基因递送载体)。绝大多数的基因疗法临床试验已利用病毒载体作为极高效的递送载体，包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、假型病毒和单纯疱疹病毒。然而，在人免疫系统与基因疗法载体的所有组分之间的相互作用似乎代表着对持久治疗功效的其中一个主要限制。人研究已显示宿主对病毒载体的免疫应答的可能性较高。导致形成中和抗体和/或由细胞毒性细胞破坏转导细胞的对病毒或转基因产物自身的这种免疫应答可极大干扰治疗功效(Seregin和Amalfitano(2010)Viruses2:2013；Mingozzi和High(2013)Blood122:23；Masat等(2013)Discov Med.15:379)。因此，开发用以规避免疫应答以及促进转基因治疗性蛋白质长期表达的策略是基因疗法在临床中取得成功的一个主要挑战。
影响针对由病毒载体编码的转基因蛋白质的免疫应答的因素包括施用途径、载体剂量、转基因蛋白质的免疫原性、宿主的炎性状况和衣壳血清型。这些因素被认为通过触发先天免疫、细胞因子产生、APC成熟、抗原递呈以及最终使天然T淋巴细胞致敏成为功能性效应子来影响免疫原性(Mingozzi和High(2013)Blood 122:23)。因此，用以通过干扰这些真正机理来减弱免疫活化的理念已在逻辑上出现，其中目的在于诱导短期免疫抑制，避免在载体施用之后的早期免疫致敏，以及促进长期耐受性。
作为一种用以抑制在基因疗法之后，特别是在多次注射之后不合需要的免疫活化的策略，在动物模型中测试在载体递送时通过靶向免疫应答的两种非冗余检查点来进行的免疫调节治疗。在小鼠或猴中进行的对在腺病毒载体滴注至肺中后载体介导的免疫应答的研究显示，用抗CD40L抗体短暂治疗可导致抑制腺病毒诱导的免疫应答；因此，动物可用腺病毒载体再次施用。用这个Ab短暂治疗导致对免疫功能的长期作用，并且使对腺病毒特异性体液应答的抑制充分延长超出Ab作用不再显著时所处的时间，从而指出阻断这个共刺激路径作为免疫调节方案来使得能够施用基因转移载体的治疗潜力(Scaria等(1997)GeneTher.4:611；Chirmule等(2000)J.Virol.74:3345)。其他研究显示大约在初级载体施用时共同施用CTLA4-Ig和抗CD40L Ab使对载体的免疫应答降低，延长长期腺病毒介导的基因表达，并且使得能够进行次级腺病毒介导的基因转移，即使在这些药剂的免疫抑制性作用不再存在之后也是如此，从而指示可有可能用短暂免疫抑制性疗法获得持续性以及次级腺病毒介导的基因转移(Kay等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4686)。在另一研究中，类似施用CTLA4-Ig和抗CD40L Ab消除了形成针对载体的中和Ab，并且使得能够进行基因转移表达，条件是在各次基因转移注射期间施用治疗剂(Lorain等(2008)Molecular Therapy16:541)。此外，即使以单次施用来向小鼠施用CTLA4-Ig也导致在早期时间点抑制免疫应答，并且延长转基因表达(Adriouch等(2011)Front.Microbiol.2:199)。然而，单独CTLA4-Ig不足以永久消灭针对转基因产物的免疫应答。用CTLA4-Ig和PD-L1或PDL-2靶向两种免疫检查点的联合治疗导致在较迟时间点协同改善转基因耐受性，可能是通过靶向两种非冗余免疫调节机理，从而导致长期转基因持续性和表达(Adriouch等(2011)Front.Microbiol.2:199)。
根据本发明的至少一些实施方案，本主题激动剂可单独或与其他活性剂一起用于克服对基因疗法的免疫应答的限制，可用于降低在基因疗法之后不合需要的免疫活化。当前方法包括排除具有针对递送载体的抗体的患者；施用高载体剂量；使用空衣壳来吸附抗载体抗体，从而允许后续的载体转导；重复血浆交换(血浆除去法)循环以吸附免疫球蛋白并降低抗载体抗体滴度。
试图克服这些限制的新型方法可分成两个大类：选择性修饰Ad载体自身和抢先免疫调节宿主(Seregin和Amalfitano(2010)Viruses 2:2013)。第一类包含若干创新策略，包括：(1)Ad衣壳展示特异性抑制剂或配体；(2)共价修饰整个Ad载体衣壳部分；(3)使用组织特异性启动子和局部施用途径；(4)使用基因组经修饰的Ad；和(5)开发嵌合或替代性血清型Ad。
第二类的方法包括使用免疫抑制性药物或特定化合物来阻断已知由病毒载体诱导的重要免疫路径。免疫抑制剂已在临床前研究中测试，并且显示出预防或根除对转移载体和转基因产物的免疫应答的功效。这些包括一般性免疫抑制剂，诸如环孢霉素A；环磷酰胺；FK506；糖皮质素或类固醇诸如地塞米松；TLR9阻断剂诸如TLR9拮抗剂寡核苷酸ODN-2088；TNF-a阻断剂和抗TNF-a抗体或TNFR-Ig抗体、Erk以及其他信号传导抑制剂诸如U0126。在临床环境中，施用糖皮质素已成功用于钝化在用表达人因子IX转基因的腺病毒相关病毒(AAV)载体向重度乙型血友病患者中进行肝基因转移后针对病毒衣壳的T细胞应答(Nathwani等(2011)N.Engl.J.Med.365:2357)。
不同于利用往往会“整体”和非特异性免疫抑制宿主的药物的先前方法，已开发更具选择性的免疫抑制性方法。这些包括使用提供对诸如CD40与CD154、ICOS与ICOSL、CD28与CD80或CD86(包括CTLA4-Ig)、NKG2D与NKG2D配体、LFA-1与ICAM、LFA-3与CD2、4-1BB与4-1BBL、OX40与OX40L、GITR与GITRL之间的正性共刺激相互作用的阻断的药剂，以及刺激负性共刺激受体诸如CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-1、TEVI-3、KIR、以及B7-H4和B7-H3的受体的药剂。这些中的一些已用于临床前或临床移植研究中(Pilat等(2011)Sem.Immunol.23:293)。
在上述基因或细胞疗法中或在治疗移植适应症时，优选地，得到或将接收细胞或基因疗法或移植组织或器官的受试者将被施用本发明的本文公开的免疫抑制性抗VISTA抗体或抗原结合片段，所述抗体可增强、激发或模拟至少一种VISTA介导的对免疫的作用，例如其对细胞毒性T细胞或NK活性的抑制作用和/或其对促炎细胞因子的产生的抑制作用，或其对Treg的刺激作用，由此预防或降低宿主针对用于疗法中的细胞或基因的免疫应答或针对移植细胞、器官或组织的非所需免疫应答。优选地，治疗将引发针对移植或输注的细胞、组织或器官的延长免疫耐受性。在一些情况下，例如在含有免疫细胞的移植细胞、组织或器官的情况下，可在输注或移植之前使本文公开的免疫抑制性抗VISTA抗体或抗原结合片段与细胞、组织或器官，和/或可能与移植受体的免疫细胞接触以使免疫细胞耐受，并且潜在预防非所需免疫应答或GVHD免疫反应。
药物组合物
在另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有根据本发明的抗人VISTA抗体中的一种或组合，以及任选另外的免疫抑制剂或其他活性剂。因此，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明至少一些实施方案的抗人VISTA抗体。特别地，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含治疗有效[免疫抑制]量的根据本发明的抗人VISTA抗体或抗体片段。
根据本发明至少一些实施方案的药物组合物[即，就本文所公开的VISTA拮抗性抗体而言]可用于治疗癌症，其中所述癌症是非转移性的、浸润性的或转移性的，和/或用于治疗免疫相关障碍、自体免疫、变态反应、GVHD、炎症或与感染性障碍相关的肝毒性和/或败血症[即就本文所公开的VISTA激动性抗体而言]。“治疗”是指治疗性治疗与预防性或防治性措施两者。需要治疗者包括已患有所述障碍者以及将预防所述障碍者。因此，本文中待治疗的哺乳动物可已被诊断为患有所述障碍，或可易感于所述障碍或易患所述障碍。出于治疗的目的，“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的药剂的有效治疗哺乳动物的疾病或障碍的量。本发明的治疗剂可单独或作为药物组合物的一部分向受试者提供，在所述药物组合物中，它们与药学上可接受的载体混合。在许多情况下，根据本发明的激动性或拮抗性抗VISTA抗体将与其他免疫治疗剂或用于治疗特定病症的其他治疗剂组合使用。
若组合物的施用可由接受患者所耐受，那么它被称为“药学上可接受的载体”。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、经脊柱或经表皮施用(例如通过注射或输注)。
这类组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度调节剂以及任选地，各添加剂，诸如去垢剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增积物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物也可如下所详述加以使用。
可用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆物质(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂加以维持。视施用途径而定，活性化合物，即特异性结合任一VISTA蛋白的单克隆或多克隆抗体和抗原结合片段以及含有其的缀合物和/或替代性骨架，或双特异性分子，可以物质包覆以保护化合物免遭酸和可使化合物失活的其他天然条件的作用。根据本发明至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性，并且不赋予任何非所需毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等；以及由无毒有机酸，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等；以及衍生自无毒有机胺，诸如Ν,Ν’-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
根据本发明至少一些实施方案的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可通过以下两种方式来确保：上文灭菌程序以及包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可合乎需要的是将等渗剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，延长可注射药物形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对药物活性物质使用所述介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则设想其用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可掺入组合物中。
治疗性组合物通常在制造和储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适合的混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将是优选的。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来达成。可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉剂。
可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉剂。
可使用多种本领域中已知的方法中的一种或多种，经由一种或多种施用途径来施用本发明组合物。如将为熟练技术人员所了解的，施用途径和/或模式将视所需结果而变化。用于根据本发明至少一些实施方案的治疗剂的优选施用途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、经脊柱、口服、经肠、经直肠、经肺(例如吸入)、经鼻、局部(包括经皮、经颊和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、经阴道、脑递送(例如脑室内、脑内和对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、脊柱周和脊柱内)或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)、经粘膜(例如舌下施用)、施用或通过植入物来施用、或其他胃肠外施用途径例如通过注射或输注、或本领域中已知的其他递送途径和/或施用形式。如本文所用，短语“胃肠外施用”意指除经肠和局部施用以外的通常通过注射达成的施用模式，并且包括不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在具体实施方案中，可腹膜内或静脉内施用根据本发明至少一些实施方案的蛋白质、治疗剂或药物组合物。
作为另一种选择，根据本发明的VISTA特异性抗体或可经由非胃肠外途径来施用，诸如局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。
可将活性化合物与将会保护化合物对抗快速释放的载体一起制备，诸如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊封递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的许多方法受专利权保护或通常为本领域技术人员所知。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson(编辑)，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可用本领域中已知的医学装置施用治疗性组合物。例如，在一个优选的实施方案中，可用针皮下注射装置施用根据本发明至少一些实施方案的治疗性组合物，所述装置诸如美国专利No.5,399,163、No.5,383,851、No.5,312,335、No.5,064,413、No.4,941,880、No.4,790,824或No.4,596,556中公开的装置。可用于本发明中的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利No.4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利No.4,486,194，其公开了一种用于穿过皮肤来施用药剂的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的变流速可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了一种具有多室隔间的渗透药物递送系统；以及美国专利No.4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。将这些专利以引用的方式并入本文。许多其他所述植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所知。
在某些实施方案中，可配制抗VISTA抗体以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)可排除许多高度亲水性的化合物。为确保根据本发明至少一些实施方案的治疗性化合物跨越BBB(若需要)，可将它们配置于例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利No.4,522,811、No.5,374,548和No.5,399,331。脂质体可包含一种或多种被选择性转运至特定细胞或器官中、从而增强靶向药物递送的部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如颁给Low等的美国专利No.5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.JPhysiol.1233:134)；pl20(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还可参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；和I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于通过以下方式来使化合物(例如治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有VISTA细胞表面受体的细胞：使所述化合物连接于本文公开的抗体。因此，本发明还提供用于离体或体内定位表达VISTA的细胞的方法(例如用可检测标记，诸如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。作为另一种选择，免疫缀合物可用于通过使细胞毒素或放射性毒素靶向VISTA抗原来杀死具有VISTA细胞表面受体的细胞。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、经脊柱或经表皮施用(例如通过注射或输注)。视施用途径而定，活性化合物，即含有VISTA抗原的胞外结构域的可溶性多肽缀合物、抗体、免疫缀合物、替代性骨架和/或双特异性分子，可以物质包覆以保护化合物免遭酸和可使化合物失活的其他天然条件的作用。根据本发明至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性，并且不赋予任何非所需毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等；以及衍生自无毒有机酸，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等；以及衍生自无毒有机胺，诸如Ν,Ν’-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
根据本发明至少一些实施方案的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。可用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆物质(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂加以维持。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可通过以下两种方式来确保：上文灭菌程序以及包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可合乎需要的是将等渗剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，延长可注射药物形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对药物活性物质使用所述介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则设想其用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可掺入组合物中。
治疗性组合物通常在制造和储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适合的混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将是优选的。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来达成。可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉剂。
可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉剂。
可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是组合物的产生治疗作用的那个量。通常，总计100％，该量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分的范围内，所述活性成分与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最优所需应答(例如治疗应答)。例如，可施用单次团注，可随时间推移施用若干分次剂量，或可如由治疗情况的紧急性所指示，按比例降低或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物以易于施用和达成剂量均一性。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理离散单元；各单元含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载体。根据本发明至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下支配并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用，和(b)混配这种活性化合物以处理个体中的敏感性的领域中固有的限制。
对于施用本文所公开的VISTA抗体，剂量在每kg宿主体重约0.0001mg至100mg，并且更通常是0.01mg至5mg的范围内。例如，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每3至6个月一次进行施用。用于根据本发明至少一些实施方案的本文所公开的抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用其中一种以下给药时程给予本文所公开的抗体：(i)每4周施用一次，持续6次剂量，接着每3个月施用一次；(ii)每3周；(iii)每千克体重3mg，1次，继之以每3周，每千克体重1mg。
在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在所述情况下，所施用的各本文所公开的抗体的剂量落在所指示的范围内。通常在多个时刻施用本文所公开的抗体。各单一剂量之间的间隔可为例如每日、每周、每月、每3个月或每年。如通过测量患者中针对靶标抗原的抗体的血液水平所指示的，间隔也可为不定期的。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000mug/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中，实现约25-300微克/ml。
作为另一种选择，治疗剂可以持续释放制剂形式施用，在所述情况下，需要的施用频率较小。剂量和频率视治疗剂在患者中的半衰期而变化。一般来讲，人抗体显示最长半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。融合蛋白的半衰期可广泛变化。施用剂量和频率可视治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，历经长的一段时间在相对不频繁间隔下施用相对低的剂量。一些患者在他们的剩余生命中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短暂间隔下使用相对高剂量直至疾病的进展得以降低或终止，并且优选地，直至患者显示疾病的症状部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以便获得活性成分的有效实现就特定患者、组合物和施用模式来说的所需治疗反应而对患者无毒的量。所选剂量水平将取决于多种药动学因素，包括所用本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和先前病史；以及医学领域中熟知的类似因素。
已经描述了本发明，提供以下实施例以进一步说明本发明及其固有的优点。
实施例
实施例1：利用测定法来筛选免疫抑制性抗小鼠VISTA抗体
本发明人开发了用于筛选推定的激动性抗小鼠VISTA抗体的多种测定法。如图1所示，将体外和体内筛选测定法用于鉴定免疫抑制性抗VISTA单克隆抗体。在图1A的实验中，在指定单克隆抗体的存在下将纯化的T细胞涂铺于抗CD3之上72小时。通过H3掺入测量增殖。在图1B的实验中，在指定抗体的存在下通过ISQ脉冲的APC刺激纯化的DO11.10 T细胞6天。通过使用CTV稀释染料测量增殖。在图1C中的实验中，通过将C57BL/6细胞转移到受照射的BALB/c受体中来诱导GVHD。转移后第0、2和4天给小鼠腹膜内注射200μg抗体并分析存活情况。在图1D的实验中，在施用ConA(15毫克/千克)之前3小时用10毫克/千克的指定抗体处理小鼠并通过Luminex在6下分析血浆中的IL-2。
更具体地，在第一个测定法中，分离CD4+T细胞并与Ab1、Ab2或Ab3一起温育，然后添加至抗CD3包被的平板中。培养3天后，用氚标记的胸苷对T细胞进行脉冲处理，氚标记的胸苷掺入进增殖细胞中。值得注意的是，Ab1和Ab2二者均诱导了T细胞增殖速率的显著降低，而Ab3没有作用(图1)。而在用抗原脉冲的APC刺激转基因T细胞的类似试验中，通过增殖染料稀释测量T细胞活化。与抗CD3测定法类似，Ab1抑制抗原特异性T细胞增殖约50％(图1B)。这些数据表明Ab3单克隆抗体可阻断mVISTA功能(即增强免疫应答)，而Ab1和Ab3可刺激mVISTA功能并下调关键免疫应答。
我们还测定了Ab3和Ab1是否可以使用体内动物模型，特别是在GVHD和ConA肝炎模型中进行区分。用对照抗体(仓鼠Ig)处理的患有GVHD的小鼠具有进行性疾病，并且正如预期的，需要在移植后第4周进行安乐死(图1C)。经Ab3处理的小鼠也易受GVHD影响，事实上大多数小鼠在对照处理组之前死亡，从而表明Ab3可能会加剧疾病。相反，所有经Ab1处理的小鼠均未显示出明显的GVHD症状，并且几乎所有小鼠都健康至少40天。具体而言，在这些实验中，用对照抗体(仓鼠Ig)处理的患有GVHD的小鼠具有进行性疾病，并且正如预期的，需要在移植后第4周实施安乐死(图1C)。经Ab3处理的小鼠也易受GVHD影响，事实上大多数小鼠在对照处理组之前死亡，从而表明Ab3可能会加剧疾病。相反，所有经Ab1处理的小鼠均未显示出明显的GVHD症状，并且几乎所有小鼠在至少40天内都健康。
在ConA模型中，发明人测试了每种VISTA抗体是否会影响对ConA的充分表征的T细胞细胞因子应答。值得注意的是，Ab1而非Ab3诱导了IL-2的血浆细胞因子水平降低(图1D)。具体而言，在ConA模型中，发明人还测试了每种VISTA抗体是否会影响对ConA的充分表征的T细胞细胞因子应答。值得注意的是，Ab1而非Ab3诱导了IL-2的血浆细胞因子水平降低(图1D)。
因此，这些结果证明抗VISTA单克隆抗体(Ab1和Ab2)二者都是免疫抑制性的，并且还显示这种免疫抑制性抗小鼠VISTA抗体可以与炎性免疫抑制性抗小鼠VISTA抗体(Ab3)区分开。如图1所示，Ab1在包括以下的多种炎症模型中是有效的(免疫抑制性的)：GVHD、NZB/WF1狼疮样肾小球性肾炎、伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝炎、胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)和咪喹莫特诱导的牛皮癣。在这些疾病中的每一者中，在疾病进展期间施用Ab1极大地减少了病理学和/或死亡率。所列出的每种模型就疾病进展而言对T细胞有独特的要求。GVHD和ConA二者均受Th1 T细胞应答驱动。
实施例2：在不同自体免疫性疾病模型中抑制自体免疫的抗VISTA抗体的鉴定
在图2A-F中的实验中，在不同的疾病模型中再次比较了不同抗小鼠VISTA抗体的作用。在图2A中的实验中，从第25周开始直至实验结束用Ab1或仓鼠Ig(200μg)处理NZB/WF1小鼠3次/周。“X”表示对照处理组全部被处死的时间点。在图2B中的实验中，在施用15mg/kg(mpk)ConA前3小时用200μg抗体处理小鼠3小时并跟踪存活情况80小时。在图2C中的实验中，先用胶原II mAb、然后用LPS依次处理小鼠，通过测量足肿胀来测量关节炎。在这些实验中，每隔一天施用Ab1和仓鼠Ig(200μg)3次。在图2D中的实验中，每天将咪喹莫特施加至小鼠的耳朵。在第14天时，每隔一天施用Ab1或仓鼠Ig(200μg)，并用卡尺测量耳厚度。在相同的图2E-F中的实验中，每天将咪喹莫特施加至小鼠的背部。在第9天，对小鼠实施安乐死，将其皮肤做成切片并染色以通过IHC针对CD3表达进行分析。
如图2A-F所示，在这些实验模型中的每一者中，在特定疾病的进展期间施用Ab1极大地减少了病理学和/或死亡率。所列出的每种模型就疾病进展而言对T细胞有独特的要求。GVHD和ConA二者均受Th1 T细胞应答驱动。
咪喹莫特诱导的牛皮癣是IL-17/23驱动的疾病，其中T细胞被募集到皮肤的真皮层中。Ab1急剧减少了CD3+细胞在真皮(图2E和F)的数目，但对脾T细胞群体没有影响(数据未示出)，从而表明该抗小鼠VISTA抗体优先在炎性病变处抑制免疫。
NZB/W F1狼疮是一种多因素疾病，由B细胞、T细胞和髓样细胞促成。在该模型中，Ab1的治疗性施用降低了蛋白尿水平，从而表明对肾脏的损害减少。最后，CAIA不涉及适应性免疫，而是由巨噬细胞和粒细胞驱动。在该模型中抗VISTA实现抑制表明该抗体也可能影响髓室。照此，抑制性VISTA单克隆抗体似乎介导对T细胞和先天免疫区室的作用。
因此，如图1和图2所示，单克隆仓鼠抗小鼠VISTA抗体Ab1和AB2二者均诱导T细胞增殖速率显著降低，而Ab3无作用(图1)。在用抗原脉冲的APC刺激转基因T细胞的类似测定中，通过增殖染料稀释测量T细胞活化。与抗CD3测定法类似，Ab1抑制抗原特异性T细胞增殖约50％(图1B)。这些数据表明Ab1和Ab2可激发VISTA功能，由此下调关键的免疫应答。
特别地，仓鼠抗小鼠VISTA抗体Ab1在包括以下的多种炎症模型中是有效的：GVHD、NZB/W F1狼疮样肾小球性肾炎、伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝炎、胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)和咪喹莫特诱导的牛皮癣(图1和2)。在这些疾病中的每一者中，在疾病进展期间施用Ab1极大地减少了病理学和/或死亡率。所列出的每种模型就疾病进展而言对T细胞有独特的要求。GVHD和ConA二者均受Th1 T细胞应答驱动。如上所述，咪喹莫特诱导的牛皮癣是IL-17/23驱动的疾病，其中T细胞被募集到皮肤的真皮层中。因此，在该特定自体免疫模型中Ab1实现抑制表明该抗体也可能影响髓室。因此，这些免疫抑制性抗小鼠VISTA单克隆抗体似乎介导对T细胞和先天免疫区室的作用。
实施例3：用于筛选激动性抗人VISTA抗体的人VISTA敲入小鼠的开发
前面的实施例涉及激动性抗小鼠VISTA抗体的分离和表征。迄今为止，文献中从未报道过激动性抗人VISTA抗体。尽管本受让人和其他组已鉴定出非常多的拮抗性抗人VISTA抗体。因此，在本发明之前，不确定是否会鉴定出激动性抗人VISTA抗体。
这样的抗体将是非常有益的，因为目前没有批准的利用NCR的天然功能来抑制免疫应答的人用治疗剂。尽管Orencia(CTLA4-Ig)是有效的，但它仅通过阻断CD28-B7相互作用和途径起作用，并且不通过刺激下调途径起作用。如下文实施例所示的两种不同激动性抗VISTA单克隆抗体的有效免疫抑制作用所示，该途径的参与可能会证明是管理不同的人自体免疫疾病的革命。此外，抗VISTA对适应性和先天性自体免疫效应机制的免疫抑制影响使其与许多其他抗炎剂区别开来。
关于前述内容，假定筛选激动性抗人VISTA抗体的理想和必需试剂是人VISTA敲入小鼠。本受让人已产生了人VISTA敲入小鼠(“hV-KI小鼠”)。这些hV-KI小鼠表达人VISTA代替小鼠VISTA。具体而言，如图3所示，从WT和VISTA KI小鼠的淋巴结中分离出CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg(CD4+FoxP3+)和单核细胞CD11b+,Ly6C+,Ly6G-，并分别用针对小鼠或人蛋白质的αVISTA抗体染色。hV-KI的表达模式与WT小鼠中所见的表达模式相同，因为CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞和单核细胞都在这两个品系之间表达一致量的表面蛋白(参见图3)。
另外，hV-KI小鼠不会发展出VISTA KO小鼠中观察到的任何炎性疾病的征象，从而表明hVISTA在小鼠免疫系统内是完全有功能的(数据未示出)。因此，该小鼠模型可在不同的测定法中用于筛选免疫抑制性单克隆抗体。
实施例4：推定的激动性抗人VISTA抗体的合成
图4包含了不同的抗人VISTA抗体的序列。这些抗体特异性地结合至人VISTA，例如VSTB49-VSTB116，并具有VISTA拮抗剂特性，即当为IgG1形式时，例如当抗体包含IgG1 Fc区(其为野生型的，即未经修饰的)时，这些抗体抑制VISTA对免疫的抑制作用。
图4中所鉴定的抗体中的其中一种是1E8。该鼠抗人VISTA抗体包含下文所述的可变重链多肽和可变轻链多肽，并由本发明人转化为两种人嵌合形式。本文称为INX800的第一种嵌合抗体是通过将人IgG2重链和轻链恒定区多肽附接至1E8可变重链多肽和可变轻链多肽连接而获得的。在该第一种嵌合抗体中，IgG2恒定区内的氨基酸残基均未经修饰。
本文称为INX801的第二种嵌合抗体类似地通过将人IgG2重链和轻链恒定区多肽附接至1E8可变重链多肽和可变轻链多肽而获得。在该第二种嵌合抗体中，人IgG2κ链内第127位的半胱氨酸残基被转化为丝氨酸。除此以外，IgG2恒定区内的氨基酸残基均未经修饰。
IE8 VH多肽
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEVYPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALYYCARGRGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:57)
IE8 VL多肽
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLSWYHQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQNFWSTPFTFGSGTKLEIKR.(SEQ ID NO:58)
实施例5：在ConA动物模型中评价推定的激动性抗人VISTA抗体
在伴刀豆球蛋白A肝炎模型中比较嵌合IgG2抗体和对照抗体的作用。在该体内模型中，在施用伴刀豆球蛋白A之前3小时，将不同的动物预先给予10mg/kg的嵌合IgG2抗体(INX800或INX801)或对照抗体。抗体施用后3小时，然后给予小鼠12mg/kg的ConA。然后在ConA给药后6小时通过心脏穿刺将这些动物和对照进行放血。所有小鼠都看起来正常，没有明显的发病或死亡。
然后分析血液的细胞因子表达。具体而言，使用常规方法和通常用于细胞因子分析的细胞因子测试试剂盒，使用从所收集的血液样品获得的血浆运行32重测定法(32-plex)。如图5所示，与对照动物相比，施用INX800或INX801抗体的动物中数种促炎细胞因子的表达被显著抑制。具体而言，与对照相比，经INX800或INX801处理的动物中GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17和TNF-α水平均显著较低。在INX800或INX801处理的动物中，这些细胞因子的[减少的]表达基本相同。
此外，与对照相比，INX800或INX801处理的动物中某些趋化因子(角化细胞衍生的趋化因子或“KC”)和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)的表达显著增加。同样，在INX800或INX801处理的动物中，这些蛋白质的[增加的]表达基本相同。基于这些结果，INX800和INX801似乎都是有效的VISTA激动剂，因为它们似乎引发的免疫抑制作用类似于VISTA引发的对各种炎性细胞因子表达的作用。
实施例6：在移植物抗宿主病(GVHD)动物模型中评价推定的激动性抗人VISTA抗体
还在移植物抗宿主病(GVHD)动物模型中，与未处理的动物或用无关抗体处理的对照相比，比较了相同的推定的激动性抗人VISTA抗体(INX800和INX801)的作用。在该动物模型中，将T细胞过继转移到经照射的宿主中，并测量体重作为疾病的读数。基于GVHD疾病进展，所有对照小鼠(8/8)必须实施安乐死。这些动物研究的结果如图6所示。如图所示，由于用INX800或INX801抗体处理，所有INX800或INX801处理的小鼠都不[0/8]需要实施安乐死，因为GVHD显著被压制。基于这些结果，INX800和INX801二者似乎都是有效的VISTA激动剂，因为它们似乎有效抑制GVHD免疫应答。
实施例7：推定的激动性抗人VISTA抗体对CD3驱动的T细胞免疫应答的作用
还对相同的激动性抗人VISTA抗体(INX800和INX801)关于它们抑制CD3驱动的T细胞免疫应答的潜力的作用进行比较。在这些实验中，将板用OKT3(2.5μg/ml)包被。将T细胞与抗体预温育30分钟。然后将经抗体处理的T细胞添加至OKT3包被的平板中，并将T细胞在这些平板上培养72小时。作为抗体对CD3驱动的T细胞免疫应答的可能影响的读数，使用氚掺入法测定T细胞增殖，氚掺入法是一种广为接受的检测T细胞增殖的方法。如图7所示，与对照T细胞培养物相比，用INX800或INX801抗体处理的培养T细胞中T细胞增殖显著降低。
实施例8：推定的激动性抗人VISTA抗体对特定T细胞群体和总T细胞数量的作用
还进行了实验以便比较相同的抗人VISTA抗体(INX800和INX801)对特定T细胞的数量以及T细胞的总数的可能作用。进行这些实验是为了评估所观察到的主题抗人VISTA抗体对细胞因子和T细胞的作用是否可归因于细胞耗竭(非特异性作用)而不是这些抗体基于它们促进特异性VISTA介导的对免疫的免疫抑制作用来引发免疫抑制作用。
两种激动性抗人VISTA抗体(INX800和INX801)均对特定T细胞群体的数量或T细胞总数没有显著作用。此外，INX800和INX801抗体的结果基本相同。示例性实验的结果如图8所示。
基于此，观察到的INX800和INX801的激动作用似乎不归因于细胞耗竭。相反，这两种抗体看起来是基于它们促进特异性VISTA介导的对免疫的免疫抑制作用而引发对T细胞活化/增殖、GVHD免疫应答和促炎细胞因子表达的免疫抑制作用。
实施例9：不同激动性抗人VISTA抗体在不同免疫模型中的作用的总结
如下面表1和表2所示，评估了具有图4所示序列的不同抗人VISTA抗体的激动性或免疫抑制性作用。迄今已证明12种不同的嵌合抗人VISTA抗体具有免疫抑制性。迄今为止获得的一些结果汇总于表中。表位区组1(Bin 1)中的抗体都竞争结合至人VISTA，但不与表位区组2(Bin 2)中的抗体竞争VISTA结合。相反，表位区组2中的抗人VISTA抗体全部彼此竞争结合至人VISTA，但不与表位区组1中的抗体竞争。
表2中标为“不确定”的抗体引发不同的作用，包括在相同测定法中的免疫抑制作用或由于其他原因引发不明确的结果。如表1和表2所示，已经分离出总共12种抗人VISTA抗体，其在MLR测定法或ConA测定法和/或其他体外和体内测定法或自体免疫疾病模型、炎性疾病模型或GVHD疾病模型中是免疫抑制性的，并且模拟或激动人VISTA的免疫抑制作用。基于这些结果，预期可通过类似方法获得其他抗人VISTA抗体，包括具有相同或不同VISTA表位特异性的那些。
此外，图9中的实验比较了不同抗人VISTA抗体在ConA测定法中的作用以及对选定促炎细胞因子和炎症标志物(即IL-2、γ干扰素和IL-12p70)的表达的作用。
表1(人或人源化抗人VISTA抗体)
表2(鼠抗人VISTA抗体)
抗体 表位区组 抑制性？ MLR中的增殖 Kd,M
1E8* 1 是 ++ 未测定
GG8 1 是 ++ 未测定
GA1 2 不确定 _ 未测定
*在两种不同的IgG2形式中显示为免疫抑制性。
实施例10：通过B细胞表位作图确定抗人VISTA抗体的表位
使用专有的方法[ProArray UltraTM]，采用定制的肽阵列(利用人VISTA片段)来确定一些推定的激动性抗人VISTA抗体的表位特异性。基本上，通过将抗体样品与ProArrayUltraTM肽微阵列一起温育，然后与荧光标记的二抗温育，来进行肽-抗体结合的测定。在数个洗涤步骤之后，将ProArray UltraTM阵列干燥并使用高分辨率荧光微阵列扫描法进行扫描。
分别合成所有的肽(下面列出)，然后使用ProImmune的专有技术使之与ProArrayUltraTM载玻片表面结合。这种优化的方法确保肽以这样的方式呈现在阵列上：即严格模拟相应蛋白质区域的性质，避免游离肽本身固有的生理化学变化，并产生相容的、组合的肽和蛋白质阵列平台。将测试分析物(肽和蛋白质)以离散点分配到ProArray UltraTM载玻片上，并且适当的gal文件使得所得的阵列特征能够精确对准回至沉积的分析物。
通过将抗体样品(由顾客提供)与ProArray UltraTM载玻片一起温育，然后与荧光标记的二抗一起温育来确定肽-抗体结合。在最后的温育和洗涤步骤后，将微阵列干燥并在高分辨率微阵列扫描系统中扫描。
在扫描荧光标记的ProArray UltraTM载玻片后，扫描仪记录图像，使用图像分析软件评估该图像-从而能够解读和量化与所扫描微阵列载玻片上的每个荧光点相关的荧光强度水平。肽微阵列是基于由人VISTA多肽序列合成的重叠肽文库。基于序列，使用ProImmune的ProArray UltraTM技术产生各15个氨基酸的微阵列肽(12个氨基酸重叠)。所合成的肽的详细信息列于表3(下文)中。“位置”是指在衍生所述肽的多肽序列中的起始和终止氨基酸。将合成的肽以24个相同的亚阵列固定在ProArray UltraTM载玻片上，每个亚阵列包含在一式六份的斑点中的测试肽和对照特征。肽在下表3示出。
表3：ProArray UltraTM肽的详细信息
用特定抗人VISTA抗体进行的表位分析的结果总结在图4。
实施例11：表位分组测定法
另外，具有图4所示序列的一些抗人VISTA抗体的表位结合特性通过将这些抗体基于它们的结合特征置于不同的表位“区组”中来表征，如下文所述。
方法：将ProteOn XPR36系统(BioRad)用于进行表位分组。采用制造商关于胺偶联化学的说明书(BioRad，目录号176-2410)，用两组单克隆抗体(mAb)(每组6种)包被ProteOnGLC芯片(BioRad，目录号176-5011)。将竞争性mAb以过量(250nM终浓度)与人VISTA(25nM终浓度)一起在室温下预温育4小时，在该包被有包被mAb组的芯片上一次运行6个，缔合时间为4分钟，然后解离5分钟。每次运行之后，用100mM磷酸使芯片再生。
数据分析涉及通过配体对所有传感图进行分组并应用对准向导，其自动执行X轴和Y轴对准以及去除假象。然后对这些数据进性点间校正(Interspot correction)。
非竞争性mAb被定义为具有相同或>Al信号的结合信号(仅与人VISTA结合)。竞争性mAb定义为具有A1信号的结合信号(即仅与人VISTA结合)。例如，与VISTA复合的VSTB49和VSTB51不与包被在芯片上的VSTB85结合，因此被归类为与VSTB85竞争VISTA上的相同结合位点。用特定抗人VISTA抗体进行这种表位分组分析的结果汇总于图4。
实施例12：使用氢/氘(H D)交换研究对抗VISTA抗体进行表位作图
抗VISTA抗体的抗体表位可通过多种方法诸如丙氨酸扫描和氢/氘(H D)交换以及如前面实施例中所述的重叠肽阵列来鉴定。用于鉴定推定的激动性抗人VISTA抗体的表位的另一示例性手段描述如下。
为了鉴定人VISTA上VSTB50、60、95和112的表位，使用相应的Fab进行溶液氢/氘交换-质谱(HDX-MS)。对于H/D交换，用于分析Fab扰动的程序类似于先前描述的程序(Hamuro等(2003)J.Biomol.Techniques 14:171-182；Horn等(2006)Biochemistry 45:8488-8498)，进行了一些修改。使用Pierce Fab制备试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，目录号为44985)，利用木瓜蛋白酶消化和蛋白A捕获从IgG制备Fab。人VISTA蛋白质序列含有六个N-连接的糖基化位点。为了改善序列覆盖率，用PNG酶F使该蛋白质去糖基化。将去糖基化的VISTA蛋白在氘代水溶液中温育预定时间，从而导致在可交换的氢原子上掺入氘。使该氘代VISTA蛋白与46氧化氘(D20)中的VSTB50、VSTB60、VSTB95或VSTB112的Fab在4℃下复合30秒、2分钟、10分钟和60分钟。通过低pH淬灭交换反应，并用胃蛋白酶消化该蛋白质。根据LC-MS上的质量偏移监测所鉴定肽处的氘水平。作为参考对照，类似地处理VISTA蛋白，不同之处在于不使其与Fab分子复合。与Fab结合的区域被推断为相对受到保护而免于交换的那些位点，从而含有比参考VISTA蛋白更高比例的氘。该蛋白质的约94％可以作图定位到特定的肽。
绘制了VISTA与VSTB50/VSTB60和VSTB95/VSTB112的HDX-MS扰动图，并鉴定了两个表位组。抗VISTA VSTB50识别与VSTB60相同的表位；
VSTB95与VSTB112在VISTA上的另一个表位区域结合。抗VISTA VSTB50和60共享相同的表位，该表位包含以下区段：103NLTLLDSGL111(SEQ ID NO:59)和136VQTGKDAPSNC146(SEQ ID NO:60)；抗VISTA VSTB95和VSTB112似乎靶向相似的表位，所述表位包含以下片段：27PVDKGHDVTF36(SEQ ID NO:61)和54RRPIRDLTFQDL65(SEQ ID NO:62)。这些HDX-MS结果提供了具有图4中鉴定的序列的示例性抗VISTA抗体的肽水平表位。这两个表位组没有重叠的表位区域。这些结果与之前的竞争表位分组数据一致，因为它们不相互竞争。再次，如本文所述分析的各种抗人VISTA抗体的表位分析结果汇总于图4。
实施例13：用于鉴定激动性抗人VISTA抗体的测定法
如本文所公开的，我们已经鉴定了十二种激动性抗人VISTA抗体，并且一旦在前述免疫模型中进行进一步的确证性实验或用其他抗体重复，我们应该会拥有其他抗体。图4中以“VSTB”命名确定的抗体是完全人的、高亲和力的食蟹猴交叉反应性抗VISTA抗体(对于人的文库亲和力范围为298-24pM，对于食蟹猴为443-26pM)，基于如本文所述的多种激动性抗人抗体的成功分离，它们应该会导致其他激动性抗人VISTA抗体的鉴定，尤其是与表位组1或2结合的其他抗体。下面描述这些方法。
体外功能筛选
直接CD4介导：在该方法中，通过阴性选择从hV-KI脾细胞分离CD4+T细胞。然后将1×105个T细胞与50种VISTA mAb(20μg/ml)或同种型对照中的每一者在冰上温育30分钟。然后将T细胞和抗体置于抗CD3包被的96孔平底板上并培养72小时。在72小时时间点时，将氚标记的胸苷添加至培养物中8小时，以通过H3掺入测量增殖。使用该测定法，我们可以在一次实验(在技术上一式三份)中筛选全部50种mAb。每种抗体将在三个独立实验中测试以确认活性。与同种型对照相比，将增殖降低至统计学上显著的程度的MAb将被鉴定为“抑制性的”。然后在初始筛选中所鉴定的所有抑制性mAb将在相同测定法中重新测试，以产生剂量-反应曲线。将以半对数稀释度(30g/ml→0.01μg/ml)测试每种抗体，并针对增殖计算IC50值。将在原始人T细胞上确认在hV-KI测定法中鉴定为抑制性的所有抗体，并且通过针对增殖的IC50分值进行排序。
NHP交叉反应测定法：在该测定法中，我们将通过使用CD3克隆SP34(其驱动有效的T细胞增殖)，通过针对小鼠和人所述的相同的CD3介导的增殖测定法，筛选在相关分类物种食蟹猴(下文称为非人灵长类动物或“NHP”)中的功能活性。来自NHP的全血将从美国弗罗里达州的World Wide Primates公司(World Wide Primates,Florida，USA)获得，并将通过磁力分离法分离T细胞。将T细胞与抗体一起温育并在CD3包被的平板上培养72小时。通过氚掺入法测量增殖，并且将为每种抗体产生IC50分值。
使用体内动物模型进行功能筛选
1.在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
自体免疫性肝炎(AIH)是肝脏的一种慢性炎性疾病，其表征为丧失自身耐受性，从而导致针对肝脏的B细胞和T细胞应答。ConA模型代表了用于理解AIH发病机理的得到最佳表征的系统。ConA是一种凝集素，其与肝脏中富含的特定糖部分结合。ConA对这些糖残基的修饰可导致通过与肝巨噬细胞表达的经修饰MHC结构相互作用而快速激活CD4+T细胞。随着大多数经典T细胞细胞因子(IL-2、IL-3、IFNγ和TNFα)在4-6小时内达到峰值血浆水平，发生强烈但短暂的细胞因子产生。值得注意的是，ConA诱导的炎症可以通过耗竭CD4+T细胞来阻断。可将使用hV-KI小鼠的ConA模型用于证实根据本发明的激动性抗VISTA单克隆抗体的抑制活性。对小鼠进行称重并在注射15mpk的ConA前3小时用10mpk的抗VISTA抗体或适当的同种型对照处理。在这些小鼠中，腹膜内施用抗VISTA单克隆抗体，而经由尾静脉注射ConA。在ConA施用后6小时时间点，对小鼠实施安乐死并收集血液。然后通过针对32种细胞因子的多重测定法分析血浆级分的血浆细胞因子。每种抗体在独立实验中测试两次以确认活性。对于该32重测定法中的每种细胞因子，将进行单向ANOVA，使用Dunnett’s后检验将每种抗VISTA抗体与同种型对照进行比较。基于细胞因子抑制的功效(细胞因子被抑制多少)和变异性(每个实验内以及各实验之间抑制性的一致性如何)对所测抗VISTA单克隆抗体进行排序。还关注了抑制与T细胞活化相关的经典细胞因子的单克隆抗体。
如同日提交的相关PCT申请中以及上文中所公开的，数种根据本发明的抗人VISTA抗体在ConA模型中进行了筛选并且在其中是有效的(免疫抑制性)，即它们抑制ConA诱导的细胞因子产生并促进存活，并且特别是抑制T细胞活化所涉及的细胞因子(包括IL-2)的表达。特别地，本发明人测试了INX800、INX801和INX903和INX904以及激动性抗鼠VISTA抗体，并且全部在ConA肝炎模型中有效(免疫抑制性)。因此，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体应该可用于治疗/预防与某些慢性和急性感染性病症诸如肝炎相关的炎症和肝毒性。
2.在移植物抗宿主病动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
GVHD是同种异体T细胞过继转移到受照射的宿主中所介导的全身性疾病。在GVHD的发病机制中有五个主要步骤是关键的：1)对宿主的损害，最常见的是以T细胞转移之前的辐射事件的形式；2)宿主APC和供体APC二者活化同种异体T细胞；3)T细胞在淋巴结和脾脏中的扩增；4)运送到外周位点诸如皮肤、肠、肝脏和肺；5)由T细胞还有募集的髓样细胞驱动的宿主受损。在某些模型，诸如F1→亲本品系中，当小鼠发展出抗核mAb和免疫复合物介导的肾小球肾炎时，发生慢性GVHD，其是狼疮的合适模型。值得注意的是，来自供体T细胞的VISTA的遗传缺失会导致比接受野生型T细胞的小鼠中所见的更具侵略性的GHVD形式。
该测定法可用于鉴定和评定激动性抗人VISTA候选物的激动作用。该测定法也可用于证实根据本发明的激动性抗体可用于治疗或预防GVHD。在该模型中，对BALB/c小鼠进行致死性照射并给予来自hV-KI小鼠的同种异体骨髓和脾T细胞以诱导GVHD；其中一组不接受T细胞作为阴性对照。将接受同种异体T细胞的小鼠分成对照Ig组和处理组。将在单个实验中使用最多四种独特的VISTA单克隆抗体，每组8只小鼠，并且将进行两次重复实验。在T细胞转移时以及转移后第2天和第4天施用10mpk或另一剂量的抗体。将跟踪每只小鼠的体重，并且将处死体重减轻超过其初始起始体重的20％的任何小鼠。产生每个实验的KaplanMeier曲线，用log-rank统计检验将每种抗VISTA抗体与对照进行比较。若所有四种VISTA单克隆抗体完全防范GVHD，那么将在GVHD模型中进行剂量反应测定法，其中各组用10、3、1和0.3mpk的抗体处理。将计算每种抗体的LD50值。
如在同日提交的相关申请中以及上文中所公开的，在该动物模型中评价了许多根据本发明的激动性抗人VISTA抗体。所测的这些抗体在该模型中都是有效的(免疫抑制性)，即它们减轻了疾病的症状、减缓了疾病进展、减少了疾病相关的体重减轻并促进了存活。特别地，对INX800、INX801、INX901、INX902、INX903和INX904中的每一者进行了评价，并证明可在该动物模型中缓解或预防疾病症状。此外，使用A形式和B形式的INX901确定A或B形式在GVHD动物模型中同样有效。
3.在炎性肠病动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
炎性肠病(IBD)、克罗恩病和溃疡性结肠炎是由宿主免疫应答、遗传易感性、环境因素和肠腔内容物之间不完全确定和复杂的相互作用引起的。最近的全基因组关联研究报道了免疫细胞调节基因与IBD易感性之间的关联。在这些研究中表现出先天性和适应性免疫细胞内在基因，从而表明这些细胞群在IBD发病机理中的核心作用。目前存在超过50种人IBD动物模型。虽然没有一种模型能够完美地模拟人IBD，但许多模型可用于研究人疾病的多个方面，包括疾病发作和进展以及伤口愈合应答。
在一个完善确立的IBD模型中，用同基因脾CD4+CD45RBhi T细胞过继转移到T细胞和B细胞缺陷的受体小鼠中来起始肠炎症。CD4+CD45RBhi T细胞群主要含有经致敏活化的幼稚T细胞，其能够诱导慢性小肠和结肠炎症。该方法允许研究人员修改关键的实验变量，包括先天性和适应性免疫细胞群，以回答与疾病发病机理有关的生物学相关问题。另外，该方法提供精确的疾病发作起始和充分表征的实验时间进程，从而允许动态研究小鼠疾病进展的临床特征。通过该方法诱导的肠炎与人IBD具有许多共同特征，包括慢性大肠和小肠穿壁性炎症(由细胞因子诸如TNF和IL-12驱动的发病机理)，以及诸如消瘦之类的全身症状。因此，其为研究人IBD发病机理的理想模型系统。
如同日提交的相关PCT申请中所公开的，测试了根据本发明的激动性抗人VISTA抗体(INX901)并且显示在该IBD模型中是有效的。具体而言，该激动性抗体被证明可抑制细胞因子水平并有效预防或抑制(i)与结肠炎相关的体重减轻，(ii)与结肠炎进展相关的体重减轻，(iii)结肠缩短，(iv)炎性浸润物募集至结肠以及(v)结肠炎的发展。因此，根据本发明的激动性VISTA抗体可用于治疗IBD和相关的炎症和肠道病症。
4.在狼疮动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
狼疮是一种自体免疫病症或炎性疾病，其症状包括肾脏炎症、蛋白尿增加和脾肿大。有4种类型的狼疮，其中全身性红斑狼疮或(“SLE”)是最常见的形式。这种疾病可能是轻微或严重的，可影响主要器官系统。狼疮是一种原因不明的自体免疫病症，可能会导致肾脏炎症(称为狼疮性肾炎)，该炎症可影响身体从血液中过滤废物的能力，或者若严重的话可能会导致肾脏损害从而需要透析或肾移植。SLE也可能会导致肺部血压升高(称为肺动脉高压)，这可导致呼吸困难。另外SLE可能会导致神经系统和大脑的炎症，这可导致记忆问题、混乱、头痛和中风。另外SLE可能会导致大脑血管的炎症，这可导致高烧、癫痫和行为改变。SLE也可能导致动脉硬化或冠状动脉疾病-冠状动脉壁上沉积物的积聚-可导致心脏病发作。
如同日提交的相关PCT申请中所公开的，测试了根据本发明的激动性抗人VISTA抗体(INX903、INX901、INX901-A和INX901-B)和抗鼠VISTA抗体并且显示在不同的狼疮模型包括MRL/lpr狼疮模型、NZBWF-1狼疮模型和B6D2F模型中是有效的。B6D2F模型是一种鼠模型，其中通过将人VISTA敲入DDE1 CD8耗竭型脾细胞(供体)转移到B6D2F1宿主(受体)中来诱导SLE。在该模型中，供体CD4T细胞多克隆活化驱动同源宿主B细胞活化、扩增和它们产生导致肾病的自体抗体。转移了B6 CD8耗竭型细胞的B6D2F1模型的狼疮样特征包括：(1)免疫复合物性肾小球肾炎；(2)抗核抗体；(3)抗dsDNA抗体；(4)抗RBC抗体(库姆斯测试(Coombs)阳性)。此外，该模型符合肾脏疾病严重性基于性别的差异。
在3种不同的狼疮模型中，激动性抗人和鼠VISTA抗体被证明是有效的并且可以降低狼疮疾病发展的发病率、疾病进展，降低蛋白尿水平，抑制肾炎和肾脏损伤，减少T细胞活化和积累，减少B细胞活化和积累，以及抑制自体抗体的产生。具体而言，INX903、INX901、INX901-A和INX901-B显示可(i)减少T细胞增殖和活化，(ii)减少同源B细胞活化(MHCII表达)和积累，减少脾肿大，减少抗dsDNA IgG自体抗体生产以及减少I型干扰素信号(interferon signature)。这些免疫抑制作用也不受抗体的人IgG2恒定区是A形还是B形的影响。因此，根据本发明的激动性VISTA抗体可用于治疗狼疮和相关的炎症和自体免疫病症。
5.在牛皮癣动物模型中测试VISTA激动性抗体
咪喹莫特(IMQD)诱导的牛皮癣模型
使用咪喹莫特(IMQD)诱导的牛皮癣模型评价抗VISTA抗体治疗牛皮癣的能力。咪喹莫特(IMQD)是市售的含有TLR7/8激动剂的乳剂，其广泛用于皮肤病学病症如病毒感染和黑素瘤。多天施加IMQD至皮肤会导致角化细胞增殖所致的表皮增厚。另外，发生T细胞和髓样细胞的群体免疫浸润进真皮层中。IMQD的再次施用会产生类似于银屑病患者中观察到的皮肤病变。IL-17和IL-23被认为是针对IMQD的免疫应答所涉及的主要细胞因子。
如在同意日期提交的相关PCT申请中所公开的，测试了激动性抗VISTA抗体并显示其在这种牛皮癣模型中是有效的。具体而言，该抗体减少了浸润经咪喹莫特处理的皮肤的CD3+T细胞的数量。基于所观察到的结果，VISTA激动性抗体可用于治疗或预防牛皮癣和其他T细胞介导的自体免疫性或炎性皮肤病症。
6.在关节炎动物模型中测试VISTA激动性抗体
可以在不同的动物模型中测试抗VISTA抗体治疗关节炎的免疫抑制作用。如同日提交的相关PCT申请中所公开的，测试了抗鼠和抗人VISTA抗体并显示在广泛接受的关节炎模型，即胶原诱导的关节炎或CIA模型中是有效的。在该关节炎模型中测试了INX800、INX901、INX902和INX903以及抗鼠抗VISTA抗体。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(Charles River Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。
如这个PCT申请所示，这些抗体中的每一者都降低了关节炎疾病，并且INX901和INX902显著降低了疾病分值。基于这些结果，抗人VISTA激动性抗体可用于治疗或预防类风湿性关节炎和其他炎症或自体免疫病症。
实施例14：在不同的体外和体内模型中评价人IgG2骨架对α-人VISTA抗体INX901激动剂/免疫抑制活性的作用
天然人IgG2骨架上的抗体作为由重链铰链、CH1和轻链中存在的半胱氨酸之间的二硫键改组引起的亚型的混合物存在(Zhang,A.(2015),“Conformational difference inhuman IgG2 disulfide isoforms revealed by hydrogen/deuterium exchange massspectrometry”,Biochemistry,54(10),1956-1962；图10)。基于Dillon等所开发的方法(“Optimization of a reversed-phase high-performance liquid chromatography/mass spectrometry method for characterizing recombinant antibodyheterogeneity and stability”,J Chromatography A,1120(1),112-120)，通过RP-HPLC(图10)评估了这些亚型。相对于Dillon(同上)中的方法该优化方法使用梯度更缓且含量更高的有机流动相B。如下制备从INX901富集的单独的A型和B型：严格根据Dillon(同上)中所报道的条件，但结合以下步骤：缓冲液交换回DPBS并在富集反应后采用内毒素去除程序(图11)。
在准备这些实验的过程中，观察到A富集形式的逆转比预期更快地发生，并且残留的氧化还原试剂浓度低于预期。因此采用了快速离心的基于尺寸排阻的脱盐程序，这似乎在很大程度上阻止了这种逆转。如图10中的分图(A)所示，二硫键改组导致亚型A和B，以及A/B的过渡状态(复制自Zhang,A.等，2015)。(B)可通过RP-HPLC区分亚型(来自Zhang,A.等，2015的图)。(C)所观察到的INX901的RP-HPLC色谱图。
下面描述发明人优化的用于检测IgG2各亚型的RP-HPLC方法。在图11中：(黑线，顶部)色谱图示出了定义B型的明显的最左边的峰。(红线，底部)色谱图示出了定义A型的明显的右边的峰。
用于亚型检测的优化RP-HPLC方法
流动相A制备(0.1％v/v TFA水溶液)：
1.在1.0升量筒中测量1.0升Milli-Q水
2.使用1mL玻璃Hamilton注射器向该1L水中添加1.0mL TFA
3.将该溶液转移至1L瓶中，充分混合。
4.有效期限为制备后2周
流动相B制备(70％v/v IPA、20％v/v ACN、9.9％v/v水、0.1％v/v TFA)：
1.将700mL IPA测量到1.0L量筒中
2.将200mL ACN测量到250mL量筒中并转移至该装有700mL IPA的1.0L量筒中
3.将Milli-Q水添加到该装有700mL IPA和200mL ACN的1.0L量筒中，直至液体达到1.0L刻度。
4.使用1mL玻璃Hamilton注射器向该1L水中添加1.0mL TFA
5.将该溶液转移至1L瓶中，充分混合。
6.有效期限为制备后2周
RP-HPLC色谱条件
1.柱A(大管径)：Zorbax 300SB-C8,5μm,2.1x150mm，<<或者>>
2.柱B(窄管径)：Zorbax 300SB-C8,3.5μm,1x50mm
3.流动相A：0.1％v/v TFA水溶液
4.流动相B：70％v/v IPA、20％v/v ACN、9.9％v/v水、0.1％v/v TFA
5.流速：0.5mL/min(对于柱A)或0.25mL/min(对于柱B)
6.柱室：75.0±1.0℃
7.检测：214nm
8.RP-HPL流动相梯度(下表)
时间(分钟) 流动相B％
0 15
2 26
34 36
35 75
36 15
40 15
INX901二硫键亚型的富集方法
B型富集
1.向无内毒素的无热原管中添加：
2.1mL的INX901(5.66mg/mL)
792.6μL的1M Tris pH 8.0
495.4μL的无内毒素水
396.3μL另外的无内毒素水
237.8μL的100mM半胱氨酸
39.6μL的100mM胱胺
2.进行手指涡旋(finger vortex)(轻微地)，然后盖上盖于2-8℃下放置24小时
3.在室温下在0.3M NaOH中浸泡Pall microsep旋转浓缩器2小时，然后用10×DPBS冲洗3次，然后用无内毒素水冲洗3次。使用前在BSC中风干
4.按照供应商关于再生0.5mL内毒素移除柱的说明，对于步骤3使用0.2N NaOH/95％乙醇(室温下2小时)选项；使用1×DPBS作为最终平衡缓冲液
5.在独立的Pall microsep(如上所述准备)中浓缩约4,020μL反应物(来自步骤2)
6.以2,500×G浓缩35分钟至少于0.4mL(≥10×)，然后用4mL 1×DPBS重新稀释，再重复2次
7.以2,500×G浓缩15分钟至2mL以下，然后加回1×DPBS至2mL
8.将所有2mL缓冲液交换的样品添加至再生的、旋转干燥的、底部带盖的内毒素移除柱，将顶部盖紧，倒置，在室温下放置，再每隔约20分钟倒置3次，然后将样品离心取出到非热原管中(根据供应商的说明，在500×G下1分钟)，置于2-8℃下
A型富集
1.向无内毒素的无热原管中添加：
1750μL INX901(6.2mg/mL)
370μL无内毒素水
700μL 1M Tris pH8.0
435μL 8M GdCl
210μL 0.1M半胱氨酸盐酸盐(用1M母液新鲜制备)
35μL 0.1M胱胺-2HC(用1M母液新鲜制备)
(最体积为3500μL)
2.进行手指涡旋(轻微地)，然后盖上盖于2-8℃下放置24小时
3.按照供应商的说明准备#7-2mL Zeba离心柱(Thermo P/N 89890)，平衡进1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。
4.将500μL上述反应混合物上样到#7柱每一者上，并以1000×G离心2分钟(也按照供应商的说明)，收集到洁净的无热原管中。
5.置于去热原的PALL microsep中，离心总计1小时10分钟，浓缩至大约1.7mL，浓度约为5mg/mL
6.将上述全部约1.7mL添加至按照供应商的说明准备(包括在室温下在0.2M NaOH中过夜)的一个0.5mL内毒素移除离心柱(Thermo P/N88274)，平衡进1×DPBS中。在室温下放置约1小时，然后在4℃下再另外放置大约1小时，在两种情况下每隔15分钟翻转该盖好的管
7.通过500×G离心1分钟回收制备物(也按照供应商的说明)
8.回收体积：大约1.3mL，浓度为4.61mg/mL(所有浓度均基于NanoDrop的内置IgG，消光系数0.73)
IgG2 A型锁定变体和IgG2 B型锁定变体
特异性置换IgG2的氨基酸序列能够防止二硫化物改组，并且取决于突变将会导致A样或B样的锁定构象(Martinez等，(2008).“Disulfide connectivity of humanimmunoglobulin G2 structural isoforms”,Biochemistry,47(28),7496-7508；Allen等，(2009),“Interchain disulfide bonding in human IgG2 antibodies probed by site-directed mutagenesis”,Biochemistry,48(17),3755-3766)。
因此，本发明人设计了具有C233S(A锁定形式)或C127S(B锁定形式)突变(Eu编号方式)的INX901和INX908变体以匹配White等(2015)(“Conformation of the humanimmunoglobulin G2 hinge imparts superagonistic properties toimmunostimulatory anticancer antibodies”,Cancer Cell,27(1),138-148)使用的IgG2变体。下面列出恒定重链序列。
IgG2 C233S(A型锁定形式)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:63)
IgG2 C127S(B型锁定形式)
ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)
沉默Fc变体
本发明人通过在IgG1骨架上引入以下点突变，设计了具有沉默Fc区的INX901和INX908变体：L234A/L235A/G237A/P238A/H268A/A330S/P331S(McCarthy等(2015)，美国专利申请14/818864。美国华盛顿特区)。在一种类型的变体(INX901Si和INX908Si)中，重恒定区的CH1/铰链区是天然IgG1，其不支持天然IgG2的二硫键改组(图12，中间)。在第二种类型的变体(INX901HSi和INX908HSi)中，CH1/铰链区是天然IgG2，其支持二硫键改组(White,A.L.等，2015)(图12，底部)。下面列出了两种类型的变体的恒定重链序列。
具有沉默Fc的IgG1(INX901Si和INX908Si)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:65)
IgG2 CH1/铰链+IgG1沉默Fc(INX901HSi和INX908HSi)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:66)
图12中的实验就二硫键改组比较了INX901 Fc沉默变体的免疫特性。(顶部)IgG2骨架上的INX901表现出预期的A亚型、A/B亚型和B亚型的混合物。(中间)沉默IgG1骨架上的INX901Si作为单一亚型存在。(底部)INX901HSi具有IgG1沉默Fc区，CH1/铰链来自IgG2，其使得二硫键改组等同于天然IgG2。这些结果表明FcR结合似乎影响本发明抗体的激动剂特性。
实施例15：各种Ig骨架中的INX901和INX908的功能，以确定铰链区和Fc区的需要
我们进行了实验以评估抗人VISTA抗体INX901和INX908的重链的CH1/铰链区和Fc区的功能要求。在它们的原始状态下，两种分子都在天然人IgG2骨架上，因此是构象不同的亚型的混合物，从而导致二硫键改组。选择高细胞密度混合淋巴细胞反应(MLR)用于这些研究，因为先前的数据表明该测定法为INX901和INX908二者提供了稳健的功能读数。对INX901和/或INX908进行了以下修饰以研究特定亚型是否负责功能：向A或B亚型的生化倾斜(skewing)，将构象“锁定”为A型或B型的遗传修饰，以及嵌合分子，其中Fc被沉默并且CH1/铰链区来自IgG1(其中不发生二硫键改组)，或来自IgG2(其允许天然二硫键改组)。
该测定法的结果表明，无论是A形式、B形式还是表征天然IgG2的形式的混合物，INX901和INX908都保留功能。此外，INX901和INX908都需要活性的Fc区才能实现功能。
MLR是标准的免疫学测定法，其依赖于I类MHC和II类MHC错配以驱动同种异体T细胞应答。从两个错配的个体中分离外周血单核细胞，一起温育，由于这些错配，发生增殖和细胞因子产生。先前已报道高细胞密度条件(HCD)(意即具有>1×107个细胞/ml的培养物)体外阐明了抗体的激动功能。我们以前的数据表明INX901和INX908二者都能在MLR中在HCD条件下抑制NFα的表达。
在就每种抗体的IgG2二硫键亚型和/或Fc沉默进行遗传修饰或生化修饰后将HCDMLR测定法用于评估INX901和INX908功能。在运行MLR之前，每种抗体均通过ELISA证实结合重组VISTA。INX901被送往科罗拉多州路易斯维尔市(Louisville,CO)的Elion，LLC公司，在那里通过氧化还原将其修饰为主要是A型(INX901 A倾斜形式)或B型(INX901 B倾斜形式)。如先前实施例中所述，通过RP-HPLC确认倾斜。(图11)。每种抗体以及亲本INX901在HCD MLR中以剂量响应形式稀释，并通过Luminex测量细胞因子产生。先前的数据已表明TNFα和/或IL-2是亲本INX901抗体的抗体功能的稳健读数。在两个单独的MLR中，与IgG2对照相比，INX901亲本、INX901 A倾斜形式和INX901 B倾斜形式减少了TNFα和IL-2二者(图13)。
为了证实来自图13的数据，使用突变制备INX901的另外的变体以产生A型或B型的锁定变体。另外，制备具有完全沉默的Fc区的嵌合形式的INX901以测试Fc结构域的功能。INX901 Si是一种完全沉默的IgG1抗体。INX901 HSi具有完全沉默的IgG1 Fc，但还具有IgG2 CH1/铰链区，其能够实现与天然IgG2无法区分的二硫键改组。在运行MLR之前，每种抗体均通过ELISA证实结合重组VISTA。确认来自所述生化倾斜形式的数据，INX901的A锁定形式和B锁定形式二者都能够减少IL-2和TNFα二者的产生(图14)。相反，INX901的Si和HSi形式都不能减少IL-2和TNFα的产生(图14)。
为了证实来自图14的数据，对INX908抗体进行相同的突变以产生A型或B型的锁定变体。另外，制备具有完全沉默的Fc区的嵌合形式的INX908以测试Fc结构域的功能。INX908Si是一种完全沉默的IgG1抗体。INX908HSi具有完全沉默的IgG1 Fc，但含有IgG2 CH1/铰链区。在运行MLR之前，每种抗体均通过ELISA证实结合重组VISTA。确认用INX901变体获得的数据，INX908的A锁定形式和B锁定形式二者都能够减少IL-2和TNFα二者的产生(图15)。相反，INX908的Si和HSi形式都不能减少IL-2和TNFα的产生(图15)。
实施例15：使用PEPPSCAN方法对激动性抗体进行不连续表位作图
Pepscan使用肽阵列来确定线性和不连续表位二者。该方法是许多研究人员和公司用于确定抗体表位的公认方法。图16示意性地描述了用于鉴定根据本发明的各种激动性抗人VISTA抗体所结合的线性表位和不连续表位的技术。
CLIPS技术的原理
CLIPS技术在结构上将肽固定为确定的三维结构。这可产生甚至最复杂的结合位点的功能模拟物。CLIPS技术现在通常用于将肽库形成单环结构、双环结构或三环结构以及片层样折叠和螺旋样折叠。CLIPS反应发生在CLIPS支架的溴基团与半胱氨酸的巯基侧链之间。在温和条件下个反应快速且是特异的。利用这种简练的化学方法，天然蛋白质序列被转化为具有一系列结构的CLIPS构建体。
组合CLIPS文库筛选细节
CLIPS文库筛选开始于使用组合矩阵设计将靶标蛋白质转化为具有多达10,000种重叠肽构建体的文库。在固体载体上，合成线性肽矩阵，随后将其成形为空间限定的CLIPS构建体。呈现正确构象的不连续表位的两个部分的构建体以高亲和力结合抗体，对该亲和力进行检测和定量。呈现不完整表位的构建体以较低亲和力结合抗体，而不含该表位的构建体根本不结合。在迭代筛选中使用亲和力信息来详细定义表位的序列和构象。该表位分析的结果汇总如下。
抗体INX901、INX902、INX904、INX906、INX907、INX908
当在中等严格度条件下测试时，抗体INX901、INX902、INX904、INX906、INX907、INX908强烈结合线性表位模拟物和构象表位模拟物。结合的肽含有核心序列48NVTLTCRLLGPV60(SEQ ID NO:67)、79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)、123SDHHGNFS130(SEQID NO:69)和153HHHSEH158(SEQ ID NO:70)，其中肽段79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)是表位的主要部分。
对采用线性表位模拟物时所记录的数据另外进行分析使得我们能鉴定对INX904、INX906、INX907和INX908的结合而言重要的残基，因为在某些位置上的双Ala突变体显著降低了信号强度。具体而言，置换48NVTLTCRLLGPV60(SEQ ID NO:71)内的残基CR可影响INX906、INX907和INX908的结合。另外置换79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)内的残基TC可明显影响INX904和INX907的结合。
抗体INX800
当在中等严格度条件下测试时，抗体INX800不能可检测地结合线性表位模拟物和简单约束的表位模拟物，但显示出可检测的与不连续表位模拟物的结合。用不连续表位模拟物获得的数据分析表明，抗体INX800识别具有核心序列53TCRLLGPVDKG63(SEQ ID NO:72)、101HGGHQAA107(SEQ ID NO:73)、121SASDHHGNFS130(SEQ ID NO:74)和153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:75)的不连续表位，其中序列153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:76)代表主要的识别位点。
抗体INX803和INX804
当在高严格度条件下测试时，抗体INX803和INX804不结合阵列上存在的任何肽。当在中等严格度条件下测试时，两种抗体都结合不连续的表位模拟物。对结合图谱进行累积分析表明，两种抗体类似地识别肽段52LTCRLLGPV60(SEQ ID NO:77)、79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:78)、98HLHHGGHQAA107(SEQ ID NO:79)、123SDHHGNFS130(SEQ ID NO:80)、153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:81)，其中区域52LTCRLLGPV60(SEQ ID NO:77)是主要的识别位点。
抗体INX900
当在高严格度条件下测试时，抗体INX900非常弱地结合具有核心序列79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)的线性表位模拟物。值得注意的是，使用以下不连续的表位模拟物时观察到更高的结合，该表位模拟物除了序列79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)之外，还含有核心序列56LLGPVDKGHDVTFYK70(SEQ ID NO:82)、113LAQRHGLESASDHHG127(SEQID NO:83)、153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:84)。
抗体INX903
当在高严格度条件下测试时，抗体INX903不结合线性表位模拟物，但弱结合构象表位模拟物。对所记录的强度谱进行分析表明，抗体识别由核心序列79EVQTCSERR87(SEQ IDNO:85)、93TFQDLHLHHGGHQAA107(SEQ ID NO:86)、146CLVVEIRHHHSEH158(SEQ ID NO:87)构成的不连续表位，其中序列79EVQTCSERR87(SEQ ID NO:85)是该表位的核心。
抗体INX905
当在高严格条件下测试时，抗体INX905结合具有核心序列79EVQTCSERRP88(SEQ IDNO:88)的线性肽。采用双Ala突变体获取的数据表明，79EVQTCSERRP88(SEQ ID NO:88)内的基序RR对于识别是关键的。采用不连续表位模拟物时所记录的强度谱表明，添加肽序列53TCRLLGPVDKG63(SEQ ID NO:89)、123SDHHG127(SEQ ID NO:90)和153HHHSEHRVHGAM164(SEQ IDNO:91)可加强抗体的结合。图17示出了大多数激动性抗人VISTA抗体结合至相同的核心序列。图18还汇总了表位结果。图19示出了示例性的根据本发明的激动性抗人VISTA抗体所结合的表位并鉴定了与结合有关的重要残基。
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Claims (52)

1.一种分离的包含特异性地结合至人T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或抗体片段可激发或促进VISTA对免疫的一种或多种作用。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其包含人IgG2恒定区或人IgG2 Fc区。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述人IgG2恒定区或Fc区结合至Fcγ受体，包括人CD32A。
4.根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述IgG2恒定区或Fc区构成结合至Fcγ受体的天然人IgG2。
5.根据权利要求4所述的分离的抗体，其中所述FcγR包括以下中的一种或多种：hFcγRI(CD64)、FcγRIIA或hFcγRIIB(CD32或CD32A)以及FcγRIIIA(CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其与具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体竞争或者结合至包括具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体所结合的表位或与所述表位重叠的VISTA表位。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其与包含LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH的残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其与包含79EVQTCSERRPIR90、48NVTLTCRLLGPV60、153HHHSEHRVHGAM164、52LTCRLLGPV60、56LLGPVDKGHDVTFYK70、113LAQRHGLESASDHHG127、153HHHSEHRVHGAM164、93TFQDLHLHHGGHQAA107、146CLVVEIRHHHSEH158、53TCRLLGPVDKG63、123SDHHG127和/或153HHHSEHRVHGAM164的一个或多个残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其与包含79EVQTCSERRPIR90的一个或多个残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的激动性抗体或抗体片段，其可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对以下任一者或多者的抑制作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖诱导；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的诱导；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的诱导。
11.一种分离的包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性或拮抗性抗人VISTA抗体或其抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列具有与具有图4所示的CDR多肽及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体任一者相同的CDR多肽，前提条件是若所述抗体或抗体片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则所述抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
12.根据权利要求11所述的分离的抗体或抗体片段，其包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或片段，则所述抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
13.根据权利要求11或12所述的分离的抗体或抗体片段，其包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽具有至少90％序列同一性的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列在图4中示出，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或片段，则所述抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
14.根据权利要求11或12所述的分离的抗体或抗体片段，其包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽具有至少95％序列同一性的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列如图4所示，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则所述抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
15.根据权利要求11或12所述的分离的抗体或抗体片段，其包含与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽具有至少96％-99％序列同一性的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列如图4所示，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则所述抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
16.根据权利要求11或12所述的分离的抗体或抗体片段，其包含与选自VSTB49-VSTB116其中一者的抗人VISTA抗体的可变重链和/或可变轻链多肽相同的可变重链和/或可变轻链多肽，其中VSTB49-VSTB116的可变重链多肽和可变轻链多肽序列如图4所示，前提条件是若所述抗体或片段构成拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，则所述抗体或抗体片段不包含与VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同的CDR。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其可拮抗或阻断人VISTA对免疫的至少一种作用。
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其可激发或阻断人VISTA对免疫的至少一种作用。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其包含人恒定结构域。
20.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或抗体片段，其包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定结构域，所述人恒定结构域任选经修饰，例如通过缺失突变、置换突变或添加突变或上述突变的任何组合进行修饰。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段包含Fab、F(ab’)2或scFv抗体片段或者是Fab、F(ab’)2或scFv抗体片段。
22.根据前述权利要求中任一项所述的拮抗性抗人VISTA抗体或抗体片段，其可阻断或抑制人VISTA对免疫的至少一种作用，例如选自其对T细胞免疫、单核细胞活化、或T细胞增殖的抑制作用；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的抑制；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的抑制。
23.根据前述权利要求中任一项所述的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如选自其对T细胞免疫、单核细胞活化的抑制作用、T细胞增殖的抑制；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的抑制；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的抑制。
24.根据权利要求23所述的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其包含人IgG2恒定区或Fc区。
25.根据权利要求23或24所述的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其可促进或增强人VISTA对免疫的抑制作用，例如其对以下任一者或多者的作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖；细胞因子表达、单核细胞的存活、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。
26.根据权利要求中23-25中任一项所述的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其可抑制T细胞免疫和/或促炎细胞因子表达。
27.根据前述权利要求任一项所述的激动性抗体或抗体片段，其为包含人Fc区，如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或前述任一者的嵌合体的人型、人源化型或嵌合型抗体。
28.根据前述权利要求中任一项所述的激动性抗体，其为嵌合型、人型或人源化型。
29.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含可潜在进行突变的人IgG2恒定结构域或Fc区。
30.根据前述权利要求中任一项所述的激动性抗体，其包含人IgG2恒定结构域或其片段或者hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链结构域和CH1结构域以及任选整个或基本上整个轻链恒定区已用hIG2的相应的整个或基本上整个轻链以及铰链结构域和CH1结构域(“H2区”或“H2结构域”)置换。
31.根据前述权利要求中任一项所述的激动性抗体，其(i)包含IgG2 Fc区，其中第127位的重链半胱氨酸残基和第214位的轻链半胱氨酸残基(其中编号方式是根据Kabat)中的一者或二者缺失或改变成不同的氨基酸残基，从而导致所得的经修饰的抗体的激动特性相对于其中这些残基未改变的抗体增加，(ii)所述抗体的H2区中第214位的半胱氨酸残基被突变或用另一个氨基酸置换和/或重链的第127、232或233位的半胱氨酸残基中的一者或多者缺失或用另一个氨基酸置换，(iii)其包含人IgG2恒定结构域，其中至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一个氨基酸，(iv)其与VSTB95(可变重链序列和可变轻链序列如图4所示)竞争或与VSTB95结合至人VISTA上的相同表位。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR以及SEQ ID NO:103、104和105的VL CDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR以及SEQ ID NO:113、114和115的VL CDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR以及SEQ ID NO:123、124和125的VL CDR；
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(xxxvi)包含SEQ ID NO:450、451和452的VH CDR以及SEQ ID NO:453、454和455的VLCDR；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:460、461和462的VH CDR以及SEQ ID NO:463、464和465的VLCDR；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR以及SEQ ID NO:473、474和475的VLCDR；
(xxxix)包含SEQ ID NO:480、481和482的VH CDR以及SEQ ID NO:483、484和485的VLCDR；
(xl)包含SEQ ID NO:490、491和492的VH CDR以及SEQ ID NO:493、494和495的VL CDR多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR以及SEQ ID NO:503、504和505的VL CDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR以及SEQ ID NO:513、514和515的VL CDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR以及SEQ ID NO:523、524和525的VLCDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR以及SEQ ID NO:533、534和535的VL CDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR以及SEQ ID NO:543、544和545的VL CDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR以及SEQ ID NO:553、554和555的VL CDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR以及SEQ ID NO:563、564和565的VLCDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR以及SEQ ID NO:573、574和575的VLCDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR以及SEQ ID NO:583、584和585的VLCDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR以及SEQ ID NO:593、594和595的VL CDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR以及SEQ ID NO:603、604和605的VL CDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR以及SEQ ID NO:613、614和615的VL CDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR以及SEQ ID NO:623、624和625的VLCDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR以及SEQ ID NO:633、634和635的VL CDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR以及SEQ ID NO:643、644和645的VL CDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR以及SEQ ID NO:653、654和655的VL CDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR以及SEQ ID NO:663、664和665的VLCDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR以及SEQ ID NO:673、674和675的VLCDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR以及SEQ ID NO:683、684和685的VL CDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR以及SEQ ID NO:693、694和695的VL CDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR以及SEQ ID NO:703、704和705的VL CDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR以及SEQ ID NO:713、
714和715的VL CDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR以及SEQ ID NO:723、
724和725的VL CDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR以及SEQ ID NO:733、
734和735的VL CDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR以及SEQ ID NO:743、744和745的VL CDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR以及SEQ ID NO:753、
754和755的VL CDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR以及SEQ ID NO:763、
764和765的VL CDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR以及SEQ ID NO:773、774和775的VLCDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR以及SEQ ID NO:783、
784和785的VL CDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR以及SEQ ID NO:793、794和795的VL CDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR以及SEQ ID NO:803、
804和805的VL CDR；
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR以及SEQ ID NO:813、
814和815的VL CDR。
33.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其：
(i)包含SEQ ID NO:106的VH多肽以及SEQ ID NO:108的VL多肽；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽以及SEQ ID NO:118的VL多肽；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽以及SEQ ID NO:128的VL多肽；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽以及SEQ ID NO:138的VL多肽；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽以及SEQ ID NO:148的VL多肽；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽以及SEQ ID NO:158的VL多肽；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽以及SEQ ID NO:168的VL多肽；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽以及SEQ ID NO:178的VL多肽；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽以及SEQ ID NO:188的VL多肽；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽以及SEQ ID NO:198的VL多肽；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽以及SEQ ID NO:208的VL多肽；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽以及SEQ ID NO:218的VL多肽；(xiii)包含SEQ IDNO:226的VH多肽以及SEQ ID NO:228的VL多肽；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽以及SEQ ID NO:238的VL多肽；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽以及SEQ ID NO:248的VL多肽；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽以及SEQ ID NO:258的VL多肽；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽以及SEQ ID NO:268的VL多肽；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽以及SEQ ID NO:278的VL多肽；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽以及SEQ ID NO:288的VL多肽；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽以及SEQ ID NO:298的VL多肽；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽以及SEQ ID NO:308的VL多肽；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽以及SEQ ID NO:318的VL多肽；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽以及SEQ ID NO:328的VL多肽；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽以及SEQ ID NO:338的VL多肽；
(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽以及SEQ ID NO:348的VL多肽；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽以及SEQ ID NO:358的VL多肽；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽以及SEQ ID NO:368的VL多肽；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽以及SEQ ID NO:378的VL多肽；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽以及SEQ ID NO:388的VL多肽；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽以及SEQ ID NO:398的VL多肽；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽以及SEQ ID NO:408的VL多肽；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽以及SEQ ID NO:418的VL多肽；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽以及SEQ ID NO:428的VL多肽；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽以及SEQ ID NO:438的VL多肽；
(xxxv)包含SEQ ID NO:446的VH多肽以及SEQ ID NO:448的VL多肽；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽以及SEQ ID NO:458的VL多肽；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽以及SEQ ID NO:468的VL多肽；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽以及SEQ ID NO:478的VL多肽；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽以及SEQ ID NO:488的VL多肽；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽以及SEQ ID NO:498的VL多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽以及SEQ ID NO:508的VL多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽以及SEQ ID NO:518的VL多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽以及SEQ ID NO:528的VL多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽以及SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽以及SEQ ID NO:548的VL多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽以及SEQ ID NO:558的VL多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽以及SEQ ID NO:568的VL多肽；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽以及SEQ ID NO:578的VL多肽；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽以及SEQ ID NO:588的VL多肽；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽以及SEQ ID NO:598的VL多肽；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽以及SEQ ID NO:608的VL多肽；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽以及SEQ ID NO:618的VL多肽；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽以及SEQ ID NO:628的VL多肽；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽以及SEQ ID NO:638的VL多肽；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽以及SEQ ID NO:648的VL多肽；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽以及SEQ ID NO:658的VL多肽；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽以及SEQ ID NO:668的VL多肽；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽以及SEQ ID NO:678的VL多肽；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽以及SEQ ID NO:688的VL多肽；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽以及SEQ ID NO:698的VL多肽；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽以及SEQ ID NO:708的VL多肽；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽以及SEQ ID NO:718的VL多肽；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽以及SEQ ID NO:728的VL多肽；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽以及SEQ ID NO:738的VL多肽；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽以及SEQ ID NO:748的VL多肽；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽以及SEQ ID NO:758的VL多肽；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽以及SEQ ID NO:768的VL多肽；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽以及SEQ ID NO:778的VL多肽；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽以及SEQ ID NO:788的VL多肽；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽以及SEQ ID NO:798的VL多肽；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽以及SEQ ID NO:808的VL多肽；以及
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽以及SEQ ID NO:818的VL多肽。
34.根据权利要求32或33所述的抗体,其包含人IgG2恒定结构域，其中任选至少一个半胱氨酸缺失或改变成另一氨基酸。
35.根据前述权利要求中任一项所述的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其介导以下免疫抑制作用中的任一种或至少一种的组合：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
36.一种药物组合物或诊断组合物，其包含至少一种根据上述权利要求任一项的拮抗性或激动性抗体或抗体片段。
37.一种治疗和/或诊断方法，或含有至少一种根据前述权利要求任一项所述的拮抗性抗体或抗体片段的组合物用于诊断或治疗用途的用途，所述方法或用途包括给有需要的受试者施用至少一剂量的包含治疗或诊断有效量的至少一种根据前述权利要求任一项所述的拮抗性抗体或抗体片段的组合物或含有根据上述权利要求任一项的组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其用于治疗癌症或感染性障碍。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症是血癌或实体瘤，如被包含髓样细胞、T细胞或髓样细胞和T细胞的组合的肿瘤基质包围的实体瘤。
40.根据权利要求38所述的方法，其用于治疗选自白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征或骨髓瘤、肺癌或它们的组合的癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述白血病包含急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓样(髓性)白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)；毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病或成人T细胞白血病。
42.一种治疗和/或诊断方法，或含有至少一种根据前述权利要求任一项所述的激动性抗体或抗体片段的组合物用于诊断或治疗用途的用途，所述方法或用途包括给有需要的受试者施用至少一剂量的包含治疗或诊断有效量的至少一种根据前述权利要求任一项所述的激动性抗体或抗体片段的组合物或含有根据上述权利要求任一项的组合物。
43.根据上述权利要求任一项所述的任何激动性抗体或抗体片段用于在体外和/或体内实现以下免疫抑制作用任一种或以下免疫抑制作用至少一种的组合的方法或用途：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、
(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、
(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的方法和用途，其用于在人受试者中治疗或预防变态反应、自体免疫、移植、基因疗法、炎症、癌症、GVHD或败血症，或者用于治疗或预防与上述任一者相关的炎症、自体免疫或变应性副作用。
45.根据前述权利要求任一项所述的抗VISTA抗体或抗原结合片段或组合物、或者方法或用途，还包含另一免疫调节抗体或融合蛋白，其选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
46.根据前述权利要求任一项所述的方法或用途，其包括在治疗之前、治疗同时和/或治疗之后测定个体的细胞中或体液中的VISTA蛋白。
47.根据前述权利要求任一项所述的方法或用途，其包括测定造血细胞上的VISTA水平。
48.根据前述权利要求任一项所述的方法或用途，其包括测定选自髓系细胞和/或淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞中的任何一种或多种的造血细胞上的VISTA水平。
49.根据前述权利要求任一项所述的方法或用途，其中所述激动性抗人VISTA抗体或片段包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR和可任选进行突变的人IgG2 Fc区。
50.根据权利要求49所述的方法或用途，其中所述IgG2恒定区或Fc区保留天然FcR结合和/或结合CD32A的能力。
51.根据前述权利要求任一项所述的抗体、组合物、方法或用途，其中所述抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，其在37℃下通过表面等离振子共振测定为50M或更低。
52.根据前述权利要求任一项所述的抗体、组合物、方法或用途，其中所述抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，其在37℃下通过表面等离振子共振测定为1nM或更低。
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