CN116735878B - 多肽在诊断癌症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断及蛋白检测技术领域，具体提供了一种多肽在诊断癌症中的应用，以及多肽联合P53蛋白在诊断癌症中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断及蛋白检测技术领域，具体涉及多肽在诊断癌症中的应用，以及多肽联合P53蛋白在诊断癌症中的应用。
背景技术
P53蛋白是肿瘤抑制因子，也是转录因子，参与细胞周期调控，负调控细胞分裂发挥抑制肿瘤的作用。在人类癌症中，p53是最常发生突变的基因，大约50％的人类癌症存在p53突变，突变的P53蛋白失去了肿瘤抑制作用。大量表达的突变型P53蛋白引起机体免疫反应，产生P53蛋白的自身抗体，血清P53蛋白自身抗体可作为潜在的肿瘤诊断的标志物。目前常用抗原蛋白检测自身抗体，但抗原蛋白一般不易获得，并且每一种肿瘤自身抗体阳性率不高，临床价值不高。因此，本申请采用多肽作为抗原，多肽模拟蛋白抗原能与自身抗体结合，用于自身抗体的检测，具有通量高、多指标、小型化的优点，在肿瘤检测中有较高的特异性和灵敏度。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种多肽在制备诊断或辅助诊断或预后评估癌症的产品中的应用，所述的多肽包括SEQ ID NO：1-5中的任一种或两种以上的组合。
本发明的第二方面，提供了多肽和蛋白联合在制备诊断癌症的产品中的应用，所述的多肽包括SEQ ID NO：1-5中的任一种或两种以上的组合。
优选的，所述的多肽包括SEQ ID NO：1、3或4中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的多肽长度为15-30aa，优选15-20aa。例如可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽为SEQ ID NO：1、3或4。
所述的蛋白为P53蛋白。
本发明的第三方面，提供了结合多肽的自身抗体作为标志物在制备诊断或辅助诊断或预后评估癌症的产品中的应用，所述的多肽包括SEQ ID NO：1-5中的任一种或两种以上的组合。
优选的，所述的多肽为SEQ ID NO：1、3或4。优选的，所述的多肽可以包含修饰或标记，例如生物素等。
所述的自身抗体还结合P53蛋白。优选的，所述的P53蛋白可以包含修饰或标记，例如生物素等。
优选的，所述的癌症包括肺癌、胃癌、食管癌、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌或卵巢癌中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估癌症包括利用多肽检测自身抗体，或者，例如多肽联合P53蛋白检测自身抗体。
优选为检测自身抗体的存在或含量。优选为检测血清或血浆中的自身抗体。
优选的，所述的自身抗体为lgG和/或lgA。
优选的，所述诊断或辅助诊断或预后评估的对象可以为人或非人动物。
优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估癌症包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估癌症包括将多肽和P53蛋白与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
具体为将多肽，或者多肽和P53蛋白，包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人IgA花青染料(Cy5)标记的二抗或者抗人IgG花青染料(Cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与自身抗体的量呈正相关。
优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
优选的，所述的产品包括多肽和固相载体；进一步优选的，所述的产品还包括P53蛋白。
优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合；
进一步优选的，所述的产品为试剂盒或芯片。
优选的，所述的产品还包含试剂，例如有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
本发明的第四方面，提供了一种多肽，所述的多肽包括SEQ ID NO：1-5中的任一种或两种以上的组合。
优选的，所述的多肽为SEQ ID NO：1、3或4。
优选的，所述的多肽可以包含修饰或标记，例如生物素等。
优选的，所述的多肽可以与自身抗体结合。进一步优选与癌症患者(例如血清或血浆)中的自身抗体结合。
优选的，所述的多肽可以用于检测自身抗体。
优选的，所述的多肽可以用于诊断或辅助诊断或预后评估癌症。
优选的，所述的多肽或结合多肽的自身抗体可以作为癌症诊断或辅助诊断或预后评估的标志物。例如检测结合多肽的自身抗体的有无或含量可以评价癌症。所述的评价例如诊断、辅助诊断、预后评估或临床分型。
所述的多肽可以采用现有技术常规的方法进行制备。例如化学合成或者原核或真核表达等等。
本发明的第五方面，提供了一种组合物，所述的组合物包含上述多肽和P53蛋白。
所述的P53蛋白包含修饰或标记，例如生物素。
本发明的第六方面，提供了一种编码上述多肽的核酸。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述核酸的载体。
本发明的第八方面，提供了一种包含上述核酸或上述载体的细胞。
本发明的第九方面，提供了一种试剂盒或芯片，所述的试剂盒或芯片包含上述的多肽、组合物、核酸、载体或细胞。
优选的，所述的试剂盒或芯片还包含P53蛋白。
优选的，所述的P53蛋白可以包含修饰或标记，例如生物素。
优选的，所述的多肽包含修饰或标记，例如生物素。
优选的，所述的试剂盒或芯片还包含固相载体。
优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的试剂盒或芯片还包括试剂，所述的试剂例如有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
本发明的第十方面，提供了一种试剂盒或芯片的制备方法，所述的制备方法包括将上述的多肽包被在固相载体上。优选的，还包括将P53蛋白包被在固相载体上。
优选的，所述的包被可以为直接包被法和间接包被法。所述的直接包被法是将多肽直接固定于固相载体上，间接包被法是通过先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
本发明的第十一方面，提供了一种癌症的生物标志物，所述的癌症的生物标志物为多肽或结合上述多肽的自身抗体。
所述的自身抗体还结合P53蛋白。
优选的，所述的自身抗体为lgG和/或lgA。
优选的，所述的自身抗体来源于血清或血浆。
本发明的第十二方面，提供了一种检测自身抗体的方法，所述的方法包括使用上述的多肽、组合物或上述的试剂盒或芯片。
优选的，包括将多肽，或者多肽和P53蛋白，与待检测样本接触，检测自身抗体的量。
具体为将多肽，或者多肽和P53蛋白，包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人IgA花青染料(Cy5)标记的二抗或者抗人IgG花青染料(Cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与自身抗体的量呈正相关。
优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
本发明的第十三方面，提供了一种癌症的诊断方法，所述的诊断方法包括使用上述的多肽、组合物或上述的试剂盒或芯片。
优选的，包括将多肽，或者多肽和P53蛋白，与待检测样本接触，检测自身抗体的量。
具体为将多肽，或者多肽和P53蛋白，包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人IgA花青染料(Cy5)标记的二抗或者抗人IgG花青染料(Cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与自身抗体的量呈正相关。
优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。所述诊断的对象可以为人或非人动物，其中，所述的非人动物优选为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
本发明所述的“辅助诊断”是指包括本申请的方法以及现有技术中常规的方法或步骤。
本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：血浆中结合多肽P009-2的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图2：血浆中结合多肽P009-2的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图3：血浆中结合多肽P009-3的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图4：血浆中结合多肽P009-3的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图5：血浆中结合多肽P010的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图6：血浆中结合多肽P010的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图7：血浆中结合多肽P021的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图8：血浆中结合多肽P021的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图9：血浆中结合多肽P033-1的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图10：血浆中结合多肽P033-1的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图11：各种癌症患者组与健康组的针对多肽P010的P53 lgG型自身抗体ROC分析。
图12：各种癌症患者组与健康组的针对多肽P010的P53 lgA型自身抗体ROC分析。
图13：各种癌症患者组与健康组的针对多肽P021的P53 lgG型自身抗体ROC分析。
图14：各种癌症患者组与健康组的针对多肽P021的P53 lgA型自身抗体ROC分析。
图15：血浆中结合多肽P010的IgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者。
图16：血浆中结合多肽P021的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者。
图17：血浆中结合P53蛋白的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者。
图18：P010多肽、P021多肽、P53蛋白，IgG型自身抗体的在肺癌检测中的ROC曲线。
图19：P010多肽、P021多肽、P53蛋白联合检测，IgG型自身抗体的在肺癌检测中的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的试剂配方如下：
磷酸盐缓冲液(PBS)：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4，pH 7.4。
洗涤缓冲液(PBST)：pH7.4的1×PBST。
封闭缓冲液：含5％BSA的1×PBST。
实施例1：多肽用于癌症的诊断
1、筛选出的多肽和对照多肽序列见表1。
表1：多肽序列
2、临床样本见表2。
表2：临床样本
表3：肺腺癌样本患者情况
表4：肺鳞状细胞癌样本患者情况
表5：大细胞肺癌样本患者情况
表6：小细胞肺癌样本患者情况
表7：正常体检样本患者情况
3、检测步骤
1)P53多肽阵列打印：用PBS将表1中P53多肽稀释，然后使用Arrayjet微阵列点样仪将P53多肽重复四次打印到载玻片表面，制备的P53多肽微阵列存放在-20℃直至准备使用；
2)复温：将P53多肽载玻片从-20℃冰箱取出平衡至室温；
3)封闭：将P53多肽载玻片组装到孵育托盘中，加入400μL封闭缓冲液，室温放置1h，轻轻摇晃；
4)血清样本制备：4℃解冻血清样品，14,000×g离心10min。以1:100的比例将4μL血清加入到400μL封闭缓冲液中制得血清样本；
5)加入血清样本：去除封闭缓冲液，加入400μL稀释的血清，然后室温孵育2.5h，轻轻摇动；孵育完成后，用400μL PBST清洗载玻片3次，每次10分钟；
6)加荧光标记抗体：采用封闭缓冲液稀释二抗(工作浓度为4μg/mL)。加入400μL稀释的二抗，室温孵育1h，轻轻摇动。用400μL PBST清洗载玻片3次，每次清洗10分钟，再用400μL蒸馏水清洗载玻片两次，每次清洗2分钟；
7)干燥载玻片：除去剩余的液体，用真空泵或移液管排空孵育托盘，然后干燥载玻片；
8)上机读数：使用GenePix 4300A微阵列扫描仪在532nm或635nm波长下扫描所有阵列。使用GenePix Pro7软件提取荧光信号强度的中值，并保存数据。
4、试验结果
结合表1中P009-2、P009-3、P021、P010或P033-1多肽的自身抗体表达水平结果见图1-10及表8。具体的，结合多肽的自身抗体在癌症患者和健康对照组具有显著统计学差异，代表其可以作为癌症的特异性标志物。
表8：示例性的几种多肽在不同癌症中的表达水平显著性
另外，癌症患者与健康组的结合多肽的自身抗体ROC分析结果见图11-14。具体的：
对于lgG型自身抗体：
多肽P010在肺癌中的AUC为0.7650，根据约登指数确定Cutoff值为2.370时，特异度为78.95％，灵敏度为72.73％。多肽P010在食管癌中的AUC为0.8386，根据约登指数确定Cutoff值为2.499时，特异度为84.21％，灵敏度为80％。多肽P010在胃癌中的AUC为0.7162，根据约登指数确定Cutoff值为2.367时，特异度为78.95％，灵敏度为64.29％。多肽P010在其他7种癌症中的AUC为0.8053，根据约登指数确定Cutoff值为2.366时，特异度为78.95％，灵敏度为80％(图11)。
多肽P021在肺癌中的AUC为0.7524，根据约登指数确定Cutoff值为8.308时，特异度为68.42％，灵敏度为75％。多肽P021在食管癌中的AUC为0.7105，根据约登指数确定Cutoff值为7.845时，特异度为63.16％，灵敏度为76.67％。多肽P021在胃癌中的AUC为0.7444，根据约登指数确定Cutoff值为11.96时，特异度为84.21％，灵敏度为53.57％。多肽P021在其他7种癌症中的AUC为0.7386，根据约登指数确定Cutoff值为8.333时，特异度为68.42％，灵敏度为73.33％(图13)。
对于lgA型自身抗体：
多肽P010在肺癌中的AUC为0.7961，根据约登指数确定Cutoff值为2.685时，特异度为68.18％，灵敏度为84.21％。多肽P010在食管癌中的AUC为0.8158，根据约登指数确定Cutoff值为2.932时，特异度为100％，灵敏度为53.33％。多肽P010在胃癌中的AUC为0.8026，根据约登指数确定Cutoff值为2.944时，特异度为100％，灵敏度为32.63％。多肽P010在其他7种癌症中的AUC为0.8491，根据约登指数确定Cutoff值为2.594时，特异度为78.95％，灵敏度为80％(图12)。
多肽P021在肺癌中的AUC为0.7865，根据约登指数确定Cutoff值为42.37时，特异度为68.42％，灵敏度为90.91％。多肽P021在食管癌中的AUC为0.7719，根据约登指数确定Cutoff值为42.57时，特异度为68.42％，灵敏度为93.33％。多肽P021在胃癌中的AUC为0.8195，根据约登指数确定Cutoff值为44.57时，特异度为68.42％，灵敏度为100％。多肽P021在其他7种癌症中的AUC为0.7860，根据约登指数确定Cutoff值为40.36时，特异度为63.16％，灵敏度为96.67％(图14)。
实施例2：多肽与P53联合对癌症的诊断
为了验证多肽与P53联合诊断癌症的效果，本申请以肺癌为例进行实验。
1、临床样本见表9。
表9：临床样本
2、检测步骤
1)P53多肽及P53蛋白阵列打印：用PBS将P53多肽、P53蛋白稀释，然后使用Arrayjet微阵列点样仪将P53多肽及P53蛋白重复四次打印到载玻片表面，制备的P53多肽及P53蛋白微阵列存放在-20℃直至准备使用；
2)复温：将P53多肽及P53蛋白载玻片从-20℃冰箱取出平衡至室温；
3)封闭：将P53多肽及P53蛋白载玻片组装到孵育托盘中，加入400μL封闭缓冲液，室温放置1h，轻轻摇晃；
4)血清样本制备：4℃解冻血清样品，14,000×g离心10min。以1:100的比例将4μL血清加入到400μL封闭缓冲液中制得血清样本；
5)加入血清样本：去除封闭缓冲液，加入400μL稀释的血清，然后室温孵育2.5h，轻轻摇动；孵育完成后，用400μL PBST清洗载玻片3次，每次10分钟；
6)加荧光标记抗体：采用封闭缓冲液稀释二抗(工作浓度为4μg/mL)。加入400μL稀释的二抗，室温孵育1h，轻轻摇动。用400μL PBST清洗载玻片3次，每次清洗10分钟，再用400μL蒸馏水清洗载玻片两次，每次清洗2分钟；
7)干燥载玻片：除去剩余的液体，用真空泵或移液管排空孵育托盘，然后干燥载玻片；
8)上机读数：使用GenePix 4300A微阵列扫描仪在532nm或635nm波长下扫描所有阵列。使用GenePix Pro7软件提取荧光信号强度的中值，并保存数据。
4、试验结果
P010多肽lgG型自身抗体在肺癌与健康组存在显著差异，结果见图15。
P010多肽lgG型自身抗体在肺癌组和健康组ROC结果分析见图18。具体的，对于lgG型自身抗体，多肽P010的AUC为0.7162，特异度为78.95％，灵敏度为64.29％。
P021多肽lgG型自身抗体在肺癌与健康组存在显著差异，结果见图16。
P021多肽lgG型自身抗体在肺癌组和健康组ROC结果分析见图18。具体的，对于lgG型自身抗体，多肽P021的AUC为0.7444，特异度为84.21％，灵敏度为53.57％。
P53蛋白lgG型自身抗体在肺癌与健康组存在显著差异，结果见图17。
P53蛋白lgG型自身抗体在肺癌组和健康组ROC结果分析见图18。具体的，对于lgG型自身抗体，P53蛋白的AUC为0.8120，特异度为84.21％，灵敏度为67.86％。
P010多肽、P021多肽、P53蛋白lgG型自身抗体在肺癌组和健康组联合分析ROC结果见图19。具体的，对于lgG型自身抗体，P010多肽、P021多肽、P53蛋白联合诊断AUC为0.8609，特异度为85.71％，灵敏度为73.68％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.多肽和P53蛋白联合在制备诊断肺癌的产品中的应用，其特征在于，所述的多肽如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品还包括固相载体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条或塑料球。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品为试剂盒或芯片。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含多肽和P53蛋白，所述的多肽如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含固相载体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条或塑料球。
8.一种芯片，其特征在于，所述的芯片包含多肽和P53蛋白，所述的多肽如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
9.根据权利要求8所述的芯片，其特征在于，所述的芯片还包含固相载体。
10.根据权利要求9所述的芯片，其特征在于，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条或塑料球。
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