CN117554615A - 一种adamts13酶活性发光免疫检测方法及adamts13酶活性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法及ADAMTS13酶活性检测试剂盒。本发明提供一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法，本发明采用利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的ADAMTS13酶活性，本发明无污染、特异性强、操作简单，并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床实际应用，为临床检测样本中的ADAMTS13酶活性提供了一种更准确、方便和快捷的方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法及ADAMTS13酶活性检测试剂盒。
背景技术
ADAMTS13是一种金属蛋白酶，主要在肝星状细胞中表达，特异性切割具有促血栓作用的大分子血管性血友病因子（von willebrand factor，VWF）多聚体。ADAMTS13缺乏可导致超大分子VWF多聚体（UL-VWFM）持续存在于血管内，诱导血小板聚集，引发血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。
健康成年人血浆中的ADAMTS13酶活性约为50%-178%，在先天性 TTP 患者中ADAMTS13 活性完全缺乏或严重减低（＜5%），所以ADAMTS13酶活性作为 TTP 诊断和的预后评估指标具有重大价值。近年来，多种方法被用于测定血浆ADAMTS13 的活性与抑制物，这些方法主要可以分为 2 个类型：
第一种类型，在变性条件下（如低浓度尿素或盐酸胍）测定其对 vWF 多聚体的裂解作用，裂解产物可以直接通过凝胶电泳测定，但这种方法费时费力，且只有专业实验室可进行。
第二种类型，将 vWF-A2结构域的73个氨基酸肽段作为 ADAMTS13 的底物来测量其活性，这种方法有更好的检测效果，但操作繁琐、较短的氨基酸肽段稳定性差。目前测定方法主要有荧光共振能量转移法（FRETS）、酶联免疫吸附测定（ ELISA）等。FRETS步骤繁琐，试剂价格昂贵，原料受商业公司垄断。ELISA存在检测时间长、操作复杂、重复性差。
因此，目前尚需灵敏度高、操作简单、自动化程度高、成本低的ADAMTS13酶活性快速定量检测方法。
发明内容
为了填补现有技术的空白，本发明提供一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法及ADAMTS13酶活性检测试剂盒。具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明第一方面提供一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测试剂盒。
根据本发明的一些实施例，本发明提供一种测定ADAMTS13酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、校准品、质控品、发光底物液。其中，所述试剂A包括C、N两端带有特定标签序列的VWF的A2结构域蛋白，所述试剂B包括能够结合VWF的A2结构域的C端特定标签序列，所述试剂C包括能够结合VWF的A2结构域的N端特定标签序列，所述发光底物液包括能催化试剂B发光的底物缓冲溶液，所述校准品包含一系列梯度浓度的ADAMTS13酶，所述质控品包括确定浓度的ADAMTS13酶。
根据本发明的一些实施例，所述试剂A、试剂B、试剂C、校准品、质控品、发光底物液的缓冲液包括选自10-100mM，pH6.0-9.0的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液的一种或几种组合。
根据本发明的一些实施例，所述试剂C中磁微粒包括三氧化二铁或四氧化三铁磁性纳米颗粒与有机高分子材料形成的复合微球，所述复合微球表面通过改性带有一种或多种活性基团，所述活性基团能够与所述抗体的氨基或羧基通过酰胺键进行交联形成抗体包被的磁微粒。
根据本发明的一些实施例，所述试剂C可以通过抗体的氨基或羧基直接或通过中间链接化合物偶联在磁珠表面，如磁珠—链霉亲和素偶联—生物素—生物素载体蛋白间接包被的方法包被于磁微粒上，也可以以抗体的形式在反应中间接连接于磁性微粒上。
根据本发明的一些实施例，每毫克磁微粒标记的抗体浓度优选为1-20μg之间，磁微粒粒径优选为0.5-10μm之间，磁微粒的浓度优选为0.1-2mg/ml之间。
根据本发明的一些实施例，所述试剂B中的标记物，包括本领域已知的任何可对抗体进行标记的物质，比如生物素标记、酶标记，具体的，当采用碱性磷酸酶（ALP）标记时，所用的底物溶液包括0.005%-0.05%浓度的9,10-二氢吖啶衍生物或0.005%-0.05%浓度的金刚烷衍生物，当所述底物在所述碱性磷酸酶（ALP）作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。
根据本发明的一些实施例，所述试剂B的抗体，包括本领域已知的任意方法获得的单克隆抗体或多克隆抗体，例如，以GST蛋白免疫动物产生的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明的一些实施例，所述试剂B中标记物与抗体通过酰胺键偶联形成的标记物—抗体B偶联物。
根据本发明的一些更具体的实施例，所述试剂B中标记物-抗体B偶联物的偶联方法包括本领域已知任意方法获得，例如，在所述抗体B加入本领域常用活化剂2-Iminothiolane hydrochloride（2-IT），在所述标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate（SMCC），活化后的标记物与抗体B的混合比例优选为1:0.5-2。
根据本发明的一些具体实施例，所述标准曲线由以下方法获得，包括：
（1）免疫反应： 50μl试剂A、50μl试剂B、50μl试剂C依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（2）酶切反应： 50μl样本或质控品或校准品加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（3）磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
（4）读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用全自动化学发光免疫分析仪测定相对发光强度；
（5）根据检测的数值使用四参数方程拟合，获得ADAMTS13酶活性-发光值标准曲线。
本发明第二方面提供一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测试剂盒在ADAMTS13酶活性检测中的用途。
根据本发明的一些具体实施例，所述检测试剂盒在ADAMTS13酶活性检测中的具体步骤包括：
（1）免疫反应： 50μl试剂A、50μl试剂B、50μl试剂C依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（2）酶切反应： 50μl样本或质控品或校准品加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（3）磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
（4）读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用全自动化学发光免疫分析仪测定相对发光强度，通过计算得到样本中的ADAMTS13酶活性。
本发明第三方面提供一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法。
根据本发明的一些实施例，本发明提供了一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法，应用磁微粒分离技术与化学发光免疫分析系统相结合定量检测样本中ADAMTS13酶活性。
根据本发明的一些更具体的实施例，所述ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法具体包括：
1、将C端标签抗体C与磁性微粒偶联后，包被在磁性微粒表面，制备试剂C；
2、将N端标签抗体B用可检测标记物进行标记制备试剂B；
3、将试剂A、试剂C、试剂B按比例混合后进行免疫反应；
4、将所述免疫复合物与待测样本进行混合反应，并与其他物质进行磁分离，收集磁性微粒沉淀，并加入使标记物的发光的底物，获得ADAMTS13酶活性-发光值标准曲线；
5、根据标准曲线计算所述ADAMTS13酶活性。
磁微粒连接的抗体C同试剂A中的N端标签结合，试剂A中的C端标签与标记物标记的抗体B结合，形成免疫复合物，待测样本或校准品或质控品中的ADAMTS13酶与免疫复合物酶切反应。随后在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质进行磁分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入底物溶液。底物在酶作用下被催化裂解发光，发光强度与样本中ADAMTS13酶活性成反比，使用四参数方程拟合可计算出样本中ADAMTS13酶活性。
根据本发明的一些实施例，所述磁微粒包括三氧化二铁或四氧化三铁磁性纳米颗粒与有机高分子材料形成的复合微球，所述复合微球表面通过改性带有一种或多种活性基团，所述活性基团能够与所述抗体C的氨基或羧基通过酰胺键进行交联形成抗体C包被的磁微粒。
根据本发明的一些实施例，所述试剂C可以通过所述抗体C的氨基或羧基直接或通过中间链接化合物偶联在磁珠表面，如磁珠—链霉亲和素偶联—生物素—生物素载体蛋白间接包被的方法包被于磁微粒上，也可以以抗体的形式在反应中直接连接于磁性微粒上。
根据本发明的一些实施例，将试剂A、试剂C、试剂B按比例混合后进行免疫反应。根据本发明的一些实施例，每毫克磁微粒标记的抗体C浓度优选为1-20μg之间，磁微粒粒径优选为0.5-10μm之间，磁微粒的浓度优选为0.1-2mg/ml之间。
根据本发明的一些实施例，所述标记物标记的抗体B的标记物，包括本领域已知的任何可对抗体进行标记的物质，比如生物素标记、酶标记，具体的，当采用碱性磷酸酶（ALP）标记时，所用的底物溶液包括0.005%-0.05%浓度的9,10-二氢吖啶衍生物或0.005%-0.05%浓度的金刚烷衍生物，当所述底物在所述碱性磷酸酶（ALP）作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。
根据本发明的一些实施例，所述试剂中的抗体，包括本领域已知的任意方法获得的单克隆抗体或多克隆抗体，例如，以GST蛋白免疫动物产生的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明的一些实施例，所述标记物与所述抗体B通过酰胺键偶联形成的标记物——抗体B偶联物。
根据本发明的一些更具体的实施例，所述标记物-抗体B偶联物的偶联方法包括本领域已知任意方法获得，例如，在所述抗体B加入本领域常用活化剂2-Iminothiolanehydrochloride（2-IT），在所述标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate（SMCC），活化后的标记物与抗体B的混合比例优选为1:0.5-2。
相对于现有技术，本发明获得了如下有益的技术效果：
1、本发明提供的ADAMTS13酶活性检测的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，提高了检测速度和检测通量，提升了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的ADAMTS13酶活性，确保了检测的灵敏度，由于利用该试剂盒采用磁微粒进行分离，无污染、特异性强、操作简单，并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，满足临床检测要求，为临床检测ADAMTS13酶活性提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
2、本发明利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测样品中的ADAMTS13酶活性，确保了检测的灵敏度，由于实验采用磁微粒分离清洗，无污染、特异性强、操作简单，并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，满足临床检测要求。本发明为临床检测样本中的ADAMTS13酶活性提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例中ADAMTS13酶活性磁微粒分离化学发光免疫检测方法流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的他处另有明确定义，否则本文中使用的所有其他技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本发明中，术语“抗体”指能以物理吸附的方法固定于磁性微粒表面的抗体，用于与待测抗原结合。抗体通过功能基团结合到磁性微粒上形成免疫磁珠，由于抗体与其相应抗原具有很高的亲和力，因此可以结合抗原一同固定于磁性微粒进行检测。
在本发明中，术语“标记物”指抗体经过酶标记或通过胶体金标记获得的抗体，是免疫电镜样品制备的一种方法，用于观察抗原抗体免疫复合物方面研究的手段。免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。抗体主要是用于抗原的定位分析，在某些情况下，也可以对混杂有大量其他分子的样本中的抗原进行定量检测。由于抗体与其相应抗原具有很高的亲和力，因此带有易识别标记物的抗体可以定位分析抗原，并且是一种理想的快速价廉的定量测定方法。
在本发明中，术语“碱性磷酸酶”（Alkaline Phosphatase，ALP）分子量140,000Da，在分子生物学和蛋白质研究中的主要应用是从DNA中去除5'-磷酸基团或作为免疫分析的报告系统。在免疫分析测试中，酶通常与特定的一级或二级抗体结合，其活性用显色（或发光）底物检测。
在本发明中，术语“磁微粒”是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料。因其具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性，因此将抗原/抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面。
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白结合，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司购买得到。本发明中所用标记碱性磷酸酶（ALP）购自英国BBI公司，型号：ALPI12G；SMCC购自thermo fisher scientific公司，货号：22360；2-IT购自thermo fisher scientific公司，CAS：4781-83-3；货号：26101；羧基修饰微粒购自JSR Life Sciences公司；EDC购自SIMGA公司，CAS：25952-53-8，货号：E7750。
实施例1：试剂A的配制
将携带有GST-VWFA2-HIS（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）的编码基因的质粒在人胚肾（HEK）293 细胞中的瞬时基因表达，通过 Ni-NTA Superflow（Qiagen）层析步骤来纯化加上 His 标签的产物。紫外分光光度计法测定最终纯化的蛋白产物浓度为2mg/ml，将产物用10mM PBS浓度稀释至100ng/ml作为试剂A备用。
实施例2：试剂B的配制
取1.0mg GST蛋白抗体（MA4-004，Invitrogen），浓缩至2.5mg/ml，加入浓度为13.76mg/ml的活化剂2-Iminothiolane hydrochloride （2-IT）溶液5μl，室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗体。
取1.2mg碱性磷酸酶，浓缩至2.5mg/ml，加入浓度为6.69mg/ml的活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate（SMCC）溶液12μl，室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶。
将活化后GST蛋白抗体与碱性磷酸酶按1.0mg的GST蛋白抗体加入1.0mg碱性磷酸酶的比例混合，放置4℃下反应18小时。
使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的GST蛋白抗体和碱性磷酸酶，将连接物保存于4℃，制得试剂B。
实施例3：试剂C的制作
取20mg羧基修饰微粒溶液（厂家：JSR Life Sciences Corporation；货号：MS300/Carboxyl；规格：3um），将具有超顺磁性、粒径均匀、表面含有羧基（COOH-）活性基团的磁微粒在磁场作用下沉降（磁分离）10分钟，去上清，沉降的磁微粒用活化缓冲液摩尔浓度0.05M的（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）MES，pH6.0缓冲液清洗3次，每次用量2ml。
将洗涤后磁微粒用1.0ml活化缓冲液摩尔浓度0.05M的（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）MES，pH6.0的缓冲液充分混悬后加入活化剂1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride（EDC），室温混悬反应30分钟，EDC反应摩尔浓度为7.5mM。
取1.0mg的HIS标签蛋白抗体，浓缩至2.5mg/ml。
将浓缩至2.5mg/ml的HIS标签蛋白抗体按1.0mg的HIS标签蛋白抗体加入20mg活化后的磁微粒溶液混合，轻摇混匀，在4℃混悬条件下反应6.5小时，使得HIS标签蛋白抗体被共价耦联在磁微粒表面，制得试剂C。
实施例4：ADAMTS13酶活性磁微粒分离化学发光免疫检测方法
检测方法流程如图1所示，具体如下：
（1）免疫反应： 50μl试剂A、50μl试剂B、50μl试剂C依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（2）酶切反应： 50μl校准品加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（3）磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
（4）读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用全自动化学发光免疫分析仪测定相对发光强度；（5）根据检测的数值使用四参数方程拟合，获得ADAMTS13酶活性-发光值标准曲线；
（6）免疫反应： 50μl试剂A、50μl试剂B、50μl试剂C依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（7）酶切反应： 50μl样本加入反应管中，37℃条件下混合温育10分钟；
（8）磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
（9）读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用全自动化学发光免疫分析仪测定相对发光强度；
（10）将待测样本的发光强度与步骤（5）的标准曲线比对，使用四参数方程拟合可计算出待测样本中ADAMTS13酶活性。
实施例5：试剂盒性能测试
本试剂盒与全自动化学发光仪配合使用，检测ADAMTS13酶活性较低的TTP患者血浆样本29例，正常人血浆样本20例，检测发光值见表1，TTP患者样本检测结果和正常人血浆样本结果经过t-test检验分析P<0.01，两组具有显著性差异。说明本试剂盒可以为相关ADAMTS13酶活性异常疾病的及时诊断和治疗提供帮助。
表1 试剂盒检测临床样本结果
本发明提供的ADAMTS13酶活性的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，提高了检测速度和检测通量，提升了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (19)
1.一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、发光底物液；
其中，所述试剂A包括C、N两端带有特定标签序列的VWF的A2结构域蛋白；
所述试剂B包括能够结合VWF的A2结构域的C端特定标签序列；
所述试剂C包括能够结合VWF的A2结构域的N端特定标签序列；
并且其中试剂B用可检测标记物进行标记，
并且其中试剂C能够固定到磁微粒上。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述C、N两端带有特定标签序列的VWF的A2结构域为可被ADAMTS13酶切的D1459至R1668氨基酸序列，
其中所述标签序列包括c-Myc、AviTag、SNAP-Tag、Strep-tag II、GST、6His；
其中所述C、N两端带有不同的上述标签；
其中所述试剂B和试剂C是抗体，试剂B特异性识别一种标签序列，试剂C特异性识别另一种标签序列。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径不大于10μm。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径为0.5-10μm。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述标记物为生物酶或化学标记物，所述生物酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少之一；所述化学标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺及其衍生物中的至少之一。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述发光底物液包括能催化试剂B发光的底物的缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括校准品和/或质控品，
其中，所述校准品包含不同活性梯度的ADAMTS13酶；
所述质控品包括确定活性的ADAMTS13酶的缓冲溶液。
8.根据权利要求6或7所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的至少之一。
9.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括校准品和/或质控品，
其中，所述校准品包含不同活性梯度的ADAMTS13酶；
所述质控品包括确定活性的ADAMTS13酶的缓冲溶液。
10.权利要求1-9中任一项所述的ADAMTS13酶活性发光免疫检测试剂盒在ADAMTS13酶活性检测中的用途。
11.一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法，其特征在于，所述检测方法包括利用权利要求1-9中任一项所述的ADAMTS13酶活性发光免疫检测试剂盒对待测样品进行ADAMTS13酶活性检测。
12.一种ADAMTS13酶活性发光免疫检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
（A）将C端标签抗体C与磁性微粒偶联后，包被在磁性微粒表面，制备试剂C；
（B）将N端标签抗体B用可检测标记物进行标记制备试剂B；
（C）将试剂A、试剂B和试剂C混合，进行免疫反应，形成免疫复合物；
（D）将所述免疫复合物与待测样本进行混合反应，并与其他物质进行磁分离，收集磁性微粒沉淀；
（E）向所述磁性微粒沉淀中加入发光底物液，检测发光强度，以便获取所述待测样品中ADAMTS13酶活性。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法进一步包括：
利用校准品绘制ADAMTS13酶活性－发光值标准曲线，其中，所述校准品包含不同梯度的ADAMTS13酶活性。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法进一步包括：
（1）以校准品为待测样品，实施步骤（A）-（E），测定不同浓度对应的发光强度，其中，所述校准品包含不同梯度的ADAMTS13酶活性；
（2）根据所述发光强度绘制ADAMTS13酶活性-发光值标准曲线；
（3）根据所述ADAMTS13酶活性-发光值标准曲线，获取未知待测样品中的ADAMTS13酶活性。
15.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述磁性微粒的粒径不大于10μm。
16.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述磁性微粒的粒径为0.5-10μm。
17.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述标记物包括生物酶、荧光素、化学发光标记物中的任意一种。
18.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，所述生物酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少之一。
19.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺及其衍生物中的至少之一。
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| CN202410044447.2A CN117554615A (zh) | 2024-01-12 | 2024-01-12 | 一种adamts13酶活性发光免疫检测方法及adamts13酶活性检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410044447.2A CN117554615A (zh) | 2024-01-12 | 2024-01-12 | 一种adamts13酶活性发光免疫检测方法及adamts13酶活性检测试剂盒 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118011015A (zh) * | 2024-04-08 | 2024-05-10 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种维生素k2发光免疫检测方法及维生素k2检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008131908A (ja) * | 2006-11-29 | 2008-06-12 | Mitsubishi Kagaku Iatron Inc | フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析方法 |
| US20090075298A1 (en) * | 2005-05-20 | 2009-03-19 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Method of analyzing enzyme |
-
2024
- 2024-01-12 CN CN202410044447.2A patent/CN117554615A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090075298A1 (en) * | 2005-05-20 | 2009-03-19 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Method of analyzing enzyme |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118011015A (zh) * | 2024-04-08 | 2024-05-10 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种维生素k2发光免疫检测方法及维生素k2检测试剂盒 |
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