CN117858895A

CN117858895A - 使用表达增强的编码重组fviii变体的病毒载体的血友病a基因疗法

Info

Publication number: CN117858895A
Application number: CN202280053592.6A
Authority: CN
Inventors: H·罗滕施泰纳
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2024-04-09
Also published as: WO2022264040A1; US20240269241A1; EP4355768A1; JP2024527252A

Abstract

除其他方面外，本公开提供了用于在哺乳动物细胞中表达的编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开还提供了用于治疗血友病A的哺乳动物基因疗法载体和方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于向血友病A患者给药编码因子VIII多肽的多核苷酸，例如密码子改变的多核苷酸的方法。

Description

使用表达增强的编码重组FVIII变体的病毒载体的血友病A基因疗法

申请的交叉引用

本申请要求2021年6月14日提交的美国临时专利申请序列号63/210,386的优先权，其公开内容出于所有目的特此通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2022年6月2日，命名为008073-5236-WO_Sequence_Lisitng_ST25.txt，并且大小为84,955千字节。

背景技术

血液凝固通过相互依赖的生化反应的复杂且动态的生物途径进行，称为凝血级联。凝血因子VIII(FVIII)是级联中的关键组分。因子VIII被募集到出血部位，并且与活化的因子IX(FIXa)和因子X(FX)形成X酶复合物。X酶复合物活化FX，FX进而将凝血酶原活化为凝血酶，然后凝血酶活化凝血级联中的其他组分以产生稳定的血块(Saenko等人,TrendsCardiovasc.Med.,9:185-192(1999)；Lenting等人,Blood,92:3983-3996(1998)中综述)。

血友病A是一种先天性X连锁出血性病症，其特征是缺乏因子VIII活性。因子VIII活性降低会抑制凝血级联中的正反馈回路。这会引起不完全凝血，其表现为持续时间增加的出血发作、广泛的瘀伤、自发性口腔和鼻腔出血、关节僵硬和慢性疼痛，并且严重时可能出现内出血和贫血(Zhang等人,Clinic.Rev.Allerg.Immunol.,37:114-124(2009))。

传统上，血友病A通过因子VIII替代疗法来治疗，所述疗法包括向患有血友病A的个体施用因子VIII蛋白(例如血浆衍生的或重组产生的因子VIII)。响应于急性出血发作，预防性地施用因子VIII以预防或减少出血发作的频率，和/或围手术期地施用以控制手术期间的出血。然而，因子VIII替代疗法有一些不期望的特征。

第一，因子VIII替代疗法用于治疗或控制血友病A，但不能治愈潜在的因子VIII缺陷。因此，血友病A患者终生需要因子VIII替代疗法。持续治疗价格昂贵，并且需要个体严格遵守，因为仅缺少少量预防剂量就可能对患有严重血友病A的个体产生严重后果。

第二，由于因子VIII在体内的半衰期相对较短，传统的预防性因子VIII替代疗法需要每两天或三天施用一次。这给个体带来了终其一生保持依从性的负担。虽然第三代“长效”因子VIII药物可能减少施用频率，但使用这些药物的预防性因子FVIII替代疗法仍然需要每月、每周或更频繁地永久施用。例如，使用ELOCTATE^TM[抗血友病因子(重组)、Fc融合蛋白]的预防性治疗需要每三至五天施用一次(ELOCTATE^TMPrescribing Information,BiogenIdec Inc.,(2015))。此外，化学修饰生物制剂(例如，聚乙二醇化多肽)的长期影响尚未完全了解。

第三，接受因子VIII替代疗法的所有个体中有15％至30％形成抗因子VIII抑制剂抗体，导致治疗效率低下。因子VIII旁路疗法(例如，施用血浆衍生的或重组产生的凝血酶原复合物浓缩物)可用于治疗形成抑制剂抗体的个体的血友病。然而，因子VIII旁路疗法不如因子VIII替代疗法有效(Mannucci,J.Thromb.Haemost.,1(7):1349-55(2003))并且可能与心血管并发症的风险增加相关(Luu和Ewenstein,Haemophilia,10增刊2:10-16(2004))。

体细胞基因疗法对于治疗血友病A具有巨大的前景，因为它可以纠正潜在的功能性因子VIII活性表达不足(例如，由于错义或无义突变)，而不是向个体提供一次性剂量的因子VIII活性。由于作用机制的这种差异，与因子VIII替代疗法相比，一次性施用因子VIII基因疗法载体可为个体提供数年的因子VIII，从而降低治疗成本并消除对患者的持续依从性的需要。

凝血因子IX(FIX)基因疗法已被有效用于治疗患有血友病B的个体，血友病B是一种特征在于因子IX活性降低的相关血液凝固病状(Manno等人,Nat.Med.,12(3):342-47(2006))。然而，因子VIII基因疗法提出了若干项独特的挑战。例如，全长野生型因子VIII多肽(2351个氨基酸；UniProt登录号P00451)比全长野生型因子IX多肽(461个氨基酸；UniProt登录号P00740)大五倍。因此，野生型因子VIII的编码序列为7053个碱基对，太大而无法包装在常规AAV基因疗法载体中。此外，已报道的因子VIII的B结构域缺失变体(BDD-FVIII)的重组表达较差。因此，若干个小组尝试改变BDD-FVIII构建体的密码子使用，但取得的成功有限。

发明内容

因此，需要其编码序列能够更高效地包装到基因疗法载体中并经由基因疗法载体递送的因子VIII变体。还需要更高效地表达因子VIII的合成的、密码子改变的核酸。此类因子VIII变体和密码子改变的核酸允许改进对因子VIII缺陷(例如，血友病A)的治疗。所公开的密码子改变的因子VIII变体减少或消除了上述缺陷以及与因子VIII缺陷(例如，血友病A)的治疗相关的其他问题。

根据一些实施方案，本公开提供了核酸，所述核酸编码与所公开的密码子改变的因子VIII重链(例如，CS04-HC-NA)和轻链(例如，CS04-LC-NA)序列具有高序列同一性的因子VIII变体。在一些实施方案中，这些核酸还包括编码因子VIII重链和轻链的序列之间的编码接头序列的序列，所述接头序列替代天然因子VIII B结构域(例如，包含弗林蛋白酶切割位点的接头序列)。

在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包括编码因子VIII多肽的核苷酸序列。因子VIII多肽包括轻链、重链以及将重链的C末端接合至轻链的N末端的多肽接头。因子VIII多肽的重链由与CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3)具有至少95％同一性的第一核苷酸序列编码。因子FVIII多肽的轻链由与CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4)具有至少95％同一性的第二核苷酸序列编码。多肽接头包含弗林蛋白酶切割位点。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多肽接头由与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3))具有至少96％的同一性，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4))具有至少96％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3))具有至少97％的同一性，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4))具有至少97％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3))具有至少98％的同一性，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4))具有至少98％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3))具有至少99％的同一性，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4))具有至少99％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3))具有至少99.5％的同一性，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ IDNO:4))具有至少99.5％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3))具有至少99.9％的同一性，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ IDNO:4))具有至少99.9％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子VIII多肽的重链的第一核苷酸序列是CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3)，并且编码因子FVIII多肽的轻链的第二核苷酸序列是CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4)。

在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含与CS04-FL-NA具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码因子VIII多肽。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1))具有至少96％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1))具有至少97％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1))具有至少98％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1))具有至少99％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1))具有至少99.5％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1))具有至少99.9％的同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列是CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少96％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少97％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少98％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少99％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少99.5％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少99.9％同一性的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子VIII多肽，所述多肽包含CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组的序列具有至少95％同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组的序列具有至少96％同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组的序列具有至少97％同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组的序列具有至少98％同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组的序列具有至少99％同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组的序列具有至少99.5％同一性。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列选自由CS04-FL-NA、CS04-HC-NA和CS04-LC-NA组成的组。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括启动子元件，其可操作地连接至编码因子VIII多肽的多核苷酸。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括增强子元件，其可操作地连接至编码因子VIII多肽的多核苷酸。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括聚腺苷酸化元件，其可操作地连接至编码因子VIII多肽的多核苷酸。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括内含子元件，其可操作地连接至编码因子VIII多肽的核苷酸序列。

在上述多核苷酸的一个实施方案中，内含子位于编码因子VIII多肽的核苷酸序列的启动子元件与翻译起始位点(例如，第一编码ATG)之间。

在另一个方面，本公开提供了一种哺乳动物基因疗法载体，其包括如本文所述的多核苷酸。

在本文所述的哺乳动物基因疗法载体的一个实施方案中，哺乳动物基因疗法载体是腺相关病毒(AAV)载体。

在上述哺乳动物基因疗法载体的一个实施方案中，AAV载体是AAV-8载体。

在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗血友病A的方法，其包括向有需要的患者施用如本文所述的哺乳动物基因疗法载体。

在另一个方面，本公开提供了一种如上所述的用于治疗血友病A的哺乳动物基因疗法载体。

在另一个方面，本公开提供了如上所述的哺乳动物基因疗法载体用于制造用于治疗血友病A的药物的用途。

附图说明

图1示出了野生型和ReFacto型人因子VIII蛋白构建体的示意图。

图2A和图2B示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的CS04密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)(“CS04-FL-NA”表示全长编码序列)。

图3示出了根据一些实施方案的由CS04密码子改变的核苷酸序列编码的因子VIII变体氨基酸序列(SEQ ID NO:2)(“CS04-FL-AA”表示全长氨基酸序列)。

图4示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的重链的CS04密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的部分(“CS04-HC-NA”)。

图5示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的轻链的CS04密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的部分(“CS04-LC-NA”)。

图6示出了根据一些实施方案的B结构域取代的接头的示例性编码序列(SEQ IDNO:5)。BDLO04(SEQ ID NO:5)是CS04密码子改变的核苷酸序列的编码B结构域取代的接头的相应部分。

图7A、图7B和图7C示出了根据一些实施方案的含有CS04密码子改变的核苷酸序列的AAV载体序列(SEQ ID NO:6)(“CS04-AV-NA”)。

图8A和图8B示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的CS08密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)(“CS08-FL-NA”)。

图9A和图9B示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的CS10密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)(“CS10-FL-NA”)。

图10A和图10B示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的CS11密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)(“CS11-FL-NA”)。

图11A和图11B示出了根据一些实施方案的CS40野生型ReFacto编码序列(SEQ IDNO:10)(“CS40-FL-NA”)。

图12A和图12B示出了根据一些实施方案的编码因子VIII变体的CH25密码子改变的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)(“CH25-FL-NA”)。

图13示出了根据一些实施方案的野生型人因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:12)(“FVIII-FL-AA”)。

图14图示了通过将合成的Refacto型BDD-FVIIIDNA序列经由AscI和NotI限制性位点插入载体骨架pCh-BB01中来克隆pCS40、pCS04、pCS08、pCS10、pCS11和pCh25构建体的方案。

图15示出了通过琼脂糖凝胶电泳分析的AAV载体基因组制备剂的完整性。泳道1，DNA标记；泳道2，vCS40；泳道4，vCS04。AAV载体具有相同大小的基因组，迁移距离为大约5kb(箭头，右侧)。左侧的刻度表示DNA片段的大小，以千碱基(kb)为单位。

图16示出了通过PAGE和银染色对AAV载体制备剂进行的蛋白质分析。泳道1，蛋白质标记(M)；泳道2，vCS40；以及泳道4，vCS04。所述构建体均具有相同的AAV8衣壳，所述衣壳由VP1、VP2和VP3组成(右侧箭头)。左侧的刻度表示蛋白质标记的大小，以千道尔顿(kDa)为单位。

图17示出了全身施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后的FVIII活性，如实施例3中所述。cp，载体衣壳颗粒；FVIII，因子VIII；LLOQ，量化下限。图表中从左到右示出了14、28、42和56天的时间点。

图18示出了全身施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，尾尖出血测定中的失血量减少，如实施例3中所述。cp，载体衣壳颗粒。

图19A、图19B和图19C示出了在全身施用后，含有CS04因子VIII密码子优化的构建体DNA的基于(r)AAV8的基因疗法载体的生物分布。1902＝肝脏；1904＝淋巴结；1906＝骨骼肌；1908＝心脏；1910＝肾；1912＝脾；1914＝肺；1916＝睾丸；1918＝大脑。

图20A、图20B、图20C和图20D图示了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，四名血友病A患者的血液中因子VIII活性随时间的变化，如实施例5中所述。

图21示出了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，四名血友病A患者的外周血中TNFa和IL-6水平随时间的变化，如实施例5中所述。

图22A和图22B图示了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，四名血友病A患者的外周血中的AAV8中和抗体滴度(22A)以及抗AAV8IgM和IgG结合滴度随时间的变化，如实施例5中所述。

图23A、图23B、图23C和图23D示出了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，四名血友病A患者的外周血中的AAV和FVIII-BDD抗原T细胞反应随时间的ELISpot测定的结果，如实施例5中所述。

图24图示了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，用于评价四名血友病A患者随时间变化的各种免疫原性途径中的基因表达模式的转录组分析工作流程，如实施例5中所述。

图25A、图25B、图25C和图25D图示了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，三名血友病A患者和健康对照的外周血中的经由TLR的MyD88依赖性和非依赖性免疫活化途径随时间的表达模式，如实施例5中所述。

图26A、图26B、图26C和图26D图示了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，三名血友病A患者和健康对照的外周血中的先天免疫信号传导和抗病毒细胞因子反应随时间的表达模式，如实施例5中所述。

图27A、图27B、图27C和图27D图示了在施用含有CS04因子VIII密码子优化构建体的基于(r)AAV8的基因疗法载体后，三名血友病A患者和健康对照的外周血中的典型和替代NFκB信号传导途径随时间的表达模式，如实施例5中所述。

具体实施方式

I.引言

基于AAV的基因疗法对于血友病患者的治疗具有巨大的前景。对于血友病B，第一临床数据令人鼓舞，因为至少某些患者可以维持约10％的FIX水平超过1年。然而，对于血友病A，由于各种原因，使用AAV载体实现5-10％的治疗表达水平仍然具有挑战性。第一，因子VIII编码序列对于常规的基于AAV的载体来说太大。第二，工程化的B结构域缺失或截短的因子VIII构建体即使在密码子优化的情况下，体内表达也较差。第三，这些B结构域缺失或截短的因子VIII变体构建体体内半衰期短，加剧了表达不良的影响。第四，即使表达，FVIII也不能像其他凝血因子(诸如因子IX)那样高效地从细胞中分泌。因此，需要改进FVIII表达的策略，使FVIII基因疗法成为血友病A患者可行的治疗选择。

本公开内容涉及密码子改变的因子VIII变体编码序列的发现，其解决了与因子VIII基因疗法相关的这些和其他问题。例如，本文公开的多核苷酸在哺乳动物细胞中提供显著改善的表达，并且由于稳定的包装相互作用而表现出改善的病毒体包装。在一些实施方式中，通过使用与密码子改变的CS04构建体具有高序列同一性(例如，与CS04-HC重链编码序列具有高序列同一性，并且与CS04-LC轻链编码序列具有高序列同一性)的因子VIII的重链和轻链的编码序列来实现这些优点。

在一些实施方式中，由本文所述的多核苷酸编码的因子VIII分子已通过截短、缺失或替代野生型B结构域而缩短。因此，多核苷酸更适合经由常规基因疗法载体来表达因子VIII，常规基因疗法载体不能高效地表达较大的多肽，诸如野生型因子VIII。

有利地，本文显示CS04密码子改变的因子VIII变体编码序列提供了B结构域缺失的因子VIII构建体的体内优异表达。例如，实施例2和表4中展示了，在因子VIII敲除小鼠中(表4)，相对于用野生型多核苷酸序列(SEQ ID NO:17)编码的对应CS40构建体，静脉内施用具有CS04(SEQ ID NO:1)编码序列的基于AAV的基因疗法载体提供了因子VIII表达的74倍增加。

此外，本文还显示CS04密码子改变的因子VIII变体编码序列提供了优异的病毒体包装和病毒产量。例如，实施例1中展示了，当从相同量的细胞沉淀分离时，相对于用野生型多核苷酸序列编码的对应CS40构建体，含有CS04构建体的AAV载体构建体提供了5至7倍更大的病毒产量。

II.定义

如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有赋予其的含义。

如本文所用，术语“因子VIII”和“FVIII”可互换使用，并且是指任何具有因子VIII活性(例如，活性FVIII，通常称为FVIIIa)的蛋白质或具有因子VIII活性(特别是因子IXa辅因子活性)的蛋白质的蛋白质前体(例如，原蛋白或前原蛋白)。在一个示例性实施方案中，因子VIII多肽是指具有与野生型因子VIII多肽的重链和轻链具有高序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高)的序列的多肽。在一些实施方案中，因子VIII多肽的B结构域被缺失、截短或用接头多肽替代以减小编码因子VIII多肽的多核苷酸的大小。在一个示例性实施方案中，CS04-FL-AA的氨基酸20-1457构成因子VIII多肽。

野生型因子VIII多肽的非限制性实例包括人前原因子VIII(例如，GenBank登录号AAA52485、CAA25619、AAA58466、AAA52484、AAA52420、AAV85964、BAF82636、BAG36452、CAI41660、CAI41666、CAI41672、CAI43241、CAO03404、EAW72645、AAH22513、AAH64380、AAH98389、AAI11968、AAI11970或AAB61261)、对应的原因子VIII、及其天然变体；猪前原因子VIII(例如，Un iProt登录号F1RZ36或K7GSZ5)、对应的原因子VIII、及其天然变体；小鼠前原因子VIII(例如，GenBank登录号AAA37385、CAM15581、CAM26492或EDL29229)、对应的原因子VIII、及其天然变体；大鼠前原因子VIII(例如，GenBank登录号AAQ21580)、对应的原因子VIII、及其天然变体；大鼠前原因子VIII；以及其他哺乳动物因子VIII同系物(例如，猴、猿、仓鼠、豚鼠等)。

如本文所用，因子VIII多肽包括具有因子IX辅因子活性的天然变体和人工构建体。如本公开中所用，因子VIII涵盖保留一些基本因子IX辅因子活性(例如，对应的野生型活性的至少5％、10％、25％、50％、75％或更高)的任何天然变体、替代序列、同工型或突变体蛋白。在人群中发现的因子VIII氨基酸变异的实例(相对于FVIII-FL-AA(SEQ ID NO:19))包括但不限于S19R、R22T、Y24C、Y25C、L26P/R、E30V、W33G、Y35C/H、G41C、R48C/K、K67E/N、L69P、E72K、D75E/V/Y、P83R、G89D/V、G92A/V、A97P、E98K、V99D、D101G/H/V、V104D、K108T、M110V、A111T/V、H113R/Y、L117F/R、G121S、E129V、G130R、E132D、Y133C、D135G/Y、T137A/I、S138R、E141K、D145H、V147D、Y155H、V159A、N163K、G164D/V、P165S、C172W、S176P、S179P、V181E/M、K185T、D186G/N/Y、S189L、L191F、G193R、L195P、C198G、S202N/R、F214V、L217H、A219D/T、V220G、D222V、E223K、G224W、T252I、V253F、N254I、G255V、L261P、P262L、G263S、G266F、C267Y、W274C、H275L、G278R、G280D、E284K、V285G、E291G/K、T294I、F295L、V297A、N299I、R301C/H/L、A303E/P、I307S、S308L、F312S、T314A/I、A315V、G323E、L326P、L327P/V、C329F、I331V、M339T、E340K、V345A/L、C348R/S/Y、Y365C、R391C/H/P、S392L/P、A394S、W401G、I405F/S、E409G、W412G/R、K427I、L431F/S、R437P/W、I438F、G439D/S/V、Y442C、K444R、Y450D/N、T454I、F455C、G466E、P470L/R/T、G474E/R/V、E475K、G477V、D478N、T479R、F484C、A488G、R490G、Y492C/H、Y492H、I494T、P496R、G498R、R503H、G513S/V、I522Y、K529E、W532G、P540T、T541S、D544N、R546W、R550C/G/H、S553P、S554C/G、V556D、R560T、D561G/H/Y、I567T、P569R、S577F、V578A、D579A/H、N583S、Q584H/K/R、I585R/T、M586V、D588G/Y、L594Q、S596P、N601D/K、R602G、S603I/R、W604C、Y605H/S、N609I、R612C、N631K/S、M633I、S635N、N637D/I/S、Y639C、L644V、L650F、V653A/M、L659P、A663V、Q664P、F677L、M681I、V682F、Y683C/N、T686R、F698L、M699T/V、M701I、G705V、G710W、N713I、R717L/W、G720D/S、M721I/L、A723T、L725Q、V727F、E739K、Y742C、R795G、P947R、V1012L、E1057K、H1066Y、D1260E、K1289Q、Q1336K、N1460K、L1481P、A1610S、I1698T、Y1699C/F、E1701K、Q1705H、R1708C/H、T1714S、R1715G、A1720V、E1723K、D1727V、Y1728C、R1740G、K1751Q、F1762L、R1768H、G1769R、L1771P、L1775F/V、L1777P、G1779E/R、P1780L、I1782R、D1788H、M1791T、A1798P、S1799H、R1800C/G/H、P1801A、Y1802C、S1803Y、F1804S、L1808F、M1842I、P1844S、T1845P、E1848G、A1853T/V、S1858C、K1864E、D1865N/Y、H1867P/R、G1869D/V、G1872E、P1873R、L1875P、V1876L、C1877R/Y、L1882P、R1888I、E1894G、I1901F、E1904D/K、S1907C/R、W1908L、Y1909C、A1939T/V、N1941D/S、G1942A、M1945V、L1951F、R1960L/Q、L1963P、S1965I、M1966I/V、G1967D、S1968R、N1971T、H1973L、G1979V、H1980P/Y、F1982I、R1985Q、L1994P、Y1998C、G2000A、T2004R、M2007I、G2013R、W2015C、R2016P/W、E2018G、G2022D、G2028R、S2030N、V2035A、Y2036C、N2038S、2040Y、G2045E/V、I2051S、I2056N、A2058P、W2065R、P2067L、A2070V、S2082N、S2088F、D2093G/Y、H2101D、T2105N、Q2106E/P/R、G2107S、R2109C、I2117F/S、Q2119R、F2120C/L、Y2124C、R2135P、S2138Y、T2141N、M2143V、F2145C、N2148S、N2157D、P2162L、R2169C/H、P2172L/Q/R、T2173A/I、H2174D、R2178C/H/L、R2182C/H/P、M2183R/V、L2185S/W、S2192I、C2193G、P2196R、G2198V、E2200D、I2204T、I2209N、A2211P、A2220P、P2224L、R2228G/L/P/Q、L2229F、V2242M、W2248C/S、V2251A/E、M2257V、T2264A、Q2265R、F2279C/I、I2281T、D2286G、W2290L、G2304V、D2307A、P2319L/S、R2323C/G/H/L、R2326G/L/P/Q、Q2330P、W2332R、I2336F、R2339T、G2344C/D/S和C2345S/Y。因子VIII蛋白还包括含有翻译后修饰的多肽。

一般来讲，编码因子VIII的多核苷酸编码无活性的单链多肽(例如，前原蛋白)，其经历翻译后加工以形成活性因子VIII蛋白(例如，FVIIIa)。例如，参考图1，野生型人因子VIII前原蛋白首先被切割以释放编码的信号肽(未示出)，从而形成第一单链原蛋白(示出为“人野生型FVIII”)。然后在B与A3结构域之间切割原蛋白，以形成包括因子VIII重链(例如，A1和A2结构域)和B结构域的第一多肽，以及包括因子VIII轻链(例如，包括A3、C1和C3结构域)的第二多肽。进一步切割第一多肽以去除B结构域，并且还分离A1和A2结构域，其仍然与成熟因子VIIIa蛋白中的因子VIII轻链缔合。关于因子VIII成熟过程的综述，参见Graw等人,Nat.Rev.Genet.,6(6):488-501(2005)，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

然而，在一些实施方案中，因子VIII多肽是单链因子VIII多肽。单链因子VIII多肽被工程改造以去除天然切割位点，并且任选地去除、截短或替代因子VIII的B结构域。因此，它们不会通过切割(除了任选的信号和/或前导肽的切割)而成熟，并且作为单链具有活性。单链因子VIII多肽的非限制性实例描述于Zollner等人(Thromb.Res.,134(1):125-31(2014))和Donath等人(Biochem.J.,312(1):49-55(1995))，其公开内容特此出于所有目的通过引用整体并入。

如本文所用，术语“因子VIII重链”或简称“重链”是指因子VIII多肽的A1和A2结构域的聚集体。在一个示例性实施方案中，CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸20-759构成因子VIII重链。

如本文所用，术语“因子VIII轻链”或简称“轻链”是指因子VIII多肽的A3、C1和C2结构域的聚集体。在一个示例性实施方案中，CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸774-1457构成因子VIII轻链。在一些实施方案中，因子VIII轻链排除酸性a3肽，其在体内成熟过程期间释放。

一般来讲，因子VIII重链和轻链表达为单一多肽链，例如与任选的B结构域或B结构域取代的接头一起。然而，在一些实施方案中，因子VIII重链和因子VIII轻链表达为单独的多肽链(例如，共表达)，并且重构以形成因子VIII蛋白(例如，体内或体外)。

如本文所用，术语“B结构域取代的接头”和“因子VIII接头”可互换使用，并且指代野生型因子VIII B结构域(例如，FVIII-FL-AA(SEQ ID NO:19)的氨基酸760-1667)的截短型式或指代经工程改造以替代因子VIII多肽的B结构域的肽。如本文所用，根据一些实施方案，因子VIII接头位于因子VIII变体多肽中的因子VIII重链的C末端与因子VIII轻链的N末端之间。B结构域取代的接头的非限制性实例公开于美国专利号4,868,112、5,112,950、5,171,844、5,543,502、5,595,886、5,610,278、5,789,203、5,972,885、6,048,720、6,060,447、6,114,148、6,228,620、6,316,226、6,346,513、6,458,563、6,924,365、7,041,635和7,943,374；美国专利申请公布号2013/024960、2015/0071883和2015/0158930；以及PCT公布号WO 2014/064277和WO 2014/127215中，其公开内容特此出于所有目的通过引用整体并入。

除非本文另有说明，否则因子VIII氨基酸的编号是指呈现为图13中的SEQ ID NO:19的全长、野生型人因子VIII序列(FVIII-FL-AA)中的对应氨基酸。因此，当提及本文公开的因子VIII变体蛋白中的氨基酸取代时，所引用的氨基酸编号是指全长、野生型因子VIII序列中的类似(例如，结构或功能等同)和/或同源(例如，在一级氨基酸序列中在进化上保守)氨基酸。例如，T2105N氨基酸取代是指全长野生型人因子VIII序列(FVIII-FL-AA；SEQID NO:19)的位置2105处的T至N取代以及由CS04(CS04-FL-AA；SEQ ID NO:2)编码的因子VIII变体蛋白的位置1211处的T至N取代。

如本文所述，因子VIII氨基酸编号系统取决于是否包括因子VIII信号肽(例如，全长野生型人因子VIII序列的氨基酸1-19)。当包括信号肽时，编号被称为“包括信号肽”或“SPI”。当不包括信号肽时，编号被称为“排除信号肽”或“SPE”。例如，SPI编号中的F328S与SPE编号中的F309S是相同的氨基酸。除非另外指明，否则所有氨基酸编号是指呈现为图13中的SEQ ID NO:19的全长、野生型人因子VIII序列(FVIII-FL-AA)中的对应氨基酸。

如本文所述，与天然编码的因子VIII构建体(例如，使用野生型人密码子编码相同因子VIII构建体的多核苷酸)提供的因子VIII表达水平相比，密码子改变的多核苷酸提供了增加的转基因因子VIII体内表达(例如，当作为基因疗法载体的一部分施用时)。如本文所用，术语“增加的表达”是指与被施用天然编码的因子VIII构建体的动物的血液中的转基因因子VIII活性水平相比，被施用编码因子VIII的密码子改变的多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII活性水平增加。可使用本领域已知的任何因子VIII活性来测量活性水平。用于确定因子VIII活性的示例性测定是Technochrome FVIII测定(Technoclone,Vienna,Austria)。

在一些实施方案中，增加的表达是指与被施用天然编码的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII活性水平相比，被施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII活性增加至少25％。在一些实施方案中，增加的表达是指与被施用天然编码的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII活性水平相比，被施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII活性增加至少50％、至少75％、至少100％、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少175倍、至少200倍、至少225倍或至少250倍。

如本文所述，与天然编码的因子VIII构建体(例如，使用野生型人密码子编码相同因子VIII构建体的多核苷酸)提供的载体产量水平相比，密码子改变的多核苷酸提供了增加的载体产量。如本文所用，术语“增加的病毒产量”是指与接种天然编码的因子VIII构建体的细胞培养物中的载体产量(例如，每升培养物的滴度)相比，接种编码因子VIII的密码子改变的多核苷酸的细胞培养物中的载体产量增加。可使用本领域已知的任何载体滴度测定来测量载体产量。用于确定载体产量(例如，AAV载体的产量)的示例性测定是靶向AAV2反向末端重复序列的qPCR(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods:Part B 23:18–28(2012))。

在一些实施方案中，增加的病毒产量是指与相同类型的培养物中的天然编码的因子VIII构建体的产量相比，密码子改变的载体产量增加至少25％。在一些实施方案中，增加的病毒产量是指与相同类型的培养物中的天然编码的因子VIII构建体的产量相比，密码子改变的载体产量增加至少50％、至少75％、至少100％、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。

如本文所用，术语“血友病”是指一组广泛地特征在于血液凝结或血液凝固减少的疾病状态。血友病可以指A型、B型或C型血友病，或者指所有三种疾病类型的复合。A型血友病(血友病A)是由因子VIII(FVIII)活性减少或丧失引起的，并且是最主要的血友病亚型。B型血友病(血友病B)是由于因子IX(FIX)凝血功能丧失或减少导致的。C型血友病(血友病C)是因子XI(FXI)凝血活性丧失或减少的结果。血友病A和B是X连锁疾病，而血友病C是常染色体疾病。血友病的常规治疗包括预防性和按需施用凝血因子，诸如FVIII、FIX，包括和FXI，以及FEIBA-VH、去氨加压素和血浆输注。

如本文所用，术语“FVIII基因疗法”包括向患者提供编码因子VIII的核酸以缓解、减少或预防与血友病相关的一种或多种症状(例如，临床因素)的复发的任何治疗方法。所述术语涵盖施用包含编码因子VIII分子(包括因子VIII的任何修饰形式(例如，因子VIII变体))的核酸的任何化合物、药物、程序或方案，以维持或改善患有血友病的个体的健康。本领域技术人员将理解，FVIII疗法的过程或FVIII治疗剂的剂量可改变，例如基于根据本公开获得的结果而改变。

如本文所用，术语“旁路疗法”包括向患者提供非因子VIII止血剂、化合物或凝血因子以缓解、减少或预防一种或多种与血友病相关的症状(例如，临床因素)的复发的任何治疗方法。非因子VIII化合物和凝血因子包括但不限于因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)、重组活化因子VII(FVIIa)、凝血酶原复合物浓缩物和活化的凝血酶原复合物浓缩物。这些非因子VIII化合物和凝血因子可以是重组的或血浆衍生的。本领域技术人员将理解，旁路疗法的过程或旁路疗法的剂量可改变，例如基于根据本公开获得的结果而改变。

如本文所用，包括施用编码因子VIII分子的核酸和常规血友病A治疗剂的“组合疗法”包括向患者提供编码因子VIII分子的核酸和因子VIII分子和/或非因子VIII止血剂(例如，旁路治疗剂)以缓解、减少或预防一种或多种与血友病相关的症状(例如，临床因素)的复发的任何治疗方法。所述术语涵盖施用包括编码因子VIII分子(包括因子VIII的任何修饰形式)的核酸的任何化合物、药物、程序或方案，其可用于维持或改善患有血友病的个体的健康并且包括本文所述的任何治疗剂。

术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够的量或剂量”是指施用时产生治疗效果的剂量。例如，可用于治疗血友病的药物的治疗有效量可以是能够预防或缓解与血友病相关的一种或多种症状的量。精确的剂量将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知的技术确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical DosageForms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro,编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。

如本文所用，术语“基因”是指编码多肽链的DNA分子的区段(例如，编码区)。在一些实施方案中，基因位于参与产生多肽链的编码区(例如，调节元件，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、5'-非翻译区、3'-非翻译区、或内含子)之前、之后和/或之间。

如本文所用，术语“调节元件”指提供编码序列在细胞中表达的核苷酸序列，诸如启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸化序列、内含子等。

如本文所用，术语“启动子元件”是指帮助控制编码序列的表达的核苷酸序列。一般来讲，启动子元件位于基因的翻译起始位点的5'。然而，在某些实施方案中，启动子元件可位于内含子序列内，或位于编码序列的3'。在一些实施方案中，可用于基因疗法载体的启动子衍生自靶蛋白的天然基因(例如，因子VIII启动子)。在一些实施方案中，可用于基因疗法载体的启动子对于在靶生物体的特定细胞或组织中的表达具有特异性(例如，肝特异性启动子)。在其他实施方案中，多个充分表征的启动子元件之一用于本文所述的基因疗法载体中。充分表征的启动子元件的非限制性实例包括CMV早期启动子、β-肌动蛋白启动子和甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子，其驱动靶蛋白的基本上恒定的表达。在其他实施方案中，启动子是诱导型启动子，其响应于特定刺激(例如，暴露于特定治疗或剂)而驱动靶蛋白的表达。关于设计AAV介导的基因疗法的启动子的综述，参见Gray等人(Human Gene Therapy22:1143-53(2011))，其内容出于所有目的明确地通过引用整体并入。

如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸(例如，编码因子VIII基因疗法构建体的核酸)转移至宿主细胞中的任何媒介物。在一些实施方案中，载体包括复制子，其用于复制媒介物以及靶核酸。可用于基因疗法的载体的非限制性实例包括质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体和病毒，其在体内充当自主复制单位。在一些实施方案中，载体是用于引入靶核酸(例如，编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸)的病毒媒介物。许多可用于基因疗法的修饰的真核病毒是本领域已知的。例如，腺相关病毒(AAV)特别适合用于人基因疗法，因为人类是所述病毒的天然宿主，已知天然病毒不会导致任何疾病，并且所述病毒会引起轻微的免疫反应。

如本文所用，术语“CpG岛”是指多核苷酸内具有统计学上高的CpG二核苷酸密度的区域。如本文所用，如果在200个碱基对的窗口内满足以下条件，则多核苷酸(例如，编码密码子优化的因子VIII蛋白的多核苷酸)的区域是CpG岛：(i)所述区域的GC含量大于50％，并且(ii)观察到的CpG二核苷酸与预期CpG二核苷酸的比率为至少0.6，如以下关系所定义：

关于鉴定CpG岛的方法的额外信息，参见Gardiner-Garden等人,J.Mol.Biol.,196(2):261-82(1987)，其内容出于所有目的明确地通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及其互补物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键联的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸类似的结合性质，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。

术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，包括以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸包括由遗传密码编码的那些，以及后期修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的氨基酸可包括例如D-氨基酸和L-氨基酸。本文使用的氨基酸还可包括非天然氨基酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的任何碳，所述R基团例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜或蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的化学化合物。氨基酸在本文中可通过其通常已知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可通过其普遍接受的单字母码来提及。

至于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到，对核酸或肽序列进行的、改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体是对本公开的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除本公开的多态性变体、种间同源物和等位基因。

提供功能相似氨基酸的保守氨基酸取代是本领域众所周知的。取决于特定氨基酸，例如催化、结构或空间上重要的氨基酸的功能性，不同的氨基酸分组可被认为是彼此的保守取代。表1提供了基于氨基酸的电荷和极性、氨基酸的疏水性、氨基酸的表面暴露/结构性质以及氨基酸的二级结构倾向而被认为是保守取代的氨基酸分组。

表1.基于蛋白质中残基的功能性的保守氨基酸取代分组。

在两个或更多个核酸或肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域内比较或比对最大对应性时，在特定区域中具有约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用例如具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查所测量的。

如本领域已知的，可使用许多不同的程序来鉴定蛋白质(或如下讨论的核酸)是否与已知序列具有序列同一性或相似性。使用本领域已知的标准技术来确定序列同一性和/或相似性，包括但不限于Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部序列同一性算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的序列同一性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机实施方式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputer Group,575Science Drive,Madison,WI)、Devereux等人,Nucl.Acid Res.,12:387-395(1984)描述的最佳拟合算法程序，优选使用默认设置，或通过检查。优选地，FastDB基于以下参数来计算百分比同一性：错配罚分为1；空位罚分为1；空位大小罚分为0.33；并且连接罚分为30，“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,”Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页(1988),Alan R.Liss,Inc，所有这些都通过引用并入。

一个有用的算法实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对从一组相关序列创建多序列比对。它还可绘制显示出用于创建比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360(1987)的渐进式比对方法的简化；所述方法类似于Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)描述的方法，两者均通过引用并入。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10以及加权末端空位。

另一个有用的算法实例是BLAST算法，其描述于：Altschul等人,J.Mol.Biol.215,403-410,(1990)；Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；以及Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787(1993)，两者均通过引用并入。一个特别有用的BLAST程序是从Altschul等人,Methods in Enzymol.,266:460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html]获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和正在搜索感兴趣序列的特定数据库的组成来建立；然而，可以调整所述值以提高敏感度。

另一种有用的算法是空位BLAST，如Altschul等人,Nucl.Acids Res.,25:3389-3402中所报导，其通过引用并入。空位BLAST使用BLOSUM-62取代得分；阈值T参数设置为9；触发无空位扩展的两次命中方法；空位长度k承担10+k的代价；Xu设置为16，并且Xg对于数据库搜索阶段设置为40并且对于算法的输出阶段设置为67。空位比对由对应于约22字节的得分触发。

％氨基酸序列同一性值通过匹配的相同残基的数量除以比对区域中“较长”序列的总残基数来确定。“较长”的序列是比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略WU-Blast-2为了使比对得分最大化而引入的空位)。以类似的方式，相对于所鉴定的多肽的编码序列的“百分比(％)核酸序列同一性”被定义为候选序列中与细胞周期蛋白的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选的方法利用设置为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125。

比对可包括在待比对的序列中引入空位。另外，对于含有比图2的序列(SEQ IDNO:1)编码的蛋白质更多或更少的氨基酸的序列，应当理解，在一个实施方案中，序列同一性的百分比将基于相对于氨基酸或核苷酸的总数的相同氨基酸或核苷酸的数量来确定。因此，例如，在一个实施方案中，如下文所讨论的，比图2所示的序列(SEQ ID NO:1)短的序列的序列同一性将使用较短序列中的核苷酸数量来确定。在同一性百分比计算中，相对权重并未分配给序列变异的各种表现，诸如插入、缺失、取代等。

在一个实施方案中，仅对同一性进行正向评分(+1)，并且将包括空位在内的所有形式的序列变异分配为值“0”，这消除了对如下所述的用于序列相似性计算的加权标度或参数的需要。例如，可通过将匹配的相同残基的数量除以比对区域中“较短”序列的残基总数并乘以100来计算序列同一性百分比。“较长”的序列是比对区域中具有最多实际残基的序列。

术语“等位基因变体”是指特定基因座处的基因的多态性形式，以及衍生自所述基因的mRNA转录物的cDNA以及由它们编码的多肽。术语“优选的哺乳动物密码子”是指编码在哺乳动物细胞中表达的蛋白质中最常用的氨基酸的密码子集合中的密码子子集，其选自以下列表：Gly(GGC、GGG)；Glu(GAG)；Asp(GAC)；Val(GTG、GTC)；Ala(GCC、GCT)；Ser(AGC、TCC)；Lys(AAG)；Asn(AAC)；Met(ATG)；Ile(ATC)；Thr(ACC)；Trp(TGG)；Cys(TGC)；Tyr(TAT、TAC)；Leu(CTG)；Phe(TTC)；Arg(CGC、AGG、AGA)；Gln(CAG)；His(CAC)；和Pro(CCC)。

如本文所用，术语密码子改变的是指编码多肽(例如，因子VIII变体蛋白)的多核苷酸序列，其中编码所述多肽的天然多核苷酸的至少一个密码子已被改变以改善所述多核苷酸序列的性质。在一些实施方案中，改善的性质促进编码多肽的mRNA的转录增加、mRNA的稳定性增加(例如，改善的mRNA半衰期)、多肽的翻译增加和/或多核苷酸在载体内的包装增加。可用于实现改善的性质的改变的非限制性实例包括改变特定氨基酸的密码子的使用和/或分布、调整全局和/或局部GC含量、去除富含AT的序列、去除重复的序列元件，调整全局和/或局部CpG二核苷酸含量，去除隐蔽的调节元件(例如，TATA盒和CCAAT盒元件)，去除内含子/外显子剪接位点，改善调节序列(例如，引入Kozak共有序列)，以及去除能够在转录的mRNA中形成二级结构(例如，茎环)的序列元件。

如本文所讨论的，存在多种术语来指代本文公开的组分。“CS号”(例如，“CS04”)是指编码FVIII多肽的密码子改变的多核苷酸和/或所编码的多肽，包括变体。例如，CS04-FL是指全长密码子改变的CS04多核苷酸序列或由CS04多核苷酸序列编码的氨基酸序列(氨基酸序列在本文中有时被称为“CS04-FL-AA”，并且核酸序列有时被称为“CS04-FL-NA”)。类似地，“CS04-LC”是指编码FVIII多肽的轻链的密码子改变的核酸序列(“CS04-LC-NA”)或由CS04多核苷酸序列编码的FVIII轻链的氨基酸序列(在本文中有时也被称为“CS04-LC-AA”)。同样，对于FVIII重链，CS04-HC、CS04-HC-AA和CS04-HC-NA是相同的。如本领域技术人员将理解的，对于仅密码子改变的诸如CS04的构建体(例如，与Refacto相比，它们不含有额外的氨基酸取代)，氨基酸序列将是相同的，因为氨基酸序列不会被密码子优化改变。因此，本公开的序列构建体包括但不限于CS04-FL-NA、CS04-FL-AA、CS04-LC-NA、CS04-LC-AA、CS04-HC-AA和CS04-HC-NA。

III.密码子改变的因子VIII变体

在一些实施方案中，本公开提供了编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸。当在基于AAV的基因疗法构建体中施用时，这些密码子改变的多核苷酸提供了显著改善的因子VIII表达。与常规的密码子优化的构建体相比，密码子改变的多核苷酸还展现出改善的AAV病毒体包装。如实施例2和表4中展示的，申请人通过发现编码具有人野生型因子VIII重链和轻链的因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸(CS04-FL-NA)以及含有弗林蛋白酶切割位点的短的14个氨基酸的B结构域取代的接头(“SQ”接头)而实现了这些优点，从而促进活性FVIIIa蛋白在体内的成熟。

在一个实施方案中，本文提供的密码子改变的多核苷酸具有至少与CS04(SEQ IDNO:1)内编码因子VIII重链和因子VIII轻链的序列具有高序列同一性的核苷酸序列。如本领域已知的，因子VIII的B结构域对于体内活性是不必要的。因此，在一些实施方案中，本文提供的密码子改变的多核苷酸完全缺乏因子VIII B结构域。在一些实施方案中，天然因子VIII B结构域被含有弗林蛋白酶切割位点的短氨基酸接头，例如由CS04(SEQ ID NO 2)构建体的氨基酸760-773组成的“SQ”接头替代。“SQ”接头也被称为BDLO04(-AA代表氨基酸序列，并且-NA代表核苷酸序列)。

在一个实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII重链和轻链分别是人因子VIII重链和轻链。在其他实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII重链和轻链是来自另一种哺乳动物(例如，猪因子VIII)的重链和轻链序列。在其他实施方案中，因子VIII重链和轻链是嵌合重链和轻链(例如，人和第二哺乳动物序列的组合)。在其他实施方案中，因子VIII重链和轻链是来自另一种哺乳动物的重链和轻链的人源化型式，例如来自另一种哺乳动物的重链和轻链序列，其中人残基在选定位置被取代以降低所得肽在向人施用时的免疫原性。

人基因的GC含量差异很大，从小于25％至大于90％。然而，一般来讲，GC含量较高的人基因的表达水平较高。例如，Kudla等人,(PLoS Biol.,4(6):80(2006))证明了增加基因GC含量会增加所编码的多肽的表达，这主要是通过增加转录和实现mRNA转录物的更高稳态水平。一般来讲，密码子优化的基因构建体的期望GC含量等于或大于60％。然而，天然AAV基因组的GC含量为约56％。

因此，在一些实施方案中，本文提供的密码子改变的多核苷酸的CG含量更接近地匹配天然AAV病毒体的GC含量(例如，约56％GC)，其低于针对在哺乳动物细胞中表达而常规地密码子优化的多核苷酸的优选CG含量(例如，达到或高于60％GC)。如实施例1中概述的，与GC含量更高的类似密码子改变的编码序列相比，GC含量为约56％的CS04-FL-NA(SEQ IDNO:1)具有改善的病毒体包装。

因此，在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量小于60％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量小于59％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量小于58％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量小于57％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量小于56％。

在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为54％至59％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为55％至59％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56％至59％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为54％至58％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为55％至58％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56％至58％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为54％至57％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为55％至57％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56％至57％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为54％至56％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为55％至56％。

在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56±0.5％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56±0.4％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56±0.3％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56±0.2％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56±0.1％。在一些实施方案中，编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸的总GC含量为56％。

A.因子VIII B结构域取代的接头

在一些实施方案中，FVIII重链与轻链之间的键联(例如，野生型因子VIII中的B结构域)被进一步改变。由于AAV包装容量的大小限制，B结构域缺失、截短和/或接头取代的变体应改善FVIII基因疗法构建体的功效。最常规使用的B结构域取代的接头是SQ FVIII的接头，其仅保留B结构域的14个氨基酸作为接头序列。猪VIII的另一种变体(“OBI-1”，描述于美国专利号6,458,563)在CHO细胞中良好表达，并且具有稍长的24个氨基酸的接头。在一些实施方案中，由本文所述的密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII构建体包括SQ型B结构域接头序列。在其他实施方案中，由本文所述的密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII构建体包括OBI-1型B结构域接头序列。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包括SQ型B结构域接头(SFSQNPPVLKRHQR；BDL-SQ-AA；SEQ ID NO:30)，其包括野生型人因子VIII B结构域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO:19)的氨基酸760-762/1657-1667(Sandberg等人,Thromb.Haemost.85:93(2001))。在一些实施方案中，SQ型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，SQ型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包括Greengene型B结构域接头，其包括野生型人因子VIII B结构域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO:19)的氨基酸760/1582-1667(Oh等人,Biotechnol.Prog.,17:1999(2001))。在一些实施方案中，Greengene型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，Greengene型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包括延伸的SQ型B结构域接头，其包括野生型人因子VIII B结构域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO:19)的氨基酸760-769/1657-1667(Thim等人,Haemophilia,16:349(2010))。在一些实施方案中，延伸的SQ型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，延伸的SQ型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包括猪OBI-1型B结构域接头，其包括来自野生型猪因子VIII B结构域的氨基酸SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR(SEQ IDNO:31)(Toschi等人,Curr.Opin.Mol.Ther.,12:517(2010))。在一些实施方案中，猪OBI-1型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，猪OBI-1型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包括人OBI-1型B结构域接头，其包括野生型人因子VIII B结构域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO:19)的氨基酸760-772/1655-1667。在一些实施方案中，人OBI-1型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，人OBI-1型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包括O8型B结构域接头，其包括来自野生型猪因子VIII B结构域的氨基酸SFSQNSRHQAYRYRRG(SEQ ID NO:32)(Toschi等人,Curr.Opin.Mol.Ther.,12:517(2010))。在一些实施方案中，猪OBI-1型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，猪OBI-1型B结构域接头相对于对应的野生型序列具有两个氨基酸取代。

B.编码具有可切割接头的因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸

CS04密码子改变的多核苷酸

在一个实施方案中，本文提供的密码子改变的多核苷酸包括编码因子VIII变体多肽的核苷酸序列，所述因子VIII变体多肽具有体内可切割的接头。因子VIII多肽包括因子VIII轻链、因子VIII重链以及将重链的C末端接合至轻链的N末端的多肽接头。因子VIII多肽的重链由与CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，其是编码因子VIII重链的CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)的一部分。因子VIII多肽的轻链由与CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，其是编码因子VIII轻链的CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶切割位点，其允许体内成熟(例如，在体内表达或施用前体多肽之后)。

在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQID NO 3和4)具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少96％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少98％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少99.9％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)相同。

在一些实施方案中，因子VIII构建体的多肽接头由与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，其编码对应于CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸760-773的14个氨基酸的接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少96％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)相同。

在一些实施方案中，密码子改变的多核苷酸具有与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少96％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.5％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.9％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)相同。

在一些实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII变体具有与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少99％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少99.5％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少99.9％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)相同。

C.因子VIII表达载体

在一些实施方案中，本文所述的密码子改变的多核苷酸被整合到表达载体中。表达载体的非限制性实例包括病毒载体(例如，适用于基因疗法的载体)、质粒载体、噬菌体载体、粘粒、噬菌粒、人工染色体等。

病毒载体的非限制性实例包括：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus)；腺病毒、腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；以及脊髓灰质炎病毒。

在一些实施方案中，本文所述的密码子改变的多核苷酸被整合到基因疗法载体中。在一些实施方案中，基因疗法载体是逆转录病毒，并且特别是复制缺陷型逆转录病毒。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的方案是本领域已知的。关于综述，参见Kriegler,GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)和Murry,Methods in Molecular Biology,第7卷,Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)。

在一个实施方案中，基因疗法载体是基于腺相关病毒(AAV)的基因疗法载体。AAV系统先前已经描述过，并且通常是本领域众所周知的(Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat.Immun.,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:97-129(1992)；以及Asokan等人,Mol.Ther.,20(4):699-708(2012)，其各自出于所有目的通过引用整体并入本文)。有关rAAV载体的产生和使用的细节描述于例如美国专利号5,139,941和4,797,368中，其各自出于所有目的通过引用整体并入本文。在一个特定的实施方案中，AAV载体是AAV-8载体。

在一些实施方案中，本文所述的密码子改变的多核苷酸被整合到逆转录病毒表达载体中。这些系统先前已经描述过，并且通常是本领域众所周知的(Mann等人,Cell,33:153-159(1983)；Nicolas和Rubinstein,In:Vectors:A survey of molecular cloningvectors and their uses,Rodriguez和Denhardt编辑,Stoneham:Butterworth,第494-513页(1988)；Temin,In:Gene Transfer,Kucherlapati(编),New York:Plenum Press,第149-188页(1986)。在一个具体的实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体(参见例如，Naldini等人,Science,272(5259):263-267(1996)；Zufferey等人,Nat Biotechnol,15(9):871-875,1997；Blomer等人,J Virol.,71(9):6641-6649(1997)；美国专利号6,013,516和5,994,136)。

多种载体可用于在细胞培养物中从密码子改变的多肽表达因子VIII多肽，包括真核和原核表达载体。在某些实施方案中，考虑将质粒载体用于在细胞培养物中表达因子VIII多肽。一般来讲，将衍生自与宿主细胞相容的物种的含有复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体可携带复制位点、以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。质粒将包括编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸，其可操作地连接至一个或多个控制序列，例如启动子。

用于原核表达的载体的非限制性实例包括质粒，诸如pRSET、pET、pBAD等，其中原核表达载体中使用的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达，诸如pAO、pPIC、pYES、pMET的载体，使用诸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等的启动子；(ii)为了在昆虫细胞中表达，诸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等的载体，使用诸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等的启动子，以及(iii)用于在哺乳动物细胞中表达，诸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等的载体，以及衍生自病毒系统(诸如痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等)的载体，使用诸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白的启动子。

D.给药

本发明提供了将本发明的密码子优化的构建体施用于已诊断为患有血友病A的人患者(“血友病A患者”或“患者”)。一般来讲，如本文所概述的，使用含有本发明的密码子优化的构建体的AAV颗粒进行施用。此外，如下文更全面地描述的，本发明的构建体的施用也可通过施用泼尼松龙(prednisolone)或泼尼松(prednisone)来增强。

每千克体重1.2x10¹³个腺相关病毒(AAV)颗粒

在一个方面，本公开提供了一种用于治疗血友病A的方法，其包括向血友病A患者静脉内输注(例如，通过外周静脉输注)每千克人患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸，其与SEQ IDNO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。

在一个实施方案中，以每千克人患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒向人患者施用的与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸编码因子VIII变体多肽，所述因子VIII变体多肽具有体内可切割的接头。因子VIII多肽包括因子VIII轻链、因子VIII重链以及将重链的C末端接合至轻链的N末端的多肽接头。因子VIII多肽的重链由与CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，其是编码因子VIII重链的CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)的一部分。因子VIII多肽的轻链由与CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，其是编码因子VIII轻链的CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶切割位点，其允许体内成熟(例如，在体内表达或施用前体多肽之后)。

在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQID NO 3和4)具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少96％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少98％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)具有至少99.9％的序列同一性。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸序列分别与CS04-HC-NA和CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3和4)相同。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与CS04-HC-AA和CS04-LC-AA相同。

在一些实施方案中，因子VIII构建体的多肽接头由与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，其编码对应于CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸760-773的14个氨基酸的接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少96％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)相同。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸760-773相同。在一些实施方案中，以每千克人患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒向人患者施用的密码子改变的多核苷酸具有与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少96％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.5％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.9％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)相同。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与CS04-FL-AA相同。

因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗血友病A的方法，其包括向血友病A患者静脉内输注每千克人患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括具有SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。

在一些实施方案中，通过静脉内输注(例如，输注到患者手臂的静脉中)以单剂量施用AAV颗粒。在一些实施方案中，施用单剂量的一部分，在短时间内(例如，30分钟)监测患者对施用的不良反应的迹象，并且然后(例如，如果未出现不良反应的迹象)向患者施用单剂量的剩余部分。

在一些实施方案中，施用AAV颗粒的人患者患有严重的血友病A。例如，在一些实施方案中，当不接受因子VIII替代疗法时，患者血流中的因子VIII活性水平低于参考血液样品(例如，因子VIII活性正常的血液样品(例如，确定不患有血友病A的受试者的血液样品))中发现的因子VIII活性，或低于确定不患有血友病A的多个受试者的血液样品中发现的平均因子VIII活性量的2％。在一些实施方案中，当不接受因子VIII替代疗法时，患者血流中的因子VIII活性水平低于参考血液样品中发现的因子VIII活性量的2％。

在一些实施方案中，施用AAV颗粒的人患者不具有针对FVIII的抑制剂(例如，因子VIII抑制剂抗体)，不具有除严重血友病A之外的止血缺陷，不具有慢性肝功能障碍，且/或不具有严重肾损伤。

因此，在一些实施方案中，本文所述的方法包括使患者有资格施用每千克人患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒的步骤，其中AAV颗粒包括编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸，其与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。所述方法包括当患者未接受因子VIII替代疗法时确定患者血流中因子VIII活性水平，以及当患者血流中的因子VIII活性水平低于参考样品中的因子VIII水平的约2％或约1％时，使患者有资格施用AAV颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括确定患者是否具有一种或多种针对FVIII的抑制剂(例如，因子VIII抑制剂抗体)、除严重血友病A之外的止血缺陷、慢性肝功能障碍和严重肾损伤，并且如果患者患有任何所列举的病状，则取消其资格。

每千克体重5x10¹³个腺相关病毒(AAV)颗粒

在一个方面，本公开提供了一种用于治疗血友病A的方法，其包括向血友病A患者静脉内输注(例如，通过外周静脉输注)每千克人患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸，其与SEQ IDNO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。

在一个实施方案中，以每千克人患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒向人患者施用的与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性的密码子改变的多核苷酸编码因子VIII变体多肽，所述因子VIII变体多肽具有体内可切割的接头。因子VIII多肽包括因子VIII轻链、因子VIII重链以及将重链的C末端接合至轻链的N末端的多肽接头。因子VIII多肽的重链由与CS04-HC-NA(SEQ ID NO:3)具有高序列同一性的第一核苷酸序列编码，其是编码因子VIII重链的CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)的一部分。因子VIII多肽的轻链由与CS04-LC-NA(SEQ ID NO:4)具有高序列同一性的第二核苷酸序列编码，其是编码因子VIII轻链的CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)的一部分。多肽接头包括弗林蛋白酶切割位点，其允许体内成熟(例如，在体内表达或施用前体多肽之后)。

在一些实施方案中，因子VIII构建体的多肽接头由与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有高序列同一性的第三核苷酸序列编码，其编码对应于CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸760-773的14个氨基酸的接头。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少96％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，第三核苷酸序列与BDLO04(SEQ ID NO:6)相同。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与CS04-FL-AA(SEQ ID NO:2)的氨基酸760-773相同。

在一些实施方案中，以每千克人患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒向人患者施用的密码子改变的多核苷酸具有与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有高序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少96％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.5％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.9％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS04-FL-NA(SEQ ID NO:1)相同。在这些实施方案中，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列与CS04-FL-AA相同。

因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗血友病A的方法，其包括向血友病A患者静脉内输注每千克人患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括具有SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。

因此，在一些实施方案中，本文所述的方法包括使患者有资格施用每千克人患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒的步骤，其中AAV颗粒包括编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸，其与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。所述方法包括当患者未接受因子VIII替代疗法时确定患者血流中因子VIII活性水平，以及当患者血流中的因子VIII活性水平低于参考样品中的因子VIII水平的约2％或约1％时，使患者有资格施用AAV颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括确定患者是否具有一种或多种针对FVIII的抑制剂(例如，因子VIII抑制剂抗体)、除严重血友病A之外的止血缺陷、慢性肝功能障碍和严重肾损伤，并且如果患者患有任何所列举的病状，则取消其资格。

与泼尼松龙或泼尼松共同施用

在一些实施方案中，上述通过施用任一剂量的AAV颗粒来治疗血友病A的方法还包括向人患者施用一个疗程的泼尼松龙或泼尼松，例如以降低炎性反应的水平，例如通过降低受试者细胞因子和/或趋化因子的产生。用于共同施用泼尼松龙或泼尼松与基因疗法的实例方法描述于例如国际专利申请公布号WO 2008/069942中，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，在施用腺相关病毒(AAV)颗粒之前向人患者施用泼尼松龙或泼尼松，其中编码因子VIII多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。例如，在一些实施方案中，在向患者施用AAV颗粒前约一周、或约一天或两天施用泼尼松龙或泼尼松。在一些实施方案中，在施用AAV颗粒前约一周或约一天或两天开始施用泼尼松龙或泼尼松疗程，并在施用AAV颗粒后继续。

在一些实施方案中，当施用腺相关病毒(AAV)颗粒时，向人患者共同施用泼尼松龙或泼尼松，其中编码因子VIII多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。例如，在一些实施方案中，泼尼松龙或泼尼松在同一天施用，例如在施用AAV颗粒之前或之后直接施用。在一些实施方案中，在施用AAV颗粒的同一天施用泼尼松龙或泼尼松疗程，并在施用AAV颗粒后继续。

在一些实施方案中，在施用腺相关病毒(AAV)颗粒之后向患者施用泼尼松龙或泼尼松，其中编码因子VIII多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性。例如，在一些实施方案中，在向患者施用AAV颗粒后约一天或两天第一次施用泼尼松龙或泼尼松。

应当注意，泼尼松龙或泼尼松是口服施用的小分子药物(尽管其也可静脉内施用)，并且因此上下文中的“共同施用”不需要单一溶液含有两种药物。

在一些实施方案中，在至少两周的时间段内向患者施用泼尼松龙或泼尼松的疗程，例如每天或每两天。在一些实施方案中，在至少三周的时间段内施用泼尼松龙或泼尼松的疗程。在一些实施方案中，泼尼松龙或泼尼松的剂量在疗程期间减少。例如，在一个实施方案中，疗程以每天施用约60mg泼尼松龙或泼尼松开始，并且随着疗程的进展而减少。

在一个实施方案中，疗程包括，紧接输注AAV颗粒后在疗程的第一周期间每天向人患者施用约60mg泼尼松龙或泼尼松，在疗程的第二周期间每天向患者施用约40mg泼尼松龙或泼尼松，并且在第三周期间每天向患者施用约30mg泼尼松龙或泼尼松。

在一些实施方案中，疗程包括在第三周后进一步逐渐减少泼尼松龙或泼尼松的施用，例如施用递减剂量的泼尼松龙或泼尼松。在一个实施方案中，递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括连续施用约20mg/天的泼尼松龙或泼尼松、约15mg/天的泼尼松龙或泼尼松、约10mg/天的泼尼松龙或泼尼松以及约5mg/天的泼尼松龙或泼尼松的剂量(例如，每个浓度一剂或多剂)。

在一个实施方案中，递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括(例如，紧接)完成初始的泼尼松龙或泼尼松疗程后连续5天每天向患者施用约20mg的泼尼松龙或泼尼松，(例如，紧接)向患者施用20mg的泼尼松龙或泼尼松5天后连续3天每天向患者施用约15mg的泼尼松龙或泼尼松，(例如，紧接)向患者施用15mg的泼尼松龙或泼尼松3天后连续3天每天向患者施用约10mg的泼尼松龙或泼尼松，以及(例如，紧接)向患者施用10mg的泼尼松龙或泼尼松3天后连续3天每天向患者施用约5mg的泼尼松龙或泼尼松。

在一个实施方案中，递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括紧接完成初始的泼尼松龙或泼尼松疗程后连续7天每天向患者施用约30mg的泼尼松龙或泼尼松，紧接向患者施用30mg的泼尼松龙或泼尼松7天后连续7天每天向患者施用约20mg的泼尼松龙或泼尼松，紧接向人受试者施用20mg的泼尼松龙或泼尼松7天后连续5天每天向患者施用约15mg的泼尼松龙或泼尼松，紧接向患者施用15mg的泼尼松龙或泼尼松5天后连续5天每天向患者施用约10mg的泼尼松龙或泼尼松，以及紧接向患者施用10mg的泼尼松龙或泼尼松5天后连续5天每天向患者施用约5mg的泼尼松龙或泼尼松。

在一些实施方案中，基于患者在初始泼尼松龙或泼尼松疗程结束时是否仍然表现出肝脏炎症体征来确定施用于患者的递减剂量的泼尼松龙或泼尼松的长度(例如，如通过因子VIII水平(例如，因子VIII滴度或因子VIII活性)的降低或肝酶的增加所示)。

例如，在一个实施方案中，在向患者施用包括编码因子VIII蛋白的多核苷酸的腺相关病毒(AAV)颗粒后并且当患者接受初始糖皮质激素类固醇疗程时，确定患者的血流(例如，从患者收集的血液样品中)中的第一因子VIII水平(例如，滴度或活性)。在初始糖皮质激素类固醇疗程完成后确定患者血流中的第二因子VIII水平(例如，滴度或活性)。然后将第二因子VIII水平与第一因子VIII水平进行比较。当第二因子VIII水平不降低时(例如，当第二因子VIII水平不小于第一因子VIII水平，或者不小于低于第一因子VIII水平的阈值量时)，在不超过三周的时间段内向患者施用第一递减剂量的糖皮质激素类固醇。当第二因子VIII水平降低时(例如，当第二因子VIII水平小于第一因子VIII水平，或者小于低于第一因子VIII水平的阈值量时)，在超过三周的时间段内向患者施用第二递减剂量的糖皮质激素类固醇。

类似地，在一些实施方案中，在向患者施用包括编码因子VIII蛋白的多核苷酸的腺相关病毒(AAV)颗粒之前(例如，或不久之后)，确定患者的血流中的第一肝酶水平(例如，肝酶滴度或活性)。在初始糖皮质激素类固醇疗程完成后确定患者血流中的肝酶水平的第二水平(例如，肝酶滴度或活性)。然后将第二肝酶水平与第一肝酶水平进行比较。当第二肝酶水平不增加时(例如，当第二肝酶水平不高于第一肝酶水平，或者不大于高于第一肝酶水平的阈值量)，在不超过三周的时间段内向患者施用第一递减剂量的糖皮质激素类固醇。当第二肝酶水平增加时(例如，当第二肝酶水平高于第一肝酶水平，或者大于高于第一肝酶水平的阈值量)，在超过三周的时间段内向患者施用第二递减剂量的糖皮质激素类固醇。

在一些实施方案中，第一递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括(例如，紧接)完成初始的泼尼松龙或泼尼松疗程后连续5天每天向患者施用约20mg的泼尼松龙或泼尼松，(例如，紧接)向患者施用20mg的泼尼松龙或泼尼松5天后连续3天每天向患者施用约15mg的泼尼松龙或泼尼松，(例如，紧接)向人受试者施用15mg的泼尼松龙或泼尼松3天后连续3天每天向患者施用约10mg的泼尼松龙或泼尼松，以及(例如，紧接)向患者施用10mg的泼尼松龙或泼尼松3天后连续3天每天向患者施用约5mg的泼尼松龙或泼尼松。

在一些实施方案中，第二递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括紧接完成初始的泼尼松龙或泼尼松疗程后连续7天每天向患者施用约30mg的泼尼松龙或泼尼松，紧接向患者施用30mg的泼尼松龙或泼尼松7天后连续7天每天向患者施用约20mg的泼尼松龙或泼尼松，紧接向患者施用20mg的泼尼松龙或泼尼松7天后连续5天每天向患者施用约15mg的泼尼松龙或泼尼松，紧接向患者施用15mg的泼尼松龙或泼尼松5天后连续5天每天向患者施用约10mg的泼尼松龙或泼尼松，以及紧接向患者施用10mg的泼尼松龙或泼尼松5天后连续5天每天向患者施用约5mg的泼尼松龙或泼尼松。

在一些实施方案中，在施用AAV颗粒后，在检测到患者的免疫反应的指征后施用泼尼松龙或泼尼松疗程。在一些实施方案中，在检测到患者的肝脏炎症的指征后施用泼尼松龙或泼尼松疗程。例如，在一些实施方案中，在施用AAV颗粒后监测患者的肝脏炎症，并且在检测到肝脏炎症后向患者施用泼尼松龙或泼尼松疗程。

在一些实施方案中，患者血流中的因子VIII表达或因子VIII活性的快速或大幅降低指示受试者的肝脏炎症。在一些实施方案中，可能会观察到因子VIII活性的早期峰值，接着是小幅和/或逐渐的降低，此后因子VIII蛋白会处于稍微较低的水平，这不需要施用泼尼松龙或泼尼松疗程。例如，在一些实施方案中，在施用AAV颗粒后监测患者血流中因子VIII的量(例如，因子VIII滴度或因子VIII活性水平)，并且如果检测到因子VIII的量的快速或大幅降低(例如，与施用AAV后的患者血流中的水平相比，大于阈值的因子VIII滴度或因子VIII活性水平降低)，则向受试者施用泼尼松龙或泼尼松疗程。

在一些实施方案中，患者肝酶水平的增加指示受试者的肝脏炎症。例如，在一些实施方案中，在施用AAV颗粒后监测患者的肝酶水平，并且如果检测到肝酶水平的增加(例如，大于阈值的肝酶量增加，例如，与施用AAV颗粒之前或施用AAV颗粒短期之后的患者的肝酶基线水平相比)，则向受试者施用泼尼松龙或泼尼松疗程。

施用后监测

在一些实施方案中，提供了在施用具有编码因子VIII多肽的多核苷酸(例如，与SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)具有高序列同一性的多核苷酸)的腺相关病毒(AAV)颗粒后，监测患者的不良反应和/或治疗功效的方法。在一些实施方案中，监测患者的以下中的一项或多项：(a)肝炎的指征(例如，经由因子VIII水平(例如，滴度或活性)的快速或大幅降低和/或肝酶(例如，滴度或活性)的增加)，(b)患者血流中的因子VIII抑制剂抗体的增加，(c)患者血流中的衣壳蛋白的增加，(d)患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的增加，以及(e)患者血流中的编码VIII多肽的多核苷酸或其片段的增加。在一些实施方案中，在检测到一种或多种不良反应和/或治疗无效后进一步治疗受试者。

例如，在一个实施方案中，提供了一种使用包括编码因子VIII多肽的多核苷酸的腺相关病毒(AAV)颗粒来监测血友病A的因子VIII基因疗法的功效的方法。所述方法包括在向患者施用AAV颗粒后确定患者血流中(例如，在从患者收集的血液样品中)是否存在因子VIII抑制剂抗体。在一些实施方案中，当在患者血流中检测到因子VIII抑制剂抗体时(例如，当与施用AAV颗粒之前患者中的水平相比，检测到因子VIII抑制剂抗体的水平增加时)，所述方法包括向患者施用用于治疗血友病A的替代剂。

在一些实施方案中，用于治疗血友病A的替代剂是因子VIII的替代形式(例如，不包括或掩蔽检测到的因子VIII抑制剂抗体靶向的一个或多个表位的剂)。在一些实施方案中，因子VIII的替代形式是化学修饰的因子VIII蛋白(例如，化学修饰的人或猪因子VIII蛋白)。在一些实施方案中，因子VIII的替代形式是衍生自非人因子VIII蛋白(例如，猪因子VIII蛋白)的因子VIII蛋白。在一些实施方案中，用于治疗血友病A的替代剂是因子VIII旁路疗法，例如包括因子II、因子IX和因子X的治疗剂。例如，在一些实施方案中，因子VIII旁路疗法是因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)复合物、重组活化因子VII(FVIIa)、凝血酶原复合物浓缩物或活化的凝血酶原复合物浓缩物。

在一个实施方案中，提供了一种用于在施用AAV颗粒后监测患者血流中的编码因子VIII多肽的多核苷酸或其片段的水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重一定剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括编码因子VIII蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的编码因子VIII蛋白的多核苷酸或其片段的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括具有SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的SEQ ID NO:1或其片段的核酸水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括具有SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的SEQ ID NO:1或其片段的核酸水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在所述方法的一些实施方案中，稍后的时间点是至少14天后或至少21天后。在一些实施方案中，稍后的时间点是施用AAV颗粒后7天时、14天时或21天时。

在一个实施方案中，提供了一种用于在施用AAV颗粒后监测患者血流中的衣壳蛋白水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括衣壳蛋白和包括SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量所述患者血流中的衣壳蛋白的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括衣壳蛋白和包括SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量所述患者血流中的衣壳蛋白的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重一定剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括衣壳蛋白和编码因子VIII蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量所述患者血流中的衣壳蛋白的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在所述方法的一些实施方案中，稍后的时间点是至少14天后或至少21天后。在一些实施方案中，稍后的时间点是施用AAV颗粒后7天时、14天时或21天时。

在一个实施方案中，提供了一种用于在施用AAV颗粒后监测患者血流中的因子VIII抑制剂抗体水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括有包括SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的抗因子VIII抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括有包括SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的抗因子VIII抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用一定剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括编码因子VIII蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的抗因子VIII抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在所述方法的一些实施方案中，稍后的时间点是至少14天后或至少21天后。在一些实施方案中，稍后的时间点是施用AAV颗粒后7天时、14天时或21天时。

在一个实施方案中，提供了一种用于在施用AAV颗粒后监测受试者血流中的抗衣壳蛋白抗体水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括衣壳蛋白和包括SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括衣壳蛋白和包括SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量所述患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在一个实施方案中，所述方法包括在第一时间点向血友病A患者施用每千克患者体重一定剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中AAV颗粒包括衣壳蛋白和编码因子VIII蛋白的多核苷酸。所述方法还包括在稍后的时间点测量所述患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。在所述方法的一些实施方案中，稍后的时间点是至少14天后或至少21天后。在一些实施方案中，稍后的时间点是施用AAV颗粒后7天时、14天时或21天时。

临床诊断

在一个实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否已经对因子VIII基因疗法产生免疫反应的方法。在一个实施方案中，所述方法包括确定来自诊断为患有血友病A的受试者的外周血样品中的免疫原性介体的第一水平。在一个实施方案中，所述方法包括在向受试者施用编码因子VIII蛋白的多核苷酸的基因疗法之后，确定来自诊断为患有血友病A的受试者的外周血样品中的免疫原性介体的第一水平。在一个实施方案中，如果受试者已经对因子VIII蛋白产生免疫反应，则向受试者施用第一剂量的类固醇。在另一个实施方案中，如果受试者尚未对因子VIII蛋白产生免疫反应，则向受试者施用小于第一剂量的类固醇的第二剂量的类固醇。

在一个实施方案中，提供了一种通过将免疫原性介体的第一水平与一个或多个健康个体的外周血中的免疫原性介体的参考水平进行比较来确定受试者是否已经对因子VIII基因疗法产生免疫反应的方法。

在一个实施方案中，提供了一种通过将免疫原性介体的第一水平与在施用包含编码因子VIII蛋白的多核苷酸的基因疗法之前从诊断为患有血友病A的受试者收集的第二外周血样品中的免疫原性介体的第二水平进行比较来确定受试者是否已经对因子VIII基因疗法产生免疫反应的方法。

在一个实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否已经对所述因子VIII基因疗法产生免疫反应的方法，其包括将免疫原性介体的第一水平与在收集第一外周血样品前并且在向受试者施用编码因子VIII蛋白的多核苷酸的基因疗法后从诊断为患有血友病A的受试者收集的第二外周血样品中的免疫原性介体的第二水平进行比较。

在一个实施方案中，免疫原性介体是细胞因子。在另一个实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子α(TNFα)或白介素6(IL-6)。在另一个实施方案中，通过酶联免疫测定(ELISA)确定细胞因子的水平。

在一个实施方案中，免疫原性介体是Toll样受体(TLR)信号传导途径的介体。在另一个实施方案中，TLR信号传导途径的介体选自CHUK、CXCL8、IFNA20P、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、INFE、IFNG、IFNG-AS1、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL3P1、IFNL4、IFNLR1、IKBKB、IKBKE、IKBKG、IKBKGP1、IL10、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL6、IRF7、MYD88、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NKFBIB、NFKBIE、REL、RELA、RELB、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR8-AS1、TLR9和TNF。

在一个实施方案中，免疫原性介体是先天免疫信号传导途径的介体或抗病毒细胞因子。在另一个实施方案中，先天免疫信号传导途径的介体或抗病毒细胞因子选自CCL5、CXCL1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNB1、IFNG、IFNK、IFNL3、IL10、IL15、IL18、IL22、IL6、LTA和TNF。

在一个实施方案中，免疫原性介体是核因子κB(NF-κB)信号传导途径的介体。在另一个实施方案中，NF-κB信号传导途径的介体选自BAX、BCL2、BCL2L1、CASP1、CASP7、CASP8、CASP9、TRAF1、TRAF2、CCR5、CCR7、CD4、CD40LG、CD44、CD80、CD83、CD86、CR2、HLA-A、ICOS、IL15RA、IL2RA、TNFRSF14、TNFRSF9、AKT1、EIF2AK2、LCK、MAP3K1、MAP3K14、RIPK1、RAF1、NFKB1、NFKB2、REL、RELA、RELB、TBP、CYLD、ILBKB、ILBKE、ILBKG、ILBKGP1、NFKBIA、NFKBIB、NFKBIE、CHUK、CCL1、CCL22、CCL4、CCL5、CXCL10、CXCL3、CXCL6、CXCL8、CXCR5、IFNB1、IFNG、IFNL1、IL12B、IL15、IL17A、IL1A、IL1RN、IL23A、IL32、IL4、IL5、IL6、IL9、TNFAIP3、TNFSF10、ICAM1、ITGA2、ITGA2B、ITGA5、ITGA6、ITGA6-AS1、PECAM1和VCAM1。

在一个实施方案中，编码因子VIII蛋白的多核苷酸是SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列。在一个实施方案中，病毒载体向受试者施用编码因子VIII蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在另一个实施方案中，AAV载体是血清型8AAV载体(AAV8)。在一个实施方案中，基因疗法施用2x10¹²个拷贝的剂量的编码因子VIII蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，基因疗法施用6x10¹²个拷贝的剂量的编码因子VIII蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，基因疗法施用1.8x10¹³个拷贝的剂量的编码因子VIII蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，基因疗法施用1.2x10¹³个拷贝的剂量的编码因子VIII蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，基因疗法施用5x10¹³个拷贝的剂量的编码因子VIII蛋白的多核苷酸。

IV.实施例

实施例1–密码子改变的因子VIII变体表达序列的构建

为了创建对A型血友病基因疗法有效的因子VIII编码序列，必须克服两个障碍。第一，由于常规基因疗法递送载体(例如，AAV病毒体)的基因组大小限制，编码的因子VIII多肽必须显著缩短。第二，必须改变编码序列以：(i)稳定递送载体内的包装相互作用，(ii)稳定mRNA中间体(intermediary)，以及(iii)改善mRNA转录/翻译的稳健性。

为了实现第一个目标，申请人从B结构域缺失的因子VIII变体构建体开始，本文中称为“FVIII-BDD-SQ”。在此构建体中，B结构域被称为“SQ”序列的十四个氨基酸的序列替代。重组FVIII-BDD-SQ以商品名出售，并且已被证明可有效控制血友病A。然而，FVIII-BDD-SQ的天然编码序列(包括因子VIII重链和轻链的人野生型核酸序列)在基因疗法载体中无效表达。

为了解决天然FVIII-BDD-SQ的不良表达，将描述于Fath等人(PLoS ONE,6:e17596(2011))中，如Ward等人(Blood,117:798(2011))和McIntosh等人(Blood,121,3335-3344(2013))中所述修改的密码子优化算法应用于FVIII-BDD-SQ序列以创建第一中间体编码序列CS04a。然而，申请人认识到使用修改的算法创建的CS04a序列可通过进一步修改序列来改进。因此，申请人重新引入了CpG二核苷酸，重新引入了精氨酸的CGC密码子，改变了亮氨酸和丝氨酸密码子分布，重新引入了高度保守的密码子对，并且去除了隐蔽的TATA盒、CCAAT盒和剪接位点元件，同时避免了CpG岛以及富含AT和GC的链段的局部过度表现。

首先，修改的算法用非CpG-二核苷酸密码子系统地替代了含有CpG-二核苷酸的密码子(例如，精氨酸密码子)，并且消除/避免由相邻密码子产生的CpG-二核苷酸。这种严格避免CpG二核苷酸通常是用于防止肌肉注射DNA疫苗后的TLR诱导的免疫。然而，这样做限制了密码子优化的可能性。例如，修改的算法排除了使用完整的CGX精氨酸密码子集合。这对于人细胞中表达的基因的编码来说尤其具有破坏性，因为CGC是高度表达的人基因中最常用的精氨酸密码子。另外，避免相邻密码子产生CpG进一步限制了优化的可能性(例如，限制了可一起使用的密码子对的数量)。

因为预计TLR诱导的免疫不会成为与肝脏定向的、基于AAV的基因疗法相关的问题，所以将包括CpG在内的密码子和产生CpG的相邻密码子重新引入到中间体编码序列CS04a中，优先引入到编码因子VIII轻链的序列中(例如，在FVIII-BDD-SQ编码序列的3'端)。这允许更频繁地使用优选的人密码子，特别是精氨酸的密码子。然而，要小心避免产生CpG岛，CpG岛是具有高频率CpG位点的编码序列区域。这与Krinner等人(Nucleic AcidsRes.,42(6):3551-64(2014))的教导相反，这表明转录起始位点下游的CpG结构域促进高水平的基因表达。

其次，修改的算法专门应用某些密码子，诸如亮氨酸的CTG、缬氨酸的GTG和谷氨酰胺的CAG。然而，这违背了平衡密码子使用的原则，例如，如Haas等人(Current Biology,6(3):315-24(1996))中所提出的。为了解决修改的算法过度使用优选密码子的问题，在应用于密码子改变(例如，CpG频率和GC含量)的其他规则允许的情况下，重新引入了替代的亮氨酸密码子。

第三，当满足某些标准(例如，CG-二核苷酸的存在)时，修改的算法会替代密码子对，而不考虑它们在自然界中的保守程度。为了解释可能通过进化而保守的有益性质，被算法替代的最保守的密码子对和最保守的优选密码子对，例如如Tats等人(BMC Genomics 9:463(2008))中所述，在应用于密码子改变(例如，CpG频率和GC含量)的其他规则允许的情况下进行分析和调整。

第四，中间体编码序列中使用的丝氨酸密码子也被重新设计。具体而言，将AGC、TCC和TCT丝氨酸密码子以更高的频率引入到修饰的编码序列中，以更好地匹配人密码子使用的整体(Haas等人，同上)。

第五，筛选TATA盒、CCAAT盒元件和内含子/外显子剪接位点并从修饰的编码序列中去除。当修饰编码序列时，要小心避免富含AT或富含GC的链段的局部过度表达。

最后，除了优化编码序列内的密码子使用之外，在进一步细化中间体编码序列CS04a时还考虑了基础AAV病毒体的结构要求。将AAV载体(例如，AAV病毒体的核酸部分)作为单链DNA分子包装到其衣壳中(关于综述，参见Daya和Berns,Clin.Microbiol Rev.,21(4):583-93(2008))。因此，载体的GC含量可能会影响基因组的包装，并因此影响生产期间的载体产量。与许多算法一样，此处使用的修改的算法创建了GC含量为至少60％的优化基因序列(参见，Fath等人,PLoS One,6(3):e17596(2011)(勘误于PLoS One,(6)3(2011)中)。然而，AAV8衣壳蛋白由具有约56％的较低GC含量的核苷酸序列编码。因此，为了更好地模拟天然AAV8衣壳蛋白编码序列，中间体编码序列CS04a的GC含量降低至56％。

如图2所示，所得的CS04编码序列的总体GC含量为56％。所述序列的CpG-二核苷酸含量适中。然而，CpG二核苷酸主要位于编码序列的下游部分，例如编码因子VIII轻链的部分。CS04序列与野生型因子VIII(Genbank登录号M14113)中的对应编码序列具有79.77％的核苷酸序列同一性。

出于比较的目的，制备了若干种其他密码子优化的ReFacto构建体。CS08 ReFacto构建体如Radcliff等人,Gene Therapy,15:289-97(2008)所述进行密码子优化，其内容特此出于所有目的明确地通过引用整体并入本文。CS10密码子优化的ReFacto构建体获自Eurofins Genomics(Ebersberg,Germany)。CS11密码子优化的ReFacto构建体获自Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,USA)。CH25密码子优化的ReFacto构建体获自ThermoFischer Scientific的GeneArt services(Regensburg,Germany)。CS40ReFacto构建体由野生型因子VIII编码序列组成。每个ReFacto编码序列之间共享的序列同一性在下表2中示出。

表2–密码子改变的因子VIII构建体的百分比同一性矩阵。

CS04

CS08

CS10

CS11

CS40

CH25

CS04

100％

CS08

82.2％

100％

CS10

79.4％

78.4％

100％

CS11

78.3％

78.1％

77.5％

100％

CS40

79.8％

76.7％

77.6％

75.4％

100％

CH25

85.1％

85.0％

79.9％

79.4％

75.8％

100％

通过将不同的合成DNA片段克隆到相同的载体主链质粒(pCh-BB01)中来构建每个构建体的质粒。侧接AscI和NotI酶切位点的Refacto型BDD-FVIII片段的DNA合成由ThermoFischer Scientific(Regensburg,Germany)进行。载体骨架含有两个侧接的AAV2衍生的反向末端重复序列(ITR)，其涵盖衍生自肝特异性鼠转甲状腺素蛋白基因的启动子/增强子序列、用于插入相应的Refacto型BDD-FVIII的AscI和NotI酶限制性位点、以及合成polyA位点。经由AscI和NotI位点连接制备的载体骨架和插入片段后，将所得质粒以毫克规模扩增。通过直接测序(Microsynth,Balgach,Switzerland)验证构建体的Refacto型BDD-FVIII序列。克隆产生了七种不同的质粒构建体，命名为pCS40、pCS04、pCS08、pCS10、pCS11和pCh25(图14)。这些构建体具有相同的载体骨架并且编码相同的B结构域缺失的FVIII蛋白(Refacto型BDD-FVIII)，但其FVIII编码序列不同。

基于AAV8的载体通过三质粒转染方法进行制备，如Grieger等人(Mol.Ther.,10月6日(2015)doi:10.1038/mt.2015.187.[印刷前的电子版]所述)，其内容特此出于所有目的明确地通过引用整体并入本文。HEK293悬浮细胞用于使用对应的FVIII载体质粒、辅助质粒pXX6-80(携带腺病毒辅助基因)和包装质粒pGSK2/8(贡献rep2和cap8基因)的质粒转染。为了分离AAV8构建体，使用碘克沙醇梯度处理一升培养物的细胞沉淀，如Grieger等人所述(2015，同上)。所述程序产生了称为vCS04、vCS08、vCS10、vCS11和vCH25的载体制备剂。使用靶向AAV2反向末端重复序列的通用qPCR程序，通过qPCR对载体进行量化(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods:Part B,23:18–28(2012))。携带AAV2反向末端重复序列的对照载体质粒用于制备标准曲线。所得的vCS04构建体在图7A至图7C中呈现为SEQ ID NO:8。

通过AAV琼脂糖凝胶电泳分析载体基因组的完整性。电泳如Fagone等人,HumanGene Therapy Methods 23:1-7(2012)所述执行。简而言之，AAV载体制备剂在0.5％SDS的存在下于在75℃下孵育10分钟，并且然后冷却至室温。1％1xTAE琼脂糖凝胶上每个泳道加载大约1.5E10个载体基因组(vg)，并且以7V/cm的凝胶长度电泳60min。然后将凝胶在2xGelRed(Biotium目录号41003)溶液中染色，并且通过ChemiDocTMMP(Biorad)成像。图15中展示出的结果表明，vCS04和vCS40病毒载体具有相同大小的基因组，由5kb范围内的不同条带指示(图15，泳道2-4)。尽管载体大小为大约5.2kb，但基因组是一条同质条带，这证实了尺寸较大的基因组(相对于4.7kb的AAV野生型基因组)的正确包装。所有其他vCS载体制备剂显示出相同的基因组大小(数据未示出)。

为了确认衣壳蛋白的预期模式，使用载体vCS04和vCS40进行SDS PAGE，接着进行银染色(图16)。如图所示，下游纯化程序产生高度纯化的材料，显示出VP1、VP2和VP3的预期蛋白质模式(图16，泳道2-4)。所有其他病毒制备剂都看到相同的模式(未示出)。AAV制备剂的SDS-PAGE程序是根据标准程序进行的。每个泳道含有1E10vg的相应的病毒构建体，并且按照制造商的说明在4-12％Bis-Tris(Novex,Life Technologies)凝胶上分离。根据制造商的说明，使用SilverQuestTM试剂盒(Novex,Life Technologies)进行银染色。

令人惊讶的是，与vCS40野生型编码构建体和其他密码子优化的构建体相比，AAV载体vCS04具有更高的病毒体包装，通过AAV病毒生产中更高的产量来测量。如表3所示，vCS04载体的复制显著优于vCS40，提供了AAV滴度的5-7倍产量增加。

表3–使用AAV载体构建体vCS04和vCD40获得的每升细胞培养物的产量，如从细胞沉淀中纯化的。

实施例2–密码子改变的因子VIII变体表达序列的体内表达

为了测试密码子改变的因子VIII变体序列的生物效力，将实施例1中描述的ReFacto型FVIII构建体施用于缺乏因子VIII的小鼠。简而言之，通过尾静脉注射每千克小鼠体重4E12个载体基因组(vg)，在C57Bl/6FVIII敲除(ko)小鼠(每组6-8只动物)中进行测定。注射后14天通过眼眶后穿刺抽血，并使用标准程序制备和冷冻血浆。选择第14天的表达水平是因为此时抑制性抗体的影响最小，所述影响随后在此小鼠模型的一些动物中看到。按照制造商(Technoclone,Vienna,Austria)的建议，使用Technochrome FVIII测定来确定小鼠血浆中的FVIII活性，仅进行微小修改。对于所述测定，将血浆样品适当稀释并与含有凝血酶、活化因子IX(FIXa)、磷脂、因子X和钙的测定试剂混合。FVIII被凝血酶活化后，形成与FIXa、磷脂和钙的复合物。所述复合物将FX活化为活化的FX(FXa)，其进而从显色底物中切割对硝基苯胺(pNA)。pNA形成的动力学在405nm处测量。速率与样品中的FVIII浓度成正比。从参考曲线读取FVIII浓度，并且结果以IU FVIII/毫升给出。

下表4中呈现的结果证明，与野生型BDD-因子VIII构建体(CS40)相比，使用商业算法(CS10、CS11和CH25)设计的密码子改变的序列仅提供了BDD-因子VIII的中等增加(3-4倍)。类似地，如Radcliffe等人所述制备的密码子改变的BDD-因子VIII构建体(CS08)仅提供了BDD-FVIII表达的3-4倍增加。此结果与Radcliff等人中报道的结果一致。令人惊讶的是，CS04构建体在体内生物效力测定中提供了高得多的BDD-FVIII表达(例如，74倍的增加)。

表4–由不同AAV载体构建体诱导的FVIII敲除小鼠血浆中的FVIII的表达。

实施例3–人FVIII基因疗法载体在小鼠中的非临床功效和毒理学评价

血友病A是一种由因子VIII(FVIII)缺失或缺陷引起的遗传性出血性疾病，并且使用血浆衍生或重组因子浓缩物进行治疗。这些浓缩物需要定期输注，以维持足够的FVIII水平，从而控制和预防出血事件。鉴于蛋白质替代疗法的挑战，基因疗法可为血友病A患者提供替代治疗方法。通过将功能性F8基因拷贝引入靶肝细胞以诱导内源性FVIII表达，就不再必须频繁输注凝血因子。

基于腺相关病毒(AAV)的基因疗法有可能为血友病A患者提供临床益处。含有CS04因子VIII密码子优化的构建体的基于重组(r)AAV8的基因疗法载体被设计为在肝特异性转甲状腺素蛋白启动子的控制下递送人密码子优化的B结构域缺失的FVIII(BDDFVIII)转基因。所述构建体用于检查F8敲除(ko)小鼠中的FVIII活性的剂量反应关系并评价单次静脉内施用后的毒性。

简而言之，为了测试治疗的功效，向每组12只雄性FVIII敲除小鼠施用单次静脉内剂量的3.0×10¹¹、1.2×10¹²或3.0×10¹²个载体衣壳颗粒(cp)/kg或10mL/kg缓冲液。在8周内每隔一周采集一次眼眶后血样，并使用显色测定分析FVIII。从最终的活体血液采样中获得的血浆样品也用于分析FVIII结合和中和抗体。在观察期结束时，使用尾尖出血测定来评估止血控制。

在研究结束时，除了4只动物(用3.0×10¹²cp/kg载体治疗)的结合和中和抗体测试呈阳性外，所有样品的抗BDD-FVIII结合抗体均为阴性。这些动物被排除在FVIII活性水平和尾尖出血测定中的失血量的统计分析之外。施用1.2×10¹²或3.0×10¹²cp/kg载体导致平均血浆FVIII活性的剂量依赖性增加，分别达到0.6和1.9IU/mL(在研究期间计算)，但用缓冲液或3.0×10¹¹cp/kg载体治疗的小鼠的FVIII活性低于量化下限(LLOQ)(图17)。

第63天在尾尖出血测定中评估功效。图18中呈现了以mg/g体重为单位的60分钟内的失血量。用缓冲液或3.0×10¹¹cp/kg基因疗法载体治疗的动物表现出相似的失血量(分别为6.1mg/g和7.5mg/g)，这与未检测到FVIII活性一致。较高剂量的基因疗法载体以剂量依赖性方式显著减少失血量(1.2×10¹²：0.6mg/g，3.0×10¹²：0.4mg/g；Jonckheere-Terpstra检验：单侧P值<0.001)。

为了测试构建体的毒理学，对雄性C57BL/6J小鼠(n＝20/组)静脉内注射单次推注剂量的1×10¹³、3×10¹³或5×10¹³cp/kg载体或制剂缓冲液(表5)。毒性评估基于临床体征、体重、食物消耗、眼科以及临床和解剖病理学。对每个队列的5只动物进行完整尸检，并记录肉眼发现、器官重量和显微镜检查的结果。从每组另外5只动物收集组织以通过定量聚合酶链反应进行生物分布评估。在给药前和尸检时收集血液。分析了FVIII活性、BDD-FVIII抗原、结合抗BDD-FVIII抗体、中和抗BDD-FVIII抗体和结合抗AAV8抗体。

表5–毒性研究的设计。

发现高达5×10¹³cp/kg的基因疗法载体的单次静脉内推注施用具有良好的耐受性。研究期间没有发生死亡，并且没有临床体征或给药后观察结果被认为与载体的施用有关。没有观察到阴性眼科发现。没有观察到对体重或食物消耗的影响。未观察到临床化学、血液学或尿液分析参数的变化。并且没有与基因疗法载体的施用相关的毒理学相关的肉眼发现或显微镜发现。

FVIII活性和BDD-FVIII抗原评价容易出现很大的变化，很可能是由于产生了针对人BDD-FVIII的中和抗体。然而，所有载体组中的个体动物在第3天、第3周和第18周的活动均高于一般基线水平(数据未示出)。在收获的组织样品中，载体DNA主要在肝中检测到。肝和其他组织的生物分布与剂量相关，通常在最早的时间点最高，并随着时间的推移而减少。随着时间的推移，大脑和睾丸中载体DNA的存在显著减少，并且在许多动物中，到第18周时已低于测定的LLOQ(图19)。

综上所述，结果表明，当以≥1.2×10¹²cp/kg的剂量施用于FVIII敲除小鼠时，密码子优化的BDD-FVII基因疗法是有效的。未观察到不良作用的水平被认为是5.0×10¹³cp/kg，是毒性研究中测试的最高剂量。

实施例4–人FVIII基因疗法载体在小鼠中的非临床功效和毒理学评价

制备了含有CS04构建体的载体，所述CS04构建体编码用于血友病A患者的基因疗法的凝血因子VIII(FVIII)。基于单链(SS)腺相关病毒(AAV8)的载体被设计为在肝特异性转甲状腺素蛋白(TTR)的控制下递送人密码子优化的B结构域缺失的FVIII(BDD-FVIII)转基因。

在接受单次静脉内(i.v.)注射的雄性FVIII敲除(ko)小鼠中评估了尾尖出血测定中的FVIII血浆活性和止血功效。在1.0x10¹² cp/kg或更高的剂量下可检测到血浆FVIII活性。血浆FVIII活性的剂量依赖性增加被证明与失血量的剂量依赖性减少一致。

在雄性C57BL/6J小鼠中，以1.9x10¹²与5.0x10¹³ cp/kg之间的单次静脉内推注施用载体，以进行毒理学和生物分布评估。数据显示，最高剂量(5.0×10¹³cp/kg)没有死亡，没有不良临床体征或给药后观察结果。生物分布分析显示主要在肝中检测到，其他组织中的载体DNA的出现呈低剂量相关性，通常随着时间的推移而减少。未观察到不良作用的水平(NOAEL)的剂量为5.0x10¹³ cp/kg，是本毒性研究中测试的最高剂量。整合位点分析显示载体整合是最小的，没有观察到克隆性生长或先前与肝细胞癌形成有关的基因内或附近的优选整合。综上所述，这些临床前研究证明了良好的安全性概况和功效概况。

在一些实施方案中，向小鼠施用的剂量可根据“Guidance for Industry-Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers,”U.S.Department of Health and HumanServices,Food and Drug Administration,Center for Drug Evaluation and Research(CDER),2005年7月,Pharmacology and Toxicology中提供的指导而转化为人剂量，所述文献的内容出于所有目的特此通过引用整体并入。

实施例5–用密码子优化的B结构域缺失的因子VIII转基因治疗的严重血友病A患者的外周血中的免疫组分的翻译分析

方法：患有严重HA且无抑制剂病史的18-75岁男性，如果年出血率(ABR)≥3或正在使用FVIII预防且暴露天数>150天，则符合资格。患者在2个递增剂量队列中接受治疗(队列1：2×10¹²个衣壳颗粒(cp)/kg和队列2：6×10¹²cp/kg)。安全性评估包括对载体输注的耐受性、衣壳或转基因产物的免疫原性、载体脱落、不良事件(AE)和严重AE(SAE)。功效评估包括FVIII表达、ABR和外源性FVIII的使用。

主要结果：四名患者接受了载体静脉内输注(每个队列n＝2)。所有4人在入组前均使用FVIII预防(ABR为0-2)。在分析时，所有患者均进行了≥10个月的随访。未观察到输注反应，并且未发生FVIII抑制剂或血栓形成。总共记录了61项AE：14项与皮质类固醇使用相关，并且8项与载体相关。输注后1个月报告了一例严重低磷血症SAE。FVIII活性峰值出现在输注后4-9周，并且呈剂量依赖性(队列1[n＝2]：3.8％、11％；队列2[n＝2]：54.7％、69.4％)。研究患者特征和时间进程在图20A至图20D中示出。所有患者均发展出轻微转氨酶升高，并接受皮质类固醇(n＝3)或皮质类固醇预防(n＝1)。在皮质类固醇递减期间，FVIII表达显著下降，并且4名患者中的3名已恢复FVIII替代治疗。

次要结果：在基线和输注后30分钟、4、8和24小时收集用于细胞因子分析的样品。在筛选时、第一周收集全血细胞计数(CBC)、结合和中和免疫球蛋白测定，然后每周收集两次，直到第34周。根据方案，从第18周到第144周，将收集间隔延长至每16周一次。在相似的时间点收集酶联免疫斑点(ELISpot)测定，直到第52周。

使用可商购获得的方法通过ELISA测量血清细胞因子以及AAV和FVIII的结合抗体。没有患者发展出输注反应，并且输注时未观察到血清细胞因子的显著变化，如图21所报告。

如Konkle等人,Blood,137(6):763-74(2001)所述，进行基于体外转导抑制的中和抗体测定。简而言之，将受试者血清的连续2倍稀释液与AAV荧光素酶以1:1的比例混合，并在37℃下孵育2小时，然后用于感染组织培养物中的Huh7。24小时后，添加荧光素并通过光度计量化荧光素酶活性。与对照相比，导致荧光素酶活性抑制≥50％的受试者血清的最高稀释度被记录为NAb滴度。输注后观察到针对AAV衣壳抗原的中和抗体和结合抗体。所有患者在第2周时发生血清转化并发展出持续高滴度的抗AAV8中和抗体，如图22A至图22B所图示。在任何时间点，在任何受试者中均未检测到FVIII抑制剂、BDD FVIII的IgG和IgM，以及FVIII的IgM。在多个时间点检测到一名患者的针对FVIII的瞬时低滴度结合IgG，没有出现临床后遗症。

如Konkle等人,Blood,137(6):763-74(2001)中先前所述进行ELISPOT测定。使用PBMC评价AAV和FVIII-BDD抗原T细胞反应的IFN-γELISpot测定。生成了序列中有10个氨基酸重叠的15聚体肽文库，以涵盖整个感兴趣的蛋白质，并将其组织成3个库。将板用无菌PBS中的人IFN-γ包被抗体进行涂覆，洗涤并用完全培养基封闭。将研究受试者的新鲜PBMC在淋巴细胞培养基中调整至2×10个细胞/mL的浓度，并添加到孔中。在37℃下刺激18-24小时后，洗涤板并与人抗IFN-γ辣根过氧化物酶(HRP)一起孵育，接着与亲和素-HRP一起孵育，并且随后与AEC显色试剂一起孵育。使用AID ELISpot读板器量化人IFN-γ活化计数。ELISpot测定与FVIII转基因表达的丧失或转氨酶升高不对应(图23A至图23D)。尽管观察到与使用高剂量糖皮质激素相对应的总WBC和中性粒细胞计数的瞬时增加(未示出)，但未观察到全血计数群的显著变化。

转录组学样品制备：在输注前、输注后8小时、第1-14周以及第4、5、6、9和12个月收集来自三名同意的HA患者的全血样品以进行转录组学研究。健康志愿者对照样品购自StemCell Technologies。全血样品收集在PAXGene管中并储存在-80℃冰箱中。使用miRNAMini试剂盒提取总RNA。制备包括总RNA提取、血红蛋白mRNA的去除以及批量mRNAseq文库的构建，接着进行测序。

分析：将等量的六个单独索引的cDNA文库汇集在一起，使用Illumina的TruSeq SRCluster试剂盒V3以8pM的浓度在Illumina cBot系统流动池中进行聚类，并在IlluminaHiSeq系统上使用TruSeq SBS试剂盒进行100个循环的测序。每个样品生成大约5000万个测序读段。使用CASAVA 1.8软件对测序读段进行多路拆分并导出至fastq文件。使用OmicSoftArraySuite软件(10.2.3.10版本)和R(版本3.6.1)进行数据分析。使用OmicSoft中的OSA4算法将读段与参考基因组进行比对。使用filterByExpr中的默认参数过滤表达的基因，并使用M的修剪平均值(TMM)将计数归一化，这两种方法都在edgeR(版本3.26.8)中进行。使用PCAtools文库(版本2.6.0；通过方差去除较低的1％的基因)将用于表达的基因的TMM进一步用于主成分分析(PCA)，以检查每个样本的总体方差。使用自定义编写的R程序(R代码团队版本3.3.2)进行基因聚类。基因簇在GraphPad Prism 8.2.1中可视化。转录组分析工作流程在图24中图示。

使用批量mRNA进行的转录组分析并未展示NK细胞、树突状细胞、IL-6、TLR 1-8、STING-C Gas途径或T细胞途径信号的显著变化。输注后8小时发生TLR9、TNF-α、CCL5和IRF7信号的小幅瞬时增加，而没有活化1型IFN反应(图25A至图25D和图26A至图26D)。典型的和替代的NFκB信号传导途径、趋化因子/细胞因子、细胞凋亡和细胞粘附途径在外周血中没有上调(图27A至图27D)。未观察到ER应激途径的上调。

讨论/结论：所述载体的安全性概况与基于AAV8的基因疗法一致。初始载体衍生的FVIII表达显示出与转氨酶升高相对应的稳定下降。使用皮质类固醇无法阻止FVIII表达的丧失。

在本实施例中，观察到剂量依赖性FVIII活性峰值，与出血事件的暂时解决以及FVIII因子输注减少相关。然而，在皮质类固醇递减期间，FVIII表达显著下降，并且所有患者随后都恢复了FVIII替代治疗。初始载体衍生的FVIII表达显示出与转氨酶升高相对应的稳定下降，这不能通过使用皮质类固醇来阻止。针对AAV8的免疫球蛋白仍然是与重新给药相关的重大挑战，并且高滴度持续至少12个月，但可能持续数年。

ELISPOT的外周血循环T细胞反应用于评价和指导许多AAV基因疗法研究中的免疫抑制。在本研究中，ELISPOT并未将转氨酶升高或FVIII表达缺失相关联。

外周血中的探索性转录组学分析显示出与炎症相关的最小瞬时免疫反应。所评价的大多数免疫原性途径未显示出与健康对照的差异。优化血友病A的AAV基因疗法的努力应聚焦于靶组织特异性分析、去除预先存在的中和抗体以及开发临床前免疫原性模型。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅出于举例说明的目的，并且本领域技术人员将想到根据本发明的各种修改或变化，所述各种修改或变化将包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的据此以引用方式整体并入。

序列表

<110> 武田药品工业株式会社(Takeda Pharmaceutical Company Limited)

<120> 使用表达增强的编码重组FVIII变体的病毒载体的血友病A基因疗法

<130> 008073-5236-WO

<150> US 63/210,386

<151> 2021-06-14

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS04-FL-NA

<400> 1

atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60

accaggagat actacctggg ggctgtggag ctttcttggg actacatgca gtctgacctg 120

ggggagctgc ctgtggatgc caggttccca cccagagtgc ccaaatcctt cccattcaac 180

acctctgtgg tctacaagaa gaccctcttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240

gccaaaccca ggccaccctg gatgggactc ctgggaccca ccattcaggc tgaggtgtat 300

gacactgtgg tcatcaccct caagaacatg gcctcccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360

ggggtcagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac ctcccagagg 420

gagaaggagg atgacaaagt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtcctc 480

aaggagaatg gccccatggc ctctgaccca ctctgcctga cctactccta cctttctcat 540

gtggacctgg tcaaggacct caactctgga ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600

ggctccctgg ccaaagagaa gacccagacc ctgcacaagt tcattctcct gtttgctgtc 660

tttgatgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaact ccctgatgca ggacagggat 720

gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780

ctgcctggac tcattggctg ccacaggaaa tctgtctact ggcatgtgat tggcatgggg 840

acaacccctg aggtgcactc cattttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900

agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctca ctgcccagac cctgctgatg 960

gacctcggac agttcctgct gttctgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020

gcctatgtca aggtggacag ctgccctgag gagccacagc tcaggatgaa gaacaatgag 1080

gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt ccgctttgat 1140

gatgacaaca gcccatcctt cattcagatc aggtctgtgg ccaagaaaca ccccaagacc 1200

tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgccccact ggtcctggcc 1260

cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctcaacaatg gcccacagag gattggacgc 1320

aagtacaaga aagtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380

attcagcatg agtctggcat cctgggccca ctcctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440

ctcatcatct tcaagaacca ggcctccagg ccctacaaca tctacccaca tggcatcact 1500

gatgtcaggc ccctgtacag ccgcaggctg ccaaaggggg tgaaacacct caaggacttc 1560

cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tcactgtgga ggatggacca 1620

accaaatctg accccaggtg cctcaccaga tactactcca gctttgtgaa catggagagg 1680

gacctggcct ctggcctgat tggcccactg ctcatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740

aggggaaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgattc tgttctctgt ctttgatgag 1800

aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagcgcttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860

cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc actccatcaa tggctatgtg 1920

tttgacagcc tccagctttc tgtctgcctg catgaggtgg cctactggta cattctttct 1980

attggggccc agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gctacacctt caaacacaag 2040

atggtgtatg aggacaccct gaccctcttc ccattctctg gggagactgt gttcatgagc 2100

atggagaacc ctggcctgtg gattctggga tgccacaact ctgacttccg caacaggggc 2160

atgactgccc tgctcaaagt ctcctcctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220

agctatgagg acatctctgc ctacctgctc agcaagaaca atgccattga gcccaggagc 2280

ttcagccaga atccacctgt cctgaaacgc caccagaggg agatcaccag gaccaccctc 2340

cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccattt ctgtggagat gaagaaagag 2400

gactttgaca tctatgacga ggacgagaac cagagcccaa ggagcttcca gaagaagacc 2460

aggcactact tcattgctgc tgtggagcgc ctgtgggact atggcatgag ctccagcccc 2520

catgtcctca ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccac agttcaagaa agtggtcttc 2580

caagagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaatgagcac 2640

ctgggactcc tgggcccata catcagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700

cgcaaccagg cctccaggcc ctacagcttc tacagctccc tcatcagcta tgaggaggac 2760

cagaggcagg gggctgagcc acgcaagaac tttgtgaaac ccaatgaaac caagacctac 2820

ttctggaaag tccagcacca catggccccc accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880

gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggcccactc 2940

ctggtctgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggaa ggcaagtgac tgtgcaggag 3000

tttgccctct tcttcaccat ctttgatgaa accaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060

gagcgcaact gcagggcccc atgcaacatt cagatggagg accccacctt caaagagaac 3120

taccgcttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctgggct tgtcatggcc 3180

caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctt tctatgggct ccaatgagaa cattcactcc 3240

atccacttct ctgggcatgt cttcactgtg cgcaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300

tacaacctct accctggggt ctttgagact gtggagatgc tgccctccaa agctggcatc 3360

tggagggtgg agtgcctcat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg 3420

gtctacagca acaagtgcca gacccccctg ggaatggcct ctggccacat cagggacttc 3480

cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctccactac 3540

tctggatcca tcaatgcctg gagcaccaag gagccattca gctggatcaa agtggacctg 3600

ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttctccagc 3660

ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaaatg gcagacctac 3720

agaggcaact ccactggaac actcatggtc ttctttggca atgtggacag ctctggcatc 3780

aagcacaaca tcttcaaccc cccaatcatc gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840

tacagcatcc gcagcaccct caggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcctgcagc 3900

atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgccc agatcactgc ctccagctac 3960

ttcaccaaca tgtttgccac ctggagccca agcaaggcca ggctgcacct ccagggaagg 4020

agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac ccaaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080

aagaccatga aggtcactgg ggtgaccacc cagggggtca agagcctgct caccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctgat cagctccagc caggatggcc accagtggac cctcttcttc 4200

cagaatggca aggtcaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtgaac 4260

agcctggacc cccccctcct gaccagatac ctgaggattc acccccagag ctgggtccac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggtcctggga tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374

<210> 2

<211> 1457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS04-FL-AA

<400> 2

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

755 760 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

770 775 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785 790 795 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

805 810 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

900 905 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

930 935 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

965 970 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

980 985 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn

1010 1015 1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys

1025 1030 1035

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr

1040 1045 1050

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr

1055 1060 1065

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe

1070 1075 1080

Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met

1085 1090 1095

Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met

1100 1105 1110

Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly

1115 1120 1125

Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser

1130 1135 1140

Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg

1145 1150 1155

Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

1160 1165 1170

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser

1175 1180 1185

Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1190 1195 1200

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe

1205 1210 1215

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp

1220 1225 1230

Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

1235 1240 1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn

1250 1255 1260

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

1265 1270 1275

Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly

1280 1285 1290

Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys

1295 1300 1305

Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn

1310 1315 1320

Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln

1325 1330 1335

Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu

1340 1345 1350

Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val

1355 1360 1365

Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys

1370 1375 1380

Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu

1385 1390 1395

Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

1400 1405 1410

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr

1415 1420 1425

Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1430 1435 1440

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1445 1450 1455

<210> 3

<211> 2220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS04-HC-NA

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ctgggggagc tgcctgtgga tgccaggttc ccacccagag tgcccaaatc cttcccattc 120

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attgccaaac ccaggccacc ctggatggga ctcctgggac ccaccattca ggctgaggtg 240

tatgacactg tggtcatcac cctcaagaac atggcctccc accctgtgag cctgcatgct 300

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gtctttgatg agggcaagag ctggcactct gaaaccaaga actccctgat gcaggacagg 660

gatgctgcct ctgccagggc ctggcccaag atgcacactg tgaatggcta tgtgaacagg 720

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agggacctgg cctctggcct gattggccca ctgctcatct gctacaagga gtctgtggac 1680

cagaggggaa accagatcat gtctgacaag aggaatgtga ttctgttctc tgtctttgat 1740

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS04-LC-NA

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成BDLO04

<400> 5

agcttcagcc agaatccacc tgtcctgaaa cgccaccaga gg 42

<210> 6

<211> 7827

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS04-AV-NA

<400> 6

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caacagccca tccttcattc agatcaggtc tgtggccaag aaacacccca agacctgggt 2160

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caacatcttc aaccccccaa tcatcgccag atacatcagg ctgcacccca cccactacag 4800

catccgcagc accctcagga tggagctgat gggctgtgac ctgaactcct gcagcatgcc 4860

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caacatgttt gccacctgga gcccaagcaa ggccaggctg cacctccagg gaaggagcaa 4980

tgcctggagg ccccaggtca acaacccaaa ggagtggctg caggtggact tccagaagac 5040

catgaaggtc actggggtga ccacccaggg ggtcaagagc ctgctcacca gcatgtatgt 5100

gaaggagttc ctgatcagct ccagccagga tggccaccag tggaccctct tcttccagaa 5160

tggcaaggtc aaggtgttcc agggcaacca ggacagcttc acccctgtgg tgaacagcct 5220

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cgctcttagt agcagtatcg ataataaaag atctttattt tcattagatc tgtgtgttgg 5400

ttttttgtgt gttaattaag ctcgcgaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 5460

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tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 5700

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cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 5940

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 6000

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caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 7440

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ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 7560

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 7620

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 7680

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 7740

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 7800

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS08-FL-NA

<400> 7

atgcagatcg aactgagcac ttgcttcttc ctgtgtctcc tgcgcttttg cttctccgcc 60

acaaggagat actatctcgg tgccgtggag ctcagctggg actacatgca gagcgacttg 120

ggtgaactgc ctgtggacgc caggtttcca ccccgcgtgc ccaagagttt cccgttcaac 180

accagtgtcg tgtacaagaa aaccctcttc gtggaattca ccgaccacct gttcaacatc 240

gccaaaccgc gccctccctg gatggggctg ctcggcccga cgatccaggc tgaggtctat 300

gacacggtgg tgattaccct caagaacatg gctagccacc cggtgagcct gcacgccgtg 360

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gagaaggaag acgacaaagt gttccccggg ggttcccaca cctatgtctg gcaggtcctg 480

aaggagaatg gtcctatggc ctccgaccca ttgtgcctca cctactctta cctaagccat 540

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<210> 8

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CS10-FL-NA

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ctctacatct ctcagttcat aataatgtat tcactggatg ggaagaaatg gcagacttac 3720

agaggaaaca gcaccgggac gctgatggtg ttctttggca acgtggacag cagcggcatc 3780

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agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctcccaga atccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340

cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400

gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460

cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520

catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580

caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640

ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700

agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760

cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820

ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880

gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940

ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000

tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060

gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120

tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180

caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240

attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300

tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360

tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420

gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480

cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540

tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600

ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660

ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720

cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780

aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840

tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900

atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960

tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020

agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080

aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200

cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260

tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta ctga 4374

<210> 11

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成CH25-FL-NA

<400> 11

atgcagatcg agctgtccac atgctttttt ctgtgcctgc tgcggttctg cttcagcgcc 60

acccggcggt actacctggg cgccgtggag ctgtcctggg actacatgca gagcgacctg 120

ggcgagctgc ccgtggacgc ccggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180

accagcgtgg tgtacaagaa aaccctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaacatc 240

gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300

gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360

ggcgtgagct actggaaggc ctccgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagcgg 420

gagaaagagg acgacaaagt ctttcctggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtcctg 480

aaagaaaacg gccccatggc ctccgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540

gtggacctgg tgaaggacct gaacagcggg ctgattgggg ccctgctggt ctgccgggag 600

ggcagcctgg ccaaagagaa aacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660

ttcgacgagg gcaagagctg gcacagcgag accaagaaca gcctgatgca ggaccgggac 720

gccgcctctg ccagagcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacagaagc 780

ctgcccggcc tgattggctg ccaccggaag agcgtgtact ggcacgtgat cggcatgggc 840

accacacccg aggtgcacag catctttctg gaagggcaca cctttctggt gcggaaccac 900

cggcaggcca gcctggaaat cagccctatc accttcctga ccgcccagac actgctgatg 960

gacctgggcc agttcctgct gttttgccac atcagctctc accagcacga cggcatggaa 1020

gcctacgtga aggtggactc ctgccccgag gaaccccagc tgcggatgaa gaacaacgag 1080

gaagccgagg actacgacga cgacctgacc gacagcgaga tggacgtggt gcggttcgac 1140

gacgacaaca gccccagctt catccagatc agaagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200

tgggtgcact acatcgccgc cgaggaagag gactgggact acgcccccct ggtgctggcc 1260

cccgacgaca gaagctacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagcg gatcggccgg 1320

aagtacaaga aagtgcggtt catggcctac accgacgaga ccttcaagac ccgggaggcc 1380

atccagcacg agagcggcat cctgggcccc ctgctgtacg gcgaagtggg cgacacactg 1440

ctgatcatct tcaagaacca ggccagccgg ccctacaaca tctaccccca cggcatcacc 1500

gacgtgcggc ccctgtacag caggcggctg cccaagggcg tgaagcacct gaaggacttc 1560

cccatcctgc ccggcgagat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga ggacggcccc 1620

accaagagcg accccagatg cctgacccgg tactacagca gcttcgtgaa catggaacgg 1680

gacctggcct ccgggctgat cggacctctg ctgatctgct acaaagaaag cgtggaccag 1740

cggggcaacc agatcatgag cgacaagcgg aacgtgatcc tgttcagcgt gttcgatgag 1800

aaccggtcct ggtatctgac cgagaacatc cagcggtttc tgcccaaccc tgccggggtg 1860

cagctggaag atcccgagtt ccaggccagc aacatcatgc actccatcaa tggctacgtg 1920

ttcgacagcc tgcagctgtc cgtgtgtctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980

atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttcagcg gctacacctt caagcacaag 2040

atggtgtacg aggacaccct gaccctgttc cctttcagcg gcgagaccgt gttcatgagc 2100

atggaaaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttccg gaaccggggc 2160

atgaccgccc tgctgaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggac 2220

agctacgagg atatcagcgc ctacctgctg tccaagaaca acgccatcga gcccagaagc 2280

ttcagccaga acccccctgt gctgaagcgg caccagagag agatcacccg gaccaccctg 2340

cagtccgacc aggaagagat cgattacgac gacaccatca gcgtggagat gaaaaaagaa 2400

gatttcgaca tctacgacga ggacgagaac cagagccccc ggtccttcca gaagaaaacc 2460

cggcactact ttatcgccgc cgtggagcgg ctgtgggact acggcatgag cagcagcccc 2520

cacgtgctgc ggaaccgggc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa agtggtgttc 2580

caggaattca ccgacggcag cttcacccag cccctgtacc ggggcgagct gaacgagcac 2640

ctggggctgc tggggcccta catcagggcc gaagtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700

cggaatcagg ccagcagacc ctactccttc tacagcagcc tgatcagcta cgaagaggac 2760

cagcggcagg gcgctgaacc ccggaagaac ttcgtgaagc ccaatgagac caagacctac 2820

ttctggaaag tgcagcacca catggccccc accaaggacg agttcgactg caaggcctgg 2880

gcctacttca gcgacgtgga tctggaaaag gacgtgcact ctggactgat tggccctctg 2940

ctggtgtgcc acaccaacac cctgaacccc gcccacggcc ggcaggtgac cgtgcaggaa 3000

ttcgccctgt tcttcaccat cttcgacgag accaagtcct ggtacttcac cgagaatatg 3060

gaacggaact gcagagcccc ctgcaacatc cagatggaag atcctacctt caaagagaac 3120

taccggttcc acgccatcaa cggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc 3180

caggaccaga ggatccggtg gtatctgctg tccatgggca gcaacgagaa tatccacagc 3240

atccacttca gcggccacgt gttcaccgtg aggaagaaag aagagtacaa gatggccctg 3300

tacaacctgt accccggcgt gttcgagacc gtggagatgc tgcccagcaa ggccggcatc 3360

tggcgggtgg agtgtctgat cggcgagcac ctgcatgccg ggatgagcac cctgtttctg 3420

gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcca gcggccacat ccgggacttc 3480

cagatcaccg cctccggcca gtacggccag tgggccccca agctggcccg gctgcactac 3540

agcggcagca tcaacgcctg gtccaccaaa gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg 3600

ctggccccta tgatcatcca cggcattaag acccagggcg ccaggcagaa gttcagcagc 3660

ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720

cggggcaaca gcaccggcac cctgatggtg ttcttcggca acgtggacag cagcggcatc 3780

aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatc gcccggtaca tccggctgca ccccacccac 3840

tacagcatca gatccaccct gcggatggaa ctgatgggct gcgacctgaa ctcctgcagc 3900

atgcctctgg gcatggaaag caaggccatc agcgacgccc agatcacagc cagcagctac 3960

ttcaccaaca tgttcgccac ctggtccccc tccaaggcca ggctgcacct gcagggccgg 4020

tccaacgcct ggcggcctca ggtgaacaac cccaaagaat ggctgcaggt ggactttcag 4080

aaaaccatga aggtgaccgg cgtgaccacc cagggcgtga aaagcctgct gaccagcatg 4140

tacgtgaaag agtttctgat cagcagcagc caggacggcc accagtggac cctgttcttt 4200

cagaacggca aggtgaaagt gttccagggc aaccaggact ccttcacccc cgtggtgaac 4260

tccctggacc cccccctgct gacccgctac ctgcggatcc acccccagtc ttgggtgcac 4320

cagatcgccc tgaggatgga agtgctggga tgtgaggccc aggatctgta ctga 4374

<210> 12

<211> 2351

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成FVIII-FL-AA

<400> 12

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro

755 760 765

Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp

770 775 780

Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys

785 790 795 800

Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser

805 810 815

Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr

820 825 830

Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn

835 840 845

Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly

850 855 860

Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu

865 870 875 880

Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys

885 890 895

Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn

900 905 910

Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met

915 920 925

Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys

930 935 940

Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu

945 950 955 960

Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu

965 970 975

Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe

980 985 990

Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala

995 1000 1005

Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser

1010 1015 1020

Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser

1025 1030 1035

Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu

1040 1045 1050

Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg

1055 1060 1065

Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met

1070 1075 1080

Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln

1085 1090 1095

Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met

1100 1105 1110

Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile

1115 1120 1125

Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro

1130 1135 1140

Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu

1145 1150 1155

Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys

1160 1165 1170

Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro

1175 1180 1185

Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu

1190 1195 1200

Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu

1205 1210 1215

Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile

1220 1225 1230

His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu

1235 1240 1245

Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr

1250 1255 1260

Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn

1265 1270 1275

Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu

1280 1285 1290

Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu

1295 1300 1305

Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln

1310 1315 1320

Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg

1325 1330 1335

Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp

1340 1345 1350

Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro

1355 1360 1365

Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala

1370 1375 1380

Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser

1385 1390 1395

Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser

1400 1405 1410

Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe

1415 1420 1425

Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys

1430 1435 1440

Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys

1445 1450 1455

Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly

1460 1465 1470

Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser

1475 1480 1485

Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp

1490 1495 1500

Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His

1505 1510 1515

Ile Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser

1520 1525 1530

Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr

1535 1540 1545

Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val

1550 1555 1560

Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser

1565 1570 1575

Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln

1580 1585 1590

Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys

1595 1600 1605

Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys

1610 1615 1620

Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys

1625 1630 1635

Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg

1640 1645 1650

Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu

1655 1660 1665

Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr

1670 1675 1680

Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile

1685 1690 1695

Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

1700 1705 1710

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr

1715 1720 1725

Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser

1730 1735 1740

Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

1745 1750 1755

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu

1760 1765 1770

His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp

1775 1780 1785

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser

1790 1795 1800

Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly

1805 1810 1815

Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr

1820 1825 1830

Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu

1835 1840 1845

Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu

1850 1855 1860

Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His

1865 1870 1875

Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln

1880 1885 1890

Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp

1895 1900 1905

Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn

1910 1915 1920

Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His

1925 1930 1935

Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met

1940 1945 1950

Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser

1955 1960 1965

Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr

1970 1975 1980

Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr

1985 1990 1995

Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly

2000 2005 2010

Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly

2015 2020 2025

Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro

2030 2035 2040

Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala

2045 2050 2055

Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His

2060 2065 2070

Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser

2075 2080 2085

Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile

2090 2095 2100

Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser

2105 2110 2115

Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr

2120 2125 2130

Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn

2135 2140 2145

Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile

2150 2155 2160

Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg

2165 2170 2175

Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys

2180 2185 2190

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln

2195 2200 2205

Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser

2210 2215 2220

Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp

2225 2230 2235

Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe

2240 2245 2250

Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys

2255 2260 2265

Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser

2270 2275 2280

Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys

2285 2290 2295

Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val

2300 2305 2310

Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His

2315 2320 2325

Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu

2330 2335 2340

Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

2345 2350

Claims

1.一种用于治疗血友病A的方法，其包括向被诊断为患有血友病A的人受试者静脉内输注每千克所述人受试者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含有包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。

2.一种用于治疗血友病A的方法，其包括向被诊断为患有血友病A的人受试者静脉内输注每千克所述人受试者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含有包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括向诊断为患有血友病A的所述人受试者施用泼尼松龙或泼尼松疗程。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述泼尼松龙或泼尼松疗程在输注所述AAV颗粒之后施用。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中施用所述泼尼松龙或泼尼松疗程包括：

在紧接输注所述AAV颗粒后的第一周期间，每天向所述人受试者施用60mg泼尼松龙或泼尼松；

在紧接输注所述AAV颗粒后的第二周期间，每天向所述人受试者施用40mg泼尼松龙或泼尼松；以及

在紧接输注所述AAV颗粒后的第三周期间，每天向所述人受试者施用30mg泼尼松龙或泼尼松。

6.如权利要求5所述的方法，其还包括在紧接输注所述AAV颗粒后的第三周后施用递减剂量的泼尼松龙或泼尼松。

7.如权利要求6所述的方法，其中施用所述递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括：

紧接完成初始泼尼松龙或泼尼松疗程后，连续5天每天向所述人受试者施用20mg泼尼松龙或泼尼松；

紧接向所述人受试者施用20mg泼尼松龙或泼尼松5天后，连续3天每天向所述人受试者施用15mg泼尼松龙或泼尼松；

紧接向所述人受试者施用15mg泼尼松龙或泼尼松3天后，连续3天每天向所述人受试者施用10mg泼尼松龙或泼尼松；以及

紧接向所述人受试者施用10mg泼尼松龙或泼尼松3天后，连续3天每天向所述人受试者施用5mg泼尼松龙或泼尼松。

8.如权利要求6所述的方法，其中施用所述递减剂量的泼尼松龙或泼尼松包括：

紧接完成初始泼尼松龙或泼尼松疗程后，连续7天每天向所述人受试者施用30mg泼尼松龙或泼尼松；

紧接向所述人受试者施用30mg泼尼松龙或泼尼松7天后，连续7天每天向所述人受试者施用20mg泼尼松龙或泼尼松；

紧接向所述人受试者施用20mg泼尼松龙或泼尼松7天后，连续5天每天向所述人受试者施用15mg泼尼松龙或泼尼松；

紧接向所述人受试者施用15mg泼尼松龙或泼尼松5天后，连续5天每天向所述人受试者施用10mg泼尼松龙或泼尼松；以及

紧接向所述人受试者施用10mg泼尼松龙或泼尼松5天后，连续5天每天向所述人受试者施用5mg泼尼松龙或泼尼松。

9.一种方法，其包括：

在向诊断为患有血友病A的人受试者施用包含编码因子VIII蛋白的多核苷酸的腺相关病毒(AAV)颗粒后并且当所述人受试者接受初始糖皮质激素类固醇疗程时，确定从所述人受试者收集的血液样品中的第一因子VIII活性水平；

在完成所述初始糖皮质激素类固醇疗程后，确定从所述人受试者收集的血液样品中的第二因子VIII活性水平；

将所述第二因子VIII活性水平与所述第一因子VIII活性水平进行比较；以及

施用递减剂量的所述糖皮质激素类固醇，其中：

当所述第二因子VIII活性水平不小于所述第一因子VIII活性水平时，在不超过三周的时间段内施用第一递减剂量的所述糖皮质激素类固醇；以及

当所述第二因子VIII活性水平小于所述第一因子VIII活性水平时，在超过三周的时间段内施用第二递减剂量的所述糖皮质激素类固醇。

10.一种方法，其包括：

在向诊断为患有血友病A的人受试者施用包含编码因子VIII蛋白的多核苷酸的腺相关病毒(AAV)颗粒之前，确定从所述人受试者收集的血液样品中的第一肝酶活性水平；

在向所述人施用包含编码因子VIII蛋白的多核苷酸的AAV颗粒后，并且在完成初始糖皮质激素类固醇疗程后，确定从所述人受试者收集的血液样品中的第二肝酶活性水平；

将所述第二肝酶活性水平与所述第一肝酶活性水平进行比较；以及

施用递减剂量的所述糖皮质激素类固醇，其中：

当所述第二肝酶活性水平不大于所述第一肝酶活性水平时，在不超过三周的时间段内施用第一递减剂量的所述糖皮质激素类固醇；以及

当所述第二肝酶活性水平高于所述第一肝酶活性水平时，在超过三周的时间段内施用第二递减剂量的所述糖皮质激素类固醇。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中施用所述第一递减剂量的所述糖皮质激素类固醇包括：

紧接完成所述初始糖皮质激素类固醇疗程后，连续5天每天向所述人受试者施用20mg泼尼松龙或泼尼松；

12.如权利要求9至11中任一项所述的方法，其中施用所述第二递减剂量的所述糖皮质激素类固醇包括：

紧接完成所述初始糖皮质激素类固醇疗程后，连续7天每天向所述人受试者施用30mg泼尼松龙或泼尼松；

13.一种使用包含编码因子VIII多肽的多核苷酸的腺相关病毒(AAV)颗粒来监测血友病A的因子VIII基因疗法的功效的方法，所述方法包括：

在向所述人受试者施用所述AAV颗粒后，确定从所述人受试者收集的血液样品中是否存在因子VIII抑制剂抗体；以及

当检测到所述人受试者的血液中存在因子VIII抑制剂时，向所述人受试者施用用于治疗血友病A的替代剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述替代剂包括化学修饰的人因子VIII蛋白。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述替代剂包括猪因子VIII蛋白。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述替代剂是包括因子II、因子IX和因子X的因子VIII旁路治疗剂。

17.一种方法，其包括：

a)在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含有包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸；以及

b)在稍后的时间点测量所述患者血流中的SEQ ID NO:1或其片段的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。

18.一种方法，其包括：

a)在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含有包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸；以及

19.一种方法，其包括：

a)在第一时间点向血友病A患者施用一定剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含编码因子VIII蛋白的多核苷酸；以及

b)在稍后的时间点测量所述患者血流中的编码所述因子VIII蛋白的多核苷酸或其片段的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。

20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是7天时。

21.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是14天时。

22.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是21天时。

23.一种方法，其包括：

a)在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重1.2x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含衣壳蛋白和包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸；以及

b)在稍后的时间点测量所述患者血流中的所述衣壳蛋白的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。

24.一种方法，其包括：

a)在第一时间点向血友病A患者施用每千克所述患者体重5x10¹³个的剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含衣壳蛋白和包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列的多核苷酸；以及

25.一种方法，其包括：

a)在第一时间点向血友病A患者施用一定剂量的腺相关病毒(AAV)颗粒，其中所述AAV颗粒包含衣壳蛋白和编码因子VIII蛋白的多核苷酸；以及

26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是7天时。

27.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是14天时。

28.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是21天时。

29.一种方法，其包括：

b)在稍后的时间点测量所述患者血流中的抗因子VIII抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。

30.一种方法，其包括：

31.一种方法，其包括：

32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是7天时。

33.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是14天时。

34.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是21天时。

35.一种方法，其包括：

b)在稍后的时间点测量所述患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的水平，其中所述稍后的时间点是7天或更长。

36.一种方法，其包括：

37.一种方法，其包括：

38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其还包括：

c)在向所述患者施用所述剂量的所述腺相关病毒(AAV)颗粒之前，测量所述患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的基线水平；以及

d)任选地，将所述稍后时间点的所述患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的所述测量水平与所述患者血流中的抗衣壳蛋白抗体的所述基线水平进行比较。

39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是7天时。

40.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是14天时。

41.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述稍后的时间点是21天时。

42.一种方法，其包括：

通过以下方式来确定受试者是否已经对因子VIII基因疗法产生免疫反应：

在向诊断为患有血友病A的受试者施用包含编码因子VIII蛋白的多核苷酸的基因疗法后，确定从所述受试者收集的第一外周血样品中的免疫原性介体的第一水平；以及

如果所述受试者已经对所述因子VIII基因疗法产生免疫反应，则向所述受试者施用第一剂量的类固醇，并且

如果所述受试者尚未对所述因子VIII基因疗法产生免疫反应，则向所述受试者施用少于所述第一剂量的所述类固醇的第二剂量的所述类固醇。

43.如权利要求42所述的方法，其中确定所述受试者是否已经对所述因子VIII基因疗法产生免疫反应包括将所述免疫原性介体的所述第一水平与一个或多个健康个体的外周血中的所述免疫原性介体的参考水平进行比较。

44.如权利要求42所述的方法，其中确定所述受试者是否已经对所述因子VIII基因疗法产生免疫反应包括将所述免疫原性介体的所述第一水平与在施用包含编码因子VIII蛋白的所述多核苷酸的所述基因疗法之前从所述诊断为患有血友病A的受试者收集的第二外周血样品中的所述免疫原性介体的第二水平进行比较。

45.如权利要求42所述的方法，其中确定所述受试者是否已经对所述因子VIII基因疗法产生免疫反应包括将所述免疫原性介体的所述第一水平与在收集所述第一外周血样品前并且在施用包含编码因子VIII蛋白的所述多核苷酸的所述基因疗法后从所述诊断为血友病A的受试者收集的第二外周血样品中的所述免疫原性介体的第二水平进行比较。

46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述免疫原性介体是细胞因子。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞因子是肿瘤坏死因子α(TNFα)或白介素6(IL-6)。

48.如权利要求46或47所述的方法，其中通过酶联免疫测定(ELISA)确定所述细胞因子的水平。

49.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述免疫原性介体是Toll样受体(TLR)信号传导途径的介体。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述TLR信号传导途径的介体选自由以下组成的组：CHUK、CXCL8、IFNA20P、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、INFE、IFNG、IFNG-AS1、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL3P1、IFNL4、IFNLR1、IKBKB、IKBKE、IKBKG、IKBKGP1、IL10、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL6、IRF7、MYD88、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NKFBIB、NFKBIE、REL、RELA、RELB、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR8-AS1、TLR9和TNF。

51.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述免疫原性介体是先天免疫信号传导途径的介体或抗病毒细胞因子。

52.如权利要求49所述的方法，其中所述先天免疫信号传导途径的介体或抗病毒细胞因子选自由以下组成的组：CCL5、CXCL1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNB1、IFNG、IFNK、IFNL3、IL10、IL15、IL18、IL22、IL6、LTA和TNF。

53.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述免疫原性介体是核因子κB(NF-κB)信号传导途径的介体。

54.如权利要求49所述的方法，其中所述NF-κB信号传导途径的介体选自由以下组成的组：BAX、BCL2、BCL2L1、CASP1、CASP7、CASP8、CASP9、TRAF1、TRAF2、CCR5、CCR7、CD4、CD40LG、CD44、CD80、CD83、CD86、CR2、HLA-A、ICOS、IL15RA、IL2RA、TNFRSF14、TNFRSF9、AKT1、EIF2AK2、LCK、MAP3K1、MAP3K14、RIPK1、RAF1、NFKB1、NFKB2、REL、RELA、RELB、TBP、CYLD、ILBKB、ILBKE、ILBKG、ILBKGP1、NFKBIA、NFKBIB、NFKBIE、CHUK、CCL1、CCL22、CCL4、CCL5、CXCL10、CXCL3、CXCL6、CXCL8、CXCR5、IFNB1、IFNG、IFNL1、IL12B、IL15、IL17A、IL1A、IL1RN、IL23A、IL32、IL4、IL5、IL6、IL9、TNFAIP3、TNFSF10、ICAM1、ITGA2、ITGA2B、ITGA5、ITGA6、ITGA6-AS1、PECAM1和VCAM1。

55.如权利要求42-54中任一项所述的方法，其中所述编码因子VIII蛋白的多核苷酸包含SEQ ID NO:1(CS04-FL-NA)的核酸序列。

56.如权利要求42-55中任一项所述的方法，其中所述基因疗法包括向所述受试者施用包含编码所述因子VIII蛋白的所述多核苷酸的病毒载体。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述AAV载体是血清型8AAV载体(AAV8)。

59.如权利要求42-58中任一项所述的方法，其中所述基因疗法包括施用一定剂量的编码所述因子VIII蛋白的所述多核苷酸，所述一定剂量的所述多核苷酸选自由以下组成的组：2x10¹²个拷贝的所述多核苷酸、6x10¹²个拷贝的所述多核苷酸、1.8x10¹³个拷贝的所述多核苷酸、1.2x10¹³个拷贝的所述多核苷酸、以及5x10¹³个拷贝的所述多核苷酸。