CN117257782A - 美利曲辛在逆转奥希替尼耐药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了美利曲辛在逆转奥希替尼耐药中的应用。本发明首次发现美利曲辛或者美利曲辛联合奥希替尼可以抑制肺癌细胞增殖和克隆形成能力，同时提高肺癌细胞胞内ROS水平。美利曲辛联合奥希替尼具有协同作用，可以显著增强奥希替尼对PC9/OR细胞的细胞凋亡能力，并且显著提高肺癌细胞胞内ROS水平，以进一步促进肺癌细胞凋亡，增强其对肺癌(尤其是非小细胞肺癌)的治疗效果。本发明首次发现美利曲辛对肺癌奥希替尼获得性耐药具有逆转作用，为克服奥希替尼耐药提供了新方法和新策略，同时提供了一种美利曲辛的新应用。

Description

美利曲辛在逆转奥希替尼耐药中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种美利曲辛在逆转奥希替尼耐药中的应用。

背景技术

肺癌是全世界发病率与死亡率均较高的恶性肿瘤。其中，约80～85％为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)等分子靶向药物使得NSCLC的临床治疗获得了突破性进展。

奥希替尼(Osimertinib,Osi)是首个获得美国FDA批准上市的第三代EGFR-TKI，可选择性地与敏感突变型及T790M耐药突变型EGFR发生不可逆结合，阻断下游信号传导而达到抗肿瘤的目的。鉴于其良好的临床疗效与安全性，该药被推荐用于EGFR突变阳性NSCLC患者的一线治疗。

然而奥希替尼也存在获得性耐药，从而导致治疗失败、疾病进展。获得性耐药原因非常复杂，目前已发现的分子机制主要包括两大类：EGFR依赖性机制，如EGFRC797S突变等；EGFR非依赖性机制，如c-MET、HER2等代偿性信号通路建立以及病理组织类型转化等。为了克服奥希替尼耐药、增强其疗效，目前已有研究表明，帕比司他、阿司匹林及姜黄素对NSCLC细胞EGFR-TKI药物获得性耐药具有一定的逆转作用，但是安全性更高、疗效稳定、有效性更好的药物逆转剂还有待被进一步探索发现。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种对肺癌奥希替尼获得性耐药具有逆转作用的逆转药物。

为了实现上述发明目的，本发明包括如下技术方案。

第一方面，本发明提供了美利曲辛在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述肺癌为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

在其中一些实施例中，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

第二方面，本发明提供了美利曲辛联合奥希替尼在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述肺癌为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

在其中一些实施例中，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

第三方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗肺癌的联合用药物，其活性成分包括美利曲辛和奥希替尼，所述美利曲辛和奥希替尼分别成为独立的给药单元，或所述美利曲辛和奥希替尼共同形成组合的给药单元。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为0.5-5：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1-3：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1.5-2.5：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1.8-2.2：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为2：1。

在其中一些实施例中，所述肺癌为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

在其中一些实施例中，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

第四方面，本发明还提供了美利曲辛在制备用于逆转肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

第五方面，本发明还提供了一种肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转方法，采用逆转药物与奥希替尼联用以实现肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转；所述逆转药物为美利曲辛。

其中，所述美利曲辛和奥希替尼分别为独立的给药单元，或所述美利曲辛和奥希替尼共同形成组合的给药单元，即美利曲辛和奥希替尼可同时给药或者分别给药。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为0.5-5：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1-3：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1.5-2.5：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1.8-2.8：1。

在其中一些实施例中，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为2：1。

在其中一些实施例中，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

本发明首次发现美利曲辛或者美利曲辛联合奥希替尼可以抑制肺癌细胞增殖和克隆形成，同时提高肺癌细胞胞内ROS水平。美利曲辛联合奥希替尼具有协同作用，可以显著增强奥希替尼对PC9/OR细胞的细胞凋亡能力，并且显著提高肺癌细胞胞内ROS水平，以进一步促进肺癌细胞凋亡，增强其对肺癌(尤其是非小细胞肺癌)的治疗效果。

本发明首次发现美利曲辛对肺癌奥希替尼获得性耐药具有逆转作用，为克服奥希替尼耐药提供了新方法和新策略，同时提供了一种美利曲辛在制备预防和/或治疗肺癌的药物，或者在制备肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转药物中的新应用。

附图说明

图1为NSCLC奥希替尼获得性耐药细胞模型的验证结果；其中，

A为CCK8实验检测亲本细胞和耐药细胞的奥希替尼IC50值；

B为q-PCR实验检测ABCB1的基因表达情况；

C为WB实验检测ABCB1的蛋白表达情况。

图2为美利曲辛对PC9/OR细胞活力的影响；其中，

A为美利曲辛的结构式；

B为CCK8实验检测耐药细胞的美利曲辛IC50值；

C为克隆形成实验检测美利曲辛对耐药细胞的克隆抑制能力。

图3为美利曲辛和奥希替尼联合用药方案对PC9/OR细胞的影响；其中，

A为流式细胞术检测细胞凋亡的结果；

B为流式细胞术检测细胞ROS水平的结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

为了克服奥希替尼耐药、增强其疗效，本发明经过大量的研究探索，发现了一种奥希替尼获得性耐药的逆转剂(逆转药物)；本发明的研究结果显示：神经系统药物—美利曲辛，一种具有口服活性的三环类双相抗抑郁药，可显著增强奥希替尼的抗肿瘤能力，具有良好的与奥希替尼联合抗肿瘤的效果。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供了美利曲辛在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。

其中，所述肺癌可以为普通肺癌，也可以为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

进一步优选地，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

在本发明的另一实施方案中，本发明提供了美利曲辛联合奥希替尼在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。

其中，所述肺癌可以为普通肺癌，也可以为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

进一步优选地，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了一种预防和/或治疗肺癌的联合用药物，其活性成分包括美利曲辛和奥希替尼，所述美利曲辛和奥希替尼分别成为独立的给药单元，或所述美利曲辛和奥希替尼共同形成组合的给药单元。即美利曲辛和奥希替尼可同时给药或者分别给药，给药时，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为0.5-5：1，优选为1-3：1，进一步优选为1.5-2.5：1，进一步优选为1.8-2.2：1，更优选为2：1。

其中，所述肺癌可以为普通肺癌，也可以为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

进一步优选地，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

在本发明所述的联合用药物还可以和药物中可接受的辅料制备成预防和/或治疗肿瘤的药物制剂。所述的药物制剂可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。

本发明所述的联合用药物，其剂型不限，只要能够使活性成分有效达到体内的剂型都可以，包括：注射剂、片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、丸剂、粉剂、喷雾剂、滴剂、栓剂、霜剂、贴剂等；优选注射剂型，如：液体注射剂、粉针剂、注射用片剂等；注射形式包括但不限于原药形式、载药纳米粒等；注射部位包括但不限于皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射以及脊椎腔注射等。

在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了美利曲辛在制备用于逆转肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转药物中的应用。

其中，所述肺癌优选为人非小细胞肺癌。

在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了一种肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转方法，采用逆转药物与奥希替尼联用以实现肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转；所述逆转药物为美利曲辛。

其中，所述美利曲辛和奥希替尼分别为独立的给药单元，或所述美利曲辛和奥希替尼共同形成组合的给药单元，即美利曲辛和奥希替尼可同时给药或者分别给药。给药时，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为0.5-5：1，优选为1-3：1，进一步优选为1.5-2.5：1，进一步优选为1.8-2.2：1，更优选为2：1。

其中，所述肺癌优选为人非小细胞肺癌。

本发明通过药物大剂量冲击法诱导奥希替尼耐药细胞模型，利用CCK-8检测不同细胞中奥希替尼的IC50值，计算耐药系数，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)实验和蛋白免疫印迹实验(Westernblotting,WB)检测多药耐药基因ABCB1的表达水平，对奥希替尼耐药细胞模型是否构建成功进行了验证。在此基础上，通过CCK-8、流式细胞术、细胞克隆形成实验，评估了美利曲辛以及美利曲辛和奥希替尼联合用药的抗肿瘤效果，并通过CI值确定其协同作用。同时通过RNA-seq检测联合用药与单独用药后耐药株中差异变化。本发明经过这些科学实验证明了：美利曲辛联合奥希替尼可以显著抑制人肺腺癌PC9细胞诱导的奥希替尼获得性耐药细胞模型PC9/OR的增殖能力，同时升高细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平，促进细胞凋亡。

以下为实施例中所用材料：

RPMI1640培养基、青霉素-链霉素(100X)购于美国Gibco公司；

胎牛血清购于中国苏州依科赛生物科技股份有限公司；

奥希替尼(T2490)，美利曲辛(T4274)购于中国上海陶术生物科技有限公司；

H2DCFDA(HY-D0940)购于美国MCE公司；

CCK-8试剂盒(FD3788)购于中国杭州弗德生物科技有限公司；

细胞凋亡检测试剂盒(KGA105)购于中国江苏凯基生物技术股份有限公司。

以下为具体实施例。

实施例1NSCLC奥希替尼获得性耐药细胞模型的建立和验证

1、细胞培养

人非小细胞肺癌细胞株PC9(EGFR基因第19外显子缺失突变)购于中国医学科学院基础医学研究所。PC9细胞培养于含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

2、耐药模型建立

利用奥希替尼敏感性PC9细胞，按照药物大剂量冲击法，建立奥希替尼获得性耐药细胞株PC9/OR。用10μM浓度奥希替尼处理对数生长期的PC9细胞48h，撤药后细胞恢复生长至80％左右生长密度，为一个冲击循环，经历多次药物冲击循环直至细胞可在含2μM奥希替尼培养液中稳定生长，即PC9/OR细胞诱导成功。

3、耐药模型验证

(1)采用CCK-8实验检测细胞活力。具体为：

取对数生长期的PC9和PC9/OR细胞，接种于96孔板中(3×10³个细胞/孔)，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度的奥希替尼，于37℃、5％CO₂条件下处理48h后，加入10％的CCK-8检测试剂继续孵育1h，酶标仪检测450nm吸光度，计算细胞半数抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)；细胞存活率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)。

结果如图1中的A所示：奥希替尼在PC9与PC9/OR中的IC50值分别为0.193μM与9.493μM。

(2)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitativepolymerase chainreaction,qPCR)、蛋白免疫印迹实验(Westernblotting,WB)检测细胞中多药耐药基因ABCB1的表达变化。具体为：

取对数生长期的PC9和PC9/OR细胞，接种于6孔板中(2×10⁵个细胞/孔)，于37℃、5％CO₂条件下培养48h后提取细胞RNA和总蛋白，分别进行qPCR、WB实验。

结果如图1中的B(q-PCR实验检测ABCB1的基因表达情况)和C(WB实验检测ABCB1的蛋白表达情况)所示：PC9/OR细胞中的ABCB1表达升高。

以上结果表明：成功建立并获得了奥希替尼获得性耐药细胞株PC9/OR。

实施例2美利曲辛对PC9/OR细胞活力的影响

美利曲辛(Melitracen)是一种具有口服活性的三环类双相抗抑郁药，其结构式如图2中的A所示。美利曲辛通过突触前膜抑制去甲肾上腺素(Norepinephrine)和5-羟色胺(5-HT)的吸收，从而增加突触间隙中单的胺递质的浓度，可用于抑郁和焦虑的治疗。

1、采用CCK-8法检测美利曲辛对PC9/OR细胞活力的影响。具体为：

取对数生长期的PC9/OR细胞，接种于96孔板中(3×10³个细胞/孔)，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度的美利曲辛于37℃、5％CO₂条件下处理24、48h后，加入10％的CCK-8溶液继续孵育1h，酶标仪检测450nm吸光度后，计算细胞半数抑制浓度(halfmaximalinhibitory concentration,IC50)；细胞存活率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)。

结果如图2中的B所示：美利曲辛处理PC9/OR细胞24h和48h的IC50值分别为26.72μM与17.85μM。

2、采用平板克隆形成实验检测美利曲辛对PC9/OR细胞活力的影响。

具体为：

取对数生长期的PC9/OR细胞，接种于6孔板中(1×10³个细胞/孔)，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度的美利曲辛，于37℃、5％CO₂条件下处理48h后，换成不含药物的培养基，继续培养7天。用4％多聚甲醛固定细胞后用结晶紫进行细胞染色。

结果如图2中的C所示：美利曲辛处理PC9/OR细胞48h后，细胞克隆形成能力被明显抑制。

实施例3美利曲辛和奥希替尼联合用药对PC9/OR细胞的影响

1、采用流式细胞术检测细胞凋亡。具体为：

取对数生长期PC9/OR细胞接种于6孔板(2×10⁵个细胞/孔)，培养24h待细胞贴壁后加入10μM美利曲辛、5μM奥希替尼、以及联合药物(10μM美利曲辛、5μM奥希替尼)处理细胞，于37℃、5％CO₂条件下处理24h后收集所有细胞。按照商品化凋亡试剂盒对细胞进行洗涤、固定和染色，最后利用流式细胞仪记录激发波FITC通道和PE通道的荧光强度，以分析细胞凋亡情况。

结果如图3中A所示：联合用药方案明显增强了奥希替尼对PC9/OR细胞的细胞凋亡能力。

2、采用流式细胞术检测细胞的ROS水平。具体为：

取对数生长期PC9/OR细胞接种于12孔板(1×10⁵个细胞/孔)，培养24h待细胞贴壁后加入10μM美利曲辛、5μM奥希替尼、以及联合药物(10μM美利曲辛、5μM奥希替尼)处理细胞，于37℃、5％CO₂条件下处理24h后，弃去原来的培养基，加入含10μM DCFH-DA的培养基(500μL/孔)于37℃下避光染色30min，PBS(500μL/孔)清洗细胞两次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，收集细胞进行流式细胞术，检测FITC通道荧光强度，分析细胞内的ROS水平。

结果如图3中的B所示：联合用药方案明显提高了PC9/OR细胞内的ROS水平。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.美利曲辛在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。

2.美利曲辛联合奥希替尼在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺癌为奥希替尼获得性耐药的肺癌。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

5.一种预防和/或治疗肺癌的联合用药物，其特征在于，其活性成分包括美利曲辛和奥希替尼，所述美利曲辛和奥希替尼分别成为独立的给药单元，或所述美利曲辛和奥希替尼共同形成组合的给药单元。

6.根据权利要求5所述的预防和/或治疗肺癌的联合用药物，其特征在于，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1-3：1；和/或，

所述肺癌为奥希替尼获得性耐药的肺癌；和/或，

所述肺癌为人非小细胞肺癌。

7.根据权利要求6所述的预防和/或治疗肺癌的联合用药物，其特征在于，所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1.5-2.5：1，优选为1.8-2.2：1。

8.美利曲辛在制备用于逆转肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转药物中的应用；优选地，所述肺癌为人非小细胞肺癌。

9.一种肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转方法，其特征在于，采用逆转药物与奥希替尼联用以实现肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转；所述逆转药物为美利曲辛，所述美利曲辛和奥希替尼分别为独立的给药单元，或所述美利曲辛和奥希替尼共同形成组合的给药单元。

10.根据权利要求9所述的肺癌奥希替尼获得性耐药的逆转方法，其特征在于，所述肺癌为人非小细胞肺癌；和/或，

所述美利曲辛和奥希替尼的摩尔比为1-3：1，优选为1.5-2.5：1，更优选为1.8-2.8：1。