CN117363537A - 一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株Wt-1及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株Wt‑1及其应用，属斯坦纳利伯克霍尔德氏菌，保藏编号：CGMCC NO.27262，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。利用菌株Wt‑1防治猕猴桃溃疡病的方法为：将菌株Wt‑1接种至LB培养基中进行培养，获得发酵种子液后再扩大培养，最后配成稀释液喷洒植株。该菌株是从采集的健康猕猴桃植株中分离纯化获得的内生细菌，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种有很强的拮抗作用，能够明显抑制该病原菌的生长，可以有效防治猕猴桃溃疡病，为猕猴桃溃疡病生物防治提供了新的微生物种质资源。
Description
技术领域
本发明属于植物保护的生物防治技术领域，具体指一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株Wt-1及应用该菌株防治猕猴桃溃疡病的方法。
背景技术
猕猴桃（Actinidia Lindl）是隶属猕猴桃科猕猴桃属的多年生藤本植物，别称毛桃、羊桃、奇异果（Kiwifruit）。其果实含有丰富的膳食纤维、维生素、矿质元素、氨基酸以及生物活性物质，尤其Vc含量高（100 g鲜果肉中达90~420 mg），素有“水果之王”的美誉；猕猴桃可以鲜食，也可加工成果酱、果汁等，还有重要的医疗保健价值，具有广阔的市场前景。
近些年来，猕猴桃产业已在全球30多个国家迅猛发展，栽培总面积约20万公顷，产量达240万吨，其中中国猕猴桃栽培面积和产量最大，分别占世界份额的53%和38%，意大利次之，新西兰位列第三。随着猕猴桃种植面积逐年增加和生产规模逐渐扩大，猕猴桃病害问题也日益突显。其中最典型的是猕猴桃细菌性溃疡病，该病由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）引起，主要危害猕猴桃的主干、枝蔓和叶片等，具有传播迅速、致病性强、防治难度大等特点，极易短期内造成树体大面积死亡。该病于1984年在日本首次发现，现已在美国、日本、意大利、新西兰、韩国和智利等国家以及中国陕西、重庆、四川和湖南等地区发生，给世界猕猴桃产业造成巨大的经济损失。如新西兰2010~2014年因猕猴桃溃疡病减少出口损失达9300亿新西兰元，中国仅2013年猕猴桃溃疡病损失累计3.23亿元。中国、新西兰、美国和欧洲植物保护组织(EPPO)已分别将猕猴桃溃疡病菌列为植物检疫对象和A2类检疫性有害生物，以控制该病害的迅速蔓延。
目前，控制猕猴桃溃疡病的措施除了科学规范的农业管理外，主要包括优良抗性品种选育、化学防治和生物防治，其中生物防治具有环境友好、人畜安全、可持续性、对病原菌特异性强等特征，符合人们对绿色食品的需求而受到众多学者青睐。邵宝林等（2015）从猕猴桃根际土壤获得生防芽孢杆菌B2，盆栽和田间试验均表现出一定的防治溃疡病功效；崔丽红等（2017）从绞股蓝根际土壤获得细菌（JDG6、JDG16、JDG23）能够明显减轻猕猴桃果园溃疡病的发生；Kim等（2019）从猕猴桃根际和叶围分离到3株放线菌，对其溃疡病具有显著防治效果；Wicaksono等（2018）从药用植物Mānuka分离到3株抑制溃疡病菌Psa的内生细菌，能一定程度减轻美味和中华猕猴桃中溃疡病发生等。虽然有关猕猴桃溃疡病的生物防治研究取得了一些成绩，但仍然存在严重不足：目前多数生防菌株来源于土壤、猕猴桃根际和叶围，应用过程中极易受到环境因素（气候、温湿度、土壤性质等）影响，生防效果不稳定和不理想。由于内生微生物对宿主植物的选择具有特异性，且不易收到外界环境因子的干扰。故此，研发猕猴桃土著内生细菌作为其溃疡病生防菌株具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服现有技术的不足，提供一种猕猴桃土著内生细菌，该细菌是猕猴桃溃疡病致病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，运用该菌株能高效防治猕猴桃溃疡病；同时，本发明还提供了运用该菌株生物防治猕猴桃溃疡病的方法。
本发明人在湖南湘西地区猕猴桃种植园采样点，采集健康的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株枝条和叶片，放入冰盒中带回实验室，从该样品中分离、筛选得到1株抑制猕猴桃溃疡病致病菌生长的内生细菌菌株，即丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，经鉴定后命名为斯坦纳利伯克霍尔德氏菌Wt-1（Burkholderia stagnalis Wt-1），并进行了保藏，保藏编号：CGMCC NO. 27262，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述菌株Wt-1的分离和筛选步骤包括：
（1）以湖南湘西地区猕猴桃溃疡病频发的种植园为采样点，采集健康的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株的枝条和叶片，放入冰盒中带回实验室备用。将枝条和叶片样品进行表面消毒，剪切成合适大小放入灭菌后的研砵中，加入5-10 mL无菌水进行研磨。静置5-10min，吸取上层液体，依次进行10-1倍、10-2倍、10-3倍梯度稀释；分别取0.1 mL稀释液涂布于LB培养基固体平板，每个稀释度重复3次，于28℃倒置培养。
（2）待涂布的平板上长出单菌落，挑取不同形态的菌落，采用四区划线法分别接种于LB固体培养基上培养；重复纯化3代，转接于LB固体培养基斜面试管培养后4℃保存。
（3）将猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种接种至LB液体培养基培养24 h，吸取菌液涂布于LB固体培养基平板中备用。挑取分离的内生细菌单菌落点种于该平板上，每个平板接种3~4个位点，于28℃恒温培养，观察抑菌情况，产生抑菌圈的即为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株。
（4）将初筛的拮抗菌株发酵培养，离心后吸取200 mL发酵液，移入涂布有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种平板的牛津杯中，观察牛津杯周围抑菌圈的大小，筛选拮抗效果强的菌株。基于形态学和16S rRNA基因序列分析鉴定菌种。
获得的拮抗丁香假单胞菌猕猴桃致病变种效果优良的内生细菌即为猕猴桃溃疡病的生防菌株，可用于猕猴桃溃疡病的生物防治，其步骤为：
（1）将上述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株接种至液体LB培养基中进行培养，获得发酵种子液；
（2）将发酵种子液接种至液体LB培养基进行扩大培养，得到发酵培养液。
（3）将发酵培养液配成一定浓度稀释液（包含菌体，细菌浓度≥1.5×103 cfu/mL，即每毫升细菌菌落总数大于等于1500个），对准猕猴桃植株喷洒，即可实现猕猴桃溃疡病的有效防治。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的猕猴桃溃疡病生防菌株Wt-1，是猕猴桃土著内生菌株，即猕猴桃溃疡病致病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株，经鉴定后命名为斯坦纳利伯克霍尔德氏菌Wt-1（Burkholderia stagnalis Wt-1）。
该菌株是从采集的猕猴桃植株枝条中分离纯化获得的内生细菌，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种有很强的抑制作用，能够明显抑制猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的生长与繁殖，可有效防治猕猴桃溃疡病发生，为猕猴桃溃疡病生物防治提供了新的微生物种质资源。
由于该菌株为猕猴桃内生细菌，可与植物组织互利共生，受外界环境因子干扰小，性能稳定，喷湿方便，防治猕猴桃溃疡效果显著，为猕猴桃溃疡的防治提供了一条环保、简洁、有效的方法，利于环境保护和有机猕猴桃的生产。
具体实施方式
现结合具体实施例对猕猴桃溃疡病生防菌株Wt-1及应用菌株Wt-1防治猕猴桃溃疡病的方法进一步具体说明。
2021年2月，以湖南湘西地区猕猴桃种植园为采样点，经纬度N26°36'31E114°07'33，采集未染病的“米良1号”和“红阳”猕猴桃植株枝条和叶片样品，放入冰盒中带回实验室备用。依次用75%乙醇浸泡1 min、1%次氯酸钠5 min、75%乙醇1 min分别对枝条和叶片样品进行表面消毒，剪切成合适大小放入灭菌后的研砵中，加入5-10 mL无菌水进行研磨。静置5-10 min，吸取上层液体，依次进行10-1倍、10-2倍、10-3倍梯度稀释。分别取0.1 mL 各梯度稀释液涂布于LB培养基平板，每个稀释度重复3次，于28℃恒温培养箱中倒置培养1−2 d，待涂布的平板上长出单菌落；挑取不同形态的菌落，采用四区划线法分别接种于LB固体培养基上培养；反复纯化3代，转接LB固体培养基试管斜面培养后保存于4℃冰箱内。
将猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种隔夜培养后取50 μL菌液，涂布于LB培养基上备用。挑取分离的内生细菌单菌落点种于该平板上，每个平板接种3~4个位点，于28℃恒温培养，2-3 d后观察抑菌情况，产生抑菌圈的即为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株。
将抑菌活性较强菌株接种至5 mL LB液体培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养24 h制成种子液，随后取100 μL接入50 mL LB液体培养基中，于28℃、180 r/min培养发酵48 h，将发酵液移入无菌离心管中，4℃、10000 r/min离心10 min，离心后用0.22 μm微孔滤膜过滤器上清备用。同时，将病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种隔夜培养，取50 μL菌液涂布于LB培养基上备用。
将牛津杯放置于涂有病原菌的平板上，取上清液200 μL移入牛津杯中，每株菌重复3次，于28℃恒温培养，2-3 d后观察抑菌情况，得到一株抑菌圈直径达与菌落直径比为1.5倍的优良菌株。
该菌株在LB培养基培养24 h，菌落较小（1~2 mm），乳白色，圆形，边缘光滑完整，中心凸起，菌落不透明。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株总DNA，利用细菌通用引物PA/PB（PA: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC A G-3'；PB: 5'-TTAAGGTGATCCA GCCGCA-3'）对分离菌株的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，反应体系为：Taq PCR Mix (2×) 25 μL；正反引物各1 μL；模板2 μL；无菌水补齐至50 μL。PCR程序为：95℃预变性2.5 min；95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃后延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验后，送生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。将测得的序列提交GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库，采用Blast工具软件搜索同源序列并进行比对，运用Mega7.0软件的邻位加入法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树，根据系统发育关系分析，将菌株鉴定和命名为斯坦纳利伯克霍尔德氏菌Wt-1（Burkholderia stagnalis Wt-1），并进行了保藏，保藏编号：CGMCC NO. 27262，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
将上述猕猴桃溃疡病生防菌株，用于猕猴桃溃疡病的生物防治，具体实施步骤为：
将菌株Wq-1接种至100 mL LB液体培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养24 h，获得发酵种子液；将发酵种子液按1%接种量接种至1 L LB液体培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养，当OD 600达到1.0时收获发酵培养液。
将发酵培养液配成一定浓度稀释液（包含菌体，细菌浓度约为1570 cfu/mL，即每毫升细菌菌落总数约1570个）作为处理组1，1.6%噻唑酮800倍稀释液作为处理组2，72%农用链霉素800倍稀释液作为处理组3，无菌清水为对照组（处理组4）。田间药效试验：选取4个树龄3~5 a生红阳猕猴桃园，在每个果园随机划分4个小区用于4个处理，每个处理50株，4个果园即4个重复，每组共调查200株猕猴桃。在秋季采果后至落叶前的关键时期，以每个处理对应的药剂进行猕猴桃全株喷雾，喷施3次，间隔10 d。在春季猕猴桃溃疡高发期（2~3月）统计各处理组中枝干、黄褐色或锈红色溃疡发病株占处理总株数的百分比，并以此为溃疡发病率即病株率，按照下式计算不同处理的田间防病效果。
防病效果=(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100%
经过统计，发现菌株Wt-1组（处理组1）的田间药效试验平均抑制率达89.5%，1.6%噻唑酮800倍稀释液组（处理组2）的田间药效试验平均抑制率为75.6%，72%农用链霉素800倍稀释液组（处理组3）的田间药效试验平均抑制率为69.7%。
进一步田间防治试验证明：当菌株Wt-1发酵培养液浓度达2.5×103 cfu/mL时，其猕猴桃溃疡病防治效果大大增强，平均抑制率可达93.4%，远远高于1.6%噻唑酮800倍稀释液和72%农用链霉素800倍稀释液。由此可见，斯坦纳利伯克霍尔德氏菌Wt-1对猕猴桃溃疡病的防治效果十分理想，是一株优良的猕猴桃溃疡病生防菌株。
Claims (2)
1.一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株Wt-1，属斯坦纳利伯克霍尔德氏菌（Burkholderia stagnalis），是猕猴桃溃疡病的生物防治菌株，保藏编号：CGMCC NO.27262，保藏日期：2023年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种利用丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的拮抗菌株Wt-1防治猕猴桃溃疡病的方法，其特征在于包括以下几个步骤：
（1）将菌株Wt-1接种至LB液体培养基中进行培养，获得发酵种子液；
（2）将发酵种子液接种至LB液体培养基中扩大培养，得到发酵培养液；
（3）将发酵培养液配成一定浓度稀释液（菌体浓度≥1.5×103cfu/mL），对准猕猴桃植株喷洒。
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