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CN117843812A - 逆转肿瘤微环境的融合蛋白及其应用 - Google Patents

逆转肿瘤微环境的融合蛋白及其应用 Download PDF

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CN117843812A
CN117843812A CN202410037360.2A CN202410037360A CN117843812A CN 117843812 A CN117843812 A CN 117843812A CN 202410037360 A CN202410037360 A CN 202410037360A CN 117843812 A CN117843812 A CN 117843812A
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CN
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car
fusion protein
cells
gamma
tumor
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CN202410037360.2A
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徐艳敏
梅恩典
赵永春
单娟娟
齐亚男
赵文旭
陈军
黄霞
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Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd
Chongqing Precision Biotech Co ltd
Original Assignee
Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd
Chongqing Precision Biotech Co ltd
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Abstract

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白、一种肿瘤免疫抑制抵抗型CAR以及表达载体、免疫细胞和应用。该融合蛋白与CEA、CD19、PSCA、BCMA等不同靶点的不同CAR结构结合成肿瘤免疫抑制抵抗型CAR或联合使用，靶向杀伤CD47阳性的的肿瘤细胞；所述肿瘤免疫抑制抵抗型CAR和免疫细胞破除肿瘤组织中抑制性信号对CAR‑T功能的影响，实现了CAR‑T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。

Description

逆转肿瘤微环境的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白、一种新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR以及表达载体、免疫细胞和应用。
背景技术
CAR全称是嵌合抗原受体，CAR-T是嵌合抗原受体T细胞即表达嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞，目前CAR-T治疗在血液系统肿瘤中取得了突破性进展，但在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为CAR-T较难进入实体瘤内部，一方面即便CAR-T细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响CAR-T细胞在实体瘤治疗的疗效；肿瘤微环境与肿瘤的发生、生长和转移有着密切关系，近年来的临床研究表明，肿瘤微环境尤其是实体瘤的免疫微环境对免疫治疗(包含免疫细胞治疗)的疗效和预后都有着显著的影响。因此，CAR-T细胞治疗实体肿瘤，解决肿瘤微环境抑制即实施肿瘤微环境抵抗必不可少。
CD47作为继PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向CD47 ScFv制备CAR-T进行肿瘤治疗。CD47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向CD47疗效有限，并且外源的ScFv由于其强的亲和力可能会导致CAR-T细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别CD47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。
信号调节蛋白α(SIRPα)是CD47的配体之一，可与CD47结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用，目前绝大多数关于CD47的研究均集中于SIRPα。SIRPγ也可与CD47结合，其存在于T细胞表面，胞外区由一个V结构域和两个C1结构域组成，无胞内信号，仅通过CD47传递单向信号，目前很少有研究者针对SIRPγ进行改造，而我们认为其是更适合进行针对CD47进行肿瘤微环境破除的配体。因此，我们选择SIRPγ蛋白的胞外段进行改造设计，并进一步设计肿瘤免疫抑制抵抗型的CAR。
发明内容
本发明的目的在于提供一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白和包含该蛋白的表达载体和免疫细胞，所述融合蛋白可以逆转肿瘤微环境，靶向杀伤肿瘤细胞。
为了实现上述目的，本发明采用以下方案：
对SIRPγ蛋白的胞外段进行改造设计，得到可以破除肿瘤组织中抑制性信号的逆转肿瘤微环境的融合蛋白。
所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白结构包含胞外段，跨膜区和胞内信号区。
进一步，跨膜结构来源于人CD28跨膜区或人CD8来源跨膜区。
进一步，所述跨膜结构氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述胞内信号区来源于CD28，序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:38所示。
进一步，所述SIRPγ融合蛋白的结构为SIRPγ-CD28TM-CD28、SIRPγ-CD8TM-4-1BB。
进一步，所述SIRPγ胞外段氨基酸序列如SEQ ID NO:1或其功能性变体所示。
进一步，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能性变体所示。
进一步，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的氨基酸序列为SEQ ID NO:3或其功能性变体所示。
进一步，所述SIRPγ融合蛋白为SIRPγ-CD28TM-CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
进一步，包含所述表达载体的免疫细胞。
进一步，所述免疫细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞。
具体的所述的T细胞可以是αβT细胞，也可以是γδT细胞；γδT细胞是一群表面含有受体γ和δ链的独特的T细胞亚群，占所有t淋巴细胞的0.5-5％，该细胞群于1987年首次发现。其虽然具有γδTCR，但是其识别抗原或配体为非MHC限制的，与传统的αβT细胞不同。目前已经有CN107810267A和CN107771215A等多篇专利公开将γδT细胞应用于细胞治疗和CAR-T细胞治疗中。
具体的，在设计SIRPγ融合蛋白的同时还设计了PD-1的融合蛋白PD-1-28TM-28、PD-1-8TM-BB。
具体地，所述设计的SIRPγ融合蛋白在与CAR1联合应用时，既可单独表达，也可以与CAR1共同表达发挥作用。并且所述SIRPγ融合蛋白也可单独应用到免疫治疗中。
具体地，本发明中，发明人认为SIRPγ蛋白更适合进行针对CD47进行肿瘤微环境破除的配体。因此，选择SIRPγ蛋白的胞外段进行改造设计，并进一步设计肿瘤免疫抑制抵抗型的CAR；因此本发明创造性的将设计构建的缺氧可调控启动子联合CAR-T细胞技术和缺氧可调控启动子、SIRPγ蛋白联合CAR-T细胞技术应用到肿瘤的免疫治疗当中，即进一步对传统的CAR结构进行改造，提高CAR-T在实体瘤上的治疗药效及CAR-T的安全性。
进一步，所述免疫细胞还包含具有识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体结构，所述嵌合抗原受体包含识别肿瘤抗原的胞外段、hinge区、跨膜区和胞内信号区，其中肿瘤抗原包含但不限于PSCA、PSMA、CD19、BCMA、CD123、CD20、CD22、CEA、EGFR、EGFRVIII、GPC3、5T4、CD33、Her2、GD2、CD70、CLL-1、Trop2、CD47、GPC3、CLND18.2、CD133、CS1、CD155、CD30、ROR1、MUC1、IL13RAα2或mesothelin等可以作为肿瘤靶向性识别的抗原分子。
本发明的目的在于还提供一种新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR，以及包含所述CAR的表达载体和免疫细胞。所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR和免疫细胞破除肿瘤组织中抑制性信号对CAR-T功能的影响，实现了CAR-T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR包含目的一所述的逆转肿瘤微环境的融合蛋白和CAR1，所述CAR1包含识别肿瘤抗原的胞外段、hinge区、跨膜区和胞内信号区。
进一步，所述融合蛋白通过多顺反子结构与CAR1连接，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点IRES，所述自剪切多肽为T2A、P2A、E2A或F2A。
进一步，所述CAR的结构为ScFv-hinge-TM-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ融合蛋白或ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ融合蛋白。
进一步，所述CAR的结构为ScFv-hinge-TM-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ-CD28TM-CD28或ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ-CD28TM-CD28。
进一步，所述CAR结构a可以是常规的第一代、第二代、第三代CAR结构，也可以是改进的双CAR、可调控CAR结构(如FRB/FKBP12调控)等新型CAR结构。
进一步，CAR1中的铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4；CAR结构中跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86；CAR结构中胞内信号区可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127。
进一步，所述ScFv可以识别CD19、CD123、MOv-γ、PSMA、IL13Rα2、EGFRvIII、EGFR、EPCAM、GD2、MUC1、HER2、GPC3、CEA、Meso、CD133、NKG2D、CD138、LeY、k-Light、CD33、ROR1、BCMA、CD30、CD20、CD22、PSCA、CLL-1、CD70、CD47中的任一种。
进一步，所述ScFv可以识别CD47或CEA或PSCA或CD19或BCMA。
在某些实施例中，所述CAR结构带有截短的EGFRt调控标签；在某些实施例中，所述靶向PSCA的CAR结构为通用型CAR结构；在某些实施例中，所述靶向PSCA的CAR结构带有自杀基因如iCasp9。
在某些实施例中，所述CAR结构包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如，CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRA、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如，CD16、和CD64；和Ly49受体，例如，LY49A、LY49C。所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，DAP12)相互作用。
作为一种优选方案1，前述的SIRPγ融合蛋白的和CAR1组成的CAR结构，其中，所述CAR1包含：hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或其功能性变体所示，TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:11或其功能性变体所示所示；融合蛋白结构：融合蛋白结构：SIRPγ的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或功能性变体所示；来源于人CD28的跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；来源于人CD28的胞内信号区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
进一步，所述ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示或其功能性变体。
具体的，本优选方案设计了表达新型免疫抑制抵抗型CAR：ScFv-hinge-TM-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ-28TM-28，ScFv-hinge-TM-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ-8TM-BB，ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ-28TM-28，ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-自剪切肽-SIRPγ-8TM-BB以及ScFv-hinge-TM-CD3ζ-自剪切肽-PD-1-28TM-28和ScFv-hinge-TM-CD3ζ-自剪切肽-PD-1-8TM-BB的基因修饰的T淋巴细胞验证新型免疫抑制抵抗型CAR的作用。
进一步，制备所述的CAR的结构的方法为，将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。
作为一种优选方案2，前述的SIRPγ融合蛋白的和CAR1组成的CAR结构，其中，所述CAR1包含抗CEA单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137和CD3ξ双刺激信号。
优选地，所述CAR结构a为CEA ScFv-CD8铰链区-CD8跨膜区-CD137-CD3ξ结构，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO：26所示的序列。其中，编码CEA单链抗体的核酸序列如SEQ IDNO：36所示；编码CD8铰链区-CD8跨膜区-CD137-CD3ξ结构的核酸序列如SEQ ID NO：37所示。
进一步，编码包含缺氧可调控的启动子的所述CAR结构的核酸序列包含如SEQ IDNO：31所示的序列。
作为一种优选方案3，前述的SIRPγ融合蛋白的和CAR1组成的CAR结构，其中，所述CAR1包括CD19单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137和CD3ξ双刺激信号；
优选地，所述CAR结构a氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示或其功能性变体。
进一步，编码所述CAR结构的核酸序列包含如SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33所示的序列。
进一步，制备所述的CAR的结构的方法为，将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。
作为一种优选方案4，前述的SIRPγ融合蛋白的和CAR1组成的CAR结构，其中，所述CAR结构a包括PSCA单链抗体、铰链区、CD28跨膜区、CD28、CD137和CD3ξ三刺激信号；所述铰链区为G4H或7H。
优选地，所述CAR结构a氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示或其功能性变体；或如SEQID NO：29所示或其功能性变体。氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示或其功能性变体为铰链区为G4H的CAR结构a；氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示或其功能性变体为铰链区为7H的CAR结构a。
进一步，编码所述CAR结构的核酸序列包含如SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35所示的序列；其中SEQ ID NO：35包含了缺氧可调控的启动子。
进一步，制备所述的CAR的结构的方法为，将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。
作为一种优选方案5，包含前述的SIRPγ融合蛋白，和优选方案1-优选方案4中的任一一种CAR1组成CAR结构，所述CAR结构还包括缺氧启动子，所述缺氧可调控启动子的核酸序列包含如SEQ ID NO：30所示的序列。包含缺氧启动子的靶向CD19的CAR结构能够在缺氧微环境中有效的清除体内肿瘤作用,并且利用缺氧微环境诱导的启动子能够在缺氧环境强化目的基因、蛋白等因子的表达，提高肿瘤的药物疗效和CAR-T治疗的有效性和安全性，而且不仅可以有效的表达于T淋巴细胞，而且在缺氧环境中能够加强CAR分子表达，并且使CAR-T细胞有高的IFN-γ分泌能力，提高CAR-T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗。
进一步，所述缺氧可调控启动子，由Hifla调节元件和迷你启动子连接构成；所述迷你启动子选自细胞病毒启动子、HSV胸苷激酶的启动子、猿猴病毒40的启动子、腺病毒晚期启动子和合成启动子中的任一项。
进一步，制备所述的CAR的结构的方法为，将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。
本发明目的在于还提供一种包含前任一所述的新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR(包括优选方案1-优选方案5中的方案和非优选地方案)的表达载体、包含该表达载体的免疫细胞。
进一步，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
进一步，所述免疫细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞。
进一步，制备所述的免疫细胞的方法为，将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞；或将不包含所述SIRPγ融合蛋白的CAR结构和所述SIRPγ融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。
在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。
在某些实施例中，CAR包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)以及优化的土拔鼠转录后调节元件(oPRE)。
在某些实施例中，所述5'LTR的启动子经异源启动子置换。
在某些实施例中，所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
在某些实施例中，所述5'LTR或3'LTR是慢病毒LTR。
在某些实施例中，所述3'LTR是自我失活(SIN)LTR。
在某些实施例中，所述CAR结构的核酸序列包含优化的Kozark序列。
在某些实施例中，可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的所述启动子以及以下组成的群组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。
在某些实施例中，包含CAR的载体可以包含分泌型抗PD-1ScFv；在某些实施例中，包含CAR的载体包含PD-1共轭转导肽(如PD-1-CD28-CD137-CD3信号结构)；在某些实施例中，包含CAR的载体多个CAR组合，如2个靶向不同抗原或同一抗原的不同识别位点的CAR组合。
本发明的目的在于还提供了一种药物组合物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述药物组合物包含所述的融合蛋白或包含所述融合蛋白的表达载体和免疫细胞或所述的新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR或包含所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR所述的免疫细胞。
在某些实施例中，融合蛋白可以选择SIRPα或者SIRPα的部分结构域，融合蛋白的结构可以是SIRPα-28TM-28，SIRPα-8TM-137，SIRPα-8TM-OX40、SIRPα-8TM-ICOS等多种融合蛋白。在有些实施例中可以单独使用表达上述SIRPα融合蛋白的免疫细胞，也可以将上述SIRPα融合蛋白和CAR分子共表达于同一免疫细胞；或分别表达SIRPα融合蛋白、CAR分子的免疫细胞以一定比例混合。
在某些具体实施例中，所述活性剂和/或治疗可以是手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228、细胞因子和辐射。
在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞活性的活性剂。活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT,LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIG、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、TGFR(TGFRβ)和TGFRβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如PD1 CAR。
进一步，种前任一所述的融合蛋白或前任一所述的CAR结构或前任一所述的核酸序列或前任一所述的表达载体或前任一所述的免疫细胞在制备肿瘤药物中的应用。
进一步，所述肿瘤为恶性肿瘤，包括急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和皮肤癌。
在本发明中，在CAR结构中，Z是指人CD3胞内信号CD3ζ，BB是指人4-1BB胞内信号，BBZ是指4-1BB ICD-CD3ζ的胞内结构域，28Z是指CD28 ICD-CD3ζ的胞内结构域。
本发明中，所述“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。
本发明中，在CAR结构中，CEAZ是指胞内结构仅有CD3ζ的靶向CEA的CAR结构，CEA-28Z是指胞内具有来源CD28胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构，CEA-BBZ是指胞内具有来源4-1BB胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构，BCMA-BBZ是指胞内具有来源4-1BB胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向BCMA的CAR结构；SIRPγ-28TM-28是指胞内仅有来源CD28胞内域信号的SIRPγ融合肽，使用SIRPγ-28简写；SIRPγ-8TM-BB是指胞内仅有来源4-1BB胞内域信号的融合肽，使用SIRPγ-BB简写。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的逆转肿瘤微环境的融合蛋白可以逆转肿瘤微环境，靶向杀伤CD47阳性的的肿瘤细胞；包含所述融合蛋白的新型肿瘤免疫抑制抵抗型CAR和免疫细胞破除肿瘤组织中抑制性信号对CAR-T功能的影响，实现了CAR-T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。
附图说明
图1为免疫抑制破除融合蛋白结构图。
图2为免疫抑制型CAR结构示意图。
图3为CAR构建质粒验证图。
图4为靶细胞构建结果。
图5a为新型免疫抑制抵抗型CAR-T的CAR阳性率。
图5b为新型免疫抑制抵抗型CAR-T的表达强度。
图6a为新型免疫抑制抵抗型CAR-T体外功能验证。
图6b为新型免疫抑制抵抗型CAR-T体外杀伤率。
图7为新型免疫抑制抵抗型CAR-T对肿瘤抑制环境破除验证。
图8a为NCG小鼠CEA，PD-L1，CD47三阳性表达。
图8b为NCG小鼠的肿瘤体积测量数据绘制肿瘤体积增长曲线。
图9为二代免疫抑制型CAR的体内有效性。
图10为CEA靶点各实验组平均荧光强度情况。
图11为CEA靶点各实验组阳性率情况。
图12为CEA靶点各实验组CAR-T的体外扩增倍数曲线。
图13为CEA靶点各实验组CAR-T对靶细胞DLDL1-CEA的杀伤效率。
图14为CEA靶点各实验组分别在DLD1-CEA和DLD1-CEA(CD47-)细胞中IFN-γ分泌情况。
图15为CEA靶点各实验组分别在DLD1-CEA和DLD1-CEA(CD47-)细胞中IL-2分泌情况。
图16为CEA靶点各实验组分别在DLD1-CEA和DLD1-CEA(CD47-)细胞中TNF-α分泌情况。
图17为CEA靶点筛选对比组a体内缺氧模型验证小鼠肿瘤生长情况实体图。
图18为CEA靶点筛选对比组a体内缺氧模型验证肿瘤小鼠体内生物发光量情况。
图19为流式检测靶向CD19的各实验组CAR-T的阳性率情况。
图20为靶向CD19的各实验组细胞杀伤情况。
图21为靶向CD19的各实验组IFN-γ因子分泌情况。
图22为靶向CD19的各实验组小鼠体内生物发光情况。
图23为靶向CD19的各实验组小鼠体内肿瘤生长情况。
图24为PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况。
图25为PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况。
图26为PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况。
图27为PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况。
图28为PSCA-28BBZ-G4H-28TM、PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况。
图29为PSCA-28BBZ-7H-28TM、PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况。
图30为PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况。
图31为PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况。
图32为PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况。
图33为PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况。
图34为PSCA-28BBZ-G4H-28TM、PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28中细胞杀伤情况。
图35为PSCA-28BBZ-7H-28TM、PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28中细胞杀伤情况。
图10-图18中，5HCEA-BBZ指的是含缺氧的并且胞内具有来源4-1BB胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构；CEA-BBZ指的是胞内具有来源4-1BB胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构；CEA-28Z指的是胞内具有来源CD28胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构，SIRPγ-28TM-28是指胞内仅有来源CD28胞内域信号的融合肽后续使用SIRPγ-28简写。
图19-图23中，5HCD19-BBZ是指胞内具有缺氧启动子、来源4-1BB(简写为BB)胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CD19的CAR结构；SIRPγ-28TM-28(SIRPγ-28)是指胞内仅有来源CD28胞内域信号的融合肽；5HCD19-BBZ-SIRPγ-28指的是指的是如下结构的CAR：5HCD19-8H-8TM-CD137-CD3ζ；SIRPγ-28-5HCD19-BBZ是指是包含缺氧启动子的CAR融合蛋白分别表达两个载体转染免疫细胞获得的CAR-T。
图24-图35中，RT4-Luc-GFP为阳性细胞，PC-3-Luc-GFP为阴性细胞；SIRPγ-28TM-28(SIRPγ-28)是指胞内仅有来源CD28胞内域信号的融合肽；PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28指的是将PSCA-28BBZ-G4H-28TM或PSCA-28BBZ-7H-28TM和SIRPγ-28与融合蛋白SIRPγ-28分别表达于两个载体转染免疫细胞获得的产品。PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28指的是将PSCA-28BBZ-G4H-28TM或PSCA-28BBZ-7H-28TM和SIRPγ-28与融合蛋白SIRPγ-28共同表达于一个载体转染免疫细胞获得的产品。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，涉及到的载体结构原件的序列如下表1所示。
表1载体结构原件的序列
本发明实施例中(表1中)：Z是指CD3ζ，CEAZ是指胞内结构仅有CD3ζ的CAR结构(ScFv(CEA)-hinge-TM-CD3ζ)，CEA-28Z是指胞内具有来源CD28胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构(ScFv(CEA)-hinge-TM-CD28-CD3ζ)，CEA-BBZ是指胞内具有来源4-1BB胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CEA的CAR结构(ScFv(CEA)-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ)，BCMA-BBZ是指胞内具有来源4-1BB(简写为BB)胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向BCMA的CAR结构；SIRPγ-28TM-28是指胞内仅有来源CD28胞内域信号的融合肽后续使用SIRPγ-28简写，SIRPγ-8TM-BB是指胞内仅有来源4-1BB胞内域信号的融合肽，后续使用SIRPγ-BB简写。
本发明实施例中，5HCD19-BBZ是指胞内具有缺氧启动子、来源4-1BB(简写为BB)胞内域的共刺激信号和CD3ζ的靶向CD19的CAR结构；SIRPγ-28TM-28(简写SIRPγ-28)是指胞内仅有来源CD28胞内域信号的融合肽；SIRPγ-28+5HCD19-BBZ是指是包含缺氧启动子的CAR融合蛋白分别表达两个载体转染免疫细胞获得的CAR-T。5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28是指是包含缺氧启动子的CAR融合蛋白共同表达一个载体转染免疫细胞获得的CAR-T。
本发明实施例中，PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28指的是将PSCA-28BBZ-G4H-28TM或PSCA-28BBZ-7H-28TM和SIRPγ-28与融合蛋白SIRPγ-28分别表达于两个载体转染免疫细胞获得的产品。PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28指的是将PSCA-28BBZ-G4H-28TM或PSCA-28BBZ-7H-28TM和SIRPγ-28与融合蛋白SIRPγ-28共同表达于一个载体转染免疫细胞获得的产品。
本发明实施例中采用磷酸钙法包装慢病毒的方法，具体为：用含10％ FBS(w/v)的DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态，包装质粒(RRE:REV:2G)和表达质粒按一定比列加入到1.5的离心管中，加入CaCl2和2×HBS，混匀后室温静置后加入到处理好的293T细胞培养液中，3-5h后再次换液至10mL含10％FBS的DMEM培养基，48h或72h后收集细胞上清，纯化病毒。
本发明实施例中，抗体为：Protein-L-PE，Protein-L可识别抗体轻链，CAR抗原识别区的ScFv序列的轻链可被Protein-L识别，因此利用Protein-L可检测CAR阳性率和CAR表达强度。SIRPγ-28后有GFP标签，以GFP阳性率确定其表达情况。
本发明实施例中，检测不同CAR-T对靶细胞杀伤能力的方法为：利用ACEAxCELLigence RTCA MP仪器进行，实验步骤依据仪器说明书进行。ACEA xCELLigence RTCAMP原理为对附着于孔底的肿瘤细胞以电阻指数为数据每15分钟记录一次，通过电阻指数判断贴壁的靶细胞的增殖或者死亡情况。利用电阻指数分析结果公式为：CAR-T细胞杀伤率＝基线电阻指数-实时电阻指数。
本发明实施例中，IFN-γ检测采用BD IFN-γ试剂盒检测，实验步骤依据产品说明书进行；IL-2检测采用inritrogen IL-2试剂盒检测，实验步骤依据产品说明书进行；TNF-α检测采用Biolegend试剂盒检测，实验步骤依据产品说明书进行。
本发明实施例中，验证缺氧模型是否构建完成的方法为：利用重组质粒病毒感染活化的PBMC构建体外缺氧细胞模型，培养12-18h后换液；然后利用CoCl2诱导缺氧环境，培养至第N天通过检测CAR结构上轻链抗体检测CAR表达情况。
本发明实施例中，体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG小鼠，由日本实验动物研究所(CIEA)的Mamoru Ito培育而成，为国际上CAR-T体内相关成瘤实验最常见品系。
本发明实施例中，体内缺氧模型验证的方法为：选择6-8周鼠龄雌性NOG小鼠，标记耳号后，在小鼠背部以1×10^6/只细胞量皮下注射靶细胞，成瘤第12天测量小鼠肿瘤体积。
第一部分
实施例1质粒构建
基于如图1所示的CAR模式图，以SIRPγ及CD47全长的质粒、pL-CAG-2AGFP、pL-CAG-PD1-CD28-2ACherry、pL-CAG-PD1-BB-2Acherry为模板，构建如图2所示的CAR结构和对应的单靶点CAR结构。构建获得载体：CEAZ-PD1-28、CEAZ-PD1-BB、CEAZ-SIRPγ-BB、CEAZ-SIRPγ-28、CEABBZ-P2A-SIRPγ-28，CEABBZ-P2A-SIRPγ-BB，BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28和单靶点CAR：CEAZ，PD1-28，PD1-BB，SIRPγ-28TM-28，SIRPγ-8TM-BB。通过酶切及测序比对验证后，结果如图3所示，重组质粒的酶切鉴定:1-3:pL-CAG-CEAZ-PD1-28质粒，依次为:原质粒，CEAZ(1371bp)，PD1-28(783bp)；4-6:pL-CAG-CEAZ-PD1-BB质粒，依次为:原质粒，CEAZ(1371bp)，PD1-BB(798bp)；7-9:pL-CAG-CEAZ-SIRPγ-28质粒，依次为:原质粒，CEAZ(1371bp)，SIRPγ-28(1374bp)；10-12:pL-CAG-CEAZ-SIRPγ-BB质粒，依次为:原质粒，CEAZ(1371bp)，SIRPγ-BB(1368bp)；M1:DL5000 DNA分子量标准；M2:DL15000 DNA分子量标准；13-15:pL-CAG-SIRPγ-28-2AGFP质粒，依次为:原质粒，SIRPγ-28(1292bp)，2AGFP(785bp)；16-18:pL-CAG-SIRPγ-BB-2AGFP质粒，依次为:原质粒，SIRPγ-BB(1286bp)，2AGFP(785bp)19-20:pL-CAG-CD47质粒，依次为:CD47(974bp)，原质粒；M3：DL5000 DNA分子量标准；构建成功。
实施例2靶细胞构建
利用磷酸钙法制备获得CEA，PD-L1，CD47抗原的病毒，分别感染CHO细胞构建CHO-CEA细胞、CHO-CEA-PD-L1细胞系和CHO-CEA-CD47细胞系。信号调节蛋白α(SIRPγ)是CD47的配体之一，可与CD47结合，因此可用CD47阳性靶细胞对CEAZ-SIRPγ-BB、CEAZ-SIRPγ-28、SIRPγ、SIRPγ-28，SIRPγ-BB进行评估。
三个细胞系经十次传代培养后检测其阳性率，结果如图4显示，CHO-CEA的阳性率为97.1％，CHO-CEA-CD47的双阳率为97.6％，CHO-CEA-PD-L1的双阳率为87％，符合实验需求，表明细胞系已构建成功，可作为靶细胞用于后续的CAR-T药效评价。
实施例3制备慢病毒及感染T淋巴细胞
采用磷酸钙法包装慢病毒，获得实施例1中5个单表达的CAR(CEAZ，PD1-28，PD1-BB，SIRPγ-28，SIRPγ-BB)及6个新型免疫抑制抵抗型CAR(CEAZ-PD1-28，CEAZ-PD1-BB，CEAZ-SIRPγ-28，CEAZ-SIRPγ-BB，CEABBZ-SIRPγ-28，CEABBZ-SIRPγ-BB)病毒颗粒。
利用梯度离心法进行淋巴细胞分离；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，获得人PBMC细胞。获得的PBMC细胞经抗CD3、CD28单克隆抗体活化24h后，按一定的感染复数(MOI)感染已活化的PBMC，在病毒感染的第12天检测CAR-T的阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：Protein-L-PE，Protein-L可识别抗体轻链，CAR抗原识别区的ScFv序列的轻链可被Protein-L识别，因此利用Protein-L可检测CAR阳性率和CAR表达强度。
结果如图5a所示：免疫抑制破除融合蛋白可在T细胞表面表达成功，如图5b所示新型免疫抑制抵抗型CAR表达成功。
实施例4新型免疫抑制抵抗型CAR-T体外功能验证
以未表达免疫抑制破除融合蛋白的Control T细胞作为对照，验证免疫抑制破除融合蛋白SIRPγ-28TM-28，SIRPγ-8TM-BB的功能。靶细胞为表达CD47的CHO细胞系。结果如图6a所示，SIRPγ-28TM-28和SIRPγ-8TM-BB融合蛋白在针对CD47阳性的靶细胞均有杀伤作用。
以CEAZ组作为阳性对照，Control-T组作为阴性对照，设置CEAZ-PD1-28，CEAZ-PD1-BB，CEAZ-SIRPγ-28，CEAZ-SIRPγ-BB组为实验组，将CHO-CEA-CD47和CHO-CEA-PD-L1作为靶细胞，验证新型免疫抑制抵抗型CAR-T体外有效性。结果如图6b及下表2所示，CEAZ-PD1-28和CEAZ-SIRPγ-28组的细胞杀伤率显著高于CEAZ组，而CEAZ-PD1-BB和CEAZ-SIRPγ-BB组对靶细胞的杀伤对比CEAZ组无明显增强。此外，CEAZ-PD1-28，CEAZ-PD1-BB组在与CHO-CEA-CD47共培养情况下以及CEAZ-SIRPγ-28，CEAZ-SIRPγ-BB组在与CHO-CEA-PD-L1共培养情况下杀伤效率较CEAZ组均无明显的差异，表明新型免疫抑制抵抗型CAR-T组具有杀伤特异性，且CEAZ-PD1-28和CEAZ-SIRPγ-28对靶细胞有较显著的杀伤效果。
表2免疫抑制抵抗型CAR-T体外杀伤率
以K562-BCMA为靶细胞，Control-T组作为阴性对照，验证BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28的功能，结果显示BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28可以显示很好的杀伤功能。
实施例5新型免疫抑制抵抗型CAR-T对肿瘤抑制环境破除验证
CAR-T细胞在浸润肿瘤组织后往往受到肿瘤免疫抑制为环境影响，高表达PD1，LAG-3，Tim-3衰减分子，进而杀伤肿瘤细胞有效功能减弱，CART细胞自身凋亡增加。为了验证新型免疫抑制抵抗型CAR-T是否能够破除肿瘤抑制微环境信号，对CEAZ，CEA-28Z，CEA-BBZ，CEAZ-PD1-28，CEAZ-PD1-BB，CEAZ-SIRPγ-28，CEAZ-SIRPγ-BB及Control-T组CAR-T细胞培养至Day 7时将CAR-T细胞与DLD-1-CEA-Luc-GFP细胞12孔细胞培养板中进行共培养，48h后收集CAR-T细胞，标记抗人CD3，PL，PD1，LAG-3，Tim-3流式抗体后进行流式检测，分析检测结果以评价其效应能力。由于CEAZ-PD1-28和CEAZ-PD1-BB组中外源表达PD1，因此这两组的PD1阳性率不用于评价CAR-T细胞的衰竭程度。衰竭分子检测结果如图7以及下表3所示：在CD3+PL+下，CEAZ-SIRPγ-28的PD1，LAG-3，Tim-3的表达程度低于CEAZ组，表明CEAZ-SIRPγ-28经抗原刺激后衰竭程度较低。
表3免疫抑制抵抗型CAR-T对肿瘤抑制环境破除验证情况
同样的，BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28经BCMA抗原刺激后也显示较低的衰竭分子表达。
实施例6新型免疫抑制抵抗型CAR-T体内功能验证
体内验证使用小鼠为NCG小鼠。选取30只NCG小鼠，并注DLD-1-CEA-Luc-GFP(CEA，PD-L1，CD47三阳性表达，如图8a所示)进行荷瘤。肿瘤生长到如绿豆大小可测量时，测量肿瘤大小，在实验过程中，实验组小鼠出现萎靡濒死、半身或全身瘫痪、体重丢失20％(与实验开始前比较)、肿瘤体积≥1500mm3任一情况时终止实验。
荷瘤后Day 5测量小鼠肿瘤荧光值，以活体成像荧光值进行随机分组，保证各组小鼠体重和荧光度值无显著差异，计算体重平均值。Day 6回输CAR-T细胞，体积为100μL(含有效CAR-T细胞数量3×106)，给予相同总细胞数的未转染的T细胞作为对照组。NCG小鼠的肿瘤体积测量数据绘制肿瘤体积增长曲线，发现Day 27-30，CEAZ-SIRPγ-28对肿瘤有较为明显的抑制效果，结果如图8b所示。
进一步，验证了二代CAR与融合蛋白联合设计的免疫抑制型CAR即CEABBZ-P2A-SIRPγ-28结构的体内有效性，同样采用NCG小鼠注射DLD-1-CEA-Luc-GFP细胞荷瘤，荷瘤13天后进行CAR-T细胞回输，总细胞数8×106。结果如图9所示，本发明的免疫抑制型CAR-T(CEABBZ-P2A-SIRPγ-28)能够很好的在体内发挥功能，效果明显优于对照组二代CAR结构的CEABBZ。
第二部分靶向CEA的CAR结构(其中CAR1氨基酸序列为27)的实验部分
实施例7靶向CEA的质粒构建
(1)实验组质粒构建
由迷你启动子miniCMV合成缺氧启动序列5HRE-CMVmini promoter，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。然后由5HRE-CMVmini promoter、慢病毒表达载体、CEAScFv-CD8铰链区-CD8跨膜区-CD137-CD3ξ-P2A-SIRPγ-CD28(5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28)的CAR结构利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆，构建靶向CEA的CAR-T细胞制剂的含有SIRPγ融合蛋白的重组质粒PBKL1-5H1P-CEA-OPRE(SIRPγ融合蛋白)，该步骤中，使用了CAR和融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞或者CAR和融合蛋白共同分别表达于一个载体转染免疫细胞两种方法来获得我们的含有融合蛋白的CAR的结构，其中CAR和融合蛋白共同分别表达于一个载体转染免疫细胞获得的产品用缩写
“5HCEA-BBZ+SIRPγ-28”表示。
(2)对照组质粒构建
按照实施例1中(1)的方法构建5HCEA-BBZ-8H-8。
实施例8靶向CEA的质粒体外功能模型验证
分别设置5HCEA-BBZ-8H-8、5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28、SIRPγ-28加CoCl2为实验组验证缺氧模型，结果如图10和图11所示，平均荧光强度和阳性率5HCEA-BBZ-8H-8、5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28、SIRPγ-28相近，如图12所示，5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28扩增倍数更具有优势。
实施例9靶向CEA的CAR-T有效性验证
(1)靶细胞DLDL1-CEA的杀伤效率
分别以CEA阳性的DLD1-CEA和DLD1-CEA(CD47-)细胞为靶细胞。将效应细胞(常规CAR-T细胞和含缺氧启动子CAR表达的CAR-T细胞)缺氧处理后，按照1：1的效靶比铺于靶细胞中，检测不同CAR-T对靶细胞杀伤能力。
加入CAR-T的24h后，各组CAR-T对靶细胞DLDL1-CEA的杀伤效率结果如图13以及下表4所示，5HCEA-BBZ-8H-8、5HCEA-BBZ+SIRPγ-28和5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28具有较强杀伤功能、SIRPγ-28组也具有杀伤功能。
表4靶向CEA的各组CAR-T对靶细胞DLDL1-CEA的杀伤效率
结构 Specific Lysis(％)
5HCEA-BBZ+SIRPγ-28 84.4752
5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28 99.4934
5HCEA-BBZ-8H-8 99.7738
SIRPγ 45.2293
Control T 29.721
Medium 0
(2)IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌检测
接着(1)，在杀伤24小时后收集细胞上清，进行CAR-T细胞受到靶细胞刺激后IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌能力的检测。收集的上清，使用试剂盒利用ELISA方法检测IFN-γ和IL-2的分泌情况。
结果如图14、图15、图16所示，靶细胞为DLD1-CEA时，5HCEA-BBZ-8H-8分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α较少，5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α远高于5HCEA-BBZ-8H-8组，靶细胞为DLD1-CEA(CD47-)细胞，IFN-γ、IL-2、TNF-α较低或达不到检测线。本发明5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28更有利于CAR-T的增值和杀伤肿瘤相关的因子分泌，说明其确实能够提高CAR-T的有效性。
实施例8含有SIRPγ融合蛋白的质粒体内功能验证
体内验证使用的成瘤靶细胞选择DLD1-CEA-Luc-GFP细胞，构建人CEA+实体瘤荷瘤模型。
根据肿瘤体积随机分为Control T(CT)组、5HCEA-BBZ-8H-8、5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28,对照组为Control T组。在成瘤第12天向不同分组小鼠尾静脉注射对应的CAR-T细胞1*10^7Copies/只；Control T组于第812天回输总数相同的T淋巴细胞。每三天测量一次各组小鼠肿瘤体积，实验结果如图17和图18所示，可见进行5HCEA-BBZ-8H-8相较于5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28组小鼠体内有效性显著提高，5HCEA-BBZ-8H-8组对肿瘤也具有明显的消除作用。
第三部分CD19靶点的CAR结构的实验部分
实施例9靶向CD19质粒构建
以SIRPγ及CD47全长的质粒、pL-CAG-2AGFP、pL-CAG-PD1-CD28-2ACherry、pL-CAG-PD1-BB-2Acherry为模板，CD19靶点CAR结构。构建获得载体：SIRPγ-28、5HCD19-BBZ、5HCD19-BBZ-SIRPγ-28。通过测序比对验证后，结构建成功。
实施例10制备慢病毒及感染T淋巴细胞
采用磷酸钙法包装慢病毒，获得实施例1中3个病毒颗粒(SIRPγ-28、5HCD19-BBZ、5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)。
利用梯度离心法进行淋巴细胞分离，离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，获得人PBMC细胞。获得的PBMC细胞经抗CD3、CD28单克隆抗体活化24h后，按一定的感染复数(MOI)感染已活化的PBMC，在病毒感染的第8天利用流式检测CAR-T的阳性率，结果如图19以及下表5所示。
表5流式检测靶向CD19的各实验组CAR-T的阳性率
结构 ％of CD3+T Cells
Control T 0.26
SIRPγ-28 51.25
5HCD19-BBZ 53.15
5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28 54.89
SIRPγ-28+5HCD19-BBZ 18.04
实施例11靶向CD19的体外药效学评价
以Control T为对照组，实验组设置SIRPγ-28组、5HCD19-BBZ组、5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28组，以Nam6-Luc-GFP(CD19阳性)、K562-Luc-GFP(CD19阴性)为靶细胞，通过体外杀伤和体外因子分泌验证体外有效性。结果如图20及下表6所示，采用一个共表达的载体转染免疫细胞获得的产品(5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)与采用两个分别表达的载体共转染免疫细胞获得的产品(SIRPγ-28+5HCD19-BBZ)的体外杀伤显著高于SIRPγ-28组和5HCD19-BBZ组，对阴性细胞无杀伤。
和图21及表7所示,采用一个共表达的载体转染免疫细胞获得的产品(5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)与采用两个分别表达的载体共转染免疫细胞获得的产品(SIRPγ-28+5HCD19-BBZ)的因子分泌显著高于高于SIRPγ-28组和5HCD19-BBZ组。
表6靶向CEA的各实验组细胞杀伤情况
结构 Specific Lysis(％)
Control T 37.2867
SIRPγ-28 28.6995
5HCD19-BBZ 84.3876
5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28 97.5187
SIRPγ-28+5HCD19-BBZ 97.4608
表7靶向CEA的各实验组IFN-γ因子分泌情况
实施例12靶向CD19的体内药效学评价
选用NCG小鼠(雌性，6周龄)，以1×106Cells/只剂量皮下注射(s.c.)Nalm6-Luc-GFP细胞建立体内荷瘤模型，荷瘤后8d以1×107CAR-T Cells/只剂量尾静脉注射(i.v.)给予不同组别(Control T、5HCD19-BBZ、5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)CAR-T。通过活体成像观察肿瘤体内生长情况，体内评价不同CAR-T对淋巴瘤治疗效果。结果如图22和图23所示，相比Control T组和5HCD19-BBZ组，5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28体内抗肿瘤效果明显，能明显清除肿瘤。
第四部分PSCA靶点的CAR结构的实验部分
实施例13靶向PSCA的质粒构建及感染T细胞
(1)质粒构建
慢病毒表达载体、PSCA ScFv-G4H铰链区-CD28跨膜区-CD28-CD137-CD3ξ-P2A-SIRPγ-28(PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28)的CAR结构利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆。
慢病毒表达载体、PSCA ScFv-7H铰链区-CD28跨膜区-CD28-CD137-CD3ξ-P2A-SIRPγ-28(PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28)的CAR结构利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆。
(2)感染T细胞
将获得的质粒感染T细胞，得CAR-T细胞。
实施例14靶向PSCA的IFN-γ因子分泌情况
以Control T为对照组，实验组分别设置PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-G4H-28TM、PSCA-28BBZ-7H-28TM，以RT4-Luc-GFP(PSCA阳性)为靶细胞，通过体外因子分泌验证体外有效性。结果如表8-表13及图24-图29所示。采用一个共表达的载体转染免疫细胞获得的产品PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28与采用两个分别表达的载体共转染免疫细胞获得的产品PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28的IFN-γ因子分泌显著高于对照组和PSCA-28BBZ-G4H-28TM组或PSCA-28BBZ-7H-28TM组，对阴性细胞无杀伤
表8PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况
结构 IFN-γ(pg/ml)
PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28 4060.33
Control T 234.23
表9PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况
结构 IFN-γ(pg/ml)
PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28 4024.67
Control T 234.23
表10PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况
结构 IFN-γ(pg/ml)
PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28 6862.33
Control T 234.23
表11PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况
结构 IFN-γ(pg/ml)
PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28 8550.67
Control T 234.23
表12PSCA-28BBZ-G4H-28TM、PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况
结构 IFN-γ(pg/ml)
PSCA-28BBZ-G4H-28TM 6998.67
PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28 6862.33
Control T 234.23
表13PSCA-28BBZ-7H-28TM、PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28分泌IFN-γ因子情况
结构 IFN-γ(pg/ml)
PSCA-28BBZ-7H-28TM 6660.33
PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28 8550.67
Control T 234.23
实施例14靶向PSCA的细胞杀伤情况
实验组分别设置PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28、PSCA-28BBZ-G4H-28TM、PSCA-28BBZ-7H-28TM，分别以RT4-Luc-GFP(PSCA阳性)、PC-3-Luc-GFP(PSCA阴性)为靶细胞，结果如表14-表19及图30-图35所示。采用一个共表达的载体转染免疫细胞获得的产品PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28与采用两个分别表达的载体共转染免疫细胞获得的产品PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28或PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28的体外杀伤显著高于对照组和PSCA-28BBZ-G4H-28TM组或PSCA-28BBZ-7H-28TM组，对阴性细胞无杀伤。
表14PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况
表15PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况
表16PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况
表17PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28分别在阳性/阴性细胞中细胞杀伤情况
表18PSCA-28BBZ-G4H-28TM、PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28中细胞杀伤情况
表19PSCA-28BBZ-7H-28TM、PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28中细胞杀伤情况
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白结构包含胞外段、跨膜结构和胞内信号区。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜结构来源于人CD28跨膜区或人CD8来源跨膜区；优选地，所述胞内信号区来源于CD28或4-1BB。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜结构氨基酸序列如SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8所示；优选地，所述胞内信号区来源于CD28，序列如SEQ ID NO:9或SEQID NO:38所示。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白的结构为SIRPγ-CD28TM-CD28或SIRPγ-CD8TM-4-1BB。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ胞外段氨基酸序列如SEQID NO:1或其功能性变体所示。
6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能性变体所示。
7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的氨基酸序列为SEQ ID NO:3或其功能性变体所示。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
9.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
10.包含权利要求1-9任一项所述的融合蛋白的表达载体。
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