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CN117683139A - 组成型嵌合细胞因子受体及表达其的免疫细胞及应用 - Google Patents

组成型嵌合细胞因子受体及表达其的免疫细胞及应用 Download PDF

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余洲
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Xinda Cell Pharmaceutical Suzhou Co ltd
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Abstract

本发明涉及组成型嵌合细胞因子受体，其包含胞外结构域和组成型激活的IL‑7R突变体，所述胞外结构域由具有重塑肿瘤微环境能力的效应分子组成，所述组成型激活的IL‑7R突变体包含IL‑7R突变跨膜结构域和IL‑7R胞内结构域。本发明还涉及所述组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽或TCR多肽，经工程化以表达所述组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽或TCR多肽的免疫效应细胞；以及制备所述免疫效应细胞的方法。表达本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽或TCR多肽的免疫效应细胞能够在受试者中用于治疗肿瘤。

Description

组成型嵌合细胞因子受体及表达其的免疫细胞及应用
技术领域
本发明总体上涉及基因工程和细胞免疫学领域，具体地，本发明涉及用于增强免疫细胞扩增及效应功能的组成型嵌合细胞因子受体，其包含胞外结构域和组成型激活的IL-7R突变体，所述胞外结构域由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成，所述组成型激活的IL-7R突变体包含IL-7R突变跨膜域和IL-7R胞内结构域，免疫细胞(例如T细胞)通过表达组成型嵌合细胞因子受体，从而具有不依赖外源细胞因子激活的组成型IL-7R自激活信号以及胞外结构域上的效应分子功效，用于肿瘤免疫治疗。本发明还涉及所述组成型嵌合细胞因子受体和嵌合抗原受体或T细胞受体的组合及其用途。
背景技术
近年来肿瘤免疫治疗领域取得巨大进展，已成为晚期肿瘤临床治疗的基石，其中，以嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)为代表的过继细胞免疫疗法(ACT)由于在治疗复发难治性血液系统肿瘤中表现出的前所未有的临床治疗效果而备受瞩目。CAR-T和T细胞受体(TCR)基因修饰的T细胞(TCR-T)都是基因修饰的细胞治疗产品：通过收集肿瘤患者外周血T细胞并激活，采用病毒或非病毒载体介导的基因修饰，使其携带能够特异识别肿瘤细胞抗原的CAR或者TCR，从而赋予T细胞肿瘤特异性识别及杀伤功能。CAR-T细胞已经在治疗复发难治性血液系统肿瘤中展现出前所未有的临床治疗效果，2017年FDA批准首个CAR-T细胞产品用于临床治疗，截止目前FDA已经批准6个CAR-T细胞产品，用于治疗复发难治性B细胞白血病、淋巴瘤及骨髓瘤等。多个TCR-T细胞治疗产品也处于关键注册临床阶段。此外，还有多种类型的免疫细胞治疗处于临床试验中，包括CAR修饰NK细胞(CAR-NK)、基因修饰肿瘤浸润T细胞(TIL)、基因修饰γδT细胞、iNKT细胞、双阴性T细胞(DNT)以及诱导多能干细胞来源(iPSC)的免疫细胞(iNK、iT)等。
大量研究探索CAR-T等基因修饰免疫细胞在实体瘤中的应用，但截至目前总体临床疗效甚微。一项统计42项实体瘤CAR-T临床试验的荟萃研究发现，在375例接受CAR-T细胞治疗患者中，客观应答率(ORR)仅13.9％，ORR及疗效持久性远低于血液系统肿瘤。免疫细胞治疗实体瘤效果不佳主要有以下原因：肿瘤没有分泌匹配的趋化因子，基因修饰免疫细胞不能有效进入肿瘤组织部位发挥效应；即使这些基因修饰免疫细胞能够浸润至肿瘤组织中，诸多因素使其很快处于功能失活状态，限制其体内扩增及存续，这些因素包括但不限于：由氧化应激、营养缺失、缺氧、酸性pH等构成的“不友好”肿瘤微环境(TME)；肿瘤细胞产生大量免疫抑制性细胞因子；肿瘤中存在大量调节性T细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(MDSC)及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等抑制性免疫细胞；T细胞内源性负反馈调节机制，例如PD-1等负性免疫调节受体表达上调导致功能“耗竭”。实体瘤细胞抗原表达高度异质性，在免疫压力下容易产生抗原缺失突变体，导致免疫逃逸。因此，选择合适的治疗靶点、赋予基因修饰免疫细胞在瘤内持续存续、扩增并能够改造“不友好”的肿瘤抑制性免疫微环境的能力，对于提高实体瘤治疗疗效至关重要。
生理情况下，初始T细胞获得最佳激活需要3种信号，由TCR提供的第一信号、由CD28、41BB等共刺激分子提供的第二信号、以及由细胞因子和其受体结合提供的第三信号，其中所述第三信号是初始T细胞获得最佳增殖、分化为效应细胞并发展形成长效记忆性T细胞所必需。
基因修饰免疫细胞(例如，CAR-T细胞)虽然通过CAR分子能够获得第一和第二信号，但缺失第三信号，从而影响了体内CAR-T的扩增、存续和功能。有报导通过系统性给予外源细胞因子能够促进动物体内CAR-T、TCR-T细胞的体内扩增和功能，但系统性给予细胞因子产生了严重的毒副作用，通过转基因形式使基因修饰细胞自分泌细胞因子也产生类似毒性。因此，目前很多研究积极探索其他策略，包括膜表面表达细胞因子、表达细胞因子转换受体(CSR)或组成型激活的细胞因子受体或其片段。例如，Thomas Shum等(WO2018038945A1)设计了表达T淋巴瘤中天然发现的组成型激活的IL-7R(即IL-7Rα)突变体(C7R)的CAR-T细胞，所述C7R缺失IL-7R天然胞外结构域，但由于IL-7R跨膜区发生了半胱氨酸或脯氨酸突变，形成组成型二聚体，在不依赖胞外结构域与配体结合情况下，激活JAK1激酶，进而激活下游STAT5等转录效应因子，调控下游靶基因表达，最终促进和维持T增殖及存活。C7R修饰的CAR-T细胞相比未修饰的CAR-T细胞，能够在反复杀伤肿瘤细胞同时减少功能耗竭，体内具有更好的增殖、存续及抗肿瘤功能。
现有技术中的C7R基因修饰CAR-T细胞虽然赋予了CAR-T细胞提高的体内外扩增、存续能力，但缺乏主动改造“不友好”的肿瘤抑制性免疫微环境的特性，在面临具有重度免疫抑制性TME特征的实体瘤时，这些CAR-T仍然受制于抑制性TME，阻碍其发挥功能。
发明概述
本发明人通过研究，开发了一组重组多肽，为组成型嵌合细胞因子受体，其包含胞外结构域和组成型激活的IL-7R突变体，所述胞外结构域由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成。本发明的组成型嵌合细胞因子受体赋予了免疫细胞利用组成型激活的IL-7R突变体持续激活STAT5信号，促进和维持免疫细胞的增殖及存活，还赋予了免疫细胞获得了新的胞外效应分子功效，使免疫细胞具备主动塑造“不友好”TME的能力，通过重构TME使“冷”肿瘤变为“热”肿瘤，免疫细胞处于更“友好”的TME中，将更加有利于发挥抗肿瘤效应。进一步地，将本发明的组成型嵌合细胞因子受体和基因修饰免疫细胞(例如，CAR-T细胞)组合使用，通过激发或增强体内内源抗肿瘤效应机制，有望使组成型嵌合细胞因子受体和基因修饰免疫细胞(例如，CAR-T细胞)产生协同抗肿瘤效果，所述基因修饰免疫细胞包括CAR-T细胞、TCR-T、CAR-NK、基因修饰TIL、γδT细胞、iNKT细胞、DNT以及iPSC来源的iT及iNK细胞等。
在第一方面，本发明提供了组成型嵌合细胞因子受体，其包含胞外结构域和组成型激活的IL-7R突变体。所述组成型激活的IL-7R突变体能够持续激活STAT5信号、维持免疫效应细胞(例如，T细胞)非外源细胞因子依赖性存活，所述胞外结构域具有重塑肿瘤微环境及激发机体内源性抗肿瘤免疫应答的效应功能。
在一些实施方案中，本发明首先利用外源细胞因子依赖的BaF3细胞系在体外比较了27种不同的组成型激活的IL-7R突变体(本文中也称为IL7Rm或M7R)，所述M7R由携带不同突变的IL7R跨膜区(IL7R-mutant(TM))(序列表中SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:46序列的加粗部分)和野生型IL7R(IL7R-WT)胞内段(IL7R-wt(ICD)，SEQ ID NO:19)组成。在一些具体的实施方案中，将胞外结构域tCD19和所述27种不同的M7R组合构建获得组成型嵌合细胞因子受体，通过检测细胞表面tCD19阳性表达来鉴定M7R表达，所获得的组成型嵌合细胞因子受体也称为tCD19-M7CR。
所述27种M7R体外维持BaF3细胞非外源细胞因子依赖的存活效应的实验结果表明，转导并稳定表达其中19个M7R序列能够维持BaF3细胞非外源细胞因子依赖的存活，M7R基因能够促进BaF3细胞以非外源细胞因子依赖方式增殖。并且随着培养时间延长，存活的BaF3细胞均是M7R表达阳性细胞，表明只有表达了M7R的BaF3细胞能够在不加入外源细胞因子的情况下存活。采用胞内流式细胞术染色分析IL-7R下游信号分子发现，这19个M7R分子(IL7Rm1.1，IL7Rm1.3，IL7Rm3.1，IL7Rm4-19)激活并维持BaF3细胞内STAT5磷酸化，水平与加入外源细胞因子相当，表明这19个M7R通过组成型激活STAT5信号通路，促进及维持BaF3细胞非外源细胞因子依赖的存续。
在另一些实施方案中，在原代T细胞中转导并稳定表达上述19个含不同M7R分子的tCD19-M7CR，发现表达所述M7R分子激活了T细胞内STAT5信号，相比较未转导的或转导IL7R-WT的T细胞，表达M7R分子的T细胞在体外具有更好的存续能力，特别地，IL7Rm4、IL7Rm5、IL7Rm7、IL7Rm8所示的M7R具有非常显著的促生存效应。在此基础上，本发明设计并构建了以细胞因子、免疫效应分子、抑制性分子拮抗剂、或靶向NK细胞激活性受体的效应分子作为所述组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域，将所述胞外结构域与M7R融合而形成本发明的组成型嵌合细胞因子受体(本文中也称为M7CR)。在一些实施方案中，所述M7CR胞外结构域可以是IL-12(IL-12p40或IL-12p70)、IL15(IL-15或IL-15FP，所述IL-15FP是指IL-15和IL-15Rα(选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))的融合蛋白，包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白)、IL-21、IL-18、IL-9、IL-23、IL-36γ、IFNα2b等细胞因子，当免疫细胞(例如T细胞)表达所述包含细胞因子的M7CR基因时，具有增强的免疫效应功能及抗肿瘤效应；在一些实施方案中，所述M7CR胞外结构域也可以是4-1BB靶向分子部分(例如，4-1BB配体(4-1BBL)、抗4-1BB抗体(α4-1BB))、CD40靶向分子部分(例如，CD40配体(CD40L)、抗CD40抗体(αCD40))、CD83靶向分子部分(例如，抗CD83抗体(αCD83))、FLT3靶向分子部分(例如，FLT3配体(FTL3L)、抗FLT3抗体(αFLT3))、GITR、ICOS、CD2、ICAM-1等免疫效应分子，这些免疫效应分子通过与体内的抗原呈递细胞(APC)例如树突状细胞(DC)或巨噬细胞表面的相关受体或配体相互作用，活化APC，从而激发内源性抗肿瘤免疫应答，进而与免疫细胞(例如T细胞)产生协同抗肿瘤功效；在一些实施方案中，所述M7CR胞外结构域也可以是抗PD-L1抗体、抗CD47分子、抗IL-4分子、抗TGFβ分子、抗PD-1分子、抗CTLA-4分子、抗LAG-3分子、抗TIGIT分子、抗CD73分子等针对抑制性免疫受体或因子的抗体部分，通过拮抗抑制性免疫受体或因子的免疫抑制效应，达到增强抗肿瘤免疫应答目的，进而与免疫细胞(例如T细胞)产生协同抗肿瘤功效；在一些实施方案中，所述M7CR胞外结构域也可以是靶向NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46等NK细胞表面表达的激活性受体的分子部分，例如，抗NKG2C、抗NKG2D、抗NKp30、抗NKp44、抗NKp46等，通过激活内源性NK细胞，取得增强抗肿瘤免疫效应的目的，进而与免疫细胞(例如T细胞)产生协同抗肿瘤功效。
在第二方面，本发明提供了M7CR修饰的CAR或TCR。本发明的新型M7CR“武装”的肿瘤靶向T细胞(例如，表达M7CR的CAR-T细胞)获得了初始T细胞最佳激活所需要的3种信号，从而产生更好的T细胞激活、增殖、生存及免疫效应功能，同时，M7CR分子胞外结构域的效应分子通过激活机体内源T细胞、活化APC、拮抗免疫抑制性受体或激活机体NK等固有免疫细胞等机制主动对“不友好”TME进行重塑，促进内源性抗肿瘤效应机制，最终产生协同抗肿瘤免疫效应。
在一些实施方案中，本发明制备了同时表达CAR和本发明的M7CR(例如，所述M7CR的胞外结构域(ECD)为tCD19、IL-12(p40或p70)、IL15 FP(包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白，其中IL-15Rα选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))、IL-21、4-1BBL、CD40L、抗PD-L1纳米抗体(PD-L1VHH)，M7R采用IL7Rm8)的病毒载体，并且在体外制备了M7CR修饰的直接靶向肿瘤抗原的传统CAR-T细胞(例如靶向claudin18.2的H9.1.2CAR)或M7CR修饰的通过P329G突变抗体介导靶向肿瘤的“模块化”PG CAR-T细胞(例如8B CAR)，并对它们的体内外功能进行了评价。
通过P2A自裂解肽构建了同时表达CAR和M7CR的双顺反子病毒载体，这些病毒转导的T细胞同时表达CAR和本发明所述的M7CR，且CAR和本发明所述的M7CR表达具有相关性。
细胞表型研究显示，M7R修饰的CAR-T细胞CD4/CD8细胞亚群比例未有显著变化，M7CR修饰CAR-T细胞根据胞外结构域(ECD)不同，其对T细胞亚群影响效应不一。例如，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞维持了更高比例的CD4细胞亚群。
细胞表型研究显示，单独M7R(例如tCD19-M7CR，胞外区域为tCD19，用于考察M7R的作用)修饰的CAR-T细胞维持了高比例Tscm/Tcm等记忆性细胞亚群，与作为阳性对照的C7R(tCD19-M7CR(CPT)，M7R序列来自C7R)效应相当；M7CR修饰的CAR-T细胞，根据胞外结构域(ECD)不同，其对T细胞分化效应不一。例如，IL-15-M7CR修饰CAR-T细胞具有更好的记忆表型，而IL-12-M7CR修饰促进了CAR-T细胞分化。
在一些实施方案中，本发明对IL-15-M7CR(所述M7CR胞外ECD结构域为IL15 FP)修饰的靶向claudin18.2的H9.2.1 CAR-T细胞表型进行了更详细研究，结果表明，单独IL-15(IL-15-M7CRin，失活了M7R信号)或M7R(tCD19-M7CR)效应显著促进了Tscm记忆性细胞亚群维持，但IL-15-M7CR具有更强的促Tscm记忆性细胞维持效应，提示膜表面表达IL-15和M7R信号产生协同效应。
在一些实施方案中，本发明通过体外杀伤实验研究了M7CR修饰的传统CAR-T细胞(例如，靶向claudin18.2的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞、H9.2.1-BB-L CAR-T细胞、H9.2.1-28-L CAR-T细胞)或PG CAR-T细胞(例如靶向claudin18.2的HuR968B CAR-T细胞)对抗原表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用，结果表明，单独M7R(例如tCD19-M7CR，胞外区域为tCD19，用于考察M7R的作用)修饰的CAR-T细胞的杀伤能力显著高于未修饰的CAR-T细胞。在M7R基础上融合胞外效应分子形成M7CR，M7CR修饰能够进一步增加CAR-T细胞体外杀伤功能。例如，4-1BBL-M7CR、抗PD-L1VHH-M7CR、IL-12-M7CR、IL-15-M7CR修饰的传统CAR-T细胞的杀伤能力显著高于未修饰或单独M7R修饰的CAR-T细胞。IL-12-M7CR、IL-15-M7CR修饰的PG CAR-T细胞杀伤效能增强，尤其在针对抗原低表达的肿瘤细胞(比如SNU-601low)情况下更显著。说明胞外效应分子与M7R在促进CAR-T细胞的杀伤作用上具有联合效应。
在另一些实施方案中，本发明通过体外反复刺激实验研究了M7CR修饰的PG CAR-T细胞在肿瘤细胞反复刺激情况下的体外增殖能力，结果表明，单独M7R(例如tCD19-M7CR，胞外区域为tCD19，用于考察M7R的作用)修饰PG CAR-T细胞在肿瘤细胞反复刺激情况下具有更好的持续增殖能力。在M7R基础上融合胞外效应分子形成的M7CR，能够进一步增加PGCAR-T细胞体外持续增殖能力，IL-12-M7CR、IL-15-M7CR等M7CR修饰的PG CAR-T细胞具有更强的体外持续增殖能力。进一步地，表型研究发现，在反复肿瘤细胞刺激下，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞具有更多的CD4+T细胞。细胞因子检测结果表明，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞IFN-γ和TNF释放水平显著升高。
在另一些实施方案中，本发明采用表达不同水平Claudin18.2抗原的肿瘤细胞作为靶细胞，对M7R(tCD19-M7CR)、IL-12-M7CR、IL15-M7CR等M7CR修饰的传统CAR-T细胞(例如，靶向claudin18.2的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞、H9.2.1-28-L CAR-T细胞)体外杀伤功能进行研究，结果表明，单独M7R(例如tCD19-M7CR，胞外区域为tCD19，用于考察M7R的作用)修饰的CAR-T细胞体外杀伤功能增强，M7CR修饰(例如IL-12-M7CR、IL15-M7CR修饰)增强效应更显著，具有显著增强CAR-T细胞对不同抗原表达水平的靶细胞的杀伤效应，在自2个供者制备的CAR-T细胞中观察到类似效应。体外反复杀伤实验研究结果表明，M7R、IL-12-M7CR、IL15-M7CR等M7CR修饰的CAR-T细胞维持了更好的体外持续杀伤功能，在自2个供者制备的CAR-T细胞中采用2个不同效靶比观察到类似效应。
在一些实施方案中，本发明通过对M7CR修饰PG CAR-T细胞的小鼠体内抗肿瘤效应进行研究，结果表明，M7CR修饰的CAR-T细胞在体内具有更强的抗肿瘤作用，且M7CR修饰的CAR-T细胞的增殖能力也强于未修饰的CAR-T细胞。
在另一些实施方案中，本发明通过对M7CR修饰传统CAR-T细胞(例如，靶向claudin18.2的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞、H9.2.1-28-L CAR-T细胞)的小鼠体内抗肿瘤效应进行研究，结果表明，M7CR修饰的CAR-T细胞在体内具有更强的抗肿瘤作用，且M7CR修饰的CAR-T细胞的增殖能力也强于未修饰的CAR-T细胞。
在第三方面，本发明提供了编码本发明的M7CR或编码本发明的M7CR修饰的CAR或TCR的核酸分子、包含编码本发明的M7CR或编码本发明的M7CR修饰的CAR或TCR的核酸分子的载体，和包含本发明的组成型嵌合细胞因子受体M7CR或M7CR修饰的CAR多肽、本发明的核酸分子、或本发明的载体的细胞，优选地，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
在第四方面，本发明提供了一种产生细胞、例如免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码本发明的M7CR或编码本发明所述M7CR修饰的CAR或TCR的核酸分子(例如，RNA分子，例如mRNA分子)，或包含编码本发明的M7CR或编码本文所述M7CR修饰的CAR或TCR的核酸分子的载体引入(例如转导)免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。
在第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含选自表达本发明的组成型嵌合细胞因子受体或组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体或组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸分子、本发明的载体、和它们的任意组合；和任选地可药用辅料。
在一些实施方案中，当表达本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽是分子开关调控型CAR多肽时，本发明的药物组合物还包含分子开关，例如，分子开关抗体。
在第六方面，本发明涉及第五方面所述的药物组合物的用途，用于在受试者中治疗肿瘤，包括向受试者施用治疗有效量的第五方面所述的药物组合物。
在第七方面，本发明涉及第五方面所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
在第八方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的第五方面所述的药物组合物。
附图简述
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1显示了本发明的M7CR和/或CAR转导T细胞后，表达本发明的M7CR和/或CAR的T细胞的作用机制，在所述M7CR中，分别以具有重塑肿瘤微环境的效应分子(例如，细胞因子、免疫效应分子或抑制性分子拮抗剂)作为胞外结构域(ECD)与M7R融合。
图2A显示了野生型IL7R受体的结构和工程化的突变IL7R受体的结构。
图2B显示了在构建的病毒表达质粒中，IL7R-tCD19构建体、IL7R-WT构建体、IL7Rm-tCD19构建体的结构示意图。图中，IL7Rm是指由不同突变的IL7R跨膜区(TM区)和IL7R野生型胞内区域(ICD)组成的部分。
图3A显示了27个包含不同突变的M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染BaF3细胞后第4天，用流式细胞术检测BaF3细胞表面tCD19表达的结果。图中，BaF3表示未经慢病毒侵染的BaF3细胞；IL7R-WT表示用包含野生型IL7R基因的慢病毒侵染BaF3细胞；IL7R-tCD19表示用包含tCD19、野生型IL7R跨膜区和胞内区的基因的慢病毒侵染BaF3细胞；IL7Rm-tCD19表示用包含tCD19、不同突变的IL7R跨膜区和IL7R野生型胞内区的基因的慢病毒侵染BaF3细胞。
图3B显示了包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染BaF3细胞后，不加入外源mIL-3培养各慢病毒侵染的BaF3细胞，能够提供持续激活的IL7R信号和促进BaF3细胞生长的不同突变M7R序列的结果图。图中各图示的含义同图3A。
图3C显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染BaF3细胞，从第3天开始不加入外源mIL-3，在第3天和第11天时检测表达CD19+的BaF3细胞百分数的结果，其中表达CD19+的BaF3细胞百分数越高，则存活的BaF3细胞越多。
图3D显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染BaF3细胞后，不加入外源mIL-3培养各慢病毒侵染的BaF3细胞，对存活的BaF3细胞进行细胞计数的结果。图中，“Parental BaF3 with IL3”表示未经病毒侵染的BaF3细胞用含有IL3的培养基培养，“parental BaF3 w/o IL3”表示未经病毒侵染的BaF3细胞用不含有IL3的培养基培养。
图4显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染BaF3细胞后，用抗pSTAT5抗体染色BaF3细胞，检测细胞中STAT5的基础磷酸化水平的结果。图中，ISO表示用抗STAT5的同型对照抗体进行染色，+IL3表示对未经慢病毒侵染的BaF3细胞，加入IL3刺激细胞STAT5激活，作为阳性对照；“without IL3”表示不用IL3刺激未经慢病毒侵染的BaF3细胞。
图5显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染T细胞后48小时，用流式细胞术检测T细胞表面tCD19表达的结果。图中，UNT表示未经慢病毒侵染的T细胞；IL7R-WT表示用包含野生型IL7R基因的慢病毒侵染T细胞；IL7R-tCD19表示用包含tCD19、野生型IL7R跨膜区和胞内区的基因的慢病毒侵染T细胞；IL7Rm-tCD19表示用包含tCD19、不同突变的IL7R跨膜区和IL7R野生型胞内区的基因的慢病毒侵染T细胞。
图6显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染T细胞后，不加入外源IL-2刺激情况下，用抗pSTAT5抗体染色T细胞，检测细胞中STAT5的基础磷酸化水平的结果。图中，UNT表示未经慢病毒侵染的T细胞；IL7Rm-tCD19表示用包含tCD19、不同突变的IL7R跨膜区和IL7R野生型胞内区的基因的慢病毒侵染T细胞。
图7A显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染T细胞后，不加入外源IL-2刺激情况下，随着时间的推移，计数表达tCD19-M7CR的T细胞数的结果。
图7B显示了用包含不同突变M7R序列的tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染T细胞后，不加入外源IL-2刺激情况下，随着时间的推移，表达tCD19-M7CR的T细胞数的变化倍数。
图8显示了M7CR修饰的CAR的结构，其中，M7CR包含胞外结构域ECD和IL7Rm。所述M7CR的N端通过P2A与不同CAR多肽的C端连接，从而构成M7CR修饰的CAR。
图9A显示了用包含不同M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR基因的慢病毒侵染T细胞后第9天时CAR及M7CR的表达水平，图9B显示了CD4和CD8阳性细胞比例。图中，“UNT”表示未经慢病毒侵染的T细胞；“H9.1.2”表示H9.1.2-BB-L CAR-T细胞，其余为tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15/IL-15Rα-M7CR(图中标记为IL-15-M7CR)、IL-12-P70-M7CR(图中标记为IL-12-M7CR)、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR、抗PD-L1VHH-M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞。
图9C显示了用包含不同M7CR修饰的HuR968B CAR基因的慢病毒侵染T细胞后第9天时CAR及M7CR的表达水平，图9D显示了CD4和CD8阳性细胞比例。图中，“UNT”表示未经慢病毒侵染的T细胞；“8B”表示HuR968B CAR-T细胞，其余为tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15/IL-15Rα-M7CR(图中标记为IL-15-M7CR)、IL-12-P70-M7CR(图中标记为IL-12-M7CR)、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR、抗PD-L1VHH-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞。
图9E显示了未修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T样品和M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T样品中总T细胞，CD4+和CD8+T的表型通过流式细胞术检测的结果。图中，“UNT”表示未经慢病毒侵染的T细胞；“H9.1.2”表示H9.1.2-BB-L CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的H9.1.2-BB-LCAR-T细胞(图中标记同图9A)。
图9F显示了未修饰的HuR968B CAR-T样品和M7CR修饰的HuR968B CAR-T样品中总T细胞，CD4+和CD8+T的表型通过流式细胞术检测的结果。图中，“UNT”表示未经慢病毒侵染的T细胞；“8B”表示HuR968B CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞(图中标记同图9C)。
图9G和图9H显示了未修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T样品和M7CR修饰的H9.2.1-BB-LCAR-T样品中总T细胞，CD4+和CD8+T的表型通过流式细胞术检测的结果。图9G显示了来自供者15的PBMC制备的CAR T细胞，图9H显示了来自供者17的PBMC制备的CAR T细胞。其中，H9.2.1-BB-L表示H9.2.1-BB-L CAR’-T细胞(H9.2.1-BB-L CAR’序列如SEQ ID NO:144所示)；H9.2.1-tCD19-M7CR表示tCD19-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR’-T细胞；H9.2.1-IL-15-M7CR表示IL-15/IL15Rα(Sushi)-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR’-T细胞；H9.2.1in-IL15-M7CR表示H9.2.1-IL-15-M7CR细胞中CAR结构功能缺失；H9.2.1-IL15-M7CRin表示H9.2.1-IL-15-M7CR细胞中M7CR胞内结构(M7R)功能缺失；H9.2.1-sIL15表示H9.2.1-BB-L CAR’-T细胞和可溶性IL15的组合，H9.2.1-IL-12-M7CR表示IL-12-p70-M7CR修饰的H9.2.1-BB-LCAR-T细胞(该H9.2.1-BB-L CAR序列如SEQ ID NO:100所示)；H9.2.1-28-IL-15-M7CR表示IL-15/IL15Rα(Sushi)-M7CR修饰的、且共刺激结构域为CD28的H9.2.1-28-L CAR’细胞，8E5表示来自CARsgen公司CT041产品CAR序列。
图9I和图9J分别显示了自供者15和17的PBMC制备的CAR-T细胞中，M7R能够持续提供激活信号，激活下游信号通路。图中，H9.2.1-tCD19-M7CR表示tCD19-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1-IL-12-M7CR表示IL-12-p70-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1in-IL12-M7CR表示H9.2.1-IL-12-M7CR细胞中CAR结构功能缺失；H9.2.1-IL12-M7CRin表示H9.2.1-IL-12-M7CR细胞中M7CR胞内结构(M7R)功能缺失；H9.2.1-sIL12表示H9.2.1-BB-L CAR-T细胞和可溶性IL12的组合。
图10A显示了通过Qufikit检测DANG-G18.2，SNU-601high，SNU-601low细胞表面CLDN18.2的分子数量。峰状图中，深色部分表示ISO，浅色部分表示阳性细胞。
图10B显示了作为靶细胞的DANG18.2细胞、NUGC-4细胞、SNU-620细胞、PANC-1细胞、SNU-601细胞、Hup-T4细胞中CLDN18.2的表达量，图中ISO为同型抗体对照，K562为CLDN18.2阴性对照细胞。
图11A、图11B和图11C显示了分别用未修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞或不同M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞与肿瘤靶细胞DAN-G18.2共孵育，在E:T分别为1:1、1:3、1:10时，各CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。图中，“PC”表示阳性对照(Positive control,用裂解液对靶细胞进行处理，使得所有靶细胞裂解)；“NT”表示未经慢病毒侵染的T细胞；“Tumor cell only”表示DAN-G18.2细胞系；“H9.1.2”表示H9.1.2-BB-L CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞(图中标记同图9A)。
图11D显示了分别用未修饰的HuR968B CAR-T细胞或不同M7CR修饰的HuR968BCAR-T细胞以及含P329G突变A6抗体(2nM)与靶细胞SUN-601high或SUN-601low共孵育，在E:T为1:1时，各CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。图中，“PC”表示阳性对照(Positive control,用裂解液对靶细胞进行处理，使得所有靶细胞裂解)；“NT”表示未经慢病毒侵染的T细胞；“8B”表示未修饰的HuR968B CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞(图中标记同图9C)。
图12A、图12C和图12E显示了分别用未修饰的HuR968B CAR-T细胞或不同M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞以及含P329G突变A6抗体(2nM)与靶细胞SUN-601high共孵育，在E:T为2:1时，使用靶细胞SUN-601high反复刺激多个轮次，计数CAR-T细胞数和CAR-T细胞增殖倍数的结果。图中，“8B”表示未修饰的HuR968B CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞(图中标记含义同图9C)。
图12B、图12D和图12F显示了分别用未修饰的HuR968B CAR-T细胞或不同M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞以及含P329G突变A6抗体(2nM)与靶细胞SUN-601high共孵育，在E:T为2:1时，使用靶细胞SUN-601high反复刺激多个轮次时，HuR968B CAR-T细胞中CAR+细胞的比例和CAR+细胞百分比的变化倍数。图中，“8B”表示未修饰的HuR968B CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞(图中标记含义同图9C)。
图13A显示了对图12A-图12F中经第一轮刺激和第三轮刺激后各组中CD4+和CD8+T细胞数的代表性流式细胞术测定结果。
图13B显示了对图13A各组中CD4+和CD8+T细胞的比例的统计结果。
图13C显示了分别用未修饰的HuR968B CAR-T细胞或不同M7CR修饰的HuR968BCAR-T细胞以及含P329G突变A6抗体(2nM)与靶细胞SUN-601high共孵育，在E:T为2:1时，使用靶细胞SUN-601high反复刺激多个轮次，使用BDTM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine Kit II对培养上清液中的细胞因子进行检测的结果，图中，“8B”表示HuR968B CAR-T细胞，其余为M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞(图中标记含义同图9C)。
图14A-14D显示了在CLDN18.2表达水平不同的靶细胞中，CAR-T细胞的杀伤作用随CLDN18.2的表达水平升高而增强。图中，H9.2.1-tCD19-M7CR表示tCD19-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1-IL-12-M7CR表示IL-12-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1in-IL12-M7CR表示H9.2.1-IL-12-M7CR细胞中CAR结构功能缺失；H9.2.1-IL-12-M7CRin表示H9.2.1-IL-12-M7CR细胞中M7CR胞内结构(M7R)功能缺失；H9.2.1-sIL12表示H9.2.1-BB-L CAR-T细胞和分泌可溶性IL12的组合。
图14E显示了分别用未修饰的H9.2.1 CAR-T细胞或IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞与靶细胞Hup-T4共孵育，在E:T为1:1和1:5时，使用靶细胞Hup-T4反复刺激三轮，各CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。经持续三轮杀伤实验后，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞对靶细胞仍然具有较好的杀伤作用，而未经修饰的H9.2.1 CAR-T细胞或单独M7R修饰的H9.2.1CAR-T细胞在多轮杀伤中，随轮数增加杀伤效果逐渐减弱。图中，H9.2.1表示H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1-tCD19-M7CR表示tCD19-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1-IL-12-M7CR表示IL-12-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞。
图15显示了在腹腔注射表达荧光素酶NUGC-4细胞构建胃癌腹腔转移模型中，通过IVIS成像系统检测小鼠肿瘤负荷变化的情况。
图16显示了表达组成型嵌合细胞因子受体的PG CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。对于荷瘤小鼠，在施用CAR-T细胞和A6抗体后，随时间增加，IL-12-M7CR修饰的PGCAR-T细胞(图中标记为8B-IL12-M7CR CAR-T)和tCD19-M7CR修饰的PG CAR-T细胞(图中标记为8B-M7R CAR-T)在体内具有更好的抗肿瘤作用。
图17显示了表达组成型嵌合细胞因子受体的PG CAR-T细胞在小鼠体内的扩增水平。对于荷瘤小鼠，在施用PG CAR-T细胞和A6抗体后第7天至第28天IL-12-M7CR修饰的PGCAR-T细胞(图中标记为8B-IL12-M7CR CAR-T)和tCD19-M7CR修饰的PG CAR-T细胞(图中标记为8B-M7R CAR-T)具有较高的扩增水平。
图18显示了表达组成型嵌合细胞因子受体的H9.2.1 CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。在施用CAR-T细胞两周后，IL-12-M7CR修饰的CAR T细胞(图中标记为IL12-M7CR-H9.2.1 CAR-T)具有最强的抗肿瘤作用，其次为tCD19-M7CR修饰的CAR-T细胞(图中标记为M7R-H9.2.1-CAR-T)，未修饰的H9.2.1 CAR T细胞在体内抗肿瘤作用最弱。
图19显示了表达组成型嵌合细胞因子受体的传统CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。对于荷瘤小鼠，在施用CAR-T细胞后，随时间增加，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞(图中标记为IL12-M7CR-H9.2.1 CAR-T)和tCD19-M7CR修饰的CAR-T细胞(图中标记为M7R-H9.2.1CAR-T)在体内具有更好的抗肿瘤作用。
图20显示了表达组成型嵌合细胞因子受体的传统CAR-T细胞在小鼠体内的扩增水平。对于荷瘤小鼠，在施用CAR-T细胞后第7天至第28天IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞(图中标记为IL12-M7CR-H9.2.1 CAR-T)和tCD19-M7CR修饰的CAR-T细胞(图中标记为M7R-H9.2.1CAR-T)具有较高的扩增水平。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的结构域时，也旨在涵盖由该具体序列组成的结构域。
“组成型激活的IL-7R突变体”是指在野生型IL-7受体α链(IL7Rα)跨膜区发生突变而产生的突变IL-7R，其能够在不依赖野生型IL7Rα的配体结合的情况下，发生二聚化并激活下游STAT5信号通路。
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。
如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法，借助所述方法，供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置，所述装置分离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环，例如，通过再输血。因此，在“单采样品”的语境中，指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
“免疫效应功能”、“免疫效应应答”或“免疫效应反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。
术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
术语“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物的表达。本发明的嵌合抗原受体能够诱导T细胞激活。用于测量T细胞激活的合适测定法在实施例中描述，并是本领域中已知的。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”是指哺乳动物中细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“Claudins”是一类存在于上皮和内皮紧密连接中的整合素膜蛋白，是紧密连接的重要组成部分，1998年由Shoichiro Tsukita等人发现。该家族有24个成员。人类Claudin 18基因有两个可供选择的1号外显子，因而产生Claudin 18.1(本文中也称为“CLDN18.1”)和Claudin 18.2(本文中也称为“CLDN18.2”)两种蛋白亚型，两者在第1个胞外结构域约50个氨基酸的序列上只有7个氨基酸残基的差异。
Claudin 18.2在癌组织和正常组织的表达上存在显著差异性，这可能源于Claudin 18.2启动子区域CREB结合位点在正常组织中CpG高度甲基化，而在细胞癌变过程中CpG甲基化水平降低，进而CREB参与激活Claudin18.2的转录。
“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。
术语“刺激”指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其相应配体的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，例如但不限于借助TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可以介导某些分子改变的表达，如下调TGF-β和/或细胞骨架结构的再组织等。
术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的T细胞表达的分子，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。
术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物，并且“CD3ζ刺激信号结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD3ζ刺激信号结构域”是在SEQID NO:12中提供的序列或其变体。
术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是CD28、4-1BB(即CD137)。共刺激信号结构域是指共刺激分子的胞内部分。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激信号结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:11提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“信号传导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生物化学关系。
在谈及组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域时，所述胞外结构域可以是细胞因子，且所述“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL15，IL-21、IL-18、IL-9、IL-23、IL-36γ；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括干扰素。在一些实施方案中，作为本发明的组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域的“细胞因子”选自任一IL-12(例如，IL-12p40或IL-12p70)、IL15(例如IL-15或IL-15FP，所述IL-15FP是指IL-15和IL-15Rα(选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))的融合蛋白，包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白))、IL-21、IL-18、IL-9、IL-23、IL-36γ和IFNα2b。
在谈及组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域时，所述胞外结构域可以是免疫效应分子，且所述“免疫效应分子”可以选自：(i)增强抗原呈递(例如，肿瘤抗原呈递)的分子；(ii)增强效应细胞反应的分子(例如，活化和/或动员B细胞和/或T细胞)。所述“免疫效应分子”例如是以下分子或其激动剂：GITR、OX40、ICOS、SLAM(例如，SLAMF7)、HVEM、LIGHT、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)、CD30、CD40、BAFFR、CD7、CD160、B7-H3或CD83。在一些实施方案中，作为本发明的组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域的“免疫效应分子”选自任一4-1BB靶向分子部分(例如，4-1BB配体、抗4-1BB抗体)、CD40靶向分子部分(例如，CD40配体、抗CD40抗体)、CD83靶向分子部分(例如，抗CD83抗体)、FLT3配体、GITR、ICOS、CD2和ICAM1。
在谈及组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域时，所述胞外结构域可以是抑制性分子拮抗剂，且所述“抑制性分子拮抗剂”是减少肿瘤免疫抑制的药剂。所述抑制性分子包括但不限于PD-1、PD-L1、CD47、TIM-3、IL-4、TGFβ、LAG-3、VISTA、B7-H4、CTLA-4、CD73或TIGIT。在一些实施方案中，作为本发明的组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域的“抑制性分子拮抗剂”选自任一抗PD-L1分子、抗CD47分子、抗IL-4分子、抗TGFβ分子、抗PD-1分子、抗CTLA-4分子、抗LAG-3分子、抗TIGIT分子和抗CD73分子。
在谈及组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域时，所述胞外结构域可以是靶向NK细胞激活性受体的效应分子，且所述“靶向NK细胞激活性受体的效应分子”是与NK细胞激活性受体结合后，能够激活NK细胞的一类分子。所述NK细胞激活性受体包括但不限于NK细胞上的NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46。在一些实施方案中，作为本发明的组成型嵌合细胞因子受体的胞外结构域的“靶向NK细胞激活性受体的效应分子”选自靶向NK细胞激活性受体NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46的分子，例如，抗NKG2C、抗NKG2D、抗NKp30、抗NKp44、抗NKp46，通过激活内源性NK细胞，获得增强的抗肿瘤免疫效应。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。
“抗体片段”或“抗原结合片段”在本文中可互换地使用，指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区任选地借助柔性短多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非另外指出，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作CDR H1、CDR H2和CDR H3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作CDR L1、CDR L2和CDR L3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal ofMolecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(Universityof Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。在本发明中，当提及抗体可变区和具体CDR序列(包括重链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统的编号位置。
尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。术语“功能变体”表示与由本发明核酸序列编码的多肽具有基本或显著序列同一性或相似性的多肽，所述功能变体保留本发明核酸序列编码的多肽的生物学活性。功能变体可以例如包含在由本发明核酸序列编码的多肽的氨基酸序列中具有至少一个保守的氨基酸置换。
术语“保守的序列修饰”、“保守的序列变化”可互换地使用，指未显著影响或改变含有氨基酸序列的多肽的生物学活性的氨基酸修饰或变化。这类种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的多肽引入修饰。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明多肽内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的多肽的生物学活性。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence Activated CellSorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACS StarPlus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。
术语“可药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、缓冲剂或稳定剂等。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量而变动。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
II.本发明的组成型嵌合细胞因子受体
本发明涉及能够持续激活STAT5信号、维持免疫效应细胞(例如，T细胞)外源细胞因子非依赖性存活、且具有重塑肿瘤微环境的效应分子的组成型嵌合细胞因子受体。具体地，本发明的组成型嵌合细胞因子受体包含:
(i)胞外结构域，所述胞外结构域由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成；和
(ii)组成型激活的IL-7R突变体，由携带不同突变的IL7R跨膜区(IL7R-mutant(TM))和IL7Rα胞内段组成。
在一些实施方案中，本发明的组成型嵌合细胞因子受体的所述(i)胞外结构域选自细胞因子、免疫效应分子、抑制性分子拮抗剂或靶向NK细胞激活性受体的效应分子。
当本发明的组成型嵌合细胞因子受体的所述(i)胞外结构域是细胞因子时，所述细胞因子可以是IL-12(IL-12-P40或IL-12-P70)、IL15(IL-15或IL-15FP，所述IL-15FP是指IL-15和IL-15Rα(选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))的融合蛋白，包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白)、IL-21、IL-18、IL-9、IL-23、IL-36γ、IFNα2b等细胞因子，采用这些细胞因子基因修饰的免疫细胞具有增强的免疫效应功能及抗肿瘤效应。
当本发明的组成型嵌合细胞因子受体的所述(i)胞外结构域是免疫效应分子时，所述免疫效应分子可以是4-1BB靶向分子部分(例如，4-1BB配体(4-1BBL)、抗4-1BB抗体(α4-1BB))、CD40靶向分子部分(例如，CD40配体(CD40L)、抗CD40抗体(αCD40))、CD83靶向分子部分(例如，抗CD83抗体(αCD83))、FLT3配体(FTL3L)、GITR、ICOS、CD2、ICAM1等，这些免疫效应分子通过与体内专职的抗原呈递细胞(APC)例如树突状细胞(DC)表面的相关受体或配体相互作用，活化APC，从而激发内源性抗肿瘤免疫应答。
当本发明的组成型嵌合细胞因子受体的所述(i)胞外结构域是抑制性分子拮抗剂时，所述抑制性分子拮抗剂可以是抗PD-L1分子、抗CD47分子、抗IL-4分子、抗TGFβ分子、抗PD-1分子、抗CTLA-4分子、抗LAG-3分子、抗TIGIT分子、抗CD73分子等针对抑制性免疫受体或因子的抗体部分，例如，抗PD-L1VHH，通过拮抗抑制性免疫受体或因子的免疫抑制效应，达到增强抗肿瘤免疫应答目的。
在一些实施方案中，本发明的组成型嵌合细胞因子受体的所述(i)胞外结构域选自靶向NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46等NK细胞表面表达的激活性受体的分子部分，例如，抗NKG2C、抗NKG2D、抗NKp30、抗NKp44、抗NKp46等抗体部分，通过激活内源性NK细胞，取得增强抗肿瘤免疫效应的目的。
在一些实施方案中，本发明的组成型嵌合细胞因子受体的所述(ii)组成型激活的IL-7R突变体包含任一选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，优选地，所述组成型激活的IL-7R突变体包含任一选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，最优选地，所述组成型激活的IL-7R突变体包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
本发明的组成型嵌合细胞因子受体是一种组成型二聚体，能够不依赖IL-7R与其配体的结合且不依赖于与共同γ信号链(γc)组合而激活IL-7R的胞内信号传导，活化JAK1激酶，进而磷酸化下游STAT5等转录效应因子，调控下游靶基因表达，最终促进和维持T增殖及存活。
本发明的组成型嵌合细胞因子受体在包含所述(ii)组成型激活的IL-7R突变体基础上，通过包含所述(i)胞外结构域作为效应分子来重塑肿瘤微环境。
III.本发明的组成型嵌合细胞因子受体与CAR多肽的共表达
本发明的组成型嵌合细胞因子受体与嵌合抗原受体(CAR)多肽共表达于T细胞时，所述组成型嵌合细胞因子受体由于包含胞外结构域和组成型激活的IL-7R突变体，其通过所述组成型激活的IL-7R突变体持续激活STAT5信号，促进和维持免疫细胞的增殖及存活，并通过所述胞外结构域赋予了免疫细胞获得了新的胞外效应分子功效，使其修饰的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)具备主动塑造“不友好”肿瘤微环境(TME)的能力，通过重构TME使“冷”肿瘤变为“热”肿瘤，其修饰的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)处于更“友好”的TME中，将更加有利于发挥抗肿瘤效应。
在一些实施方案中，所述CAR多肽是传统CAR多肽，其直接靶向一种或多种癌相关抗原。例如，所述癌相关抗原(也称为“肿瘤抗原”)选自以下一种或多种：CD19；CD20；CD22；CD24；CD30；CD123；CD171；CD33表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6(CLDN6)；CLDN18.2；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH葡糖苷神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；FOS相关抗原1；肿瘤蛋白质p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；顶体蛋白酶原结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；豆荚蛋白酶；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hosp 70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；与免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施方案中，由传统CAR多肽直接靶向的癌相关抗原是CLDN18.2，所述传统CAR多肽从N端至C端包含信号肽、癌相关抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和主信号传导结构域。
在一些实施方案中，所编码的CAR多肽的癌相关抗原结合结构域包含针对癌相关抗原的抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域，或骆驼科VHH结构域。
在一些实施方案中，CAR多肽的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β、或ζ的跨膜结构域、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和/或NKG2C的跨膜结构域。
在某些实施方案中，CAR多肽的跨膜结构域包含CD8跨膜结构域的氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:8的一个、两个或三个氨基酸修饰的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:8的序列。
在某些实施方案中，癌相关抗原结合结构域由铰链区连接到所述跨膜结构域。在一个实施方案中，铰链区包含CD8铰链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:7，或与SEQ ID NO:7具有一个、两个或三个氨基酸修饰的序列。
在其他实施方案中，CAR多肽包含胞内信号传导结构域，例如主信号传导结构域(primary signaling domain)和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含主信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含主信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
在某些实施方案中，主信号传导结构域包含选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR多肽的主信号传导结构域包含CD3ζ的功能信号传导结构域。CD3ζ主信号传导结构域可包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的1、2或3个氨基酸修饰。在一些实施方案中，主信号传导结构域包含SEQ ID NO:12的序列。
在一些实施方案中，CAR多肽的胞内信号传导结构域包含主信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含选自如下一种或多种的蛋白质的功能信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46或NKG2D。
在一些实施方案中，CAR多肽的共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的1、2、或3个氨基酸修饰。在一些实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:11的序列。
在一些实施方案中，CAR还包含信号肽序列。在一个实施方案中，信号肽序列包含SEQ ID NO:1的序列。
在某些实施方案中，CAR多肽的癌相关抗原结合结构域对癌相关抗原具有10-4M到10-8M的结合亲和力KD。
在一些实施方案中，传统CAR多肽包含传统CLDN18.2 CAR多肽。
在一个实施方案中，传统CLDN18.2 CAR多肽包含：
(1)特异性结合CLDN18.2分子的H9.1.2抗体scFv序列，其包含重链可变区和轻链可变区，
其中：
所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:106)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:107)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列LNRGQSLDY(SEQ ID NO:108)所示的CDRH3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNAGNQRNYLT(SEQ ID NO:109)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:110)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:111)所示的CDR L3、或所述CDRL3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
例如，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ IDNO:13的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(2)铰链区，其选自CD8铰链区(SEQ ID NO:7)，或其具有至少80％的序列同一性的铰链区。
(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:8所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:12所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体
任选地，所述传统CLDN18.2 CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ IDNO:1所示的信号肽序列，
在一个具体实施方案中，传统CLDN18.2 CAR多肽包含，例如本文所述的H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，传统CLDN18.2 CAR多肽包含：
(1)特异性结合CLDN18.2分子的H9.2.1抗体scFv序列，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:112)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:113)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列LNRGNALDY(SEQ ID NO:114)所示的CDRH3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFQSGNQRNYLT(SEQ ID NO:115)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:116)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:117)所示的CDR L3、或所述CDRL3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
例如，所述重链可变区包含SEQ ID NO:99的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ IDNO:98的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(2)铰链区，其选自CD8铰链区(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：146)，或其具有至少80％的序列同一性的铰链区。
(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:147所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；或其选自CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:143所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:12所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体
任选地，所述传统CLDN18.2 CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ IDNO:1所示的信号肽序列，
在一个具体实施方案中，传统CLDN18.2 CAR多肽包含例如本文所述的H9.2.1-BB-L CAR(SEQ ID NO:100)。
在一个具体实施方案中，传统CLDN18.2 CAR多肽包含例如本文所述的H9.2.1-BB-L CAR’(SEQ ID NO:144)。
在一个具体实施方案中，传统CLDN18.2 CAR多肽包含例如本文所述的H9.2.1-28-L CAR(SEQ ID NO:142)。
在一些实施方案中，所述CAR多肽是分子开关调控型CAR多肽，其不直接靶向一种或多种癌相关抗原，而是通过“分子开关”来靶向一种或多种癌相关抗原。例如，通过将Pro329Gly(抗体Fc段根据EU编号的第329位脯氨酸突变为甘氨酸，简写为P329G)突变抗体作为“分子开关”，构建的这样的CAR分子，其能够特异结合包含P329G突变Fc结构域的抗体而不结合不包含P329G突变Fc结构域的抗体，由此，通过将表达所述CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)与作为“分子开关”的靶向癌相关抗原的P329G突变抗体组合，用于治疗肿瘤。
在一个实施方案中，所述分子开关调控型CLDN18.2 CAR多肽包含：
(1)人源化抗P329G突变scFv序列，其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域，但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列：
(i)重链可变区，其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:118)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDRH1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:119)所示的CDR H2、或所述CDRH2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:120)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(ii)轻链可变区，其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:121)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:122)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:123)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代
例如，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:10的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
(2)铰链区，其选自CD8铰链区(SEQ ID NO:7)，或其具有至少80％的序列同一性的铰链区；
(3)跨膜区(TM)，其选自CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:8所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(4)共刺激信号结构域(CSD)，其选自4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
(5)刺激信号结构域(SSD)，为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，SEQ ID NO:12所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体。
任选地，所述分子开关调控型CLDN18.2 CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列，例如，SEQ ID NO:1所示的信号肽序列。
在一个具体实施方案中，分子开关调控型CLDN18.2 CAR多肽包含例如本文所述的HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)
在一个实施方案中，所述作为“分子开关”的靶向癌相关抗原的P329G突变抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYVMS(SEQ ID NO:124)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列TISHSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:125)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列DAPYYDILTGYRY(SEQ ID NO:126)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:127)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；氨基酸序列KASSLES(SEQ ID NO:128)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和氨基酸序列QQYNSYSYT(SEQ ID NO:129)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
例如，所述重链可变区包含SEQ ID NO:130的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ IDNO:131的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，表达分子开关调控型CAR多肽(例如，SEQ ID NO:15所示的HuR968B CAR)的CAR-T细胞与P329G突变的抗CLDN18.2抗体(例如，P329G突变的HB37A6 PGAb，本文中又称A6抗体，)(参见中国申请号202111416497.1)的组合显示出持续杀伤肿瘤细胞的能力，并且维持了CAR分子的特异性，表达分子开关调控型CAR多肽的T细胞在与肿瘤细胞的共培养实验中，只有在P329G突变抗体存在情况下所述表达分子开关调控型CAR多肽的T细胞才能被激活、增殖、分泌效应细胞因子并对表达或过表达CLDN 18.2的肿瘤细胞产生杀伤效应。
为了在免疫效应细胞上共表达本发明的组成型嵌合细胞因子受体和嵌合抗原受体(CAR)多肽，可以将所述组成型嵌合细胞因子受体构建在一个构建体上，将所述CAR多肽构建在另一个构建体上，将这两个构建体共同导入免疫效应细胞而表达。
备选地，在一个核酸构建体上构建编码组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸，所述组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽包含位于CAR多肽的N端或者C端的本发明组成型嵌合细胞因子受体，且所述组成型嵌合细胞因子受体与CAR多肽之间具有自切割肽，使得核酸构建体产生包含通过自切割肽连接的本发明的组成型嵌合细胞因子受体和CAR多肽，不需要任何外部切割活性，将核酸构建体产生的多肽切割成单独的组成型嵌合细胞因子受体和单独的CAR多肽。
所述“自切割肽”是指这样的肽，该肽发挥功能使得当产生从N端至C端包含第一多肽、自切割肽和第二多肽的融合多肽时，该融合多肽被切割成独特的且离散的第一多肽和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。自切割肽可以是来自口蹄病毒或心脏病毒的2A自切割肽。
在一些实施方案中，所述自切割肽为SEQ ID NO:3所示的P2A或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。
在一些实施方案中，本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽从N端至C端含CAR多肽、自切割肽和组成型嵌合细胞因子受体。
IV.编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体或者编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸分子、载体和表达细胞
本发明提供了编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体或者编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子作为DNA构建体提供。
IV.1.编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体的DNA构建体
在一些实施方案中，编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体的DNA构建体从N端至C端包含编码信号肽的多核苷酸、编码由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成的胞外结构域的多核苷酸、编码IL-7R突变跨膜结构域和IL-7R胞内结构域的多核苷酸。任选地，在编码所述胞外结构域的多核苷酸与编码IL-7R突变跨膜结构域和IL-7R胞内结构域的多核苷酸之间存在编码铰链区的多核苷酸，所述铰链区例如SEQ ID NO:6所示的Flag Tag或其功能变体。
在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:2的序列或其功能变体。
在一些实施方案中，编码IL-7R突变跨膜结构域和IL-7R胞内结构域的多核苷酸包含编码任一选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的多核苷酸，优选地，包含编码任一选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的多核苷酸，最优选地，包含编码SEQID NO:34所示的氨基酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成的胞外结构域是细胞因子，所述细胞因子可以是例如IL-12(IL-12-P40或IL-12-P70)、IL15(IL-15或IL-15FP，所述IL-15FP是指IL-15和IL-15Rα(选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))的融合蛋白，包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白)、IL-21、IL-18、IL-9、IL-23、IL-36γ、IFNα2b等细胞因子，免疫细胞(例如T细胞)表达所述包含细胞因子的M7CR基因，具有增强的免疫效应功能及抗肿瘤效应。在一些实施方案中，所述细胞因子是SEQ ID NO：47所示的IL-15或其功能变体；SEQ ID NO：48所示的IL-15FP(IL15/IL15Rα(Sushi)融合蛋白)或其功能变体；SEQ ID NO：140所示的IL-15FP(IL15/IL15Rα融合蛋白)或其功能变体；SEQ ID NO：141所示的IL-15FP(IL15 Rα(Sushi)/IL15融合蛋白)或其功能变体；SEQ ID NO：49所示的IL-12-P70或其功能变体；SEQ ID NO：50所示的IL-12-p40或其功能变体；SEQ ID NO：51所示的IL-21或其功能变体；SEQ ID NO：52所示的IL-9或其功能变体；SEQ ID NO：53所示的IL-18或其功能变体；SEQ ID NO：54所示的IL-23或其功能变体；SEQ ID NO：55所示的IL-36γ或其功能变体；SEQ ID NO：56所示的IFNα2b或其功能变体。
在一些实施方案中，由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成的胞外结构域是免疫效应分子，所述免疫效应分子可以是例如4-1BB靶向分子部分(例如，4-1BB配体(4-1BBL)、抗4-1BB抗体(α4-1BB))、CD40靶向分子部分(例如，CD40配体(CD40L)、抗CD40抗体(αCD40))、CD83靶向分子部分(例如，抗CD83抗体(αCD83))、FLT3配体(FTL3L)、GITR、ICOS、CD2、ICAM1等，这些免疫效应分子通过与体内专职的抗原呈递细胞(APC)例如树突状细胞(DC)表面的相关受体或配体相互作用，活化APC，从而激发内源性抗肿瘤免疫应答，进而与免疫细胞(例如T细胞)产生协同抗肿瘤功效。在一些实施方案中，所述免疫效应分子是SEQID NO：57所示的4-1BBL或其功能变体；SEQ ID NO：58所示的CD40L或其功能变体；SEQ IDNO：59所示的FLT3L或其功能变体；SEQ ID NO：60所示的ICOS或其功能变体；SEQ ID NO：61所示的GITR或其功能变体；SEQ ID NO：62所示的ICAM-1或其功能变体；SEQ ID NO：63所示的CD2或其功能变体；SEQ ID NO：64所示的抗4-1BB或其功能变体；SEQ ID NO：65所示的抗CD40或其功能变体；SEQ ID NO：66所示的抗CD83或其功能变体。
在一些实施方案中，由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成的胞外结构域是抑制性分子拮抗剂，所述抑制性分子拮抗剂可以是例如抗PD-L1分子、抗CD47分子、抗IL-4分子、抗TGFβ分子、抗PD-1分子、抗CTLA-4分子、抗LAG-3分子、抗TIGIT分子、抗CD73分子等针对抑制性免疫受体或因子的抗体部分，通过拮抗抑制性免疫受体或因子的免疫抑制效应，达到增强抗肿瘤免疫应答目的，进而与免疫细胞(例如T细胞)产生协同抗肿瘤功效。在一些实施方案中，所述抑制性分子拮抗剂是SEQ ID NO：67所示的抗TGFβ分子或其功能变体；SEQ IDNO：68所示的抗PD-L1VHH或其功能变体；SEQ ID NO：69所示的抗CD47分子或其功能变体；SEQID NO：70所示的抗IL-4分子或其功能变体；SEQ ID NO：71所示的抗PD-1分子或其功能变体；SEQ ID NO：72所示的抗CTLA-4分子或其功能变体；SEQ ID NO：73所示的抗LAG-3分子或其功能变体；SEQ ID NO：74所示的抗TIGIT分子或其功能变体；SEQ ID NO：75所示的抗CD73分子或其功能变体。
在一些实施方案中，由具有重塑肿瘤微环境的效应分子组成的胞外结构域是靶向NK细胞激活性受体的效应分子，所述靶向NK细胞激活性受体的效应分子可以是靶向NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46等NK细胞表面表达的激活性受体的分子部分，例如，抗NKG2C、抗NKG2D、抗NKp30、抗NKp44、抗NKp46等抗体部分，通过激活内源性NK细胞，取得增强抗肿瘤免疫效应的目的，进而与免疫细胞(例如T细胞)产生协同抗肿瘤功效。在一些实施方案中，所述NK细胞激活分子是SEQ ID NO：76所示的抗NKG2D或其功能变体；SEQ ID NO：77所示的抗NKG2C或其功能变体；SEQ ID NO：78所示的抗NKp30或其功能变体；SEQ ID NO：79所示的抗NKp46或其功能变体。
IV.2.编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的DNA构建体
在一些实施方案中，编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的DNA构建体从N端至C端包含编码组成型嵌合细胞因子受体的多核苷酸、编码自切割肽的多核苷酸和编码CAR多肽的的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的DNA构建体从N端至C端包含编码CAR多肽的的多核苷酸、编码自切割肽的多核苷酸和编码组成型嵌合细胞因子受体的多核苷酸。
所述编码组成型嵌合细胞因子受体的多核苷酸如上文所述。
所述编码自切割肽的多核苷酸是例如编码SEQ ID NO:3所示的P2A或其具有1-5个氨基酸修饰的变体的多核苷酸。
所述编码CAR多肽的的多核苷酸可以是编码现有技术中已知的任一CAR多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述CAR多肽是传统CAR多肽，其直接靶向一种或多种上文所述的癌相关抗原。在一些实施方案中，所述CAR多肽是直接靶向CLDN18.2的传统CAR多肽，其从N端至C端包含信号肽、癌相关抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和主信号传导结构域。
在一个具体实施方案中，所述传统CAR多肽从N端至C端包含：SEQ ID NO:1所示的CD8信号肽或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:13所示的VL-(G4S)n肽接头-SEQID NO:14所示的VH，其中“n”是1至10的整数，例如2至4的整数，例如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5所示的序列；SEQ ID NO:7所示的CD8铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ IDNO:8所示的跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:11所示的共刺激信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:12所示的主信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。在具体实施方案中，所述传统CAR多肽是具有SEQ IDNO:16所示氨基酸序列的H9.1.2-BB-L CAR。
在一个具体实施方案中，所述传统CAR多肽从N端至C端包含：SEQ ID NO:1所示的CD8信号肽或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:98所示的VL-(G4S)n肽接头-SEQID NO:99所示的VH，其中“n”是1至10的整数，例如2至4的整数，例如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5所示的序列；SEQ ID NO:7所示的CD8铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ IDNO:8所示的跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:11所示的共刺激信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:12所示的主信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。在具体实施方案中，所述传统CAR多肽是具有SEQ IDNO:100所示氨基酸序列的H9.2.1-BB-L CAR。
在一个具体实施方案中，所述传统CAR多肽从N端至C端包含：SEQ ID NO:1所示的CD8信号肽或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:98所示的VL-接头-SEQ ID NO:99所示的VH，例如，所述接头为SEQ ID NO:145所示的序列；SEQ ID NO:147所示的CD8铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:148所示的跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:11所示的共刺激信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:12所示的主信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。在具体实施方案中，所述传统CAR多肽是具有SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的H9.2.1-BB-L CAR’。
在一个具体实施方案中，所述传统CAR多肽从N端至C端包含：SEQ ID NO:1所示的CD8信号肽或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:98所示的VL-接头-SEQ ID NO:99所示的VH，例如，所述接头为SEQ ID NO:145所示的序列；SEQ ID NO:147所示的CD8铰链区或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:148所示的跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:143所示的共刺激信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:12所示的主信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。在具体实施方案中，所述传统CAR多肽是具有SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的H9.2.1-28-L CAR。
在一些实施方案中，所述CAR多肽是分子开关调控型CAR多肽。在一些实施方案中，所述CAR多肽是通过与作为分子开关的P329G突变(所述P329G突变也简称为“PG”)抗癌相关抗原的抗体组合来靶向癌相关抗原，其从N端至C端包含信号肽、抗PG抗体scFv序列、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和主信号传导结构域。在具体实施方案中，所述分子开关调控型CAR多肽从N端至C端包含：SEQ ID NO:1所示的CD8信号肽或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:9所示的抗PG抗体VH-(G4S)n肽接头-SEQ ID NO:10所示的抗PG抗体VL，其中“n”是1至10的整数，例如2至4的整数，例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的序列；GGGGS铰链；SEQ ID NO:8所示的跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:11所示的共刺激信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；SEQ ID NO:12所示的主信号传导结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体。在具体实施方案中，所述分子开关调控型CAR多肽是具有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的HuR968B CAR。
在一些实施方案中，编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的DNA构建体包含编码任一SEQ ID NO:80-SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQID NO:133、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138的氨基酸序列的多核苷酸和其功能变体。
本发明还提供了插入有本发明DNA构建体的载体。通过将编码本发明DNA构建体的核酸有效连接至启动子插入表达载体中，实现DNA构建体上的多核苷酸所编码多肽的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体的基因或者编码本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。
能够在哺乳动物T细胞中表达本发明的转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动了克隆至慢病毒载体中的转基因的表达。参见，例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。
在一些实施方案中，本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞(例如哺乳动物T细胞或哺乳动物NK细胞)中表达本发明的DNA构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。
从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如FicollTM分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。
可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如M-450CD3/CD28 T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一些实施方案中，该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。
可以用抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集，其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如经工程化，从而它在其表面上不表达任何功能性TCR；经工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如，经工程化，从而它不表达或显示出减少表达的TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)；或经工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达实现HLA的下调。
在一些实施方案中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA，例如，HLA I类和/或HLA II类。
对经体外增殖后获得的共表达CAR和本发明的组成型嵌合细胞因子受体的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。
V.本发明的药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含选自表达本发明的组成型嵌合细胞因子受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码所述组成型嵌合细胞因子受体的核酸分子、包含编码所述组成型嵌合细胞因子受体的核酸分子的载体、和它们的任意组合；和任选地可药用辅料。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含选自表达本发明的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码所述组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸分子、包含编码所述组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸分子的载体、和它们的任意组合；和任选地可药用辅料。进一步地，当所述CAR多肽是分子开关调控型CAR多肽时，所述的药物组合物还包含分子开关，例如抗体分子开关。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的。
本发明的药物组合物可根据常规方法制剂化(例如Remington’s PharmaceuticalScience,最新版,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)。可药用辅料可以例示例如表面活性剂、赋形剂、着色料、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等。进一步地，也可合适地使用其他常用的载剂，例如，轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、白砂糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等作为载剂，但不限于此。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗癌症，例如表达或过表达CLDN18.2的癌症。
VI.本发明的药物组合物的用途和使用本发明的药物组合物的治疗方法
本发明提供了前述本发明的药物组合物，其用于在受试者中治疗肿瘤(例如癌症)。本发明还涉及治疗受试者的肿瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。在一些实施方案中，本文所述的肿瘤，例如癌症，包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于在受试者中治疗表达或过表达CLDN18.2的癌症，并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。本发明提供了在受试者中治疗癌症(例如，表达或过表达CLDN 18.2的癌症)的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的药物组合物。
本发明提供了前述本发明的药物组合物在制备用于治疗癌症(例如，表达或过表达CLDN 18.2的癌症)的药物中的用途。
本发明的药物组合物也可以施用于已经用一种或多种先前疗法治疗癌症但随后复发或转移的个体。
本发明的药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体重、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、和待并行施用的其他药物。
在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用本发明的药物组合物导致肿瘤的完全消失。在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤细胞或肿瘤大小减少至少85％或更多。可以通过本领域已知的任何方法测量肿瘤的减少，例如X-线、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、细胞学、组织学或分子遗传分析。
本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例
实施例1、M7R的合成、筛选及功能研究
实施例1.1.构建用于表达M7R基因的慢病毒载体
如图2A所示，IL-7与其野生型受体IL-7受体α链(IL7Rα)结合后诱导后者与共同γ信号链异二聚化，激活下游JAK/STAT信号。但当野生型IL7Rα跨膜区发生突变而产生突变的IL7R，所述突变可能诱导所产生的突变IL7R自二聚化，从而能够在不依赖IL-7结合情况下，该自二聚化的突变IL7R组成型激活下游STAT5信号通路。
如图2B所示，构建病毒表达质粒，用于表达含不同IL7R突变(IL7Rm或M7R)和tCD19组成的嵌合受体tCD19-M7CR(在本说明书中也称为IL7Rm-tCD19)，这些tCD19-M7CR由相同的截短CD19(tCD19，SEQ ID NO:17)构成的胞外结构域(ECD)和不同的IL7R突变体(文中也称IL7Rm或M7R)组成，所述IL7Rm(SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:46)由携带不同突变的IL7R跨膜区(IL7R-mutant(TM))(参见序列的加粗部分)和野生型IL7R胞内段(IL7R-wt(ICD)，SEQID NO:19)组成。
所述27个IL7Rm分别命名为IL7Rm1.1、IL7Rm1.2、IL7Rm1.3、IL7Rm1.4、IL7Rm2.1、IL7Rm2.2、IL7Rm2.3、IL7Rm2.4、IL7Rm3.1、IL7Rm3.2、IL7Rm4、IL7Rm5、IL7Rm6、IL7Rm7、IL7Rm8、IL7Rm9、IL7Rm10、IL7Rm11、IL7Rm12、IL7Rm13、IL7Rm14、IL7Rm15、IL7Rm16、IL7Rm17、IL7Rm18、IL7Rm19、IL7Rm20(参见序列表中的SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:46)，其相对应的tCD19-M7CR则分别命名为IL7Rm1.1-tCD19、IL7Rm1.2-tCD19、IL7Rm1.3-tCD19、IL7Rm1.4-tCD19、IL7Rm2.1-tCD19、IL7Rm2.2-tCD19、IL7Rm2.3-tCD19、IL7Rm2.4-tCD19、IL7Rm3.1-tCD19、IL7Rm3.2-tCD19、IL7Rm4-tCD19、IL7Rm5-tCD19、IL7Rm6-tCD19、IL7Rm7-tCD19、IL7Rm8-tCD19、IL7Rm9-tCD19、IL7Rm10-tCD19、IL7Rm11-tCD19、IL7Rm12-tCD19、IL7Rm13-tCD19、IL7Rm14-tCD19、IL7Rm15-tCD19、IL7Rm16-tCD19、IL7Rm17-tCD19、IL7Rm18-tCD19、IL7Rm19-tCD19、IL7Rm20-tCD19；作为对照，IL7R-tCD19构建体包含tCD19胞外结构域和野生型IL7R跨膜区和胞内段(SEQ ID NO:96)，IL7R-WT构建体包含完整的野生型IL7R链(SEQ ID NO:18)。
实施例1.2.构建稳定表达不同M7R的BaF3细胞系
BaF3(购自南京科佰生物科技有限公司)是鼠源前B淋巴细胞，依赖外源加入的小鼠IL-3(mIL-3)细胞因子(R&D system)生存。当外源基因转入该细胞系使BaF3细胞获得不依赖IL-3的生长特性时，说明转入的外源基因能够传递组成型促细胞生存信号，因此BaF3细胞系是筛选具有组成型促生存信号基因的常用工具细胞系。
为了鉴定实施例1.1中构建的tCD19-M7CR基因导入该BaF3细胞系后，是否能够持续激活STAT5信号，将不同tCD19-M7CR基因通过慢病毒转入BaF3细胞中，根据BaF3细胞是否能够产生IL-3非依赖生长来筛选具有持续激活STAT5功能的M7R基因。具体实验步骤如下，将处于对数生长期的Lenti-X-293T细胞(Takara公司)(3×105个细胞)接种入6孔板中，待细胞贴壁后，分别将27个克隆有不同tCD19-M7CR基因、以及克隆有对照IL7R-tCD19基因的各表达质粒pRK(金维智构建)、包装质粒pMDLg/pRRE(Addgene，12251，购自生物风)、调节质粒pRSV-rev(Addgene，12253，购自生物风)及包膜质粒pMD2G(Addgene，12259，购自生物风)以3:3:2:2的质量比例用PEI转染法转染在含有10％FBS的DMEM培养基中培养的Lenti-X-293T细胞(Takara公司)，转染16小时后，更换含有2％胎牛血清(FBS)的新鲜DEME培养基，继续培养48小时后，收集细胞培养上清，离心去细胞碎片，得到含慢病毒的上清。
用含慢病毒的上清去侵染BaF3细胞24小时，然后用含mIL-3(R&D systems，403-ML)的RPMI 1640完全培养基常规培养48h。
实施例1.3.检测细胞中M7R的表达
通过实施例1.2制备的慢病毒侵染BaF3细胞后，采用流式细胞术检测BaF3细胞表面是否表达tCD19来判断M7R是否成功表达。
具体而言，取实施例1.2制备的慢病毒侵染后的BaF3细胞，用FACS缓冲液洗涤一遍后，用FACS缓冲液重悬BaF3细胞，加入LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Thermo，L34963)，PE-CD19抗体(BD公司，555413)，4℃孵育30至45min。然后用FACS缓冲液洗涤一遍，用FACS缓冲液重悬细胞后，通过流式细胞术检测细胞表面tCD19的表达。
结果如图3A所示，27个包含不同tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染BaF3细胞后第4天，BaF3细胞表面均有tCD19的表达，说明了M7R基因在BaF3细胞成功表达。
实施例1.4.筛选具有激活STAT5功能的M7R待27个包含不同M7R基因的慢病毒侵染BaF3细胞并测得27个不同M7R基因均在被侵染的BaF3细胞有表达后，将实施例1.2制备的慢病毒侵染后的BaF3细胞(表达不同M7R基因的每组BaF3细胞)均置于不含mIL-3的RPMI-1640(10％FBS)完全培养基中进行培养，通过观察BaF3细胞是否能够以mIL-3非依赖方式生长，从而判断各M7R是否具有促BaF3细胞mIL-3非依赖生长效应。随后，将筛选出来的具有mIL-3非依赖生长的每组BaF3细胞以相同的细胞数量(即，5×105个细胞/孔)加入24孔板中，通过细胞计数仪对每组细胞进行计数，记录细胞增殖的情况，绘制生长曲线。
结果如图3B所示，被侵染的BaF3细胞经过不加入外源mIL-3培养后，表达IL7Rm1.1-tCD19、IL7Rm1.3-tCD19、IL7Rm3.1-tCD19、IL7Rm4-tCD19、IL7Rm5-tCD19、IL7Rm6-tCD19、IL7Rm7-tCD19，IL7Rm8-tCD19，IL7Rm9-tCD19，IL7Rm10-tCD19，IL7Rm11-tCD19，IL7Rm12-tCD19，IL7Rm13-tCD19，IL7Rm14-tCD19，IL7Rm15-tCD19，IL7Rm 16-tCD19，IL7Rm 17-tCD19，IL7Rm 18-tCD19，IL7Rm 19-tCD19的BaF3细胞中tCD19+细胞的比例上升，剩余组别的BaF3细胞在不加入外源mIL-3培养后不能维持存活，说明IL7Rm1.1，IL7Rm1.3，IL7Rm3.1，IL7Rm4，IL7Rm5，IL7Rm6，IL7Rm7，IL7Rm8，IL7Rm9，IL7Rm10，IL7Rm11，IL7Rm12，IL7Rm13，IL7Rm14，IL7Rm15，IL7Rm 16，IL7Rm 17，IL7Rm 18，IL7Rm 19能够提供持续激活的IL7Rα信号，促进BaF3细胞以mIL-3非依赖方式生长。
在病毒侵染细胞后，从第3天开始不加入外源mIL-3对细胞进行筛选，图3C所示，统计了不加入外源mIL-3筛选BaF3细胞前后CD19+细胞的比例变化，结果表明，不加入外源mIL-3培养BaF3细胞后，在第11天时检测CD19+的比例，有细胞存活的组中CD19+的比例均显著提高。
如图3D所示，经过细胞计数，发现IL7Rm1.1、IL7Rm1.3、IL7Rm3.1、IL7Rm4～12、IL7Rm14～18等M7R基因均能够促进BaF3细胞以mIL-3非依赖方式增殖。
实施例1.5.BaF3细胞的胞内p-STAT5检测：
取未经慢病毒侵染的BaF3细胞(作为对照)和实施例1.4的筛选后能够稳定表达tCD19-M7CR的各组BaF3细胞，用PBS洗涤两遍，重悬至无血清RPMI-1640培养基中过夜。次日，离心收集细胞，用3％多聚甲醛固定细胞，用FACS缓冲液洗涤1遍；用0.1％Triton-X透化细胞，用FACS缓冲液洗涤1遍；将细胞置于95％预冷的甲醇中，置于-20℃过夜；次日，离心收集细胞，用FACS缓冲液洗涤1遍，然后将细胞和AF647-p-STAT5(BD，562076)抗体置于室温共孵育45min，最后通过流式细胞术检测BaF3细胞内p-STAT5的表达水平。
图4中，ISO是指用抗STAT5的同型对照抗体进行染色，+IL3是指在未经侵染的BaF3细胞中加入IL3刺激细胞STAT5激活，作为阳性对照；without IL3是不用IL3刺激未侵染的BaF3细胞，用抗pSTAT5抗体染色，检测细胞中STAT5的基础磷酸化水平。
如图4所示，未经慢病毒侵染的BaF3细胞(ISO,作为对照)只有在加入外源mIL-3刺激情况下检测到STAT5磷酸化信号；而表达IL7Rm1.1、IL7Rm1.3、IL7Rm3.1、IL7Rm4、IL7Rm5、IL7Rm6、IL7Rm7、IL7Rm8、IL7Rm9、IL7Rm10、IL7Rm11、IL7Rm12、IL7Rm14、IL7Rm15、IL7Rm16、IL7Rm17、IL7Rm18基因的BaF3细胞在不加入外源mIL-3刺激情况下检测到STAT5磷酸化信号，表明这些M7R基因能够组成型激活STAT5信号通路。
实施例2、M7R对人T细胞生长的影响
根据实施例1中使用BaF3细胞筛选构建的tCD19-M7CR基因的结果，选取了具有组成型激活功能的M7R序列(分别为IL7Rm1.1、1.3、3.1、4～12、14～18)。
为了鉴定所述tCD19-M7CR基因导入T细胞系后，M7R序列是否能够持续激活T细胞中的STAT5信号通路，将不同tCD19-M7CR基因(分别为含IL7Rm1.1、1.3、3.1、4～12、14～18的tCD19-M7CR基因)通过慢病毒转入T细胞中，根据T细胞是否能够产生IL-2非依赖生长来筛选在T细胞中具有持续激活STAT5功能的M7R基因。
慢病毒包装步骤同实施例1.2所述，获得分别包含不同M7R序列(分别为IL7Rm1.1、1.3、3.1、4～12、14～18)的tCD19-M7CR基因的慢病毒上清。采用表达不同tCD19-M7CR基因的慢病毒侵染激活的人T细胞(PBMC信息见表1)以获得稳定表达不同tCD19-M7CR的T细胞。具体步骤如下。
T细胞分选和激活步骤：添加注射用重组人白介素-2(国药准字S20040020)至TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec,170-076-309)中，配制成IL-2浓度为200IU/ml的T细胞培养基。
自ORiCELLS获得了多个供者PBMC细胞，具体信息如下表1所示：
表1.供者PBMC细胞的相关来源信息
PBMC细胞编号 目录号 批次号 供者ID号
供者3PBMC FPB004F-C PCH2020110004 Z0052
供者5PBMC FPB004F-C PCH20210100004 Z0086
供者13PBMC FPB004F-C LP211027009 Z0301
供者15PBMC FPB004F-C LP211013009 Z0290
供者17PBMC FPB004F-C LP211214008 Z0349
第0天使用Pan T Cell Isolation Kit(human)(Miltenyi,130-096-535)对复苏后的各供者PBMC进行分选，获得T细胞，使用T细胞培养基将T细胞重悬至一定的密度(例如，细胞密度1×106个细胞/mL)并添加TransAct(Miltenyi,130-111-160)进行激活；第1天分出一定量细胞不添加慢病毒继续培养，该部分细胞为未转导细胞(UNT细胞,un-transducedT cells)，剩余的细胞添加分别包含不同tCD19-M7CR基因的慢病毒的上清并将T细胞吹打均匀；第2天离心去除包含慢病毒的上清，重悬T细胞至新鲜含IL-2的T细胞培养基中。对UNT细胞无任何操作。37℃，5％CO2细胞培养箱培养48h后，用LIVE/DEAD Fixable Dead CellStain(Thermo，L34963)、PE-CD19(BD，555413)、AF647-p-STAT5(BD，562076)抗体组合检测M7R基因在T细胞中的表达水平及T细胞中STAT5的磷酸化水平。然后将相同数量tCD19+T细胞(5×106细胞/孔)加入24孔板中，用RPMI1640完全培养基(不含hIL-2)培养，每2至3天换液一次。每周通过细胞计数仪对总T细胞进行计数，并通过流式细胞术检测tCD19+细胞的比例，并绘制细胞生长曲线。
使用供者3的PBMC细胞，待病毒侵染T细胞后48h，检测T细胞上的tCD19表达。结果如图5所示，在感染不同tCD19-M7CR基因、包含野生型IL7Rα跨膜区及胞内段的IL7R-tCD19基因的人T细胞中检测到不同比例tCD19表达，而未转染(UNT)的T细胞及表达野生型IL7Rα(IL7R-WT)的T细胞中未检测到tCD19表达。说明了M7R基因在T细胞中成功表达。
使用供者3的PBMC细胞，待病毒侵染T细胞后，培养5天(从第0天开始算分选激活一直到检测时共培养5天)后检测T细胞中STAT5的磷酸化水平。如图6所示，未转染的T细胞(UNT)只有在加入外源IL-2刺激情况下检测到STAT5磷酸化信号；而在不加入外源IL-2刺激情况下，稳定表达不同M7R的而不是表达野生型IL7R跨膜及胞内段(对照IL7R-tCD19)的T细胞中检测到STAT5磷酸化信号，表明这些M7R基因在人T细胞中同样能够组成型激活STAT5信号通路。
使用供者3的PBMC细胞，待病毒侵染T细胞，绘制细胞生长曲线，如图7A和图7B所示，表达IL7R-tCD19的T细胞体外在加入外源IL-2刺激情况下持续扩增2周，此后细胞停止扩增并维持约1周，然后细胞数量显著下降。在不加入外源IL-2刺激情况下，表达IL7R-tCD19的T细胞数量持续下降，2周后所有细胞死亡。
与表达IL7R-tCD19的T细胞相比较，表达IL7Rm4、5、7和8构建体的T细胞在不加入外源IL-2情况下数量能够维持1周，1周后开始缓慢下降，直到4周所有细胞死亡，这些体外实验表明表达M7R基因促进了T细胞的存续并具有维持T细胞存活的能力。
实施例3、构建M7CR修饰的CAR
如图8所示，设计了不同的M7CR基因，其中将胞外结构域(ECD)和M7R(IL-7Rα突变体跨膜和胞内信号区组成的融合IL-7R突变体)直接连接组成的组成型嵌合细胞因子受体M7CR；然后通过P2A将M7CR的N端与不同CAR多肽的C端连接，从而构成M7CR修饰的CAR。
在所述M7CR中，位于M7R的N端的ECD包括但不限于IL-15(SEQ ID NO：47)、IL-15/IL-15Rα(SEQ ID NO：140)、IL-15/IL-15Rα(Sushi)(SEQ ID NO：48)、IL-15Rα(Sushi)/IL-15(SEQ ID NO：141)、IL-12-P70(SEQ ID NO：49)、IL-12-p40(SEQ ID NO：50)、IL-21(SEQID NO：51)、IL-9(SEQ ID NO：52)、IL-18(SEQ ID NO：53)、IL-23(SEQ ID NO：54)、IL-36γ(SEQ ID NO：55)、IFNα2b(SEQ ID NO：56)、4-1BBL(SEQ ID NO：57)、CD40L(SEQ ID NO：58)、FLT3L(SEQ ID NO：59)、ICOS(SEQ ID NO：60)、GITR(SEQ ID NO：61)、ICAM-1(SEQ ID NO：62)、CD2(SEQ ID NO：63)、抗4-1BB(SEQ ID NO：64)、抗CD40(SEQ ID NO：65)、抗CD83(SEQID NO：66)、抗-TGFβ(SEQ ID NO：67)、抗PD-L1VHH(SEQ ID NO：68)、抗CD47(SEQ ID NO：69)、抗IL-4(SEQ ID NO：70)、抗PD-1(SEQ ID NO：71)、抗CTLA-4(SEQ ID NO：72)、抗LAG-3(SEQID NO：73)、抗TIGIT(SEQ ID NO：74)、抗CD73(SEQ ID NO：75)、抗NKG2D(SEQ ID NO：76)、抗NKG2C(SEQ ID NO：77)、抗NKp30(SEQ ID NO：78)和抗NKp46(SEQ ID NO：79)。不同ECD分别和M7R连接后分别构成各M7CR分子：IL-15-M7CR、IL15/IL15Rα-M7CR、IL15/IL15Rα(Sushi)-M7CR、IL15 Rα(Sushi)/IL15-M7CR IL-12-P70-M7CR、IL-12-p40-M7CR、IL-21-M7CR、IL-9-M7CR、IL-18-M7CR、IL-23-M7CR、IL-36γ-M7CR、IFNα2b-M7CR、4-1BBL-M7CR、CD40L-M7CR、FLT3L-M7CR、ICOS-M7CR、GITR-M7CR、ICAM-1-M7CR、CD2-M7CR、抗4-1BB-M7CR、抗CD40-M7CR、抗CD83-M7CR、抗TGFβ-M7CR、抗PD-L1 VHH-M7CR、抗CD47-M7CR、抗IL-4-M7CR、抗PD-1-M7CR、抗CTLA-4-M7CR、抗LAG-3-M7CR、抗TIGIT-M7CR、抗CD73-M7CR、抗NKG2D-M7CR、抗NKG2C-M7CR、抗NKp30-M7CR和抗NKp46-M7CR。
图1显示了所构建的M7CR转导T细胞后，表达所构建的M7CR的T细胞的作用机制。
实施例4、制备M7CR修饰的CAR-T细胞
实施例4.1.序列合成
人工合成DNA序列，所述DNA序列分别编码HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)(下文/附图中有时也简称为“8B”)、H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)(文中有时也称“H9.1.2”)、H9.2.1-BB-L-CAR(SEQ ID NO:100)或H9.2.1-BB-L-CAR’(SEQ ID NO:144)(文中有时也称“H9.2.1或H9”)、H9.2.1-28-L-CAR(SEQ ID NO:142)(文中有时也称“H9.2.1(CD28)”)、H9.1.2-P2A-tCD19-M7CR(下文中又称H9.1.2-tCD19-M7CR)(SEQ ID NO:80)、H9.1.2-P2A-tCD19-M7CR(CPT)(下文中又称H9.1.2-tCD19-M7CR(CPT))(SEQ ID NO:81)、H9.1.2-P2A-IL-12-P70-M7CR(下文中又称H9.1.2-IL-12-M7CR)(SEQ ID NO:82)、H9.1.2-P2A-IL-15/IL-15Rα-M7CR(下文中又称H9.1.2-IL-15-M7CR)(SEQ ID NO:83)、H9.1.2-P2A-IL-21-M7CR(下文中又称H9.1.2-IL-21-M7CR)(SEQ ID NO:84)、H9.1.2-P2A-CD40L-M7CR(下文中又称H9.1.2-CD40L-M7CR)(SEQ ID NO:85)、H9.1.2-P2A-4-1BBL-M7CR(下文中又称H9.1.2-4-1BBL-M7CR)(SEQ ID NO:86)、H9.1.2-P2A-抗PD-L1VHH-M7CR(下文中又称H9.1.2-抗PD-L1VHH-M7CR)(SEQ ID NO:87)、8B-P2A-tCD19-M7CR(下文中又称8B-tCD19-M7CR)(SEQ IDNO:88)、8B-P2A-tCD19-M7CR(CPT)(下文中又称8B-tCD19-M7CR(CPT))(SEQ ID NO:89)、8B-P2A-IL-15/IL-15Rα-M7CR(下文中又称8B-IL-15-M7CR)(SEQ ID NO:90)、8B-P2A-IL-12-P70-M7CR(下文中又称8B-IL-12-M7CR)(SEQ ID NO:91)、8B-P2A-IL-21-M7CR(下文中又称8B-IL-21-M7CR)(SEQ ID NO:92)、8B-P2A-CD40L-M7CR(下文中又称8B-CD40L-M7CR)(SEQID NO:93)、8B-P2A-4-1BBL-M7CR(下文中又称8B-4-1BBL-M7CR)(SEQ ID NO:94)、8B-P2A-抗PD-L1VHH-M7CR(下文中又称8B-抗PD-L1VHH-M7CR)(SEQ ID NO:95)、H9.2.1-P2A-tCD19-M7CR(下文中又称H9.2.1-tCD19-M7CR)(SEQ ID NO:101)、H9.2.1-P2A-IL-12-P70-M7CRin(下文中又称H9.2.1-IL-12-M7CRin或H9.2.1-IL12-M7CRin)(SEQ ID NO:102)、H9.2.1in-P2A-IL-12-P70-M7CR(下文中又称H9.2.1in-IL-12-M7CR或H9.2.1in-IL12-M7CR)(SEQ IDNO:103)、H9.2.1-P2A-IL-12-P70-M7CR(下文中又称H9.2.1-IL-12-M7CR或H9.2.1-IL12-M7CR)(SEQ ID NO:104)、H9.2.1-P2A-sIL-12-P70(下文中又称H9.2.1-sIL-12或H9.2.1-sIL12)(SEQ ID NO:105)、H9.2.1-P2A-IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR(下文中又称H9.2.1-IL-15-M7CR)(SEQ ID NO:136)、H9.2.1-P2A-IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CRin(下文中又称H9.2.1-IL-15-M7CRin)(SEQ ID NO:135)、H9.2.1in-P2A-IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR(下文中又称H9.2.1in-IL-15-M7CR)(SEQ ID NO:134)、H9.2.1-P2A-sIL-15(下文中又称H9.2.1-sIL-15)(SEQ ID NO:139)、H9.2.1(CD28)-P2A-IL-12-P70-M7CR(SEQ ID NO:133)、H9.2.1(CD28)-P2A-IL-15/IL15Rα(Sushi)-M7CR(SEQ ID NO:137)、H9.2.1-P2A-IL15Rα(Sushi)/IL-15-M7CR(SEQ ID NO:138)蛋白。
在所述构建体中，HuR968B CAR多肽(SEQ ID NO:15)从N端至C端包含CD8-SP(SEQID NO:1)、抗PG抗体VH(SEQ ID NO:9)、G4S接头(SEQ ID NO:5)、VL(SEQ ID NO:10)、GGGGS铰链、CD8 TMD(SEQ ID NO:8)、4-1BB CSD(SEQ ID NO:11)和CD3ζSSD(SEQ ID NO:12)。所述CAR多肽通过P2A(SEQ ID NO:3)连接M7CR分子。
在所述构建体中，H9.1.2-BB-L CAR分子(SEQ ID NO:16)从N端至C端包含CD8-SP(SEQ ID NO:1)、H9.1.2-VL(SEQ ID NO:13)、(G4S)3接头(SEQ ID NO:4)、H9.1.2-VH(SEQID NO:14)、CD8铰链(SEQ ID NO:7)、CD8 TMD(SEQ ID NO:8)、4-1BB CSD(SEQ ID NO:11)和CD3ζSSD(SEQ ID NO:12)。所述CAR多肽通过P2A(SEQ ID NO:3)连接M7CR分子。
在所述构建体中，H9.2.1-BB-L CAR分子(SEQ ID NO:100)从N端至C端包含CD8-SP(SEQ ID NO:1)、H9.2.1-VL(SEQ ID NO:98)、(G4S)3接头(SEQ ID NO:4)、H9.2.1-VH(SEQID NO:99)、CD8铰链(SEQ ID NO:7)、CD8 TMD(SEQ ID NO:8)、4-1BB CSD(SEQ ID NO:11)和CD3ζSSD(SEQ ID NO:12)。H9.2.1-BB-L CAR’分子(SEQ ID NO:144)从N端至C端包含CD8-SP(SEQ ID NO:1)、H9.2.1-VL(SEQ ID NO:98)、接头序列(SEQ ID NO:145)、H9.2.1-VH(SEQID NO:99)、CD8铰链(SEQ ID NO:146)、CD8 TMD(SEQ ID NO:147)、4-1BB CSD(SEQ ID NO:11)和CD3ζSSD(SEQ ID NO:12)。所述CAR多肽通过P2A(SEQ ID NO:3)连接M7CR分子。
在所述的构建体中，H9.2.1-28-L CAR分子(SEQ ID NO:142)从N端至C端包含CD8-SP(SEQ ID NO:1)、H9.2.1-VL(SEQ ID NO:98)、接头序列(SEQ ID NO:145)、H9.2.1-VH(SEQID NO:99)、CD8铰链(SEQ ID NO:146)、CD8 TMD(SEQ ID NO:147)、CD28 CSD(SEQ ID NO:143)和CD3ζSSD(SEQ ID NO:12)。所述CAR多肽通过P2A(SEQ ID NO:3)连接M7CR分子。
所述H9.1.2-P2A-tCD19-M7CR分子(SEQ ID NO:80)从N端至C端包含H9.1.2-BB-LCAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ ID NO：3)以及tCD19-M7CR。所述H9.1.2-P2A-tCD19-M7CR(CPT)分子(SEQ ID NO:81)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ IDNO：3)以及tCD19-M7CR(CPT)。所述H9.1.2-P2A-IL-12-M7CR分子(SEQ ID NO:82)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-12-P70-M7CR。所述H9.1.2-P2A-IL-15-M7CR分子(SEQ ID NO:83)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ IDNO:16)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-15/IL-15Rα-M7CR。所述H9.1.2-P2A-IL-21-M7CR分子(SEQ ID NO:84)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-21-M7CR。所述H9.1.2-P2A-CD40L-M7CR分子(SEQ ID NO:85)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ ID NO：3)以及CD40L-M7CR。所述H9.1.2-P2A-4-1BBL-M7CR分子(SEQ ID NO:86)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ IDNO：3)以及4-1BBL-M7CR。所述H9.1.2-P2A-抗PD-L1VHH-M7CR分子(SEQ ID NO:87)从N端至C端包含H9.1.2-BB-L CAR(SEQ ID NO:16)、P2A(SEQ ID NO：3)以及抗PD-L1VHH-M7CR。
所述8B-P2A-tCD19-M7CR分子(SEQ ID NO:88)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及tCD19-M7CR。所述8B-P2A-tCD19-M7CR(CPT)分子(SEQID NO:89)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及tCD19-M7CR(CPT)。所述8B-P2A-IL-15-M7CR分子(SEQ ID NO:90)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-15/IL-15Rα-M7CR。所述8B-P2A-IL-12-M7CR分子(SEQ ID NO:91)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-12-P70-M7CR。所述8B-P2A-IL-21-M7CR分子(SEQ ID NO:92)从N端至C端包含HuR968BCAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-21-M7CR。所述8B-P2A-CD40L-M7CR分子(SEQ ID NO:93)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及CD40L-M7CR。所述8B-P2A-4-1BBL-M7CR分子(SEQ ID NO:94)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及4-1BBL-M7CR。所述8B-P2A-抗PD-L1VHH-M7CR分子(SEQ ID NO:95)从N端至C端包含HuR968B CAR(SEQ ID NO:15)、P2A(SEQ ID NO：3)以及抗PD-L1VHH-M7CR。
在上述“H9.1.2”和“8B”相关构建体中，所有M7CR分子从N端至C端均包含GM-CSFRα-SP(SEQ ID NO:2)、ECD以及M7R，任选地在ECD的C端和M7R的N端之间连接有Flag Tag，(下文该部分实施例中作为M7R例示了SEQ ID NO：34所示的ILRm8)，ECD选自tCD19(SEQ ID NO：17)、IL-12-P70(SEQ ID NO：49)、IL-15/IL-15Rα(SEQ ID NO：140)、IL-21(SEQ ID NO：51)、4-1BBL(SEQ ID NO：57)、CD40L(SEQ ID NO：58)、抗PD-L1VHH(SEQ ID NO：68)。其中IL-12-P70-M7CR、IL-15/IL-15Rα-M7CR、IL-21-M7CR在ECD序列和M7R序列之间还包含Flag Tag(SEQ ID NO:6)。tCD19-M7CR、IL-12-P70-M7CR(下文中也称IL-12-M7CR)、IL-15/IL-15Rα-M7CR(下文中也称IL-15-M7CR)、IL-21-M7CR、4-1BBL-M7CR、CD40L-M7CR、抗PD-L1VHH-M7CR分子的M7R部分为IL7Rm8(SEQ ID NO:34)，tCD19-M7CR(CPT)作为对照，其M7R部分为IL7Rm(CPT)(SEQ ID NO:97)(IL7Rm(CPT)是作为对照的M7R分子)。此外，在抗PD-L1VHH-M7CR分子的M7R部分IL7Rm8序列的N段还包括“ESKYGPPCPPCP”序列。
所述H9.2.1-P2A-tCD19-M7CR分子(SEQ ID NO:101)从N端至C端包含H9.2.1-BB-LCAR(SEQ ID NO:100)、P2A(SEQ ID NO：3)以及tCD19-M7CR。所述H9.2.1-P2A-IL-12-P70-M7CR分子(SEQ ID NO:104)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CAR(SEQ ID NO:100)、P2A(SEQID NO：3)以及IL-12-P70-M7CR。所述H9.2.1-P2A-IL-12-M7CRin分子(SEQ ID NO:102)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CAR(SEQ ID NO:100)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-12-P70-M7CRin，其中IL-12-P70-M7CRin表示在IL-12-P70-M7CR的基础上，将IL-7受体胞内Box1结构域(第1060-1071位氨基酸，序列为SEQ ID NO:132所示的PIVWPSLPDHKK)删除及同时设计Y1239F,Y1246F(以IL7Rα(P16871-1)为参照)点突变以失活胞内M7R的信号。所述H9.2.1in-P2A-IL-12-P70-M7CR分子(SEQ ID NO:103)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CARin、P2A(SEQID NO：3)以及IL-12-P70-M7CR，其中H9.2.1-BB-LCARin表示将H9.2.1-BB-L CAR(SEQ IDNO:100)分子胞内4-1BB和CD3两个结构域删除(以失活CAR分子胞内信号)、且在C端加上了“KRGR”序列。所述H9.2.1-P2A-sIL-12分子(SEQ ID NO:105)从N端至C端包含H9.2.1-BB-LCAR(SEQ ID NO:100)、P2A(SEQ ID NO：3)以及sIL-12，其中sIL-12表示由GM-CSFRα-SP(SEQID NO:2)、IL-12-p70(SEQ ID NO:49)组成的、能够表达外分泌可溶性IL-12的基因。
所述H9.2.1-P2A-IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR分子(SEQ ID NO:136)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CAR’(SEQ ID NO:144)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR。所述H9.2.1-P2A-IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CRin分子(SEQ ID NO:135)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CAR’(SEQ ID NO:144)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CRin，其中IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CRin表示在IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR的基础上，将IL-7受体胞内Box1结构域(第1060-1071位氨基酸(272-280(以IL7Rα为参照(P16871-1)))，序列为SEQ ID NO:132所示的PIVWPSLPDHKK)删除及设计Y1239F,Y1246F点突变以失活胞内M7R的信号。所述H9.2.1in-P2A-IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR分子(SEQ ID NO:134)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CARin、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR，其中H9.2.1-BB-LCARin表示将H9.2.1-BB-L CAR’(SEQ ID NO:144)分子胞内4-1BB和CD3两个结构域删除以失活CAR分子胞内信号。所述H9.2.1-P2A-sIL-15分子(SEQ ID NO:139)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CAR’(SEQ ID NO:144)、P2A(SEQ ID NO：3)以及sIL-15，其中sIL-15表示由GM-CSFRα-SP(SEQ ID NO:2)、IL-15(SEQ ID NO:47)组成的、能够表达外分泌可溶性IL-15的基因。所述H9.2.1-P2A-IL15Rα(Sushi)/IL-15-M7CR分子(SEQ ID NO:138)从N端至C端包含H9.2.1-BB-L CAR’(SEQ ID NO:144)、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL15Rα(Sushi)/IL-15-M7CR。
所述H9.2.1(CD28)-P2A-IL-12-P70-M7CR分子(SEQ ID NO:133)从N端至C端包含H9.2.1-28-L CAR(SEQ ID NO:142)、序列“RAKR”、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-12-P70-M7CR。所述H9.2.1(CD28)-P2A-IL-15/IL15Rα(Sushi)-M7CR分子(SEQ ID NO：137)从N端至C端包含H9.2.1-28-L CAR(SEQ ID NO:142)、序列“RAKR”、P2A(SEQ ID NO：3)以及IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR。
在上述与“H9.2.1”和“H9.2.1(CD28)”相关的构建体中，所有M7CR分子从N端至C端均包含GM-CSFRα-SP(SEQ ID NO:2)、ECD以及M7R(下文该部分实施例中作为M7R例示了SEQID NO：34所示的ILRm8)，ECD选自tCD19(SEQ ID NO：17)、IL-12-P70(SEQ ID NO：49)、IL-15/IL-15Rα(Sushi)(SEQ ID NO：48)、IL-15Rα(Sushi)/IL-15(SEQ ID NO：141)。tCD19-M7CR、IL-12-P70-M7CR(下文中也称IL-12-M7CR)、IL-15/IL-15Rα(Sushi)-M7CR和IL-15Rα(Sushi)/IL-15-M7CR(下文中有时也称IL-15-M7CR)分子的M7R部分为IL7Rm8(SEQ ID NO:34)，tCD19-M7CR(CPT)作为对照，其M7R部分为IL7Rm(CPT)(SEQ ID NO:97)(IL7Rm(CPT)是作为对照的M7R分子)。
将上述合成的DNA片段插入pRKN慢病毒表达载体(金唯智公司)的EF1α启动子下游，替换原载体中EGFR序列，得到相应的表达质粒(由金唯智公司合成)。
实施例4.2.慢病毒的制备
将实施例4.1获得的表达质粒与结构质粒pMDLg/pRRE(Addgene，12251，购自生物风)、调节质粒pRSV-rev(Addgene，12253，购自生物风)及包膜质粒pMD2G(Addgene，12259，购自生物风)以3:3:2:2的质量比例用PEI转染法转染Lenti-X-293T细胞(Takara公司)，转染16小时后，更换含有2％胎牛血清(FBS)的新鲜DEME培养基，继续培养48小时后，收集细胞上清，离心去细胞碎片，加入PEG8000 4℃孵育16-64小时进行病毒浓缩，再次离心后弃上清，采用T细胞培养基(TexMACs)重悬病毒沉淀物，获得慢病毒浓缩液，分装后-80℃冻存。消化Lenti-X-293T细胞(Takara公司)并用含有8μg/ml Polybrene(Sigma，H9268-5G)的DMEM培养基重悬并加入到24孔板中，加入不同体积上述获得的慢病毒浓缩液培养72小时，进行293T细胞的转导。将转导后的293T细胞消化，用Biotin-SP-conjugated抗Human IgG,F(ab’)2-specific(Jackson ImmunoResearch,109-066-006)以及APC-Streptadvidin(BioLegend,405207)进行染色，并采用细胞流式细胞术检测APC阳性细胞的比例。通过起始细胞量、病毒体积和阳性细胞比例计算出病毒滴度(TU/ml)。
实施例4.3.T细胞的获得及慢病毒转导
添加注射用重组人白介素-2(国药准字S20040020)至TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec,170-076-309)中，配制成IL-2浓度为200IU/ml的T细胞培养基。第0天使用Pan T Cell Isolation Kit(human)(Miltenyi,130-096-535)对复苏后的PBMC进行分选，获得T细胞，使用上述T细胞培养基将细胞重悬至一定的密度并添加TransAct(Miltenyi,130-111-160)进行激活；第1天分出一定量细胞不添加慢病毒继续培养，该部分细胞为未转导细胞(UNT细胞,un-transduced T cells)，剩余的细胞按MOI＝1～5)添加不同种类的自上述实施例4.2获得的慢病毒浓缩液并将细胞吹打均匀；第2天离心去除病毒上清，重悬细胞至新鲜T细胞培养基。UNT细胞无任何操作；第3天将所有细胞转移至G-Rex(WILSONWOLF,货号80040S)中，并添加适量新鲜T细胞培养基，放置于37℃CO2培养箱中静置培养；每隔2～3天，弃掉一半细胞培养基上清，补加等体积新鲜含IL-2的T细胞培养基或者补加等体积新鲜T细胞培养基。将细胞以培养基的半量更换为新鲜培养基或直接补加IL-2，其中，添加IL-2至细胞培养基浓度中IL-2浓度为200IU/ml。当细胞数量扩增约为20-80倍时，满足需求后进行细胞收获，离心去除培养基后CAR-T细胞采用CS10(Stemcell,07930)重悬后分装，程序降温至-80℃进行冻存。
实施例4.4.CAR表达检测及表型检测
取适量自上述实施例4.3获得的CAR-T细胞，FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤一次，重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Thermo，L34963)的FACS缓冲液，室温染色10-15min，洗涤两次，加入PE-Cy7-CD45RA(Biolegend，304126)，FITC-CCR7(Biolegend，353216)，BV605-CD4(BD，562658)，BV421-CD8(BD，749366)，APC-Strep(Biolegend，405207)抗体组合，分别用PE-Flag(Biolegend，637310)，PE-CD40L(Biolegend，310806)，PE-41BBL(Biolegend，311504)，PE-IL15(R&D，MAB247-SP)，PE-CD19(BD，555413)，his-PD-L1蛋白和PE-抗his检测不同ECD分子，其中，抗PD-L1VHH作为ECD是用His标记的PD-L1纯化蛋白作为第一染色试剂，然后用PE-抗His的抗体作为第二染色试剂来检测的。4℃染色30～45min；细胞洗涤两次后FACS缓冲液重悬，用流式细胞仪检测。
使用供者5的PBMC细胞，如图9A所示为制备CAR-T后第9天时CAR及M7CR的表达水平。图中，“H9.1.2”为H9.1.2-BB-L CAR-T细胞，其余为tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15/IL-15Rα-M7CR(图中标记为IL-15-M7CR)、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR、抗PD-L1VHH-M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞。
从图9A中可以看出，在第9天时通过FACS检测CAR多肽和M7CR的表达，CAR多肽能够在所有CAR-T细胞中表达，在H9.1.2中CAR+细胞的比例约为26％，而tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15-M7CR、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR组中的CAR+细胞的比例分别为：12.14％、11.87％、6.81％、6.37％、18.75％、12.97％、11.13％、10.62％。tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15-M7CR、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR组中的M7CR分子均有表达，表达效率分别为：6.6％、6.81％、1.43％、3.59％、4.95％、2.97％、1.03％、7.45％。说明CAR多肽和M7CR分子均能表达，且CAR和各个M7CR分子的表达具有一定的关联性。
图9B中可以看出，CD4和CD8阳性细胞在表达H9.1.2CAR细胞中的比例分别为59.9％，36.3％；在tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15-M7CR、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR组中的CD4+细胞比例分别为：55.9％、62.5％、60.2％、56.1％、62％、65.7％、60.5％和46.5％；CD8+细胞比例分别为：36.3％、33.5％、26.9％、38％、31.5％、29.8％、32.7％和48.2％。
使用供者13的PBMC细胞，待病毒侵染T细胞，如图9C所示为制备CAR-T后第9天时CAR及M7CR的表达水平，图中，“8B”为HuR968B CAR-T细胞，其余为tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15/IL-15Rα-M7CR(图中标记为IL-15-M7CR)、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR、抗PD-L1VHH-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞。
从图9C中可以看出，在第9天时通过FACS检测CAR多肽和M7CR的表达，CAR多肽能够在所有CAR-T细胞中表达，在8B中CAR+细胞的比例约为39％，其它组tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15-M7CR、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR的CAR+细胞的比例分别为：20.41％、17.58％、11.29％、12.01％、26.12％、21.86％、20.12％、21.68％。每组中tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15-M7CR、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR分子均有表达，表达效率分别为：6.6％、6.81％、1.43％、3.59％、4.95％、2.97％、1.03％、7.45％。说明了CAR多肽和M7CR分子均能表达，且CAR和各个M7CR分子的表达有一定的关联性。
从图9D中可以看出，CD4和CD8阳性细胞在表达8B CAR细胞中的比例分别为33.2％，61.6％；在tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL-15-M7CR、IL-12-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBL-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR组中的CD4+细胞比例分别为：31.1％、32.4％、29.8％、38.2％、32.4％、32.2％、32.2％和32.2％；CD8+细胞比例分别为：64.3％、63.2％、65.1％、55.7％、63.5％、63.3％、63.5％和61.1％。
测了H9.1.2-BB-L CAR-T和M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T样品中总T细胞，CD4+和CD8+T的表型，结果如图9E所示。代表性流式细胞图显示不同CAR-T细胞CD45RA、CCR7的表达，CD45RA+CCR7+代表初始T细胞或干性记忆性T细胞(TN/TSCM)、CD45RA-CCR7+代表中心记忆性T细胞(TCM)、CD45RA-CCR7-代表效应记忆性T细胞(TEM)、CD45RA+CCR7-代表效应T细胞(Teff)亚群，CAR-T细胞大部分为TN/TSCM、TCM细胞。和UNT相比，H9.1.2的表型没有明显变化。
与未修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T相比，IL12-M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞样品中总T细胞，CD4+和CD8+T细胞发生明显分化，TCM和TN亚群细胞比例降低，TEM和Teff亚群细胞比例上升，其它组中T细胞表型没有发生明显分化。
检测未修饰的HuR968B CAR-T和M7CR修饰的HuR968B CAR-T样品中总T细胞，CD4+和CD8+T的表型，结果如图9F所示。与未修饰的HuR968B CAR相比，IL12-M7CR修饰的HuR968BCAR-T细胞样品中总T细胞，CD4+和CD8+T细胞发生明显分化，TCM和TN亚群细胞比例降低，TEM和Teff亚群细胞比例上升，其它组中T细胞表型没有发生明显分化。进一步检测了H9.2.1-BB-L CAR’-T(其中H9.2.1-BB-L CAR’的序列如SEQ ID NO:144所示)和M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR’-T样品中总T细胞，CD4+和CD8+T的表型，结果如图9G和图9H所示。在两个供者中均发现，与未修饰的H9.2.1 CAR’-T相比，IL-15-M7CR、sIL-15或IL-15-M7CRin修饰的H9.2.1CAR’-T细胞样品中总T细胞，CD4+和CD8+T细胞TCM和TN亚群细胞比例升高；而IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞样品中总T细胞，CD4+和CD8+T细胞细胞发生部分分化，TCM和TN亚群细胞比例降低，TEM和Teff亚群细胞比例上升。说明不同ECD结构对CAR-T细胞表型会产生不同的影响。
实施例4.5CAR-T细胞STAT5信号激活
通过FACS检测胞内p-STAT5的表达水平，研究STAT5的激活情况。实验步骤如下，取1E6的T细胞，用PBS洗涤一遍后，重悬于无血清的RPMI1640培养基中，过夜。次日，将用IL-2(200UI/mL)刺激UNT细胞20min后，FACS缓冲液洗涤一遍。然后加入AF647-p-STAT5(BD，562076)抗体进行胞内染色，具体步骤同实施例1.5。如图9I和图9J所示，UNT在IL-2的刺激下，p-STAT5水平升高，H9.2.1CAR-T细胞中不论CAR+还是CAR-，p-STAT5均不上升。而表达M7R的CAR+细胞中，p-STAT5的平均表达水平上升，其中对M7R进行失活突变的H9.2.1-IL-12-M7CRin中，p-STAT5的表达水平没有上升。以上结果表明，在CAR-T细胞中M7R能够持续提供激活信号，激活下游信号通路。
实施例5、Qufikit定量分析细胞表面抗原分子数：
用饱和浓度的小鼠抗人CLDN18抗体与细胞系(SNU-601high，SNU-601low，和DAN-G18.2细胞系购自南京科佰生物科技公司)进行孵育，随后qufikit试剂盒(Agilentcompany)定量测量细胞表面上CLDN18的抗原数目。
具体而言，取DAN-G18.2和SNU-601细胞(1E5)于96孔V底板中，丢弃上清。随后添加FACS缓冲液进行重悬洗涤，再次离心去除上清。使用FACS缓冲液配置饱和的小鼠抗人CLDN18.2混合液，于孔内添加100μL的上述混合液。于孔内添加100μL的FACS缓冲液。4℃避光孵育30min。300g离心5min，弃上清。对qufikit试剂盒中的标准品的孔分别添加震荡混匀后的40ul beads(Vial 1和Vial 2)，300g离心5min，弃上清。使用FACS缓冲液配制二抗(Alexa488AffiniPure Goat抗Mouse IgG,F(ab')2fragment specific,1:100),于每个孔内添加100μL的二抗染料，4℃避光孵育30min。使用FACS缓冲液重悬，300g离心5min，丢弃上清。添加FACS缓冲液150μL进行重悬，上机FACS分析。
如图10A所示，SNU-601high细胞，SNU-601low细胞，和DAN-G18.2细胞表面CLDN18的表达量具有差异，其中DAN-G18.2的表达水平最高。
表2
结合特异性抗体的能力 DAN-G18.2细胞 SNU-601细胞
高表达 655891 87427
低表达 — 24360
如表2所示，通过Qufikit定量分析计算细胞表面分子数量，SNU-601high，SNU-601low，和DANG-18.2high表面CLDN18分子数量分别为：87427、24360和655891个。
通过抗体标记不同靶细胞表面的CLDN18.2，然后用流式细胞术检测靶细胞表面CLDN18.2的表达水平。具体而言，用A6抗体与靶细胞4℃共孵育30min；然后FACS缓冲液洗涤一遍后，用APC标记的抗人Fc抗体与细胞4℃共孵育30min；最后用FACS缓冲液洗涤一遍后，上机检测。如图10B所示，峰状图表示每种细胞中CLDN18.2的表达量，通过计算MFI对表达量进行定量。其中，DANG18.2，NUGC-4细胞中CLDN18.2表达量较高，SNU-601和Hup-T4为中表达，SNU-620和PANC-1为低表达，ISO为同型抗体对照，K562为CLDN18.2阴性对照细胞。
实施例6、体外动态杀伤实验
用xCELLigence RTCA MP仪器(Agilent company)动态实时检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤情况。在E-Plates板中添加50μL培养基，仪器读取基准值后，添加50μL肿瘤靶细胞，然后置于机器内对细胞生长情况进行动态监测。复苏实施例4.3制备的UNT细胞以及CAR-T细胞(T细胞来自供者5，供者13的PBMC细胞)，置于37℃细胞培养箱中过夜。次日，按实验需要的E:T比例将CAR-T加入对应组别E-Plates孔中，同时，针对HuR968B CAR-T细胞及M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞所对应的孔内添加含P329G突变A6抗体，利用P329G突变A6抗体的VH/VL结构域结合肿瘤靶细胞、Fc端P329G突变结合HuR968B CAR-T细胞的胞外结合区域，从而激活HuR968B CAR-T细胞或M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞的靶向肿瘤杀伤功能。xCELLigence RTCA MP仪器系统动态监测CAR-T细胞对靶细胞杀伤情况，持续48-96小时。
如图11A所示，分别用H9.1.2-BB-L CAR-T细胞或不同M7CR修饰的H9.1.2-BB-LCAR-T细胞与肿瘤靶细胞DAN-G18.2共孵育，在E:T分别为1:1、1:3、1:10时，tCD19-M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞的杀伤作用相当且均优于H9.1.2-BB-L CAR-T细胞，其它组中CAR-T细胞的杀伤作用和H9.1.2-BB-L CAR-T细胞基本上相当。
如图11B所示，在E:T分别为1:1、1:3、1:10时，4-1BBL-M7CR修饰的H9.1.2-BB-LCAR-T细胞的杀伤作用强于tCD19-M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞。
如图11C所示，在E:T分别为1:1、1:3、1:10时，抗PD-L1VHH-M7CR修饰的H9.1.2-BB-LCAR-T细胞的杀伤作用均强于tCD19-M7CR修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞和未修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞，且这种优势随E:T比例的降低而更明显。说明抗PD-L1VHH和M7R组合修饰使得经修饰的H9.1.2-BB-L CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果具有协同促进的作用。
如图11D所示，用HuR968B CAR-T细胞和M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞和A6抗体(2nM)及靶细胞SUN-601high或SUN-601low共孵育(E:T＝1)。IL-12-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞对SNU-601high和SNU-601low的杀伤作用优于未修饰的HuR968B CAR-T、tCD19-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞及其它M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞，且这种效果在SNU-601low中更明显。另外，IL-15/IL-15Rα-M7CR(图11D中标记为IL-15-M7CR)修饰的HuR968B CAR-T细胞对SNU-601low的杀伤作用略优于未修饰的HuR968B CAR-T细胞和tCD19-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞。
实施例7、体外肿瘤细胞反复刺激实验
第0天将SNU-601high细胞(2.5E5)加入24孔板中，待其贴壁过夜，同时复苏实施例4.3制备的不同组别HuR968B CAR-T细胞(使用供者13的PBMC细胞)。第1天调整CAR-T细胞的CAR阳性率并使其一致，然后将以E:T＝2向每孔中分别加入不同组别HuR968B CAR-T细胞，并加入含P329G突变A6抗体，使其最终浓度为2nM。第2天，收集100μL上清用于细胞因子检测实验。第3天，第5天对每组进行半量换液。第7天将SNU-601high细胞(2×105)加入一块新的24孔板中(记为下一轮刺激的第0天)，通过流式细胞术检测每组中CAR-T细胞的比例及表型，通过细胞计数仪检测T细胞数量。第8天取出5E5个CAR-T细胞加入新的24孔板中(记为下一轮刺激的第1天)。每轮刺激结束，增殖倍数(CAR-T细胞)＝CAR-T细胞数(第7天)/5E5，累计增殖倍数＝增殖倍数Round1×增值倍数Round2×…。
如图12A所示，前7天，所有组中的HuR968B CAR-T细胞在靶细胞的刺激下增殖，第7天至第21天，IL-15/IL-15Rα-M7CR(图12A中标记为IL-15-M7CR)和IL-12-M7CR修饰的组中HuR968B CAR-T细胞持续扩增，增殖倍数均高于未修饰的HuR968B CAR-T细胞组和tCD19-M7CR修饰的HuR968BCAR-T细胞。其中，IL-12-M7CR修饰的组中的CAR-T细胞经过21天的刺激后累计扩增倍数最高(约44倍)。以上表明在靶细胞反复刺激下，IL-12-M7CR修饰能够提高CAR-T细胞的增殖能力。
如图12B所示，在经过靶细胞多轮刺激后，第14天时HuR968B CAR-T细胞中的CAR+细胞比例为53.3％，和第1天时相比略有上升。而经修饰的HuR968B CAR-T细胞中CAR+细胞的比例显著上升，在第21天时tCD19-M7CR、tCD19-M7CR(CPT)、IL15-M7CR、IL-12-M7CR和IL-21-M7CR修饰的组中CAR+细胞比例分别是：76.5％、78.6％、90.1％、79.52％、51.39％。
如图12C和图12D所示，经过靶细胞刺激后，第7天时经4-1BBL-M7CR、CD40L-M7CR和tCD19-M7CR修饰过的CAR-T细胞增殖倍数显著高于HuR968B CAR-T细胞。第7天至第14天，经过靶细胞刺激后所有组中CAR-T细胞的增殖能力均开始下降。
如图12E和图12F所示，在经过靶细胞多轮刺激后，抗PD-L1VHH-M7CR修饰的HuR968BCAR-T细胞增殖倍数略高于tCD19-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞和未经修饰的HuR968BCAR-T细胞。第14天时HuR968B CAR-T细胞中的CAR+比例为53.3％，和第1天时相比略有上升。而经过tCD19-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBl-M7CR和抗PD-L1VHH-M7CR修饰的HuR968B CAR-T细胞中CAR+比例显著上升，至第14天时CAR+的比例分别为：77.4％、71.8％、66.3％、75.1％。
图13A显示了图12A－图12F中经靶细胞第一轮和第三轮刺激后，各组中CD4+和CD8+T细胞数的代表性流式细胞术测定结果图。如图13A所示，实验起始时各组中CD4+和CD8+T细胞的比例基本维持在1:2。经过多轮实验后，IL-12-M7CR修饰能够提高CD4+和CD8+T细胞的比例(约为1:1)，而其它组中CD8+T细胞比例显著增加，CD4+T细胞比例明显降低。表明在靶细胞的刺激下，IL-12-M7CR修饰能够促进CD4+T细胞的扩增。
图13B显示了对图13A中各组中CD4+和CD8+T细胞的比例的统计结果。如图所示，经过多轮刺激后，IL-12-M7CR修饰能够提高CD4+和CD8+T细胞的比例至1：1左右，而其它组中CD8+T细胞比例显著增加，CD4+T细胞比例明显降低。
实施例8、细胞因子检测实验
使用BDTM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine Kit II对细胞因子进行检测。等体积混匀Capture Beads，以25μL/孔进行铺板。添加等体积的体外肿瘤细胞反复刺激实验中的上清液或上清稀释液或标准品。混匀后添加25μL等体积的人Th1/Th2PE检测试剂，室温避光孵育3h。使用洗涤缓冲液洗涤两次后重悬，通过流式细胞仪PE通道MFI值计算细胞因子浓度。
如图13C所示，通过CBA检测第1轮刺激时效应细胞加入后24h上清中IL-2、IFN-γ和TNF细胞因子的水平。发现IL-15/IL-15Rα-M7CR(图13C中标记为IL-15-M7CR)修饰组(＜2000pg/mL)上清中的IL-2水平最低，IL-12-M7CR修饰和tCD19-M7CR(CPT)修饰组(2000-4000pg/mL)次之，未修饰的HuR968B CAR组，tCD19-M7CR、IL-21-M7CR、CD40L-M7CR、4-1BBl-M7CR和αPD-L1VHH-M7CR修饰的HuR968B CAR组(＞6000pg/mL)较高。IL-12-M7CR修饰组(＞10000pg/mL)上清中IFN-γ水平最高，其它组上清中IFN-γ水平均低于5000pg/mL。IL-12-M7CR修饰组(＞1000pg/mL)上清中TNF的水平最高，其它组上清中TNF水平均处于较低水平。
实施例9、IL-12-M7CR/IL-15-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞的体外杀伤作用
进一步地，针对不同Claudin18.2表达水平的靶细胞实施了体外杀伤实验，研究IL-12-M7CR/IL-15-M7CR修饰的H9.2.1 CAR-T在体外对靶细胞的杀伤作用。
用xCELLigence RTCA MP仪器(Agilent company)动态实时检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤情况。实验方法如前面所述。选取CLDN18.2表达水平不同的细胞系作为靶细胞。其中PANC-1为CLDN18.2低表达细胞系，SNU-601和Hup-T4是中高表达细胞系，DAN-G18.2为高表达细胞系。使用来自供者15和供者17的PBMC制备CAR-T细胞。其中，H9.2.1-IL12-M7CR表示IL-12-P70修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞；H9.2.1in-IL12-M7CR表示H9.2.1-BB-L CAR-T中的4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域缺失，进而达到CAR结构功能缺失的目的；H9.2.1-IL12-M7CRin表示将M7CR胞内Box1结构域缺失，且引入Y449F，Y456F(以IL7Rα(P16871-1)为参照)突变进而达到失活M7CR胞内结构功能的目的；H9.2.1-sIL12表示H9.2.1-BB-L CAR-T细胞和可溶性IL12的组合。如图14A－图14D所示，在CLDN18.2的不同表达水平的靶细胞中，CAR-T细胞的杀伤作用随CLDN18.2的表达水平升高而增强，说明H9.2.1-BB-L CAR-T细胞的杀伤作用具有抗原依赖性。在不同效靶比下CAR-T细胞的杀伤能力从低到高依次为H9.2.1in-IL-12-M7CR CAR-T，其次为H9.2.1-BB-L CAR-T细胞，tCD19-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞和H9.2.1-IL-12-M7CRin CAR-T细胞、H9.2.1-sIL12CAR-T细胞相当，IL-12-M7CR修饰的H9.2.1-BB-L CAR-T细胞杀伤作用最强。说明IL-12-P70和M7R在促进CAR-T细胞的杀伤作用上具有联合效应。
类似地，使用H9.2.1-BB-L CAR-T细胞实施了对靶细胞Hup-T4的反复杀伤实验。
用Xcelligence仪器检测CAR-T细胞对靶细胞Hup-T4的杀伤作用。具体实验步骤如下，day0将靶细胞Hup-T4(4×104个/孔)加入Eplate中，放入Xcelligence仪器过夜。待Cellindex升至1左右，进行实验。所述Cell index是Xcelligence仪器的读出(read out)，对于使用该型号仪器进行杀伤实验，用cell index数值来表示活细胞量为通用标准。按E：T＝1：1和E：T＝1：5，向孔中加入不同组别的CAR-T细胞，PC组中加入裂解缓冲液，UNT组中加入未转染CAR的来自同一供者的T细胞。当cell index稳定不再降低时，结束本轮杀伤。然后将Eplate取出，离心去除上清，用新鲜RPMI 1640完全培养基重悬细胞，加入至前一天铺好的含有靶细胞的Eplate中，进行第二轮实验。共进行三轮实验。如图14E所示，持续三轮杀伤实验后，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞仍然具有较好的杀伤作用，而未经修饰的H9.2.1 CAR-T细胞在多轮杀伤中，随轮数增加杀伤效果逐渐减弱。以上结果说明，在反复杀伤实验中IL-12-M7CR分子能够提高H9.2.1 CAR-T细胞的杀伤能力，及持续杀伤的作用。
实施例10、表达组成型嵌合细胞因子受体的CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。
通过动物实验，研究了表达组成型嵌合细胞因子受体的CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用，检测是否IL-12-M7CR分子能够促进PG CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用及增殖能力。实验方法具体如下，选用NOG小鼠(购自维通利华)，Day-7给小鼠腹腔注射NUGC-4-Gluc细胞(每只1×106)进行造模，通过小动物活体成像系统对小鼠造模情况进行检测，至Day0时肿瘤负荷为1×109p/s(为IVIS成像系统中对于肿瘤产生光子数的计算值和单位)时对动物进行分组(每组5只)。然后通过尾静脉注射给予每只小鼠5×105个CAR-T细胞，UNT组给予的UNT细胞数量和CAR阳性率最低组小鼠输注的总T细胞数量一致。每周对小鼠负荷进行成像，外周血中CAR-T细胞的数量。
如图15及图16所示，将基于PG CAR-T细胞(HuR968B CAR-T细胞)构建的表达M7CR的CAR-T细胞，通过尾静脉注射进造模小鼠体内，同时注射0.3mg/kg含P329G突变A6抗体，通过小动物活体成像发现，随时间增加IL-12-M7CR和tCD19-M7CR修饰的PG CAR-T细胞在体内具有更好的抗肿瘤作用，且如图17所示，在第7天至第28天PG CAR-T细胞具有较高的扩增水平，而未经修饰的PG CAR-T细胞在体内具有较弱的抗肿瘤作用及较差的扩增能力。以上体内结果说明，M7CR修饰在体内具有促进PG CAR-T细胞扩增和提高CAR-T细胞抗肿瘤的作用。
如图18所示，将基于传统CAR-T细胞(H9.2.1-BB-L CAR-T细胞，下文中示例的H9.2.1-BB-L CAR序列如SEQ ID NO:100所示)构建的表达M7CR的CAR-T细胞通过尾静脉注射进造模小鼠体内，通过小动物活体成像发现，随时间增加，IL-12-M7CR和tCD19-M7CR修饰的CAR-T细胞在体内具有更好的抗肿瘤作用，且在Day13时，IL-12-M7CR修饰的CAR-T细胞能够使得造模小鼠体内肿瘤完全消除。如图19所示，该图是对IVIS影像的量化统计，同样可以发现，与UNT组相比，H9.2.1 CAR-T细胞、M7R H9.2.1 CAR-T细胞和IL-12-M7CR CAR-T细胞在造模小鼠体内具有较好的抗肿瘤作用。其中，M7R修饰能够提高H9.2.1 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，IL-12修饰能够进一步提高M7R H9.2.1 CAR-T细胞的抗肿瘤作用。如图20所示，通过流式细胞术检测小鼠外周血中总人T细胞和CAR-T细胞的数量，在一次注射CAR-T细胞后，随着时间增加，除UNT组外，其它组别中总T细胞和CAR-T细胞均增加，其中IL-12-M7CR组中CAR-T细胞扩增数量最多，其次为M7R组，最后为H9.2.1组。以上体内结果表明，M7CR修饰在体内具有促进传统CAR-T细胞扩增和提高CAR T细胞抗肿瘤的作用。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
序列表

Claims (22)

1.组成型嵌合细胞因子受体，其包含胞外结构域和组成型激活的IL-7R突变体，所述胞外结构域由具有重塑肿瘤微环境能力的效应分子组成，例如，所述胞外结构域选自细胞因子、免疫效应分子、抑制性分子拮抗剂、或靶向NK细胞激活性受体的效应分子；所述组成型激活的IL-7R突变体包含IL-7R突变跨膜结构域和IL-7R胞内结构域。
2.根据权利要求1所述的组成型嵌合细胞因子受体，其中所述组成型激活的IL-7R突变体包含任一选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，优选地，所述组成型激活的IL-7R突变体包含任一选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，最优选地，所述组成型激活的IL-7R突变体包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的组成型嵌合细胞因子受体，其中作为胞外结构域的细胞因子选自任一IL-12(例如，IL-12p40或IL-12p70)、IL15(例如，IL-15或IL-15FP，其中所述IL-15FP是IL-15和IL-15Rα的融合蛋白，由此，所述IL-15FP包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白，所述IL-15Rα选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))、IL-21、IL-18、IL-9、IL-23、IL-36γ和IFNα2b；作为胞外结构域的免疫效应分子选自任一4-1BB靶向分子部分(例如，4-1BB配体、抗4-1BB抗体)、CD40靶向分子部分(例如，CD40配体、抗CD40抗体)、CD83靶向分子部分(例如，抗CD83抗体)、FLT3靶向分子部分(例如，FLT3配体(FTL3L)、抗FLT3抗体(αFLT3))、GITR、ICOS、CD2和ICAM-1；作为胞外结构域的抑制性分子拮抗剂选自任一抗PD-L1分子、抗CD47分子、抗IL-4分子、抗TGFβ分子、抗PD-1分子、抗CTLA-4分子、抗LAG-3分子、抗TIGIT分子和抗CD73分子；作为胞外结构域的靶向NK细胞激活性受体的效应分子选自靶向NK细胞激活性受体NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46的分子，例如，抗NKG2C、抗NKG2D、抗NKp30、抗NKp44、抗NKp46，通过激活内源性NK细胞，获得增强的抗肿瘤免疫效应。
4.根据权利要求1或2所述的组成型嵌合细胞因子受体，其中所述胞外结构域选自IL-12(例如，IL-12p40或IL-12p70)、IL15(例如，IL-15或IL-15FP，其中所述IL-15FP是IL-15和IL-15Rα的融合蛋白，由此，所述IL-15FP包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白，所述IL-15Rα选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))、IL-21、4-1BB配体、CD40配体或抗PD-L1纳米抗体。
5.核酸分子，其编码权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体。
6.载体，其包含权利要求5所述的核酸分子，例如，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
7.细胞，其包含权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体、权利要求5所述的核酸分子、或权利要求6所述的载体，所述细胞是例如免疫效应细胞，例如，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。
8.药物组合物，其包含
选自表达权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、编码权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体的核酸分子、权利要求6的载体、和它们的任意组合；和
任选地可药用辅料；
例如，所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体的T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体的T细胞。
9.根据权利要求8所述的药物组合物的用途，用于在受试者中增强抗肿瘤免疫效应，例如，使免疫效应细胞激活、增殖、生存和发挥免疫效应功能。
10.根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
11.权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽或TCR多肽，其包含位于CAR多肽或TCR多肽的N端或者C端的权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体，且所述组成型嵌合细胞因子受体与CAR多肽或TCR多肽之间具有自切割肽或IRES序列，例如，所述自切割肽是来自口蹄病毒或心脏病毒的2A自切割肽，例如，SEQ IDNO:3所示的P2A。
12.根据权利要求11所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽，所述CAR多肽直接靶向或通过“分子开关”靶向一种或多种癌相关抗原，例如，直接靶向癌相关抗原的CAR多肽从N端至C端包含信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域；通过“分子开关”靶向癌相关抗原的CAR多肽从N端至C端包含信号肽、P329G突变结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域，所述CAR多肽结合“分子开关”的P329G突变，继而通过“分子开关”靶向癌相关抗原。
13.根据权利要求11或12所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽，所述CAR多肽直接靶向或通过“分子开关”靶向癌相关抗原CLDN18.2。
14.根据权利要求13所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽，所述组成型嵌合细胞因子受体选自IL-12(例如，IL-12p40或IL-12p70)、IL15(例如，IL-15或IL-15FP，其中所述IL-15FP是IL-15和IL-15Rα的融合蛋白，由此，所述IL-15FP包括IL-15/IL-15Rα和IL-15Rα/IL-15两种形式的融合蛋白，所述IL-15Rα选自IL-15Rα或IL-15Rα(Sushi))；所述CAR多肽直接靶向或通过“分子开关”靶向癌相关抗原CLDN18.2(例如，直接靶向CLDN18.2的CAR多肽从N端至C端包含信号肽、CLDN18.2抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域；通过“分子开关”靶向CLDN18.2的CAR多肽从N端至C端包含信号肽、P329G突变结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域，所述CAR多肽结合“分子开关”的P329G突变，继而通过“分子开关”的靶向癌相关抗原CLDN18.2)。
15.核酸分子，其编码权利要求11-14中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽或TCR多肽。
16.载体，其包含权利要求15所述的核酸分子，例如，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
17.细胞，其表达(1)CAR多肽或TCR多肽；和(2)权利要求1至4中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体；
例如，其包含权利要求11-14中任一项所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽或TCR多肽、权利要求15所述的核酸分子、或权利要求16所述的载体；或者，其包含权利要求5的核酸分子的核酸构建体和表达CAR多肽或TCR多肽的核酸构建体；
所述细胞是例如免疫效应细胞，例如，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。
18.药物组合物，其包含
选自(1)权利要求17所述的细胞；(2)编码权利要求15所述的组成型嵌合细胞因子受体修饰的CAR多肽的核酸分子；(3)权利要求16的载体；(4)权利要求5的核酸分子的核酸构建体和表达CAR多肽或TCR多肽的核酸构建体；和(5)所述(1)至(4)的任意组合；和任选地可药用辅料；
例如，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞制备的，例如，所述细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，当所述CAR多肽是分子开关调控型CAR多肽时，所述药物组合物还包含分子开关。
20.根据权利要求18或19所述的药物组合物的用途，用于在受试者中治疗肿瘤，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求18或19所述的药物组合物。
21.根据权利要求18或19所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
22.一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求8、权利要求18和19中任一项所述的药物组合物。
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