CN1179976C - 产生凝血因子ⅷ的生产方法和宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的重组凝血因子VIII、及其生产方法以及作为治疗甲型血友病的药物组合物。更具体地说，本发明涉及人源凝血因子VIII基因的改建，使其在哺乳动物细胞表达体系中的表达量增加。本发明还提供了含该凝血因子的药物组合物，该组合物对甲型血友病患者的血浆有明显的促进凝血的生物活性。

Description

产生凝血因子VIII的生产方法和宿主细胞

本发明涉及新的重组凝血因子VIII(简称为“FVIII”，又称为抗血友病因子(AHF))及其生产方法，以及含有该重组凝血因子VIII的作为治疗甲型血友病的药物组合物。

甲型血友病是一种常见的X性连锁遗传性出血性疾病，在男性中的发病率为1∶10,000[Levinson B.，Jonco R.，Phillips III J.et al.，Nucl.Acids.Res.，1987，15(23)：9797-10001]，在所有血友病中占85％。其致病因素是由于FVIII的数量不足或质量异常所致。目前对该病的治疗主要采用从血浆中提取的浓缩FVIII制剂，虽具有一定的疗效，使患者的寿命有所延长，但仍存在治疗费用昂贵和容易受病毒感染的问题。

国内外对甲型血友病的治疗和FVIII的研究开展已有很长的历史。特别是1984年FVIII cDNA克隆及表达的成功[Gitschier J.，Wood W.I.，Goralka T.M.，et al.，Natrue，1984，312：326-330；Toole J.J.，Knopf J.L.，Wozney J.M.，et al.，Nature 1984，312：342-345 Vehar G.A.，Keyt B.，Eaton D.，et al.，Nature，1984，312：337-342；Wood W.I.，Capon D.J.，Simonsen C.C.，etal.，Nature，1984，312：330-326]，无疑为甲型血友病患者带来巨大的福音，这预示可通过生物工程技术生产大量高纯度的重组FVIII(rFVIII)，为临床提供高效、廉价、安全的FVIII代用品。目前对rFVIII进行的体外及体内试验表明，rFVIII具有与血浆FVIII相似的生化、免疫及药理学特性，亦能纠正血友病患者的出血倾向[Roberts H.R.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1991，614：106-114；Aronson D.L.，Transfusion.1990，30(8)：748-754]。

FVIII的生理功能是在内源性凝血系统中，在二价金属离子及磷脂的存在下，以辅酶的形式参与FIXa对FX的激活。FVIII是一种高分子糖蛋白，从血浆和重组细胞培养上清中分离纯化得到活性(或激活后)的FVIII由两条链组成，重链分子量为90-200KD不等，轻链的分子量为80KD，两条链通过二价离子非共价连接。由于FVIII分子的异质性，在血浆中的浓度极微(0.1-0.2ug/ml)，对蛋白酶又很敏感，使分离纯化非常困难。直到1984年，FVIII的cDNA序列被阐明后，对FVIII的结构与功能的研究才有所突破。

人的FVIII基因定位于X染色体长臂末端(Xq28)，约占X染色体的0.1％，长186kb，由26个外显子及25个内含子组成。外显子大小为69-3106bp，内含子大小为207-32，400bp(Gitschier，J.，Wood，W.I.，Goralka，T.M.，etal.，Natrue，1984，312：326，Vehar，G.A.，Keyt，B.，Eaton，D.，et al.，Nature 1984，312：337)。

FVIII的mRNA长9kb，编码一条由2351氨基酸组成的前体肽，其中N-端19个氨基酸为信号肽，成熟的FVIII由2332个氨基酸组成(Ala¹-Tyr²³³²)。对FVIII的氨基酸序列分析表明，它由三种结构域组成：A结构域(330-380aa)、B结构域(980aa)和C结构域(150aa)。在FVIII中，各结构域中的排列为A1-A2-B-A3-C1-C2。A区间有30％氨基酸相同，C区间有37％氨基酸相同，B区完全由外显子14编码，富含天冬酰胺糖链(Asn-X-Thr/Ser)。FVIII共有25个天冬酰胺糖基化位点，其中19个在B区，有23个Cys残基，大部分分布于A区及C区。此外，在A1-A2及B-A3间，各有一富含酸性氨基酸的间隔区，分别含36及41个残基(Kaufman，R.J.，Wasley，L L.，Dorner，A.J.，et al，J Biol.Chem.1988，263：6352)。另一作为辅酶的凝血因子V(FV)，无论在结构与功能上都与FVIII相类似。FV亦有三个A区，一个B区及两个C区组成，各区的排列顺序也与FVIII相同。此外FVIII有30％氨基酸与铜蓝蛋白相同(Ryden，L.and Biork，I.，Biochemistry，1976，15：3411；Pittman，D.D.and KaufmanR.J.，Thromb.Haemost.，1989，61(2)：161)，后者也与FVIII有类似的三个A区构成。在铜蓝蛋白中，与Cu²⁺结合的氨基酸残基在FVIII的A1和A3结构域中高度保守，这表明FVIII的A结构域可能和金属离子的结合有关。用原子吸收光谱证明FVIII中的金属离子就是Cu²⁺(Bihoreau.N.，Pin，S，de-keisabiee-AM，et al.Eur.J.Biochem.1994，222(1)：41)，这可以解释为什么FVIII和铜蓝蛋白有相当的同源性。FVIII的C结构域则与盘状蛋白(discoidin)及鼠乳脂球结合蛋白极其相似(Poole，S.，Firtel，R.A.，Lamar，E.，et al J.Mol.Biol.，1981，153：273)。

有980个氨基酸残基组成的B结构域在FVIII激活过程中由蛋白酶水解而释放出来，比较猪的FVIII和人的FVIII的氨基酸序列发现，两者的A2及A3结构域极其类似，有80-85％氨基酸相同，而两者的B结构域则完全不同(Pittman，D.D.and Kaufman R.J.，Thromb.Haemost.1989，61(2)：161)。从猪血浆中提取的FVIII浓制剂亦可用于甲型血友病的治疗，据此推测B结构域对FVIII的凝血活性并非必需。利用DNA重组技术逐渐增加B结构域序列的缺失，直至B结构域完全缺失，将这些缺失B区的cDNA的分子在真核细胞中表达，发现所表达的蛋白质其特异的凝血活性及被凝血酶激活的特性与野生型分子相同。且B结构域缺失的FVIII也能与vWF结合。重组的野生型及B结构域缺失的FVIII注射FVIII缺乏的狗后，均能校正其出血倾向。与野生型相类似，B结构域缺失型FVIII的生物半衰期为13小时，这表明B结构域的缺失在体外及体内对FVIII均无影响。

B结构域存在的生物学意义仍不十分清楚，FV与FVIII具有类似的辅酶活性并高度糖基化，但两者的B结构域极其不同。FV的部分B结构域可作为FXIII转谷氨酰酶的底物(Francis，R.T.，McDonagh，J.，Mann，K.G.，J.Biol.Chem.1986，261：9787)，对野生型及缺失B结构域的FVIII研究表明，FVIII的B结构域或许以某些精细的方式调节FVIII。首先，与野生型分子比较，缺失B结构域的FVIII对凝血酶水解的敏感性增加(Eaton，D.L.，Wood，W.I.，Eaton，D.，et al.Biochemistry 1986，25：8342)。这表明，B结构域对FVIII有一定的保护作用，免遭凝血酶的水解，这或许是由于B结构域的高度糖基化所产生的空间障碍；其次，缺失B结构域的分子表达水平高于野生型5-10倍(Pittman，D.D.and Kaufman R.J.，Thromb.Haemost，1989，61(2)：161)，这些说明B结构域可能对调节FVIII在体内加工和分泌有一定作用。

vWF(血管性假血友病因子)对FVIII活性的调节也相当重要的调节作用。vWF缺乏症(von Willebrand病，vWD)是一类常染色体异常的遗传性疾病，虽然vWD与甲型血友病是二种性质完全不同的遗传性疾病，但二者的区别曾混淆多年。这是由于vWD患者常伴有某种程度的FVIII活性降低；另外，早期制备的抗血友病因子(AHF)不仅能纠正血友病患者的出血倾向，也能恢复vWD患者的血小板聚集功能(Kaufman，R.J.，Nature 1987，342：207)。目前已知，FVIII与vWF是结构与功能完全不同的二种蛋白。vWF的主要功能有：a)在止血过程中起桥梁作用，可促使血小板的粘附和聚集。b)是血浆FVIII的载体，可与其结合并使其稳定。

vWF如何调节血浆FVIII的水平目前仍不清楚。目前看来，FVIII是由肝细胞合成的凝血因子，而vWF则由内皮细胞及巨噬细胞合成，在血液循环中二者以复合物的形式存在(Mayadas，T.N.and Wayner，D.D.，Ann.N.Y.Acad.Sci.1991，614：153；Wagner，D.D.，Ann.Rev.Cell.Biol.1990，6：217，Weiss，H.J.，Ann.N.Y.Acad.Sci.1991，614：125)，但二者形成复合物的确切部位仍不清楚。vWF在血浆中的浓度(5-10ug/ml)比FVIII(0.2ug/ml)高得多，vWF每分子亚基可结合一分子FVIII，也就是说仅1/100量的vWF与FVIII结合，故在血液循环中许多vWF分子并不载有FVIII。

FVIII极易被蛋白酶水解，体外及体内实验均表明，vWF对FVIII具有稳定作用。一般而言，FVIII在血浆中的正常浓度依vWF而定。在重型vWD时，由于血液中完全缺乏vWF，使FVIII极其不稳定而伴随有FVIII浓度的显著降低，但在正常及轻型vWD时，FVIII活性和vWF含量间有良好的对应关系。当给甲型血友病患者注入含有vWF的AHF时，FVIII的半衰期为12小时，当注入不含有vWF的AHF时，其半衰期与前者相似，推测这是由于注入的FVIII能与vWF快速结合的缘故。相反，当给严重的vWD患者输入纯的FVIII制剂时，FVIII的半衰期为2.4小时，被迅速清除。将vWF输入伴有FVIII降低的vWD患者时，FVIII水平可恢复正常。这些结果表明，vWF不仅通过直接稳定血浆中的FVIII，且可能通过其它机制而影响FVIII的生物合成及代谢。

研究表明，vWF可促进FVIII轻链与重链的组装(Wise，R.J.，Dornev，A.J.，Krane，M.，et al.J.Biol.Chem.，1991，266：21948；Fay，P.J.，Arch.Biochem.Biophys.1988，262：525)，在产生FVIII细胞的培养基中，vWF为FVIII活性积累的必需成分之一。在缺乏vWF的培养基中所分泌的FVIII为彼此不结合的二条肽链，并逐渐降解。这表明，在vWD患者体内FVIII浓度降低的部分原因或许是由于肝细胞中缺乏vWF，所分泌的FVIII轻链与重链不能组装，vWF是否直接调节FVIII基因的表达目前仍不清楚。

vWF调节FVIII的活性或许还通过其他一些机制(Anderson，L.O.，Brown，J.E.，Biochem.J.，1981，200：161；Lajmonvich A.，Hodry-Clergeon G.，Frayssinet J.M.，et al.Biochem.Biophys.Acta.1981，678：123)。vWF可抑制FVIII与磷脂及血小板上的受体的结合，且可拮抗FXa对FVIII的激活作用及活化的蛋白C(activated protein C，APC)对FVIII的灭活作用，但vWF却可促进凝血酶对FVIII轻链的水解。这些效应或许均由于vWF阻止FVIII与磷脂的结合有关。因为FXa对FVIII的激活及APC对FVIII灭活均需有磷脂参与，而磷脂的存在与否对凝血酶水解FVIII并无影响。

成熟vWF亚基的N-端1至272位氨基酸残基区域是其与FVIII结合的主要部位，而FVIII轻链的N-端是与vWF相互作用的部位(Foster P.A.，Fulcher，C.A.，Marti，T.，et al.J.Biol.Chem.1987，262：8443；Takahashi，Y.，Kalafatis，M.，Girma，J.P.，et al Blood 1987，70：1679)。这一区域即处于FVIII的第二酸性区，当FVIII被凝血酶激活后，此区域可被除去，FVIII便从vWF中释放。通过DNA重组技术，产生出不含这一酸性区的FVIII轻链，则不再能与vWF结合，但仍具有与野生型相似的凝血活性。将轻链N-端48个氨基酸残基除去后所产生的FVIII在快速沉淀分析实验中也不能与vWF结合。用识别FVIII的第二酸性区1674aa-1684aa的单抗可阻断FVIII和vWF的结合，更精确定位了FVIII上vWF的结合位点，位于FVIII片段1669-1689中(James，W.P.，Bruce，C.K.David，N.F.，Blood 1991，77(9)：1929；Anja，L.Harm.B，van Schijnder J.Biol.Chem.1991，266(2)：740)。

轻链的1664及1680处的二个Tyr残基在蛋白翻译后加工过程中可被磺基化。为了研究翻译后加工对蛋白活性的影响，用定点突变的方法将Tyr1680→Met，结果发现虽然在表达体系中加有vWF，而这种突变分子与vWF的亲和力大大降低，使产生的FVIII蛋白质极其不稳定，但仍具有正常的凝血活性，对一例具有Tyr1680→Phe点突变的中型血友病的检测发现，该患者的FVIII抗原为20％，而FVIII的活性为10％，这些结果均表明，轻链1680位磺化的Tyr为FVIII与vWF结合的必需氨基酸残基。除此以外，仍有其他因素影响FVIII与vWF的相互作用。

通过多年来对FVIII的研究表明，基因工程重组FVIII是治疗甲型血友病的理想药物，但由于费用高居不下，推广有较大的困难。此外，研究发现FVIII在体外的表达量明显低于与其性质和结构类似的基因(如凝血因子V和vWF)，这说明细胞内存在对FVIII表达的负调控机制，使FVIII在细胞内的水平保持在一较低的状态。这可能是机体对FVIII需求的反映，但对通过体外重组表达FVIII来讲是一主要障碍。除此之外，目前对血友病的基因治疗的尝试中也发现维持FVIII的表达量距治疗水平的要求仍有较大的距离。

因此，本领域迫切需要开发新型的重组凝血因子VIII，以及高效表达生产凝血因子VIII的方法。

本发明的目的就是通过对人源凝血因子VIII基因序列的改建，提供一种新的凝血因子VIII，以及使该凝血因子VIII在哺乳动物细胞表达体系中的高效表达的方法。

在本发明的第一个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞是幼仓鼠肾细胞HL-1，保藏号为CCTCC No：C200007。

在本发明的另一个方面，提供了一种产生凝血因子VIII的方法，包括步骤：

(1)在适合表达所述凝血因子VIII重链和轻链的条件下，培养权利要求1所述的宿主细胞，从而表达出所述的凝血因子VIII的重链和轻链，形成重组的凝血因子VIII；和

(2)分离所述的凝血因子VIII。

本发明的本发明人经过多年研究，意外地发现凝血因子VIII基因结构对其在哺乳动物中的表达有较大的影响，因此对凝血因子VIII的结构进行了改进，从而完成了本发明。

在本发明中，使用如下定义：

本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的药物组合物。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本文中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

本文中，术语“安全有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的治疗反应而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“安全有效量”因各种因素而异，如受治疗的特殊病情、患者的身体条件、受治疗的哺乳动物的种类、疗程、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、所应用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。

本文中，“药物载体”是用于将凝血因子VIII传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，可根据给药方式而选择的。

本文中，“甲型血友病”指人由于血液中凝血因子VIII数量不足或质量异常而造成的凝血障碍性疾病。

在本文中，“凝血因子VIII多肽”指凝血因子VIII、凝血因子VIII轻链和/或重链。

首先，本发明提供了改造的凝血因子VIII重链和轻链及其编码序列。重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，包括了19个氨基酸的信号肽(1-19位)和740个氨基酸的成熟肽(20-759位)；核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中第63-2285位为成熟重链的编码序列。轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，包括了19个氨基酸的信号肽(1-19位)和771个氨基酸的成熟肽(20-790位)；核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中第58-2373位为成熟轻链的编码序列。

与天然的凝血因子VIII基因结构相比，本发明的凝血因子VIII的多核苷酸序列缺失了B结构域，并且缺失了天然凝血因子VIII中5’和3’的非翻译区。在一个实例中，在5’端起始密码子前人工加入了Kozak顺序，从而有助于基因表达。在另一实例中，根据FVIII在体内活化过程中被蛋白酶加工分成重链和轻链，才能产生有生物活性的FVIII的现象，分别构建编码FVIII的重链和轻链的cDNA，使其在同一哺乳动物细胞中表达，从而提高重组凝血因子VIII的表达量。

此外，本发明还提供了含有上述重链和/或轻链的凝血因子VIII。

本发明还提供凝血因子VIII蛋白或多肽的类似物。这些类似物与本发明SEQ ID NO：2和4所示的凝血因子VIII重链和轻链的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“凝血因子VIII蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成凝血因子VIII的重链或轻链。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

                 表I

最初的残基

代表性的取代

优选的取代

Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
			Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Ash(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
			Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2或4的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2或4的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明的凝血因子VIII核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列片段。然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或凝血因子VIII编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

本发明中，凝血因子VIII的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，JBio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

本领域的技术人员熟知的方法，能用于构建含凝血因子VIII编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。优选的宿主细胞是肝细胞、肾细胞、CHO。更佳地，宿主细胞是干细胞和肾细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的凝血因子VIII。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码凝血因子VIII的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在本发明的一个实例中，使分别编码凝血因子VIII重链和轻链的cDNA在同一细胞株中进行共表达。也可以使两种分别表达的凝血因子VIII重链和轻链cDNA的细胞株混合后产生重组的FVIII。

另一种优选方法是，在分离纯化凝血因子VIII之前，将重组的vWF与重组的凝血因子VIII在细胞外混合，从而起到稳定保护FVIII因子活性的作用。由于聚合形式存在，还利用vWF的亲和层析，这有利于产品的分离纯化。

另一方面，本发明还包括对凝血因子VIII多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于凝血因子VIII基因产物或片段。较佳地，指那些能与凝血因子VIII基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的凝血因子VIII基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的凝血因子VIII基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。

本发明还提供了含本发明凝血因子VIII的药物组合物，它包括安全有效量的本发明凝血因子VIII作为有效成分，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。此外，该药物组合物还可含有其他成分，例如还含有选自下组的物质：维生素、人血清白蛋白、钙离子。

A.剂量

在本发明中，对重组凝血因子VIII的剂量没有特别限制，可用任何合适的剂量。载体的类型以及数量也可以很不相同，这取决于温血动物或人的种类、体重、和待治疗出血症状的严重程度等。一般，合适的含量是重组凝血因子VIII占药物组合物总重量的0.01％-99％，较佳地0.1-90％。在治疗甲型血友病时，重组凝血因子VIII的有效剂量范围通常为0.05-20微克/千克·天或更高，较佳地为0.1-10微克/千克·天。

剂量单元包括重组凝血因子VIII，或者该重组凝血因子VIII与其他促凝血物质所形成的混合物。剂量单元还可含有稀释剂、填充剂、载体等。剂量单位是固体或凝胶形式，如丸剂、片剂、胶囊等，或者是液体形式，它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药。

B.剂型

本发明非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳浊剂。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含丙二醇，聚乙二醇，可可脂、橄榄油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80(商品名)等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用滤菌膜过滤上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。

C.治疗方法

治疗方法可以是，治疗具体的甲型血友病的任何合适有效方法。治疗可以是口服给药、直肠给药、局部给药、肠胃外给药、静脉内给药。施用有效量药物的方法还取决于病情的严重程度。据信，通过静脉内和局部给药的治疗方法，是将凝血因子施用于温血动物的优选方法。本发明的凝血因子VIII还可其他治疗甲型血友病的常规药物联用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人在分子克隆的实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 凝血因子VIII单克隆抗体的制备

(1)免疫

以100μl含市售重组凝血因子VIII(200μg/ml)与等体积的福氏完全佐剂免疫Bal b/c小鼠四只，并每隔三周加强免疫(用100μl含重组凝血因子VIII(200μg/ml)与等体积的福氏非完全佐剂)，共进行三次。

(2)融合

骨髓瘤细胞SP2/0于融合前4天左右复苏，培养于含20％小牛血清的DMEM培养基中，每天扩增一次。细胞融合时收集骨髓瘤细胞，计数。处死经免疫的Balb/c小鼠，无菌条件下取脾脏，放在丝网上剪碎脾脏，用约10ml DMEM培养液冲下脾细胞，计数。将骨髓瘤细胞与脾细胞以1∶2-5的比例混合，1000g离心10分钟。去上清，打散混合细胞使之均匀分布于塑料管，于37℃水浴中。缓慢加入0.5ml PEG，60秒钟内加完、再轻轻摇动塑料管30秒，然后静置60秒。缓慢加入10ml DMEM培液，置37℃水浴中孵育10分钟后，1000g离心10分钟，去上清，细胞沉淀用含20％小牛血淆的DMEM培养液悬浮，分配于有96孔细胞培养板中，每孔中约加入10万个骨髓瘤细胞。然后，于37℃细胞培养箱中，5-7％CO₂条件下培养约10天左右可观察到细胞克隆的出现。

(3)克隆化

将培养板中的阳性杂交瘤细胞吹散，计数。然后在20ml含20％小牛血清的DMEM培养基中加入约100个细胞。分配于96孔的细胞培养板中，置细胞培养箱中37℃，5-7％CO₂条件下培养约14天，检测单克隆细胞培养液。

(4)阳性克隆的检测

将FVIII蛋白抗原用酶标包被液稀释到5ug/ml，酶标板每孔加入50ul，4℃过夜，用酶标洗涤液洗三次(以后各步操作间均要用酶标洗涤液洗三次)，加入1％BSA溶液，37℃保温1小时，然后向每孔分别加入经酶标稀释液梯度稀释的样品，37℃保温1小时后加入二抗(HRP-羊抗鼠1∶5000稀释)，37℃保温0.5小时，加入底物溶液(TMB 0.4mM，H₂O₂ 5×10-3％)，37℃保温30分钟，加入2mM H₂SO₄50ul以终止反应，于酶标仪读数OD_460nm，计算效价。阴性对照为新鲜培养液。

(5)冻存和复苏杂交瘤细胞株

阳性杂交瘤细胞株经扩增后，1000g离心10分钟收集细胞，加入含10％DMSO的20％小牛血清DMEM培养基制成细胞悬浮液，移入冻存管，每管0.5ml，含10⁶-10⁷细胞，以1℃/分钟速度降温，最后保存于液氮中。

复苏细胞时，将装有细胞株的冻存管取出，迅速置37℃水浴溶化，将细胞转移到37℃预热的DMEM培液中，1000g离心10分钟，去上清后细胞悬浮于5ml含20％小牛血清的DMEM培养基中，置细胞培养箱在37℃，7％CO₂条件下培养。

(6)腹水制备

分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，以2-5×10⁶细胞量接种到经降植烷(pristane)敏化的Ba1 b/c(大于13周龄)小鼠腹腔。经10-20天后小鼠长出腹水。处死小鼠，打开腹腔取出腹水，并用PBS洗腹腔2次。合并腹水及洗出液，4000g离心10分钟。取上清，加入等体积的饱和(NH4)₂SO₄，搅拌1小时，5000g离心15分钟，去上清，沉淀即为腹水的(NH4)₂SO₄糊。

(7)抗体亚型的测定

用免疫双扩散法：1％琼脂糖溶解于50mM，pH8.6，巴比妥缓冲液中，铺玻璃板，然后在琼脂板上打梅花孔。中央空中加入待测的杂交瘤细胞培养液上清，置湿盒中，37℃保温18-24小时。观察沉淀线。发现产生沉淀线的为IgG和IgG1，证明本实施例中所得到的单抗为IgG1。

实施例2 FVIII生物活性测定和抗原含量

(1)生物活性的测定

FVIII生物活性测定采用一步法。主要原理是利用FVIII缺陷的甲型血友病患者的血浆，加入待测定样品后，测定凝血现象出现的时间，再与不同比例稀释的正常人血浆加入后凝血现象出现的时间进行比较，计算其活力单位(1ml正常人血浆所含FVIII量定为1单位，1U)。

(2)竞争性ELISA测定FVIII抗原含量

在酶标板上包被一定量的FVIII抗原(50ng/孔)，将已知浓度的FVIII标准样品作一定的稀释倍数(0-150ng)，和单抗一起加入酶标板中，由于游离的FVIII标准品和被固定的FVIII和FVIII的单抗竞争结合，洗板后去除和游离FVIII结合的单抗，依次加入酶标二抗和底物，读数，所测得的光吸收反映的是固定于酶标板的FVIII所结合单抗的量。将游离FVIII的量和光吸收作一标准曲线，待测样品恰当稀释后也与单抗一起加入酶标板，反应后所得吸收值和标准曲线对比，换算得出所含FVIII抗原量。

实施例3 凝血因子VIII基因序列的获得

(1)DNA及RNA的制备

高分子量DNA是从一正常人的外周血的细胞中按常规方法进行抽提。总RNA从新鲜胚胎组织中提取，用异硫氰酸胍-氯化铯梯度法进行，并用寡聚脱氧腺苷酸(Oligo-dT)纤维素柱分离mRNA。

(2)寡聚核苷酸引物的设计和聚合酶链反应

设计并合成七对引物，序列分别为第1对：引物1，引物2；第2对：引物3，引物4；第3对：引物5，引物6；第4对：引物7，引物8，第5对：引物9，引物10；第6对：引物11，引物12；第7对：引物13，引物14。为了便于整个分子的克隆，每对引物所扩增出的片段两侧均含有相应的限制性内切酶位点。这7对引物扩增后的cDNA片段分别对应于片段a，b，c，d，g，h和i，见图1。

第1-6对引物采用逆转录聚合酶链反应(RT/PCR)进行扩增，其中各对引物的第二个引物作为逆转录反应的引物。

逆转录反应体系：在40ul体积中进行。包括mRNA 1.5ug，逆转录引物100ng及MMLV逆转录酶(BRL)200U。

PCR反应体系：在100ul体积中进行，包括逆转录酶反应产物10ul(第7对引物进行PCR扩增所用的模板为基因组DNA，2ug)，寡核苷酸引物各100pmol，dNTPs各为200mmol；Tris-HCl pH 8.4 10mmol；MgCl₂ 1.5mmol；BSA 20ug/ml；KCl 50mmol。

扩增条件：变性：94℃ 45秒；退火：55℃ 45秒；延伸：72℃ 1分种，反应30个周期第一周期变性条件为94℃ 4分钟，最后一个周期延伸时间增至10分钟。

FVIII基因的14号外显子是目前所克隆的人类最大的外显子之一，长为3.1kb。为克隆这部分DNA，用一RT/PCR产物(长800bp，含有外显子14的部分序列)作为探针。筛选基因组文库，得到一含外显子14序列阳性克隆。从中分离得到两个cDNA片段，分别为2.5kb的EcoR I-BamH I片段及420bp的BamH I-PstI片段。序列分析后分别将这两个片段亚克隆至pBluscript SK⁺质粒中，按FVIIIcDNA顺序将这两个片段与其他各片段进行FVIII cDNA组装。

(3)全长FVIII cDNA的克隆

利用pGEM-3Z及pBluscript SK⁺的的多个限制性内切酶位点，将7个PCR产物片段a，b，c，d，g，h，i及2个来自基因组文库克隆的外显子14的片段e和f按照FVIII cDNA顺序进行组装。拼接后，得到了FVIII全部编码序列的cDNA分子，长7828bp，包括5’端非翻译区82bp，FVIII编码序列7053bp及3’端非翻译区693bp。在该分子的5’及3’端分别附加有Sal I和Not I人工接头，这两个限制性酶切位点在整个分子中并不存在，因此可用于克隆到表达载体中。整个拼接过程参见图1。

引物序列：

引物1：5’GCGTCGACCCTCCTGGGAGCTAAAGATA 3’

引物2：5’CAGCTCCCTCAGAAGCTTT 3’

引物3：5’TATCCTACTGGAAAGCTTCT 3’

引物4：5’CTACTTTGACATAAGCTTCC 3’

引物5：5’CATGATGGCATGGAAGCTTATG 3’

引物6：5’GCTTGGAACTCTGGATCCTC 3’

引物7：5’AGTGCAGCTTGAGGATCCAG 3’

引物8：5’GCTCTAGACAACTCTGTTGCTGCAGTTG 3’

引物9：5’ATTGCTGCAGTGGAGAGGCT 3’

引物10：5’ATATTGCAGGGAGCCCTGCA 3’

引物11：5’TACTTCACTGAAAATATGGA 3’

引物12：5’GCAAGCTTGGGTCTAGAGAGTTCACCA 3’

引物13：5’CAAGACTCCTTCACACCTGT 3’

引物14：5’ATGCGGCCGCGGACTTAGGGATTCTT 3’

实施例4 凝血因子VIII B结构域缺失cDNA(FVIII(ΔB))的构建

设计寡核苷酸引物四条，序列分别为引物15，引物16，引物17和引物18，应用PCR(聚合酶链式反应)对FVIII大部分B结构域进行缺失突变。应用引物15和引物16的PCR产物以及引物17和引物18的PCR产物A，B分别对应于FVIII的1868-2334bp和4974-5164bp。其中引物16和引物17有16bp的配对序列，所以产物A，B经过变性、再退火后，有16bp的核酸序列可以杂交，这种杂交产物可作为模板，以引物15和引物18为引物，扩增得到产物C(658bp)，对应于FVIII基因的1868-2334bp和4974-5164bp。用BamHI和PstI限制性酶切PCR产物C和FVIII全长cDNA，用PCR产物C替代FVIII全长cDNA的相应片段，这样就产生了B结构域缺失的FVIII cDNA(参见图2)，命名为FVIII(ΔB)。这种FVIII(ΔB)相比全长FVIII cDNA而言，缺少了FVIII cDNA中2334-4974bp的碱基序列。

引物序列：

引物15：5’GCGGA TCCAG AGTTC CAAGC CTCCA 3’

引物16：5’ACTGG TGGGG TGGCA TTAAA TTGCTT TTG 3’

引物17：5’ATGCC ACCCC ACCAG TCTTG AAACGC CAT 3’

引物18：5’GCCTG CAGCA ATAAA ATAGT GTCGTG TTTT 3’

实施例5 FVIII(ΔB)cDNA 5’端和3’端非翻译区的缺失及FVIII重轻链cDNA的构建

由于编码FVIII的cDNA序列较长，B结构域缺失后的FVIII还有5.2kb。这可能是在哺乳动物细胞表达系统中获得高表达的一种障碍，于是对FVIII的5’和3’的非编码区进行了缺失，进一步减少序列的长度，另一方面在5’端起始密码子前人工加入了Kozak顺序，从而有助于基因表达。另一种策略是根据FVIII在体内活化过程中，被蛋白酶加工分成重链和轻链，才能产生有生物活性的FVIII。分别构建编码FVIII的重链和轻链的cDNA，使其在同一哺乳动物细胞中表达，从而有助于提高重组凝血因子VIII的表达量。

(1)FVIII(ΔB)cDNA 5’端和3’端非翻译区的缺失

根据以上策略，首先合成一寡核苷酸接头，由引物19和引物20构成，含有Kozak序列，利用两头SalI和SacI的酶切位点，替代了FVIII(ΔB)5’非翻译区约100bp的序列，产生FVIII(Δ5’)(参见图3)。3’非编码区缺失的FVIII则通过引物21和22扩增得到包含XbaI(6944)到NotI(7156)的片段，约240bp，替代原先基因中的XbaI(6944)到NotI(7800)的片段，成为FVIII(Δ5’，Δ3’)，也同时缺失了5’和3’非翻译区。

引物序列

引物19：5’TCGAC CCACC ATGCA AATAG AGCT 3’

引物20：5’CTATT TGCAT GGTGG G 3’

引物21：5’CAAGA CTCCT TCACA CCTGT 3’

引物22：5’GCGCG GCCGC TAGGA TTTAG CACAA AG 3’

(2)编码FVIII重链和轻链cDNA的构建

在编码FVIII重链和轻链cDNA的构建过程中，为了避免过长PCR所引起的碱基突变，只在基因两端用PCR扩增出相应的小片段，再与原先的FVIII(ΔB)cDNA中的相应片段拼接，没有采取直接用PCR扩增整个基因片段的方法(见图4)。设计三对引物即23和24，25和26，27和28分别用PCR扩增得到产物I、II和III，分别约420bp、420bp和150bp，进一步测序证实没有PCR引起的错配。

产物I在ATG之前含有Kozak序列，产物II在3’端加了Not I酶切位点和TGA的终止密码子。产物I、II和FVIII BclI和BamHI之间的片段通过酶切，拼接成编码重链的cDNA(FVIII-HC)。PCR产物III包含FVIII中-19到1氨基酸的信号肽，两侧为SalI和BamHI的酶切位点，和FVIII中的BamHI到NotI的片段拼接，产生编码轻链的cDNA(FVIII-LC)(参见图4)。

引物序列：

引物23：5’-GCGTC GACCC ACCAT GCAAA TAGAG CTCTC CAC-3’

引物24：5’-GACTG GTCTG ATCAT CATAT-3’

引物25：5’-GCTTG AGGAT CCAGA GTTC-3’

引物26：5’-GCGCG GCCGC TCATC TTGGT TCAAT GGC-3’

引物27：5’-GCGTC GACCC TCCTG GAG-3’

引物28：5’-GCGGA TCCAA ACTAA AGCAG AATCG CAAAA-3’

实施例6：vWF基因表达及活性的测定

(1)vWF基因克隆：

根据已知的vWF cDNA序列，利用序列中的酶切位点：BamHI和KpnI，基因的5’和3’端用SalI和EcoRI，将vWF cDNA分为三段，分别设计三对适合进行长片段PCR的引物29-34加以扩增，具体设计见图5。

引物29：5’GCGTC GACCT TGGAG ATAGC CGCAG CCCTC ATTG  3’

引物30：5’AGAAT GATGT ACCGG CCAGA CTCCA CCACC       3’

引物31：5’CAAGG AGTAT GCCCC TGGAG AAA               3’

引物32：5’TTTCC GGTGA CCATG TAGAC                   3’

引物33：5’TGCCA GAGAT CCGCT ACCAG                 3’

引物34：5’ATGGG TGCCT GCTGC TGCCT GCCTT           3’

用以上引物(引物配对为29+30，31+32和33+34)，以人内皮细胞cDNA文库为模板，经过PCR扩增后分别获得三个PCR产物。PCR产物经电泳鉴定，分子量分别为2.9kb、2.3kb和3.4kb，之后进行序列测定，证明序列正确。

将鉴定后的PCR产物，根据其酶切位点，组装于pbluescript-SK⁺载体中，以获得全长vWFcDNA。

(2)vWF的测定

ELISA夹心法检测细胞培养液中vWF含量：利用两种抗体，一种是vWF的单克隆抗体，另一是HRP标记的针对vWF另一抗原决定簇的单克隆抗体。将前者包被在酶标板上，封闭后加入不同稀释度的vWF标准品或样品于37℃作用1小时，经多次清洗，依次加入HRP标记的单克隆抗体，HRP底物邻苯二胺，测定吸光度后作出标准曲线，计算vWF抗原含量。

生物活性测定：根据vWF在瑞斯托霉素(Ristocetin)存在的情况下，可以促进血小板的凝聚和粘附，此性质称为vWF：RcoF活性。具体方法为取一定量的富含血小板的血浆，加入瑞斯托霉素和不同稀释度的vWF标准品或样品，根据血小板凝聚时间作出标准曲线，计算vWF生物活性(见图6)。

结果表明，重组的vWF确实有明显的vWF：RcoF活性。

(3)vWF cDNA表达载体的构建及哺乳动物细胞Cos-7中的表达

将vWF cDNA从pbluescript-SK⁺载体中以SalI和NotI切出，克隆于哺乳动物表达载体pcDNA3中。质粒经纯化后，用基因传染试剂LIPOFECTamine转染Cos-7细胞，48小时后收集细胞培养上清，离心后测定vWF表达量。以空载体pcDNA3转染细胞作为阴性对照。将正常人血浆作不同的稀释倍数，做出标准曲线。待测样品经与标准曲线比较后，计算表达量。结果发现vWF cDNA在Cos-7细胞中有一定的表达，但表达量并不高，不到正常人血浆含量的百分之一，见表1。

                         表1 vWF的表达量

载体                             O.D值             vWF含量

pcDNA3-vWF                       0.5               82ng/ml

pcDNA3                           0.05              8.1ng/ml

正常人血浆(10ug/ml)1∶100稀释    0.62              100ng/ml

(4)vWF在哺乳动物细胞BHK中的表达

将vWF克隆入BHK系统的表达载体pZP9N(Xu WF，Andersen H，Whitmore TE，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：6642)中，经酶切鉴定证实无误。将上述表达载体转染BHK细胞，测定其表达量。与Cos-7表达体系相比较，vWF的表达水平均明显提高数十倍(约为2ug/ml)，为正常人的十分之一到五分之一。

实施例7 FVIII cDNA表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

将构建好的不同结构的FVIII cDNA(FVIII全长cDNA，FVIII(ΔB)cDNA，FVIII(Δ5’)cDNA，FVIII(Δ5’，Δ3’)cDNA，FVIII-HC和FVIII-LC)分别克隆于表达载体pCMV-dhfr，在CHO细胞中瞬时表达，比较其表达效率。

将以上不同基因结构的FVIII cDNA克隆于表达载体pCMV-dhfr中，转染CHO细胞，48小时收集培养液，离心后测定FVIII的生物活性和抗原量。

从表2中可以看到，通过一系列的基因结构改建，FVIII的表达量有所提高，特别是将FVIII重、轻链分开后，表达量有很明显的增加，是FVIII(ΔB)的3倍多。

               表2：不同基因结构对凝血因子VIII表达的影响

    FVIII cDNA                            FVIII活性(U/ml/day/10⁶cells)

    FVIII                                 0.021

    FVIII(ΔB)                            0.134

    FVIII(Δ5’)                          0.204

    FVIII(Δ5’，Δ3’)                   0.211

    FVIII-HC+FVIII-LC^*                   0.452

*注：凝血因子VIII重链和轻链在CHO细胞中瞬时表达

分别将所需的基因片段有选择地克隆入合适BHK系统的表达载体中，其构建的主旨是要适用于重链，轻链的共表达和vWF的协助表达。因此分别将重链，轻链及vWF基因构建入不同载体(pZP9，pZP9P，pZP9N等(Xu WF，Andersen H，Whitmore TE，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：6642))，经酶切鉴定证实无误。将上述FVIII不同结构的cDNA分别克隆于幼仓鼠肾细胞(BHK)体系相关载体中，转染或共同转染BHK细胞，测定其表达量。

与CHO表达体系相比较，FVIII的表达水平均明显提高数倍。并利用载体上存在的多种标记基因进行加压筛选，分别获得多株能够高效表达FVIII的细胞株。其筛选压力分别为MTX 1umol/L，G418 400mg/L和(或)嘌呤霉素1mg/L。B结构域缺失的cDNA表达量为1U/ml/10⁶细胞，vWF与FVIII的共表达及重链与轻链的共表达则使FVIII的表达量增加至约1.5-2U/ml/10⁶细胞。与在CHO细胞中的表达都有明显提高。

其中，同时含凝血因子VIII重链和轻链的幼仓鼠肾细胞HL-1(即在该细胞中，重链和轻链的编码序列分别位于质粒pZP9，pZP9N上，从而实现共表达)，于2000年12月8日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保减号为CCTCC NO：C200007。

实施例8  宿主细胞株与FVIII表达的关系

在正常人体中，表达FVIII的器官主要是肝脏，而目前采用的体外表达体系主要是卵巢细胞或肾细胞。于是本发明人考虑是否在肝细胞中存在FVIII表达所需的一些特殊因子，有助于FVIII的表达和分泌，而在其他组织中不存在这些因子，FVIII表达就有很大的障碍。于是选择了肝癌细胞株SMMC-7721和肾细胞Cos-7、肺癌细胞A549和卵巢细胞CHO(dhfr^-)作为研究对象，将现有的已构建好的表达载体pCMV-FVIII(ΔB)在这些细胞株中瞬时表达，测定活性，比较FVIII在不同来源细胞株中的表达效率。从测活结果来看(表3)，用pCMV这种载体时，FVIII在肝癌细胞中的表达量最高，达到0.74U/ml/day/10⁶细胞，肾细胞其次，而在肺细胞中的表达量最低。这说明FVIII的表达有很强组织特异性，肝细胞是FVIII表达的较佳组织。

                表3 凝血因子VIII表达与宿主细胞类型的关系

   细胞株                            FVIII活性(U/ml/day/10⁶cells)

   SMMC-7721                         0.74

   A549                              0.08

   Cos-7                             0.24

   CHO(dhfr^-)                       0.09

实施例9：重组FVIII产物的初步纯化

在正常血浆中，vWF与天然FVIII以1∶1结合，可以保护FVIII不受蛋白酶的降解，延长半衰期。同时vWF与FVIII形成的复合物具有很大的分子量，能够十分方便地将之与小分子表达产物分离开来。

从实施例7中vWF和FVIII共表达的细胞培养上清中纯化重组FVIII。培养上清经高速离心，取上清上样于阴离子交换层析(DEAE-52)，层析柱经过平衡缓冲液洗脱(pH7.0，50mM的磷酸缓冲液)后，进行盐梯度洗脱，梯度为经10个柱体积，洗脱液由A液转变成B液(A液为平衡缓冲液，B液为含1M NaCl的平衡缓冲液)。根据FVIII的活性测定和抗原测定，收集含重组FVIII的吸收峰。将收集到的重组FVIII经凝胶过滤层析柱(Sephacryl S-200)进一步分离纯化，得到rFVIII及rFVIII和rvWF混合产物，见图7。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                  序列表

(1)一般信息

    (i)申请人：中国科学院上海生物化学研究所

    (ii)发明名称：新的重组凝血因子VIII及其生产方法和药物组合物

    (iii)序列数目：4

(2)SEQ ID N0：1的信息：

    (i)序列特征

      (A)长度：2285bp

      (B)类型：核酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：cDNA

      (A)描述：描述/＝凝血因子VIII重链的DNA序列

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：1：

CCACC ATGCA AATAGAGCTC TCCACCTGCT TCTTTCTGTG CCTTTTGCGA TTCTGCTTTA 60

GTGCCACCAG AAGATACTAC CTGGGTGCAG TGGAACTGTC ATGGGACTAT ATGCAAAGTG  120

ATCTCGGTGA GCTGCCTGTG GACGCAAGAT TTCCTCCTAG AGTGCCAAAA TCTTTTCCAT  180

TCAACACCTC AGTCGTGTAC AAAAAGACTC TGTTTGTAGA ATTCACGGAT CACCTTTTCA  240

ACATCGCTAA GCCAAGGCCA CCCTGGATGG GTCTGCTAGG TCCTACCATC CAGGCTGAGG  300

TTTATGATAC AGTGGTCATT ACACTTAAGA ACATGGCTTC CCATCCTGTC AGTCTTCATG  360

CTGTTGGTGT ATCCTACTGG AAAGCTTCTG AGGGAGCTGA ATATGATGAT CAGACCAGTC  420

AAAGGGAGAA AGAAGATGAT AAAGTCTTCC CTGGTGGAAG CCATACATAT GTCTGGCAGG  480

TCCTGAAAGA GAATGGTCCA ATGGCCTCTG ACCCACTGTG CCTTACCTAC TCATATCTTT  540

CTCATGTGGA CCTGGTAAAA GACTTGAATT CAGGCCTCAT TGGAGCCCTA CTAGTATGTA  600

GAGAAGGGAG TCTGGCCAAG GAAAAGACAC AGACCTTGCA CAAATTTATA CTACTTTTTG  660

CTGTATTTGA TGAAGGGAAA AGTTGGCACT CAGAAACAAA GAACTCCTTG ATGCAGGATA  720

GGGATGCTGC ATCTGCTCGG GCCTGGCCTA AAATGCACAC AGTCAATGGT TATGTAAACA  780

GGTCTCTGCC AGGTCTGATT GGATGCCACA GGAAATCAGT CTATTGGCAT GTGATTGGAA  840

TGGGCACCAC TCCTGAAGTG CACTCAATAT TCCTCGAAGG TCACACATTT CTTGTGAGGA  900

ACCATCGCCA GGCGTCCTTG GAAATCTCGC CAATAACTTT CCTTACTGCT CAAACACTCT  960

TGATGGACCT TGGACAGTTT CTACTGTTTT GTCATATCTC TTCCCACCAA CATGATGGCA  1020

TGGAAGCTTA TGTCAAAGTA GACAGCTGTC CAGAGGAACC CCAACTACGA ATGAAAAATA  1080

ATGAAGAAGC GGAAGACTAT GATGATGATC TTACTGATTC TGAAATGGAT GTGGTCAGGT  1140

TTGATGATGA CAACTCTCCT TCCTTTATCC AAATTCGCTC AGTTGCCAAG AAGCATCCTA  1200

AAACTTGGGT ACATTACATT GCTGCTGAAG AGGAGGACTG GGACTATGCT CCCTTAGTCC  1260

TCGCCCCCGA TGACAGAAGT TATAAAAGTC AATATTTGAA CAATGGCCCT CAGCGGATTG  1320

GTAGGAAGTA CAAAAAAGTC CGATTTATGG CATACACAGA TGAAACCTTT AAGACTCGTG  1380

AAGCTATTCA GCATGAATCA GGAATCTTGG GACCTTTACT TTATGGGGAA GTTGGAGACA  1440

CACTGTTGAT TATATTTAAG AATCAAGCAA GCAGACCATA TAACATCTAC CCTCACGGAA  1500

TCACTGATGT CCGTCCTTTG TATTCAAGGA GATTACCAAA AGGTGTAAAA CATTTGAAGG  1560

ATTTTCCAAT TCTGCCAGGA GAAATATTCA AATATAAATG GACAGTGACT GTAGAAGATG  1620

GGCCAACTAA ATCAGATCCT CGGTGCCTGA CCCGCTATTA CTCTAGTTTC GTTAATATGG  1680

AGAGAGATCT AGCTTCAGGA CTCATTGGCC CTCTCCTCAT CTGCTACAAA GAATCTGTAG  1740

ATCAAAGAGG AAACCAGATA ATGTCAGACA AGAGGAATGT CATCCTGTTT TCTGTATTTG  1800

ATGAGAACCG AAGCTGGTAC CTCACAGAGA ATATACAACG CTTTCTCCCC AATCCAGCTG  1860

GAGTGCAGCT TGAGGATCCA GAGTTCCAAG CCTCCAACAT CATGCACAGC ATCAATGGCT  1920

ATGTTTTTGA TAGTTTGCAG TTGTCAGTTT GTTTGCATGA GGTGGCATAC TGGTACATTC  1980

TAAGCATTGG AGCACAGACT GACTTCCTTT CTGTCTTCTT CTCTGGATAT ACCTTCAAAC  2040

ACAAAATGGT CTATGAAGAC ACACTCACCC TATTCCCATT CTCAGGAGAA ACTGTCTTCA  2100

TGTCGATGGA AAACCCAGGT CTATGGATTC TGGGGTGCCA CAACTCAGAC TTTCGGAACA  2160

GAGGCATGAC CGCCTTACTG AAGGTTTCTA GTTGTGACAA GAACACTGGT GATTATTACG  2220

AGGACAGTTA TGAAGATATT TCAGCATACT TGCTGAGTAA AAACAATGCC ATTGAACCAA  2280

GATGA                                                              2285

(2)SEQ ID NO：2的信息：

    (i)序列特征

      (A)长度：759个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：多肽

      (A)描述：描述/＝凝血因子VIII重链的氨基酸序列

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：2：

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP  50

PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY  100

DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG  150

GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE  200

GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM  250

HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH  300

RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE  350

EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT  400

WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY  450

TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT  500

DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR  550

YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE  600

NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL  650

HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS  700

MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL  750

SKNNAIEPR                                               759

(2)SEQ ID NO：3的信息：

   (i)序列特征

     (A)长度：2373碱基

     (B)类型：核酸

     (C)链性：单链

     (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：cDNA

     (A)描述：描述/＝凝血因子VIII轻链的DNA序列

   (iii)序列描述：SEQ ID NO：3：

ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTTTG 60

GATCCTCTTG CTTGGGATAA CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC  120

CAAGAGAAGT CACCAGAAAA AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC  180

GCTTGTGAAA GCAATCATGC AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA  240

GAAGTCACCT GGGCAAAGCA AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC  300

TTGAAACGCC ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT  360

GACTATGATG ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG  420

GATGAAAATC AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA  480

GTGGAGAGGC TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT  540

CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC  600

TTTACTCAGC CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT  660

ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC  720

TATTCCTTCT ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT  780

AGAAAAAACT TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT  840

ATGGCACCCA CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC  900

CTGGAAAAAG ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA  960

CTGAACCCTG CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC  1020

TTTGATGAGA CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC  1080

TGCAATATCC AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT  1140

GGCTACATAA TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG  1200

TATCTGCTCA GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG  1260

TTCACTGTAC GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT  1320

TTTGAGACAG TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT  1380

GGCGAGCATC TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG  1440

ACTCCCCTGG GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA  1500

TATGGACAGT GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG  1560

AGCACCAAGG AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC  1620

GGCATCAAGA CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC  1680

ATCATGTATA GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC  1740

TTAATGGTCT TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT  1800

CCAATTATTG CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT  1860

CGCATGGAGT TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT  1920

AAAGCAATAT CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC  1980

TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG  2040

GTGAATAATC CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA  2100

GTAACTACTC AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC  2160

TCCAGCAGTC AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT  2220

TTTCAGGGAA ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG  2280

ACTCGCTACC TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG  2340

GTTCTGGGCT GCGAGGCACA GGACCTCTAC TGA                               2373

(2)SEQ ID NO：4的信息：

    (i)序列特征

      (A)长度：790氨基酸

      (B)类型：核酸

      (C)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：多肽

      (A)描述：描述/＝凝血因子VIII轻链的氨基酸序列

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：4：

MQIELSTCFF LCLLRFCFSL DPLAWDNHYG TQIPKEEWKS QEKSPEKTAF  50

KKKDTILSLN ACESNHAIAA INEGQNKPEI EVTWAKQGRT ERLCSQNPPV  100

LKRHQREITR TTLQSDQEEI DYDDTISVEM KKEDFDIYDE DENQSPRSFQ  150

KKTRHYFIAA VERLWDYGMS SSPHVLRNRA QSGSVPQFKK VVFQEFTDGS  200

FTQPLYRGEL NEHLGLLGPY IRAEVEDNIM VTFRNQASRP YSFYSSLISY  250

EEDQRQGAEP RKNFVKPNET KTYFWKVQHH MAPTKDEFDC KAWAYFSDVD  300

LEKDVHSGLI GPLLVCHTNT LNPAHGRQVT VQEFALFFTI FDETKSWYFT  350

ENMERNCRAP CNIQMEDPTF KENYRFHAIN GYIMDTLPGL VMAQDQRIRW  400

YLLSMGSNEN IHSIHFSGHV FTVRKKEEYK MALYNLYPGV FETVEMLPSK  450

AGIWRVECLI GEHLHAGMST LFLVYSNKCQ TPLGMASGHI RDFQITASGQ  500

YGQWAPKLAR LHYSGSINAW STKEPFSWIK VDLLAPMIIH GIKTQGARQK  550

FSSLYISQFI IMYSLDGKKW QTYRGNSTGT LMVFFGNVDS SGIKHNIFNP  600

PIIARYIRLH PTHYSIRSTL RMELMGCDLN SCSMPLGMES KAISDAQITA  650

SSYFTNMFAT WSPSKARLHL QGRSNAWRPQ VNNPKEWLQV DFQKTMKVTG  700

VTTQGVKSLL TSMYVKEFLI SSSQDGHQWT LFFQNGKVKV FQGNQDSFTP  750

VVNSLDPPLL TRYLRIHPQS WVHQIALRME VLGCEAQDLY             790

Claims (3)

1.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞是幼仓鼠肾细胞HL-1，保藏号为CCTCC No：C200007。

2.一种产生凝血因子VIII的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)在适合表达所述凝血因子VIII重链和轻链的条件下，培养权利要求1所述的宿主细胞，从而表达出所述的凝血因子VIII的重链和轻链，形成重组的凝血因子VIII；和

(2)分离所述的凝血因子VIII。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤：分离之前，将凝血因子VIII与vWF混合，以稳定保护凝血因子VIII活性。

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