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CN103882014A - 用于固定二氧化碳的构建体、菌株及其制备方法 - Google Patents

用于固定二氧化碳的构建体、菌株及其制备方法 Download PDF

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CN103882014A
CN103882014A CN201210559843.6A CN201210559843A CN103882014A CN 103882014 A CN103882014 A CN 103882014A CN 201210559843 A CN201210559843 A CN 201210559843A CN 103882014 A CN103882014 A CN 103882014A
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ribulose
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CN201210559843.6A
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吕雪峰
杨柳
高政绪
谈晓明
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Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
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Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
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Abstract

本发明涉及用于在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中实现二氧化碳固定和/或减少二氧化碳排放的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)，以及在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中固定二氧化碳和/或减少二氧化碳排放的方法。

Description

用于固定二氧化碳的构建体、菌株及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物质能源领域、生物化学领域和基因工程领域。具体而言，本发明涉及用于在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中实现二氧化碳固定和/或减少二氧化碳排放的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)，以及在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中固定二氧化碳和/或减少二氧化碳排放的方法。
背景技术
能源需求的持续快速增长与能源价格的不断攀升，石化能源供给的不足以及大量使用石化能源所导致的环境污染与气候变化等问题使得发展可再生替代能源迫在眉睫。针对减少对石油资源的依赖、降低二氧化碳排放等问题，以生物质资源利用为基础的、生产生物燃料和生化产品的技术是一个有吸引力和有效的手段。然而，生物燃料和生化产品的生产过程中的二氧化碳排放，使得生物制品的环境友好及“零碳排放”变得有争议。在生物质发酵过程中，由于微生物的代谢性质，二氧化碳排放在本质上是不可避免的。大多数具有活性和功能的生物大分子例如碳水化合物，脂肪和蛋白质在被降解和氧化的过程中，均伴有二氧化碳的产生/释放。例如，在以葡萄糖为底物、厌氧发酵生物质以生产生物制品及衍生糖类时，每产生一分子乙醇都伴有一分子二氧化碳的排放：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2。因此，无论从科学研究的角度，还是从优化工业生产及环境保护的角度来看，解决微生物发酵过程中的二氧化碳排放问题都非常必要。
在植物和自养微生物中，二氧化碳可以被固定并转化为有机生物质。目前已鉴定了六种不同的二氧化碳固定途径，包括例如卡尔文循环、核酮糖-单磷酸途径(Ribolose-Monophosphate Pathway)和丝氨酸途径(Serine Pathway)等(参见，例如图1B)。这些代谢途径存在于不同的生物体系中，并且由光、硫化物、氢等各种能量在厌氧或好氧的环境下提供还原力。
在本申请中，发明人创造性地将原核生物的CO2固定途径引入了异养微生物，从本质上减少了微生物发酵过程中的二氧化碳排放/释放(参见，例如图1C)，从而为解决微生物发酵过程中的二氧化碳排放问题提供了新的思路和手段。
发明内容
相关术语
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学、分析化学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“异养”是相对于“自养”而言的，其具有本领域技术人员所通常理解的含义。通常，“自养微生物”是指，不依赖于任何有机营养物即可正常生活的微生物，“异养微生物”是指，必须依赖于至少一种有机营养物才可正常生活的微生物。自养微生物的一个典型代表是蓝细菌(Cyanobacterium)，例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻(例如集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC6803))。蓝细菌也称为蓝藻，其是能够利用太阳能来固定二氧化碳的光合自养型原核微生物。异养微生物的一个典型代表是大肠杆菌(E.coli)，例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)。大肠杆菌因容易培养、遗传学清晰、生长周期短等优点，已成为最广泛使用且最具有代表性的原核异养微生物。
如本发明中所使用的，磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase,prk)是指，能够催化将5-磷酸核酮糖转化为1,5-二磷酸核酮糖的下述反应的酶(EC2.7.1.19)：
Figure BDA00002626780300031
编码野生型磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19)的基因是本领域公知的，并且可获得自各种公共数据库(例如GENBANK，EXPASY等)。此外，编码磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19)的基因可获自各种来源，例如其可以来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)。
本领域技术人员理解，在野生型磷酸核酮糖激酶基因或其编码的多肽中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能或者活性（即，催化式I的反应）。因此，在本发明中，还可以使用野生型磷酸核酮糖激酶基因的功能性变体。如本发明中所使用的，“基因的功能性变体”是指这样的变体，其与野生型基因在序列上存在差异，但所编码的多肽/蛋白质仍然保留野生型蛋白质的功能或者活性。因此，野生型磷酸核酮糖激酶基因的功能性变体可以是这样的变体，其核苷酸序列与野生型磷酸核酮糖激酶基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质；或者，可以是这样的变体，其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与野生型磷酸核酮糖激酶基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质。
如本发明中所使用的，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco)是指，能够催化将1,5-二磷酸核酮糖和一分子二氧化碳转化为两分子3-磷酸甘油酸的下述反应的酶(EC4.1.1.39)：
编码野生型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39)的基因是本领域公知的，并且可获得自各种公共数据库(例如GENBANK，EXPASY等)。此外，编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39)的基因可获自各种来源，例如其可以来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)。
通常，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶包含2种亚基(即，大亚基rbcL和小亚基rbcS)。然而在一些生物(例如某些藻类，例如集胞藻)中，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶可包含3种亚基(rbcL，rbcS和rbcX)。
此外，本领域技术人员理解，在野生型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因或其编码的多肽中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能或者活性（即，催化式II的反应）。因此，在本发明中，还可以使用野生型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因的功能性变体。例如，野生型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因的功能性变体可以是这样的变体，其核苷酸序列与野生型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质；或者，可以是这样的变体，其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与野生型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质。
如本发明中所使用的，载体(vector)是指能够将DNA片段(例如，目的基因)插入其中从而允许将DNA片段(例如，目的基因)转移到受者细胞中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的DNA片段所编码的蛋白获得表达时，载体也称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
如本发明中所使用的，通常将DNA片段(例如，目的基因)与表达调控序列可操作地连接，以实现DNA片段(例如，目的基因)的组成型或诱导型表达。如本发明中所使用的，“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达调控序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达调控序列对基因编码序列的表达的控制作用。如本发明中所使用的，“表达调控序列”是实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域熟知的。表达调控序列通常包括启动子，常常也包括转录终止序列（即，终止子），并且还可以包含其他序列，如增强子序列。
如本发明中所使用的，“杂交”表示这样一个过程：在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间(则这称为G-C键)形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的(则称为互补序列)，即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。这种杂交也可以是部分的(则称为足够互补的序列)，即获得的双链包含允许形成双链的A-T键和C-G键，且还包含未与互补碱基结合的碱基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。
如本领域已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。术语“严紧杂交条件”是指这样的条件，其中在该条件下彼此杂交的两条核酸序列的同一性为至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，也即，这样的条件，其中，仅在杂交所获得的双链包含至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％的A-T键和C-G键时，能够发生杂交。
“严紧杂交条件”是本领域熟知的，并且取决于多个因素，例如所使用的缓冲液的成分、pH和离子强度，所使用的温度等等。特别地，在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0%到至少大约15%v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-30℃到大约42℃。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少大约16%v/v到至少大约30%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31%v/v到至少大约50%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行：Tm=69.3+0.41(G+C)%(Marmur and Doty,1962)。但是，每增加1%的错配碱基对数目，双链体DNA的Tm下降1℃(Bonner,1983)。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定：低严紧杂交条件是6x SSC缓冲液，1.0%w/v SDS，在25-42℃下；中等严紧杂交条件是2x SSC缓冲液，1.0%w/v SDS，在20℃至65℃的温度下；高严紧杂交条件是0.1x SSC缓冲液，0.1%w/v SDS，在至少65℃的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen,(1993)Labora tory Techniques inBiochemistry andMolecular Biology-Hybridiza tion with Nucleic Acid Probes,第1部分,第2章(Elsevier,New York);和Ausubel等人,编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章（GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York）。还可参见Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)。确定和选择合适的严紧杂交条件完全在本领域技术人员的能力范围之内。
如本发明中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性(最佳比对)时进行比较。序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482,1970)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443,1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444,1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLASTN和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current ProtocolsinMolecular Biology(1995增刊))。例如，最佳比对可通过使用，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar,Inc.）方便地进行的Needleman等人（1970）J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表（weight residue table）、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重（gapweight）和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
本发明的实施方案所涉及的同一性百分数包括至少大约60%，或至少大约65%，或至少大约70%，或至少大约75%，或至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或更高，例如大约95%，或大约96%，或大约97%，或大约98%，或大约99%，例如至少大约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。
本发明的详细描述
本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现：通过在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中引入二氧化碳固定途径(例如磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶)，可以减少异养微生物发酵过程中的二氧化碳排放/释放。
不希望受任何理论束缚，发明人现认为，通过在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中引入二氧化碳固定途径(例如磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶)，异养微生物能够将二氧化碳转化为有机物，从而实现二氧化碳的固定和/或减少二氧化碳的排放。例如，在异养微生物中引入磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶后，所述异养微生物将可以利用磷酸核酮糖激酶，以5-磷酸核酮糖为底物产生1,5-二磷酸核酮糖；并可以进一步利用1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，以1,5-二磷酸核酮糖和二氧化碳为底物产生3-磷酸甘油酸(参见，例如图1C)，从而将二氧化碳转化为有机物(例如，3-磷酸甘油酸)以参与微生物体内代谢，并最终实现二氧化碳的固定和/或该微生物发酵过程中的更低的二氧化碳排放。
因此，在第一方面，本发明提供了一种构建体，其包含第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自：
1）磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)；
2）其核苷酸序列与1）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和
3）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
并且其中，所述第二基因选自：
4）1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)；
5）其核苷酸序列与4）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和
6）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因。
所述构建体可用于在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中引入二氧化碳固定途径。
在一个优选的实施方案中，本发明的构建体还包含与第一基因和/或第二基因可操作地连接的表达调控序列，例如启动子，终止子，和/或增强子。例如，本发明的构建体还包含与第一基因可操作地连接的表达调控序列，以及与第二基因可操作地连接的表达调控序列。
此类表达调控序列是本领域技术人员公知的。在一个优选的实施方案中，所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在另一个优选的实施方案中，所述启动子包括但不限于,例如T7启动子，CMV启动子，pBAD启动子，Trc启动子，Tac启动子，lacUV5启动子。在一个进一步优选的实施方案中，所述启动子是T7启动子。
在一个优选的实施方案中，在将构建体转化入宿主细胞后，构建体中的第一基因和第二基因分别进行表达，产生具有磷酸核酮糖激酶活性的第一蛋白和具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的第二蛋白。在另一个优选的实施方案中，第一基因和第二基因在宿主细胞中表达为融合蛋白，其具有磷酸核酮糖激酶活性和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性。
在一个优选的实施方案中，所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因。在一个进一步优选的实施方案中，所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID NO:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列。
在一个优选的实施方案中，所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因。在一个进一步优选的实施方案中，所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
在一个优选的实施方案中，所述构建体还可以包含用于筛选转化体的标记基因。所述标记基因包括但不限于，例如卡那霉素抗性基因（NCBI ID：NC_003239.1），红霉素抗性基因（NCBI ID：NC_015291.1）和壮观霉素抗性基因（参见例如，中国发明专利申请201010213758.5）。此类标记基因是本领域技术人员熟知的，并且其选择在本领域技术人员的能力范围之内。在一个优选的实施方案中，所述标记基因是卡那霉素抗性基因。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因为壮观霉素抗性基因Omega片段，其序列例如参见中国发明专利申请201010213758.5。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因可以位于与第一基因和/或第二基因可操作地连接的启动子的上游或下游。
在第二方面，本发明提供了一种载体，其包含上文第一方面中所定义的构建体。
可用于插入目的基因或构建体的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
在第三方面，本发明提供了一种宿主，其包含上面所定义的构建体和/或载体，或者已用上面所定义的载体进行了转化。
在一个优选的实施方案中，所述宿主是异养微生物。例如，所述宿主可以是异养细菌、真菌和酵母，其包括但不限于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕氏酵母（Pichia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（Escherichia coli）、醋酸杆菌（Bacillusaceticus）、假单胞菌（Pseudomonas）、短杆菌（bacillusbrevis）、棒杆菌（Corynebacterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、丙酮丁醇芽孢梭菌（Clostridium acetobutylicum）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）、巴氏芽孢梭菌（Clostridiumpasteurianum）。优选地，所述宿主是大肠杆菌。
在一个优选的实施方案中，所述宿主是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)且保藏号为CGMCC No.5435的大肠杆菌E2。
在第四方面，本发明提供了一种组合，其包含含有第一基因的第一构建体和含有第二基因的第二构建体，其中所述第一基因选自：
1）磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)；
2）其核苷酸序列与1）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和
3）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
并且其中，所述第二基因选自：
4）1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)；
5）其核苷酸序列与4）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和
6）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因。
在一个优选的实施方案中，所述第一构建体与第二构建体分别作为分离的组分存在，或作为二者的混合物存在。
在一个优选的实施方案中，所述第一构建体还包含与第一基因可操作地连接的表达调控序列，和/或所述第二构建体还包含与第二基因可操作地连接的表达调控序列，例如启动子，终止子，和/或增强子。
此类表达调控序列是本领域技术人员公知的。在一个优选的实施方案中，所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在另一个优选的实施方案中，所述启动子包括但不限于,例如T7启动子，CMV启动子，pBAD启动子，Trc启动子，Tac启动子，lacUV5启动子。在一个进一步优选的实施方案中，所述启动子是T7启动子。
在一个优选的实施方案中，所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因。在一个进一步优选的实施方案中，所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID NO:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列。
在一个优选的实施方案中，所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因。在一个进一步优选的实施方案中，所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因具有如SEQ I D NO：2所示的序列。
在一个优选的实施方案中，所述第一构建体和/或第二构建体还可以包含用于筛选转化体的标记基因。所述标记基因包括但不限于，例如卡那霉素抗性基因（NCBI ID：NC_003239.1），红霉素抗性基因（NCBIID：NC_015291.1）和壮观霉素抗性基因（参见例如，中国发明专利申请201010213758.5）。此类标记基因是本领域技术人员熟知的，并且其选择在本领域技术人员的能力范围之内。在一个优选的实施方案中，所述标记基因是卡那霉素抗性基因。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因为壮观霉素抗性基因Omega片段，其序列例如参见中国发明专利申请201010213758.5。在另一个优选的实施方案中，所述第一构建体和第二构建体都包含标记基因。在一个进一步优选的实施方案中，第一构建体中的标记基因与第二构建体中的标记基因可以是相同的或者不同的标记基因。
在第五方面，本发明提供了一种组合，其包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含上文第四方面中所定义的第一构建体，并且第二载体包含上文第四方面中所定义的第二构建体。
可用于插入目的基因或构建体的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，所述第一载体和/或第二载体各自独立地是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主，其包含上面所定义的第一构建体和/或第一载体，并且包含上面所定义的第二构建体和/或第二载体，或者其已用上面所定义的第一载体和第二载体进行了转化。
在一个优选的实施方案中，所述宿主是异养微生物。例如，所述宿主可以是异养细菌、真菌和酵母，其包括但不限于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕氏酵母（Pichia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（Escherichia coli）、醋酸杆菌（Bacillus aceticus）、假单胞菌（Pseudomonas）、短杆菌（bacillusbrevis）、棒杆菌（Corynebacterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、丙酮丁醇芽孢梭菌（Clostridium acetobutylicum）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）、巴氏芽孢梭菌（Clostridiumpasteurianum）。优选地，所述宿主是大肠杆菌。
在第六方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含，1）上文第一方面中所定义的构建体，或上文第二方面中所定义的载体；和/或2）上文第四或第五方面中所定义的组合。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含另外的试剂，例如用于将构建体或载体引入宿主(例如异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌)的试剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的试剂例如是转染试剂。
在第七方面，本发明提供了在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的方法，其包括，
1）将上文第一方面中所定义的构建体，或上文第二方面中所定义的载体导入所述异养微生物中；或者，
2）将上文第四方面中任一项所定义的第一构建体和/或上文第五方面中所定义的第一载体，以及上文第四方面中所定义的第二构建体和/或上文第五方面中所定义的第二载体导入所述异养微生物中，
从而使所述异养微生物能够表达第一基因和第二基因。
在一个优选的实施方案中，所述第一基因和第二基因被整合入所述异养微生物的基因组内。在另一个优选的实施方案中，所述第一基因和第二基因在所述宿主中作为游离体存在。
在一个优选的实施方案中，所述宿主是异养微生物。例如，所述宿主可以是异养细菌、真菌和酵母，其包括但不限于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕氏酵母（Pichia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（Escherichia coli）、醋酸杆菌（Bacillus aceticus）、假单胞菌（Pseudomonas）、短杆菌（bacillusbrevis）、棒杆菌（Corynebacterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、丙酮丁醇芽孢梭菌（Clostridium acetobutylicum）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）、巴氏芽孢梭菌（Clostridiumpasteurianum）。优选地，所述宿主是大肠杆菌。
用于将构建体或载体引入宿主的方法是本领域技术人员公知的，其包括但不限于，转染、转化和转导。例如，此类方法包括但不限于，脂质体转染，磷酸钙沉积，电穿孔、颗粒轰击等等。
在第八方面，本发明的实施方案涉及上文第一方面中所定义的构建体或上文第二方面中所定义的载体或上文第四或第五方面中所定义的组合或者上文第六方面中所定义的试剂盒用于在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的用途。
在一个优选的实施方案中，所述宿主是异养微生物。例如，所述宿主可以是异养细菌、真菌和酵母，其包括但不限于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕氏酵母（Pichia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（Escherichia coli）、醋酸杆菌（Bacillus aceticus）、假单胞菌（Pseudomonas）、短杆菌（bacillusbrevis）、棒杆菌（Corynebacterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、丙酮丁醇芽孢梭菌（Clostridium acetobutylicum）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）、巴氏芽孢梭菌（Clostridiumpasteurianum）。优选地，所述宿主是大肠杆菌。
在第九方面，本发明提供了能够固定二氧化碳的大肠杆菌E2，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5435。
在第十方面，本发明提供了在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的方法，其包括，将第一基因和第二基因导入所述异养微生物中；其中所述第一基因选自：
1）磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)；
2）其核苷酸序列与1）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和
3）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
并且其中，所述第二基因选自：
4）1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)；
5）其核苷酸序列与4）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和
6）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因，
从而使所述异养微生物能够表达第一基因和第二基因。
在一个优选的实施方案中，所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因。在一个进一步优选的实施方案中，所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID NO:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列。
在一个优选的实施方案中，所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因。在一个进一步优选的实施方案中，所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因具有如SEQ I D NO：2所示的序列。
可使用本领域技术人员已知的任何方法将所述第一基因和第二基因导入所述异养微生物中。此类方法包括但不限于，转化，转导，转染，例如脂质体转染，磷酸钙沉积，电穿孔、颗粒轰击等等。
此外，由于1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)可包含2种亚基(大亚基rbcL和小亚基rbcS)或3种亚基(rbcL，rbcS和rbcX)，因此，可通过一种或多种载体将第二基因导入所述异养微生物。例如，可以通过同时编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS（或者亚基rbcL，rbcS和rbcX）的1种载体将第二基因导入所述异养微生物。或者，可通过分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基rbcL和小亚基rbcS的2种载体将第二基因导入所述异养微生物。或者，可通过分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的rbcL，rbcS和rbcX亚基的3种载体将第二基因导入所述异养微生物。
在一个优选的实施方案中，所述第一基因和第二基因被整合入所述异养微生物的基因组内。在另一个优选的实施方案中，所述第一基因和第二基因在所述宿主中作为游离体存在。
在一个优选的实施方案中，所述宿主是异养微生物。例如，所述宿主可以是异养细菌、真菌和酵母，其包括但不限于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕氏酵母（Pichia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（Escherichia coli）、醋酸杆菌（Bacillus aceticus）、假单胞菌（Pseudomonas）、短杆菌（bacillusbrevis）、棒杆菌（Corynebacterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、丙酮丁醇芽孢梭菌（Clostridium acetobutylicum）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）、巴氏芽孢梭菌（Clostridiumpasteurianum）。优选地，所述宿主是大肠杆菌。
在第十一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含第一组分和第二组分，其中
第一组分包含编码磷酸核酮糖激酶(Prk)的载体，并且
第二组分包含编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的一种或多种载体，
其中，第一组分和第二组分分别作为分离的组分存在，或作为二者的混合物存在。
在一个优选的实施方案中，所述第二组分包含1种载体，其编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS（或者亚基rbcL，rbcS和rbcX）。
在另一个优选的实施方案中，所述第二组分包含2种载体，其分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS。
在另一个优选的实施方案中，所述第二组分包含3种载体，其分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL，rbcS和rbcX。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含另外的试剂，例如用于将构建体或载体引入宿主(例如异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌)的试剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的试剂例如是转染试剂。
本发明还提供了上述试剂盒用于在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的用途。
发明的有益效果
在本申请中，发明人通过在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中引入了编码磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的基因，在该异养微生物中建立起了二氧化碳固定途径，进而使得该异养微生物能够将二氧化碳转化为有机物，最终在异养微生物发酵过程中实现了二氧化碳的固定，减少了二氧化碳的排放。因此，本发明的实施方案的一个优点是，在微生物发酵过程中减少了二氧化碳的排放，使得利用微生物来生产生物制品和生化产品的过程更为低碳。此外，本发明为解决微生物发酵过程中的二氧化碳排放问题提供了新的思路和手段，对优化工业生产及环境保护具有重要的意义。特别地，可以将本发明的实施方案与各种可以进行遗传改造的工业应用微生物相结合，以进一步优化工业生产和提高环境友好度。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1示意性地说明了，(A)微生物中产生二氧化碳的主要代谢途径；(B)六种二氧化碳固定途径；(C)通过在异养微生物中表达磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因而建立的固定二氧化碳的代谢途径。
图2示意性地说明了质粒pYL25的基本结构，其中PT7是指T7启动子，prk是指磷酸核酮糖激酶基因，Kanr是指卡那霉素抗性基因。质粒pYL25是通过利用NdeI和XhoI两个限制性酶切位点，将源于集胞藻PCC6803的prk基因(SEQ ID NO:1)克隆到质粒pET28a(Novagen)中而获得的。
图3示意性地说明了质粒pYL33的基本结构，其中PT7是指T7启动子，Rubisco是指1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因，Kanr是指卡那霉素抗性基因。质粒pYL33是通过利用NdeI和XhoI两个限制性酶切位点，将源于集胞藻PCC6803的rubisco基因（SEQ I D NO:2）克隆到质粒pET28a（Novagen）中而获得的。
图4示意性地说明了质粒pYL35的基本结构，其中PT7是指T7启动子，prk是指磷酸核酮糖激酶基因，Rubisco是指1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因，Kanr是指卡那霉素抗性基因。
图5展示了，磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的蛋白质印迹分析，其中，prk是指磷酸核酮糖激酶；Rubisco是指1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶；泳道(P+R)1和(P+R)2分别显示，用质粒pYL35转化的大肠杆菌细胞经破碎和离心后得到的沉淀和上清中的Prk及Rubisco酶的表达情况；泳道Marker表示，蛋白质分子量标记。结果显示，Prk和Rubisco酶均能够在大肠杆菌细胞中表达。
图6展示了照片，其证实，经转化的大肠杆菌中所表达的磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶均具有活性，其中，Prk表示用磷酸核酮糖激酶基因(质粒pYL25)转化的大肠杆菌，Rubisco表示用1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(质粒pYL33)转化的大肠杆菌，Prk＋Rubisco表示用磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(质粒pYL35)转化的大肠杆菌，CT表示用质粒pET28a转化的大肠杆菌。图6A显示，经转化的大肠杆菌在不存在IPTG的情况下的生长情况；图6B显示，经转化的大肠杆菌在存在0.5mM IPTG（用于诱导外源基因的表达）的情况下的生长情况。结果显示，在不存在IPTG的情况下，所有的经转化的大肠杆菌均正常生长；而在存在0.5mM IPTG的情况下，(1)用磷酸核酮糖激酶基因(质粒pYL25)转化的大肠杆菌不能正常生长，这表明在该大肠杆菌菌株中，5-磷酸核酮糖在磷酸核酮糖激酶的催化下被转化为不能被代谢的终产物1,5-二磷酸核酮糖，导致菌株不能正常生长并出现致死现象，从而证实了，该大肠杆菌菌株能够表达具有活性的磷酸核酮糖激酶；(2)用磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(质粒pYL35)转化的大肠杆菌能够正常生长，这表明该大肠杆菌菌株能够表达具有活性的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，其将不能被代谢的1,5-二磷酸核酮糖进一步转化为能够被代谢的3-磷酸甘油酸，从而拯救了用磷酸核酮糖激酶基因(质粒pYL25)转化的大肠杆菌的致死现象。
序列表信息
SEQ I D NO:1：GenBank:AP012278.1，来源于集胞藻PCC6803（Synechocystissp.PCC6803）的prk基因的核苷酸序列
ATGACCACACAGCTAGACCGCGTGGTTCTTATTGGTGTTGCCGGGGATTCCGGTTGCGGTAAGTCTACTTTCTTACGTCGTTTAACGGATTTATTCGGCGAAGAGTTCATGACGGTAATTTGTTTGGACGATTACCATAGTTTGGATCGCCAGGGTAGAAAAGCCGCTGGGGTCACCGCCCTGGATCCCAGAGCCAACAATTTTGACCTCATGTATGAGCAGATTAAAACGCTCAAAAGTGGTCAATCCATTATGAAACCCATTTACAACCACGAAACGGGGCTGCTGGATCCGCCGGAAAAAGTTGAACCCAACAAAGTGGTGGTTATTGAGGGTTTGCATCCCCTCTACGATGAACGGGTGCGGGAACTGGTGGATTTCGGGGTCTACCTGGACATCAGCGAAGAAGTGAAAATTAACTGGAAAATTCAACGGGACATGGCCGAACGGGGCCACACCTATGAAGATATTTTGGCTTCCATCAACGCCCGTAAGCCTGACTTCACTGCCTATATCGAGCCCCAAAAGCAATATGCGGACGTGGTGATCCAGGTGTTGCCCACCCGCTTGATTGAGGACAAGGAAAGTAAACTCCTGCGGGTTCGTCTTGTGCAAAAAGAAGGGGTTAAATTCTTCGAGCCAGCCTACCTGTTTGACGAAGGTTCCACCATTGATTGGCGTCCCTGTGGTCGGAAGCTGACCTGTACCTATCCTGGCATCAAGATGTACTACGGCCCCGATAATTTTATGGGCAACGAAGTATCTTTGCTGGAAGTGGACGGCAGGTTTGAAAACCTAGAGGAAATGGTTTATGTGGAAAACCACCTCAGCAAGACTGGTACTAAGTACTACGGTGAAATGACCGAGTTGTTGCTCAAGCATAAGGATTACCCAGGCACTGACAATGGTACTGGCCTGTTCCAGGTGTTAGTGGGTCTGAAAATGCGGGAAGTTTACGAACAGTTAACGGCGGAAGCTAAGGTCCCGGCCTCTGTGTAA
SEQ ID NO:2：GenBank:AP012278.1，来源于集胞藻PCC6803的Rubisco基因的核苷酸序列
ATGGTACAAGCCAAAGCAGGGTTTAAGGCGGGCGTACAAGATTATCGCCTGACCTACTATACCCCCGACTACACCCCCAAGGATACCGACCTGCTCGCCTGCTTCCGTATGACCCCCCAACCGGGTGTACCTGCTGAAGAAGCCGCTGCTGCGGTGGCCGCTGAGTCTTCCACCGGTACCTGGACCACCGTTTGGACTGACAACCTAACTGACTTGGACCGCTACAAAGGTCGTTGCTATGACCTGGAAGCTGTTCCCAACGAAGATAACCAATATTTTGCTTTTATTGCCTATCCTCTAGATTTATTTGAAGAAGGTTCCGTCACCAACGTTTTAACCTCTTTGGTCGGTAACGTATTTGGTTTTAAGGCTCTGCGGGCCCTCCGTTTAGAAGATATTCGTTTTCCCGTTGCTTTAATTAAAACCTTCCAAGGCCCTCCCCACGGTATTACCGTTGAGCGGGACAAATTAAACAAATACGGTCGTCCTCTGCTTGGTTGTACCATCAAACCCAAACTTGGTCTGTCCGCCAAGAACTACGGTCGGGCTGTTTACGAATGTCTCCGGGGTGGTTTGGACTTCACCAAAGACGACGAAAACATCAACTCCCAGCCCTTCATGCGTTGGCGCGATCGTTTCCTCTTCGTTCAAGAGGCGATCGAAAAAGCCCAGGCTGAGACCAACGAAATGAAAGGTCACTACCTGAACGTCACCGCTGGCACCTGCGAAGAAATGATGAAACGGGCCGAGTTTGCCAAGGAAATTGGCACCCCCATCATCATGCATGACTTCTTCACCGGCGGTTTCACTGCCAACACCACCCTCGCTCGTTGGTGTCGGGACAACGGCATTTTGCTCCATATTCACCGGGCAATGCACGCCGTAGTTGACCGTCAGAAAAACCACGGGATCCACTTCCGGGTTTTGGCCAAGTGTCTGCGTCTGTCCGGCGGTGACCACCTCCACTCCGGTACCGTGGTTGGTAAATTGGAAGGGGAACGGGGTATCACCATGGGCTTCGTTGACCTCATGCGCGAAGATTACGTTGAGGAAGATCGCTCCCGGGGTATTTTCTTCACCCAAGACTATGCCTCCATGCCTGGCACCATGCCCGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGTATGGCACATGCCCGCGTTGGTGGAAATCTTCGGTGATGATTCCTGCTTACAGTTTGGTGGTGGTACTTTGGGTCACCCCTGGGGTAATGCTCCCGGTGCAACCGCTAACCGTGTTGCTTTGGAAGCTTGTGTTCAAGCTCGGAACGAAGGTCGTAACCTGGCTCGCGAAGGTAATGACGTTATCCGGGAAGCCTGTCGTTGGTCCCCTGAGTTGGCCGCCGCCTGCGAACTCTGGAAAGAGATCAAGTTTGAGTTCGAGGCCATGGATACCCTCTAAACCGGTGTTTGGATTGTCGGAGTTGTACTCGTCCGTTAAGGATGAACAGTTCTTCGGGGTTGAGTCTGCTAACTAATTAGCCATTAACAGCGGCTTAACTAACAGTTAGTCATTGGCAATTGTCAAAAAATTGTTAATCAGCCAAAACCCACTGCTTACTGATGTTCAACTTCGACAGCAATTTACCAATTACCGGGTAGAGTGTTCATGCAAACTAAGCACATAGCTCAGGCAACAGTGAAAGTACTGCAAAGTTACCTCACCTACCAAGCCGTTCTCAGGATCCAGAGTGAACTCGGGGAAACCAACCCTCCCCAGGCCATTTGGTTAAACCAGTATTTAGCCAGTCACAGTATTCAAAATGGAGAAACGTTTTTGACGGAACTCCTGGATGAAAATAAAGAACTGGTACTCAGGATCCTGGCGGTAAGGGAAGACATTGCCGAATCAGTGTTAGATTTTTTGCCCGGTATGACCCGGAATAGCTTAGCGGAATCTAACATCGCCCACCGCCGCCATTTGCTTGAACGTCTGACCCGTACCGTAGCCGAAGTCGATAATTTCCCTTCGGAAACCTCCAACGGAGAATCAAACAACAACGATTCTCCCCCGTCCTAACGTAGTCATCAGCAAGGAAAACTTTTAAATCGATGAAAACTTTACCCAAAGAGCGCCGCTACGAAACCCTTTCTTACCTGCCCCCTTTAACCGATCAACAGATTGCTAAACAGGTTGAGTTTCTGTTAGACCAGGGCTTTATTCCCGGCGTGGAATTTGAAGAAGACCCCCAACCCGAAACCCACTTCTGGACCATGTGGAAACTGCCCTTCTTTGGTGGTGCCACTGCCAACGAAGTTCTAGCCGAAGTACGGGAATGTCGTTCTGAGAATCCCAACTGCTACATTCGGGTGATTGGTTTCGACAATATCAAACAGTGCCAGACTGTAAGCTTTATTGTCCACAAACCCAACCAAAACCAAGGCCGTTACTAA
SEQ ID NO:3：引物PrkF的序列
GGCATATGACCACACAGCTAGACCG
SEQ ID NO:4：引物PrkR的序列
AGCTCGAGTTACACAGAGGCCGGGAC
SEQ ID NO:5：引物RubiscoF的序列
GTTGTCGACGAAGGAGATATACATATGGTACAAGCCAAAGCAG
SEQ ID NO:6：引物RubiscoR的序列
GACTCGAGACTGTAACTTGGGTAACGGCCTTGGT
SEQ I D NO:7：GenBank：NP_441778.1，来源于集胞藻PCC6803（Synechocystis sp.PCC6803）的prk基因编码的氨基酸序列
MTTQLDRVVLIGVAGDSGCGKSTFLRRLTDLFGEEFMTVICLDDYHSLDRQGRKAAGVTALDPRANNFDLMYEQIKTLKSGQSIMKPIYNHETGLLDPPEKVEPNKVVVIEGLHPLYDERVRELVDFGVYLDISEEVKINWKIQRDMAERGHTYEDILASINARKPDFTAYIEPQKQYADVVIQVLPTRLIEDKESKLLRVRLVQKEGVKFFEPAYLFDEGSTIDWRPCGRKLTCTYPGIKMYYGPDNFMGNEVSLLEVDGRFENLEEMVYVENHLSKTGTKYYGEMTELLLKHKDYPGTDNGTGLFQVLVGLKMREVYEQLTAEAKVPASV
SEQ ID NO:8：GenBank：NP_442120.1，来源于集胞藻PCC6803的Rubi sco基因所编码的rbcL亚基的氨基酸序列
MVQAKAGFKAGVQDYRLTYYTPDYTPKDTDLLACFRMTPQPGVPAEEAAAAVAAESSTGTWTTVWTDNLTDLDRYKGRCYDLEAVPNEDNQYFAFIAYPLDLFEEGSVTNVLTSLVGNVFGFKALRALRLEDIRFPVALIKTFQGPPHGITVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAVYECLRGGLDFTKDDENINSQPFMRWRDRFLFVQEAIEKAQAETNEMKGHYLNVTAGTCEEMMKRAEFAKEIGTPIIMHDFFTGGFTANTTLARWCRDNGILLHIHRAMHAVVDRQKNHGIHFRVLAKCLRLSGGDHLHSGTVVGKLEGERGITMGFVDLMREDYVEEDRSRGIFFTQDYASMPGTMPVASGGIHVWHMPALVEIFGDDSCLQFGGGTLGHPWGNAPGATANRVALEACVQARNEGRNLAREGNDVIREACRWSPELAAACELWKEIKFEFEAMDTL
SEQ ID NO:9：GenBank：NP_442121.1，来源于集胞藻PCC6803的Rubisco基因所编码的rbcX亚基的氨基酸序列
VFMQTKHIAQATVKVLQSYLTYQAVLRIQSELGETNPPQAIWLNQYLASHSIQNGETFLTELLDENKELVLRILAVREDIAESVLDFLPGMTRNSLAESNIAHRRHLLERLTRTVAEVDNFPSETSNGESNNNDSPPS
SEQ ID NO:10：GenBank：NP_442122.1，来源于集胞藻PCC6803的Rubisco基因所编码的rbcS亚基的氨基酸序列
MKTLPKERRYETLSYLPPLTDQQIAKQVEFLLDQGFIPGVEFEEDPQPETHFWTMWKLPFFGGATANEVLAEVRECRSENPNCYIRVIGFDNIKQCQTVSFIVHKPNQNQGRY
生物材料样品保藏信息
本发明所提及的大肠杆菌菌株E2由中国科学院青岛生物能源与过程研究所（山东省青岛市崂山区松岭路189号）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，CGMCC）（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），并且其保藏时间为2011年11月3日，保藏号为CGMCC No.5435。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.用于表达磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的载体及菌株的构建
在本实施例中，构建了用于表达磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的载体及菌株。
1、载体pYL25的构建
以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，以Prk-F(5'-GGC ATA TGACCA CAC AGC TAG ACC G-3')和Prk-R(5'-AGC TCG AGT TAC ACA GAGGCC GGG AC-3')为引物进行PCR扩增。然后，根据生产商的说明书，将所获得的PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara,Catalog No.:D101A)中，从而得到载体pYL22。载体pYL22经测序验证后，用NdeI(Takara,Catalog No.:D1161A)和XhoI(Takara，CatalogNo.:D1073A)进行双酶切，并回收1.7kb的片段。另外，使用NdeI(Takara,CatalogNo.:D1161A)和XhoI(Takara,CatalogNo.:D1073A)酶切质粒pET28a(Novagen,Catalog NO.:69864-3)，并回收5.3kb的片段(该片段含有抗性基因)。然后，使用连接酶，将所获得的1.7kb的片段和5.3kb的片段相连接，从而得到质粒pYL25。质粒pYL25的基本结构示意性地描述图2中，其中PT7是指T7启动子，prk是指磷酸核酮糖激酶基因，Kanr是指卡那霉素抗性基因。
2、载体pYL33的构建
以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，以Rubisco-F(5'-AAC TCGAGG AAG GAG ATA ATG GTA CAA GCC AAA GCA G-3')和Rubisco-R(5'-TGACTC GAG ACT GTA CCT TAG TAA CGG CC-3')为引物进行PCR扩增。然后，根据生产商的说明书，将所获得的PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara,Catalog No.:D101A)中，从而得到质粒pYL30。质粒pYL30经测序正确后，用NdeI(Takara,Catalog No.:D1161A)和XhoI(Takara，CatalogNo.:D1073A)进行双酶切，并回收2.4kb的片段。另外，使用NdeI(Takara,Catalog No.:D1161A)和XhoI(Takara，CatalogNo.:D1073A)酶切质粒pET28a(Novagen)，并回收5.3kb的片段(该片段含有抗性基因)。然后使用连接酶，将所获得的2.4kb的片段和5.3kb的片段相连接，从而得到质粒pYL33。质粒pYL33的基本结构示意性地描述图3中，其中PT7是指T7启动子，Rubisco是指1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因，Kanr是指卡那霉素抗性基因。
3、载体pYL35的构建
使用SalI(Takara，CatalogNo.:D1080A)和XhoI(Takara，CatalogNo.:D1073A)酶切质粒pYL33，并回收2.4kb的Rubisco基因片段。另外，使用XhoI(Takara，CatalogNo.:D1073A)单酶切质粒pYL25，并回收7kb的片段(该片段含有启动子、Prk基因、抗性基因、His标签)。然后使用连接酶，将所获得的2.4kb的片段和7kb的片段相连接，从而得到质粒pYL35。质粒pYL35的基本结构示意性地描述图4中，其中PT7是指T7启动子，prk是指磷酸核酮糖激酶基因，Rubisco是指1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因，Kanr是指卡那霉素抗性基因。所使用的载体pET28a本身携带2个His标签。经过上述构建程序后，在所获得的质粒pYL35中，一个His标签融合于Prk基因的编码序列的N端，而另一个His标签融合于Rubisco基因的编码序列的C端。因此，在将质粒pYL35导入宿主细胞后，宿主细胞将表达其N端融合了His标签的Prk蛋白以及其C端融合了His标签的Rubisco蛋白。可利用这些His标签来对宿主细胞表达的Prk蛋白以及Rubisco蛋白进行检测和纯化。
4、基因工程菌株E1和E2的构建
使用化学转化法，将pET28a(Novagen)和pYL35分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，从而得到基因工程菌株E1(阴性对照)和E2。菌株构建过程简要概述如下。
1)从甘油保存菌种中接种一环大肠杆菌至LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。然后挑取2-3mm直径的单菌落接种至装有50ml LB液体培养基的三角瓶中，在37℃下震荡培养2小时(摇床转速250r/min)。当OD500达到0.4左右时，吸取1.4ml菌液至EP管，并以7000g离心2min，弃去上清。再次以7000g离心2min，并弃去上清。然后将细菌沉淀悬浮于1ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，并冰浴10min。冰浴后，以7000g离心2min，弃去上清，收集细菌沉淀。
2)将细菌沉淀重悬于200μl预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，并冰浴30min。然后向细菌悬液中加入质粒DNA(50ng/10μl)，轻轻混匀，并冰浴20min。冰浴后，将细菌悬液于42℃水浴中温育2min（不要摇动），然后迅速转移至冰浴中并静置2min。冰浴后，添加800μlLB液体培养基，并于37℃下培养45min，以便经转化的大肠杆菌菌株表达抗性。
3)将步骤2)获得的大肠杆菌菌株接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上，并于37℃恒温培养箱中培养过夜。挑取平板上的单菌落，并通过质粒提取或PCR鉴定来验证外源基因的存在，从而获得目的转化子。
实施例2.磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶在基因工程菌株中的表达的验证
在本实施例中，通过蛋白质印迹分析(Western blot)验证了磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶在基因工程菌株中的表达。
1、总蛋白的提取
通过实施例1中描述的方法，将质粒pYL35转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，并在16℃、200ml LB培养基（含有0.5mM IPTG，以诱导外源基因表达）中震荡培养过夜(摇床转速200r/min)。然后，以8000rpm离心菌体5min，收集菌体并倒掉培养液。向菌体细胞中加入3ml4℃预冷的PBS(0.01M，pH7.2-7.3)，轻轻摇动1min以洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上洗涤操作两次（共洗涤细胞三次），以洗去残留的培养液。然后，向菌体细胞中加入3ml PBS，并进行超声破碎，然后取1ml转移到离心管中。然后，于4℃下以12000rpm对经破碎的细胞离心5min。将离心后得到的上清(P+R)2和下层沉淀(P+R)1分离，并分别转移到新的离心管中。向下层沉淀(P+R)1加入1ml的1X上样缓冲液(Loading buffer)(BioChi p，CatalogNo.:370009-S2)，充分混合，并在100℃下煮沸5min以完成样品的制备，然后取6μl用于上样。另外，取上清(P+R)26μl，添加3μl5X上样缓冲液(BioChip，CatalogNo.:370009-S2)，并添加水至15μl（上样缓冲液的终浓度为1X），然后在100℃下煮沸5min以完成样品的制备，用于上样。
2、SDS-PAGE电泳和转膜
使用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳（电泳时间为4-5h，电压为40V或60V），并在电泳结束后，将在凝胶中分离的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上。
3、膜的染色
在转膜结束后，在摇床上将膜用1×丽春红染液染5min，然后用水冲洗，以除去残留的染液。在染色后，可在膜上观察到蛋白条带。将膜晾干备用。
4、免疫检测
1)将膜用TBS(8.8g NaCl，1M Tris(PH8.0)，定容至1L)浸湿后，转移至含有封闭液（5%脱脂奶粉，于TBST(8.8g NaCl，1M Tris(PH8.0)，0.5ml Tween20，定容至1L)中）的平皿中，并在室温下、在摇床上封闭1h。
2)封闭后，使用鼠抗His标签抗体(Invitrogen，Catalog No.:37-2900，其用TBST以1：10000进行稀释)，在室温下孵育膜1-2h；然后，用TBST在室温下、在摇床上洗涤膜两次，每次10min；然后再用TBS洗涤膜一次，10min。
3)用山羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶(Invitrogen,Catalog No.:G-21060，其用TBST以1：3000进行稀释)在室温下孵育膜1-2h；然后，用TBST在室温下、在摇床上洗涤膜两次，每次10min；然后再用TBS洗涤膜一次，10min。
4)根据制造商的说明书，使用NBT-BCIP显色试剂盒(Roche,Catalog No.:11681451001)对膜进行显影。Western Blot的检测结果如图5所示。结果显示，在用质粒pYL35转化的菌株中，磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶均能够在大肠杆菌细胞中表达。
实施例3.基因工程菌株中表达的磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的活性的验证
在本实施例中，验证了基因工程菌株E2中表达的磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的活性。
为了证实本发明所构建的质粒能够在大肠杆菌菌株中表达有活性的磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，进行如下实验。将质粒pYL25、质粒pYL33、质粒pYL35和pET28a分别转化入大肠杆菌菌株中。然后，将经转化的大肠杆菌菌株分别涂布于含有0mMIPTG和50μg mL-1卡那霉素的LB固体培养基平板（图6A）以及含有0.5mM IPTG和50μg mL-1卡那霉素的LB固体培养基平板（图6B）上，并在37℃下培养过夜。观察大肠杆菌菌株的生长情况，并将观察结果示于图6中。
1、磷酸核酮糖激酶的活性的验证
磷酸核酮糖激酶催化将5-磷酸核酮糖转化为1,5-二磷酸核酮糖的反应。在异养微生物大肠杆菌中，5-磷酸核酮糖为PPP途径（戊糖磷酸途径）的重要反应底物，而1,5-二磷酸核酮糖为不能被代谢的终产物。因此，当磷酸核酮糖激酶在大肠杆菌中大量表达时，其将与PPP途径竞争重要反应底物5-磷酸核酮糖，并大量积累不能被代谢的终产物1,5-二磷酸核酮糖，使得过表达磷酸核酮糖激酶的大肠杆菌菌株不能正常生长,出现致死现象。
图6A的结果显示，在不存在IPTG（即，不诱导外源基因表达）的情况下，所有经转化的大肠杆菌菌株均能够在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上正常生长。这表明，目的质粒均已被转化入大肠杆菌中，并且表达了卡那霉素抗性基因。同时，由于不存在IPTG，大肠杆菌菌株未表达质粒中所包含的Prk基因和/或Rubisco基因，从而菌株正常生长，没有出现致死现象。
进一步，图6B的结果显示，在存在0.5mM IPTG（即，诱导外源基因表达）的情况下，用质粒pET28a转化的大肠杆菌菌株能够在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上正常生长，而用质粒pYL25转化的大肠杆菌菌株不能够生长。这与预期的结果相符合，即，磷酸核酮糖激酶在大肠杆菌菌株中的大量表达将导致大肠杆菌菌株不能正常生长,出现致死现象。因此，该结果（特别地，比较图6A和图6B中由Prk标示的区域）表明，用质粒pYL25转化的大肠杆菌菌株在PT7启动子的驱动下，在IPTG的诱导下能够表达具有活性的磷酸核酮糖激酶。
2、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的活性的验证
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶能够催化将1,5-二磷酸核酮糖转化为3-磷酸甘油酸的反应。因此，当1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶正确表达时，其将与磷酸核酮糖激酶构成代谢通路，将原本在大肠杆菌中不能代谢的1,5-二磷酸核酮糖转化为能够被进一步代谢的3-磷酸甘油酸，从而缓解1,5-二磷酸核酮糖的过量产生对细胞的致死作用（参见图1C）。
图6B的结果显示，在存在0.5mM IPTG（即，诱导外源基因表达）的情况下，用质粒pYL33转化的大肠杆菌菌株能够在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上正常生长。该结果（特别地，比较图6A和图6B中由Rubisco标示的区域）表明，Rubisco的单独表达不会对大肠杆菌菌株的生长造成显著不利的影响。
进一步，图6B的结果还显示，在存在0.5mM IPTG（即，诱导外源基因表达）的情况下，用质粒pYL35转化的大肠杆菌菌株能够在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上正常生长。该结果（特别地，比较图6B中由Prk标示的区域和由Prk＋Rubisco标示的区域）表明，用质粒pYL35（包含磷酸核酮糖激酶基因和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因）转化的大肠杆菌菌株能够表达具有活性的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，其与磷酸核酮糖激酶一起构成了二氧化碳固定途径，将原本不能代谢的终产物1,5-二磷酸核酮糖进一步转化为能够被代谢的3-磷酸甘油酸，拯救了用单独的磷酸核酮糖激酶基因(质粒pYL25)转化的大肠杆菌的致死现象。
实施例4.经基因工程改造的大肠杆菌的二氧化碳排放的检测
1、实验步骤
(1)培养方式为摇瓶培养。使用普通250ml三角烧瓶，其中装有100ml液体M9培养基(参见J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989)。在该培养基中，以4g/L葡萄糖为唯一碳源，并且加入50ug mL-1卡那霉素。向培养基中分别接种实施例1所构建的基因工程菌株E1(阴性对照)或E2，初始接种浓度为OD6000.05。在37℃，200rpm下培养大肠杆菌菌株，直至OD600达到0.4-0.6。然后加入0.5mM IPTG，继续培养25小时。
(2)取50mL培养液，以8000rpm离心5min，分别收集菌体和上清。将菌体沉淀悬浮于3ml无糖M9培养基中，吹洗1min，然后以8000rpm离心5min，并弃去洗液。重复以上洗涤操作两次（共洗涤细胞三次）以洗去残留的葡萄糖，并收集最后一次离心后的菌体沉淀。另外，将之前收集的上清以12000rpm离心10min，再次收集上清并进行过滤，然后收集约10ml的过滤后的上清（即，发酵残液）。
(3)烘干菌体沉淀，测量其干重。根据制造商的说明书，利用总碳总氮分析仪Elementar liquid TOCII（德国Elementar公司），检测发酵残液中的碳含量(无机碳和有机碳的含量)，洗涤后的菌体沉淀中的碳含量，以及初始培养基中的碳含量。
(4)利用初始培养基中的碳含量，菌体沉淀中的碳含量和发酵残液中的碳含量，如下计算总的二氧化碳排放量（以碳的含量表示），及每OD600的二氧化碳排放量：
总的二氧化碳排放量＝初始培养基中的碳含量－菌体沉淀的碳含量－发酵残液中的碳含量；
每OD600的二氧化碳排放量＝总的二氧化碳排放量/发酵液的OD600。
2、实验结果
所测量的初始培养基中的碳含量、菌体沉淀中的碳含量和发酵残液中的碳含量，以及经计算得出的总的二氧化碳排放量和每OD600的二氧化碳排放量示于表1中。
表1.E1和E2的碳代谢分布。
Figure BDA00002626780300331
表1的结果显示，与菌株E1相比较，菌株E2以更小的碳消耗（发酵残液中剩余更多的有机碳），产生了更多的生物质（即，获得了更多的菌体），显著降低了发酵过程中的二氧化碳排放量（每升培养液每OD600菌体的碳排放量减少33%）。该结果表明，通过在异养微生物（大肠杆菌）中表达磷酸核酮糖激酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，发明人已成功地在异养微生物（大肠杆菌）中构建了二氧化碳固定途径，并且所构建的二氧化碳固定途径能够对二氧化碳进行有效固定，从而显著地减少了微生物发酵过程中的二氧化碳排放量，提高了碳源/能源的利用率。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Figure IDA00002626781100011
Figure IDA00002626781100021
Figure IDA00002626781100051
Figure IDA00002626781100061
Figure IDA00002626781100071

Claims (42)

1.一种构建体，其包含第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自：
1）磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)；
2）其核苷酸序列与1）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和
3）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
并且其中，所述第二基因选自：
4）1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)；
5）其核苷酸序列与4）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和
6）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因。
2.权利要求1的构建体，其还包含与第一基因和/或第二基因可操作地连接的表达调控序列，例如启动子，终止子，和/或增强子。
3.权利要求2的构建体，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，优选地所述启动子选自:T7启动子，CMV启动子，pBAD启动子，Trc启动子，Tac启动子，lacUV5启动子，更优选地所述启动子是T7启动子。
4.权利要求1-3任一项的构建体，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID NO:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ I D NO：1所示的序列。
5.权利要求1-4任一项的构建体，其中所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
6.权利要求1-5中任一项的构建体，其中所述构建体还可以包含用于筛选转化体的标记基因；优选地，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因。
7.一种载体，其包含权利要求1-6中任一项的构建体。
8.包含权利要求1-6中任一项的构建体和/或权利要求7的载体的宿主。
9.权利要求8的宿主，其是异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
10.权利要求8的宿主，其是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心且保藏号为CGMCC No.5435的大肠杆菌。
11.一种组合，其包含含有第一基因的第一构建体和含有第二基因的第二构建体，其中所述第一基因选自：
1）磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)；
2）其核苷酸序列与1）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和
3）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
并且其中，所述第二基因选自：
4）1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)；
5）其核苷酸序列与4）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和
6）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因。
12.权利要求11的组合，其中第一构建体与第二构建体分别作为分离的组分存在，或作为二者的混合物存在。
13.权利要求11或12的组合，其中第一构建体还包含与第一基因可操作地连接的表达调控序列，和/或第二构建体还包含与第二基因可操作地连接的表达调控序列，所述表达调控序列例如选自启动子，终止子，和/或增强子。
14.权利要求13的组合，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，优选地所述启动子选自:T7启动子，CMV启动子，pBAD启动子，Trc启动子，Tac启动子，lacUV5启动子，更优选地所述启动子是T7启动子。
15.权利要求11-14任一项的组合，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID NO:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ I D NO：1所示的序列。
16.权利要求11-15任一项的组合，其中所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
17.权利要求11-16中任一项的组合，其中所述第一构建体和/或第二构建体还包含用于筛选转化体的标记基因；优选地，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因。
18.一种组合，其包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含权利要求11-17中任一项所定义的第一构建体，并且第二载体包含权利要求11-17中任一项所定义的第二构建体。
19.一种宿主，其包含权利要求11-17中任一项所定义的第一构建体和/或权利要求18所定义的第一载体，并且包含权利要求11-17中任一项所定义的第二构建体和/或权利要求18所定义的第二载体。
20.权利要求19的宿主，其是异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
21.一种试剂盒，其包含，
1）权利要求1-6任一项的构建体，或权利要求7的载体；或者
2）权利要求11-18任一项的组合。
22.权利要求21的试剂盒，其还包含用于将构建体或载体引入宿主(例如异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌)的试剂，例如转染试剂。
23.在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的方法，其包括，
将权利要求1-6任一项的构建体，或权利要求7的载体导入所述异养微生物中；或者，
将权利要求11-17中任一项所定义的第一构建体和/或权利要求18所定义的第一载体，以及权利要求11-17中任一项所定义的第二构建体和/或权利要求18所定义的第二载体导入所述异养微生物中，
从而使所述异养微生物能够表达第一基因和第二基因。
24.权利要求23的方法，其中所述第一基因和第二基因被整合入所述异养微生物的基因组内。
25.权利要求23的方法，其中所述第一基因和第二基因作为游离体存在于异养微生物中。
26.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述异养微生物选自异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
27.权利要求1-6任一项的构建体或权利要求7的载体或权利要求11-18任一项的组合或者权利要求21或22的试剂盒用于在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的用途。
28.权利要求27的用途，其中所述异养微生物选自异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
29.在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的方法，其包括将第一基因和第二基因导入所述异养微生物中；其中所述第一基因选自：
1）磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)；
2）其核苷酸序列与1）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和
3）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；
并且其中，所述第二基因选自：
4）1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)；
5）其核苷酸序列与4）中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和
6）其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4）中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因，
从而使所述异养微生物能够表达第一基因和第二基因。
30.权利要求29的方法，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQID NO:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ IDNO：1所示的序列。
31.权利要求29或30的方法，其中所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
32.权利要求29的方法，其中通过一种或多种载体将第二基因导入所述异养微生物。
33.权利要求32的方法，其中通过同时编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS或者亚基rbcL，rbcS和rbcX的1种载体将第二基因导入所述异养微生物，或者通过分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS的2种载体将第二基因导入所述异养微生物，或者通过分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的rbcL，rbcS和rbcX亚基的3种载体将第二基因导入所述异养微生物。
34.权利要求29-33任一项的方法，其中所述第一基因和第二基因被整合入所述异养微生物的基因组内。
35.权利要求29-33任一项的方法，其中所述第一基因和第二基因作为游离体存在于异养微生物中。
36.权利要求29-35中任一项的方法，其中所述异养微生物选自异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
37.一种试剂盒，其包含第一组分和第二组分，其中
第一组分包含编码磷酸核酮糖激酶(Prk)的载体，并且
第二组分包含编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的一种或多种载体，
其中，第一组分和第二组分分别作为分离的组分存在，或作为二者的混合物存在。
38.权利要求37的试剂盒，其中第二组分包含1种载体，其编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS或者亚基rbcL，rbcS和rbcX。
39.权利要求37的试剂盒，其中第二组分包含2种载体，其分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS。
40.权利要求37的试剂盒，其中第二组分包含3种载体，其分别编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL，rbcS和rbcX。
41.权利要求37-40任一项的试剂盒，其还包含用于将载体引入宿主(例如异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌)的试剂，例如转染试剂。
42.权利要求37-41任一项的试剂盒用于在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的用途。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140625

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