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CN104422768A - 一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒 - Google Patents

一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒 Download PDF

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CN104422768A CN201310389388.4A CN201310389388A CN104422768A CN 104422768 A CN104422768 A CN 104422768A CN 201310389388 A CN201310389388 A CN 201310389388A CN 104422768 A CN104422768 A CN 104422768A
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Abstract

本发明涉及一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒。本发明所述的试剂盒包括：固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；特异性抗体，选自针对如下卵巢癌标志物的抗体：MSP-α、TIMP-4、PDGF-Rα、OPG、CA125；所述各种特异性抗体分别固定于所述固相载体上，形成若干个独立识别位点；反应剂和检测剂；所采用的对照品包括：对照血清和确诊卵巢癌病人血清。本发明从174种标志物中经过创新方法筛选出5种标志物，采用针对5种标志物的特异性抗体制备得本发明所述的抗体芯片试剂盒，非常适合于早期诊断卵巢癌，该5种标志物的抗体组合是首次报道，其检测效果是高特异性和高灵敏度的。

Description

一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒。
背景技术
卵巢癌（EOC）是当今妇科恶性肿瘤死亡的首要原因，是中国妇女癌症死亡的五大最常见的原因之一。大多数卵巢癌的早期症状是微弱的，不像是会威胁到生命的身体变化。这些症状包括纳差、腹胀、骨盘不适、后背痛、早饱感、消化不良、恶心呕吐、排便习惯改变等。因此，大概80%的癌患者在晚期才诊断出卵巢癌。这个时期确诊的患者的五年存活率只有15-20%，而在早期阶段就能诊断出卵巢癌的患者的五年存活率能达到90%。因此迫切需要开发一种能在早期阶段就能检测出卵巢癌的生物标记物。
临床上采用酶标法对相关肿瘤标志物进行检测。酶标法就是将酶与抗原（抗体）结合，形成酶标物，与相应的抗体（抗原）反应形成免疫复合物。在一定的底物参与下，免疫复合物上的酶催化底物使其水解形成显色物质。酶的催化底物与显色程度成正比。因此可以定量测定样品中肿瘤标志物的含量。该技术需要离心机、孵育箱、酶标仪等实验设备，操作过程复杂。目前主要采用检测CA125肿瘤标记物的ELISA法检测卵巢癌，但单个指标的特异性不强，没有高通量的检测手段辅助诊断。
目前临床常用的检测方法是采用肿瘤标志物的检测试剂盒，存在操作复杂，重复，费时，费力，费钱等缺点。常规的ELISA一次只能从样品检测一个肿瘤标志物。对多个肿瘤标志物的检测用常规ELISA不止耗时耗力，而且需要许多病人的样品。同时，肿瘤标志物的特异性不强，不能检测出到底在哪个器官发生了恶性肿瘤，需借助超声波，核磁共振等物理方法配合检测以确定病变部位。
由于肿瘤的复杂性和异质性，一个生物标志物不可能有足够高的特异性和灵敏度来检测出疾病所有亚型和阶段。恶性肿瘤的发展是一个极其复杂的过程，其间有很多生物学上的变化（Hanahan and Weinberg,2000）。在分子水平上，这些生物学的变化是顺序遗传和表观遗传病变引起多种信号通路的基因表达模式改变的结果。另一方面，癌症是个体的疾病：患有同类型的癌症的不同病人可能会经历不同的疾病过程，且对同样的治疗有不同的临床反应。因此，从患有同样的癌症的不同病人很可能有不同的生物标志物分类。如果使用单一的生物标志物，很多患者将被错误诊断。因此，多个生物标志物或者一组生物标志物可能是不同癌症鉴别诊断的必要。此外，在早期阶段，生物标志物表达水平的变化是非常小的，所以多个生物标志物组合可能比单一指标有更多的预测能力。Lokshin博士的研究组（Molina et al.，2004）测定44例早期卵巢癌、45健康妇女、37例良性肿瘤患者血清中24个细胞因子和CA-125。其中，6个标志物包括IL-6，IL–8、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1的）和CA-125在卵巢癌和对照组血清中有显著性差异，84%灵敏度和95%特异性。此外，与其他6个生物标志物组合（CA-125、OPN、IGF-II、MIF、瘦素与泌乳素），Gil Mor’s的小组（Molina et al.，2004）成功开发出了一个血清生物标志物组合检测卵巢癌，具有95.3％的灵敏度和99.4％的特异性。
当前对于卵巢癌的诊断方法依赖于识别症状、活体结果和一个或多个血清蛋白标志物的检测，包括血清CA125、HE4、YKL-40、TATI、CEA和Tag-72。然而，这些标志物也只能检出40%的无症状病人。如果要对血清CA125、HE4、YKL-40、TATI、CEA和Tag-72等多种生物标志物进行检测，就需要多个试剂盒才能将所有的多种生物标志物检测完毕，每次反应只能检测一个指标，速度慢，效率低，费用昂贵，需要样本的量大。
当前使用最多的检测卵巢癌的方法是血清CA125表达水平与影像学的检测，但这两种方法即使同时采用也无法百分百诊断早期卵巢癌。比如，血清CA125在早期癌症患者中有大于98%的灵敏度，但只有50-60%的特异性。其它肿瘤生成，血清中CA125的表达水平也会升高。因此，就有较大一部分比例患有早期癌症的病人漏诊。此外，目前还缺乏针对卵巢癌的特异性治疗抗体。目前还没有批准用于卵巢癌诊断的试剂盒出现。
当前使用最多的方法是血清CA125表达水平与影像学的检测，但这两种方法即使同时采用也无法百分百诊断早期卵巢癌。比如，血清CA125在早期癌症患者中有大于98%的灵敏度，但只有50-60%的特异性。其它肿瘤生成，血清中CA125的表达水平也会升高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒，实现高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的早期卵巢癌检测。
本发明所述的一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒，包括：固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；特异性抗体，选自针对如下卵巢癌标志物的抗体：MSP-α（人巨噬细胞刺激蛋白α）、TIMP-4（金属蛋白酶组织抑制剂-4）、PDGF-Rα（血小板衍生因子受体α）、OPG（护骨素）、CA125（癌抗原125）；所述各种特异性抗体分别固定于所述固相载体上，形成若干个独立识别位点；反应剂和检测剂，包括：抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，抗体混合液中的特异性抗体上标记有生物素；链霉亲和素，用于识别特异性抗体上的生物素标记；所述链霉亲和素标记有荧光染料，所述荧光染料为Cy3或具有类似吸收波长的荧光染料；肿瘤标志物标准品，所述肿瘤标志物准品为具有梯级浓度所述若干种肿瘤标志物的混合物；所采用的对照品包括：对照血清和确诊卵巢癌病人血清。
根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，在一张玻片表面用非接触性点样仪将多种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2×8个相同的抗体微阵列，将点有2×8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2×8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列；玻片和框架之间通过两侧的边框夹紧扣形成抗体芯片。
根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述框架是由三部分组成：上层塑料框架、下层乳胶封闭框和两侧的边框夹；乳胶封闭框通过高透明双面胶贴于表面点有微阵列的玻片上，乳胶封闭框的另一面贴上塑料框架，再用边框夹将它们两边夹紧，形成孔间互不交叉污染的反应器。
本发明所述的联合检测早期卵巢癌标志物的抗体检测芯片试剂盒具有以下优点：
（1）该试剂盒采用了针对5种精选的标志物的特异性抗体，这5种标志物中的4种（MSP-α、TIMP-4、PDGF-Rα、OPG）是从174种标志物中经过发明人的创新方法筛选出来的，非常适合于早期诊断卵巢癌，这4种标志物与CA125的抗体组合是首次报道，其检测效果是高特异性和高灵敏度的。
（2）本发明所述的试剂盒采用抗体联合检测芯片技术，只需要检测这5种肿瘤标志物，就能达到检测上百种标志物的同等效果，不仅填补了抗体芯片检测卵巢癌的空白，而且克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
附图说明
图1是174个血清标记物的抗体芯片散点图。
图2是174个血清标记物的抗体芯片的筛选结果。
图3a显示卵巢癌和健康对照组的174标记抗体阵列的人工神经网络分析结果。
图3b是对8个血清标记物进行人工神经网络分析的结果。
图4显示了ELISA法检测两个血清标记物（MSP-α和TIMP-4）的代表性数据。
图5是对抗原-抗体对的特异性的测试结果。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一：用于检测早期卵巢癌的血清标记物的确定
本实施例试图从候选的血清标记物中筛选得到特异性的可用于检测早期卵巢癌的标记物，用于抗体检测芯片的制造。
图1是174个血清标记物的抗体芯片散点图。如图1所示，A组（左）为在同一日对同一样品在同一张膜的测定结果，显示174个血清标记物与卵巢癌具有很强的相关性；B组（中）为在不同的日子对同一样品中在不同的膜的测定结果，显示这174个血清标记物与卵巢癌也具有很强的相关性；C组（右）为在同一日用同一张膜对癌症患者与健康人群样品的检测结果，显示这174个血清标记物之间的相关性较差。
实验提示，尽管174个血清标记物表现出与卵巢癌的强相关性，但各个血清标志物之间对于癌症患者与健康人群的区别度较大，应当从中进一步筛选特异性强的标记物以便用于制备检测卵巢癌的试剂盒。
图2是174个血清标记物的抗体芯片的筛选结果。这里挑选了部分代表性的芯片，其中，面板A（左）中显示芯片6的代表性结果，面板B（中）中显示芯片7的代表性结果，面板C（右）中显示芯片8的代表性结果。
以下，利用卵巢癌患者和健康人群样本中对174个血清标记物的抗体芯片的人工神经网络分析，结果见图3。这里采用了留一交叉验证筛选方法（leave-onecross-validation approach）：每一回合把样本N分成训练组N-1和预测组1，就会得到N个模型,用N个模型最终的预测组的分类准确率的平均数作为此下分类样本的性能指标。此筛选方法的优点是每一回合中几乎所有的样本皆用于训练模型，因此最接近原始样本的分布，这样评估所得的结果比较可靠；实验过程中没有随机因素会影响实验数据，确保实验过程是可以被复制的。
筛选方法：首先采用法选出8个标记物，该法的优点是所有的样本皆用于训练模型，因此最接近原始样本的分布，这样评估所得的结果比较可靠。其次采用SPSS法从8个中逃选出5个血清标记物。再用ELISA验证这5个血清标记物。
图3a显示卵巢癌和健康对照组的174标记抗体阵列的人工神经网络分析结果。图中所示的这两个训练组和预测组。实验选择了87个样本，分为训练组（51个样本，其中健康样本31个，卵巢癌样本20个）和预测组（36个样本，其中健康样本22个，卵巢癌样本14个），结果表明：临床诊断的正确一致率在训练组和预测组中分别只有90%和89%。
通过人工神经网络分析，共有8个血清标志物被挑选出来作为有效的预期因子。这8种因子是：MSP-α（人巨噬细胞刺激蛋白α）、TIMP-4（金属蛋白酶组织抑制剂-4）、PDGF-Rα（血小板衍生因子受体α）、OPG(护骨素)、MIG、IGF-I、IGF-II、GITR。
然后，采用这8种血清标志物在预测组中预测疾病状态。通过人工神经网络分析，与临床诊断的正确一致率在训练组和预测组中分别只有82%和80%。
对这8个血清标记物进行人工神经网络分析，结果见图3b，挑选最上面的4个血清标记物，再利用SPSS软件对这4个血清标记物用于层次聚类（hierarchalcluster）分析。结果表明，对于这4个血清标记物（MSP-α、TIMP-4、PDGF-Rα、OPG），95%健康对照样本和62%卵巢癌样本能被正确识别，总的正确识别率为83%。
所有87个样本是通过上述4个血清标志物加上CA125（癌抗原125）采用分割点分数分析。采用截止点分数3，100%的卵巢癌样本和95%健康对照样本能被正确识别，总的正确识别率为96.6%。
因为CA125是最广泛用于卵巢癌检测的标志物，发明人比较了在CA125与5个标志物面板在ROC曲线（受试者工作特征曲线）上的AUC值（曲线下面积）。CA125单独的AUC值为0.87，另一方面，新识别的5个标志物面板的AUC值为0.98。结果表明，新识别的5个标志物都可用于卵巢癌的早期检测。
这些4种标志物，通过ANN（人工神经网络）分析和分割点分数分析来识别，然后通过ELISA（酶联免疫）试剂盒确认。图4显示了ELISA法检测两个血清标记物（MSP-α和TIMP-4）的代表性数据。在卵巢癌和健康对照血清样本中确定抗体阵列数据和ELISA数据是完全一致的。抗体阵列的数据以数组中位数的信号强度（FI）显示，ELISA法的试验数据以平均蛋白浓度（纳克/毫升）显示。
实施例二：本发明所述的联合检测早期卵巢癌标志物的抗体检测芯片试剂盒的构建
为了开发本发明所述的联合检测早期卵巢癌标志物的抗体检测芯片试剂盒，首先从供应商筛选现有抗体产品或通过自行开发合适的抗体对。然后从这些抗体中筛选出5个抗体对用于创建一个芯片以同时检测卵巢癌疾病相关的5个肿瘤标记物。
材料
所述抗体和抗原购买如表1至表3所示。
表1：
捕获抗体 供应商
MSP链 MAB352 R&D
TIMP-4 119-16174 RayBiotech
PDGF R 119-11860 RayBiotech
OPG 119-12729 RayBiotech
CA125 M86306M Meridian
表2：
检测抗体 供应商
MSP链 BAM3521 R&D
TIMP-4 BAF974 R&D
PDGF R BAF322 R&D
OPG BAF805 R&D
CA125 M86924M Meridian
表3：
抗原 供应商
MSP链 352-MS-050/CF R&D
TIMP-4 230-00269 Raybiotech
PDGF R 322-PR-050/CF R&D
OPG 805-OS/CF R&D
CA125 A43350H Meridian
链霉亲和素购买于BD PharMingen公司。玻片购买于Corning公司（美国纽约州康宁）。
使用点样机将捕获抗体点于玻片上，每个点的体积为350pl，间距为500μm。每种抗体点4个重复点；每种玻片有16个独立的微阵列。生物素标记的抗牛IgG（羊）抗体也点于玻片上作为阳性对照。玻片被具有16个杂交室的垫片固定以防止微阵列间的交叉污染。在室温干燥1-2小时后，用含5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭30min。然后，每张微阵列分别用细胞培养上清、人类血清、组织裂解液或者不同浓度的标准蛋白混合物（封闭液稀释）4℃孵育过夜。玻片用洗涤液I（PBS，0.1%Tween20）洗涤三次，每次5min；洗涤液II（PBS）洗涤两次，每次5min；以洗净不结合的蛋白。然后，玻片用相应的抗体对（生物素标记）孵育2小时。洗涤后，玻片用荧光染料HyLight555（激发波长550nm，发射波长566nm）标记的链霉亲和素室温孵育1小时，然后按上述步骤洗涤玻片。干燥后，用激光扫描仪（Genepix 4000B，Axon Instruments公司，美国加州Sunnyvale）扫描玻片，获取信号。
上述抗体联合检测芯片的构建，是基于现有的蛋白芯片技术，并针对卵巢癌疾病相关蛋白检测的特殊性来加以摸索而反复试验所完成的。其中，有以下特别需要注意的关键点：
（1）在芯片的组成上，本发明采用活性氨基丙基硅烷包被的玻片，取代目前蛋白芯片常用的玻片。实验表明，普通玻片的背景比较高，尤其是在检测蛋白样品时稳定性和重复性都比较差。针对本发明的要求，发明人特意选用活性氨基丙基硅烷包被的玻片，不仅降低了实验的背景，而且使芯片的稳定性和检测的敏感性都有大幅的改善。
（2）在芯片的制备工艺上，优化了芯片点阵，控制温度为70-75F，湿度为40-45%，实验表明，这样的芯片可以改善点样的形态，使抗体在玻片上的分布更加均匀。同时，过夜室温的静置有利于抗体更有效的固定在玻片上。
（3）在芯片的检测上，目前最常用Cy3（激发550nm，发射570nm）荧光染料作为绿光激光扫描检测所选用的荧光素。但是，Cy3对激光的稳定性差，光失活明显。为了解决蛋白检测时不同次扫描时的重复性问题，本发明选用有显著耐光失活效应而且信号更强的HyLight555（激发550nm，发射566nm）标记标记的链霉亲和素，使实验的敏感度和重复性都有明显的改善。
(4)在一张玻片表面用非接触性点样仪将多种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2×8个相同的抗体微阵列，将点有2×8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2×8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列；玻片和框架之间通过两侧的边框夹紧扣形成抗体芯片。
(5)所述框架是由三部分组成：上层塑料框架、下层乳胶封闭框和两侧的边框夹；乳胶封闭框通过高透明双面胶贴于表面点有微阵列的玻片上，乳胶封闭框的另一面贴上塑料框架，再用边框夹将它们两边夹紧，形成孔间互不交叉污染的反应器。
实施例三：抗体芯片的灵敏度和特异性实验
实施例二所制备的芯片的各个标记物灵敏度显示于表4中。
表4：
标记物 pg/ml
MSP-α 10000
OPG 100
PDGF-Rα 10
TIMP-4 100
各标记物的灵敏度取决于每个检测目标的正常范围。一些检测目标在血清中是非常丰富的，因为检测灵敏度较低是足够的，而一些检测目标在血清中的含量是痕量的，则需要较高的检测灵敏度。上述四种标记物的灵敏度符合检测目标的要求。
表4中蛋白质的检测水平在pg/ml到ng/ml的范围内，其中最小的检测水平为10pg/ml。蛋白质检测灵敏度的差异可能是由于每个抗原-抗体相互作用的结合亲和力差异，以及特异性抗体结合固体支持物的特性差异造成的。
接着，对抗原-抗体对的特异性进行测试。芯片孵育于每种抗原终浓度为10ng/ml的抗原混合物中，然后再用每个检测抗体分别检测。每个捕获抗体与其相应的检测抗体之间最强信号用下划线标明，表明具有较高的特异性相互作用。参见图5。
然后，通过比较同一芯片中4个重复点的信号，同一玻片中3个不同芯片的信号及分别来自三张不同玻片3个芯片的信号检测差异性。变异系数表明此系统的可靠性是好的。为了获得每种目标蛋白的标准曲线，纯化的抗原混合物以梯度浓度孵育于玻片的不同芯片中。在此标准混合物中每种抗原的浓度是根据玻片上其相应捕获抗体的灵敏度进行优化的。标准曲线由每种目标蛋白的浓度比信号强度表示。除了特异性，灵敏度及差异性以外，本发明也验证了该抗体芯片的稳定性及准确性。首先，用细胞培养上清和人类血清检测芯片。通过添加不同浓度的重组蛋白于细胞培养上清和人类血清中进行研究。大多数被添加蛋白的回收率达到理论值的80%。极少数蛋白的低回收率可能是由于基质影响或样品中特异目标蛋白的高丰度造成的。
应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种联合检测早期卵巢癌标志物的抗体芯片试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；
特异性抗体，选自针对如下卵巢癌标志物的抗体：MSP-α（人巨噬细胞刺激蛋白α）、TIMP-4（金属蛋白酶组织抑制剂-4）、PDGF-Rα（血小板衍生因子受体α）、OPG（护骨素）、CA125（癌抗原125）；所述各种特异性抗体分别固定于所述固相载体上，形成若干个独立识别位点；
反应剂和检测剂，包括：抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，抗体混合液中的特异性抗体上标记有生物素；链霉亲和素，用于识别特异性抗体上的生物素标记；所述链霉亲和素标记有荧光染料，所述荧光染料为Cy3或具有类似吸收波长的荧光染料；肿瘤标志物标准品，所述肿瘤标志物准品为具有梯级浓度所述若干种肿瘤标志物的混合物；
所采用的对照品包括：对照血清和确诊卵巢癌病人血清。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：在一张玻片表面用非接触性点样仪将多种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2×8个相同的抗体微阵列，将点有2×8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2×8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列；玻片和框架之间通过两侧的边框夹紧扣形成抗体芯片。
3.根据权利要求2所述的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述框架是由三部分组成：上层塑料框架、下层乳胶封闭框和两侧的边框夹；乳胶封闭框通过高透明双面胶贴于表面点有微阵列的玻片上，乳胶封闭框的另一面贴上塑料框架，再用边框夹将它们两边夹紧，形成孔间互不交叉污染的反应器。
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