CN117089540B - 粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共479个氨基酸，理论分子量为54.46kDa。所述的谷氨酸脱羧酶最适作用pH为5.0，在pH4.0‑8.0范围内处理1h后，剩余酶活高于100％；最适作用温度为60℃，在30，35，40，45，50℃条件下耐受1h，剩余酶活高于100％，该谷氨酸脱羧酶具有良好的热稳定性，是典型的热稳定性酶。在最适条件下，该酶的比活为3106.23U/mg，高于其他微生物来源的谷氨酸脱羧酶。本发明的谷氨酸脱羧酶可应用于重组大肠杆菌全细胞高效合成γ‑氨基丁酸，在工业、食品等方面具有潜在的应用价值。

Description

粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用。

背景技术

谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)是催化L-谷氨酸脱羧获得γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶，属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶。GABA是哺乳动物中枢神经系统的主要抑制性神经递质，与调节突触传递、降低血压、抗氧化等有关。研究证实，肠道微生物产生的GABA与宿主的健康和疾病密切相关，是调节肠-脑-轴通讯的重要神经递质，其介导的神经传递调节宿主的多种疾病。GABA作为一种生物活性因子，被广泛应用于医疗、食品和饲料等行业。

目前利用微生物发酵生产γ-氨基丁酸具有生产周期短、成本低、安全性高的优点，但可培养微生物来源的谷氨酸脱羧酶在热和酸碱条件下不够稳定。因此，从不同环境微生物中获得稳定性强的谷氨酸脱羧酶，不断提高γ-氨基丁酸的转化率，对于高效合成谷氨酸脱羧酶具有重要意义。

基于此，本发明设计了粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用以解决上述问题。

发明内容

针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组载体，包含所述的编码基因。

一种重组菌，包含所述的编码基因。

更进一步的，重组菌株为BL21(DE3)/Xby1_8。

一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括以下步骤：

1)筛选克隆谷氨酸脱羧酶基因；

2)PCR扩增，得到谷氨酸脱羧酶基因；

3)将谷氨酸脱羧酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱导重组谷氨酸脱羧酶表达；

4)回收并纯化所表达的谷氨酸脱羧酶，得到谷氨酸脱羧酶。

更进一步的，从宏基因组中筛选谷氨酸脱羧酶，把宏基因组DNA作为模板进行PCR扩增，得到谷氨酸脱羧酶基因。

更进一步的，以SEQ ID NO.3所示的引物Xby1_8-F和SEQ ID NO.4所示的引物Xby1_8-R进行PCR扩增。

一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶在重组大肠杆菌全细胞合成γ-氨基丁酸中的应用。

有益效果

本发明提供了一种粪便微生物宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共479个氨基酸，理论分子量为54.46kDa。所述的谷氨酸脱羧酶最适作用pH为5.0，在pH4.0-8.0范围内处理1h后，剩余酶活高于100％；最适作用温度为60℃，在30，35，40，45，50℃条件下耐受1h，剩余酶活高于100％，该谷氨酸脱羧酶具有良好的热稳定性，是典型的热稳定性酶。在最适条件下，该酶的比活为3106.23U/mg，高于其他微生物来源的谷氨酸脱羧酶。

本发明的谷氨酸脱羧酶可应用于重组大肠杆菌全细胞高效合成γ-氨基丁酸，在工业、食品等方面具有潜在的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的谷氨酸脱羧酶Xby1_8的SDS-PAGE分析；其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pEASY-E2载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组谷氨酸脱羧酶；3：纯化的谷氨酸脱羧酶；

图2是本发明实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的最适pH结果；

图3是本发明实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的pH稳定性结果；

图4是本发明实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的最适温度结果；

图5是本发明实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的温度稳定性结果；

图6是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适pH结果；

图7是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适温度结果；

图8是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适PLP浓度结果；

图9是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适底物浓度结果；

图10是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适细胞浓度结果；

图11是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适反应时间结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

其中，试验材料和试剂说明：

1、样品、菌株及载体：倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA、表达载体pEASY-E2，实验室保藏；BL21(DE3)购自北京擎科新业生物技术有限公司；

2、基因工程操作酶类、试剂盒及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒为美国Omega公司；其他试剂均为分析纯；

3、LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在以上基础上加2.0％(w/v)琼脂；

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1重组谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8的获得

步骤如下：

1)倭蜂猴粪便微生物宏基因组谷氨酸脱羧酶的筛选；

从已构建倭蜂猴粪便微生物文库中根据基因预测、功能注释和分泌蛋白预测分析结果，筛选注释结果为谷氨酸脱羧酶的基因，从而得到谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8，该基因序列如SEQ ID NO.1所示，基因大小为1440bp；

2)谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8的克隆；

以Xby1_8-F:5'-taagaaggagatatacatatgGAATTGATGAAAGACTCAAATTTCAGAAAT-3'和Xby1_8-R:5'-gtggtggtggtggtgctcgagTTTCTTAGCGTTGCTCATTG-3'为引物对，用所述倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10.0μL)：宏基因组文库DNA 0.5μL，PrimeSTAR Max 5μL，Xby1_8-F0.5μL，Xby1_8-R 0.5μL，ddH2O补足10.0μL；

PCR反应参数为：98℃10s；55℃15s；72℃1min30s；30个循环；72℃10mi n；4℃30min；PCR结果得到目的基因Xby1_8；

实施例2重组谷氨酸脱羧酶Xby1_8的制备

步骤如下：

1)将实施例1制备的谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8与质粒pEASY-E2连接得到重组表达载体pEASY-E2-Xby1_8，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Xby1_8；

2)取含有重组表达载体pEASY-E2-Xby1_8的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Xby1_8，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃180rpm过夜培养；

3)然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃180rpm培养大约2～3h(OD₆₀₀达到0.6～0.8)后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于16℃、150rpm培养大约20h；6000rpm离心10min，收集菌体；

4)用适量的纯水悬浮菌体后，于高压细胞破碎仪破碎菌体；以上胞内浓缩的粗酶液经12，000rpm，4℃离心20min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白，得到谷氨酸脱羧酶Xby1_8；

对所述纯化目的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果参见图1，图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的谷氨酸脱羧酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pEASY-E2载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组谷氨酸脱羧酶3：纯化的重组谷氨酸脱羧酶；

由图1可知，重组谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带；

实施例3重组谷氨酸脱羧酶Xby1_8的性质测定

步骤如下：

酶活性测定方法参照李祥，略有改动(李祥，2021)：酶活测定反应体系为500μL，将PLP和L-谷氨酸溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)中，浓度分别为0.06mmol/L、20mmoL/L，37℃温度下保温5min后加入40μL稀释后的纯酶，迅速混合反应5min后终止酶催化反应，离心后吸取400μL至10mL离心管中，向离心管加入400μL、0.2mol/L硼酸缓冲液(pH9.0)后，依次加入1.0mL、6％的苯酚溶液和1.0mL的次氯酸钠(有效氯气大于7.5)混匀后，沸水浴10min后，冰水中显色20min，待反应液上层出现蓝绿色后，再加入2.0mL、60％的乙醇溶液；最后测量反应液在643nm的吸光值，以加入40μL已失活的酶液作为空白对照；

酶活单位定义为：一个酶活单位(U)即在酶的最适反应条件下，每分钟催化合成1μmol GABA所需的酶量；

3.1重组谷氨酸脱羧酶Xby1_8的最适pH和pH稳定性的测定

酶的最适pH测定：将实施例2纯化的谷氨酸脱羧酶Xby1_8在37℃，pH 3.5-7.0的缓冲液中进行酶促反应；

酶的pH稳定性测定：将实施例2纯化的酶液置于pH 3.0-10.0的缓冲液中，在37℃下处理1h后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照；

缓冲液为：0.1mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄(pH3.0-7.0)；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.0-10.0)以L-谷氨酸为底物，反应5min后灭活，测定纯化的谷氨酸脱羧酶的酶学性质；

结果参见图2和图3，图2为本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶的最适pH，图3为本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶的pH稳定性；由图2和图3可知，本发明提供的谷氨酸脱羧酶的最适pH5.0；经pH 4.0-8.0的缓冲液处理1h后，酶活剩余高于100％；

3.2重组谷氨酸脱羧酶Xby1_8的最适温度及温度稳定性测定

酶的最适温度测定：将实施例2纯化的谷氨酸脱羧酶在pH5.0，于30-90℃下进行酶促反应，比较不同温度条件下的相对酶活，确定最适温度；

酶的温度稳定性测定：将同量的酶液置于设定的温度(30-60℃)中处理1h，每隔10分钟在60℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照；

结果参见图4、图5，图4是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶的最适温度，图5是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶的温度稳定性；结果表明：谷氨酸脱羧酶的最适温度为60℃，在30-50℃条件下保持稳定；

3.3谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA发酵条件的优化

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞培养，将谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌在37℃下进行培养3h后，在16℃、诱导20h，将发酵完成的菌液离心，再用双蒸水悬浮菌体，用紫外分光光度计测定反应体系的细胞浓度，设定波长为600nm，L-谷氨酸作为底物，用于GABA制备及测定，总反应体系为15mL。测定GABA的转化率，计算方法如下式：

y＝M₁/M₂×100％

式中：y为GABA的转化率；M₁为生成GABA的浓度；M₂为底物浓度；

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA最适pH的测定：反应温度37℃、反应1.5h、细胞浓度OD₆₀₀值为3.0，分别测定纯水和pH 2.5-6.5下谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞制备GABA的转化率；

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA最适温度的测定：底物浓度为260mM、反应1.5h，细胞浓度OD₆₀₀值为3.0，反应体系在不同温度(30-60℃)进行反应，分别测定不同温度下谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞制备GABA的转化率；

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA最适PLP浓度的测定：底物浓度为260mM、反应温度55℃、反应1.5h，细胞浓度OD₆₀₀值为3.0，使用不同PLP浓度(0-0.2mM)进行反应，分别测定不同PLP浓度下谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞制备GABA的转化率；

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA最适底物浓度的测定：反应温度55℃、反应1.5h、细胞浓度OD₆₀₀值为3.0，反应体系使用不同底物浓度(160-960mM)进行反应，分别测定不同底物浓度下谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞制备GABA的转化率；

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA最适细胞浓度的测定：底物浓度为260mM、反应温度55℃、反应1.5h，使用不同细胞浓度OD₆₀₀值为(1.0-4.0)进行反应，测定不同细胞浓度下谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞制备GABA的转化率；

谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA最适反应时间的测定：底物浓度260mM、细胞浓度OD₆₀₀值为3.5，反应体系15mL，反应温度55℃、150r/min条件下转化GABA，反应0.5-3.0h，测定不同反应时间下谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞制备GABA的转化率；

结果参见图6、图7、图8、图9、图10、图11；图6是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适pH，图7是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适温度，图8是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适PLP浓度，图9是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适底物浓度，图10是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适细胞浓度，图11是本发明实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适反应时间。结果表明：谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成GABA的最适pH5.0，但在水溶底物体系中合成GABA转化率最高；最适温度为55℃；最适PLP浓度为0.06mM，但PLP为0时与PLP为0.06mM时的转化率相差不多，因此后续试验选择不添加PLP；最适底物浓度为260mM；最适细胞浓度OD₆₀₀值为3.5；最适反应时间2.5h；

3.3.1重组谷氨酸脱羧酶的动力学参数测定

动力学参数在pH5.0、温度60℃条件下，以不同浓度的L-谷氨酸为底物(8-26mM)进行测定，根据Lineweaver-Burk法计算出K_m和V_max值。经测定，在pH5.0及温度60℃条件下该酶的K_m和V_max分别(10.16±1.49)mmol/L和(3574±198.3)U/mg。

3.3.2不同金属离子及化学试剂对重组谷氨酸脱羧酶活力影响测定

在酶促反应体系中加入化学试剂(终浓度为1mM)，研究其对酶活的影响。在60℃，pH 5.0，测定酶活(同样条件下以未加金属离子及化学试剂的酶促反应作为对照)，结果参见表1；

表1可知，在不同金属离子和化学试剂条件下检测酶活，K⁺对该重组酶具有促进作用，Ca²⁺对该酶无明显影响，其他大部分的金属离子对重组酶有不同程度的抑制作用，说明该酶对金属离子的作用敏感；SDS化学试剂对该酶的酶活性抑制作用很强，使酶完全变性，而EDTA、Tween-80对该酶的活性无明显影响；

表1化学试剂对重组谷氨酸脱羧酶的活力影响

3.3.3重组谷氨酸脱羧酶对不同底物降解的测定

分别配制浓度为20mmol/L的L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-谷氨酸钠、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸为底物，按照酶活测定的方法，在37℃下进行特异性活力测定分析。结果表明重组谷氨酸脱羧酶只对L-谷氨酸底物有活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶在重组大肠杆菌全细胞合成γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因编码。