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CN1146207A - 制备有效的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法及这些抑制剂的应用 - Google Patents

制备有效的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法及这些抑制剂的应用 Download PDF

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CN1146207A
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哈维·鲁宾
巴里·库珀曼
诺曼·谢克特
迈克尔·普洛特金
王志美
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University of Pennsylvania Penn
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Abstract

本发明提供了一种生产能有效调节丝氨酸蛋白酶活性的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法。同时也提供了能够调节丝氨酸蛋白酶活性的组成以及使用这些组成来调节细胞中的发炎过程。

Description

制备有效的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂 的方法及这些抑制剂的应用
发明背景
丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种超家族抑制剂，参与宿主存活必需的许多生物过程的介导。丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员在以下一些生物过程，但不限于这些过程，中起作用：发炎、受精、肿瘤迁移、向神经性及热激。Maspin最近才被人们所识别并且作为保护性的丝氨酸蛋白酶通常存在于哺乳动物上皮中，但在大多数哺乳动物的癌细胞系中却不存在。在植物、原核生物、昆虫及动物体中均发现有丝氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂的自然突变及修饰与许多严重的疾病状态有关。丝氨酸蛋白酶抑制剂机能障碍与肺、肝及血液凝结疾病例如气肿，肝硬变、血栓形成及肺栓塞有关。
丝氨酸蛋白酶抑制剂与内源的及微生物蛋白酶的相互作用能产生多种种类的分子，它们均是进化上高度保守的内环境稳定机制成分，该机制维持宿主存活所必需的完整的有活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂浓度。例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂-蛋白酶复合物及其水解物，完整的丝氨酸的非完整形式刺激白介素-6的产生，是肝细胞增加急性期蛋白质合成的信号，所述急性期蛋白质包括丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质超家族的亚群。当丝氨酸蛋白酶抑制剂－酶复合物快速从循环中清除时，这些复合物的断裂的和完整的形式能在发炎的局部区域进行积累。这种积累能为化学引诱剂及趋化性的抑制剂以及嗜中性白细胞脱粒、白三烯、血小板活化因子(PAF)及超氧化物生产的活化剂和抑制剂提供了复杂的微环境。几种痘病毒的极端的毒性已部分归因于靶是半胱氨酸蛋白酶ICE，白介素1-β转化酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
通过多种动物模型，已证明无控制丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性是肺损伤的主要机制，并且适当的丝氨酸蛋白酶抑制剂反应控制损伤的程度。例如，抗凝血酶III(ATIII)与α-1-蛋白酶抑制剂(α1P1)相结合，能够保护绵羊不受内毒素诱导的肺损伤，在此该个体的丝氨酸蛋白酶抑制剂不如结合态的有效。Rednes等，Circ.Shock 1988，26，15。Redens等人也表明ATIII防止了在内毒血症大鼠体内非传播性血管内凝结的发生。Emerson等，Circ.Shock 1987，21，1。H2O2的清除剂及弹性蛋白酶的氯甲基酮抑制剂阻抑大鼠体内嗜中性弹性蛋白酶介导的调节急性肺水肿损伤中反应氧的增强，并且α1P1减少了博莱霉素的肺炎及随后的纤维化。Baird等，Physio1.1986，61，2224及Nagai等，Am.Rev.Resp.Dis.1992，145，651。在另一系统中，嗜中性弹性蛋白酶抑制剂，Eglin C和一种低分子量化合物L658，758，不能抑制白三烯B4诱导的嗜中性白细胞介导的粘附，血细胞渗出或导管泄漏。Rosengren等，Am J.Physiol.1990，259，H1288。这些研究表明，通过蛋白水解酶抑制剂的治疗性给药能限制发炎的分子及细胞机制并且可以减少组织损伤。
在丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中有两个亚家族。一个家族包含的蛋白质无一被鉴定为同种丝氨酸蛋白酶。该家族的蛋白质例子包括卵清蛋白、血管紧张肽原及胆固醇结合球蛋白。第二家族包括的成员，其中至少一种丝氨酸蛋白酶被发现是抑制靶。抑制丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂的亚家族具有一些特性，这些特性定义了抑制剂的活性，即对它们同种酶抑制的二次速率常数的范围从102到107M-1S-1；在某些条件下酶-抑制剂复合物是稳定的，并且作为分子量大于SDS聚内烯酰胺凝胶单体组分的种类可被测定；并且，当反应中心的连接链断裂时会发生大量的构型变化，这会导致蛋白质热力学稳定性提高。在该亚家族的一个丝氨酸蛋白酶抑制剂的例子是α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)，胰凝乳蛋白酶(Chtr)的抑制剂。ACT主要由肝脏合成，并且是一种急性期反应物，对很多种损伤包括外伤、急性心肌梗塞、烧伤、自身免疫疾病，恶性病、感染及肝脏同种移植排斥的应答，其水平可很快升至5倍多。ACT还与神经系统的塑性相联系，并且与阿耳茨海默式疾病、大脑老化、Down’s综合症、及遗传性大脑出血的Dutch变异体中的β淀粉样蛋白沉淀有关。已经证明天然ACT及重组ACT(rACT)都抑制悬浮液中人嗜中性白细胞的超氧化物生成。
通常，抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应环由相对较短的氨基酸序列组成。对于抑制特定类型蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂的选择性取决于暴露于丝氨酸蛋白酶抑制剂表面的反应中心区域的氨基酸序列。Jiang H.等，J.Biol.Chem.1994，269，55-58，证明来自鳞蝶呤昆虫，Manduca sexta的丝氨酸蛋白酶抑制剂的选择性可以通过改变反应环中的氨基酸序列进行改变。人们发现前－mRNA的剪接通过使用连接于不同反应位点区盒的相同的蛋白质框架产生了抑制剂的多样性以及调节多种蛋白酶的可能性。
基于小抑制剂(大约50个氨基酸)与它们的靶酶所形成的复合物的三维结构，人们认为P3-P3′区域，ACT的356-361位的氨基酸，(Schecter I.及Berger A.C的命名法。Biochemistry Biophysics Research Communication 1967，27：157)，在丝氨酸蛋白酶抑制剂环中，或称作“活化位点区域”(或(bait区域)，作为主要的与蛋白酶的接触位点或结合位点。现在还发现环的另一部分(从P14到P9)，定义为“铰链区”，对于丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性也很重要。现在已经发明了一种方法来调节细胞及组织中丝氨酸蛋白酶的活性，该方法包括选择能在细胞及组织中进行积累的靶蛋白酶，产生一种具有蛋白酶结合位点及反应中心环铰链区域的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述的蛋白酶结合位点及反应中心环铰链区含有修饰的氨基酸序列从而可改变抑制剂和靶蛋白酶之间的相互作用，及与具有修饰的氨基酸的蛋白酶抑制剂的细胞和组织进行接触从而调整丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。同时也提供了能有效调节丝氨酸蛋白酶活性的组合物，其中包括具有修饰氨基酸的蛋白酶结合位点及反应环的铰链区的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂。这些组合物在发炎的调节过程中很有用。另外，还提供了一种生产能有效调节丝氨酸蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括确定丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列；鉴别所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应环，所述反应环包含蛋白酶结合位点的第一氨基酸序列及铰链区的第二氨基酸序列；修饰所述蛋白酶结合位点的第一氨基酸序列从而改变重组丝氨酸蛋白酶抑制剂对其它蛋白酶的选择性；修饰所述铰链区的第二氨基酸序列从而使得所述的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制剂能够有效调节丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性；及合成该修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
发明概述
本发明的目的是提供一种能有效调节丝氨酸蛋白酶活性的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法，包括确定选定的丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列；鉴别所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应环，所述反应环包含蛋白酶结合位点的第一氨基酸序列以及铰链区的第二氨基酸序列；修饰所述蛋白酶结合位点的第一氨基酸序列从而改变重组丝氨酸蛋白酶抑制剂对其它蛋白酶的选择性；修饰所述铰链区的第二氨基酸序列从而所述的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂能有效地调节蛋白酶的活性；及合成该修饰的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。
本发明的另一目的是提供能有效调节丝氨酸蛋白酶活性的组合物，包括具有蛋白酶结合位点及反应环铰链区的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述的蛋白酶结合位点及反应环铰链区具有修饰的氨基酸序列。
本发明还有一个目的是提供一种调节细胞及组织中丝氨酸蛋白酶活性的方法，包括选择能在细胞及组织中积累的靶蛋白酶；生产具有蛋白酶结合位点及反应中心环铰链区的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述的蛋白酶结合位点及反应中心环铰链区具有修饰的氨基酸序列，从而改变抑制剂和靶蛋白酶之间的相互作用；及与具有修饰丝氨酸的蛋白酶抑制剂的细胞或组织接触从而调节丝氨酸蛋白酶的活性。
本发明还有一个目的是提供人α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，它们是胰凝乳蛋白酶的有效抑制剂。
另外还提供了编码包括α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的丝氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列，包含这些核苷酸序列的表达载体，能够表达这些核苷酸序列的转化宿主细胞，能够表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞培养物及包含这些丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白质制剂。
发明的详细描述
糖蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂在保持生物体内环境稳定性中具有重要作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂调节一些重要的生物过程中涉及的蛋白酶，这些过程包括，但不限于血液凝结，受精及发炎。人们认为动物及昆虫体内多种的丝氨酸蛋白酶抑制剂参与了基因的复制及分离，从而导致了在单个生物体内的大量丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，每个基因编码一种具有独特反应位点区域及生理功能的蛋白质。丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个实例是抗胰凝乳蛋白酶(ACT)，它抑制胰凝乳蛋白酶、胰弹性蛋白酶、肥大细胞胰凝乳蛋白酶样蛋白酶及组织蛋白酶G。在包括外伤，急性心肌梗塞、烧伤、自身免疫疾病、恶性病、感染及肝同种移植排斥的各种损伤中，已观察到高水平的ACT。
ACT与某些细胞介导的及细胞因子介导的事件有关。例如，肿瘤坏死因子通过TNF介导的组织蛋白酶G从嗜中性白细胞中的释放来增强血小板的活化作用。该作用可被ACT阻断。另外，白三烯B4及血小板活化因子，在TNF刺激的嗜中性白细胞中的合成与释放也会受到ACT的阻断。嗜中性白细胞组织蛋白酶G及肥大细胞胰凝乳蛋白酶样蛋白酶是在皮肤及肺部炎症反应中的主要成分。所以，有人提出ACT在限制发炎上起着调控作用，该炎症引起颗粒释放出酶性内容物。还表明天然及重组的ACT可以抑制人嗜中性白细胞产生超氧化物。在未破坏的细胞系统中，完整的ACT及ACT与胰凝乳蛋白酶的复合物均对受f-Met-Leu-Phe，Con A或PMA刺激的人嗜中性白细胞的自由基产生同样具有抑制作用。人们已经发现具有正常循环量50％的ACT的家族在肺功能上出现异常，具有大的残余体积并且特应性疾病有所增加。这样看来完整的ACT，以及断裂的及复合形式的ACT，在调节发炎及某些发育过程中起着中心作用。
ACT与丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的其它成员具有许多共同的特性。ACT及其它保留抑制活性及特异性的丝氨酸蛋白酶抑制剂的最重要的特征是存在可活动的反应环。
人们认为丝氨酸蛋白酶抑制剂按照以下一般机制来抑制它们的靶丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶需要丝氨酸蛋白酶抑制剂作为底物，从而起动蛋白水解作用。通过与特异位点，P残基的相互作用，丝氨酸蛋白酶抑制剂与它们的靶蛋白酶形成紧密的1∶1的复合物。标准符号定义P1位点为裂解位点的直接N末端，P2是P1的N端，以此类推。P1位点位于丝氨酸蛋白酶抑制剂中被称作反应环的暴露区域。从肽抑制剂中得到的大量结构数据表明抑制剂上的反应环是一种反向平行β链构型，称作“经典构型(canonical)”。但是，现在发现完整的丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应环呈现某些变形的螺旋构型，其P1侧链从丝氨酸蛋白酶抑制剂的其它部分向后延伸。反应环并不预先形成一种反向平行β链构型，而为了与蛋白酶进行生产性的结合它呈现相继的螺旋不稳定态。与蛋白酶的结合导致了丝氨酸蛋白酶抑制剂构型上的改变，在一定的条件下，进一步改变蛋白酶本身的构型。蛋白酶改变的构型有效地消除了它的酶活性，并且蛋白酶的酶反应途径也被阻断。
丝氨酸蛋白酶抑制剂研究的一个重要的焦点是丝氨酸蛋白酶抑制剂与它们的靶酶之间的不均衡与组织损坏及衰退性疾病之间的关系。通过对丝氨酸蛋白酶抑制剂，以及丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程的变异体，与靶蛋白酶之间相互作用的生化和结构性能的详细调查，已经发明了具有治疗活性的新蛋白的合理设计。按照由短肽抑制剂(大约50个氨基酸)与它们的靶蛋白酶所形成的复合物的三维模型，人们认为在丝氨酸蛋白酶抑制剂环上的P3-P3′区域，也称为“活化位点区域”或“bait区域”，是酶的主要接触位点或结合位点。在这个蛋白酶结合位点区域通过修饰氨基酸，通过突变或缺失，丝氨酸蛋白酶抑制剂对选定酶的抑制活性可得到改变。例如，人们发现对野生型的ACT在P1′位点用甲硫氨酸取代亮氨酸，可以产生一种突变体，该突变体具有部分抑制人嗜中性弹性蛋白酶，而同时保持它本身抑制胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶-G及胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的能力(见表1及2)。另外也发现反应环中缺失P6′-P9′残基的变异体保留其对胰凝乳蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性，并且增强了其对人嗜中性弹性蛋白酶的抑制活性。在本申请中人嗜中性弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G及胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的活力按照实施例2到5中所述的方法进行了测定。纤溶酶及溶血酶的活力测定按照现有技术中已熟知的方法进行，例如Cooperman等，J.Bil.Chem.1993，268，23616。
另外也发现铰链区(P14-P9)在维持丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制活性上是环上的一个重要组分。氨基酸序列排列表明在每个抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂的铰链区与带电残基例如精氨酸和谷氨酸相比，短的、中性侧链的氨基酸，例如丙氨酸和谷氨酸来说是高度保守的。在重组ACT(rACT)中的P14以精氨酸取代苏氨酸会导致底物失去其抑制活性(见表1和2)。
在本发明中提供了一种制备能有效调节重组丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法。在该方法中，确定了所选定丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列，并识别出该丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应环。然后修饰该环上蛋白酶结合位点的氨基酸序列从而改变该丝氨酸蛋白酶抑制剂对多种其它蛋白酶的选择性。对蛋白酶结合位点的修饰包括取代或缺失序列中的一个或多个氨基酸。在一优选实施方案中，修饰作用将包含用已知存在于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂中的氨基酸来取代蛋白酶结合位点区域的一些氨基酸。例如，将ACT中P1′位点的亮氨酸用甲硫氨酸取代(甲硫氨酸是在丝氨酸蛋白酶抑制剂α1P1中位于同一位置的氨基酸，丝氨酸蛋白酶抑制剂α1P1是人嗜中性弹性蛋白酶的抑制剂)，可产生一种突变体，它具有抑制胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶-G、胰凝乳蛋白酶样蛋白及人嗜中性白细胞弹性蛋白酶的能力(见表1和2)。可按照本发明中的教导，本领域的技术人员可常规地确定蛋白酶结合位点氨基酸序列的适当取代作用。铰链区的氨基酸序列也可被修饰。在一优选实施方案中，修饰铰链区使其主要包含短的中性链的氨基酸，例如丙氨酸和苏氨酸。然后合成该修饰的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。可按本领域技术人员熟知的定点诱变标准技术完成修饰作用。
在本发明的一项实施方案中，该方法用于制备ACT的类似物。ACT在结合DNA的能力上在丝氨酸蛋白酶抑制剂中是独特的。已将ACT置于某些恶性和良性细胞的细胞核中，并且已发现它抑制αDNA聚合酶，抑制通透化人癌细胞中的DNA合成，以及依赖于聚胞苷酸的引发酶，但它刺激依赖于聚dT的引发酶。已经发现rACT的两个短区域中的赖氨酸残基对于DNA的结合很重要。rACT具有两个元件，赖氨酸延伸区(残基210-212)及C末端肽390-398，包含的两个赖氨酸参与与DNA结合的相互作用。将赖氨酸210-212用谷氨酸或苏氨酸取代可导致DNA结合活性的全部丧失。若仅将一或两个赖氨酸用苏氨酸取代则能保留部分DNA结合活性。对于C-末端肽，已发现对rACT中最具反应活性的赖氨酸K396的乙酰化作用，在DNA存在下被削弱，而用苏氨酸取代两个赖氨酸K391与K396，可导致产生具有很小DNA结合能力的蛋白质。所以，在制备和选择重组ACT类似物时，应在赖氨酸210-212处及在C末端肽390-398处进行进一步的修饰作用，从而调节抑制剂的DNA结合。
对于丝氨酸蛋白酶抑制剂与丝氨酸蛋白酶之间相互作用的研究表明，在丝氨酸蛋白酶抑制剂与蛋白酶结合时发生的构型改变对于选定的丝氨酸蛋白酶活性的抑制很重要。
按照本发明的说明，还提供了能有效调节丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的组合物。本发明的组合物包含具有修饰氨基酸序列的蛋白酶结合位点及反应环铰链区的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一优选实施方案中铰链区的修饰氨基酸序列包含具有短的中性侧链的氨基酸例如丙氨酸及苏氨酸。本发明的组合物对于与丝氨酸蛋白酶在细胞及组织中积累有关的发炎过程的调节特别有用。
在本发明中还提供了调节细胞及组织中丝氨酸蛋白酶活性的方法。该方法包括选择在细胞及组织中积累的靶蛋白酶，制备具有蛋白酶结合位点及反应中心环铰链区的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述的结合位点及铰链区具有修饰的氨基酸序列从而可改变抑制剂与靶蛋白酶的相互作用。优选将丝氨酸蛋白酶抑制剂铰链区的氨基酸用含有短的中性侧链的氨基酸例如丙氨酸和苏氨酸来修饰。
在一个实施方案中受调节的丝氨酸蛋白酶的活性是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的活性。在该实施方案中优选将丝氨酸蛋白酶抑制剂作为人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，该类似物具有氨基酸358位的修饰或氨基酸356-361位的修饰。
在另一实施方案中，受调节的丝氨酸蛋白酶的活性是弹性蛋白酶的活性。在该实施方案中优选将丝氨酸蛋白酶抑制剂作为人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，该类似物具有氨基酸358位的修饰或氨基酸356-361位的修饰。
特别地，本发明提供了重组化方法制备的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们是α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物。这些类似物是胰凝乳蛋白酶的有效抑制剂。例如，本发明提供了α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶氨基酸位置350上的丙氨酸被精氨酸取代。也提供了人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的另一种类似物，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶氨基酸第349-368位的Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Arg-Thr-Ile-Val(SEQ ID NO：31)被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-Phe-Ash-Thr(SEQ ID NO：32)取代。该类似物称为rACT-P10P10′。另外，还提供了一种人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶氨基酸第349-363位的Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu(SEQ ID NO：33)用Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu(SEQ ID NO：34)取代，并且在第368位的氨基酸Vla被Ala所取代。该类似物称作rACT-P10P5′。由相应于这里指出的氨基酸取代的核苷酸序列可制备本发明中的类似物。具有比这里所公开的α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的序列有较多或较少的氨基酸、片段，或有一个或多个的氨基酸差异的氨基酸序列的蛋白质，这些蛋白质具有抗胰凝乳蛋白酶，抗胰蛋白酶，抗凝血酶及抗人嗜中性白细胞弹性蛋白酶(HNE)活性，这些蛋白质也在本发明的范围之内。
本发明还提供了编码，包括这些α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列，包含这些核酸序列的表达载体，能够表达这些核酸序列的转移宿主细胞，能够表达重组丝氨酸蛋白酶抑制剂例如本发明中的人α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物的细胞培养物，以及包含重组丝氨酸蛋白酶抑制剂例如人α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的蛋白质制剂。
通常，包括α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂由含有编码特定重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列的表达载体转化的宿主细胞产生。宿主细胞在一定条件下进行培养，该条件使编码特定丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列得到表达。经过一段适当的时间让产品积累后，将抑制剂从宿主细胞或细胞周围的介质中纯化出来。
本发明中适用的宿主细胞和表达载体可以用常规方法选择，来形成能产生重组丝氨酸蛋白酶抑制剂例如α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的表达系统。本发明适用的宿主细胞包括原核和真核细胞，它们能被转化从而稳定地包含和表达这些重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。合适的细胞包括细菌，酵母，及哺乳动物细胞。当使用原核宿主细胞时，不发生丝氨酸蛋白酶的糖基化作用。但是，人们惊奇地发现未糖基化的丝氨酸蛋白酶抑制剂，人α-1-抗胰凝乳蛋白酶，表现出与天然人血清α-1-抗胰凝乳蛋白酶基本相同的功能，并因此，未糖基化的重组丝氨酸蛋白酶有望在治疗应用中成为天然丝氨酸蛋白酶抑制剂有效的取代物。优选大肠杆菌用来生产蛋白质产品，因为克隆和表达能够快速完成。另外，大肠杆菌的生产易于进行经济的、大规模的发酵和蛋白质提纯。将含有编码重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列的表达载体引人宿主细胞可用多种方法进行，例如氯化钙或氯化锂处理或电穿孔作用。包含编码重组丝氨酸蛋白酶抑制剂例如人α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的核酸序列的表达载体优选进一步包含有效连接于编码重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列的转录及翻译控制元件；例如，上游位置，启动子，接下来是包含核糖体结合位点的翻译起始信号，起始密码子，然后在下游位置是转录终止信号。转录和翻译控制元件可以任何功能性组合或顺序进行连接。在本发明中任何特定实施方案中使用的转录和翻译控制元件要参考为形成表达系统而将表达载体引入的细胞的类型来选择。
优选使用强启动子，例如大肠杆菌trp-lac启动子或T7PL启动子以确保蛋白质产品的高水平表达。已经发现当P1Nomp和β-内酰胺酶启动子与编码α-l-抗胰凝乳蛋白酶的DNA进行有效连接时，α-1-抗胰凝乳蛋白酶的产量很低或根本不产生。启动子优选可诱导启动子，例如PL启动子，以防止在产物积累过程中可能发生的宿主毒性。
或者，可以使用基于在Studier and Moffatt，J.Mol.Biol.1986，189：113-130中所公开的噬菌体T7RNA聚合酶的基因表达系统，该文献在此引人作为参考。在该系统中，大肠杆菌细胞以包含噬菌体T7启动子的质粒转化，所述启动子与编码选定的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列有效连接，用含有T7RNA聚合酶表达基因的人噬菌体侵染大肠杆菌。在宿主细胞中复制了足够数量的质粒之后再用噬菌体侵染细胞，并且侵染后马上出现蛋白质的合成。
包含编码重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸序列的转化的宿主细胞接下来将生长于对宿主适宜的培养基中。当使用可诱导启动子时，宿主细胞能生长到高密度，然后启动子开启进行融合蛋白质和蛋白酶的表达。当启动子不是可诱导性的时，则发生蛋白质产品的组成型生产。这些在表达系统中的抑制剂的组成型生产只有在它对宿主细胞基本上没有毒性时才是优选的。可使细胞生长到产物形成不再有进一步的增长，或者直到消耗的营养物与产物形成的比例降至预先确定的水平之下时，可进行细胞的收集，溶解，并且依照惯用技术得到和纯化蛋白质产品。
如这里所使用的，用适当的表达载体进行转化的宿主细胞，和这些宿主细胞的培养物则可用于合成本发明的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白质制剂同样也可以通过宿主细胞和细胞培养物来制备。
将宿主细胞在适合于维持细胞的培养基中进行培养，并且产生细胞和含有重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的培养基的混合物。选择性地，可进行混合物的纯化。可以使用的纯化方法包括，但不限于离子交换层析、亲和层析，电泳、透析及现有技术中已知的其它蛋白质提纯方法。从宿主细胞制备出了含纯化或未纯化的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白质制剂。这些蛋白质制剂包含重组丝氨酸蛋白酶抑制剂及可能的来自细胞和培养基混合物的其它物质，这将取决于蛋白质纯化的程度。
因此，本发明提供了一种生产重组丝氨酸蛋白酶抑制剂例如人α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的方法，包括培养能够表达重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的宿主细胞，以及可选择地纯化混合物从而得到纯化形式的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。
当术语“纯化的”用于描述本发明中的核酸序列时，指的是核酸序列基本上不含不编码重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的核酸或在非重组细胞中常与核酸有关的其它物质。当术语“纯化的”或“以纯化形式的”当用于描述重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质的状态时，指的是至少在某种程度上重组丝氨酸蛋白酶抑制剂不含有细胞物质。重组丝氨酸蛋白酶抑制剂优选具有至少约25％到约100％的纯度或同一性。更优选纯度约50％或更高。
依照本发明的教导制备的丝氨酸蛋白酶抑制剂能够用于与蛋白酶或其抑制剂的异常功能有关的疾病的治疗。例如，丝氨酸蛋白酶例如弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，胰凝乳蛋白酶样蛋白酶及胰蛋白酶与吞噬作用有关。这些蛋白酶或它们抑制剂的功能异常与发炎、气肿、成年人呼吸道困难综合症(ARDS)及类风湿性关节炎有关。丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶及肠激酶参与消化作用。这些酶或它们的抑制剂的功能异常与胰腺炎有关。丝氨酸蛋白酶如纤溶酶和纤溶酶原激活剂与纤维蛋白溶解有关。这些蛋白酶或它们抑制剂的功能异常则与肿瘤的侵人有关。丝氨酸蛋白酶如因子IXI，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子VIIa，凝血酶，活化的蛋白质C血浆血管舒缓素均参与血液凝结作用。这些蛋白酶或它们的抑制剂的异常功能与血管堵塞、脑梗塞、及冠状动脉梗塞有关。丝氨酸蛋白酶如因子Clr，因子Cls，因子D，因子B及C3转化酶参与补体活化。这些蛋白酶及它们的抑制剂的异常功能与类风湿性关节炎和发炎有关。丝氨酸蛋白酶如组织激肽释放酶及后脯氨酸裂解酶参与激素的产生与降解。这些蛋白酶或它们的抑制剂的功能异常与发炎有关。丝氨酸蛋白酶如纤溶酶、纤溶酶原激活剂及顶体蛋白与排卵及受精有关。这些蛋白酶及它们抑制剂的功能与生育控制有关。依赖于ATP的蛋白酶参与蛋白质的翻转。与这些蛋白酶及它们的抑制剂相关的异常特性则与肌肉降解与发烧有关。
本发明的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂在药物学上可接受的载体的存在下以有效量给药于病人。“有效量”所指的量能调节选定的蛋白酶活性的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的浓度。通常该数量可依照病人的体重，年龄及临床诊断的状况由本领域的技术人员确定。适宜的药物学上可接受的载体在本领域是熟知的，并且被描述于，例如，Gennaro，Alfonso，ed.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA中，该书为该领域的标准参考文献。适宜的药物载体依照预定的给药途径及标准的药物应用经验来选定。该组合物可按任何适当途径进行给药，包括，但并不限于静脉注射，口服，腹膜内注射，肌肉注射，皮下注射，局部施用，以及通过上皮或粘膜下层例如鼻的，口腔的，阴道的，直肠的，胃肠的吸收作用。活性成分与药物载体的比例一般取决于重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的化学性质、溶解性、稳定性。按照已公开的发明制备的组合物可单独或与其它化合物结合进行给药，所述的其它化合物包括但不限于其它重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，抗体，毒素、以及反义寡核苷酸。这些组合物对于诊断和治疗野生型丝氨酸蛋白酶抑制剂不足的病人也有用。家族的αl-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)缺乏，定义为低于正常水平64％的血浆水平，在具有低于正常水平50％的部分缺乏的病人及其亲属中进行了研究。8个ACT缺乏者中的6个，超过25岁，患有肝异常，而8个ACT缺乏者中的3个则患有肺异常。这些患者的症状在严重的疾病到轻微的实验室异常之间变化，并且似乎与ACT的基因中有一至两个等位基因的缺失导致的ACT的异常表达有关，所述的缺失引起蛋白酶Chtr的不可控制的活性。Eriksson等，ActaMed Scand 1986，220，447。人α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)基因的两个缺失突变体与慢性阻塞性肺病(COPD)有关。Poller，W.等，Genomics 1993，17，740。在患有COPD病的家族的连续三代中都观察到了亮氨酸55被脯氨酸取代导致的ACT等位基因的缺陷。在有阳性家族史的四个病人中的另一种突变，脯氨酸229被丙氨酸取代，与ACT血清缺乏有关。在每种这样的突变中，与突变有关的生理现象都能通过对缺乏的早期的诊断和治疗得到缓解。利用熟知的PCR或RT-PCR技术对突变进行识别并与本发明中的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂进行相关分析可以使这种情况的诊断简化。另外，本发明中的组合物在治疗这些缺乏症时很有用。提供以下非限制性的实施例用来进一步说明本发明。
实施例
实施例1：ACT类似物的制备及纯化
以ACT表达载体pACT作为开始，并使用标准的定点诱变基因，在相应于P10-P9的位置上产生了一个独一的Kpnl限制位点，将Ala-Ala变为Gly-Thr，并且在P10′-P11′产生了一个Mlul限制位点，将Val变为Thr。由这种表达载体编码的变异体rACT的相关速率常数是5×106M-1S-1，并且具有一个S1值为1的野生型的等价体。通过移走Kpnl-Mlul片断并且插入合成的带有选定编码序列的双链寡核苷酸即可产生盒变异体。rACT-P10P10′，rACT-P10P5″及rACT-OM突变体都可在盒载体中产生。
点突变体rACT-T345R，rACT-A347R及rACT-A350R可通过使用标准技术由PCR产生。编码特定突变的一对互补内部引物通过分别与它们相应的外部引物配对用于两个PCR反应。两个PCR反应得出两种类型的突变，它们包含突变位点并具有互补末端。两种类型以相同的摩尔浓度混合用作突变体模板，用两个外部引物进行PCR反应扩增突变基因。以这种方式构建的点突变体rACT-T345R，rACT-A347R及rACT-A350R由核酸序列得到了证实。
进行野生型rACT和突变体提纯时，在French press中溶解细菌，接下来进行离心，并将上清液加入阴离子交换柱，并用盐梯度液洗脱。将活性级分加入DNA纤维素柱并且用盐洗脱。纯产品在SDS-PAGE胶上呈现单一的带。由这种方法制备的突变示于表1。
                        表1抗胰凝乳蛋白酶反应中心环的突变SEQ ID    名称                     序列/突变NO
                       P10    P5    P1P1′P5′P10′3         rACT   (野生型)           TEASAATAVKITLLSALVETRTIVRFN4         rACT-L358M                ::::::::::::::M::::::::::::5         rACT-L358R                ::::::::::::::R::::::::::::6         rACT-L358W                ::::::::::::::W::::::::::::7         rACT-V-P3′               :::::::::::::::::V:::::::::8         rACT-P3P3′              ::::::::::::IPMSIP::::::::::9         rACT-P6-P3                :::::::::LEAIPMSIP:::::::::10        rACT-CAS                  ::::GT:::::::::::::::::T:::11        rACT-CAS-F                ::::GT::::::::F::::::::T:::12        rACT-CAS-M                ::::GT::::::::M::::::::T:::13        rACT-CAS-P3-P3′          ::::GT::::::IPMSIp:::::T:::14        rACT-CAS-P3-P3′/L        ::::GT::::::IPLSIp:::::T:::15        rACT-CAS-ElasW            ::::GT:::::VISAEWM:::::T:::16        rACT-CAS-Try              ::::GTMFLEAIPMSIPPE::::T:::17        rACT-P10P5′              ::::GTMFLEAIPMSIPPE::::A:::18        rACT-P10P10′             ::::GTMFLEAIPMSIPPEVKFNT:::19        rACT-T345R                R::::::::::::::::::::::::::20        rACT-T347R                ::R::::::::::::::::::::::::21        rACT-T350R                :::::R:::::::::::::::::::::22        rACT-PZM/P3P4′ΔP6′9′  ::::GTTAVKIIPMSIPPE////T:::23        rACT-PI-P3′R             :::::::::::IPRSIP::::::::::24        rACT-Hep Cof II           :::::::::::MPLSTQ::::::::::25        rACT-抗-凝血酶            :::::::::::AGRSLN::::::::::26        rACT-Ci抑制剂             :::::::::::VARTLL::::::::::27        rACT-PAI                  :::::::::::SARMAP::::::::::28        rACT-抗-纤溶酶            :::::::::::MSRMSL::::::::::29        rACT-Prot C.Inhi          :::::::::::TFRSAR::::::::::30        α1P1   (野生型)          TEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFT
在上表中，符号“:”表示与野生型相同的氨基酸；符号“/”表示氨基酸的缺失。
实施例2：人嗜中性白细胞弹性蛋白酶活力的抑制
测定人嗜中性弹性蛋白酶的浓度，含有N-mMeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA，SEQID NO：1，(在1％的Me2SBSO中的终浓度为1.0mM)在100mM Hepes，500 mM NaCl，pH7.5，室温下表现出特异性活性为0.0053吸光度单位(410nm)/min/pmol/ml。测定Chtr的活力，具有Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，SEQ ID NO：2，(在0.2％Me2SO中的终浓度为0.2mM)在500mM Tris-HCl，0.025％Tx-100，pH8.3，室温下表现出特异性活性为0.02的吸光度单位(410nm)/min/pmol/ml。抑制性的化学计算法分析在含100mM Tris-HCl，pH8.3，0.005％(v/v)Triton X-100及恒定量的Chtr(大约180μM)的1ml中，在变换rACT及突变体浓度的条件下进行。rACT突变体对Chtr的抑制速率在25℃二级条件下在含有Chtr和具抑制活性的突变体的等摩尔浓度的反应混合物中进行测定。这些实验得到的数据示于表2。
实施例3：组织蛋白酶G活性的抑制
从人体嗜中性白细胞中得到的组织蛋白酶G来自雅典研究和技术公司(雅典，GA)并在未进一步提纯的条件下直接使用。组织蛋白酶G的浓度在标准分析条件下(0.1M Hepes，pH7.5和1mM Suc-AAPF-P-NA，37℃)测定，表现出为每分钟250pmol产品的特异性活性。组织蛋白酶G(250 nM)与rACT变异体的反应在250℃含有以下缓冲液的0.1-0.2mM的溶液中进行：PBS，pH7.4；0.1M Tris-HCl，pH8.3；1M Tris-HCl，pH7.0；1.0MNaPi，pH7.0或1MNaPi，pH8.3。与不同量的抑制剂保温15到30分钟后，残余活性由分光光度法通过在含有4mM底物溶液Suc-AAPF-pNA的0.8ml标准分析缓冲液中稀释样品等分(4-8倍)进行测定。底物的水解速率在用于测定残余活力的2分钟内保持不变，说明组织蛋白酶G：ACT复合物是对稀释稳定的。这些实验得到的数据示于表2。
实施例4：胰凝乳蛋白酶活力的抑制
测定胰凝乳蛋白酶(Chtr)的活力，含Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，SEQ ID NO：2，(在0.2％Me2SO中的终浓度为0.2mM)在500mM Tris-HCl，0.025％Tx-100，pH8.3，室温下表现出特异性活性为0.02吸光度单位(410nm)/min/pmol/ml。抑制性的化学计算法分析(SI)在总体积为1ml含有100mM Tris-HCl，pH8.3，0.005％(v/v)Triton-X-100及恒定量的Chtr(约180μM)中，改变rACT及突变体浓度的条件下进行。rACT突变体对Chtr的抑制速率在25℃二级条件下在含有等摩尔浓度的Chrt和具抑制活性的突变体的反应混合物中测定。这些实验中得到的数据示于表2。
实施例5：胰凝乳蛋白酶样蛋白酶活力的抑制
纯化胰凝乳蛋白酶样蛋白酶并按照Schecter等，J.Biol.Chem.1993，268，23626所描述的方法确定其浓度。各种rACT抑制剂对胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的抑制用滴定法测定。在含有1至2M NaCl/含有0.01％Triton X-100，pH8.0的0.1M的Tris-HCl的反应液中，在25℃以增加量的rACT变异体滴定胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。用总体积以50到100μl含有相同量胰凝乳蛋白酶样蛋白酶与不同量rACT变异体的几种反应完成该滴定。适当的反应时间后的残余活力可按以下进行确定，首先从每个反应液中移走等分，将它用含有1mM Suc-Ala-Pro-Phe-pNA(SEQ IDNO：2)底物的分析缓冲液稀释至1ml，并用分光光度法在410nm监测pNA的释放达3分钟。底物的水解速率在3分钟的监测期间内保持不变，说明胰凝乳蛋白酶样蛋白酶-ACT复合物对稀释是稳定的，并且用该方法得到的残余活力是滴定反应中对自由酶的可靠测量。将数据转化成分数活力并对[I]0/[E]0的对每一反应的比率作图从而确定抑制的化学计算法。各种rACT抑制剂对胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的抑制速率常数(Kobs/I)在拟一级条件下在底物存在时进行测定。抑制剂浓度是酶浓度乘以SI的至少10倍以上。由数据计算得出的表观抑制速率常数由于底物的存在要进行校正，从而得到Kobs/I值。这些实验的数据示于表2
                                  表2
                   变对抗胰凝乳蛋白酶反应环的酶抑制效果
SEQ ID NO 胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制 组织蛋白酶-G抑制 胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制 人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制 凝血酶抑制 纤溶酶抑制
3 a a p i p
    4     a     a       p      p
5 p p i a a
    6       v
    7     a       a
    8     a     a       a      a
    9     a      p
    10     a     a       p      i     p
    11     v     v       p
    12     a     a       p      p
    13     a     a       a      a
14 a i
15 i i
    16     i
    17     p      i
18 p i
19 i i i
    22     a      a
    30      a
在表2中：
“v”表示非常有效，优于任何天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂；
“a”表示有效；
“p”表示部分有效；以及
“i”表示无效。
                                序列表
(1)一般信息
(i)申请人：哈维·鲁宾，巴里·库珀曼，诺曼·谢克特，迈克尔·普洛特金，
           王志美
(ii)发明名称：制备有效的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法及这些抑制剂的应用。
(iii)序列数：34
(iv)通讯地址：
(A)收信人：简·马塞·利卡塔，先生
(B)街通：210 Lake Drire East，Suife 201
(C)城市：Cherry Hill
(D)州：新译西州
(E)国家：美国
(F)邮编：08002
(V)计算机读取于：
(A)媒介类型：软盘，3.5英寸，1.44Mb储存容量
(B)计算机：IBM486
(C)操作系统：WINDOWS FOR WORKGROUPS
(D)软件：WORDPERFECT5.1
(vi)最新申请资料：
(A)申请号：未指定
(B)申请日：内附
(C)分类：
(vii)优先申请资料：
(A)申请号：276,936
(B)申请日：1994年7月19日
(A)申请号：221,078
(B)申请日：1994年3月31日
(A)申请号：221,171
(B)申请日：1994年3月31日
(A)申请号：005,908
(B)申请日：1993年1月15日
(A)申请号：735,335
(B)申请日：1991年7月24日
(viii)代理人/代理机构信息(A)名称：简·马塞·利卡塔(B)登记号：32,257(C)参考/卷宗号：PENN-0107(ix)电讯信息：(A)电话：(609)779-2400(B)传真：(609)779-8488(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征：
  (A)长度：4
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Ala Ala Pro Val
1(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征：
  (A)长度：4
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Ala Ala Pro Phe
1(2)SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Met Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Alg Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Trp Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Vlu Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：7的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Ala Val Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：8的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys Ile Ile Pro Met Ser
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Ile Pro Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：9的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser
1               5                   10                  15
Ile Pro Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：10的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Thr Glu Ala Ser Gly Thr Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Thr Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：11的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
Thr Glu Ala Ser Gly Thr Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Thr Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：12的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
Thr Glu Ala Ser Gly Thr Thr Ala Val Lys Ile Thr Leu Met Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Thr Arg Phe Asn
                20                  25(2)SEQ ID NO：13的信息(i)序列特征：
  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
Thr Glu Ala Ser Gly Thr Thr Ala Val Lys Ile Ile Pro Met Ser
1               5                   10                  15
Ile Pro Val Glu Thr Arg Thr Ile Thr Arg Phe Asn
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  (A)长度：27
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
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1               5                   10                  15
Ile Pro Val Glu Thr Arg Thr Ile Thr Arg Phe Asn
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  (B)类型：氨基酸
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1               5                   10                  15
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  (B)类型：氨基酸
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  (B)类型：氨基酸
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1               5                    10                  15
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1               5                   10                  15
Ile Pro Pro Glu Thr Arg Phe Asn
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  (B)类型：氨基酸
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Ile Pro Val Glu Thr Arg Thr Ile Vrg Arg Phe Asn
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                5                   10                  15
Leu Asn Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
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  (B)类型：氨基酸
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1               5                   10                  15
Leu Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
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1               5                   10                  15
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1               5                   10                  15
Ser Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
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1               5                   10                  15
Ala Arg Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn
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1               5                   10                  15
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Val Lys Phe Asn Thr
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Claims (31)

1.生产能有效调节丝氨酸蛋白酶活性的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法，包括：
a)确定选定丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列；
b)识别所述丝氨酸蛋白酶抑制剂反应环，所述反应环包含蛋白酶结合位点的第一氨基酸序列及铰链区的第二氨基酸序列；
c)修饰所述蛋白酶结合位点的第一氨基酸序列从而改变丝氨酸蛋白酶抑制剂对其它蛋白酶的选择性；
d)修饰所述铰链区的第二氨基酸序列从而使得所述重组丝氨酸蛋白酶抑制剂能够有效调节蛋白酶的活性；及
e)合成所述的修饰重组丝氨酸蛋白酶抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述铰链区的第二氨基酸序列由含短的中性侧链的氨基酸进行修饰。
3.权利要求1的方法，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂也能与DNA连接。
4.能有效调节丝酸蛋白酶活性的组合物，包括重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂含有具有修饰的氨基酸序列的蛋白酶结合位点及反应环的铰链区。
5.权利要求4的组合物，其中所述铰链区的修饰氨基酸序列包含具有短的中性侧链的氨基酸。
6.权利要求4的组合物，在调节细胞或组织的发炎过程中的应用。
7.调节丝氨酸蛋白酶的方法，包括：
a)选择可以在细胞或组织中积累的靶蛋白酶；
b)制备含有具有修饰氨基酸序列的蛋白酶结合位点及反应中心环的铰链区的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，从而改变丝氨酸蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶之间的相互作用；及
c)将细胞或其中发炎细胞积累的组织与修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂接触，从而调节丝氨酸蛋白酶的活性。
8.权利要求7的方法，其中所述铰链区的修饰氨基酸序列包含具有短的中性侧链。
9.诊断怀疑患有编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因突变从而导致蛋白酶无控制活性的病人的方法，包括：
a)从怀疑具有蛋白酶无控制活性特征症状的患者中获得生物样本；
b)识别与该状态有关的丝氨酸蛋白酶抑制剂；以及
c)测定编码所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因中的突变。
10.权利要求9的方法，其中的症状包含肝及肺的异常。
11.治疗与丝氨酸蛋白酶有关的患者症状的方法，包括给药于患者有效量的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂含有具有修饰氨基酸序列的蛋白酶结合位点及反应环上的铰链区。
12.权利要求11的方法，其中的症状包括发炎、生育力控制、肿瘤迁移、向神经性、热休克、急性心肌梗塞、烧伤、自身免疫疾病、恶性病、感染或肝脏同种移植排斥。
13.抑制分子或细胞发炎机制及减少细胞或组织中组织损伤的方法，包括将有效量的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂与细胞或组织接触，该抑制剂含有具有修饰的氨基酸序列的蛋白酶结合位点及反应环上的铰链区。
14.人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，其中相应于野生型αα-1-抗胰凝乳蛋白酶的第350位上的氨基酸丙氨酸被精氨酸取代。
15.人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349至368位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Arg-Thr-Ile-Val被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-Phe-Asn-Thr取代。
16.人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的类似物，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349到363位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu取代，且第368位的氨基酸Val被Ala所取代。
17.编码人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的核酸序列，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第350位的氨基酸丙氨酸被精氨酸取代。
18.表达载体，包含权利要求17的核酸序列。
19.能够表达权利要求17的核酸序列的宿主细胞。
20.编码人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的核酸序列，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349-368位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Arg-Thr-Ile-Val被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-Phe-Asn-Thr取代。
21.表达载体，包含权利要求20的核酸序列。
22.能表达权利要求20的核酸序列的宿主细胞。
23.编码人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的核酸序列，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349-363位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu取代，且第368位的氨基酸Val被Ala所取代。
24.包含权利要求23的核酸序列的表达载体。
25.能表达权利要求23的核酸序列的宿主细胞。
26.能表达人野生型α-1-抗胰乳蛋白酶类似物的细胞培养物，其中相应于人野生型α-1-抗胰乳蛋白酶的第350位的氨基酸丙氨酸被精氨酸取代。
27.能够表达人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的细胞培养物，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349-368位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Arg-Thr-Ile-Val被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-Phe-Asn-Thr取代。
28.能够表达人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的细胞培养物，其中相应于野生型α-1-抗胰乳蛋白酶的第349-363位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-lle-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu被Gly-Thr－Met-Phe-Leu-Glu-Ala－Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu取代，且第368位的氨基酸Val被Ala所取代。
29.包含人野生型α-1-肮胰凝乳蛋白酶类似物的蛋白质制剂，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第350位的氨基酸丙氨酸被精氨酸取代。
30.包含人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的蛋白制剂，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349-368位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Arg-Thr-Ile-Val被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-Phe-Asn-Thr取代。
31.包含人野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶类似物的蛋白质制剂，其中相应于野生型α-1-抗胰凝乳蛋白酶的第349-363位的氨基酸Ala-Ala-Thr-Ala-Val-Lys-Ile-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu被Gly-Thr-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu取代，并且第368位的缬氨酸被丙氨酸取代。
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