CN116814844A - 一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的分子标记及应用，所述分子标记是特异性分子标记，位于CTB4a编码基因的SNP‑1930处。所述特异性分子标记的SNP位点碱基多态性为G/C；若该位点处碱基为G，则待测水稻材料具有耐冷性基因CTB4a，若该位点处碱基为C，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。所述特异性分子标记的检测引物组合包括引物ctb4a‑1930 F和ctb4a‑1930 R，以及限制性内切酶HindⅢ。本发明特异性分子标记的应用为在水稻耐冷基因CTB4a鉴定中的应用。所述引物组合在水稻种质资源鉴定、筛选中的应用及在耐冷能性水稻品种选育中的应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用技术领域。
背景技术
水稻冷害是指在持续一段时间内，水稻遭遇植株正常生长发育最低临界温度以下的温度时所造成的影响。根据水稻遭遇冷害时的生育期将冷害分为芽期冷害、苗期冷害、孕穗开花期冷害、灌浆期冷害。其中，孕穗开花期是对低温最为敏感的时期，此时正常生长发育的最低临界温度为18℃，其受害程度与抽穗前9-11天的平均气温有关，低温造成的损失最大，制约着水稻高产稳产。研究表明随着低温时间及低温强度的增加，水稻的减产率在显著增加。
目前已报道的在水稻12条染色体上共检测到270多个耐冷QTL，其中孕穗期克隆的耐冷基因共有五个，bZIP73，Ctb1，CTB2，CTB4a，CTB4b。其中，CTB4a由温带粳稻在低温环境下驯化产生；该基因编码一个蛋白激酶，可使植株低温条件下产生更多ATP，以维持维持耐冷性；低温条件下该基因的高表达单倍型可使水稻花粉育性、结实率和产量都显著提高，该基因的耐冷单倍型在云南地方种质昆明小白谷（Kunming Xiaobaigu，KMXBG）中克隆得到，并存在于丽江新团黑谷、寒地粳稻东农428和稻花香等耐冷性强的品种中。CTB4a对孕穗期的水稻植株耐冷性具有剂量效应，其耐冷单倍型启动子区包含所有5个一致SNPs，其中，SNP-2536（A/G）、SNP -2511（T/C）和SNP -1930（G/C）是功能性SNPs（FNPs），可解释CTB4a等位基因表达水平的差异。而在已测水稻水稻材料中，这三个碱基中只有SNP-1930处的功能碱基G在耐冷单倍型CTB4a中存在。
传统的水稻抗性育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助育种(Molecular Marker－assisted Selection，MAS)简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期。当今水稻耐冷育种的主要问题是可应用的耐冷基因太少，检测水稻耐冷基因，了解不同水稻品种的耐冷遗传背景，可以减少耐冷性育种工作的盲目性，提高育种效率，因此用基因特异性分子标记对水稻品种资源进行耐逆基因的鉴定十分重要。开发CTB4a特异分子标记，将有助于水稻育种家在育种过程中为分子设计育种改良水稻抗逆性提供理论依据，最终实现高效育种，带来巨大的社会经济效益。
对比文件及简单说明：
（1）一种水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4a及编码基因与应用 CN 107118264 B
对比文件（1）主要明确了CTB4a的基因蛋白序列及编码序列；本发明主要提供一种新的CTB4a的检测方法，本发明所涉及的检测位点及相应引物序列不在对比文件核酸及蛋白序列的保护范围内。
（2）用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用 CN 110878375 A
对比文件（2）针对的SNP位点存在于CTB4a的编码区范围内，所使用的方法为KASP；本发明针对的位点为启动子区域 -1930bp 的SNP，所使用的方法为酶切扩增多态性序列（CAPS）。两者针对位点不一样，涉及检测方法也不一样。
（3）Natural variation in CTB4a enhances rice adaptation to coldhabitats. Nat Commun. 2017 Mar 23;8:14788. doi:10.1038/ncomms14788. PMID:28332574; PMCID: PMC5376651.
对比文件（3）中提出了SNP-1930作为CTB4a的功能性位点，但是对比文件中对该位点的检测是结合基因芯片及Sanger测序法获得；本发明针对SNP-1930位点的多态性设计了新的特异性分子标记位点，其对限制性内切酶及扩增引物的使用具有创新性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，位于CTB4a编码基因的SNP -1930处。
所述该SNP位点碱基有2种情况：多态性为G/C；若该位点处碱基为G，则待测水稻材料具有耐冷性基因CTB4a，若该位点处碱基为C，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。
所述的特异分子标价可以使用一组引物组合来检测，所述引物组合包括引物ctb4a-1930 F和ctb4a-1930 R，以及限制性内切酶HindⅢ。
含有上述引物组合的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围
本发明提供了上述引物组合在检测水稻耐冷基因CTB4a中的应用。
所述的应用，进一步包括以下步骤：
（1）提取待检测水稻材料基因组DNA：
（2）以待测水稻基因组DNA为模板，利用引物组合ctb4a -1930 F/ctb4a -1930 R进行扩增；
（3）用限制性内切酶HindⅢ对PCR扩增产物进行酶切，其结果有一下几种情况：若PCR产物在酶切后只显示1条条带，则待测水稻材料携带耐冷性单倍型CTB4a；若PCR产物在酶切后只显示2条条带，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a；若PCR产物在酶切后只显示3条条带，则待测水稻材料则同时携带有耐冷性单倍型CTB4a和非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。
步骤2中的PCR扩增反应条件为：预变性温度：95℃，时间：5min；变性温度：95℃，时间：30s；退火温度即TM值：56℃，时间：30s；延伸温度：72℃，时间：1min；保温：72℃，时间：5min。
PCR扩增体系如下：PCR反应体系为20μL，其中包含：2×phanta max master mix10μL，10mmol/LCTB4a -1930 F 1μL，10mmol/L CTB4a -1930 R 1μL，基因组DNA模板(20ng)1μL，ddH2O 7μL。
本发明提供了上述特异性分子标记在辅助鉴定水稻耐冷基因CTB4a中的应用。
本发明提供了上述特异性分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在水稻种质资源鉴定、筛选中的应用。
本发明提供了上述的特异性分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在耐冷能性水稻品种选育中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异分子标记的方法及相应的引物组合。本发明基于CTB4a启动子部位的 -1930bp 的多态性位点，开发了包含该位点特异PCR片段的限制性长度变异的信息的CAPS标记，该标记具有共显性，可从待测材料中快速准确分辨CTB4a及其等位基因。与现有的基于KASP技术的鉴定方法相比，本发明具有仪器要求低、操作方法简便及检测结果准确等特点。同时，利用本发明的方法无需重复进行亲本多态性的筛选，可加快耐冷水稻种质资源的筛选鉴定及品种选育进度，适用于我国大面积应用的水稻恢复系与不育系骨干亲本材料的转基因育种、基因聚合以及基于MAS技术的育种。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1为本发明所涉基因及其余水稻品种的CTB4a等位基因序列比对图。
图2为本发明限制性内切酶HindⅢ对所获得PCR片段进行酶切电泳结果图。
图3为本发明云南地方稻种资源的酶切产物电泳结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水稻耐冷基因CTB4a特异性CAPS标记的引物设计与检测
从National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中下载得到水稻品种日本晴（AP04960.1）、Changxianggeng 1813（CP101150.1)、RPBio-226（CP012612.1）、Shuhui498（CP018160.1）、Zhenshan97（CP056055.1）和Minghui 63（CP054679.1）的包含CTB4a启动子及编码区在内的序列，昆明小白谷及其余6个云南地方水稻品种的CTB4a等位基因序列由PCR扩增并测序得到；对这些序列进行比对，筛查CTB4a特异的、能区别于该位点等位基因的SNP位点。如图1所示，其中位于具有强耐冷性状的昆明小白谷CTB4a单倍型基因SNP -1930bp位的碱基为“G”，其余品种所有基因型均为“C”。进一步的分析，发现当SNP -1930bp位点的碱基为“C”时，该碱基与前后碱基一起组成位点“AAGCTT”，导致该类基因型在此处可被限制性内切酶HindⅢ识别并切开（图1）。
基于测序水稻品种93-11和日本晴的基因组DNA，利用Primer3（https://primer3.ut.ee/）软件设计检测上述分子标记的特异性引物组合，其序列为：ctb4a-1930F: CCTCCTCGTGCTCTACCAG；ctb4a-1930 R: AGGGAGTATGTACATAGGTTGGT；预计PCR扩增产物大小为567bp。
提取日本晴、93-11、昆明小白谷的基因组DNA，并用引物组进行扩增，均获得在500bp Marker处对应的长度一致的片段。
应用限制性内切酶HindⅢ对所获得PCR片段进行酶切，电泳检测后得下述结果：昆明小白谷样品泳道显现一条带，大小为567bp；日本晴和93-11样品的泳道显示两条带，分别为132bp和435bp（图2）。
实施例2、云南地方稻种资源CTB4a基因分析
（1）提取待测水稻基因组DNA
待测水稻样品共174份，为来源于云南不同稻区的云南地方稻种，使用CTAB法提取水稻样品基因组DNA。
（2）PCR反应扩增检测扩增包含 SNP -1930bp的片段
对待测水稻材料基因组DNA进行PCR扩增，
PCR扩增体系如下：PCR反应体系为20μL，其中包含：2×phanta max master mix10μL，10mmol/LCTB4a -1930 F 1μL，10mmol/L CTB4a -1930 R 1μL，基因组DNA模板(20ng)1μL，ddH2O 7μL。
PCR扩增反应条件为：预变性温度：95℃，时间：5min；变性温度：95℃，时间：30s；退火温度即TM值：56℃，时间：30s；延伸温度：72℃，时间：1min；保温：72℃，时间：5min。
PCR扩增产物酶切检测，酶切体系为：PCR扩增产物原液10μL，限制性内切酶QuickCut™ Hind III 1μL，10×QuickCut Buffer 2μL，ddH2O 7μL。酶切反应条件和时间为：37℃ 1.5 h。
酶切产物在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测，部分样品结果见图3。
（3）检测结果
在这174种材料中只有25种材料携带CTB4a（以昆明小白谷做对照），占总材料数14.37%，其中粳稻材料有14份，占总携带基因材料数的77.7%；籼稻材料有3份，占总携带基因材料数的16.6%。
表1. 参试水稻品种检测带型列表
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述（包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位）。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记位于CTB4a编码基因启动子区域的SNP -1930处。
2.根据权利要求1所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记的SNP位点碱基多态性为G/C；
若该位点处碱基为G，则待测水稻材料具有耐冷性基因CTB4a，
若该位点处碱基为C，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。
3.根据权利要求1所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记的检测引物组合包括引物ctb4a-1930 F和ctb4a-1930 R，以及限制性内切酶HindⅢ。
4.根据权利要求3所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记检测引物组合的PCR扩增反应条件为：预变性温度：95℃，时间：5min；变性温度：95℃，时间：30s；退火温度即TM值：56℃，时间：30s；延伸温度：72℃，时间：1min；保温：72℃，时间：5min。
5.根据权利要求3所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记检测引物组合的PCR扩增体系如下：PCR反应体系为20μL，其中包含：2×phanta max master mix 10μL，10mmol/L CTB4a -1930 F 1μL，10mmol/L CTB4a -1930 R 1μL，基因组DNA模板(20ng) 1μL，ddH2O 7μL。
6.根据权利要求3所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记检测引物组合的酶切体系为：PCR扩增产物原液10μL，限制性内切酶QuickCut™ Hind III 1μL，10×QuickCut Buffer 2μL，ddH2O 7μL；酶切反应条件和时间为：37℃ 1.5 h。
7.根据权利要求1所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记的应用包括以下步骤：
步骤1）：提取待检测水稻材料基因组DNA：
步骤2）：以待测水稻基因组DNA为模板，利用引物组合ctb4a -1930 F/ctb4a -1930 R进行扩增；
步骤3）：用限制性内切酶HindⅢ对PCR扩增产物进行酶切，其结果有一下几种情况：若PCR产物在酶切后只显示1条条带，则待测水稻材料携带耐冷性单倍型CTB4a；若PCR产物在酶切后只显示2条条带，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a；若PCR产物在酶切后只显示3条条带，则待测水稻材料则同时携带有耐冷性单倍型CTB4a和非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。
8.如权利要求1或2所述的特异性分子标记的应用，其特征在于，在水稻耐冷基因CTB4a鉴定中的应用。
9.如权利要求3或4或5所述的特异性分子标记的应用，其特征在于，所述引物组合在水稻种质资源鉴定、筛选中的应用。
10.如权利要求3或4或5所述的特异性分子标记的应用，其特征在于，所述引物组合在耐冷能性水稻品种选育中的应用。
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