CN110628687B - 链霉菌5017及其在拮抗植物病原菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株链霉菌5017，其特征在于保藏编号为CCTCC NO：M2019648，分类命名为Streptomyces sp.B5017。试验表明，本发明海洋来源的链霉菌新菌种具有拮抗多种植物病原菌的功效，对香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种或链格孢菌等均有抑制作用。由本发明链霉菌5017制成的发酵液，在盆栽实验中能够有效避免香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种引起的叶片枯黄凋萎，证明了该链霉菌5017能有效防治香蕉枯萎病，增强香蕉的抗病性，具有良好的生态效益和社会效益，作为生防制剂开发具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一株链霉菌5017及其在拮抗植物病原菌中的应用。
背景技术
香蕉作为世界第二大水果作物，富含钾、镁和粗纤维，营养丰富，同时也是世界贸易第一大宗水果，具有很高的经济价值。由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense.Foc)引起的香蕉枯萎病由于传播速度快、发病迅速、危害严重，限制了香蕉的种植和可持续发展。目前，尚无有效的防治方法和化学药剂能够彻底防治该病。长期使用化学杀菌剂极易破坏土壤的生态环境，促使病原菌产生耐药性，危害人类健康。
近年来应用微生物防治香蕉枯萎病已被证实安全有效，特别是有益微生物的使用，不仅能改良土壤环境，还对植株的生长起促进作用。目前，使用最多的生防菌来源于链霉菌属(Streptomyces)，该菌属的细菌能够生产多种多样的活性化合物，抗生素和胞外酶，据报道有将近90％的抗生素由链霉菌产生。第一株链霉菌自1891年被发现以来，至今链霉菌属已包含超过1000种细菌。链霉菌在自然界中分布广泛，主要来源于土壤、淡水和海洋。目前,国家大力提倡充分利用海洋微生物资源和积极推广生物防治措施，因此从近海海洋细菌中筛选出能够拮抗多种植物病原菌的海洋细菌,并将其作为菌肥应用于生物防治对于海洋资源利用及生防菌剂的开发具有重要意义。然而，现下使用陆地来源的链霉菌应用于生防领域的研究较多，而使用海洋来源的链霉菌作为生防制剂应用于拮抗植物病原菌，特别是香蕉枯萎病方面的研究相对较少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株链霉菌5017及其在拮抗植物病原菌中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株链霉菌5017，保藏编号为CCTCC NO：M2019648，分类命名为Streptomycessp.B5017(以下简称链霉菌5017)。
上述链霉菌5017，其16S rRNA基因具有序列表SEQ.ID.NO.3的碱基序列。
上述链霉菌5017在拮抗植物病原菌中的应用。
植物病原菌为香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种或链格孢菌。
上述链霉菌5017在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
上述链霉菌5017的发酵液在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
植物病原菌为香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种。
发酵液按以下制备：将链霉菌5017接种至ISP2固体培养基上培养5天，然后将固体培养基上的菌块接种至ISP2液体培养基中，在28℃下培养5天，收集发酵液。
发酵液的使用方法，将发酵液施用于被香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种侵染的香蕉苗上。
发酵液稀释50倍后施用，每隔五天施用一次。
发明人从广西钦州北部湾红树林植物根际土壤中分离得到一菌株，经鉴定为链霉菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019648，分类命名为Streptomyces sp.B5017。试验表明，本发明海洋来源的链霉菌新菌种具有拮抗多种植物病原菌的功效，对香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种和链格孢菌等均有抑制作用。由本发明链霉菌5017制成的发酵液，在盆栽实验中能够有效避免香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种引起的叶片枯黄凋萎，证明了该链霉菌5017能有效防治香蕉枯萎病，增强香蕉的抗病性，具有良好的生态效益和社会效益，作为生防制剂开发具有很好的应用前景。
附图说明
图1是链霉菌5017在ISP2培养基上生长的菌落形态图。
图2是基于16S rRNA基因序列构建的Streptomyces sp.B5017系统发育树。
图3是链霉菌5017对香蕉尖孢镰刀菌4号小种抑制活性检测图。
图4是链霉菌5017对香蕉尖孢镰刀菌1号小种抑制活性检测图。
图5是链霉菌5017对香蕉炭疽菌抑制活性检测图。
图6是链霉菌5017对芒果炭疽菌抑制活性检测图。
图7是链霉菌5017对珍珠李炭疽菌抑制活性检测图。
图8是链霉菌5017对葡萄座腔菌抑制活性检测图。
图9是链霉菌5017对链格孢抑制活性检测图。
图10是在盆栽实验中使用不同处理方法的香蕉植株茎部病变程度图。
图11是链霉菌5017发酵液稀释50倍后对被侵染香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种的香蕉植株的生防结果图。
图3至图9中：a为植物病原菌，b为链霉菌5017。
保藏信息说明
Streptomyces sp.B5017，保藏编号为CCTCC NO：M2019648，保藏日期：2019年08月19日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
具体实施方式
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1菌株的分离与纯化
收集广西北部湾红树林植物根际土壤(距离根须5mm以内)，称取2.0g土壤样品装于20ml无菌水(内有玻璃珠)的锥形瓶中，手动摇匀；依次制成10-2和0-3稀释度的样液。取200μl样品置于6种不同培养基中进行涂布，放入28℃培养箱中培养20天，观察菌落形态特征，挑取菌落进行纯化。纯化后的菌株置于20％(v/v)甘油中，-80℃冷冻保藏。
供试植物病原菌菌株香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号和1号以及链格孢菌均由广西农业科学研究院提供。
1.1.2供试培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、水1000ml。
ISP2琼脂培养基：麦芽糖2.0g，酵母提取物2.0g，葡萄糖2.0g，琼脂16.0g，去离子水1000ml，pH7.2-7.4。
2.菌株的分类鉴定
2.1 Streptomyces sp.B5017的16S rRNA基因序列的测定
2.1.1 Streptomyces sp.B5017 DNA的提取
将纯化后的菌株5017接种到ISP2液体培养基中，28℃摇床培养3天，离心(10000rpm，4℃)收集菌体，采用bio-Teke DNA抽提试剂盒提取基因组总DNA。
2.1.2 PCR扩增
采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ.ID.NO.1)和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ.ID.NO.2)对DNA进行扩增，PCR反应体系总体积为25μl，扩增条件为95℃，8min；58℃，45s；72℃，90s。经过测序后，获得长度为1573bp的序列(SEQ.ID.NO.3)。
2.1.3序列比对
所得序列在NCBI网站使用Blast进行细菌同源性比对分析，确定菌株5017隶属于Streptomyces菌属，与标准模式菌Streptomyces owasiensis NBRC 13832、Streptomycesmalaysiense MUSC136、Streptomyces misionensis DSM40306和Streptomycesphaeoluteichromatogenes NRRL5799同源性分别为99.86％、99.60％、99.59％和99.44％，以16S rRNA序列使用MEGA 7.0软件通过最大似然估计(Maximum-likelihood)方法建立系统进化树，该菌株独自处在一个分支上，表明该菌种作为新菌种的可能性极高。因此，从分类学角度暂命名为链霉菌(Streptomyce sp.)5017。
如图2所示，基于Streptomyces sp.B5017的16S rRNA并以最大释然法建立的进化树。以Bacillus cereus S13作为外群体(outgroup)。其BLAST比对结果如表1所示。
表1菌株Streptomyces sp.B5017的16S rRNA基因测序BLAST比对结果
2.2生理生化测定
Streptomyces sp.B5017在ISP2培养基上培养3天后，菌落为白色或浅灰色，粉状，有孢子生成。通过使用R2A培养基并改变细菌的培养温度、pH以及NaCl含量，测出菌体生长温度范围在15-37℃，最适生长温度是28℃；pH生长范围为4.0-10.0，最佳值为7.0，可耐受0-10％NaCl。
使用Biolog菌种鉴定仪GNIII测试板、API 50和API ZYM试纸条，检测链霉菌Streptomyces sp.B5017能利用的碳源以及各种酶活性，结果如表2。
表2 Streptomyces sp.B5017碳源利用及酶活性情况
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
综合16S rRNA序列分析、系统发育分析、生理生化分析结构，本发明提供的Streptomyces sp.B5017疑似链霉菌属的一株典型的细菌新种，将其暂命名为Streptomyces sp.B5017(简称链霉菌5017)。该菌已于该菌株已2019年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No.M2019648。
3.Streptomyces sp.B5017抑菌活性检测
3.1采用平板对峙培养法对菌株Streptomyces sp.B5017的广谱抗性进行鉴定。
将不同植物病原菌分别接种在PDA培养基的中心，Streptomyces sp.B5017接种在距病原菌菌丝块2～3cm处，每平板接种两个Streptomyces sp.B5017菌株，以不接任何Streptomyces sp.B5017菌株的病原菌为对照，每个菌株三次重复，28℃恒温培养7天后，测定对照病原菌菌落直径和处理病原菌菌落，并计算Streptomyces sp.B5017拮抗病原菌的抑菌率。
抑菌率＝(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直接×100％
抑菌活性检测结果如图3至图9所示(其中a为植物病原菌，b为链霉菌5017)，抑菌率如表3所示。
表3链霉菌5017对不同植物病原菌的抑制作用
由表3可知，Streptomyces sp.B5017对上述病原菌均具有抑制作用，对于综合防控植物病害，具有一定应用价值。
3.2 Streptomyces sp.B5017菌株发酵液对香蕉尖孢镰刀菌4号小种和1号小种的防治效果
盆栽试验检测Streptomyces sp.B5017菌株发酵液对香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种的防治效果，光照培养箱的培养条件为26℃～28℃，选取长势一致的香蕉苗，营养钵装土500g/钵，将香蕉苗栽入其中。试验设2个处理，1)空白处理：施用清水；2)对照组-同时侵染：香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种分别接种至无菌的燕麦中培养5天，将香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种的燕麦与土壤混合；将靠近根部的香蕉植株的茎部处用灭菌剪刀划开，制造伤口，并栽种于混有香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种的土壤中，施用清水；3)实验组：香蕉植株处理方法与对照组相同，并施用稀释50倍的Streptomyces sp.B5017发酵液原液。各处理设3个重复，每个重复5株香蕉苗；空白组和对照组每次每盆植株施用100ml清水，实验组每次每盆植株施用100ml稀释50倍后的Streptomyces sp.B5017发酵液原液，每5d浇水一次。在香蕉移栽第60天时，记录各处理香蕉尖孢镰刀菌4号和1号小种的发病率。
病情指数＝Σ(发病数×级数)×100/(调查总数×最高级别)
病情分级：0级为无病状；1级为整株叶片只有最下部1片叶片发黄轻度萎蔫，嫩叶完好；2级为1-2片叶片变黄萎蔫；3级为全株1/3-1/2叶片变黄萎蔫；4级为全株1/2-3/4叶片变黄萎蔫；5级为全株3/4以上叶片变黄萎蔫或整株死亡。
防病效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)*100/对照病情指数表4菌株链霉菌5017发酵液对香蕉苗抗病性的影响
序列表
<110> 广西科学院
<120> 链霉菌5017及其在拮抗植物病原菌中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1573
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgcctgca ggtcgacgat taaggaggtg atccaaccgc accttccggt acggctacct 60
tgttacgact tcgtcccaat cgctggtccc accttcgaca gctccctccc acaaggggtt 120
gggccaccgg cttcgggtgt taccgacttt cgtgacgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 180
cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat ctgcgattac tagcgactcc gacttcatgg 240
ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt ttgagattcg ctccacctca 300
cggtatcgca gctcattgta ccggccattg tagcacgtgt gcagcccaag acataagggg 360
catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc tccgagttga ccccggcggt ctcccgtgag 420
tccccagcac cacaagggcc tgctggcaac acgggacaag ggttgcgctc gttgcgggac 480
ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacagccatg caccacctgt acaccgacca 540
caaggggggc actatctcta atgctttccg gtgtatgtca agccttggta aggttcttcg 600
cgttgcgtcg aattaagcca catgctccgc cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 660
agttttagcc ttgcggccgt actccccagg cggggcactt aatgcgttag ctgcggcacg 720
gacaacgtgg aatgttgccc acacctagtg cccaccgttt acggcgtgga ctaccagggt 780
atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagtatcgg cccagagatc 840
cgccttcgcc accggtgttc ctcctgatat ctgcgcattt caccgctaca ccaggaattc 900
cgatctcccc taccgaactc tagcctgccc gtatcgactg cagacccggg gttaagcccc 960
gggctttcac aaccgacgtg acaagccgcc tacgagctct ttacgcccaa taattccgga 1020
caacgctcgc gccttacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gcgcttcttc 1080
tgcaggtacc gtcactttcg cttcttccct gctgaaagag gtttacaacc cgaaggccgt 1140
catccctcac gcggcgtcgc tgcatcaggc tttcgcccat tgtgcaatat tccccactgc 1200
tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccggtcg ccctctcagg 1260
ccggctaccc gtcgtcgcct tggtgagccg ttacctcacc aacaagctga taggccgcgg 1320
gctcatcctg caccgccgga gctttacacc atcaaggatg cccaagatgg tcatatccgg 1380
tattagaccc cgtttccagg gcttgtccca gagtgcaggg cagattgccc acgtgttact 1440
cacccgttcg ccactaatcc accccgaagg gcttcatcgt tcgacttgca tgtgttaagc 1500
acgccgccag cgttcgtcct gagccatgat caaactctaa tctctagagg atccccgggt 1560
accgagctcg aat 1573
Claims (6)
1.一株链霉菌（Streptomyces sp.）B5017，其特征在于保藏编号为CCTCC NO：M2019648。
2.权利要求1所述链霉菌（Streptomyces sp.）B5017在拮抗植物病原菌对植物致病中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种或链格孢菌。
3.权利要求1所述链霉菌（Streptomyces sp.）B5017在制备植物病原菌抑制剂中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种或链格孢菌。
4.权利要求1所述链霉菌（Streptomyces sp.）B5017的发酵液在制备植物病原菌抑制剂中的应用，其特征在于：所述植物病原菌为香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号小种、香蕉尖孢镰刀菌1号小种或链格孢菌；所述发酵液按以下制备：将链霉菌（Streptomyces sp.）B5017接种至ISP2固体培养基上培养5天，然后将固体培养基上的菌块接种至ISP2液体培养基中，在28℃下培养5天，收集发酵液。
5.权利要求1所述链霉菌（Streptomyces sp.）B5017的发酵液的使用方法，其特征在于将发酵液施用于被香蕉尖孢镰刀菌4号小种和香蕉尖孢镰刀菌1号小种侵染的香蕉苗上；所述发酵液按以下制备：将链霉菌（Streptomyces sp.）B5017接种至ISP2固体培养基上培养5天，然后将固体培养基上的菌块接种至ISP2液体培养基中，在28℃下培养5天，收集发酵液。
6.根据权利要求5所述链霉菌（Streptomyces sp.）B5017的发酵液的使用方法，其特征在于：所述发酵液稀释50倍后施用，每隔五天施用一次。
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