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CN116615251A - 包含glp1肽模拟物的抗体-药物缀合物及其用途 - Google Patents

包含glp1肽模拟物的抗体-药物缀合物及其用途 Download PDF

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CN116615251A
CN116615251A CN202180076678.6A CN202180076678A CN116615251A CN 116615251 A CN116615251 A CN 116615251A CN 202180076678 A CN202180076678 A CN 202180076678A CN 116615251 A CN116615251 A CN 116615251A
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antibody
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gly
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A·韩
冈本春香
W·奥尔森
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本文描述了蛋白‑药物缀合物及其组合物，该蛋白‑药物缀合物及其组合物可用于例如靶向胰高血糖素样肽1受体(GLP1R)。在某些实施方案中，提供了肽模拟物有效载荷和接头‑有效载荷以及制备其的方法。更具体地，提供了GLP1肽模拟物、抗体‑药物缀合物和包含抗GLP1R抗体和GLP1肽模拟物有效载荷的组合物以及治疗GLP1R相关状况的方法。

Description

包含GLP1肽模拟物的抗体-药物缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月14日提交的美国临时专利申请第63/077,983号的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入。于2021年9月8日生成的所述ASCII副本被命名为250298_000250_SL.txt并且大小为6,072字节。
本公开内容的领域
本公开内容涉及蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、药物组合物及用其治疗疾病的方法。还提供了肽模拟物有效载荷和接头-有效载荷及其制备方法。更具体地，本公开内容涉及包含GLP1肽模拟物的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)以及用其治疗GLP1R相关状况的方法。
本公开内容的背景
糖尿病是糖代谢异常的慢性疾病。估计全球4.25亿人伴随有糖尿病。全球糖尿病药物包括胰岛素、DPP-4抑制剂、胰高血糖素样肽1受体(GLP1R)激动剂，但大多数患者没有实现控制高血糖和心血管风险因素的组合治疗目标。
胰高血糖素样肽1受体(GLP1R)是胰高血糖素样肽1(GLP1)的受体，并且在胰腺β细胞中表达。GLP1R也在脑中表达，在脑中它起控制食欲、记忆和学习的作用。GLP1R是G蛋白偶联受体(GPCR)分泌素家族(B类)的成员。在结合其配体GLP1后，GLP1R通过Gαs G蛋白(提高细胞内环AMP(cAMP)水平)启动下游信号传导级联，这导致基因的转录调节(Donnelly2011)。GLP1R的激活导致胰岛素合成和胰岛素释放增加。
GLP1R和GLP1是高度有效的肥胖和2型糖尿病靶。销售的GLP1R激动剂增加胰岛素分泌，从而降低血糖水平，但它们需要每周或更频繁地施用。
因此，本领域对于持续时间更长且安全性更好的GLP1R激动剂存在需求。在某些实施方案中，本公开内容满足需求并且提供其他优点。
呈现前述讨论仅仅是为了提供对本领域所面临的问题性质的更好的理解，并且不应该以任何方式被解释为对现有技术的承认，也不应该将本文中任何参考文献的引用解释为对这样的参考文献构成本申请的“现有技术”的承认。
公开内容的概述
下文描述本公开内容的多种非限制性方面和实施方案。
在一个方面，具有式(A)结构的化合物：
BA-(L-P)m(A)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自键、–(CH2)2-6–NH–、–(CH2)2-6–Tr–和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文提供了具有式(I)结构的化合物：
BA-L-P(I)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷P附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
或其药学上可接受的盐。
在本文描述的化合物的一些实施方案中，BA是靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向GLP1R的抗体是GLP1R激动剂抗体。在一些实施方案中，靶向GLP1R的抗体是5A10、9A10、AB9433-I、h38C2、PA5-111834、NLS1205、MAB2814、EPR21819或glutazumab。
在一些实施方案中，接头L与BA的一条或两条重链附接。在一些实施方案中，接头L与BA的一条或两条重链可变结构域附接。在一些实施方案中，接头L与BA的一条或两条轻链附接。在一些实施方案中，接头L与BA的一条或两条轻链可变结构域附接。
在一些实施方案中，接头L经由谷氨酰胺残基与BA附接。在一些实施方案中，谷氨酰胺残基被引入BA的一条或两条重链的N末端。在一些实施方案中，谷氨酰胺残基被引入BA的一条或两条轻链的N末端。在一些实施方案中，谷氨酰胺残基天然存在于BA的CH2结构域或CH3结构域中。在一些实施方案中，谷氨酰胺残基通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至BA中。在一些实施方案中，谷氨酰胺残基是Q295或N297Q。
在一些实施方案中，接头L经由赖氨酸残基与BA附接。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是非糖基化的。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是去糖基化的。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab片段。
在一种实施方案中，m是1。在一种实施方案中，m是从2至4的整数。在一种实施方案中，m是2。
在一些实施方案中，多于一个L-P与BA附接。在一些实施方案中，两个L-P与BA附接。
在一些实施方案中，接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp不存在或是与所述P共价附接的第二接头，其中当Lp不存在时，Y也不存在。
在一些实施方案中，Y具有选自由以下组成的组的结构：
其中Q是C或N。
在一些实施方案中，Lp包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段。在一些实施方案中，PEG区段包括2个与30个之间的EG单元。在一些实施方案中，PEG区段包括4个与24个之间的EG单元。在一些实施方案中，PEG区段包括4个EG单元或8个EG单元或12个EG单元或24个EG单元。在一些实施方案中，PEG区段包括4个EG单元。在一些实施方案中，PEG区段包括8个EG单元。
在一些实施方案中，Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
或其三唑位置异构体，
其中p是从1至36的整数。
在一些实施方案中，Lp包括选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸。在一些实施方案中，Lp包括1个至10个甘氨酸。在一些实施方案中，Lp包括1个至6个丝氨酸。在一些实施方案中，Lp包括1个至10个甘氨酸和1个至6个丝氨酸。在一些实施方案中，Lp包括4个甘氨酸和1个丝氨酸。在一些实施方案中，Lp选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)(SEQ ID NO:1)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)(SEQ ID NO:2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S-G4S)(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，Lp包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。在一些实施方案中，丝氨酸残基包括糖类基团。在一些实施方案中，丝氨酸残基包括葡萄糖基团。
在一些实施方案中，Lp具有选自由以下组成的组的结构：
其中Y是包含三唑的基团，并且P是有效载荷，并且其中Rc选自H和葡萄糖，g是从1至10的整数，并且s是从0至4的整数。
在一些实施方案中，Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
以及或其三唑位置异构体。
在一些实施方案中，La包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段。在一些实施方案中，PEG区段包括4个EG单元或8个EG单元或12个EG单元或24个EG单元。在一些实施方案中，PEG区段包括8个EG单元。在一些实施方案中，La具有选自由以下组成的组的结构：和
在一些实施方案中，La包括选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸。在一些实施方案中，La包括1个至10个甘氨酸和1个至6个丝氨酸。在一些实施方案中，La包括4个甘氨酸和1个丝氨酸。在一些实施方案中，La选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(G2S-G2S-G2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(G4S-G4)。
在一些实施方案中，La包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。在一些实施方案中，La选自由以下组成的组：
在一些实施方案中，La包括–(CH2)2-24-链。在一些实施方案中，La包括–(CH2)2-24-链、具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。La选自由以下组成的组：
在本文描述的化合物的各种实施方案中，P具有结构
在一些实施方案中，X1是H；X2是X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；n是1，并且X4是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH2OH，并且X7是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；n是1；X4是H，并且X5是
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3；X7是并且X8是-NH2。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X8是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时都是H；X7是并且X8是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3；X7是并且X8是
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3，并且X7是
在一些实施方案中，X1是H；X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X5是
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是0；X4是苯基，并且X5是
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是苯基，并且X5是
在本文描述的化合物的各种实施方案中，P具有结构
在一些实施方案中，X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；X4是H，并且X5是
在本文描述的化合物的各种实施方案中，P具有选自由以下组成的组的结构：
在本文描述的化合物的各种实施方案中，化合物在血浆中具有长于7天的半衰期。
在本文描述的化合物的各种实施方案中，化合物不与除了GLP1R之外的G蛋白偶联受体(GPCR)结合。
在另一个方面，本文提供了包含本文描述的任何一种实施方案的化合物的药物组合物。
在另一个方面，本文提供了包含本文描述的任何一种实施方案的化合物的药物剂型。
在另一个方面，本文提供了一种用本文描述的任何一种实施方案的化合物选择性地靶向细胞表面上的GLP1R的方法。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。在一些实施方案中，细胞是胰腺细胞、脑细胞、心脏细胞、血管组织细胞、肾细胞、脂肪组织细胞、肝细胞或肌细胞。
在另一个方面，本文提供了一种增强有相应需要的个体的GLP1R活性的方法，包括向个体施用有效量的本文描述的任何一种实施方案的化合物、本文描述的组合物或本文描述的剂型。
在另一个方面，本文提供了一种降低有相应需要的个体的血糖水平的方法，包括向个体施用有效量的本文描述的任何一种实施方案的化合物、本文描述的组合物或本文描述的剂型。
在另一个方面，本文提供了一种降低有相应需要的个体的体重的方法，包括向个体施用有效量的本文描述的任何一种实施方案的化合物、本文描述的组合物或本文描述的剂型。
在另一个方面，本文提供了一种治疗有相应需要的个体的GLP1R相关状况的方法，包括向个体施用有效量的本文描述的任何一种实施方案的化合物、本文描述的组合物或本文描述的剂型。在一些实施方案中，GLP1R相关状况是II型糖尿病、肥胖、肝病、冠状动脉疾病或肾病。在一些实施方案中，GLP1R相关状况是II型糖尿病和/或肥胖。
在本文描述的任何方法的各种实施方案中，本公开内容的化合物、组合物或剂型被皮下、静脉内、皮内、腹膜内或肌肉内施用。在另一个方面，本文提供了一种产生本文描述的具有式(A)结构的化合物的方法：
BA-(L-P)m(A)，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少m个谷氨酰胺残基Gln的BA与至少m当量的化合物L-P接触，以及
b)分离所产生的式(A)化合物。
在另一个方面，本文提供了一种产生本文描述的具有式(I)结构的化合物的方法：
BA-L-P(I)，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA与化合物L-P接触，以及
b)分离所产生的式(I)化合物。
在另一个方面，本文提供了一种产生权利要求1的具有式(A)结构的化合物的方法：
BA-(L-P)m(A)，
其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp是与所述P共价附接的第二接头，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少m个谷氨酰胺残基Gln的BA与包括叠氮化物或炔烃部分的第一接头La接触；
b)使步骤a)的产物与至少m当量的化合物Lp-P接触，其中所述第二接头Lp包括叠氮化物或炔烃部分，其中La和Lp能够反应产生三唑，以及
c)分离所产生的式(A)化合物。
在另一个方面，本文提供了一种产生本文描述的具有式(I)结构的化合物的方法：
BA-L-P(I)，
其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp是与所述P共价附接的第二接头，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA与包括叠氮化物或炔烃部分的第一接头La接触；
b)使步骤a)的产物与化合物Lp-P接触，其中所述第二接头Lp包括叠氮化物或炔烃部分，其中La和Lp能够反应产生三唑，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在另一个方面，本文提供了具有选自由式(P-IB)、式(P-IIB)和式(P-IIIB)组成的组的结构的化合物：
(P-IIIB)，其中：
X1选自H；
X2选自
X3选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH2，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文提供了具有式(II)结构的化合物：
其中：
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和-CH3，条件是当X3是-CH3时，n是1，并且Ra在至少一次出现时选自–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
n是0或1；
m是从0至3的整数；
Ra在每次出现时独立地选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，P具有选自由以下组成的组的结构：
在另一个方面，本文提供了具有式(C)结构的化合物：
其中：
Lp不存在或者是包括以下一种或更多种的接头：氨基甲酸酯基团；环糊精；具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段；–(CH2)2-24-链；三唑；选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸；
Q是选自-NH2、-N3、的部分，其中A是C或N；
X1选自H；
X2选自
X3选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH2，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文提供了具有式(III)结构的化合物：
其中：
Lp不存在或者是包括以下一种或更多种的接头：氨基甲酸酯基团；环糊精；具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段；选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸；
Q是选自-N3、的部分，其中A是C或N；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和-CH3，条件是当X3是-CH3时，n是1，并且Ra在至少一次出现时选自–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
n是0或1；
Ra在每次出现时独立地选自H、-CH3、–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，以上描述的化合物具有选自由以下组成的组的结构：
结构
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本文提供了一种抗体-药物缀合物，包含任选地通过接头与有效载荷缀合的靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段，所述有效载荷具有选自由以下组成的组的结构：
结构
或其药学上可接受的盐。
在又另一个方面，本文提供了一种抗体-药物缀合物，包含靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段以及具有以下结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷直接或通过接头附接至所述抗体或其抗原结合片段的附接点。
在一种实施方案中，有效载荷具有以下结构：
在又另一个方面，本文提供了一种抗体-药物缀合物，包含靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段以及具有以下结构的接头-有效载荷：
其中是所述接头-有效载荷附接至所述抗体或其抗原结合片段的附接点。
在一种实施方案中，接头-有效载荷具有以下结构：
在阅读本公开内容的以下详细描述(包括所附权利要求书)之后，本公开内容的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得明显。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色制作的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。
图1A示出了示例性抗体拴系的药物缀合物(ATDC)设计及其作用机制的示意图。
图1B示出了常规抗体-药物缀合物(ADC)设计及其作用机制的示意图。
图2示出了具有与胞外结构域(ECD)结合的抗体和与跨膜结构域(TMD)结合的有效载荷的抗体拴系的药物缀合物的模型。
图3A示出了GLP1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：4)的示意图。序列上方的数字对应于胰高血糖素前肽中的氨基酸位置。蓝色箭头指示二肽基肽酶-4(DPP-IV)裂解位点。红色箭头指示中性内肽酶(NEP)裂解位点。虚线箭头指示由一种或更多种未知内切蛋白酶的裂解位点。呈橙色的残基是当被取代时降低GLP1R结合及cAMP产生的氨基酸。呈绿色的残基是当被取代时降低GLP1R结合的氨基酸。
图3B示出了与GLP1(蛋白数据库ID:3IOL)结合的GLP1R的结构。这种结构的参考文献可以见于Zhang等人Nature 2017，Chepurny等人JBC2019，De Graaf等人Pharmacological reviews 2016以及Manandhar和Ahn Journal of Medical Chemistry2014，所述参考文献的每一个都通过引用以其整体并入本文。
图4A示出了GLP1肽模拟物肽5(SEQ ID NO:5)的序列和结构。序列上方的数字对应于胰高血糖素前肽中的氨基酸位置。
图4B示出了使用5NX2中的GLP1R作为模板，与肽5(蛋白数据库ID:5NX2)结合的GLP1R和与GLP1(蛋白数据库ID:3IOL)结合的GLP1R的叠加结构。5NX2结构的参考文献可以见于Jazayeri A，等人Nature第546卷，第254–258页(2017)，所述参考文献通过引用以其整体并入本文。
图5示出了本公开内容的用于制备GLP1肽模拟物有效载荷的合成方案。建立了树脂上的固相肽合成，其以良好的收率有效地产生了本公开内容的有效载荷。经由系统R1/R2/R3修饰产生另外的GLP1R肽模拟物有效载荷。
图6A-图6D显示了，本公开内容的GLP1R肽模拟物有效载荷在相关的GPCR生物测定中没有显示出激活。
图7A-图7B示出了，较短接头GLP1R ATDC显示出比对照ATDC更大的效力。
图8示出了，前导接头-有效载荷显示出最佳体外ADME谱且无体外心脏毒性和致突变潜力，并且其ATDC在血浆中高度稳定。
图9A示出了用于将接头-有效载荷与本公开内容的抗体缀合的两种方法。
图9B示出了抗GLP1R ATDC药物载量谱的代表性疏水相互作用色谱(HIC)图。HIC用于缀合性筛选，以类选(triage)显示出低缀合收率、低DAR、高聚集体和差Biacore结合的ATDC。
图10示出了由抗GLP1R ATDC引起的CRE依赖性萤光素酶报告物基因活性。抗GLP1RATDC显示出比同种型对照ATDC较好的体外效力。未缀合的mAb不激活hGLP1R细胞(未示出)。ATDC不激活胰高血糖素样肽-2受体(GLP 2R)、胰高血糖素受体(GCGR)或抑胃多肽受体(GIPR)(未示出)。
图11A示出了在存在未缀合的抗GLP1R抗体的情况下，由抗GLP1R ATDC引起的环AMP响应元件(CRE)依赖性萤光素酶报告物基因活性。它显示了，未缀合的抗GLP1R mAb浓度<10nM对抗GLP1R ATDC活性没有影响。100nM未缀合的抗GLP1R mAb将抗GLP1R ATDC效力降低3.8倍。首先添加未缀合的抗GLP1R mAb，然后立即添加抗GLP1R ATDC，并且孵育4小时来进行测定。
图11B示出与图11A中的图对应的数据。
图12示出了本公开内容的示例性GLP1R Q-标签mAb-GLP1R激动剂缀合物的示意图。
图13示出了制备根据本公开内容的GLP1肽模拟物的一般合成方案。
图14示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P1和P8的固体支持合成的顺序。
图15示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P2和P9的固体支持合成的顺序。
图16示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P3、P4、P5、P6、P7、P11、P13、P14、P15、P16和P17的固体支持合成的顺序。
图17A和图17B示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P10、P12、P18、P19、P25、P26、P27、P28、P29、P30、P31、P36、P37和P38的固体支持合成的顺序。
图18示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P20和P21的固体支持合成的顺序。
图19示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P22和P23的固体支持合成的顺序。
图20示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P24的固体支持合成的顺序。
图21示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P32、P33、P34和P35的固体支持合成的顺序。
图22示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P39的固体支持合成的顺序。
图23示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P40的固体支持合成的顺序。
图24示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P41的固体支持合成的顺序。
图25示出了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P42的固体支持合成的顺序。
图26示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP1、LP2、LP3、LP4和LP5的合成路线。
图27示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP6和LP7的合成路线。
图28示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP8、LP9、LP10和LP11的合成路线。
图29示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP12的合成路线。
图30示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP13和LP14的合成路线。
图31示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP15和LP18的合成路线。
图32示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP17的合成路线。
图33示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP18和LP20的合成路线。
图34示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP19的合成路线。
图35示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP21的合成路线。
图36示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP22的合成路线。
图37示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP23的合成路线。
图38示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP24的合成路线。
图39示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP25的合成路线。
图40示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP26的合成路线。
图41示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP27和LP28的合成路线。
图42示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP29的合成路线。
图43示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP30的合成路线。
图44示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP31的合成路线。
图45示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP32的合成路线。
图46示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP33的合成路线。
图47示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP34的合成路线。
图48示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP35的合成路线。
图49示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP36、LP37、LP38、LP39、LP40和LP41的合成路线。
图50示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP42的合成路线。
图51示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP43的合成路线。
图52示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP44的合成路线。
图53示出了制备根据本公开内容的接头-有效载荷LP45的合成路线。
图54示出了制备位点特异性抗体-药物缀合物的通用两步缀合程序的示意图。
图55示出了制备位点特异性抗体-药物缀合物的通用一步缀合程序的示意图。
图56示出了电生理学研究的指令电压方案。从-80mV的保持电位开始，电压首先步进至-50mV，持续80ms，用于漏减(leak subtraction)，并且然后步进至+20mV，持续4800ms，以打开hERG通道。在此之后，电压步进返降至-50mV，持续5000ms，引起“反弹”或尾电流，测量并收集该电流用于数据分析。最后，电压步进返回至保持电位(-80mV,1000ms)。电压指令方案每20秒重复一次，并且在测试(媒介物对照和测试化合物)期间连续进行。
图57示出了抗GLP1R mAB2-LP11在小鼠、猴和人类血浆中37℃孵育7天的体外稳定性。
图58示出了GLP1R ATDC对肥胖GLP1R人源化小鼠体重变化百分比的影响。
图59示出了GLP1R ATDC对肥胖GLP1R人源化小鼠血糖水平的影响。
图60是根据本公开内容的示例性实施方案的GLP1R ATDC的示意图。
详细描述
在一些方面，本公开内容提供了特异性结合胰高血糖素样肽1受体(GLP1R)蛋白的抗体-药物缀合物。如以上背景部分描述的，GLP1R及其配体GLP1是高度有效的肥胖和二型糖尿病靶。然而，尚未鉴定用于二型糖尿病治疗的直接激动剂抗体。对GLP1R具有激动剂活性的单肽是葡萄糖控制和体重减轻的有效治疗剂，但在线肽-抗体融合物(in-linepeptide-antibody fusions)易受蛋白水解的影响。在本公开内容的某些实施方案中，产生将特异性靶向GLP1R的胞外结构域的抗体或其抗原结合片段与功能性激活GLP1R的GLP1肽模拟物组合的抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物具有更长的药物持续时间，具有相当或更好的体重和葡萄糖降低效力以及最小化的脱靶副作用。
本文公开了本公开内容的详细实施方案；然而，应当理解，所公开的实施方案仅仅是可以以各种形式体现的本公开内容的说明。此外，结合本公开内容的各种实施方案给出的每个实例旨在是说明性的，而不是限制性的。因此，本文公开的特定结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是作为教导本领域技术人员以不同方式采用本公开内容的代表性基础。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种方法”包括本文描述的和/或对于本领域技术人员而言在阅读本公开内容后将变得明显的一种或更多种方法，和/或类型的步骤。
术语状态、紊乱或状况的“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防、延迟或降低在可能罹患或易患状态、紊乱或状况但尚未经历或表现出状态、紊乱或状况的临床或亚临床症状的受试者中发展状态、紊乱或状况的至少一种临床或亚临床症状的发病率和/或出现的可能性；或者(2)抑制状态、紊乱或状况，即，阻止、降低或延迟疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状复发；或者(3)缓解疾病，即，引起状态、紊乱或状况或其临床或亚临床症状的至少一种的消退。对待治疗的受试者的益处为在统计学上显著的或至少对患者或对医师为可感知的。在一些实施方案中，治疗包括以间接影响疾病的这样的方式消融细胞的方法。在某些实施方案中，治疗包括在疗法前耗尽免疫细胞作为造血调节方案。
如本文使用的“受试者”或“患者”或“个体”或“动物”是指人类、兽医学动物(例如，猫、犬、牛、马、绵羊、猪等)和疾病的实验动物模型(例如，小鼠、大鼠)。在优选的实施方案中，受试者是人类。
如本文使用的，适用于剂量或量的术语“有效”指在向有相应需要的受试者施用后足以产生期望活性的化合物或药物组合物的量。注意，在施用活性成分的组合时，组合物的有效量可以包括或可以不包括如果单独施用时将有效的每一种成分的量。所需的确切量将根据受试者的物种、年龄和一般状况、被治疗状况的严重程度、采用的一种特定药物或更多种特定药物、施用的模式等因受试者而异。
如结合本公开内容的组合物使用的短语“药学上可接受的盐”是指适于向患者施用的任何盐。合适的盐包括但不限于在Berge等人，”Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.,1977,66:1中公开的那些，该文献通过引用并入本文。盐的实例包括但不限于酸来源的盐、碱来源的盐、有机盐、无机盐、胺盐和碱金属盐或碱土金属盐，包括但不限于钙盐、镁盐、钾盐、钠盐，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。在一些实例中，本文描述的有效载荷包括叔胺，其中叔胺中的氮原子是有效载荷通过其与接头或接头-间隔物键合的原子。在这样的情况下，与有效载荷的叔胺键合在接头-有效载荷分子中产生季胺。季胺上的正电荷可以被反衡离子(例如氯、溴、碘或任何其他合适地带电荷的部分，诸如本文描述的那些)平衡。
范围在本文可以表示为从“约”或“大约”一个特定值，和/或至“约”或“大约”另一个特定值。在表示这样的范围时，另一种实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。
“包括/包含(comprising)”或“包括/包含(containing)”或“包括/包含(including)”意指，至少被指名的化合物、要素、颗粒或方法步骤存在于组合物或物品或方法中，但不排除其他化合物、材料、颗粒或方法步骤的存在，即使其他这样的化合物、材料、颗粒或方法步骤具有与被指名的相同的功能。
本公开内容的化合物包括本文一般描述的化合物，并且通过本文公开的类别、亚类和种类进一步说明。如本文使用的，除非另外指示，否则以下定义应适用。为了本公开内容的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics，第75版来标识。另外地，有机化学的一般原理在以下中描述：“Organic Chemistry”,ThomasSorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March’s Advanced OrganicChemistry”，第5版，编著：Smith,M.B.和March,J.,John Wiley&Sons,New York:2001，所述文献的全部内容通过引用特此并入。
如本文使用的，术语“烷基”被赋予其在本领域中的普通含义，并且可以包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有约1-20个碳原子(例如，C1-C20对于直链，C2-C20对于支链)，并且可选地约1-10个碳原子，或约1-6个碳原子。在一些实施方案中，环烷基环在其环结构中具有约3-10个碳原子，其中这样的环是单环或双环的，并且可选地在环结构中具有约5个、6个或7个碳。在一些实施方案中，烷基基团可以是低级烷基基团，其中低级烷基基团包括1-4个碳原子(例如C1-C4对于直链低级烷基)。
如本文使用的，术语“烯基”是指具有一个或更多个双键的如本文定义的烷基基团。
如本文使用的，术语“炔基”是指具有一个或更多个三键的如本文定义的烷基基团。
术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮)的一种或更多种。
术语“卤素”意指F、Cl、Br或I；术语“卤化物”是指卤素基团或取代基，即-F、-Cl、-Br或-I。
本公开内容的术语“加合物”，例如“Diels-Alder加合物”，涵盖包括加成反应(例如Diels-Alder反应)的产物的任何部分，与产生该部分所采取的合成步骤无关。
术语“共价附接”意指共价键的形成，即涉及两个原子之间共有一个或更多个电子对的化学键。共价键合可以包括不同的相互作用，包括但不限于σ-键合、π-键合、金属对金属键合、抓桥(agostic)相互作用、弯曲键和三中心双电子键。在第一基团被称为与第二基团“能够共价附接”时，这意味着第一基团能够例如通过使用催化剂或在特定的反应条件下与第二基团直接或间接形成共价键。能够彼此共价附接的基团的非限制性实例可以包括例如胺和羧酸(形成酰胺键)、二烯和亲二烯体(经由Diels-Alder反应)、马来酰亚胺和硫醇(形成硫醇-马来酰亚胺)以及叠氮化物和炔烃(经由1,3-环加成反应形成三唑)。
如本文描述的，本公开内容的化合物可以包括“任选地取代的”部分。通常，术语“取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，都意味着指定部分的一个或更多个氢被合适的取代基取代。除非另外指示，否则“任选地取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置处具有合适的取代基，并且在任何给定结构中的多于一个位置可以被选自特定组的多于一个取代基取代时，该取代基可以在每个位置处相同或不同。本公开内容所设想的取代基组合优选地是那些导致形成稳定或化学上可行的化合物的组合。
如本文使用的术语“稳定的”是指在经历允许它们的产生、检测以及在某些实施方案中允许它们的回收、纯化和用于本文公开的一个或更多个目的使用的条件时，基本上没有改变的化合物。
除非另外说明，否则本文描绘的结构也意指包括结构的所有异构体(例如，对映异构体、非对映异构体和几何(或构象))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体，以及(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何(或构象)混合物在本公开内容的范围内。
除非另外说明，否则本文描述的环加合物，例如环加成反应的产物，例如叠氮化物-乙炔环加成反应或Diels-Alder反应的产物，包括所有位置异构体，即仅官能团或取代基的位置不同的结构异构体。通过实例的方式，以下结构表示三唑位置异构体，它们仅三唑环上取代基的位置不同：
三唑位置异构体也可以由以下结构表示：
除非另外说明，否则本公开内容的化合物的所有互变异构形式都在本公开内容的范围内。
另外地，除非另外说明，否则本文描绘的结构还意指包括仅在一个或更多个同位素富集的原子的存在方面不同的化合物。例如，除了用氘或氚替代氢，或用11C-或13C-或14C-富集的碳替代碳之外，具有本发明结构的化合物在本公开内容的范围内。
还应当理解，提及一个或更多个方法步骤并不排除存在另外的方法步骤或明确标识的那些步骤之间的中间方法步骤。类似地，还应当理解，提及装置或系统中的一个或更多个组件并不排除存在另外的组件或明确标识的那些组件之间的中间组件。
除非另外说明，本公开内容的化合物及其盐的所有结晶形式也在本公开内容的范围内。本公开内容的化合物可以以多种无定形和结晶形式分离，包括但不限于无水、水合、非溶剂化或溶剂化的形式。示例性水合物包括半水合物、一水合物、二水合物等。在一些实施方案中，本公开内容的化合物是无水和非溶剂化的。“无水”意味着该化合物的结晶形式在晶格(crystal lattice)结构中基本上不含结合水，即该化合物不形成结晶水合物。
如本文使用的，“结晶形式”意指是指结晶物质的某种晶格(lattice)构型。同一物质的不同结晶形式通常具有不同的结晶晶格(例如，晶胞)，这导致每种结晶形式特征性的不同的物理特性。在一些情况下，不同的晶格构型具有不同的水或溶剂含量。不同的结晶晶格可以通过固态表征方法诸如X射线粉末衍射(PXRD)来鉴定。其他表征方法，诸如差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)、动态蒸汽吸附(DVS)、固态NMR等，进一步帮助鉴定结晶形式以及帮助确定稳定性和溶剂/水含量。
物质的结晶形式包括溶剂化(例如，水合)和非溶剂化(例如，无水)形式两者。水合形式是在结晶晶格中包括水的结晶形式。水合形式可以是化学计量的水合物，其中水以一定的水/分子比，诸如半水合物、一水合物、二水合物等存在于晶格中。水合形式也可以是非化学计量的，其中水含量是可变的，并且取决于外部条件诸如湿度。
在一些实施方案中，本公开内容的化合物是基本上分离的。“基本上分离”意味着特定化合物与杂质至少部分地分离。例如，在一些实施方案中，本公开内容的化合物包括少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约2.5％、少于约1％或少于约0.5％的杂质。杂质通常包括不是基本上分离的化合物的任何东西，包括例如其他结晶形式和其他物质。
某些基团、部分、取代基和原子用波浪线描绘。波浪线可以与一个键或更多个键相交或对一个键或更多个键加帽。波浪线指示基团、部分、取代基或原子通过其键合的原子。例如，被如以下描绘的丙基基团取代的苯基基团：
具有以下结构：
术语“GLP1R”是指胰高血糖素样肽1受体，并且包括重组GLP1R蛋白或其片段。GLP1R具有463个残基的序列。Donnelly,Br J Pharmacol,166(1):27–41(2011)。胰高血糖素样肽1(GLP1)是在营养物质消耗后从肠L细胞释放的31个氨基酸的肽激素。GLP1与GLP1R的结合增强葡萄糖诱导的来自胰腺β细胞的胰岛素分泌、增加胰岛素表达、抑制β细胞凋亡、促进β细胞新生、降低胰高血糖素分泌、延迟胃排空、促进饱腹感和增加外周葡萄糖处置(peripheral glucose disposal)。
短语“结合GLP1R的抗体”或“抗GLP1R抗体”包括特异性识别GLP1R的抗体及其抗原结合片段。
如本文使用的“激动剂抗体”(或者“增加或增强GLP1R活性的抗体”)意在是指其与GLP1R结合导致GLP1R的至少一种生物活性激活的抗体。例如，如果细胞是哺乳动物胰腺β细胞，GLP1R的激动剂抗体可以引发腺苷酸环化酶途径的刺激，导致环AMP的合成增加和胰岛素的释放。GLP1R的激动剂抗体也可以在向有相应需要的受试者施用后降低葡萄糖水平。
本公开内容中使用的所有氨基酸缩写是如37C.F.R.§1.822(B)(J)中示出的被美国专利商标局(the United States Patent and Trademark Office)接受的那些。
术语“蛋白”意指具有经由酰胺键共价连接的多于20个氨基酸的任何氨基酸聚合物。如本文使用的，“蛋白”包括生物治疗蛋白、研究或疗法中使用的重组蛋白、trap蛋白和其他Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、人类抗体、双特异性抗体、抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、scFv融合蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白可以使用基于重组细胞的产生系统来产生，诸如昆虫杆状病毒(bacculovirus)系统、酵母系统(例如毕赤酵母属物种(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物如CHO-K1细胞)。
除非明确指定为来自非人类物种，否则本文对蛋白、多肽和蛋白片段的所有提及意在是指相应蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式。因此，除非指定为来自非人类物种，例如“小鼠GLP1R”、“猴GLP1R”等，否则表述“GLP1R”意指人类GLP1R。
抗体的氨基酸序列可以使用任何已知的编号方案进行编号，包括由以下描述的那些：Kabat等人，(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Pluckthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)。除非另外指定，否则本文使用的编号方案是Kabat编号方案。然而，编号方案的选择并不意在暗示序列中不存在的差异，并且本领域技术人员可以通过检查一种或更多种抗体的氨基酸序列容易地确认序列位置。除非另外说明，否则在提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人的报道，同上)。
术语“谷氨酰胺酰基修饰的抗体”是指本公开内容的具有从谷氨酰胺侧链至伯胺化合物的至少一个共价连接的抗体。在特定实施方案中，伯胺化合物通过谷氨酰胺侧链上的酰胺连接来连接。在某些实施方案中，谷氨酰胺是内源谷氨酰胺。在其他实施方案中，谷氨酰胺是通过多肽工程化(例如，经由多肽上的氨基酸缺失、插入、取代或突变)使其具有反应性的内源谷氨酰胺。在另外的实施方案中，谷氨酰胺是用含酰基供者谷氨酰胺的标签(例如，含谷氨酰胺的肽标签、Q-标签或TG识别标签)工程化的多肽。
术语“TG识别标签”是指包括接受者谷氨酰胺残基的氨基酸序列，并且该接受者谷氨酰胺残基在掺入(例如，附加至)多肽序列时，在合适的条件下，被TG识别，并且通过氨基酸序列内的氨基酸侧链与反应配偶体之间的反应导致TG的交联。识别标签可以是不天然存在于包括TG识别标签的多肽中的肽序列。在一些实施方案中，TG识别标签包括至少一个Gln。在一些实施方案中，TG识别标签包括氨基酸序列XXQX，其中X是任何氨基酸(例如，常规氨基酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gln、Ile、Met、Pro、Thr、Lys或Trp或非常规氨基酸)。在一些实施方案中，含酰基供者谷氨酰胺的标签包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：LLQGG(SEQ ID NO:6)、LLQG(SEQ ID NO:7)、LSLSQG(SEQ IDNO:8)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:9)、GLLQG(SEQ ID NO:10)、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:11)、GLLQGGG(SEQ ID NO:12)、GLLQGG(SEQ ID NO:13)、GLLQ(SEQ ID NO:14)、LLQLLQGA(SEQ IDNO:15)、LLQGA(SEQ ID NO:16)、LLQYQGA(SEQ ID NO:17)、LLQGSG(SEQ ID NO:18)、LLQYQG(SEQ ID NO:19)、LLQLLQG(SEQ ID NO:20)、SLLQG(SEQ ID NO:21)、LLQLQ(SEQ ID NO:22)、LLQLLQ(SEQ ID NO:23)和LLQGR(SEQ ID NO:24)。参见例如WO2012059882，该文献的全部内容并入本文。
如本文使用的，术语“抗体”意指包括与特定抗原特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链即两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以还细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区间插着称为框架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL包括3个CDR和4个FR，按以下顺序从氨基末端向羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人类种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可以基于两个或更多个CDR的并列(side-by-side)分析来定义。
如本文使用的术语“抗体”也包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术从例如完整抗体分子中获得，所述标准技术诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术，包括操作和表达编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA。这样的DNA是已知的和/或容易从例如，商业来源、DNA文库(包括，例如，噬菌体抗体文库)可得，或者可以合成。可以对DNA进行测序并且如下进行操作：化学或通过使用分子生物学技术，例如，将一个或更多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其他工程化分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体(nanobody)(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(small modular immunopharmaceuticals，SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被涵盖在如本文使用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成，并且通常将包含与一个或更多个框架序列相邻或符合读框(in frame)的至少一个CDR。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体，并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。
可选地，抗体的抗原结合片段可以包含单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含被共价连接至至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以存在于本说明书抗体的抗原结合片段中的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(V)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括本文列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过完整或部分铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，这些氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。
此外，本说明书抗体的抗原结合片段可以包括以彼此和/或与一个或更多个单体VH结构域或VL结构域(例如，通过一个或更多个二硫键)非共价缔合的本文列出的可变结构域和恒定结构域构型中的任一种的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
如与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与单独的抗原或与同一抗原上的不同表位特异性结合。任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，都可以使用本领域可得的常规技术适于在本说明书抗体的抗原结合片段的上下文中使用。
在某些实施方案中，本说明书的抗体，例如抗GLP1R抗体，是人类抗体。如本文使用的，术语“人类抗体”意在包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本说明书的人类抗体可以包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，所述氨基酸残基例如在CDR中并且特别是在CDR3中。然而，如本文使用的术语“人类抗体”不意在包括其中来源于另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被接枝到人类框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，抗体可以是重组人类抗体。如本文中使用的术语“重组人类抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)、从重组的、组合人类抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)、从对于人类免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人类抗体经历体外诱变(或，当使用人类Ig序列的转基因动物时，则经历体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管来源于人类种系VH和VL序列并且与人类种系VH和VL序列相关，但可以不天然地存在于体内人类抗体种系贮库(human antibody germline repertoire)中。
人类抗体可以以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包括大约150kDa-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不经由链间二硫键连接，并且形成包括共价偶联的轻链和重链的约75kDa-80kDa的分子(半抗体)。即使在亲和纯化之后，这些形式也极难分离。第二种形式在多种完整IgG同种型中出现的频率是由于但不限于与抗体铰链区同种型相关的结构差异。人类IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30:105)显著降低至通常使用人类IgG1铰链观察到的水平。本说明书涵盖在铰链区、CH2区或CH3区具有一个或更多个突变的抗体，该突变例如在产生中可能是期望的，以改进期望抗体形式的收率。
本说明书的抗体可以是分离的或纯化的抗体。如本文使用的“分离的抗体”或“纯化的抗体”意指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。出于本说明书的目的，例如，已经从生物体的至少一种组分或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或取出的抗体是“分离的抗体”。例如，已经从反应或反应序列的至少一种组分中纯化的抗体是“纯化的抗体”或由纯化抗体产生。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体或纯化的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
与抗体来源于的对应种系序列相比，本文公开的抗体可以包括重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这样的突变可以通过将本文公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可得的种系序列进行比较来容易地确定。本说明书包括来源于本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或更多个框架和/或CDR区内的一个或更多个氨基酸被突变为抗体来源于的种系序列的一个或更多个对应残基、或另一个人类种系序列的一个或更多个对应残基、或一个或更多个对应种系残基的保守氨基酸取代(这样的序列变化在本文统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从给出的重链和轻链可变区序列开始，可以容易产生包括一个或更多个个体种系突变或其组合的许多抗体及抗原结合片段。在某些实施方案中，VH结构域和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在抗体来源于的原始种系序列中存在的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内存在的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内存在的突变残基。在其他实施方案中，一个或更多个框架和/或一个或更多个CDR残基被突变为不同种系序列(即，不同于抗体原始来源于的种系序列的种系序列)的一个或更多个对应残基。
此外，本说明书的抗体可以包含框架和/或CDR区内两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些单独残基被突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基被维持或突变为不同种系序列的对应残基。在获得后，可以容易地测试包含一个或更多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或更多种期望的特性，诸如改进的结合特异性、增加的结合亲和力、改进或增强的拮抗或激动生物学特性(可以根据具体情况而定)、降低的免疫原性、抗体-药物缀合物的改进的药物与抗体比(DAR)等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段被涵盖在本说明书中。
术语“非糖基化抗体”是指不包括可能干扰转谷氨酰胺反应的糖基化序列的抗体，例如在一条或更多条重链上的N297处不具有糖基团的抗体。在特定实施方案中，抗体重链具有N297突变。换言之，根据Kabat等人公开的EU编号系统，抗体被突变为在位置297处不再具有天冬酰胺残基。在特定实施方案中，抗体重链具有N297Q或N297D突变。这样的抗体可以通过定点诱变以使糖基化序列去除或失效，或者通过定点诱变以在除了任何干扰糖基化位点或任何其他干扰结构之外的位点插入谷氨酰胺残基来制备。这样的抗体也可以从天然或人工来源分离。非糖基化抗体还包括包含T299或S298P或其他突变或导致缺乏糖基化的突变组合的抗体。
术语“去糖基化抗体”是指其中糖基基团被去除以促进转谷氨酰胺酶介导的缀合的抗体。糖包括但不限于N-连接寡糖。在一些实施方案中，在残基N297处进行去糖基化。在一些实施方案中，糖基团的去除是酶促(包括但不限于经由PNG(Peptide:N-glycosidase,PNGase))完成的。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位(paratope)的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合，并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖类、磷酰基团或磺酰基团的部分。
如本文使用的术语“缀合蛋白”或“缀合抗体”是指与一个或更多个化学部分共价连接的蛋白或抗体。化学部分可以包括本公开内容的胺化合物。适于与本公开内容一起使用的接头(L)和有效载荷(P)在本文详细地描述。在特定实施方案中，包括治疗部分的缀合抗体是抗体-药物缀合物(ADC)，也称为抗体-有效载荷缀合物或抗体-接头-有效载荷缀合物。
术语“药物与抗体比”或(DAR)是与本公开内容的结合剂缀合的治疗部分(例如药物)的平均数。
在一些实施方案中，术语“接头抗体比”或(LAR)也表示为小写字母，是与本公开内容的结合剂缀合的反应性伯胺化合物的平均数。这样的结合剂，例如抗体，可以与包括例如合适的叠氮化物或炔烃的伯胺化合物缀合。用叠氮化物或炔烃官能化的所得结合剂随后可以经由1,3-环加成反应与包括对应叠氮化物或炔烃的治疗部分反应。
短语“药学上可接受量”是指在治疗、降低、减轻或调节有相应需要的受试者中的至少一种健康问题的影响或症状方面有效或足够的量。例如，抗体或抗体-药物缀合物的药学上可接受量是使用本文提供的抗体或抗体-药物缀合物用于调节生物靶有效的量。合适的药学上可接受量包括但不限于约0.001％多达至约10％，以及介于两者之间的任何量，诸如约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的本文提供的抗体或抗体-药物-缀合物。
短语“反应pH”是指已经添加所有反应组分或反应物之后反应的pH。
在提及核酸或其片段时，术语“基本上同一性”或“基本上相同”指示，在与另一核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，如下文讨论的，如通过任何熟知的序列同一性算法，诸如FASTA、BLAST或Gap测量的，在至少约95％，并且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本上同一性的核酸分子可以编码与由参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上相似氨基酸序列的多肽。
在应用于多肽时，术语“基本上相似性”或“基本上相似”意指在诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重最佳比对时，两个肽序列共有至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度，以校正取代的保守性质。用于做出该调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。具有具有相似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可选地，保守替代是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数可能性矩阵中具有正值的任何改变。“中度保守”替代是PAM250对数可能性矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性，也称为序列同一性，通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性量度来匹配相似的序列。例如，GCG软件包含程序诸如Gap和Bestfit，这些程序可以以默认参数使用，以确定密切相关的多肽诸如来自不同生物体物种的同源多肽之间或者野生型蛋白与其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，GCG 6.1版。多肽序列也可以使用FASTA(GCG6.1版中的程序)使用默认或推荐的参数进行比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。在将本说明书序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种特定算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
蛋白-药物缀合物化合物
根据前述目的和其他目的，本公开内容提供了蛋白-药物缀合物化合物，例如抗体-药物缀合物化合物，及其前体和中间体、药物组合物和用于治疗有这样的治疗需要的受试者的某些疾病的方法。根据本公开内容，本文提供的蛋白-药物缀合物化合物包含与治疗部分例如，如本文描述的GLP1肽模拟物缀合的结合剂。
在一个方面，本公开内容提供了包含根据本公开内容的结合剂(例如，抗体或其片段)的化合物，该结合剂经由不可裂解的接头与一种或更多种GLP1肽模拟物缀合。说明性非限制性实例包括本文描述的式(I)。在根据本公开内容的蛋白-药物缀合物的特定实施方案中，其中结合剂是抗体(例如，单克隆抗体)，任选地使用术语“抗体药物缀合物”或ADC。
在各种实施方案中，本公开内容的抗体药物缀合物或ADC是抗体拴系的药物缀合物或ATDC。ATDC是抗体-药物缀合物，其中药物通过不可裂解的接头与抗体拴系。在一些实施方案中，本公开内容的ATDC中的不可裂解的接头在ATDC被施用到体内(例如人体)之后是稳定的。例如，不可裂解的接头可以在血浆中是稳定的，例如在人类血浆中，在结合细胞表面时是稳定的，或者在抗体结合其靶抗原和/或GLP1肽模拟物结合GLP1R时是稳定的。在一些实施方案中，不可裂解的接头在体内比有效载荷或抗体在相同的生理条件下更稳定。在一些实施方案中，本公开内容的ATDC可以在溶酶体中降解以释放有效载荷、接头-有效载荷和/或其ATDC代谢物/分解代谢物，其在某些实施方案中对于局部或全身的GLP1R激活有效。
在一些实施方案中，ATDC在血浆中是稳定的，并且在溶酶体中降解。在一些实施方案中，ATDC在血浆中是稳定的，并且在溶酶体中不降解。
在一个方面，本文提供了具有式(A)结构的化合物：
BA-(L-P)m(A)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自键、–(CH2)2-6–NH–、–(CH2)2-6–Tr–和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，m是1。在一种实施方案中，m是从2至4的整数。在一种实施方案中，m是2。
在一个方面，本公开内容提供了具有式(I)的结构的化合物：
BA-L-P(I)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
或其药学上可接受的盐。
接头L
在一种实施方案中，接头L是不可裂解的接头，即是稳定的并且在抗体与药物之间，例如，在根据本公开内容的靶向GLP1R的抗体与GLP1肽模拟物有效载荷P之间提供共价连接的接头。在一些实施方案中，本公开内容的不可裂解的接头L在ATDC被施用到体内(例如人体)之后是稳定的。例如，接头L可以在血浆中是稳定的，例如在人类血浆中，在结合细胞表面时是稳定的，或者在抗体结合其靶抗原和/或GLP1肽模拟物结合GLP1R时是稳定的。在一些实施方案中，接头L在体内比有效载荷或抗体在相同的生理条件下更稳定。
在一种实施方案中，接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与抗体或其抗原结合片段共价附接的第一接头；
Y是包含三唑、Diels-Alder加合物或硫醇-马来酰亚胺加合物的基团，并且
Lp不存在或者是与根据本公开内容的有效载荷P共价附接的第二接头，其中当Lp不存在时，Y也不存在。
在一种实施方案中，Y是包含三唑的基团。
在另一种实施方案中，Y是包含Diels-Alder加合物的基团。
在一种实施方案中，接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与抗体或其抗原结合片段共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp不存在或者是与根据本公开内容的有效载荷P共价附接的第二接头。
在一种实施方案中，La包括C1-6烷基、苯基、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、包括2个至4个氨基酸的肽单元或其组合，其的每一种能够任选地被-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-和CO2H中的一个或更多个取代，其中下标u和v独立地是1至8的整数。
在一种实施方案中，La选自由以下组成的组：
其中RA是包括炔烃、叠氮化物、四嗪、反式环辛烯、马来酰亚胺、胺、酮、醛、羧酸、酯、硫醇、磺酸、甲苯磺酸酯、卤化物、硅烷、氰基基团、糖类基团、生物素基团、脂质残基的基团，并且其中下标x、n、p和q独立地是0至12的整数，以及其组合。
在一种实施方案中，-La-选自由以下组成的组：
其中是与抗体和/或其抗原结合片段的残基(例如，谷氨酰胺残基)附接的氨基附接点。
在一种实施方案中，-La-是
在另一种实施方案中，-La-选自由以下组成的组：
其中是与抗体和/或其抗原结合片段的残基(例如，谷氨酰胺残基)附接的氨基附接点。
在一些实施方案中，La包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段。在一些实施方案中，PEG区段包括4个EG单元或8个EG单元或12个EG单元或24个EG单元。在一些实施方案中，PEG区段包括8个EG单元。在一些实施方案中，La具有选自由以下组成的组的结构：和
在一些实施方案中，La包括选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸。在一些实施方案中，La包括1个至10个甘氨酸和1个至6个丝氨酸。在一些实施方案中，La包括4个甘氨酸和1个丝氨酸。在一些实施方案中，La选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)(SEQ ID NO:1)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)(SEQ ID NO:2),Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(G2S-G2S-G2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(G4S-G4)(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，La包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。在一些实施方案中，La选自由以下组成的组：
在一些实施方案中，La包括–(CH2)2-24-链。在一些实施方案中，La包括–(CH2)2-24-链、具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。La选自由以下组成的组：
在一种实施方案中，Y具有选自由以下组成的组的结构：
其中Q是C或N。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段。
在一种实施方案中，PEG区段包括2个与30个之间的EG单元或4个与24个之间的EG单元。在一种实施方案中，PEG区段包括2个EG单元或4个EG单元或6个EG单元或8个EG单元或10个EG单元或12个EG单元或14个EG单元或16个EG单元或18个EG单元或20个EG单元或22个EG单元或24个EG单元。
在一种实施方案中，PEG区段包括4个EG单元。在一种实施方案中，PEG区段包括8个EG单元。在一种实施方案中，PEG区段包括12个EG单元。在一种实施方案中，PEG区段包括24个EG单元。
在一种实施方案中，PEG区段包括4个至8个EG单元。在一种实施方案中，PEG区段包括4个EG单元或8个EG单元。
在一种实施方案中，La包括具有3个EG单元的PEG区段。
在一种实施方案中，Lp包括具有4个EG单元的PEG区段。在一种实施方案中，Lp包括具有8个EG单元的PEG区段。
在一种实施方案中，Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
其中p是从1至36的整数。
在一种实施方案中，Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
或其三唑位置异构体，
其中p是从1至36的整数。
在另一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括1个至10个甘氨酸或1个甘氨酸或2个甘氨酸或3个甘氨酸或4个甘氨酸或5个甘氨酸或6个甘氨酸或7个甘氨酸或8个甘氨酸或9个甘氨酸或10个甘氨酸。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括1个至6个丝氨酸或1个丝氨酸或2个丝氨酸或3个丝氨酸或4个丝氨酸或5个丝氨酸或6个丝氨酸。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括1个至10个甘氨酸和1个至6个丝氨酸。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括4个甘氨酸和1个丝氨酸。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)(SEQ ID NO:1)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)(SEQ ID NO:2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S-G4S)(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，一个或更多个丝氨酸残基包含糖类基团，例如葡萄糖基团。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括1个至10个谷氨酸和1个至10个甘氨酸。
在一些实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段和选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和1个至10个甘氨酸的组合。在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)(SEQ ID NO:1)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)(SEQ ID NO:2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S-G4S)(SEQ ID NO:3)的基团的组合。
在一种实施方案中，接头L或第一接头La或第二接头Lp具有选自由以下组成的组的结构：
其中Y是例如，如以上示出的包含三唑的基团，并且P是有效载荷，并且其中Rc选自氢(H)和葡萄糖，g是从1至10的整数，并且s是从0至4的整数。
在一种实施方案中，Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
以及
在一种实施方案中，接头L包括环糊精部分。
在一些实施方案中，接头L经由谷氨酰胺残基与抗体或其抗原结合片段附接。在一些实施方案中，接头L经由赖氨酸残基与抗体或其抗原结合片段附接。在一些实施方案中，接头L经由半胱氨酸残基与抗体或其抗原结合片段附接。
有效载荷P
在一个方面，根据本公开内容的有效载荷P具有选自由式(P-IB)、式(P-IIB)和式(P-IIIB)组成的组的式的结构：
(P-IIIB)，其中：
X1选自H；
X2选自
X3选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH2，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数，
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，根据本公开内容的有效载荷P具有式(II)的结构：
其中：
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和-CH3，条件是当X3是-CH3时，n是1，并且Ra在至少一次出现时选自–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
n是0或1；
m是从0至3的整数；
Ra在每次出现时独立地选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
以及其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，有效载荷P具有选自以下的结构：
其中指示附接至接头的附接点。
在一种实施方案中，有效载荷具有以上示出的式(P-I)的结构，其中
·X1是H；X2是X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；n是1，并且X4是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH2OH，并且X7是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；n是1；X4是H，并且X5是
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3；X7是并且X8是-NH2；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X8是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时都是H；X7是并且X8是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3；X7是并且X8是
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3，并且X7是
·X1是H；X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H；
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X5是
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是0；X4是苯基，并且X5是并且
·X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是苯基，并且X5是
在一种实施方案中，有效载荷具有如以上示出的式(P-II)的结构，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；X4是H，并且X5是
在一种实施方案中，根据本公开内容的有效载荷P具有选自以下的结构：
在一种实施方案中，如以上描述的有效载荷具有以下特性：
在一些实施方案中，本公开内容的有效载荷易于与结合剂(例如，抗体)缀合。
接头-有效载荷(L-P)
在一种实施方案中，本公开内容提供了反应性接头-有效载荷，包括如以上描述的有效载荷P和能够与抗体或其抗原结合片段共价附接的接头。
在一种实施方案中，根据本公开内容的接头-有效载荷具有式(C)的结构：
其中：
Lp不存在或者是包括以下一种或更多种的接头：氨基甲酸酯基团；环糊精；具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段；–(CH2)2-24-链；三唑；选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸；
Q是选自-NH2、-N3、的部分，其中A是C或N；
X1选自H；
X2选自
X3选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH2，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，根据本公开内容的接头-有效载荷具有式(III)的结构：
其中：
Lp不存在或者是包括以下一种或更多种的接头：氨基甲酸酯基团；环糊精；具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段；选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸；
Q是选自-N3、的部分，其中A是C或N；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和-CH3，条件是当X3是-CH3时，n是1，并且Ra在至少一次出现时选自–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
n是0或1；
Ra在每次出现时独立地选自H、-CH3、–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
以及其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，接头-有效载荷LP包括环糊精部分。在一些实施方案中，包括环糊精部分的接头-有效载荷LP表现出GLP1R激动活性。
在一种实施方案中，根据本公开内容的接头-有效载荷LP具有选自由以下组成的组的结构：
在一种实施方案中，如以上描述的接头-有效载荷具有以下特性：
结合剂
在一种实施方案中，本文描述的蛋白-药物缀合物实施方案的有效性取决于结合剂结合其结合配偶体的选择性。在本公开内容的一种实施方案中，结合剂是能够以某种特异性与给定结合配偶体结合的任何分子。在一种实施方案中，结合剂在哺乳动物体内，在那里相互作用可以产生治疗用途。在替代实施方案中，结合剂在体外，在那里相互作用可以产生诊断用途。在一些方面，结合剂能够与细胞或细胞群体结合。
本公开内容的合适结合剂包括与结合配偶体结合的蛋白。合适的结合剂包括但不限于抗体、淋巴因子、激素、生长因子、病毒受体、白细胞介素或任何其他细胞结合或肽结合分子或物质。
在一种实施方案中，结合剂是抗体。在某些实施方案中，抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(Fab、Fab’和F(ab)2、微抗体、双抗体、三抗体等)。本文中的抗体可以使用美国专利第6,596,541号和美国公布第2012/0096572号中描述的方法进行人源化，这两个专利通过引用以其整体并入本文。在本公开内容的蛋白-药物缀合物化合物的某些实施方案中，BA是人源化单克隆抗体。例如，BA可以是结合GLP1R的单克隆抗体。
在本公开内容中，抗体可以是被认为适于本领域从业者的任何抗体。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一条或两条重链附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个重链可变结构域附接。
在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个重链可变结构域的N末端附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的两个重链可变结构域的N末端附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一条或两条轻链附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个轻链可变结构域附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个轻链可变结构域的N末端附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的两个轻链可变结构域的N末端附接。
在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个重链可变结构域的C末端附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的两个重链可变结构域的C末端附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一条或两条轻链附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个轻链可变结构域附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的一个或两个轻链可变结构域的C末端附接。在一些实施方案中，接头或接头-有效载荷与抗体或其抗原结合片段的两个轻链可变结构域的C末端附接。
在一些实施方案中，抗体在至少一个多肽链序列中包括至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，抗体包括一个或更多个Gln295残基。在某些实施方案中，抗体包括两条重链多肽，该两条重链多肽各自具有一个Gln295残基。在另外的实施方案中，抗体在除了重链295之外的位点处包括一个或更多个谷氨酰胺残基。这样的抗体可以从天然来源分离或被工程化为包括一个或更多个谷氨酰胺残基。将谷氨酰胺残基工程化到抗体多肽链中的技术在本领域从业人员的技术内。在某些实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体多肽链的N末端。在一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的一条或两条重链的N末端。在一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的两条重链的N末端。在另一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的一条或两条轻链的N末端。在一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的两条轻链的N末端。在另一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的一条或两条重链和一条或两条轻链的N末端。
在某些实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体多肽链的C末端。在一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的一条或两条重链的C末端。在一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的两条重链的C末端。在另一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的一条或两条轻链的C末端。在一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的两条轻链的C末端。在另一种实施方案中，谷氨酰胺残基被引入抗体的一条或两条重链和一条或两条轻链的C末端。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以包含TG识别标签。合适的TG识别标签包括本文描述的那些。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在一条或两条抗体轻链的N末端处包含Q-标签。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在两条抗体轻链的N末端处包含Q-标签。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在一条或两条抗体重链的N末端处包含Q-标签。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在两条抗体重链的N末端处包含Q-标签。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在一条或两条抗体轻链的C末端处包含Q-标签。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在两条抗体轻链的C末端处包含Q-标签。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在一条或两条抗体重链的C末端处包含Q-标签。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段已被修饰以在两条抗体重链的C末端处包含Q-标签。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是非糖基化的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是去糖基化的。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段是Fab片段。
抗体可以是本领域技术人员已知的任何形式。在某些实施方案中，抗体包括轻链。在某些实施方案中，轻链是κ轻链。在某些实施方案中，轻链是λ轻链。
在某些实施方案中，抗体包括重链。在一些方面，重链是IgA。在一些方面，重链是IgD。在一些方面，重链是IgE。在一些方面，重链是IgG。在一些方面，重链是IgM。在一些方面，重链是IgG1。在一些方面，重链是IgG2。在一些方面，重链是IgG3。在一些方面，重链是IgG4。在一些方面，重链是IgA1。在一些方面，重链是IgA2。
在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些方面，抗体片段是Fv片段。在一些方面，抗体片段是Fab片段。在一些方面，抗体片段是F(ab’)2片段。在一些方面，抗体片段是Fab’片段。在一些方面，抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些方面，抗体片段是scFv-Fc片段。
在一种实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是人类抗体。
抗体可以对被认为适于本领域技术人员的任何抗原具有结合特异性。在某些实施方案中，抗原是跨膜分子(例如受体)或生长因子。示例性抗原包括但不限于诸如GLP1R的分子。
本文的一些实施方案是用于治疗或诊断用途的靶特异性的。
在一些实施方案中，结合剂是抗胰高血糖素样肽1受体(GLP1R)，即抗GLP1R抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合剂是抗GLP1R激动剂抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，合适的抗GLP1R抗体是在美国公布第US20060275288A1号中公开的那些，该美国公布通过引用以其整体并入本文。根据本公开内容的示例性抗GLP1R抗体包括5A10和9A10。
在一些实施方案中，合适的抗GLP1R抗体包括但不限于AB9433-I、h38C2、PA5-111834、NLS1205、MAB2814、EPR21819和glutazumab。
本公开内容还提供了编码抗GLP1R抗体或其部分的核酸分子。本公开内容的范围内还包括能够表达包含抗GLP1R抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本公开内容包括包含以上提及的核酸分子的任何一种的重组表达载体。本公开内容的范围内还包括已经引入这样的载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并回收如此产生的抗体和抗体片段来产生抗体或其部分的方法。
在一些实施方案中，本公开内容包括具有修饰的糖基化模式的抗GLP1R抗体。在一些实施方案中，去除不期望的糖基化位点的修饰可能是有用的，或者例如，缺乏寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体可用于增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰，以便修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本公开内容提供了一种药物组合物，包括特异性结合GLP1R的重组人类抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一个相关方面，本公开内容包括一种组合物，该组合物是抗GLP1R抗体和第二治疗剂的组合。在一种实施方案中，第二治疗剂是有利地与抗GLP1R抗体组合的任何剂。涉及本公开内容的抗GLP1R抗体的另外的组合疗法和共制剂(co-formulations)在本文别处公开。
在另一个方面，本公开内容提供了用于使用本公开内容的抗GLP1R抗体靶向表达GLP1R的细胞的治疗方法，其中该治疗方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的包括本公开内容的抗GLP1R抗体的药物组合物。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。在一些实施方案中，细胞是胰腺细胞、脑细胞、心脏细胞、血管组织细胞、肾细胞、脂肪组织细胞、肝细胞或肌细胞。在一种实施方案中，细胞是胰腺细胞或脑细胞。
在一些情况下，抗GLP1R抗体(或其抗原结合片段)可以用于增强细胞中的GLP1R活性。
本公开内容还包括本公开内容的抗GLP1R抗体在制备用于治疗与表达GLP1R的细胞相关的疾病或紊乱(例如，II型糖尿病和/或肥胖)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗GLP1R抗体或抗原结合片段的化合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
在又一个方面，本公开内容提供了用于诊断应用诸如例如成像试剂的单特异性抗GLP1R抗体。
本公开内容还包括与本文描述的抗体竞争对与人类GLP1R结合的抗体或抗原结合片段。
本公开内容还包括抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与本文描述的抗体结合人类GLP1R上的相同表位。
在一个方面，本公开内容提供了包含如以上描述的抗GLP1R抗体或其抗原结合片段和治疗剂(例如，GLP1肽模拟物)的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段和有效载荷经由接头共价附接，如以上讨论的。在多种实施方案中，抗GLP1R抗体或抗原结合片段可以是本文描述的抗GLP1R抗体或片段的任何一种。在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物在血浆中是稳定的。血浆稳定性可以使用体外或者体内血浆稳定性测定来确定，诸如下文实施例8.2或实施例10中陈述的那些。在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物在血浆中具有以下的半衰期：长于4天、长于5天、长于6天、长于7天、长于8天、长于9天、长于10天、长于11天、长于12天、长于13天、长于2周、长于3周、长于4周、约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、介于5-10天、介于8-12天、介于10-15天、介于12-18天、介于15-20天、介于20-30天、介于1-2周、介于2-3周、介于3-4周、介于4-6周、介于5-8周、介于6-10周、介于1-2个月、介于1.5-3个月、介于2-4个月、介于2.5-5个月、介于3-6个月或介于4-6个月。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物以比其他G蛋白偶联受体(GPCR)大至少10倍的亲和力与GLP1R结合。在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物以比其他G蛋白偶联受体(GPCR)大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍的亲和力与GLP1R结合。在一些实施方案中，这样的抗体-药物缀合物表现出对除了GLP1R之外的GPCR基本上检测不到的结合。抗体-药物缀合物与靶分子的结合可以使用相关领域中可用的标准结合测定来测量，诸如萤光素酶报告物测定、表面等离子体共振测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析或蛋白印迹测定。除了GLP1R之外的GPCR的实例包括但不限于GIPR、GLP2R和GCGR。
在某些实施方案中，本公开内容的抗体药物缀合物包含与接头有效载荷缀合的抗GLP1R抗体或其抗原结合片段，其中接头有效载荷与抗体或其抗原结合片段在轻链的N末端处缀合。在一种实施方案中，本公开内容的抗体药物缀合物包含在轻链的N末端处与接头有效载荷缀合的抗GLP1R抗体或其抗原结合片段，其中有效载荷具有以下结构：
在某些实施方案中，本公开内容的抗体药物缀合物包含与两个接头有效载荷缀合的抗GLP1R抗体或其抗原结合片段，其中每个接头有效载荷与抗体或其抗原结合片段在轻链的N末端处附接。在一种实施方案中，本公开内容的抗体药物缀合物包含在每条轻链的N末端处与接头有效载荷缀合的抗GLP1R抗体或其抗原结合片段，对于每一个抗体总计两个接头有效载荷，其中有效载荷具有以下结构：
在又另一个方面，本文提供了一种抗体-药物缀合物，包含靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段以及具有以下结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷直接或通过接头附接至所述抗体或其抗原结合片段的附接点。
在一种实施方案中，有效载荷具有以下结构：
在又另一个方面，本文提供了一种抗体-药物缀合物，包含靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段以及具有以下结构的接头-有效载荷：
其中是所述接头-有效载荷附接至所述抗体或其抗原结合片段的附接点。
在一种实施方案中，接头-有效载荷具有以下结构：
抗体缀合
用于与抗体或抗原结合片段的残基缀合的技术和接头是本领域已知的。可以在本方面的上下文中使用的示例性氨基酸附接，例如，赖氨酸(参见例如，US 5,208,020；US2010/0129314；Hollander等人，Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见例如，US 2007/0258987；WO2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如，WO 2008/122039；以及Hofer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)、甲酰甘氨酸(参见例如，Carrico等人，Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51,以及Rabuka等人，Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如，WO 2013/068874和WO 2012/166559)、以及酸性氨基酸(参见例如，WO 2012/05982)。赖氨酸缀合也可以通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)进行。通过在硫醇之间形成碳桥，接头也可以与半胱氨酸残基(包括裂解的链间二硫键的半胱氨酸残基)缀合(参见例如，US9,951,141和US 9,950,076)。接头也可以经由与糖类(参见例如，US 2008/0305497、WO2014/065661和Ryan等人，Food&Agriculture Immunol.,2001,13:127-130)和二硫接头(参见例如，WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611和Shaunak等人，Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)附接而与抗原结合蛋白结合。位点特异性缀合技术也可以用于与抗体或抗原结合蛋白的特定残基直接缀合(参见例如，Schumacher等人，J ClinImmunol(2016)36(增刊1):100)。在下文更详细讨论的特定实施方案中，位点特异性缀合技术包括经由转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合(参见例如，Schibli,Angew Chemie Inter编著2010,49,9995)。
通过赖氨酸和/或半胱氨酸，例如经由马来酰亚胺或酰胺缀合连接的根据本公开内容的有效载荷被包括在本公开内容的范围内。
在一些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物根据两步方法产生，其中步骤1是基于赖氨酸的接头的缀合，例如与NHS-酯接头缀合，并且步骤2是有效载荷缀合反应(例如，1,3-环加成反应)。
在一些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物根据两步方法产生，其中步骤1是基于半胱氨酸的接头的缀合，例如与马来酰亚胺接头缀合，并且步骤2是有效载荷缀合反应(例如，1,3-环加成反应)。
在一些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物根据两步方法产生，其中步骤1是转谷氨酰胺酶介导的位点特异性缀合，并且步骤2是有效载荷缀合反应(例如，1,3-环加成反应)。
步骤1：转谷氨酰胺酶介导的位点特异性缀合
在一些实施方案中，蛋白(例如，抗体)可以根据已知方法被修饰以提供谷氨酰胺酰基修饰的蛋白。用于缀合抗体和伯胺化合物的技术是本领域已知的。本文采用位点特异性缀合技术，经由谷氨酰胺转胺酶使用谷氨酰胺缀合来指导与谷氨酰胺的缀合(参见，例如，Schibli,Angew Chemie Inter Ed.2010,49,9995)。
本公开内容的含伯胺的化合物(例如，接头La)可以经由基于转谷氨酰胺酶的化学-酶促缀合(参见例如，Dennler等人，Protein Conjugate Chem.2014,25,569-578，以及WO 2017/147542)与结合剂(例如，蛋白，例如，抗体，例如，抗GLP1R抗体)的一个或更多个谷氨酰胺残基缀合。例如，在存在转谷氨酰胺酶的情况下，抗体的一个或更多个谷氨酰胺残基可以与伯胺接头化合物偶联。简言之，在一些实施方案中，在存在酶转谷氨酰胺酶的情况下，具有谷氨酰胺残基(例如，Gln295，即Q295残基)的结合剂用含伯胺的接头La处理。在某些实施方案中，结合剂是非糖基化的。在某些实施方案中，结合剂是去糖基化的。
在某些实施方案中，结合剂(例如，蛋白，例如，抗体)在至少一个多肽链序列中包括至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，结合剂包括两个重链多肽，该两个重链多肽各自具有一个Gln295残基。在另外的实施方案中，结合剂在除了重链295之外的位点处包括一个或更多个谷氨酰胺残基。
在一些实施方案中，结合剂诸如抗体可以通过定点诱变制备，以在某个位点处插入谷氨酰胺残基，而不会导致抗体功能或结合失效。例如，本文包括如本文描述的携带一个或更多个Asn297Gln(N297Q)突变的抗体。在一些实施方案中，具有Gln295残基和/或N297Q突变的抗体在其可变区中包含一个或更多个另外的天然存在的谷氨酰胺残基，其可以被转谷氨酰胺酶接近，并且因此能够与接头或接头有效载荷缀合。示例性天然存在的谷氨酰胺残基可以存在于，例如，轻链的Q55处。在这样的情况下，经由转谷氨酰胺酶缀合的结合剂例如抗体可以具有高于预期的LAR值(例如，高于4的LAR)。任何这样的抗体都可以从天然或人工来源分离。
步骤2：有效载荷缀合反应
在某些实施方案中，根据本公开内容的接头La包括能够在转谷氨酰胺化之后进一步反应的至少一个第一反应性基团。在这些实施方案中，谷氨酰胺酰基修饰的蛋白(例如，抗体)能够与反应性有效载荷化合物P或反应性接头-有效载荷化合物(例如，如本文公开的Lp-P)进一步反应，以形成蛋白-有效载荷缀合物。更具体地，反应性接头-有效载荷化合物Lp-P可以包括能够与接头La的第一反应性基团反应的第二反应性基团。在某些实施方案中，根据本公开内容的第一或第二反应性基团包括能够进行1,3-环加成反应的部分。在某些实施方案中，反应性基团是叠氮化物。在某些实施方案中，反应性基团包括炔烃(例如，末端炔烃或内部应变炔烃)。在本公开内容的某些实施方案中，反应性基团与结合剂和转谷氨酰胺反应条件相容。
在本公开内容的某些实施方案中，接头La分子包括第一反应性基团。在本公开内容的某些实施方案中，接头La分子包括多于一个反应性基团。
在某些实施方案中，反应性接头-有效载荷Lp-P包括一个有效载荷分子(n＝1)。在某些其他实施方案中，反应性接头-有效载荷Lp-P包括两个或更多个有效载荷分子(n≥2)。
在本公开内容的某些实施方案中，药物-抗体比或DAR是每个抗体约1个至约30个、或约1个至约24个、或约1个至约20个、或约1个至约16个、或约1个至约12个、或约1个至约10个、或约1个至约8个、或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个有效载荷分子。在一些实施方案中，DAR是1至30。在一些实施方案中，DAR是1至16。在一些实施方案中，DAR是1至8。在一些实施方案中，DAR是1至6。在某些实施方案中，DAR是2至4。在一些情况下，DAR是2至3。在某些情况下，DAR是0.5至3.5。在一些实施方案中，DAR是约1、或约1.5、或约2、或约2.5、或约3、或约3.5。在一些实施方案中，DAR是2。在一些实施方案中，DAR是4。在一些实施方案中，DAR是8。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(L-P)m(A)，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少m个谷氨酰胺残基Gln的BA与至少m当量的化合物L-P接触，以及
b)分离所产生的式(A)化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(L-P)m(A)，
其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp是与所述P共价附接的第二接头，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少m个谷氨酰胺残基Gln的BA与包括叠氮化物或炔烃部分的第一接头La接触；
b)使步骤a)的产物与至少m当量的化合物Lp-P接触，其中所述第二接头Lp包括叠氮化物或炔烃部分，其中La和Lp能够反应产生三唑，以及
c)分离所产生的式(A)化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-L-P(I)，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA与化合物L-P接触，以及
b)分离所产生的式(I)化合物，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-L-P(I)，
其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑、Diels-Alder加合物或硫醇-马来酰亚胺加合物的基团，并且
Lp是与所述P共价附接的第二接头，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA与包括叠氮化物或炔烃部分的第一接头La接触；
b)使步骤a)的产物与化合物Lp-P接触，其中所述第二接头Lp包括叠氮化物或炔烃部分，其中La和Lp能够反应产生三唑，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物，
其中BA、L’和P如以上定义。
在一种实施方案中，Y是包含三唑的基团。
在一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln天然存在于BA的CH2结构域或CH3结构域中。在另一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至BA中。在一种实施方案中，Gln是Q295或N297Q。
在一种实施方案中，转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)。在一种实施方案中，转谷氨酰胺酶是细菌转谷氨酰胺酶(BTG)。
在一种实施方案中，用于在产生式(I)化合物的以上方法的任何一种中使用的化合物L-P具有选自由以下组成的组的结构：
结构
或其药学上可接受的盐。
治疗制剂和施用
本公开内容提供了包括本公开内容的蛋白-药物缀合物的药物组合物。
在一个方面，本公开内容提供了包括根据本公开内容的蛋白-药物缀合物群体的组合物，所述蛋白-药物缀合物群体具有约0.5至约30.0的药物-抗体比(DAR)。
在一种实施方案中，组合物具有约1.0至约2.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约2的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约3.0至约4.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约4的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约6.5至约8.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约8的DAR。
本公开内容的组合物用合适的载体、赋形剂和提供改进的转移、递送、耐受性等的其他试剂配制。许多适当的制剂可见于所有药物化学家都知道的配方集中：Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液carbowax(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含carbowax的半固体混合物。还参见Powell等人”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)JPharm Sci Technol 52:238-311。
向患者施用的蛋白-药物缀合物的剂量可以根据患者的年龄和大小、靶疾病、状况、施用途径等而变化。合适的剂量通常根据体重或体表面积来计算。在本公开内容的蛋白-药物缀合物用于成人患者中的治疗目的时，通常以约0.01mg/kg至约20mg/kg体重、更优选地约0.02mg/kg至约7mg/kg、约0.03mg/kg至约5mg/kg或约0.05mg/kg至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开内容的蛋白-药物缀合物可以是有利的。根据状况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用蛋白-药物缀合物的有效剂量和方案可以凭经验确定；例如，可以通过定期评价监测患者进展，并相应调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间缩放(例如，Mordenti等人，1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
多种递送系统是已知的，并且可以用于施用本公开内容的药物组合物，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞中(参见例如，Wu等人，1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注、通过经由粘膜上皮或粘膜皮层衬里(诸如口腔黏膜、直肠和肠粘膜等)吸收被施用，并且可以与其他生物活性剂一起被施用。施用可以是全身性的或局部的。
本公开内容的药物组合物可以通过标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔递送装置容易在递送本公开内容的药物组合物方面具有应用。这样的笔递送装置可以是可重复使用的或一次性使用的。可重复使用的笔递送装置通常利用包含药物组合物的可更换药筒。在药筒内的全部药物组合物已经被施用并且药筒是空的后，空的药筒可以容易地被弃去并被包含药物组合物的新药筒替代。然后，笔递送装置可以重复使用。在一次性使用的笔递送装置中，不存在可更换的药筒。而是，一次性使用的笔递送装置预先填充(comes prefilled)有保持在装置内的储器(reservoir)中的药物组合物。在储器中的药物组合物被清空后，整个装置就被弃去。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置在皮下递送本公开内容的药物组合物方面具有应用。实例包括，但不限于，仅举几个例子，AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。在本公开内容的药物组合物的皮下递送方面具有应用的一次性使用的笔递送装置的实例，包括但不限于，仅举几个例子，SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)。
在某些情况下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一种实施方案中，可以使用泵(参见，Langer，同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一种实施方案中，可以使用聚合物材料；参见，Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(编著),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一种实施方案中，控制释放系统可以置于组合物的靶附近，因此仅要求全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,同上，第2卷，第115-138页)。Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论了其他控制释放系统。
可注射制品可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制品可以通过公众已知的方法制备。例如，可注射制品可以通过，例如，将以上描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为注射用水性介质，存在，例如，生理盐水、包含葡萄糖和其他辅助剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，采用了，例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。这样制备的注射剂优选地填充在合适的安瓿中。
有利地，以上描述的用于口服或肠胃外使用的药物组合物以适于适合活性成分剂量的单位剂量制备为剂型。单位剂量的这样的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。在单位剂量中，被包含的前述抗体的量通常是每剂型约5mg至约500mg；特别是在注射形式中，优选的是前述抗体以约5mg至约100mg被包含并且对于其他剂型以约10mg至约250mg被包含。
蛋白-药物缀合物、接头-有效载荷和有效载荷的治疗用途
在另一个方面，本文公开的化合物(例如抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)尤其可用于治疗、预防和/或改善需要这样的治疗的疾病、紊乱或状况。
在一个方面，本公开内容提供了一种治疗有相应需要的受试者的状况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的根据本公开内容的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)，或包含根据本公开内容的任何化合物的组合物。
在一些实施方案中，本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)可用于治疗其中刺激、激活和/或靶向GLP1R将是有益的任何疾病或紊乱。特别地，本公开内容的抗GLP1R抗体-药物缀合物可以用于治疗、预防和/或改善与GLP1R表达或活性相关或由其介导的任何疾病或紊乱。
在一些实施方案中，本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)可用于治疗GLP1R相关状况。在一些实施方案中，GLP1R相关状况是1型或2型糖尿病病。所施用的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)可以引起以下结果的至少一种：诱导胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放、降低血糖、改进血糖控制、促进胰岛新生以及延迟胃排空或增强葡萄糖抗性胰岛。
在一些实施方案中，GLP1R相关状况是神经退行性紊乱、认知障碍、记忆障碍或学习障碍。神经退行性紊乱可以是例如痴呆、老年性痴呆、轻度认知障碍、阿尔茨海默病相关痴呆、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s chorea)、迟发性运动障碍、运动过度(hyperkinesias)、躁狂、Morbus Parkin-son、steel-Richard综合征、唐氏综合征、重症肌无力、神经创伤、脑创伤、血管淀粉样变性、伴有淀粉样变性的脑出血I、脑炎症、Friedrich共济失调、急性意识神志不清紊乱、肌萎缩侧索硬化、青光眼和阿尔茨海默病。
在一些实施方案中，GLP1R相关状况是肝病。肝病可以是例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。
在一些实施方案中，GLP1R相关状况是冠状动脉疾病。冠状动脉疾病可以是例如心肌病和心肌梗塞。
在一些实施方案中，GLP1R相关状况是肾病。肾病可以是例如高血压或慢性肾衰竭。
在一些实施方案中，GLP1R相关状况是进食障碍。进食障碍可以是例如暴饮暴食。
不希望受理论约束，本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)可以用于减弱以下的影响：凋亡介导的中枢神经系统退行性疾病诸如阿尔茨海默病、Creutzfeld-Jakob病和牛科海绵状脑病、慢性消耗综合征和其他朊病毒介导的凋亡性神经疾病(参见例如，Perry和Grieg(2004)Current Drug Targets 6:565-571)。本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)的施用也可以导致βAPP的下调，并且从而改善与阿尔茨海默病相关的Aβ单体或寡聚体介导的病理(参见例如，Perry等人(2003)Journal of Neuroscience Research 72:603-612)。
还设想，本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)可以用于改进学习和记忆，例如通过增强神经元可塑性和促进细胞分化(参见During等人(2003)Nature Medicine 9:1173-1179)。此外，本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)也可以用于维持Morbus Parkinson的多巴胺神经元和运动功能(参见例如，Greig等人(2005)Abstract 897.6,Society for Neuroscience,Washington,D.C.)。
在一些实施方案中，本文公开的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)也可以用于治疗代谢紊乱。代谢紊乱可以是例如肥胖、血脂异常、代谢综合征X和由胰岛功能不全引起的病理。
可以由本公开内容的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)治疗的另外的疾病包括自身免疫性疾病，特别是与炎症相关的疾病，包括但不限于自身免疫性糖尿病、成人发病糖尿病、病态肥胖、代谢综合征X和血脂异常。例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物可以用作促进自身免疫性糖尿病患者的胰岛生长的生长因子。本文描述的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)也可以可用于治疗充血性心力衰竭。
在一个方面，本公开内容提供了一种用化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原(例如，GLP1R)的方法。在一种实施方案中，用化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原(例如，GLP1R)的方法包括将化合物与靶向抗体连接。在一种实施方案中，化合物是如以上描述的有效载荷。在一种实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一种实施方案中，细胞是人类细胞。在一种实施方案中，细胞是胰腺细胞或脑细胞。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种用具有选自由以下组成的组的结构的化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原的方法：
其中是化合物附接至接头L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本公开内容还包括本公开内容的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)在制备用于治疗与表达GLP1R的细胞相关或由其引起的疾病或紊乱(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及用于在医学中使用的包括如本文公开的抗GLP1R抗体或抗原结合片段的蛋白-药物缀合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
组合疗法和制剂
本公开内容提供了包括组合施用药物组合物与一种或更多种另外的治疗剂的方法，该药物组合物包括本文描述的示例性蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷的任何一种。
可以与本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷组合或与其组合施用的示例性另外的治疗剂包括其他GLP1R激动剂(例如，抗GLP1R抗体或GLP1R的小分子激动剂或抗GLP1R抗体-药物缀合物)。GLP1R激动剂的非限制性实例包括艾塞那肽(Byetta、Bydureon)、利拉鲁肽(Victoza、Saxenda)、利西拉肽(欧洲的Lyxumia、美国的Adlyxin)、阿必鲁肽(Tanzeum)、度拉糖肽(Trulicity)、塞马鲁肽(Ozempic)和他司鲁肽。
示例性的另外的治疗剂可以包括双重或三重激动剂，包括GLP1R/GIPR双重激动剂，诸如GLP1R/GCGR双重激动剂、GLP1R/GIPR/GCGR三重激动剂。
可以与本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷组合有益施用的其他剂包括那些可用于治疗糖尿病(例如，II型糖尿病)、肥胖和/或其他相关代谢疾病的剂。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗糖尿病剂。可以使用任何合适的抗糖尿病剂。抗糖尿病剂的非限制性实例包括胰岛素、胰岛素类似物(包括赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素(insulin glulisine)、低精蛋白胰岛素(isophane insulin)、锌胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素)、双胍类(包括二甲双胍、苯乙双胍和丁双胍(buformin))、噻唑烷二酮类或TZD(包括罗格列酮、吡格列酮和曲格列酮)、磺脲类(包括甲苯磺丁脲、乙酰六酰胺、妥拉磺脲、氯丙酰胺、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列齐特、格列吡脲和格列喹酮)、美格列奈类(meglitinides)药物(包括瑞格列奈和那格列奈)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(包括米格列醇、阿卡波糖和伏格波糖)、胰高血糖素样肽类似物和激动剂(包括艾塞那肽、利拉鲁肽、塞马鲁肽、他司鲁肽、利西拉肽、阿必鲁泰和度拉鲁肽)、抑胃肽类似物、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(包括维格列汀(vildagliptin)、西他列汀、沙格列汀、利格列汀(linagliptin)、阿格列汀、塞他列汀(septagliptin)、特力利汀(teneligliptin)和吉格列汀)、胰淀素激动剂类似物、钠/葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、葡萄糖激酶激活剂、鲨烯合酶抑制剂、其他降脂剂和阿司匹林。在一些这样的实施方案中，抗糖尿病剂是口服抗糖尿病剂(OAA)，诸如二甲双胍、阿卡波糖或TZD。在一些这样的实施方案中，抗糖尿病剂是二甲双胍。
在一些实施方案中，GLP1R激动剂和一种或更多种抗糖尿病剂可以配制到同一剂型中，诸如用于胃肠外施用的溶液或悬浮液。
一种或更多种另外的治疗活性组分可以在本公开内容的化合物临施用之前、施用的同时或施用之后不久施用；(为了本公开内容的目的，这样的施用方案被认为是抗原结合分子与另外的治疗活性组分“组合”的施用)。
本公开内容包括药物组合物，其中本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷与本文别处描述的一种或更多种另外的治疗活性组分的一种或更多种共配制。
施用方案
根据本公开内容的某些实施方案，可以在确定的时间过程中向受试者施用多剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。根据本公开内容的这一方面的方法包括向受试者顺序施用多剂量的本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。如本文使用的，“顺序施用”意味着在不同的时间点，例如在由预定间隔(例如，小时、天、周或月)分隔的不同天数，向受试者施用每个剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。本公开内容包括了方法，该方法包括向患者顺序施用单个初始剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷，随后是一个或更多个第二剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷，以及任选地随后是一个或更多个第三剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷施用的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量都可以包含相同量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷，但通常可以在施用频率方面彼此不同。然而，在某些实施方案中，在治疗过程期间，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中包含的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷的量彼此不同(例如，酌情上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时以“加载剂量(loading doses)”施用两个或更多个(例如2个、3个、4个或5个)剂量，随后是以基于不太频繁施用的随后剂量(例如，“维持剂量”)。
在本公开内容的一种示例性实施方案中，每个第二剂量和/或第三剂量在紧接前一剂量之后1周至26周(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多周)施用。如本文中使用的短语“紧接前一剂量”意指在多次施用的顺序中，在顺序中施用下一个剂量之前向患者施用的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷的剂量，没有中间剂量。
根据本公开内容的这一方面的方法可以包括向患者施用任何数目的第二剂量和/或第三剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗GLP1R抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用单个第二剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第二剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单个第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，每个第二剂量可以以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可以在紧接前一剂量之后1周至2周向患者施用。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，每个第三剂量可以以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量可以在紧接前一剂量之后2周至4周向患者施用。可选地，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中改变。在临床检查后，医生也可以根据个体患者的需要在治疗过程期间调整施用频率。
实施例
以下实施例示出了本说明书的具体方面。这些实施例不应被解释为限制性的，因为这些实施例仅仅提供了对实施方案及其各个方面的具体理解和实践。
在实施例和整个说明书中使用的缩写如下：
实施例1.小分子有效载荷和接头-有效载荷的合成
1.1肽模拟物有效载荷的固相肽合成
使用SPPS方法制备肽模拟物(有效载荷)的一般程序
方案1描绘了根据本公开内容的肽模拟物有效载荷在树脂上的组装。使用配备有过滤盘的聚丙烯柱，通过滚轴混合器将肽手工地组装到Fmoc SPPS(固相肽合成)上。将足够量的Rink酰胺MBHA树脂(载量：0.5～0.6mmol/g)在DMF或CH2Cl2中溶胀15min。
方案1：使用SPPS策略组装多肽有效载荷的一般方案
步骤1：用于从Fmoc-Rink酰胺MBHA树脂中去除Fmoc的一般程序
通过将树脂与20％哌啶在DMF(10-30ml/100mg树脂)中孵育5min至15min，去除树脂上的Fmoc基团。将去保护的树脂过滤，并且用过量的DMF和DCM洗涤。在洗涤三次之后，将树脂在新鲜蒸馏的DMF(1mL/100mg树脂)中在氮气气氛下孵育5分钟。
步骤2：用于在Rink酰胺MBHA树脂上酰胺偶联的一般方法
对于以SPPS-反应物进行的酰胺偶联反应，向树脂中添加包含HATU(1.5-4当量)、Fmoc保护的氨基酸(在0.5M浓度的1.5-5当量)和DIPEA(5-10当量)的DMF溶液。对于以天然氨基酸作为反应物的酰胺偶联反应，将Fmoc-氨基酸(5当量)、HATU(4.5当量)和DIPEA(10当量)与树脂混合；对于以非天然氨基酸作为反应物的酰胺偶联反应，将Fmoc-氨基酸(1.5-2当量)、HATU(1.5当量)和DIPEA(5.0当量)与树脂混合。然后将混合的树脂混合物在氮气气氛下摇动1-3小时，并且使用茚三酮测试定性分析监测偶联反应。在附接Fmoc保护的氨基酸之后，然后用DMF和DCM洗涤树脂以产生对应的肽结合树脂。
步骤3：用于从树脂上裂解随后整体去保护的一般程序
使树脂结合的肽模拟物有效载荷经历用TFA混合物的裂解和去保护，如下所示。将TFA/水/三异丙基硅烷(95:2.5:2.5)的溶液(10mL每100mg肽基树脂)添加至肽基树脂中，并且将混合物保持在室温。在2-3小时之后，将树脂过滤并且用裂解溶液冲洗。将合并的滤液用冷t-BuOMe处理以使肽沉淀。将悬浮液离心10min(5000R)。将粗制的白色粉末合并并且通过制备型HPLC纯化。
如方案1中描绘的，肽链延伸通过由去保护、洗涤、偶联和洗涤程序组成的多次迭代来进行(即，每次使树脂经历反应条件持续1小时，并且每次将溶液排出并且使树脂再次经历新鲜试剂)。最后，如以上描述的，将所得Fmoc保护的肽基树脂用20％哌啶去保护，并且用DMF和DCM各洗涤四次。将树脂结合的肽在氮气流下干燥10-15分钟，并且经历裂解/去保护。使用以上方案及其合适的变化，本公开内容中设计的肽模拟物使用Fmoc-SPPS方法来制备。此外，使用以下方案将树脂结合的肽模拟物裂解和去保护、纯化和表征。
1.2粗制肽模拟物的制备型HPLC纯化：
将制备型HPLC在Shimadzu LC-8a液相色谱仪上进行。将溶解于DMF或水中的粗制肽溶液注入柱中，并且用ACN在水中的线性梯度洗脱。使用不同的方法。(参见一般信息)。洗脱的期望产物在级分中，并且通过冻干各自的HPLC级分获得作为无定形粉末的纯肽模拟物。通常，在制备型HPLC纯化之后，发现总回收率在40％～50％收率的范围内。
制备型HPLC方法A：使用FA条件(柱：Xtimate C 18 150*25mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：40％-70％，7min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法B：使用TFA条件(柱：YMC-Exphere C18 10μm300*50mm 12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法C：使用中性条件(柱：Phenomenex Gemini-NX150*30mm*5μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：21％-51％，11min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法D：使用中性条件(柱：Waters Xbridge 150*255u；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：20％-50％，7min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法E：使用FA条件(柱：Phenomenex Luna C18 250*50mm*10μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：55％-86％，21min)以获得纯产物。
1.3纯化的肽模拟物的HPLC分析：
如以上描述的，通过制备型HPLC纯化之后，使用方法A、B、C、D、E或F通过分析型HPLC分析每种肽。通常，使用PDA检测器在220nm处进行色谱采集，发现在制备型HPLC纯化之后获得的纯肽模拟物的纯度>95％。
HPLC方法A(20min)：流动相：在4L水中的4.0mL TFA(溶剂A)和在4L乙腈中的3.2mLTFA(溶剂B)，在20分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.0mL/分钟的流量在80％保持3.5分钟；柱：Gemini-NX 5μm 150*4.6mm，C18，110A波长：UV 220nm，254nm；柱温：30℃
HPLC方法B(15min)：流动相：在水中的2.75mL/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5mL/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在80％保持5分钟；柱：WELCH Ultimate LP-C18 150*4.6mm 5μm；波长：UV 220nm，215nm，254nm；柱温：40℃
HPLC方法C(8min)：流动相：在水中的2.75mL/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5mL/4L TFA(溶剂B)，在7分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在80％保持0.48分钟；柱：Ultimate XB-C18，3μm,3.0*50mm；波长：220nm，215nm，254nm；柱温：40℃。
HPLC方法D(15min)：流动相：包含0.04％TFA的水(溶剂A)。和包含0.02％TFA的乙腈(溶剂B)，在15分钟内使用10％至80％的洗脱梯度(溶剂B)，并且以1.5mL/分钟的流量在80％保持3.5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm波长：UV 220nm，254nm；柱温：30℃。
HPLC方法E(8min)：流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2mL/1L NH3*H2O，在5分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在60％保持2分钟；柱：Xbridge Shield RP-18,5μm,2.1*50mm。波长：UV 220nm，254nm；柱温：30℃。
HPLC方法F(7min)：流动相：在水中的1.5mL/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75mL/4L TFA(溶剂B)，使用10％-80％的洗脱梯度(溶剂B)。柱：Xtimate C18 2.1*30mm；波长：UV220nm，254nm；柱温：50℃。
1.4通过质谱表征：
以流动注入或LC/MS模式通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)对每种肽进行表征。在所有情况下，实验测量的分子量在计算的单同位素分子量的0.5道尔顿以内。使用以上描述的方案，通过质谱对所有粗制/纯肽模拟物进行表征，并且通常，观察到的肽模拟物质量与计算/理论质量一致，这确认了期望肽模拟物的成功合成。
LC-MS方法A：MERCK(RP-18e 25-2mm)柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LC-MS方法B：Xtimate(C18 2.1*30mm,3μm)柱，流量为0.8mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LC-MS方法C：Chromolith(Flash RP-18e 25-3mm)柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LC-MS方法D：Agilent,a Pursuit(5C18 20*2.0mm)柱，流量1.5ml/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LC-MS方法E：Waters Xbridge C18 30*2.0mm，3.5μm柱，流量1.0mL/min，用5％至95％的梯度洗脱。流动相：A)在水中的0.05％NH3H2O；B)ACN。梯度：在5.8min内0％B增加至95％B；在95％B保持1.1min；然后在6.91min时返回至0％B，并且保持0.09min。
LC-MS方法F：XBridge C18 3.5μm 2.1*30mm柱，流量为1.0mL/min，流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.8mL/4L NH3·H2O，在2分钟内使用10％-80％(溶剂B)的梯度，并且在80％保持0.48分钟。
1.5 HRMS分析在Agilent 6200系列TOF和6500系列Q-TOF LC/MS系统上进行。
流动相：在水(溶剂A)和ACN(溶剂B)中的0.1％FA；洗脱梯度：在3分钟内5％-95％(溶剂B)，并且以1ml/分钟的流量在95％保持1分钟；柱：Xbridge Shield RP 18 5μm,2.1*50mm离子源：AJS ESI源；离子模式：正；雾化气体：氮气；干燥气体(N2)流量：8L/min；雾化器压力：35psig；气体温度：325℃；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；毛细管电压：3.5KV；碰撞电压：175V。
实施例2.非天然氨基酸的合成
表1.天然和非天然氨基酸aa1–aa30的结构
2.1非天然氨基酸(aa1b)的合成
方案2概述了非天然氨基酸(aa1b)的合成：
方案2
试剂和条件：a)1-(苄氧基)-4-(溴甲基)苯(aa1b-4)(1.0当量)、t-BuOK(1.0当量)、THF，0℃-10℃，1h，67.93％；b)Pd/C(10％)、H2(50Psi)、MeOH，40℃，44h；94.24％；c)1-氯-4-碘丁烷(1.5当量)、K2CO3(2.0当量)、DMF，50℃，16h，83.44％；d)NaN3(2.17当量)、K2CO3(2.0当量)、DMF，65℃，16h，98.44％；e)LiOH·H2O(2.0当量)、THF/H2O，22℃，1h，100％；f)HCl/EtOAc，22℃，1h，85.04％；g)NaHCO3水溶液(0.43M)、Fmoc-osu、THF、0℃-22℃，16h，92.11％；h)(Boc)2O(3.0当量)、DIPEA(3.0当量)、Pd/C(10％)、H2(15Psi)，4h，22.50％。
aa1b-2根据见于以下中的详细合成程序制备：Wu,X.Y.；Stockdill,J.L.；Park,P.K.；Samuel J.Danishefsky,S.J.Expanding the Limits of Isonitrile-MediatedAmidations:On the Remarkable Stereosubtleties of Macrolactam Formation fromSynthetic Seco-Cyclosporins.J.Am.Chem.Soc.2012,134,2378-2384。aa1b-1的制备参考了Du,J.J.；Gao,X.F.；Xin,L.M.；Lei,Z.；Liu,Z.；和Guo,J.Convergent Synthesis of N-Linked Glycopeptides via Aminolysis ofω-Asp p-Nitrophenyl Thioesters inSolution.Org.Lett.2016,18,4828-4831。
步骤1：(S,Z)-5-(4-(苄氧基)苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊-4-烯酸甲酯(aa1b-3)的合成
在0℃在氮气下向aa1b-2(17.50g,32.43mmol,1.0当量)在THF(100mL)中的悬浮液中添加t-BuOK(3.64g,32.43mmol,1.0当量)。将混合物在0℃搅拌30min。向该混合物中逐滴添加aa1b-1(7.5g,32.43mmol,1.0当量)在THF(50mL)中的溶液。将反应物加热至10℃并且搅拌1小时。观察到浅黄色悬浮液。将反应物添加至冰水(300mL)中，并且用EtOAc(200mL×2)提取。将有机层合并并且用盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g硅快速柱，0％～18％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@50mL/min)纯化1.5h，总体积为2.5L以给出作为浅黄色油状物的aa1b-3(9.7g,23.57mmol,67.93％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.45-7.26(m,6H),7.18(br d,J＝8.6Hz,1H),6.92(dd,J＝8.7,11.4Hz,2H),6.56-6.34(m,1H),5.98-5.83(m,1H),5.55-5.42(m,1H),5.07(d,J＝2.2Hz,3H),4.48-4.36(m,1H),3.77-3.68(m,3H),2.94-2.56(m,2H),1.43(s,9H)。
步骤2：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(4-羟基苯基)戊酸甲酯(aa1b-4)的合成
将甲基aa1b-3(9.7g,23.57mmol,1.0当量)和Pd/C(10％激活的钯碳,1.0g,9.40mmol)在MeOH(100mL)中的溶液在50Psi的氢气下在40℃搅拌44小时。观察到黑色悬浮液。将反应物过滤通过硅藻土垫，用MeOH(50mL×3)洗涤滤饼。将滤液在真空中浓缩，以给出作为灰色固体的aa1b-4(7.5g,22.22mmol,94.24％收率,95.788％纯度)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.05-6.92(m,J＝8.3Hz,2H),6.79-6.70(m,J＝8.3Hz,2H),5.59(br s,1H),5.03(br d,J＝7.8Hz,1H),4.37-4.26(m,1H),3.71(s,3H),2.61-2.47(m,2H),1.81(br s,1H),1.68-1.54(m,3H),1.44(s,9H)。LCMS(ESI):RT＝0.927min，对于C17H25NO5质量计算为323.17,m/z，实测345.9[M+Na]+。使用方法C进行反相LC-MS。
步骤3：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(4-(4-氯丁氧基)苯基)戊酸甲酯(aa1b-5)的合成
将aa1b-10(7g,21.65mmol,1.0当量)、1-氯-4-碘丁烷(7.09g,32.47mmol,1.5当量)和K2CO3(5.98g,43.29mmol,2.0当量)在DMF(70mL)中的溶液在50℃搅拌16小时。将合并的反应物添加至冰水(200mL)中，并且用EtOAc(150mL×3)提取。将有机层合并并且用盐水(150mL×2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g硅快速柱，0％～20％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@50mL/min)纯化1.5h，总体积为2.5L，以给出作为无色油状物的aa1b-5(8g,19.33mmol,83.44％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.04(d,J＝8.6Hz,2H),6.79(d,J＝8.6Hz,2H),4.95(br d,J＝7.3Hz,1H),4.34-4.22(m,1H),3.98-3.92(m,2H),3.70(s,3H),3.60(t,J＝6.2Hz,2H),2.62-2.48(m,2H),2.04-1.84(m,4H),1.83-1.59(m,4H),1.42(s,9H)。
步骤4：(S)-5-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸甲酯(aa1b-6)的合成
将aa1b-5(7.5g,18.12mmol,1.0当量)、NaN3(2.56g,39.32mmol,2.17当量)、K2CO3(5.01g,36.24mmol,2.0当量)和KI(300.78mg,1.81mmol,0.1当量)在DMF(75mL)中的混合物在65℃搅拌16小时。将反应物添加至冰水(200mL)中，并且用EtOAc(100mL×3)提取。将有机层合并并且用盐水(100mL×3)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出作为黄色油状物的aa1b-6(7.5g，17.84mmol，98.44％收率)。
步骤5：(S)-5-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸(aa1b-7)的合成
将aa1b-6(7.5g,17.84mmol,1.0当量)和LiOH·H2O(1M,35.67mL,2.0当量)在THF(70mL)中的溶液在22℃搅拌1小时。没有观察到变化。将反应物在真空中浓缩以去除THF。将反应物用1N HCl调节至pH＝5，并且用EtOAc(10mL×2)提取。将有机层合并并且用盐水洗涤(10mL)，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出作为无色油状物的aa1b-7(7.25g，17.84mmol，100.00％收率)。
步骤6：(S)-2-氨基-5-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基)戊酸盐酸盐(aa1b-8)的合成
将aa1b-7(7.25g,17.84mmol,1.0当量)在4M HCl/EtOAc(75mL)中的溶液在22℃搅拌1小时。将反应物在真空中浓缩，以给出作为白色固体的aa1b-8(5.2g,15.17mmol,85.04％收率,HCl)。
步骤7：(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基)戊酸(aa1b-9)的合成
在0℃向aa1b-8(5g,14.58mmol,1.0当量,HCl)在THF(116mL)中的溶液中添加在H2O(58mL)中的NaHCO3(2.45g,29.17mmol,2.0当量)，并且然后添加Fmoc-OSu(5.41g,16.04mmol,1.1当量)。将反应混合物在22℃搅拌16小时。没有观察到变化。将反应物用1NHCl调节至pH＝6，并且用EtOAc(50mL×3)提取。将有机层合并并且用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g硅快速柱，0％～5％MeOH/DCM梯度的洗脱液@50mL/min)纯化2.5h，总体积为3L，以给出作为黄色油状物的aa1b-9(7g,12.20mmol,83.64％收率,92.113％纯度)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.75(br d,J＝7.3Hz,2H),7.60-7.49(m,2H),7.41-7.34(m,2H),7.29(br t,J＝7.5Hz,2H),7.05(br d,J＝8.3Hz,2H),6.78(br d,J＝8.3Hz,2H),5.18(br d,J＝8.3Hz,1H),4.40(br d,J＝6.8Hz,3H),4.21(br t,J＝7.0Hz,1H),3.98-3.88(m,2H),3.34(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(br d,J＝6.1Hz,2H),1.98-1.60(m,8H)。
步骤8：(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁氧基)苯基)戊酸(aa1b)的合成
将aa1b-15(7g,13.24mmol,1.0当量)、DIPEA(5.13g,39.73mmol,6.92mL,3.0当量)和Boc2O(8.67g,39.73mmol,9.13mL,3.0当量)以及Pd/C(10％激活的碳钯,3.5g,32.9mmol)在EtOAc(100mL)中的混合物在15PSi的H2下在25℃搅拌持续4小时。观察到黑色悬浮液。将反应物过滤通过硅藻土垫，用EtOAc(50mL×3)洗涤滤饼。将滤液用NH4Cl水溶液(100mL×3)、盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以给出作为无色油状物的粗制品。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Luna(2)C18 250*50 10μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：45％-78％,21.5min)纯化，以给出作为黄色油状物的aa1b(1.8g,2.99mmol,22.50％收率)。LCMS(ESI):RT＝0.954min，对于C35H42N2O7Na质量计算为625.29,m/z，实测625.1[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.75(br d,J＝7.6Hz,2H),7.60-7.55(m,2H),7.38(br t,J＝6.7Hz,2H),7.29(t,J＝7.1Hz,2H),7.04(br d,J＝8.1Hz,2H),6.78(d,J＝7.4Hz,2H),5.24(br s,1H),4.40(br d,J＝6.6Hz,2H),4.23-4.18(m,1H),3.92(br s,2H),3.21-3.07(m,2H),2.61-2.51(m,2H),1.97-1.84(m,2H),1.82-1.54(m,8H),1.43(s,9H)。
2.2非天然氨基酸(aa2)的合成
方案3概述了非天然氨基酸(aa2)的合成：
方案3
试剂和条件：(a)K2CO3、PMB-Cl、DMF，25℃，12h；(b)Ph3PCH2Br、t-BuOK、THF，0℃-25℃，4h，71.91％；(c)Pd(dppf)Cl2、KOAc、4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷、1,4-二噁烷，80℃，20h，42.75％；(d)aa 2-6,K2CO3、Pd(PPh3)4、1,4-二噁烷和H2O，80℃，2.5h，76.20％；(e)Pd/C、H2(15psi)、MeOH，25℃，48h，85.01％；(f)K2CO3、1-氯-4-碘-丁烷、DMF，50℃，12h；(g)K2CO3、KI、NaN3、DMF，50℃，7h；
化合物aa2-5根据以下文献参考文献制备：I.Berezowska,N.N.Chung,C.Lemieux,B.C.Wilkes和P.W.Schiller,Agonist vs Antagonist Behavior ofδOpioid PeptidesContaining Novel Phenylalanine Analogues in Place of Tyr.J.Med.Chem.,第52卷,第21期,2009,6941-6945。
步骤1：2-溴-5-((4-甲氧基苄基)氧基)苯甲醛(aa2-2)的合成
向aa2-1(10g，49.75mmol，1.0当量)和K2CO3(10.31g，74.62mmol，1.5当量)在DMF(100mL)中的溶液中添加PMB-Cl(11.69g，74.62mmol，10.16mL，1.5当量)。将混合物在25℃搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩。将剩余物用H2O(100mL)稀释并且用EtOAc(100mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。获得作为白色固体的化合物aa2-2(21g，粗制)，其直接用于下一步骤，而无任何进一步纯化。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.16(s,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.43-7.34(m,3H),7.28(dd,J＝3.3,8.8Hz,1H),6.99-6.90(m,2H),5.10(s,2H),3.75(s,3H)。
步骤2：1-溴-4-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-乙烯基苯(aa2-3)的合成
在氮气下向Ph3PCH3Br(4.56g，12.77mmol，1.0当量)在THF(25mL)中的溶液中添加t-BuOK(7.16g,63.83mmol，5.0当量)。将混合物在0℃搅拌1小时。然后逐滴添加在THF(25mL)中的aa2-2(4.1g，12.77mmol，1.0当量)。将混合物在25℃搅拌3小时。将反应混合物用H2O(100mL)稀释并且用EtOAc(100mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～5％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@30mL/min)纯化24min，总体积为0.9L。获得作为白色固体的化合物aa2-3(2.93g，9.18mmol，71.91％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.46-7.29(m,3H),7.18-7.09(m,1H),7.06-6.96(m,1H),6.95-6.86(m,2H),6.81-6.70(m,1H),5.72-5.59(m,1H),5.40-5.29(m,1H),5.03-4.90(m,2H),3.86-3.74(m,3H)。
步骤3：2-(4-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-乙烯基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(aa2-4)的合成
将aa2-3(200mg，626.58μmol，1当量)在1,4-二噁烷(3mL)中的溶液用Pd(PPh3)4(72.41mg，62.66μmol，0.1当量)和KOAc(122.99mg，1.25mmol，2当量)处理，并且然后添加4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(477.34mg，1.88mmol，3当量)。将混合物在氮气下在80℃搅拌12小时。将反应混合物用盐水(30mL)稀释并且用EtOAc(30mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(4g硅快速柱，0％～10％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@30mL/min)纯化。获得作为白色固体的化合物aa2-4(190mg，518.76μmol，82.79％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.75(d,J＝8.4Hz,1H),7.55(dd,J＝10.9,17.5Hz,1H),7.36(d,J＝8.6Hz,2H),7.22(d,J＝2.4Hz,1H),6.97-6.89(m,2H),6.87(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),5.67(d,J＝17.4Hz,1H),5.26(d,J＝11.0Hz,1H),5.03(s,2H),3.82(s,3H),1.34(s,12H)。
步骤4：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(4’-((4-甲氧基苄基)氧基)-2’-乙烯基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸甲酯(aa2-6)的合成
将aa2-4(100mg，273.03μmol，1当量)在1,4-二噁烷(3mL)和H2O(1mL)中的溶液用K2CO3(56.60mg，409.55μmol，1.5当量)和Pd(PPh3)4(31.55mg，27.30μmol，0.1当量)处理，并且然后添加aa2-5(116.69mg，273.03μmol，1当量)。将混合物在氮气下在80℃搅拌2.5小时。将反应混合物用盐水(30mL)稀释并且用EtOAc(30mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(4g硅快速柱，0％～10％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@18mL/min)纯化14min，总体积为0.3L。获得作为黄色油状物的化合物aa2-6(100mg，193.20μmol，70.76％收率)。
LCMS(ESI):RT＝0.950min，对于C31H35NO6Na质量计算为540.24，[M+Na]+，m/z，实测540.1[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.39(d,J＝8.6Hz,2H),7.27-7.25(m,2H),7.23(s,2H),7.17(dd,J＝8.3,16.2Hz,3H),6.97-6.91(m,3H),6.67(dd,J＝11.0,17.4Hz,1H),5.67(dd,J＝1.1,17.4Hz,1H),5.22-5.15(m,1H),5.05(s,2H),3.83(s,3H),3.74(s,3H),1.47-1.35(m,1H),1.43(s,8H)。
步骤5：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(2’-乙基-4’-羟基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸甲酯(aa2-7)的合成
向aa2-6(2.8g，5.41mmol，1.0当量)在MeOH(25mL)中的溶液中添加Pd/C(300mg，10％激活的碳钯)，并且在氢气(15psi)下在25℃搅拌48小时。将反应混合物过滤并且在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～30％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@35mL/min)纯化22min，总体积为0.9L。获得作为无色油状物的化合物aa2-7(1.85g，4.60mmol，85.01％收率，99.3％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.935min，对于C23H29NO5Na质量计算为422.20[M+Na]+，m/z，实测422.1[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.22-7.11(m,4H),7.04(d,J＝8.2Hz,1H),6.78(d,J＝2.6Hz,1H),6.69(dd,J＝2.6,8.2Hz,1H),5.24(s,1H),5.05(br d,J＝8.4Hz,1H),4.70-4.58(m,1H),3.73(s,3H),3.20-3.11(m,1H),3.11-3.02(m,1H),2.53(q,J＝7.6Hz,2H),1.42(s,9H),1.08(t,J＝7.5Hz,3H)。
步骤6：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(4’-(4-氯丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸甲酯(aa2-8)的合成
在25℃向aa2-7(350mg，876.14μmol，1当量)和K2CO3(242.18mg，1.75mmol，2.0当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加1-氯-4-碘-丁烷(287.11mg，1.31mmol，1.5当量)。将混合物在50℃搅拌12小时。将剩余物用盐水(50mL)稀释，并且用EtOAc(50mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(12g硅快速柱，0％～30％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@35mL/min)纯化14min，总体积为0.4L。获得作为黄色油状物的化合物aa2-8(340mg,粗制)。
LCMS(ESI):RT＝1.145min，对于C27H36ClNO5Na质量计算为512.22[M+Na]+，m/z，实测512.2[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤7：(S)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸甲酯(aa2-9)的合成
向aa2-8(1.6g，3.27mmol,1.0当量)在DMF(15mL)中的溶液中添加K2CO3(902.51mg，6.53mmol，2.0当量)、KI(54.20mg，326.51μmol,0.1当量)和NaN3(460mg，7.08mmol，2.1当量)。将混合物在50℃搅拌7小时。将反应混合物用盐水50mL稀释并且用EtOAc(50mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过添加NaClO水溶液(1.0M，100mL)猝灭水层。获得作为黄色油状物的化合物aa2-9(1.7g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝1.140min，对于C27H36N4O5Na质量计算为519.27,m/z，实测519.3[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤8：(S)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(aa2-10)的合成
在0℃向aa2-9(1.7g，3.42mmol，1.0当量)在THF(12mL)中的溶液中添加在H2O(6mL)中的LiOH·H2O(287.31mg，6.85mmol，2.0当量)，并且然后允许混合物逐渐升温至25℃并且搅拌2小时。将混合物用EtOAc(30mL)处理，并且用水(25mL×2)提取。将合并的水性层酸化(1M HCl水溶液)并且用EtOAc(50mL×3)提取。将合并的有机层通过无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。获得作为黄色油状物的化合物aa2-10(2.01g，粗制)，其直接用于下一步骤，而无任何进一步纯化。
步骤9：(S)-2-氨基-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸盐酸盐(aa2-11)的合成
将化合物aa2-10(2.01g，4.17mmol，1.0当量)溶解在4.0M HCl/EtOAc(20mL)中。将混合物在25℃搅拌1小时。将反应混合物过滤。将滤饼用EtOAc(30ml)洗涤，并且在真空下干燥。获得作为白色固体的化合物aa2-11(1g，粗制)，其直接用于下一步骤，而无任何进一步纯化。
LCMS(ESI):RT＝1.121min，对于C21H27N4O3质量计算为383.21[M+H]+，m/z实测383.2[M+H]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤10：(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸(aa2)的合成
在0℃向aa2-11(1g，2.39mmol，1.0当量)在THF(15mL)中的溶液中添加在H2O(8mL)中的NaHCO3(401.07mg,4.77mmol,2.0当量)，并且然后添加(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)9H-芴-9-基甲基碳酸酯(805.23mg,2.39mmol,1.0当量)。将混合物在25℃搅拌12小时。将反应混合物用盐水(100mL)稀释，并且酸化(1M HCl水溶液)至pH＝2～3。将反应混合物用EtOAc(30mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～10％甲醇/二氯甲烷的洗脱液@30mL/min)纯化16min，总体积为0.6L。获得作为白色泡沫的产物aa2(1.3g，2.14mmol，89.52％收率，99.4％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.113min，对于C36H36N4O5Na质量计算为627.26,m/z，实测627.3[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.88(d,J＝7.5Hz,2H),7.81(d,J＝8.6Hz,1H),7.66(t,J＝6.9Hz,2H),7.40(dt,J＝2.3,7.3Hz,2H),7.34-7.25(m,4H),7.14(d,J＝8.2Hz,2H),6.97(d,J＝8.4Hz,1H),6.83(d,J＝2.4Hz,1H),6.76(dd,J＝2.5,8.5Hz,1H),4.27-4.17(m,3H),4.17-4.13(m,1H),4.03-3.98(m,2H),3.42(t,J＝6.7Hz,2H),3.13(br dd,J＝3.9,13.8Hz,1H),2.96-2.87(m,1H),2.52(d,J＝1.8Hz,2H),2.43(q,J＝7.4Hz,2H),1.82-1.74(m,2H),1.73-1.66(m,2H),0.98-0.90(m,3H)。
SFC：ee％＝97.95％-2.05％＝95.9％；方法注释：柱：Chiralcel OJ-3100×4.6mmI.D.，3μm；流动相：A：CO2B：乙醇(0.05％DEA)；梯度：在4分钟内从5％的B至40％的B并且保持40％持续2.5min，然后5％的B持续1.5min；流量：2.8mL/min；柱温度：35℃；ABPR：1500psi。
2.3非天然氨基酸(aa2b)的合成
方案4概述了非天然氨基酸(aa1b)的合成：
方案4
试剂和条件：(a)H2、Pd/C、(Boc)2O、DIPEA、MeOH，20℃，12h，47％。
步骤1：(R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4’-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸(aa2b)的合成
向aa2(3.2g，5.29mmol，1.0当量)在MeOH(30mL)中的溶液中添加Pd/C(700mg，10％激活的碳钯)、DIPEA(1.37g，10.60mmol，1.84mL，2.0当量)和Boc2O(2.31g，10.58mmol，2.43mL，2.0当量)。将混合物在氢气(15psi)下在20℃搅拌12小时。将反应混合物过滤通过一小块硅藻土垫，并且用40*5mL的EtOAc(40mL*5)冲洗滤饼。然后添加盐水(400mL)并且用EtOAc(300mL*2)提取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以给出剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Luna C18 250*50mm*10μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：55％-86％，21min)，将产物悬浮在水(150将mL)中，混合物在干冰/乙醇浴中冷冻以获得作为白色固体的产物aa2b(3.4g，5.01mmol，47.32％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.922min，对于C41H46N2O7Na质量计算为701.33[M+Na]+,m/z，实测701.3[M+Na]+。使用方法C进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.87(d,J＝7.6Hz,2H),7.69-7.60(m,2H),7.43-7.36(m,2H),7.33-7.20(m,4H),7.15-7.05(m,3H),6.95(br d,J＝8.3Hz,1H),6.89-6.70(m,4H),4.28(br dd,J＝5.9,9.0Hz,1H),4.17-4.09(m,2H),4.00-3.91(m,3H),3.19-3.09(m,2H),3.02-2.88(m,2H),2.46-2.38(m,2H),1.73-1.62(m,2H),1.56-1.48(m,2H),1.37(s,9H),0.93(br t,J＝7.6Hz,3H)。
2.4非天然氨基酸(aa13)的合成
方案5概述了非天然氨基酸(aa13)的合成：
方案5
试剂和条件：(a)HATU(1.5当量)、DHP(1.0当量)、DIPEA(3.0当量)、DCM，25℃，2h；(b)10％Pd/C，MeOH，25℃，5h。
aa13-1根据WO 2010/052253制备，该文献的内容通过引用以其整体并入本文。
步骤1：2,2-二甲基-3-氧代-3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基)丙酸苄酯(aa13-2)的合成
将aa13-1(200mg，899.94μmol，1当量)、HATU(513.28mg，1.35mmol，1.5当量)和DIPEA(348.93mg，2.70mmol，470.26μL，3当量)在DCM(10mL)中的溶液在25℃搅拌10分钟。将四氢吡喃-2-基羟胺(105.42mg，899.94μmol，1当量)添加至该混合物中，并且在25℃搅拌2小时。向反应物中添加DCM(5mL)并且用NH4Cl水溶液(5mL)洗涤。将水性层分离并且用DCM(5mL)提取。将有机层合并并且用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品，其通过快速硅胶色谱(20g硅快速柱，0％～35％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@30mL/min)纯化，以给出作为无色油状物的aa13-2(230mg，715.69μmol，79.53％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝9.28-9.14(m,1H),7.38-7.30(m,5H),5.16(s,2H),4.87(br s,1H),3.93-3.80(m,1H),3.59(br d,J＝1.5Hz,1H),1.76(br s,3H),1.65-1.58(m,1H),1.56-1.52(m,2H),1.48(s,6H)。
步骤2：2,2-二甲基-3-氧代-3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基)丙酸(aa13)的合成
将aa13-2(230mg，715.69μmol，1当量)和10％Pd/C(23mg)在MeOH(5mL)中的黑色的悬浮液在15Psi的H2下在25℃搅拌5小时。将反应物过滤通过硅藻土垫，用MeOH(5mL*3)洗涤滤饼。将滤液在真空中浓缩，以给出作为无色油状物的aa13(120mg，518.93μmol，72.51％收率)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝4.90-4.88(m,1H),4.05(br s,1H),3.59-3.53(m,1H),1.85-1.68(m,3H),1.68-1.51(m,3H),1.40(s,6H)。
2.5非天然氨基酸(aa14)的合成
方案6概述了非天然氨基酸(aa14)的合成：
方案6
试剂和条件：(a)aa-14-1a(1.0当量)、二噁烷，50℃，15h；(b)LiOH·H2O(2.0当量)、THF/H2O＝1/1，50℃，16h；(c)10％Pd/C cat.TFA、EtOH
化合物aa14-1根据US2015/380666制备。
步骤1：2-(1-苄基-1H-吡唑-5-基)-2-甲基丙酸甲酯(aa14-3)的合成
将aa14-1(2.76g，13.85mmol，1当量)和aa14-1a(2.20g，13.85mmol，1当量)在二噁烷(30mL)中的混合物在50℃搅拌15小时。将反应物过滤，并且将滤液在真空中浓缩，以给出棕色油状物的粗制品。将剩余物通过快速硅胶色谱(20g硅快速柱，0％～20％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@25mL/min)纯化，以给出作为浅黄色油状物的aa14-2(0.9g，3.48mmol，25.15％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.53(s,1H),7.29-7.26(m,1H),7.23-7.16(m,1H),6.98(d,J＝7.4Hz,2H),6.22(s,1H),5.23(s,2H),3.26(s,3H),1.56(s,6H)。
步骤2：2-(1-苄基-1H-吡唑-5-基)-2-甲基丙酸甲酯(aa14-3)的合成
将aa14-2(700mg，2.71mmol，1当量)和LiOH·H2O(1M，5.42mL，2当量)在THF(5.4mL)中的混合物在50℃搅拌16小时。将反应物在真空中浓缩以去除THF。将反应物用水(5mL)和MTBE(5mL)稀释。将水性层分离，并且用1N HCl调节至pH＝6。将有机层弃去。将水性层用EtOAc(5mL*3)提取。将有机层合并并且用盐水洗涤(5mL)，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空下浓缩，以给出作为白色固体的aa14-3(600mg，2.46mmol，90.64％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.53(s,1H),7.26-7.17(m,3H),6.97(d,J＝7.4Hz,2H),6.24(s,1H),5.23(s,2H),1.54(s,6H)。
步骤3：2-甲基-2-(1H-吡唑-5-基)丙酸(aa14)的合成
将aa14-3(500mg，2.05mmol，1当量)、TFA(23.34mg，204.68μmol，15.15μL，0.1当量)和10％Pd/C(100mg)在EtOH(5mL)中的混合物在100Psi的H2下在80℃搅拌16小时。将反应物过滤通过硅藻土垫，用EtOH(5mL*3)洗涤滤饼。将滤液在真空中浓缩，以给出作为浅黄色油状物的aa14(300mg，1.52mmol，74.27％收率，78.11％纯度)。LCMS(ESI):RT＝1.036min，m/z，对于C7H11N2O2，计算为155.07[M+H]+，实测155.0。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.57-7.50(m,1H),6.26(d,J＝1.8Hz,1H),1.56(s,6H)。
2.6非天然氨基酸[aa20:(R)-异构体和aa21:(S)-异构体]的合成
方案7概述了非天然氨基酸(aa20)和(aa21)的合成：
方案7
试剂和条件：(a)NaH(1.2当量)、二溴乙烷(2当量)、THF(25ml)，0℃～100℃，16h；(b)2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)乙胺(0.9当量)、DMF(5ml)，60℃，16h；(c)LiOH(4当量)、H2O(10ml)，THF(10ml)，20℃，16h；(d)SFC分离。
步骤1：2-(2-溴乙基)-2-甲基丙二酸二乙酯(aa20-2)的合成
在N2气氛下将一定体积的THF(10mL)添加至NaH(252.57mg，6.31mmol，60％纯度，1.1当量)。将THF溶液冷却至0℃。伴随搅拌在30min内添加在THF(5mL)中的化合物aa20-1(1g，5.74mmol，980.39μL，1当量)。允许反应混合物在20℃搅拌60min。在氮气气氛下伴随搅拌在60min内将产生的烯醇酯滴入在THF(10mL)中的1,2-二溴乙烷(2.16g，11.48mmol，866.23μl，2当量)。然后将反应混合物在溶剂中加热至100℃持续14小时。TLC指示反应物被消耗，并且检测到具有较低极性的一个主要新斑点。将剩余物倒入1N HCl中调节pH 2～4。然后将水相用乙酸乙酯(30mL*3)提取。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将剩余物以0.8L溶剂通过快速硅胶色谱(24g硅快速柱，0％～30％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@20mL/min)纯化40min。获得作为淡黄色液体的化合物aa20-2(1.2g，4.27mmol，74.35％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.18(q,J＝7.20Hz,4H),3.33-3.41(m,2H),2.39-2.47(m,2H),1.43(s,3H),1.22(s,6H)。
步骤2：3-甲基-2-氧代-1-(2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)吡咯烷-3-羧酸乙酯(aa20-3)的合成
向2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)乙胺(1g，2.83mmol，1当量)在DMF(10mL)中的溶液中添加aa20-2(874.95mg，3.11mmol，1.1当量)。将混合物在60℃搅拌16小时。LCMS显示材料被完全消耗，并且期望的产物被观察为主要产物。将剩余物倒入水(100mL)中。将水相用乙酸乙酯(50mL*3)提取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗制产物通过C-18反相色谱(80g，C-18柱，0％～100％乙腈/H2O梯度的洗脱液@40mL/min，60分钟，总体积为2400mL)纯化以提供黄色固体。获得作为黄色固体的化合物aa20-3(650mg，903.47μmol，31.93％收率，70.55％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.861min，m/z，对于C32H34N3O3计算为508.25[M+H]+，实测508.3。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤3：3-甲基-2-氧代-1-(2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)吡咯烷-3-羧酸(aa20-4)的合成
向aa20-3(650mg，1.28mmol，1当量)的混合物中添加在H2O(10mL)和THF(10mL)中的LiOH.H2O(268.67mg，6.40mmol，5当量)。将混合物在20℃搅拌16小时。LCMS显示材料被完全消耗，并且期望的产物被观察为主要产物。将剩余物倒入H2O(50mL)中，添加5％KHSO4调节pH2～3。将水相用乙酸乙酯(50mL*3)提取。将合并的有机相用盐水(50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Phenomenex SynergiMax-RP 250*50mm*10μm；流动相：水(0.225％FA)-ACN；B％：30％-60％,60min)纯化，以给出作为白色固体的aa20-4(180mg，375.34μmol，29.31％收率)。
LCMS(ESI):RT＝2.391min，m/z对于C30H30N3O3计算为480.6，实测480.3[M+H]+。使用Merck RP-18e 25-2mm柱进行反相LC-MS，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
1H NMR(ES8586-496-P1B1)1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.92(s,1H),7.35-7.42(m,9H),7.12-7.19(m,6H),6.97(s,1H),3.39-3.64(m,3H),3.32(br d,J＝3.75Hz,1H),2.84(br t,J＝5.95Hz,2H),2.34-2.42(m,1H),1.86(td,J＝7.99,12.90Hz,1H),1.25(s,3H)。
步骤4：(R)-3-甲基-2-氧代-1-(2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)吡咯烷-3-羧酸(aa20)和(S)-3-甲基-2-氧代-1-(2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)吡咯烷-3-羧酸(aa21)的合成
aa20(R)和aa21(S)的绝对构型尚未确认。
化合物aa20-4(180mg，375.34μmol)通过制备型SFC(柱：DAICEL CHIRALPAK IC(250mm*30mm,10μm；流动相：0.1％NH3H2O MEOH；B％:50％-50％,80min)纯化。获得作为白色固体的异构体(R)aa20(86mg，177.18μmol，94.41％收率，98.8％纯度)，并且还获得作为白色固体的异构体(S)aa21(85mg，175.29μmol，93.41％收率，98.9％纯度)。
异构体aa20运行SFC-HPLC：RT＝2.346min。HPLC条件：Chiralpak IC-3 100×4.6mm I.D.，3μm，流量2.8mL/min。用40％甲醇(0.05％DEA)(溶剂B)和CO2(溶剂A)的梯度洗脱。
异构体aa21运行SFC-HPLC：RT＝3.607min。HPLC条件：Chiralpak IC-3 100×4.6mm I.D.，3μm，流量2.8mL/min。用40％甲醇(0.05％DEA)(溶剂B)和CO2(溶剂A)的梯度洗脱。
2.7非天然氨基酸[aa22(S)-异构体和aa23(R)-异构体]的合成
方案8概述了非天然氨基酸(aa22)和(aa23)的合成：
方案8
试剂和条件：(a)TrtCl(1.2当量)、Et3N(2当量)、DMF，20℃，2h，31％；(b)TsCl(1.5当量)、Et3N(3当量)、DMAP(0.5当量)、DCM，20℃，2h，66％；(c)aa22-3(1.0当量)、aa22-3a(1.2当量)、LiI(1.5当量)、DIPEA(4当量)、60℃，2h，17％收率；(d)aa22-3(1.0当量)、aa22-3b(1.2当量)、LiI(1.5当量)、K2CO3(4当量)、20℃，3h，58％收率；(e)NaOH(2当量)、MeOH/水，20℃，2h，87％收率。
步骤1：2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)乙醇(aa22-2)的合成
在20℃向aa22-1(2g，17.84mmol，1当量)在DMF(40mL)中的溶液中添加TEA(3.61g，35.67mmol，4.97mL，2当量)、[氯(二苯基)甲基]苯(5.97g，21.40mmol，1.2当量)。将反应混合物在20℃搅拌2小时。通过TLC(DCM:MeOH＝10:1)监测反应进程，这指示起始材料已被消耗，并且观察到一个新的斑点。将反应混合物通过NaHCO3(饱和水溶液，20mL)猝灭并且用EtOAc(50mL*2)提取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(20g硅快速柱，0％～100％乙酸乙酯/石油醚然后是0％～10％MeOH(0.5％TEA添加剂)/DCM梯度的洗脱液@30mL/min)纯化25min，总体积为1.6L。获得作为白色固体的化合物aa22-2(2.2g，5.59mmol，31.32％收率，90％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝1.397min，m/z，对于C24H23N2O计算为355.2，实测355.2[M+H]+；使用方法B进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.39-7.31(m,10H),7.17-7.11(m,6H),6.63-6.57(m,1H),3.89(t,J＝5.6Hz,2H),3.64(br s,1H),2.76(t,J＝5.5Hz,2H)。
步骤2：2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)乙基-4-甲基苯磺酸酯(aa22-3)的合成
在20℃向aa22-2(2.2g，5.59mmol，1当量)在DCM(20mL)中的溶液中添加TEA(1.70g，16.76mmol，2.33mL，3当量)、4-甲基苯磺酰氯(1.60g，8.38mmol，1.5当量)和DMAP(341.23mg，2.79mmol，0.5当量)。将反应混合物在20℃搅拌2小时。通过LC-MS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余并且形成期望的产物。将反应混合物通过NaHCO3(饱和水溶液，50mL)猝灭并且用EtOAc(50mL*2)提取。将合并的有机层用盐水(20mL×2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(24g硅快速柱，0％～5％MeOH(4％TEA添加剂)/DCM梯度的洗脱液@20mL/min)纯化35min，总体积为1.2L。获得作为棕色固体的化合物aa22-3(2.1g，3.72mmol，66.52％收率，90％纯度)。LCMS：(ESI)：RT＝0.775min，m/z，对于C31H28N2O3SNa计算为531.2[M+H]+，实测531.1。使用方法D进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.73(d,J＝8.3Hz,2H),7.38-7.28(m,12H),7.15-7.08(m,6H),6.61(s,1H),4.27(t,J＝7.0Hz,2H),2.91-2.86(m,2H),2.42(s,3H)。
步骤3：(R)-1-(2-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)乙基)吡咯烷-3-羧酸(aa22)的合成
向aa22-3(500mg，983.03μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加aa22-3a(135.81mg，1.18mmol，1.2当量)、LiI(197.36mg，1.47mmol，56.55μL，1.5当量)和DIPEA(508.20mg，3.93mmol，684.91μL，4.0当量)。然后将混合物加热至60℃，并且在60℃搅拌2小时。LCMS显示反应物被完全消耗，并且检测到期望的MS。反应混合物通过添加水(10mL)猝灭，并且然后用EtOAc(20mL)稀释，然后用EtOAc(20mL*2)提取。将水性层用2M HCl酸化至pH6。然后将水相用DCM(20mL*5)提取。将合并的有机层浓缩，以给出剩余物。将粗制产物通过反相HPLC(中性条件)纯化。获得作为灰白色固体的产物aa22(80mg，168.31μmol，17.12％收率，95％纯度)。LCMS(ESI):RT＝1.986min，对于C29H30N3O2质量计算为452.23,m/z，实测452.3[M+H]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤4：(3S)-1-[2-(1-三苯甲基咪唑-4-基)乙基]吡咯烷-3-羧酸甲酯(aa23-1)的合成
在20℃向aa22-3(750mg，1.47mmol，1当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加K2CO3(815.17mg，5.90mmol，4当量)、aa22-3b(293.05mg，1.77mmol，1.2当量，HCl)和LiI(296.04mg，2.21mmol，84.83μL，1.5当量)。将反应混合物在20℃搅拌3小时。通过LC-MS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余并且形成期望的产物。将混合物冷却至25℃，并且倒入水(30mL)中并且搅拌5min。将水相用乙酸乙酯(50mL*2)提取。将合并的有机相用盐水(15mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(20g硅快速柱，0％～100％乙酸乙酯/石油醚然后是0％～10％MeOH(0.5％TEA添加剂)/DCM梯度的洗脱液@30mL/min)纯化25min，总体积为1.6L。获得作为棕色油状物的产物aa23-1(420mg，856.99μmol，58.12％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.717min，m/z，对于C30H31N3O2计算为466.2[M+H]+，实测465.9；LC-MS条件：使用方法D进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.40-7.30(m,10H),7.20-7.09(m,6H),6.58(s,1H),3.75-3.64(m,3H),3.10-2.95(m,2H),2.83-2.74(m,5H),2.72-2.64(m,1H),2.55(q,J＝8.0Hz,1H),2.14-2.07(m,2H)。
步骤5：(3S)-1-[2-(1-三苯甲基咪唑-4-基)乙基]吡咯烷-3-羧酸甲酯(aa23)的合成
在20℃向aa23-1(390.00mg，837.66μmol，1当量)在MeOH(3mL)和水(3mL)中的溶液中添加NaOH(67.01mg，1.68mmol，2当量)。将反应混合物在20℃搅拌2小时。通过LCMS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余并且形成期望的产物。在完成之后，将反应混合物冷却至室温。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂。将剩余物用1M HCl调节至pH＝6，并且通过冻干干燥。将剩余物用DCM/MeOH＝10/1(15mL*3)研磨。将合并的有机相用无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。获得作为棕色固体的产物aa23(350mg，736.34μmol，87.90％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.708min，m/z，对于C29H30N3O2计算为452.2[M+H]+，实测451.9；使用方法D进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.38(s,1H),7.36-7.31(m,9H),7.12(dd,J＝3.3,6.3Hz,6H),6.64(s,1H),3.83(br s,1H),3.56(br s,1H),3.20(br d,J＝18.5Hz,2H),3.05-2.96(m,4H),2.65-2.61(m,1H),2.42-2.30(m,1H),2.18-2.09(m,1H)。
2.8非天然氨基酸(aa27)的合成
方案9概述了非天然氨基酸(aa27)的合成：
方案9
试剂和条件：(a)HCl/二噁烷，0℃-25℃，2h，100％；(b)CbzCl(1.2当量)，HOSu(1.3当量)，DIPEA(2当量)，DCM，0℃-20℃，12h，96％；(c)3a(2当量)，K2CO3(2当量)，60℃，12h，56％；(d)LiOH(2.0当量)，THF，H2O，20℃，12h，94％；(e)H2，Pd(OH)2，AcOH，MeOH，20℃，12h；(f)FmocOSu(1.2当量)，NaHCO3(2.0当量)，THF，H2O，0℃-20℃，12h，44％；(g)PhNH2(1.1当量)，DIC(1.0当量)，HOBt(1.0当量)，DCM,0℃-20℃，1h，76％；(h)哌啶(5.0当量)，DMF，20℃，1h，65％。
步骤1：(2S)-2-氨基-3-[4-(2-乙基-4-羟基-苯基)苯基]丙酸甲酯(aa27-2)的合成
在0℃将化合物aa27-1(3.5g，8.76mmol，1当量)溶解在HCl/二噁烷(4M，100mL，45.65当量)中。将混合物在25℃搅拌2小时。通过LCMS监测反应进程。将反应混合物在减压下浓缩，以给出粗制产物。获得作为无色油状物的化合物aa27-2(2.6g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝0.772min，对于C18H22NO3质量计算为300.16[M+H]+，m/z实测300.00[M+H]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤2：(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-3-[4-(2-乙基-4-羟基-苯基)苯基]丙酸甲酯(aa27-3)的合成
在0℃向HOSu(1.25g，10.86mmol，1.3当量)在DCM(50mL)中的溶液中添加DIPEA(3.24g，25.05mmol，4.36mL，3当量)和CbzCl(1.57g，9.19mmol，1.31mL，1.1当量)。在25℃搅拌2小时之后，然后添加化合物aa27-2(2.5g，8.35mmol，1当量)并且将混合物在20℃搅拌10小时。通过LC-MS和TLC监测反应进程。将混合物用DCM(30mL)稀释并且用H2O(30mL*2)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出剩余物，然后通过柱色谱(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2/1)纯化。获得作为黄色油状物的化合物aa27-3(3.5g，8.07mmol，96.68％收率)。
LCMS(ESI):RT＝0.992min，对于C26H27NNaO5+，质量计算为456.18[M+Na]+，m/z，实测456.2[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.35(s,1H)7.88(br d,J＝8.07Hz,1H)7.21-7.38(m,7H)7.15(br d,J＝8.07Hz,2H)6.93(d,J＝8.31Hz,1H)6.70(d,J＝2.20Hz,1H)6.63(dd,J＝8.07,2.45Hz,1H)4.99(br s,2H)4.24-4.36(m,1H)3.60-3.65(m,3H)3.07(br dd,J＝13.69,4.89Hz,1H)2.91(br dd,J＝13.57,10.39Hz,1H)2.40-2.48(m,2H)0.99(t,J＝7.58Hz,3H)。
步骤3：(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(4’-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸甲酯(aa27-4)的合成
向aa27-3(3.3g，7.61mmol，1当量)和aa27-3a(5.23g，15.23mmol，2当量)在DMF(30mL)中的溶液中添加K2CO3(2.10g，15.23mmol，2当量)。将混合物在60℃搅拌12小时。通过LC-MS和TLC监测反应进程。将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释并且用H2O(80mL*3)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出剩余物，然后通过柱色谱(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至2/1)纯化。获得作为黄色油状物的化合物aa27-4(2.9g，4.32mmol，56.70％收率，90％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.140min，对于C35H44N2NaO7质量计算为627.30[M+Na]+,m/z，实测627.2[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤4：(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(4’-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸(aa27-5)的合成
向aa27-4(2.7g，4.46mmol，1当量)在THF(30mL)中的溶液中添加LiOH·H2O(374.72mg，8.93mmol，2当量)在H2O(15mL)中的溶液。将混合物在20℃搅拌2小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物用1M HCl调至pH 3～4，并且用EtOAc(20mL*3)提取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出产物。获得作为黄色油状物的化合物aa27-5(2.5g，4.23mmol，94.79％收率)。
LCMS(ESI):RT＝1.082min，对于C34H42N2NaO7质量计算为613.29,m/z，实测613.2[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.29-7.36(m,5H)7.14-7.21(m,4H)7.07(br d,J＝8.56Hz,1H)6.81(s,1H)6.73(br d,J＝7.83Hz,1H)5.27(br d,J＝7.58Hz,1H)5.05-5.16(m,2H)4.68-4.75(m,1H)4.50-4.68(m,2H)3.99(br s,2H)3.20-3.28(m,2H)2.53(q,J＝7.42Hz,2H)1.62-1.68(m,2H)1.51-1.57(m,2H)1.44(br s,9H)1.07(t,J＝7.46Hz,3H)。
步骤5：(2S)-2-氨基-3-[4-[4-[4-(叔丁氧基羰基氨基)丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]丙酸(aa27-6)的合成
向aa27-5(1.5g，2.54mmol，1当量)在MeOH(30mL)中的溶液中添加Pd(OH)2/C(300mg，213.62μmol，10％纯度)和AcOH(105.00mg，1.75mmol，0.1mL)。将混合物在H2下在20℃搅拌12小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物过滤并且浓缩，以给出粗制产物。获得作为黄色油状物的化合物aa27-6(1.16g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝0.890min，对于C26H36N2NaO5质量计算为479.25,m/z，实测479.1[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤6：(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4’-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)丙酸(aa27-7)的合成
在0℃向aa27-6(1.16g，2.54mmol，1当量)在THF(15mL)和H2O(8mL)中的溶液中添加NaHCO3(426.64mg，5.08mmol，197.52μL，2当量)和Fmoc-OSu(1.03g，3.05mmol，1.2当量)。将混合物在20℃搅拌12小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物调至pH 3～4，并且用EtOAc(20mL*2)提取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以给出剩余物，然后通过制备型HPLC(AcOH条件；MeCN/H2O，0％～100％)纯化。获得作为无色油状物的化合物aa27-7(950mg，1.12mmol，44.09％收率，80％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.142min，对于C41H46N2NaO7质量计算为701.32,m/z，实测701.0[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
HPLC：RT＝4.33min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.2mL/min的流量在80％保持2分钟；柱：Ultimate C183.0*50mm,3μm。
SFC：RT＝0.598min，柱：Chiralpak AD-3 50×4.6mm I.D.，3μm；流动相：A：CO2B：乙醇(0.05％DEA)等度：40％B；流量：4mL/min。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.29-7.36(m,5H)7.14-7.21(m,4H)7.07(br d,J＝8.56Hz,1H)6.81(s,1H)6.73(br d,J＝7.83Hz,1H)5.27(br d,J＝7.58Hz,1H)5.05-5.16(m,2H)4.68-4.75(m,1H)4.50-4.68(m,2H)3.99(br s,2H)3.20-3.28(m,2H)2.53(q,J＝7.42Hz,2H)1.62-1.68(m,2H)1.51-1.57(m,2H)1.44(br s,9H)1.07(t,J＝7.46Hz,3H)。
步骤7：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-2-苯胺基-1-[[4-[4-[4-(叔丁氧基羰基氨基)丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(aa27-8)的合成
在0℃向aa27-7(250mg，368.29μmol，1当量)和HOBt(49.76mg，368.29μmol，1当量)在DCM(1.5mL)中的溶液中添加苯胺(36.01mg，386.71μmol，35.31μL，1.05当量)以及DIC(46.48mg，368.29μmol，57.03μL，1当量)在DCM(0.5mL)中的溶液。将混合物在20℃搅拌1小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物用DCM(20mL)稀释并且用H2O(10mL*2)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(12g硅快速柱，0％～50％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@20mL/min)纯化。获得作为白色固体的化合物aa27-8(220mg，283.05μmol，76.86％收率，97％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.198min，对于C47H51N3NaO6质量计算为776.37,m/z，实测777.3[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。
HPLC：RT＝8.07min，使用方法D进行反相HPLC分析。SFC：RT＝2.186min；柱：Chiralcel OD-3 50×4.6mm I.D.，3μm；流动相：A：CO2B：乙醇(0.05％DEA)；等度：40％B；流量：4mL/min。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.74(br d,J＝7.58Hz,2H)7.51-7.58(m,3H)7.30-7.40(m,4H)7.28(br d,J＝7.58Hz,4H)7.17-7.24(m,4H)7.07-7.11(m,1H)7.02(d,J＝8.31Hz,1H)6.81(d,J＝2.45Hz,1H)6.72(dd,J＝8.31,2.45Hz,1H)5.57(br s,1H)4.32-4.69(m,4H)4.20(t,J＝6.72Hz,1H)3.99(t,J＝6.24Hz,2H)3.06-3.29(m,4H)2.49(q,J＝7.42Hz,2H)1.77-1.87(m,2H)1.68(dt,J＝14.55,7.15Hz,2H)1.44(s,9H)1.03(t,J＝7.58Hz,3H)。
步骤8：N-[4-[4-[4-[(2S)-2-氨基-3-苯胺基-3-氧代-丙基]苯基]-3-乙基-苯氧基]丁基]氨基甲酸叔丁酯(aa27)的合成
向aa27-8(220mg，291.81μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加哌啶(124.24mg，1.46mmol，5当量)的溶液。将混合物在20℃搅拌1小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物用EtOAc(30mL)稀释并且用H2O(10mL*3)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出剩余物，然后通过柱色谱(SiO2，EtOAc:MeOH＝1:0至5:1)纯化。获得作为黄色泡沫的化合物aa27(105mg，191.56μmol，65.65％收率，97％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.953min，对于C32H41N3NaO4质量计算为554.30,m/z，实测554.1[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。HPLC：RT＝9.13min，使用方法C进行反相HPLC分析。
SFC：RT＝3.185min，柱：Chiralpak AS-3 100×4.6mm I.D.，3μm；流动相：A：CO2B：乙醇(0.1％乙醇胺)梯度：在4.5min内从5％的B至40％的B，并且保持40％持续2.5min，然后5％的B持续1min；流量：2.8mL/min。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 9.45(s,1H)7.60(br d,J＝7.83Hz,2H)7.33(t,J＝7.83Hz,2H)7.20-7.29(m,4H)7.06-7.13(m,2H)6.84(d,J＝2.20Hz,1H)6.75(dd,J＝8.31,2.45Hz,1H)4.68(br s,1H)4.01(t,J＝6.11Hz,2H)3.82(br d,J＝5.38Hz,1H)3.41(br dd,J＝13.82,3.30Hz,1H)3.13-3.27(m,2H)2.84(br dd,J＝13.82,9.90Hz,1H)2.56(q,J＝7.50Hz,2H)1.79-1.86(m,2H)1.69(quin,J＝7.15Hz,2H)1.45(s,9H)1.09(t,J＝7.58Hz,3H)。
2.9非天然氨基酸(aa28)的合成
方案10概述了非天然氨基酸(aa28)的合成：
方案10
试剂和条件：(a)PhNH2(1.1当量)，DIC(1.0当量)，HOBT(1.0当量)，DCM，0℃-20℃，1h；(b)哌啶(3.0当量)，DMF，20℃，12h，52％；(c)3a(1当量)，DIC(1.0当量)，HOBT(1.0当量)，DCM，0℃-20℃，1h，61％；(d)哌啶(15.0当量)，DMF，20℃，0.5h，41％。
步骤1：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-4-(3,5-二甲基苯基)-1-(苯基氨基甲酰基)丁基]氨基甲酸酯(aa28-1)的合成
在0℃向aa1(300mg，676.39μmol，1当量)和HOBt(91.40mg，676.39μmol，1当量)在DCM(1.5mL)中的溶液中添加苯胺(66.14mg，710.21μmol，64.84μL，1.05当量)。将DIC(85.36mg，676.39μmol，1当量)在DCM(0.5mL)中的溶液添加至混合物中。将反应物在20℃搅拌1小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物用DCM(20mL)稀释并且用H2O(10mL*2)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出粗制产物。获得作为黄色固体的化合物aa28-1(400mg，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝1.178min，对于C34H35N2O3 +质量计算为519.26[M+H]+，m/z实测519.1[M+H]+。使用方法A进行反相LC-MS。
步骤2：(2S)-2-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-N-苯基-戊酰胺(aa28-2)的合成
在20℃向aa28-1(400mg，771.24μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加哌啶(197.01mg，2.31mmol，3当量)。将反应物在20℃搅拌12小时。通过LC-MS和TLC监测反应进程。将混合物用EtOAc(30mL)稀释并且用H2O(10mL*3)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出剩余物，然后通过快速硅胶色谱(12g硅快速柱，0％～100％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@20ml/min)纯化。获得作为黄色泡沫的化合物aa28-2(150mg，399.79μmol，51.84％收率，79％纯度)。LCMS(ESI):RT＝0.861min，对于C19H25N2O质量计算为297.2[M+H]+，m/z实测297.1[M+H]+。使用方法A进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,CD3Cl)δppm 9.46(br s,1H),7.60(d,J＝7.83Hz,2H),7.33(t,J＝7.95Hz,2H),7.07-7.14(m,1H),6.78-6.86(m,4H),3.51(dd,J＝7.95,4.28Hz,1H),2.57-2.64(m,2H),2.29(s,6H),1.67-1.81(m,4H)。
步骤3：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[4-[4-[4-(叔丁氧基羰基氨基)丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-4-(3,5-二甲基苯基)-1-(苯基氨基甲酰基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(aa28-3)的合成
在0℃向aa2b(343.52mg，506.06μmol，1当量)和HOBt(68.38mg，506.06μmol，1当量)在DCM(2.5mL)中的溶液中添加aa28-2(150mg，506.06μmol，1当量)。将DIC(63.86mg，506.06μmol，1当量)在DCM(0.5mL)中的溶液添加至混合物中。将反应物在20℃搅拌1小时。通过TLC监测反应进程。将混合物用DCM(20mL)稀释并且用H2O(10mL*2)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(12g硅快速柱，0％～45％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@20mL/min)纯化。获得作为黄色泡沫的化合物aa28-3(400mg，309.23μmol，61.11％收率，74％纯度)。LCMS(ESI):RT＝6.617min，对于C60H68N4NaO7质量计算为979.50,m/z，实测979.8[M+Na]+。使用方法B进行反相LC-MS。
1H NMR(400MHz,CD3Cl)δppm 7.72-7.80(m,2H),7.49-7.57(m,3H),7.35-7.41(m,2H),7.20-7.33(m,5H),7.08-7.20(m,4H),6.96-7.08(m,2H),6.76-6.84(m,2H),6.68-6.75(m,3H),5.32-5.47(m,1H),4.64(br s,1H),4.52-4.60(m,1H),4.42-4.51(m,2H),4.37(brs,1H),4.13-4.23(m,1H),4.00(t,J＝6.24Hz,2H),3.05-3.27(m,4H),2.44-2.61(m,4H),2.20-2.25(m,6H),1.82-1.89(m,2H),1.62-1.75(m,6H),1.46(s,9H),1.01-1.09(m,3H)。
步骤4：N-[4-[4-[4-[(2S)-2-氨基-3-[[(1S)-4-(3,5-二甲基苯基)-1-(苯基氨基甲酰基)丁基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3-乙基-苯氧基]丁基]氨基甲酸叔丁酯(aa28)的合成
在20℃向aa28-3(380mg，396.99μmol，1当量)在DMF(2.5mL)中的溶液中添加哌啶(507.06mg，5.95mmol，15当量)。将反应物在20℃搅拌0.5小时。通过LC-MS监测反应进程。将混合物用ACN(2mL)稀释并且通过制备型HPLC(HCl条件；柱：Agela ASB 150*25mm*5μm；流动相：[水(0.05％HCl)-ACN]；B％：55％-85％,8min)纯化。获得作为少量黄色泡沫的化合物aa28(125mg，164.97μmol，41.56％收率，97％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.061min，对于C45H58N4NaO5质量计算为757.43,m/z，实测757.5[M+Na]+。使用方法A进行反相LC-MS。HPLC：RT＝10.66min，使用方法C进行反相HPLC分析。SFC：RT＝2.161min，柱：Chiralpak AD-3 50*4.6mm I.D.，3μm；流动相：A：CO2B：异丙醇(0.05％DEA)；梯度：在2分钟内从5％的B至40％的B并且保持40％持续1.2min，然后5％的B持续0.8min；流量：4mL/min。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.55(br d,J＝8.07Hz,2H),7.24-7.31(m,4H),7.14(d,J＝8.07Hz,2H),7.05-7.11(m,1H),6.95(d,J＝8.31Hz,1H),6.81(d,J＝2.45Hz,1H),6.78(s,3H),6.68-6.72(m,1H),4.54(t,J＝6.72Hz,1H),4.20(t,J＝6.85Hz,1H),4.00(t,J＝6.11Hz,2H),3.25-3.30(m,1H),3.12(br t,J＝6.85Hz,3H),2.54-2.63(m,2H),2.51(q,J＝7.50Hz,2H),2.22(s,6H),1.62-1.95(m,8H),1.44(s,9H),1.03(t,J＝7.58Hz,3H)。
2.10非天然氨基酸(aa29)的合成
方案11概述了非天然氨基酸(aa29)的合成：
方案11
步骤1：(E)-3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)丙烯酸(aa29-2)的合成
在20℃将化合物aa29-1(2g，14.48mmol，1.0当量)、TEA(4.40g，43.44mmol，6.05mL，3.0当量)和TrtCl(4.04g，14.48mmol，1.0当量)在DMF(34mL)中搅拌12小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完全。将混合物用CH2Cl2稀释，用H2O(3*50mL)和柠檬酸溶液(3*50mL)洗涤。蒸发有机相并且通过柱色谱(洗脱液：CH2Cl2/MeOH,9:1)纯化。获得作为白色固体的化合物aa29–2(1.6g，4.21mmol，29.05％收率)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.57(s,1H),7.51(d,J＝15.77Hz,1H),7.38-7.45(m,9H),7.32(s,1H),7.15-7.22(m,6H),6.45(d,J＝15.65Hz,1H)ppm。
步骤2：3-(1-三苯甲基-1H-咪唑-5-基)丙酸(aa29)的合成
在N2气氛下向化合物aa29-2(1.6g，4.21mmol，1当量)在EtOH(20mL)中的溶液中添加Pd/C(1g，10％纯度)。将悬浮液脱气并且用H2吹扫3次。将混合物在20℃在H2(15Psi.)下搅拌2小时。在完成之后，将混合物过滤并且浓缩滤液，以给出产物。获得作为白色固体的化合物aa29-4(1.2g，3.14mmol，74.60％收率)。
LCMS(ESI):RT＝0.802min，对于C25H21N2O2质量计算为381.17[M-H]-，实测381.17[M-H]-，如下进行反相LCMS：使用Waters Xbridge C1830*2.0mm，3.5μm，流量1.2ml/min，用包含ACN的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含在水中的0.05％NH3H2O的水(溶剂A)的梯度洗脱。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.34-7.39(m,4H),7.22-7.39(m,4H),7.11-7.14(m,3H),7.06-7.20(m,2H),7.08(d,J＝7.25Hz,4H),2.90(t,J＝7.32Hz,1H),2.80(t,J＝7.38Hz,1H),2.51-2.62(m,2H)ppm。
2.11非天然氨基酸(aa30)的合成
方案12概述了非天然氨基酸(aa30)的合成：
方案12
步骤1：(3-羟丙基)三苯基溴化鏻(aa30-2)的合成
向3-溴丙烷-1-醇(10g，71.95mmol，6.49mL，1当量)在甲苯(100mL)中的溶液中添加PPh3(22.65g，86.34mmol，1.2当量)。将混合物在N2下在100℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将反应物冷却至0℃并且过滤，用甲苯(10mL*3)洗涤滤饼，然后在减压下干燥。获得作为白色固体的化合物aa302(20.7g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝0.758min，对于C21H22OP+，质量计算为321.14[M]+，实测321.0[M]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C1820*2.0mm波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
1H NMR(400MHz,CD3Cl)δ7.83-7.65(m,15H),4.94(br s,1H),3.87-3.73(m,4H),1.83(m,2H)ppm。
步骤2：(E)-4-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)丁-3-烯-1-醇(aa30-3)的合成
向aa30-2(10.67g，26.60mmol，1.5当量)在THF(50mL)中的溶液中添加LiHMDS(1M，70.92mL，4当量)。将混合物在0℃搅拌0.5小时，然后将aa30-2A(1-三甲基咪唑-4-甲醛，6g，17.73mmol，1.0当量)在THF(60mL)中的溶液添加至以上混合物中，并且将所得混合物在25℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物，然后将剩余物重新溶解在二噁烷(50mL)中，并且将最终溶液在100℃搅拌12h，这之后，将溶液在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g硅快速柱，0％～80％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@60mL/min)纯化。获得作为黄色固体的化合物aa30-3(650mg，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝0.846min，对于C26H24N2ONa质量计算为403.19[M+Na]+，实测403.1[M+Na]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.68-7.57(m,1H),7.40-7.37(m,9H),7.18-7.13(m,6H),6.83(d,J＝1.0Hz,1H),6.36-6.14(m,2H),3.62(t,J＝6.7Hz,2H),2.36(q,J＝6.6Hz,2H)ppm。
步骤3：4-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)丁-1-醇(aa30-4)的合成
向aa30-3(650mg，1.71mmol，1当量)在MeOH(5mL)中的溶液中添加Pd/C(50mg，489.61mmol，10％纯度)。将混合物在H2下在25℃搅拌2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物以总体积通过快速硅胶色谱(25g硅快速柱，0％～50％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@40mL/min)纯化8min。获得作为白色固体的化合物aa30-4(450mg，1.18mmol，68.87％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.850min，对于C26H26N2ONa质量计算为405.20[M+Na]+，实测405.2[M+Na]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
步骤4：4-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)丁酸(aa30)的合成
向aa30-4(450mg，1.18mmol，1当量)在MeCN(5mL)和H2O(7mL)中的溶液中添加TEMPO(277.51mg，1.76mmol，1.5当量)和PIDA(碘苯二乙酸酯(3240-34-4)，947.35mg，2.94mmol，2.5当量)。将混合物在25℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，向混合物中加入柠檬酸(水溶液15mL)以调节pH＝4，然后用EtOAc(15mL*2)提取，收集有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩，以给出剩余物。然后将剩余物通过MTBE研磨。获得作为白色固体的化合物aa30(250mg，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝2.484min，对于C26H25N2O2质量计算为397.18[M+H]+，实测397.2[M+H]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.69(d,J＝1.6Hz,1H),7.53-7.38(m,9H),7.28-7.14(m,7H),2.75(t,J＝7.5Hz,2H),2.34(t,J＝7.1Hz,2H),2.00-1.87(m,2H)ppm。
2.12非天然氨基酸(aa31)的合成
方案13概述了非天然氨基酸(aa31)的合成：
方案13
步骤1：(3-羧基丙基)三苯基溴化鏻(aa31-2)的合成
向4-溴丁酸(5g，29.94mmol，6.76mL，1当量)在甲苯(70mL)中的溶液中添加PPh3(8.64g，32.93mmol，1.1当量)。将混合物在N2下在110℃搅拌12h。通过TLC和LCMS监测反应进程。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃，然后过滤并且用甲苯(10mL*3)洗涤，收集滤饼并且在减压下干燥。获得作为白色固体的化合物aa31-2(5.6g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝1.076min，对于C22H22O2P+，质量计算为349.14[M]+，实测349.2[M]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在1.35分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.9分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
1H NMR(400MHz,CD3Cl)δ7.91-7.66(m,15H),3.31-3.22(m,2H),2.55(t,J＝6.3Hz,2H),1.84(m,2H)ppm。
步骤2：(E)-5-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)戊-4-烯酸(aa31-3)的合成
在N2下在0℃向aa31-2(3.81g，8.87mmol，1.5当量)在THF(20mL)中的溶液中添加tBuOK(1.99g，17.73mmol，3当量)，将混合物在0℃搅拌30min，然后在0℃将aa31-2A(2g，5.91mmol，1当量)在THF(20mL)中的溶液添加至以上混合物中，并且将最终混合物在25℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，向混合物中添加柠檬酸以调节pH＝4，然后用EtOAc(50mL*2)提取，收集有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g硅快速柱，0％～10％MeOH/DCM的洗脱液@40mL/min)纯化。获得作为浅黄色泡沫的化合物aa31-3(4g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝1.487min，对于C27H25N2O2质量计算为409.18[M+H]+，实测409.3[M+H]+。LCMS条件：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的1.5ML/4L TFA，在1.35分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.9分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
步骤3：5-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)戊酸(aa31)的合成
向aa31-3(3g，7.34mmol，粗制纯度，1当量)在MeOH(40mL)中的溶液中添加Pd/C(300mg，489.61mmol，10％纯度)。将混合物在H2下在25℃搅拌2h。通过LCMS监测反应进程。在完成后，将混合物过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物以总体积通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～10％MeOH/DCM的洗脱液@40mL/min)纯化7min。这之后，将产物用TBME研磨。获得作为白色固体的化合物aa31(290mg，692.32mmol，71.05％收率，98％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.805min，对于C27H27N2O2质量计算为411.20[M+H]+，实测411.3[M+H]+。LCMS条件：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.8mL/4L NH3·H2O，在6分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：XBridge C183.5mm 2.1*30mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
1H NMR(400MHz,CD3Cl)δ7.65(s,1H),7.44-7.34(m,9H),7.16(dd,J＝2.9,6.8Hz,6H),6.77(s,1H),2.58(br t,J＝6.8Hz,2H),2.28(t,J＝7.1Hz,2H),1.70-1.55(m,4H)ppm。
2.13非天然氨基酸(aa32)的合成
方案14概述了非天然氨基酸(aa32)的合成：
方案14
步骤1：(4-羧基丁基)三苯基溴化鏻(aa32-2)的合成
向5-溴戊酸(10g，55.24mmol，6.76mL，1当量)在甲苯(100mL)中的溶液中添加PPh3(15.94g，60.76mmol，1.1当量)。将混合物在N2下在110℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃，然后过滤并且用甲苯(10mL*3)洗涤，收集滤饼并且在减压下干燥。获得作为白色固体的化合物aa32-2(16.4g，36.99mmol，66.97％收率)。
LCMS(ESI):RT＝1.076min，对于C22H22O2P+，质量计算为349.14[M+H]+，实测349.2[M+H]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在1.35分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.9分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；
1H NMR(400MHz,CD3Cl)δ7.91-7.66(m,15H),3.31-3.22(m,2H),2.55(t,J＝6.3Hz,2H),1.86-1.82(m,4H)ppm。
步骤2：(E)-6-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)六-5-烯酸(aa32-3)的合成
在N2下在0℃向aa32-2(7.86g，17.73mmol，1.5当量)在THF(60mL)中的溶液中添加t-BuOK(3.98g，35.46mmol，3当量)。将混合物在0℃搅拌30min。在0℃将aa32-2A(4g，11.82mmol，1当量)在THF(40mL)中的溶液添加至以上混合物中，并且所得混合物在25℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，向混合物中添加柠檬酸以调节pH＝4，然后用EtOAc(50mL*2)提取，收集有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g硅快速柱，0％～10％MeOH/DCM的洗脱液@40mL/min)纯化。获得作为浅黄色泡沫的化合物aa32-3(4g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝2.739min，对于C28H27N2O2质量计算为423.20[M+H]+，实测423.2[M+H]+。LCMS条件：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的1.5ML/4L TFA，在1.35分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.9分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
步骤3：6-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)己酸(aa32)的合成
向aa32-3(4g，9.47mmol，1当量)在MeOH(40mL)中的溶液中添加Pd/C(300mg，489.61mmol，10％纯度)。将混合物在H2下在25℃搅拌2h。通过LCMS监测反应进程。在完成后，将混合物过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～10％MeOH/DCM的洗脱液@40mL/min)纯化。这之后，将产物用TBME研磨。获得作为白色固体的化合物aa32(660mg，1.51mmol，15.93％收率，97％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.807min，对于C28H29N2O2质量计算为425.22[M+H]+，实测425.2[M+H]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6.0分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(d,J＝1.3Hz,1H),7.41-7.34(m,9H),7.19-7.11(m,6H),6.65(s,1H),2.52(t,J＝7.4Hz,2H),2.24(t,J＝7.4Hz,2H),1.60(m,4H),1.38-1.27(m,2H)ppm。
2.14非天然氨基酸(aa33)的合成
方案15概述了非天然氨基酸(aa33)的合成：
方案15
步骤1：(5-羧基戊基)三苯基溴化鏻(aa33-2)的合成
向6-溴己酸(5g，25.63mmol，1当量)在甲苯(50mL)中的溶液中添加PPh3(7.06g，26.92mmol，1.05当量)。将所得溶液在120℃搅拌超过12h。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃，然后过滤并且用甲苯(10mL*3)洗涤，收集滤饼并且在减压下干燥。获得作为白色固体的化合物aa33-2(6.85g，14.47mmol，56.44％收率，96.6％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.916min，m/z，对于C24H26PO2 +计算为377.17，实测377.1[M-Br]+。如下进行反相LCMS：使用Xtimate C18,2.1*30mm 3mm，SN：3U411301530柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％-80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤2：(E)-7-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)庚-6-烯酸(aa33-3)的合成
在N2下在0℃向aa33-2(4.05g，8.87mmol，2当量)在THF(20mL)中的溶液中添加tBuOK(1M，22.16mL，5当量)，将混合物在0℃搅拌30min，然后在0℃将aa33-2A(1.5g，4.43mmol，1当量)在THF(20mL)中的溶液添加至以上混合物中，并且将最终混合物在25℃搅拌12h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，混合物中添加柠檬酸以调节pH＝4，然后用EtOAc(50mL*2)提取，收集有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将粗制产物用于下一步骤，而无任何进一步纯化。获得作为黄色糖浆状物的化合物aa33-3(3.8g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝2.904min和3.068min，对于C29H29N2O2，质量计算为437.22，实测437.3[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤3：7-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)庚酸(aa33)的合成
向aa33-3(3g，6.87mmol，1当量)在MeOH(30mL)中的溶液中添加Pd/C(300mg，489.61mmol，10％纯度)。将混合物在H2下在25℃搅拌2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将剩余物通过制备型HPLC(柱：Boston Prime C18 150*25mm*5mm；流动相：[水(0.05％氢氧化氨v/v)-ACN]；B％：22％-45％，7min)纯化。获得作为白色固体的化合物aa33(200mg，456.04mmol，6.64％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.231min，对于C29H31N2O2质量计算为439.23[M+H]+，实测439.3[M+H]+。LCMS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.45-7.31(m,10H),7.19-7.11(m,6H),6.64(s,1H),2.52(t,J＝7.3Hz,2H),2.24(t,J＝7.4Hz,2H),1.65-1.52(m,4H),1.38-1.26(m,4H)ppm。
2.15非天然氨基酸(aa34)的合成
方案16概述了非天然氨基酸(aa34)的合成：
方案16
步骤1：7-[BLAH(三苯基)-λ5-磷酰基]庚酸(aa34-2)的合成
向aa34-1(10g，47.83mmol，1当量)在甲苯(100mL)中的溶液中添加PPh3(13.80g，52.61mmol，1.1当量)。将混合物在110℃搅拌12小时。在完成之后，将反应物在减压下过滤，以给出剩余物。将粗制产物用于下一步骤，而无进一步纯化。获得作为黄色油状物的化合物aa34-2(22.8g，43.73mmol，91.43％收率，90.410％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.792min，m/z，对于C25H28O2P+，计算为391.18[M]+，实测391.1[M]+，LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
步骤2：(E)-8-(1-三苯甲基咪唑-4-基)辛-7-烯酸(aa34-3)的合成
在N2下在0℃向aa34-2(10.45g，22.16mmol，1.5当量)在THF(150mL)中的溶液中添加t-BuOK(4.97g，44.33mmol，3当量)，将混合物在0℃搅拌，然后在0℃将aa34-2A(5g，14.78mmol，1当量)在THF(20mL)中的溶液添加至以上混合物中，并且将最终混合物在25℃搅拌12小时。在完成之后，混合物中添加柠檬酸以调节pH＝4，然后用EtOAc(200mL*2)提取，收集有机层，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩，以给出作为白色固体的目标aa34-3(14.5g，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝0.870min，m/z，对于C30H31N2O2，计算为451.23[M+H]+，对于C30H30N2O2Na计算为473.23[M+Na]+，实测473.1[M+Na]+，LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C1820*2.0mm。
步骤3：8-(1-三苯甲基咪唑-4-基)辛酸(aa34)的合成
向aa34-3(14g，15.54mmol，50％纯度，1当量)在MeOH(200mL)中的溶液中添加Pd/C(4g，10％纯度)和H2。将混合物在25℃搅拌3小时。在完成之后，将混合物过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将粗制产物通过C-18反相色谱(120gC-18柱，60％～70％乙腈/H2O梯度的洗脱液@80mL/min，40分钟，总体积为2mL)纯化以给出剩余物(中性)。获得作为白色固体的化合物aa34(2.1g，4.53mmol，29.15％收率，97.6％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.956min，对于C30H33N2O2质量计算为453.25[M+H]+，实测453.3[M+H]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6.0分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.47-7.33(m,10H),7.22-7.10(m,6H),6.64(s,1H),2.52(t,J＝7.4Hz,2H),2.26(t,J＝7.4Hz,2H),1.69-1.48(m,4H),1.37-1.26(m,6H)ppm。
2.16非天然氨基酸(aa35)的合成
方案17概述了非天然氨基酸(aa35)的合成：
方案17
步骤1：(7-羧基庚基)三苯基溴化鏻(aa35-2)的合成
向aa35-1(15g，71.74mmol，1当量)在甲苯(150mL)中的溶液中添加PPh3(20.70g，78.92mmol，1.1当量)。将混合物在N2下在110℃搅拌20h。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃，然后过滤并且用甲苯(10mL*3)洗涤，收集滤饼并且在减压下干燥。将剩余物用THF(200mL)研磨。然后将混合物过滤，并且干燥滤饼，以给出作为白色固体的产物aa35-2(20g，40.31mmol，56.18％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.175min，对于C26H30O2P+[M+H]+，质量计算为405.20，实测405.70；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C1825-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤2：(E)-9-(1-三苯甲基-1H-咪唑-4-基)壬-8-烯酸(aa35-3)的合成
在0℃向aa35-2(10.45g，22.17mmol，1.5当量)在THF(150mL)中的溶液中添加t-BuOK(4.97g，44.34mmol，3.0当量)。然后将混合物在0℃搅拌30min。添加aa35-2A(5g，14.78mmol，1当量)在THF(50mL)中的溶液。然后将混合物在20℃搅拌12h。在完成之后，将反应混合物在0℃通过添加H2O(100mL)猝灭，并且然后用EtOAc(150mL*2)提取。将合并的有机层用饱和NaCl 100mL(50mL*2)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过快速硅胶色谱(80g Special硅快速柱，0％～20％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@60mL/min)纯化，以给出作为浅黄色油状物的产物aa35-3(1.4g，粗制)。
LCMS：(ESI)：Rt＝3.310min，对于C31H33N2O2[M+H]+，质量计算为465.25，实测465.20[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤3：9-(1-三苯甲基咪唑-4-基)壬酸(aa35)的合成
向aa35-3(1.4g，3.01mmol，1当量)在MeOH(40mL)中的溶液中添加Pd/C(0.2g，10％纯度)。将混合物在H2下在25℃搅拌3小时。在完成之后，将混合物过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：C18spherical 20-35um，100A，12g；流动相：[水-ACN]；B％：0％-90％，15min)纯化，以给出作为白色固体获得的产物aa35(0.12g，244.31μmol，8.11％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝3.257min，对于C31H35N2O2[M+H]+，质量计算为467.26，实测467.20[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
2.17非天然氨基酸(aa36)的合成
方案18概述了非天然氨基酸(aa36)的合成：
方案18
步骤1：1-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)哌啶-2-酮(aa36-2)的合成
在0℃向aa36-1(6g，60.53mmol，1当量)在THF(300mL)中的溶液中分份(inportions)添加NaH(2.66g，66.58mmol，60％纯度，1.1当量)。将混合物在20℃搅拌0.5小时，并且添加aa36-1A(14.48g，60.53mmol，1当量)。将反应混合物加热至70℃持续12h。LCMS显示观察到了期望的产物。将混合物冷却至r.t.，用水(150mL)猝灭并且用EtOAc(150mL×2)提取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将剩余物通过柱色谱(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化。获得作为无色油状物的化合物aa36-2(2.7g，10.49mmol，17.33％收率)。
LCMS(ESI):RT＝0.974min，对于C13H27NO2SiH质量计算为258.18，实测258.2[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm，流量为1.5mL/min，在0.7分钟内用5％-95％(溶剂B)的梯度洗脱，并且在95％保持0.4分钟。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.64(t,J＝6.0Hz,2H),3.32-3.29(m,4H),2.16(t,J＝6.0Hz,2H),1.74-1.57(m,4H),0.83(s,9H),0.00(s,6H)ppm。
步骤2：1-(2-羟乙基)哌啶-2-酮(aa36-3)的合成
在0℃向aa36-2(2.7g，10.49mmol，1当量)在MeOH(12mL)中的溶液中添加HCl/MeOH(v/v＝30％，8mL)。将溶液在0℃搅拌0.5h。在完成之后，将溶液在真空中浓缩。将剩余物通过柱色谱(SiO2,DCM/MeOH＝10/1)纯化。获得作为黄色固体的粗制产物aa36-3(1.4g，9.73mmol，92.76％收率，99.5％纯度)，其用于下一步骤，而无进一步纯化。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)4.13-4.11(m,1H),3.52-3.44(m,2H),3.34-3.29(m,4H),2.20(t,J＝6.0Hz,2H),1.75-1.61(m,4H)ppm。
LCMS(ESI):RT＝0.448-0.574min，对于C7H13NO2H质量计算为144.09，实测144.2[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm，流量为1.5mL/min，在0.7分钟内用5％-95％(溶剂B)的梯度洗脱，并且在95％保持0.4分钟。
步骤3：2-(2-(2-氧代哌啶-1-基)乙基)异吲哚-1,3-二酮(aa36-4)的合成
在0℃向aa36-3(1.5g，10.48mmol，1当量)和aa36-3A(1.85g，12.57mmol，1.2当量)在THF(40mL)中的溶液中添加PPh3(4.12g，15.71mmol，1.5当量)和DIAD(3.18g，15.71mmol，3.06mL，1.5当量)。将所得混合物在20℃搅拌2h。LCMS显示观察到了期望的产物。将混合物过滤，并且在真空中浓缩滤液。将剩余物通过柱色谱(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化。获得作为白色固体的化合物aa36-4(0.15g，550.87μmol，5.26％收率)。
LCMS(ESI):RT＝0.764min，对于C15H16N2O3H质量计算为273.12，实测273.1[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm，流量为1.5mL/min，在0.7分钟内用5％-95％(溶剂B)的梯度洗脱，并且在95％保持0.4分钟。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)7.83-7.65(m,4H),3.68-3.58(m,2H),3.45-3.39(m,2H),3.21(t,J＝6.0Hz,2H),1.89(t,J＝6.4Hz,2H),1.64-1.56(m,2H),1.55-1.47(m,2H)ppm。
步骤4：1-(2-氨基乙基)哌啶-2-酮(aa36-5)的合成
向aa36-4(0.15g，550.87μmol，1当量)在MeOH(10mL)中的溶液中添加NH2NH2 .H2O(275.76mg，5.51mmol，267.73μL，10当量)。将溶液在45℃搅拌2h。在完成之后，将溶液冷却至r.t.，并且在真空中浓缩。获得作为无色油状物的粗制产物aa36-5(0.07g，粗制)，其用于下一步骤，而无进一步纯化。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.27-3.22(m,6H),2.62(t,J＝6.8Hz,2H),2.17(t,J＝6.0Hz,2H),1.76-1.58(m,4H)ppm。
步骤5：2,2-二甲基-4-氧代-4-((2-(2-氧代哌啶-1-基)乙基)氨基)丁酸(aa36)的合成
向aa36-5(0.07g，492.27μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加aa36-5A(69.38mg，541.50μmol，60.86μL，1.1当量)。将溶液在20℃搅拌12h。LCMS显示观察到了期望的产物。将溶液在真空中浓缩。将剩余物通过制备型HPLC(FA条件；柱：Phenomenex SynergiC18 150*30mm*4μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：15％-25％,11min)纯化。获得作为白色固体的化合物aa36(20mg，73.99μmol，15.03％收率)。
LCMS(ESI):RT＝0.19min，对于C13H22N2O4H质量计算为271.16，实测271.1[M+H]+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm，流量为1.5mL/min，在0.7分钟内用5％-95％(溶剂B)的梯度洗脱，并且在95％保持0.4分钟。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)3.51-3.44(m,2H),3.43-3.35(m,4H),2.47(s,2H),2.35(t,J＝6.0Hz,2H),1.91-1.76(m,4H),1.25(s,6H)ppm。
2.18非天然氨基酸(aa37)的合成
方案19概述了非天然氨基酸(aa37)的合成：
方案19
步骤1：N-[2-(5-甲基-1,3-二氧代-异吲哚-2-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(aa37-2)的合成
向aa37-1(500mg，3.08mmol，1当量)在甲苯(10mL)中的溶液中添加aa37-1A(543.46mg，3.39mmol，532.80μL，1.1当量)。将混合物在120℃搅拌12小时。在完成之后，将反应混合物在真空下浓缩，以给出粗制产物，其在25℃用MTBE/PE(1:1)研磨1h。获得作为黄色固体的化合物aa37-2(460mg，1.44mmol，46.56％收率，95％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.898min，m/z，对于C16H21N2O4，计算为305.14[M+H]+，对于C16H21N2O4Na，计算为327.14[M+Na]+，实测327.2[M+Na]+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤2：2-(2-氨基乙基)-5-甲基-异吲哚-1,3-二酮(aa37-3)的合成
向aa37-2(460mg，1.51mmol，1当量)的溶液中添加HCl/MeOH(4M，377.87μL，1当量)。将混合物在25℃搅拌12小时。在完成之后，将反应物在真空中浓缩，以给出作为白色固体获得的粗制产物aa37-3(300mg，粗制，HCl盐)。
LCMS(ESI):RT＝0.638min，m/z，对于C11H13N2O2，计算为205.09[M+H]+，实测205.0[M+H]+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.99(br s,2H),7.26-7.21(m,1H),3.56(br s,2H),2.77(br s,4H),2.08(s,3H)ppm。
步骤3：2-[2-[2-(5-甲基-1,3-二氧代-异吲哚-2-基)乙氨基]-2-氧代-乙基]硫烷基乙酸(aa37)的合成
向aa37-3(250mg，1.22mmol，1当量)和aa37-3A(194.11mg，1.47mmol，1.2当量)在DMF(4mL)中的溶液中添加DIPEA(316.42mg，2.45mmol，426.45μL，2当量)。将混合物在25℃搅拌12小时。使反应混合物在EtOAc(50mL)与水(60mL)之间分配。将水层用1N HCl溶液酸化至pH＝4。将有机相分离，用盐水(30mL×3)洗涤，并且经无水Na2SO4干燥。将所得溶液在减压下浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(12g硅快速柱，0％～30％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱液@35mL/min)纯化。获得作为白色固体的化合物aa37(200mg，535.14μmol，43.72％收率，90％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.757min，m/z，对于C15H16N2O5SNa计算为359.08[M+Na]+，实测358.9[M+Na]+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.69-7.60(m,1H),7.55(s,1H),7.43(br d,J＝7.3Hz,1H),3.82-3.70(m,2H),3.52-3.41(m,2H),2.86(s,2H),2.76(s,2H),2.38(s,3H)ppm。
实施例3.GLP1肽模拟物的合成
制备根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷的一般合成方案如图13所示。以下示出的表2描绘了Rink酰胺MBHA树脂结合肽和中间体1-59的结构。
表2
Rink酰胺MBHA树脂结合肽和中间体(1～59)在从树脂上裂解之后通过LC-MS分析。下表2B总结了这些中间体。
表2B.从MBHA树脂裂解的中间体
图14描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P1和P8的固体支持物合成的步骤顺序。
3.1(3S,6S,9R,12S,15S,21S)-21-氨基-3-(((S)-1-(((S)-1-氨基-5-(3,5-二甲 基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-氨基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)- 1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟乙基)-6-(羟甲基)- 12-甲基-5,8,11,14,17,20-六氧代-22-(2H-四唑-5-基)-4,7,10,13,16,19-六氮杂二十二 烷-1-酸(P1)的制备
对应的Fmoc保护的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(9，16.59μmol)如SPPS的一般程序中描述的制备。树脂结合肽9遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将该粗产物溶解在DMF(1mL)中，并且在氮气下在20℃以一整份(in one portion)添加哌啶(14.13mg，165.94μmol，16.39μL，10.0当量)。将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：30％-60％，60min)纯化以获得纯产物。将产物悬浮在水中(10mL)，将混合物在干冰/乙醇浴中冷冻，并且然后冻干至干燥，以获得作为白色固体的期望的产物P1(1.02mg，7.48e-1μmol，4.50％收率，100％纯度)。
HRMS(ESI)：对于C65H87FN17O15质量计算为1364.6552,m/z，实测1364.4887[M+H]+。
HPLC：RT＝10.15min，使用MERCK RP-18e 25-2mm柱进行反相HPLC，流量为1.2mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
3.2(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-氨基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟 乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代- 3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(P8)的制备
对应的aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(10，100.99μmol)如SPPS的一般程序中描述的组装。树脂结合肽10遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。粗制品使用以下通过制备型HPLC纯化：柱Luna 200*25mm，C18，10μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：30％-60％，60min，以获得纯产物。将产物悬浮在水中(10mL)，将混合物在干冰/丙酮浴中冷冻，并且然后冻干至干燥，以获得作为白色固体的期望的产物P8(25.00mg，17.49μmol，17.32％收率，100％纯度)。
HRMS(ESI)：对于C75H100FN20O17质量计算为1571.7559,m/z，实测1571.7589[M+H]+。
HPLC：RT＝10.14min。如下进行反相LC-HPLC：使用YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.062％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.068％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图15描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P2和P9的固体支持物合成的步骤顺序。
3.3(8S,14S,17S,20R,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-氨基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟 乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代- 3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(P2)的制备
对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，74.75μmol)如SPPS的一般程序中描述的制备。树脂结合肽18遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制产物送至制备型HPLC(柱：流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：20％-50％，60min)以获得纯产物。将产物悬浮在水中(100mL)，将混合物在干冰/丙酮浴中冷冻，并且然后冻干至干燥，以提供获得作为白色固体的期望的产物P2(11.56mg，8.45μmol，11.27％收率，97.84％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.830min，对于C65H88FN15O15，质量计算为1337.66[M-4tBu-Boc+6H]+669.83[M-4tBu-Boc+7H]2+，实测670.0[M-4tBu-Boc+7H]2+。如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.77min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.4(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-氨基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟 乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代- 3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(P9)的制备
对应的aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(19)如SPPS的一般程序中描述的制备。树脂结合肽19遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制产物送至制备型HPLC(TFA：流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化以获得纯产物。将产物悬浮在水中(20mL)，将混合物在干冰/丙酮浴中冷冻，并且然后冻干至干燥，以提供获得作为白色固体的期望的产物P9(125mg，79.82μmol，7.70％收率，98.7％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.843min，对于C75H102FN18O17，质量计算为1545.77[M-4tBu-Boc+6H]+773.385[M-4tBu-Boc+7H]2+，实测773.9[M-4tBu-Boc+7H]2+。如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图16描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P3、P4、P5、P6、P7、P11、P13、P14、P15、P16和P17的固体支持物合成的步骤顺序。
3.5 3-[[(1S)-2-[[2-[[(1S,2R)-1-[[(1S)-2-[[(1S,2R)-1-[[(1S)-2-[[(1S)- 2-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰 基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-1-(羧甲基)-2-氧代-乙基]氨 基]-1-(羟甲基)-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-羟基-丙基]氨基]-1-[(2-氟苯基)甲基]- 1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-羟基-丙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-1- (2H-四唑-5-基甲基)乙基]氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酸(P3)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，152.96μmol)和aa11(57.58mg，305.91μmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa11-aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(20，119μmol)。
对应的树脂结合肽20(119μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为浅黄色固体的P3(8mg，5.47μmol，3.58％收率，99.37％纯度)。
HPLC：RT＝8.10min。HPLC条件：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.12％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.841min，m/z，对于C18H21NO2，计算为1452.69[M+H]+，实测727.3[M+2H]2+；LCMS条件：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
3.6(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧代-丙 酰基)氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2- 氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁 酸(P4)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18(192.73μmol)和aa12(75.82mg，578.18μmol，3当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的获得对应的aa12-aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(21，192.73μmol)。
对应的树脂结合肽21(192.73μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为浅黄色固体的P4(35mg，24.03μmol，8.73％收率，99.66％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.861min，对于C76H103FN18O17质量计算为726.36m/z[M+2H]2+；实测726.7m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.854min，对于C76H103FN18O17质量计算为726.36m/z[M+2H]2+；实测726.7m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.90min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.7(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-(羟基 氨基)-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基] 丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-4-氧 代-丁酸(P5)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18(152.96μmol)和aa13(60mg，259.47μmol，1.7当量)开始，如SPPS的一般程序中描述获得对应的aa13-aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(22，152.67μmol)。
对应的树脂结合肽22遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为浅黄色固体的P5(4mg，2.66μmol，42.12％收率，97.7％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.705min，对于C70H96FN16O18，质量计算为733.85m/z[M+2H]2+；实测718.2m/z[M-2OH+4H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.847min，对于C70H96FN16O18，质量计算为733.85 m/z[M+2H]2+；实测735.2m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝8.00min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.8(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-甲基- 2-(1H-吡唑-5-基)丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基] 氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸 (P6)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18(82.60μmol)和aa14(25.47mg，165.19μmol，2当量)开始，如SPPS的一般程序中描述获得对应的aa14-aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(23，82.60μmol)。
对应的树脂结合肽23(82.60μmol)遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为浅黄色固体的P6(9mg，6.10μmol，7.40％收率，97.34％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.856min，对于C72H98FN17O16，质量计算为737.87m/z[M-4tBu-Boc-C17H17NO4+8H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；实测738.2m/z[M-4tBu-Boc-C17H17NO4+8H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.856min，对于C72H98FN17O16，质量计算为737.87m/z[M-4tBu-Boc-C17H17NO4+8H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；实测738.2m/z[M-4tBu-Boc-C17H17NO4+8H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝8.16min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.9(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-羟基-丙酰基] 氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯 基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸 (P7)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，76.48μmol)和aa4(87.98mg，229.44μmol，3当量)开始。对应的aa4-aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(24，76.48μmol)如SPPS的一般程序中描述获得。
对应的树脂结合肽24(76.48μmol)遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：28％-58％，30min)纯化，以提供作为白色固体的P7(17mg，11.16μmol，14.59％收率，93.57％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝2.675min，m/z，对于C68H95FN16O17，计算为713.35[M+2H]2+，m/z，实测713.8[M+2H]2+；流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；
LCMS：(ESI)：RT＝0.757min,m/z，对于C68H95FN16O17，计算为713.35[M+2H]2+，m/z，实测713.8[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱；
HPLC(Rt＝7.58min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.10(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[6-(1H-咪 唑-5-基)己酰氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲 基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P11)的制 备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，74.75μmol)和aa17(70.13mg，165.19μmol，2当量)开始，如SPPS的一般程序中描述获得对应的aa17-aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(27，74.75μmol)。
对应的树脂结合肽化合物27(74.75μmol)遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P7(9mg，5.80μmol，7.05％收率，96.92％纯度)。
HPLC：RT＝7.72min。HPLC条件：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.12％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.828min，m/z，对于C18H21NO2，计算为1502.75[M+H]+，实测752.3[M+2H]2+；LCMS条件：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
3.11(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,5- 二氨基-5-氧代-戊酰基]氨基]-3-(1H-咪唑-4-基)丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-3-(2H-四 唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰 基]氨基]-3-羟基丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P13)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18(82.60μmol)、aa15(77.14mg，247.79μmol，3当量)、aa16(93.40mg，247.49μmol，3当量)和aa19(40.63mg，165.00μmol，2当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa19-aa16-aa15-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(30，82.50μmol)。
对应的树脂结合肽30(82.50μmol)遵循一般程序裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P13(10mg，5.69μmol，6.90％收率，95.28％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.807min，对于C79H110FN21O19，质量计算为837.9m/z[M-4tBu-2Boc-C17H17NO4+9H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；实测838.4m/z[M-4tBu-Boc-C17H17NO4+9H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.820min，对于C79H110FN21O19，质量计算为837.9m/z[M-4tBu-2Boc-C17H17NO4+9H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；实测838.3m/z[M-4tBu-Boc-C17H17NO4+9H]2+，rink酰胺(C17H17NO4，精确质量＝299.12)；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.37min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.12(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[(3R)-1- [2-(1H-咪唑-5-基)乙基]-3-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-羰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟 基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P14)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，82.60μmol)和aa20(79.22mg，165.19μmol，2当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa20-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(31，82.60μmol)。
对应的树脂结合肽31(82.60μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P14(8mg，3.85μmol，6.2％收率，93.37％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.840min，对于C76H103FN18O17质量计算为779.39m/z[M+2H]2+；实测779.9m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.864min，对于C76H103FN18O17质量计算为779.39m/z[M+2H]2+；实测779.9m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.60min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.13(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[(3R)-1- [2-(1H-咪唑-5-基)乙基]-3-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-羰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟 基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P15)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，82.60μmol)和aa21(79.22mg，165.19μmol，2当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa21-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(32，82.60μmol)。
对应的树脂结合肽32(82.60μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P15(10.5mg，6.54μmol，7.91％收率，96.96％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.828min，对于C76H103FN18O17质量计算为779.39m/z[M+2H]2+；实测779.8m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.830min，对于C76H103FN18O17质量计算为779.39m/z[M+2H]2+；实测779.8m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.62min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.14(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[(3S)-1- [2-(1H-咪唑-5-基)乙基]吡咯烷-3-羰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基] 氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨 基]-4-氧代-丁酸(P16)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18,141.13μmol)和aa22(127.46mg，282.27μmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa22-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(33，141.13μmol)。
对应的树脂结合肽33(141.13μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P16(15mg，9.71μmol，6.88％收率，以及99％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.361min，m/z，对于C75H103FN18O16，计算为1530.76M-Boc-4tBu+2H]2+，m/z，实测765.8，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃
LCMS(ESI):RT＝0.755min，m/z，对于C75H103FN18O16，计算为1530.76M-Boc-4tBu+2H]2+，m/z，实测765.8，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm波长：UV 220nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
HPLC：RT＝7.18min流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm波长：UV 220nm，215nm&254nm；柱温：40℃。
3.15(3S,9S,12S,15S,18S,21S)-叔丁基1-((R)-1-(2-(1H-咪唑-5-基)乙基)吡咯 烷-3-基)-3-((2H-四唑-5-基)甲基)-21-(((S)-1-(((S)-1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1- 氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-氨基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙 烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟乙基)-18-(羟甲基)-12-甲基- 1,4,7,10,13,16,19-七氧代-2,5,8,11,14,17,20-七氮杂二十三烷-23-酸酯(P17)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18,101.97μmol)和aa23(80mg，177.16μmol，1.74当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa23-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(34，101.88μmol)。
对应的树脂结合肽34(101.88μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P17(18mg，11.65μmol，7.91％收率，99％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.828min，m/z，对于C75H103FN18O16，计算为1530.76M-Boc-4tBu+2H]2+，m/z，实测765.8，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm波长：UV 220nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
HPLC：RT＝7.36min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm波长：UV 220nm，215nm&254nm；柱温：40℃。
图17A和图17B描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P10、P12、P18、P19、P25、P26、P27、P28、P29、P30、P31、P36、P37和P38的固体支持物合成的步骤顺序。
3.16[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-(1H-咪唑-5-基)丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]- 3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2- 甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P10)的 制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，137.66μmol)开始，如SPPS的一般程序中描述的通过用aa15(128.58mg，412.99μmol，3当量)并且然后aa16(155.42mg，411.83μmol,3当量)延长肽来制备对应的aa16-aa15-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(26，137.28μmol)。
对应的树脂结合肽26(137.28μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P10(16mg，10.33μmol，7.55％收率，99.85％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.808min，对于C74H100FN19O17，质量计算为1545.75[M-4tBu-Boc+6H]+773.88[M-4tBu-Boc+7H]2+，实测774.2[M-4tBu-Boc+7H]2+。如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.46min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.17(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3-羟基-5-甲基-苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3- [[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2- [[2-[3-(1H-咪唑-4-基)丙酰基氨基]乙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰 基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨 基]-4-氧代-丁酸(P12)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(18，82.60μmol)开始，如SPPS的一般程序中描述的通过用aa8(73.67mg，247.79μmol，3当量)并且然后aa18(63.18mg，165.19μmol,2当量)延长肽来制备对应的aa18-aa8-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(29，82.60μmol)。
对应的树脂结合肽29(82.60μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P12(11mg，7.09μmol，8.59％收率，97.99％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.828min，对于C72H96FN18O18质量计算为759.86m/z[M+2H]2+；实测759.7m/z[M+2H]2+；[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝0.828min，对于C72H96FN18O18质量计算为759.86m/z[M+2H]2+；实测759.8m/z[M+2H]2+；[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.65min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.18(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-羟基-丙酰基] 氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯 基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸 (P18)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18(137.66μmol)开始，如SPPS的一般程序中描述的通过用aa15(71.43mg，229.44μmol，3当量)并且然后aa24(64.54mg，229.44μmol,3当量)延长肽来制备对应的aa24-aa15-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物35(76.48μmol)。
对应的树脂结合肽35(76.48μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：YMC-Exphere C18 10μm 300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化，以提供作为白色固体的P18(16mg，10.15μmol，11.76％收率，99.77％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.762min,m/z，对于C77H104FN17O18，计算为786.89[M+2H]2+，m/z，实测787.3[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC(Rt＝7.68min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在80％保持5分钟。
3.19(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-氨基-3-(4-羟基苯 基)丙酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]- 3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟 基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P19)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物18(81.07μmol)开始，如SPPS的一般程序中描述的通过用aa25(79.13mg，243.20μmol，3当量)并且然后aa24(68.41mg，243.20μmol,3当量)延长肽来制备对应的aa24-aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物37(81.07μmol)。
对应的树脂结合肽37遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX150*30mm*5μm；流动相：[水((0.04％NH3H2O+10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：10％-50％，15min)纯化，以提供作为白色固体的P19(9mg，5.62μmol，7.03％收率，99％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.841min,m/z，对于C78H106FN17O18，计算为793.90[M+2H]2+，m/z，实测794.2[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
粗制HPLC：(Rt＝7.81min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
LCMS：(ESI)：RT＝0.813min,m/z，对于C78H106FN17O18，计算为793.90[M+2H]2+，m/z，实测794.4[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：Rt＝7.81min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.20(3S,6S,9S,12S,15S,21S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-3-(((S)-1-(((S)-1- 氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟 乙基)-6-(羟甲基)-28-(1H-咪唑-5-基)-12,24,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧 代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-1-酸(P25)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
在20℃向化合物36A(0.1g，50.70μmol，1.0当量)在DMF(20mL)中的混合物中以一整份添加化合物aa29(58.17mg，152.11μmol，3.0当量)、PyBOP(73.88mg，141.96μmol，2.8当量)和DIPEA(39.32mg，304.21μmol,52.99μl,6.0当量)在DMF(20mL)中的溶液。将混合物在20℃用N2鼓泡2小时。将混合物过滤，并且用DMF(50mL*3)、DCM(50mL*3)洗涤收集的树脂，以给出在固相上的粗制产物，使其经历通过使用TFA混合物(6mL TFA、0.4mL水、0.3mL三异丙基硅烷、120mg苯酚)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(1000mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NXC18 80*3 0mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：10％-60％，20min)纯化，以给出作为白色固体获得的产物P25(2.3mg，1.33μmol，2.63％收率，91％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.006min，m/z，对于C75H100FN20O17，计算为1571.76[M+H]+，实测786.20[M+2H]2+，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
HPLC：RT＝9.54min，98.48％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.21(3S,6S,9S,12S,15S,21S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-3-(((S)-1-(((S)-1- 氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟 乙基)-6-(羟甲基)-29-(1H-咪唑-5-基)-12,24,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧 代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十九烷-1-酸(P26)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
使树脂结合化合物36A(50mg，25.35μmol，1当量)经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，并且然后离心(5000R)10min，以给出作为白色固体的粗制产物aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1(50mg，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝3.968min，m/z，对于C69H95FN18O16，计算为1449.70，实测1449.7[M+H]+，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm，254nm，烘箱温度50℃。
向aa30(34.19mg，86.23μmol，2.5当量)在DMF(4mL)中的溶液中添加PyBOP(39.49mg，75.88μmol，2.2当量)和DIPEA(26.75mg，206.96μmol，36.05μL，6当量)，将混合物在25℃搅拌10min，然后添加aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1(50mg，34.49μmol，1当量)，并且将最终混合物在25℃搅拌2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物通过TBME(25mL)研磨，以给出粗制产物，将该粗制产物添加到H2O(0.1mL)、三异丙基硅烷(77.10mg，486.88μmol，0.1mL，14.83当量)和TFA(2.77g，24.31mmol，1.8mL，740.69当量)的溶液中。将混合物在25℃搅拌1h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤，并且然后通过TBME(50mL)研磨，以给出粗制产物，将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Gemini NXC18 5μm*10*150mm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：10％-60％，30min)纯化，以给出作为白色固体的P26(7.72mg，4.77μmol，14.54％收率，98％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.991min，对于C76H103FN20O17，质量计算为793.38[M+H]+，实测793.7[M+H]+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6.0分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：X timate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
HPLC：RT＝9.55min，HPLC条件：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：WELCH Ultimate LP-C18 150*4.6mm 5μm；波长：UV 220nm、215nm、254nm；柱温：40℃。
3.22(3S,6S,9S,12S,15S,21S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-3-(((S)-1-(((S)-1- 氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟 乙基)-6-(羟甲基)-30-(1H-咪唑-5-基)-12,24,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧 代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂三十烷-1-酸(P27)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
在20℃向化合物36A(120mg，60.84μmol，1当量)在DMF(4mL)中的混合物中以一整份添加aa31(62.44mg，152.11μmol，2.5当量)、PyBOP(69.66mg，133.85μmol，2.2当量)和DIPEA(47.18mg，365.05μmol，63.59μL，6当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h，并且重复该进程两次。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL*4)和DCM(10mL*4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini NX C18 150*40mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-45％，30min)纯化，以给出作为白色固体的产物P27(2.4mg，1.47μmol，2.48％收率，98％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.071min，m/z，对于C77H105FN20O17，计算为800.39[M+2H]2+，实测800.8，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
HPLC：RT＝9.58min，HPLC条件：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：WELCH Ultimate LP-C18 150*4.6mm 5μm；波长：UV 220nm、215nm、254nm；柱温：40℃。
3.23(3S,6S,9S,12S,15S,21S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-3-(((S)-1-(((S)-1- 氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟 乙基)-6-(羟甲基)-31-(1H-咪唑-4-基)-12,24,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧 代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂三十一烷-1-酸(P28)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
在20℃向化合物36A(120mg，60.84μmol，1当量)在DMF(4mL)中的混合物中以一整份添加aa32(64.57mg，152.10μmol，2.5当量)、PyBOP(69.65mg，133.85μmol，2.2当量)和DIPEA(39.32mg，304.20μmol，52.99μL，5当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h，并且重复该进程两次。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL*4)和DCM(10mL*4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.05％氢氧化氨v/v)-ACN]；B％：0％-45％，30min)纯化，以给出作为白色固体的产物P28(8.5mg，5.21μmol，10.34％收率，99％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.035min，m/z，对于C78H107FN20O17，计算为807.40[M+2H]2+，实测807.8，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
HPLC：RT＝9.60min，HPLC条件：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：WELCH Ultimate LP-C18 150*4.6mm 5μm；波长：UV 220nm、215nm、254nm；柱温：40℃。
3.24(3S,6S,9S,12S,15S,21S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-3-(((S)-1-(((S)-1- 氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟 乙基)-6-(羟甲基)-32-(1H-咪唑-4-基)-12,24,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧 代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂三十二烷-1-酸(P29)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
在20℃向化合物36A(120mg，60.84μmol，1当量)在DMF(4mL)中的混合物中以一整份添加aa33(64.04mg，146.02μmol，2.4当量)、PyBOP(63.32mg，121.68μmol，2当量)和DIPEA(39.32mg，304.21μmol，52.99μL，5当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h，并且重复该进程两次。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL*4)和DCM(10mL*4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-55％，20min)纯化，以给出作为白色固体的产物P29(5mg，3.05μmol，5.22％收率，99.4％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.997min，m/z，对于C77H103FN20O17，计算为814.40[M+2H]2+，实测814.9，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
HPLC：RT＝9.61min，HPLC条件：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：WELCH Ultimate LP-C18 150*4.6mm 5μm；波长：UV 220nm、215nm、254nm；柱温：40℃。
3.25(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-叠氮基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[8- (1H-咪唑-5-基)辛酰基氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙 酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基] 氨基]-4-氧代-丁酸(P30)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
在20℃向化合物36A(500mg，126.75μmol，50％纯度，1当量)在DMF(4mL)中的混合物中以一整份添加aa34(286.84mg，633.77μmol，5当量)、HATU(86.75mg，228.16μmol，1.8当量)和DIPEA(65.53mg，507.02μmol，88.31μL，4当量)在DMF(20mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL*4)和DCM(10mL*4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(10mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(100mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：22％-62％，9min)纯化，以给出作为白色固体的产物P30(7.68mg，4.62μmol，4.45％收率，98.82％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.998min，m/z，对于C80H110FN20O17，计算为1641.83[M+H]+，对于C80H111FN20O17，计算为821.4[M+2H]2+，实测821.8[M+2H]2+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝9.63min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
3.26(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-叠氮基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[9- (1H-咪唑-5-基)壬酰基氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙 酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基] 氨基]-4-氧代-丁酸(P31)的制备
从对应的aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(1.03mmol)、aa25(669mg，206mmol，2.0当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物36A(1.03mmol)。
在20℃向化合物36A(125mg，63.38μmol，1当量)在DMF(4mL)中的混合物中以一整份添加aa35(57.37mg，126.75μmol，2.0当量)、HATU(43.38mg，114.08μmol，1.8当量)和DIPEA(32.76mg，253.51μmol，44.16μL，4.0当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL*4)和DCM(10mL*4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：BostonGreen ODS 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：25％-65％，9min)纯化，以给出作为白色固体的产物P31(7.0mg，4.23μmol，6.69％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.023min，m/z，对于C75H100FN20O17，计算为1571.76[M+H]+、786.38[M+2H]2+，实测786.20[M+2H]2+，流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.5分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm、254nm，烘箱温度50℃。
HPLC：RT＝9.80min，100％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.27(9S,15S,18S,21S,24S,27S)-9-((2H-四唑-5-基)甲基)-27-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙 基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-18-(2-氟苄基)-15,21-双((R)- 1-羟乙基)-24-(羟甲基)-6,6,18-三甲基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧代-1-(2-氧代哌 啶-1-基)-3,8,11,14,17,20,23,26-八氮杂二十九烷-29-酸(P36)的制备
在20℃向aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(75mg，19.87μmol，50％纯度，1当量)在DMF(2mL)中的混合物中以一整份添加aa36(20mg，73.99μmol，3.72当量)、HATU(15.11mg，39.74μmol，2当量)和DIPEA(25.68mg，198.71μmol，34.61μL，10当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL×4)和DCM(10mL×4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：50％-80％，10min)纯化，以给出作为白色固体的产物P36(2.4mg，1.48μmol，7.47％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.416min，对于C95H122N20O22FH，质量计算为1917.11[M+H]+，对于C95H122N20O22F，质量计算为809.1[M+2H]2+，实测809.3[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash柱，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18,2.1*30mm。
HPLC：RT＝5.24min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：Ultimate XB-C18，3μm，3.0*50mm。
3.28(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-叠氮基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[2- [2-(5-甲基-1,3-二氧代-异吲哚基-2-基)乙基氨基]-2-氧代-乙基]硫烷基乙酰基]氨基]- 3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟 基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P37)的制备
在20℃向aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(100mg，26.49μmol，1当量)在DMF(2mL)中的混合物中以一整份添加aa36(44.56mg，132.47μmol，5当量)、HATU(18.13mg，47.69μmol，1.8当量)和DIPEA(13.70mg，105.98μmol，18.46μL，4当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL×4)和DCM(10mL×4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(5mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(50mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge BEH C18 100*25mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：20％-80％，15min)纯化，以给出作为白色固体的产物P37(4.81mg，2.86μmol，10.86％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.602min，m/z，对于C80H101FN19O19S，计算为1682.71[M+H]+，对于C80H100FN19O19S，计算为841.85[M+2H]2+，实测842.3[M+2H]2+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝4.844min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
3.29(3S,6S,9S,12S,15S,21S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-3-(((S)-1-(((S)-1- 氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基- [1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟 乙基)-6-(羟甲基)-12-甲基-5,8,11,14,17,20,23,27-八氧代-29-(2-氧代吡咯烷-1-基)- 4,7,10,13,16,19,22,26-八氮杂二十九烷-1-酸(P38)的制备
在20℃向aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(0.2g，52.99μmol，50％纯度，1.0当量)在DMF(2mL)中的混合物中以一整份添加aa38(82.48mg，264.94μmol，5.0当量)、HATU(90.66mg，238.45μmol，4.5当量)和DIPEA(68.48mg，529.88μmol，92.29μL，10.0当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL×4)和DCM(10mL×4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，将粗制产物同样用20％哌啶/DMF(20mL)溶胀，并在20℃用N2鼓泡2小时。在完成之后，将混合物过滤，用DMF(100mL×3)、DCM(100mL×3)洗涤收集的树脂，以给出在固相上的粗制产物aa38-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1(52.99μmol)。
在20℃向aa38-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(52.60μmol，1当量)在DMF(2mL)中的混合物中以一整份添加aa39(41.33mg，262.98μmol，5.0当量)、HATU(90.00mg，236.69μmol，4.5当量)和DIPEA(67.98mg，525.97μmol，91.61μL，10.0当量)在DMF(10mL)中的溶液，并且将最终混合物在20℃用N2鼓泡2h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将混合物过滤并且用DMF(10mL×4)和DCM(10mL×4)洗涤，以给出在固相上的粗制产物，使该粗制产物经历通过使用TFA混合物(10mL，TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解。将混合物过滤，并且用t-BuOMe(100mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：36％-76％，9min)和制备型HPLC(柱：Waters X-bridge BEHC18 100*25mm*5μm；流动相：[水(0.05％NH3H2O)-ACN]；B％：5％-49％，11min)纯化，以给出作为白色固体的产物P38(3.0mg，1.71μmol，3.26％收率，90％纯度)。LCMS(ESI):RT＝4.313min，m/z，对于C75H102FN19O18，计算为1575.76[M+H]+、788.38[M+2H]2+，实测788.20[M+2H]2+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18,2.1*30mm；HPLC：RT＝9.93min，90％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
图18描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P20和P21的固体支持物合成的步骤顺序。
3.30(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]3-[[(2S)-2- [[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2,5-二氨基-5-氧代戊酰基]氨基]乙酰 基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基丁酰基]氨 基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P20)的制备
从对应的aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(17，175.17μmol)和aa26(193.59mg，525.51μmol，3当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa26-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(38，175.17μmol)。
对应的树脂结合肽38(175.17μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：0％-90％，25min)纯化，以提供作为白色固体的P20(4.65mg，3.35μmol，95.77％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.789min，对于C66H93FN12O16，质量计算为664.34m/z[M+2H]2+；实测665.0m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS：(ESI)：RT＝1.362min，对于C66H92FN12O16，质量计算为1327.67m/z[M+H]+；实测1327.7m/z[M+H]+；LC-MS：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.48分钟。
HPLC：RT＝7.40min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
3.31(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-5-氨基-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基) 乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟 基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基- 丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P21)的制备
从对应的aa26-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂化合物38(175.17μmol)和aa10(163.80mg，350.34μmol，2当量)开始，如SPPS的一般程序中描述的制备对应的aa10-aa26-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2b-aa1肽基Rink酰胺MBHA树脂(39，175.17μmol)。
对应的树脂结合肽39(175.17μmol)遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，20min)纯化，以提供作为白色固体的P21(20mg，12.94μmol，7.39％收率，99.31％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.833min，对于C76H106FN15O18，质量计算为767.89m/z[M+2H]2+；实测768.3m/z[M+2H]2+；LC-MS：MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.44min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
图19描述了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P22和P23的固体支持物合成的步骤顺序。
3.32(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-苯 胺基-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S, 3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰 基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基] 氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P22)的制备
对应的aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3肽基2-氯三苯甲基氯树脂结合肽47如SPPS的一般程序中描述的制备。
在N2下在25℃向对应的树脂结合肽(47，553.98μmol)的混合物中以一整份添加在DCM(8mL)中的TFE(2.61g，26.09mmol，1.88mL，47.09当量)和AcOH(1.97g，32.83mmol，1.88mL，59.26当量)。将混合物在25℃摇动2小时。LCMS示踪显示反应完成。将混合物过滤，并且用DCM(5mL×3)洗涤滤饼。将滤液在真空中浓缩，以给出黄色油状物，将黄色油状物用水(5mL)稀释。将混合物用饱和NaHCO3水溶液调节至pH＝8，使黄色固体沉淀。将混合物过滤，并且用水(5mL×2)洗涤滤饼，在真空中干燥，以给出作为黄色固体的粗制产物(550mg，粗制)。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：48％-58％，11min)纯化，以给出作为灰白色固体的化合物47(220mg，122.65μmol，36.10％收率，82.05％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.073min，对于C76H104FN14O15，质量计算为1471.78m/z[M-C19H13Cl+2H]+，m/z，实测1471.65[M-C19H13Cl+2H]+；rink 2-[氯(二苯基)甲基]苯(C19H13Cl，精确质量＝276.1)；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱进行反相LC-MS，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS(ESI):RT＝1.079min，对于C76H104FN14O15，质量计算为1471.78m/z[M-C19H13Cl+2H]+，m/z，实测1471.8[M-C19H13Cl+2H]+；rink 2-[氯(二苯基)甲基]苯(C19H13Cl，精确质量＝276.1)；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝10.96min。HPLC：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟。
在20℃向化合物47(37.37μmol)和HOBt(5.05mg，37.37μmol，1当量)在CHCl3(0.225mL)和DMF(0.025mL)中的溶液中添加aa27(19.87mg，37.37μmol,1当量)。将DIC(4.72mg，37.37μmol，5.79μL，1当量)在CHCl3(0.225mL)和DMF(0.025mL)中的溶液添加至该混合物。将反应物在20℃搅拌16小时。LCMS示踪显示反应完成。将反应物在真空中浓缩，以给出作为棕色油状物的粗制产物48(74.2mg，37.37μmol)，其用于下一步骤，而无进一步纯化。
LCMS(ESI):RT＝1.215min，对于C108H144FN17O18，计算为993.05m/z[M+2H]2+，m/z，实测993.8m/z[M+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
在N2下在25℃向化合物48(74.2mg，37.37μmol，1当量)的混合物中以一整份添加在TFA(2mL)和H2O(0.06mL)中的三异丙基硅烷(137.30mg，867.01μmol，178.08μL，23.20当量)。将混合物在15℃静置2.5小时。LCMS示踪显示反应完成。将混合物在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBDC18150*30mm，10μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：28％-58％，11min)纯化，以给出作为白色固体的化合物P22(7.5mg，5.18μmol，13.86％收率，97.96％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.811min，对于C68H90FN17O16，计算为709.84m/z[M+2H]2+，m/z，实测710.2m/z[M+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.06min。HPLC：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟。
3.33(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-(4-氨基丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-4-(3,5-二甲基苯基)-1-(苯基氨基甲酰基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3- [[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2- [[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5- 基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨 基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P23)的制备
在20℃向47(27.18μmol)和HOBt(3.67mg，27.18μmol，1当量)在CHCl3(0.225mL)和DMF(0.025mL)中的溶液中添加aa28(19.98mg，27.18μmol,1当量)。将DIC(3.43mg，27.18μmol，4.21μL，1当量)在CHCl3(0.225mL)和DMF(0.025mL)中的溶液添加至该混合物。将反应物在20℃搅拌16小时。LCMS示踪显示反应完成。将反应物在真空中浓缩，以给出作为棕色油状物的粗制产物49(59.49mg，27.18μmol)，其用于下一步骤，而无进一步纯化。
LCMS(ESI):RT＝1.223min，对于C116H154FN18O17，计算为1045.09m/z[M-Boc+3H]2+，m/z，实测1044.8m/z[M-Boc+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
在N2下在15℃向化合物49(59.49mg，27.18μmol，1当量)的混合物中以一整份添加在TFA(6mL)和H2O(0.17mL)中的三异丙基硅烷(131.07mg，827.67μmol，0.17mL，30.45当量)。将混合物在15℃静置2.5小时。LCMS示踪显示反应完成。将混合物在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Xtimate C18 10μm，250mm*50mm；流动相：[水(0.04％NH3H2O+10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：25％-55％，8min)纯化，以给出作为白色固体的化合物P23(7.5mg，4.60μmol，16.91％收率，99.38％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.875min，对于C81H107FN18O17，计算为811.4m/z[M+2H]2+，m/z，实测811.9m/z[M+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS(ESI):RT＝0.882min，对于C81H107FN18O17，计算为811.4m/z[M+2H]2+，m/z，实测811.8m/z[M+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝8.30min。HPLC：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
图20描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P24的固体支持物合成的步骤顺序。
3.34(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-4-[4-(4-氨基丁氧基)苯基]-1-氨基甲酰基-丁 基]氨基]-1-[[4-(2-乙基-4-甲氧基-苯基)苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2- [[(2R,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H- 咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨 基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙 酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(P24)的制备
对应的aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2c-aa1b肽基Rink酰胺MBHA树脂(59)如SPPS的一般程序中描述的制备。
对应的树脂结合肽59遵循一般程序进一步裂解，以给出作为白色固体的粗制产物。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：15％-45％，55min)纯化以获得纯产物。将产物悬浮在水(20mL)中，将混合物在干冰/丙酮浴中冷冻，并且然后冻干至干燥，以获得期望的产物。获得作为白色固体的化合物P24(50mg，29.69μmol，6.76％收率，98.686％纯度，TFA盐)。
LCMS(ESI):RT＝0.821min，对于C74H99FN18O18，质量计算为1546.74[M+H]+、773.4[M+H]2+，m/z，实测774.8[M+H]2。如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图21描绘了根据本公开内容的GLP1肽模拟物有效载荷P32、P33、P34和P35的固体支持物合成的步骤顺序。
3.35(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(4-(氨基甲基)苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’- 乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双 ((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21, 24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(P24A)的制备
使用Liberty Lite自动化微波肽合成仪以0.5mmol规模进行肽延伸。向聚丙烯固相反应容器中添加Rink酰胺MBHA树脂(0.5mmol，1当量)。如下将树脂洗涤(溶胀)两次：通过容器顶部向反应容器中添加DMF(10mL)，将混合物在容器上搅拌5分钟，然后溶剂通过玻璃料排出。
每个氨基酸的一般偶联反应在一般去除Fmoc基团程序之后进行。A)Fmoc基团的一般去除程序：向包含来自前一步骤的树脂的反应容器中添加哌啶:DMF(1:4v/v，5mL)。将混合物在微波下在90℃搅拌2min，并且然后将溶液通过玻璃料排出。如下将树脂洗涤五次：每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(5mL)，并且将所得混合物周期性搅拌0.5分钟，然后将溶液通过玻璃料排出。B)一般偶联反应步骤：
向反应容器中添加氨基酸(在DMF中的0.2M，12.5mL，5当量)，然后添加DIC(在DMF中的0.5M，4mL，4当量)和oxyma(在DMF中的0.5M，2mL，2当量)。将混合物在微波下在90℃搅拌10min，然后将反应溶液通过玻璃料排出。如下将树脂洗涤四次：每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(8mL)，并且将所得混合物周期性搅拌0.5分钟，然后将溶液通过玻璃料排出。合成完成之后，将树脂用DMF(6×6mL)，然后用CH2Cl2(6×6mL)彻底冲洗。使所得树脂经历使用TFA混合物(TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解持续2小时，然后过滤，并且滤液用t-BuOMe稀释以得到沉淀，将其离心(5000R)10min并且倾析，以给出粗制产物。
对应的aa10-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-aa2-aa1b肽基Rink酰胺MBHA树脂如SPPS的一般程序中描述的制备。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NXC18 80*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：5％-55％，8min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物P24A(50mg，31.79μmol，41.80％收率)。
LCMS(ESI):RT＝2.913min，m/z，对于C75H101FN20O17，计算为786.37，实测786.9[M+2H]2+。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18,2.1*30mm。
HPLC：RT＝7.44min，99.18％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.36(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(4-(13-氨基-3,6,9,12-四氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷基)苯基)-1-氧代戊 烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2- 基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5- 基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二 十八烷-28-酸(P32)的制备
向P24A(20mg，12.72μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加P32-1(7.13mg，15.26μmol，1.2当量)和DIPEA(3.29mg，25.43μmol，4.43μL,2.0当量)。然后将溶液在20℃搅拌2小时。在完成之后，添加水(6mL)，并且将混合物冻干，以给出白色固体(25mg，粗制)，将其添加在DCM(2.5mL)中，随后添加TFA(3.85g，33.77mmol，2.5mL，2567.52当量)。然后将溶液在20℃搅拌2小时。在完成之后，在减压下去除溶液中的溶剂，以给出粗制品。将该粗制品通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX80*40mm*3μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：5％-45％，30min)纯化。获得作为白色固体的P32(7.2mg，3.60μmol，27.36％收率，90％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.880min，对于C82H112FN25O21，质量计算为901.20，实测900.91[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C1825-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.23min，100％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.37(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(4-(17-羟基-3-氧代-6,9,12,15-四氧杂-2-氮杂十七烷基)苯基)-1-氧代戊烷- 2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基) 氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5- 基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二 十八烷-28-酸(P33)的制备
向P24A(10mg，6.36μmol，1当量)在DMF(0.3mL)中的溶液中添加P33-1(2.96mg，7.63μmol，1.2当量)和DIPEA(1.64mg，12.72μmol，2.22μL,2.0当量)。然后将溶液在20℃搅拌2小时。在完成之后，将反应混合物通过制备型HPLC(TFA条件，柱：Boston Green ODS150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：14％-54％，9min)纯化，以获得作为白色固体的P33(2.0mg，1.13μmol，17.69％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝3.383min，对于C85H120FN21O23，质量计算为911.40，实测911.40[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.96min，95.47％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.38(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(4-(29,29-二甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧代-28-氧杂-2,5,8,11,14, 17,20,23,26-壬氮杂三十烷基)苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧 基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14, 20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15, 18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(P34)的制备
向P32(5mg，2.78μmol，1当量)在DMF(1mL)中的溶液中添加P32-1(1.56mg，3.33μmol，1.2当量)和DIPEA(717.64μg，5.55μmol，9.67e-1μL,2.0当量)。然后将溶液在20℃搅拌2小时。在完成之后，添加水(6mL)，并且将混合物冻干，以给出白色固体(25mg，粗制)，将其添加在DCM(0.2mL)中，随后添加TFA(256.67mg，2.25mmol，166.67μL，958.60当量)。然后将溶液在20℃搅拌2小时。在完成之后，在减压下去除溶液中的溶剂，以给出粗制品。将该粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge BEH C18 100*25mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：10％)纯化。获得作为白色固体的P34(1.72mg，7.63e-1μmol，32.49％收率，90％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.760min，对于C90H124FN29O25，质量计算为1014.98，实测1015.20[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.15min，100％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
3.39(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(4-(17-羟基-3-氧代-6,9,12,15-四氧杂-2-氮杂十七烷基)苯基)-1-氧代戊烷- 2-基)氨基)-3-(4’-(4-叠氮基丁氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基) 氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5- 基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二 十八烷-28-酸(P35)的制备
向P24A(20mg，12.72μmol，1当量)在DMF(0.3mL)中的溶液中添加P35-1(10.75mg，19.08μmol，1.5当量)和DIPEA(3.29mg，25.43μmol，4.43μL,2.0当量)。然后将溶液在20℃搅拌2小时。在完成之后，将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：14％-54％，9min)纯化，以获得作为白色固体的P33(20mg，10.01μmol，78.75％收率，100％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝3.325min，对于C93H136FN21O27，质量计算为998.98，实测999.40[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.88min，100％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
图22描绘了P39合成的顺序。
(3S,6S,9S,12S,15S,21S,27S)-21-((2H-四唑-5-基)甲基)-27-氨基-3-(((S)-1- (((S)-1-氨基-5-(4-(氨基甲基)苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4-羟基苯基)-1-氧代 丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(2-氟苄基)-9,15-双((R)-1-羟乙基)-6-(羟甲基)-28-(4-羟 基苯基)-12,24,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧代-44,7,10,13,16,19,22,25- 八氮杂二十八烷-1-酸(P39)的制备
使用Liberty Lite自动化微波肽合成仪以0.5mmol规模进行肽延伸。在肽合成仪上遵循标准操作：a)去保护：向树脂容器中添加20％哌啶/DMF(5mL)的溶液，在90℃用N2搅拌2min。然后排空容器，并且在20℃用DMF(3mL×3)洗涤。b)偶联(每个氨基酸与5.0当量一式三份反应)：将氨基酸(2.5mmol，5当量)在DMF(5mL)、DIC(2mL)和oxyma(1mL)中的溶液添加至容器中，并且在90℃用N2搅拌10min。对所有氨基酸重复a)和b)。使树脂经历使用TFA混合物(TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解，然后过滤，并且滤液用t-BuOMe稀释以得到沉淀，将其离心(5000R)10min，以给出粗制产物。
对应的aa24-aa25-aa9-aa8-aa7-aa6-aa5-aa4-aa3-Y-aa1b肽基Rink酰胺MBHA树脂如SPPS的一般程序中描述的制备。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Boston Prime C18150*30mm*5μm；流动相：[水(0.05％氢氧化氨v/v)-ACN]；B％：0％-35％，9min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物P39(15mg，9.35μmol，9.35％收率，88％纯度)。将产物通过制备型HPLC(柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：5％-45％，12min)进一步纯化，以给出作为白色固体获得的产物(10mg，6.96μmol，65.51％收率，98.26％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.573min，m/z，对于C65H87FN17O18[M+H]+，计算为1412.63，对于C65H88FN17O18[M+2H]2+，计算为707.81，实测C65H87FN17O18[M+H]+1412.70，实测C65H88FN17O18[M+2H]2+707.30。LCMS条件：如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝4.72min，98.26％纯度LC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
实施例4.接头的合成
4.1PEG接头的制备
下文的方案20描绘了PEGn接头(n＝4、8、12和24)的合成：
方案20
具有n＝8的PEGn接头的合成作为示例提供；以同样的方式制备其他长度的接头。根据以下进行L-1((11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酸)的合成：L.S.Campbell-Verduyn,L.Mirfeizi,A.K.Schoonen,R.A.Dierckx,P.H.Elsinga和B.L.Feringa,Strain-Promoted Copper-Free“Click”Chemistry for 18F Radiolabelingof Bombesin.Angew.Chem.Int.编著，第50卷，第47期，2011,11117-11120。
步骤1：2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酸酯(L2)的合成
向L1(0.35g，1.15mmol，1当量)在DCM(4mL)中的溶液中添加HOSu(158.31mg，1.38mmol，1.2当量)和EDCI(263.70mg，1.38mmol，1.2当量)。将混合物在20℃搅拌1小时。TLC(PE:EtOAc＝1:1)指示反应物完全消耗。将混合物过滤并且浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过柱色谱(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝3/1至1/1)纯化。获得作为白色固体的期望化合物L2(450mg，1.12mmol，97.56％收率)。
步骤2：3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(39-氮杂三环十六烷-(4),1(5),2(6),3(7),31,33-己烯-9-炔-39-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(L4)的合成
向L2(54.68mg，135.90μmol，1.5当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加L3(n＝8，40mg，90.60μmol，1当量)和DIPEA(58.54mg，452.99μmol，78.90μL，5当量)。将混合物在25℃搅拌1小时。LCMS示踪指示反应物完全消耗并且形成期望的质量。将混合物过滤并且通过制备型HPLC(AcOH 0.3％，MeCN/H2O，0％～43％，25mL/min，15min)纯化。获得作为浅黄色油状物的期望的L4(60mg，74.09μmol，81.78％收率，90％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.900min，对于C38H53N2O12，质量计算为729.36,m/z，实测729.3[M+H]+。如下进行反相LC-MS：使用MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤3：(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(43-氮杂三环十六烷-(4),1(5),2(6),3(7),33,35-己烯-11-炔-43-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯(L5)的合成
向L4(20mg，27.44μmol，1当量)在DCM(0.5mL)中的溶液中添加HOSu(6.32mg，54.88μmol，2当量)和DCC(8.49mg，41.16μmol，8.33μL,1.5当量)。将混合物在25℃搅拌1小时。LCMS示踪指示反应物完全消耗并且形成期望的质量。将混合物过滤并且通过制备型HPLC(AcOH 0.3％，MeCN/H2O，0％～65％，18mL/min，15min)纯化。获得作为浅黄色油状物的期望的化合物L5(18mg，17.87μmol，65.13％收率，82％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.920min，对于C42H55N3O14质量计算为825.37,m/z，实测848.2[M+Na]+。如下进行反相LC-MS：使用MERCK,RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
4.2肽接头L8的制备
下文的方案21描绘了SG4-SH肽接头L8的合成：
方案21
参见以下参考文献D.Crich,K.Sana和S.Guo,Amino Acid and PeptideSynthesis and Functionalization by the Reaction of Thioacids with 2,4-Dinitrobenzenesulfonamides.Org.Lett.,第9卷，第22期，2007,4423-4426以及X.Y.Wu,J.L.Stockdill,P.K.Park,J.Samuel和S.J.Danishefsky,Expanding the Limits ofIsonitrile-Mediated Amidations:On the Remarkable Stereosubtleties ofMacrolactam Formation from Synthetic Seco-Cyclosporins.J.Am.Chem.Soc.,第134卷，第4期，2012,2378-2384。
步骤1：(S)-S-((9H-芴-9-基)甲基)6-(叔丁氧基甲基)-2,2-二甲基-4,7,10,13,16-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂十九烷-19-硫代酯(L8-3)
向L8-1(700mg，1.43mmol，1当量)在DMF(7mL)中的溶液中添加4A MOLECULARSIEVE(1g)和L8-2(455.40mg，2.14mmol，1.5当量)，并且将混合物在-20℃搅拌。在15min之后，添加PyBOP(1.12g，2.14mmol，1.5当量)和DIPEA(369.63mg，2.86mmol，498.15μL，2当量)，并且将反应混合物在-20℃搅拌1.5h。LCMS示踪指示反应完全转化。将反应物用EtOAc(30mL)稀释并且过滤，用EtOAc(10mL*2)洗涤滤饼。将滤液用NH4Cl水溶液(20mL)、水(20mL)、盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将剩余物通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～20％MeOH/DCM梯度的洗脱液@30mL/min)纯化，以给出作为浅黄色油状物的L8-3(700mg，814.78μmol，56.98％收率，79.594％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.882min,m/z，对于C29H38N5O6S，计算为584.25[M-Boc+2H]2+，m/z，实测584.3[M-Boc+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)＝7.78(d,J＝7.3Hz,2H),7.66(d,J＝7.2Hz,2H),7.42-7.29(m,4H),4.15(d,J＝5.0Hz,2H),4.04(s,2H),3.92(d,J＝4.3Hz,6H),3.68-3.57(m,4H),3.38-3.35(m,3H),1.46(s,9H),1.19(s,10H)。
步骤2：(S)-6-(叔丁氧基甲基)-2,2-二甲基-4,7,10,13,16-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂十九烷-19-硫代S-酸(L8)
在20℃向L8-3(560mg，818.94μmol，1当量)在THF(7mL)中的溶液中添加哌啶(139.46mg，1.64mmol，161.75μL，2当量)。将反应物在20℃搅拌2h。LCMS示踪指示反应完全转化。向反应物中添加MTBE(50mL)，使白色固体沉淀。将混合物过滤，以给出作为灰白色固体的粗制品。将粗制品通过制备型HPLC(反相柱，40g，0％～35％在水/ACN中的0.4％AcOH，15min)纯化，以给出作为灰白色固体的L8(180mg，252.88μmol，30.88％收率，71.028％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.709min,m/z，对于C15H28N5O6S，计算为406.18[M-Boc+2H]+，m/z，实测406.2[M-Boc+2H]+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
4.3肽接头L9的制备
下文的方案22描绘了SG4-SH肽接头L8的合成：
方案22
糖肽L13-3a根据以下合成：J.J.Du,X.F.Gao,L.M.Xin,Z.Lei,Z.Liu和J.Guo,Convergent Synthesis of N-Linked Glycopeptides via Aminolysis of ω-Asp p-Nitrophenyl Thioesters in Solution.Org.Lett.,第18卷，第19期，2016,4828-4831。L13-1a的合成根据以下进行：Y.A.Naumovich,I.S.Golovanov,A.Y.Sukhorukov和S.L.Loffe,Addition of HO-Acids to N,N-Bis(oxy)enamines:Mechanism,Scope andApplication to the Synthesis of Pharmaceuticals.Eur.J.Org.Chem.,第2017卷，第4期，2017,6209-6227。
步骤1：2,2-二甲基-4,7,10,13-四氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-酸苄酯(L13-2)的合成
在20℃向L13-1a(10g，34.57mmol，1当量)在DMF(60mL)中的溶液中添加HOBt(5.61g，41.48mmol，1.2当量)、DIPEA(22.34g，172.84mmol，30.10mL，5当量)和EDCI(7.95g，41.48mmol，1.2当量)。将混合物在20℃搅拌15min，添加L13-1(11.08g，32.84mmol，0.95当量)并且将反应混合物在20℃搅拌2h。通过LC-MS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余，并且形成期望的产物。将混合物用饱和的NaHCO3溶液(20mL)和盐水(20mL×3)猝灭，收集固体沉淀并且用PE(20mL×2)洗涤，在减压下浓缩，以给出作为白色固体的L13-2(13.5g，29.38mmol，85.00％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.714min，m/z，对于C20H28N4O7Na计算为459.2[M+Na]+，实测459.1；LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.31(br t,J＝5.7Hz,1H),8.19(br t,J＝5.8Hz,1H),8.05(br t,J＝5.3Hz,1H),7.43-7.29(m,5H),7.04-6.95(m,1H),5.13(s,2H),3.90(d,J＝5.9Hz,2H),3.75(d,J＝5.6Hz,4H),3.58(br d,J＝6.0Hz,2H),1.38(s,9H)。
步骤2：2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙酸苄酯盐酸盐(L13-3)的合成
在20℃将HCl/EtOAc(4M，14.80mL，4当量)的溶液逐滴添加至L13-2(7g，14.80mmol，1当量，HCl)。将混合物在20℃搅拌10min。通过LC-MS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余，并且形成期望的产物。将混合物在真空中浓缩并且冻干以提供作为白色固体的L13-3(5.5g，10.33mmol，69.77％收率，70％纯度，HCl)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.479min，m/z，对于C15H21N4O5计算为337.1[M+H]+，实测337.1；LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
步骤3：(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(((S)-16-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3,6,9,12,15-五氧代-1-苯基-2-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十七烷-17-基)氧基)-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(L13-4)的合成
在20℃向L13-3a(2.9g，4.41mmol，1当量)在DMF(20mL)中的溶液中添加HOBt(715.03mg，5.29mmol，1.2当量)、DIPEA(3.42g，26.46mmol，4.61mL，6当量)和DIC(667.82mg，5.29mmol，819.42μL，1.2当量)。将混合物在20℃搅拌15min，添加L13-3(3.29g，6.61mmol，1.5当量，HCl)并且将反应混合物在20℃搅拌12h。通过LC-MS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余，并且形成期望的产物。将混合物用水(40mL)猝灭并且用乙酸乙酯(40mL×2)提取。将有机层用水和盐水(30mL×3)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将剩余物通过快速硅胶色谱(40g硅快速柱，0％～5％MeOH/DCM的洗脱液)纯化25min，总体积1.6L，以提供作为白色固体的L13-4(2.1g，1.72mmol，39.04％收率，80％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝1.937min，m/z，对于C47H54N5O18计算为976.3[M+H]+，实测976.3；LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在2.0分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.48分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.83-7.73(m,2H),7.59(br d,J＝7.5Hz,2H),7.47-7.28(m,10H),7.21-7.03(m,2H),5.87(br d,J＝5.5Hz,1H),5.27-4.89(m,5H),4.61-4.38(m,4H),4.29-3.81(m,13H),2.10-1.98(m,12H)。
步骤4：(S)-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-5-((((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂十八烷-18-酸(L13)的合成
在20℃向L13-4(2.1g，2.15mmol，1当量)在EtOAc(16mL)和MeOH(2mL)中的溶液中添加Pd/C(300mg，430.35μmol，10.35μL，10％纯度，0.20当量)，并且将混合物在H2(4.35mg，2.15mmol，1当量)(15psi)下在20℃搅拌4小时。通过LC-MS监测反应进程，这指示没有起始材料剩余，并且形成期望的产物。将混合物过滤，并且用MeOH(10mL×3)洗涤滤饼，在真空中浓缩，以给出作为白色固体的L13(1.2g，1.29mmol，59.81％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.788min，m/z，对于C40H48N5O18计算为886.3[M+H]+，实测886.3；LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.81(br d,J＝7.4Hz,2H),7.73-7.63(m,2H),7.44-7.37(m,2H),7.36-7.29(m,2H),5.31-5.18(m,1H),5.03(t,J＝9.8Hz,1H),4.94-4.89(m,2H),4.51-4.20(m,5H),4.16-4.08(m,1H),4.06-3.75(m,11H),2.05-1.98(m,12H)。
实施例5.GLP1肽模拟物接头-有效载荷的合成
图26描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP1、LP2、LP3、LP4和LP5的合成。
5.1(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[[4-(124-氮杂三环十六烷-8 (14),9(15),10(16),12(18),68,70(73)-己烯-33-炔-124-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁氧基]-2-乙基-72-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)- 2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2- (1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟 基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP1)的制备
向P9(9.46mg，14.56μmol，1.5当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加L5(n＝4，15mg，9.70μmol，1当量)和DIPEA(6.27mg，48.52μmol，8.45μL，5当量)。将混合物在25℃搅拌1小时。LCMS示踪指示反应物完全消耗并且形成期望的质量。将混合物过滤并通过制备型HPLC(TFA条件；柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：30％-60％，11min)纯化，以给出作为白色固体的LP1(4.84mg，2.23μmol，23.02％收率，96％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.944min，对于C105H135FN20O24质量计算为2078.99,m/z，实测1041.0[M+2H]2+。如下进行反相LC-MS：使用Merck RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
5.2 3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(132-氮杂 三环十六烷-8(14),9(15),10(16),12(18),76,78(81)-己烯-33-炔-132-基)-4-氧代-丁酰 基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁 氧基]-2-乙基-80-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基] 氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S, 3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙 酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰 基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP2)的制备
从P9(18mg，21.79μmol，2.25当量)开始并且使用与实施例1中描述的相同程序，获得作为白色固体的期望的LP2(3.41mg，1.41μmol，14.63％收率，94％纯度)。评价LP2的水溶性并且确定为等于或大于60nM。
LCMS(ESI):RT＝0.949min，对于C113H151FN20O28质量计算为2255.10,m/z，实测1128.9[M+2H]2+。如下进行反相LC-MS：使用MERCK,RP-18e25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝15.273min。如下进行反相HPLC：使用Gemini-NX 5μm 150*4.6mm，C18，110A柱，流量为1.0mL/min，用包含0.12％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.12％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
5.3(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [[4-(140-氮杂三环十六烷-8(14),9(15),10(16),12(18),84,86(89)-己烯-33-炔-140- 基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁氧基]-2-乙基-88-苯基]苯基]甲基]- 2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3- [[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2- [[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5- 基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨 基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP3)的制备
从P9(14.59mg，14.56μmol，1.5当量)开始并且使用与实施例1中描述的相同程序，获得作为白色固体的期望的产物LP3(4.68mg，1.68μmol，17.27％收率，87.1％纯度)。
HPLC条件：RT＝15.120min，如下进行反相HPLC：使用Gemini-NX5u C18 110A 150*4.6mm柱，流量为1.0mL/min，用包含0.1％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
5.4(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(164-氮杂三环十六烷-8,10(16),12(18), 14(108),15(109),110(113)-己烯-33-炔-164-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]丁氧基]-2-乙基-112-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二 甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯 基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲 基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]- 2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP4) 的制备
从P9(20mg，12.94μmol，1.0当量)开始并且使用与实施例1中描述的相同程序，获得作为白色固体的期望的产物LP4(5.58mg，1.76μmol，13.59％收率，93.29％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.912min，对于C145H215FN20O44，质量计算为2961.36[M+H]+、987.514[M+3H]3+，m/z，实测988.3[M+3H]3+。如下进行反相LC-MS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HRMS(ESI)：对于C145H216FN20O44，质量计算为2960.5263[M+H]+、1480.7632[M+2H]2+、987.5088[M+3H]3+，m/z，实测2960.53[M+H]+、1481.26[M+2H]2+、987.8517[M+3H]3+。
5.5 8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1-(((S)- 1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-((1-((1R,8S,9s)-双环 [6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3,17-二氧代-2,7,10,13,16-五氧杂-4,18-二氮杂二十二烷-22- 基)氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)- 14,20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12, 15,18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(LP5)的制备
向P9(12mg，7.76μmol，1当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加L6(8.30mg，15.53μmol，2.0当量)和TEA(1.57mg，15.53μmol，2.16μL,2.0当量)。然后将混合物在20℃搅拌12h。LCMS示踪显示大部分反应物被完全消耗，并且检测到期望的MS。将其通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：0％-55％，45min)纯化。获得作为白色固体的化合物LP5(4mg，2.00μmol，25.75％收率，97％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝4.087min，对于C95H132FN19O24，质量计算为971.5[M+2H]2+，m/z，实测971.5[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm柱，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：(ESI)：Rt＝10.12min，如下进行反相LCMS：使用柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，流量为1.5ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图27描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP6和LP7的合成。
5.6(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[4-(128-氮杂三 环十六烷-8(14),9(15),10(16),12(18),63,65(68)-己烯-33-炔-128-基)-4-氧代-丁酰 基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基] 丁氧基]-2-乙基-67-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁 基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2- [[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3- 氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲 基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP6)的制 备
向烘干小瓶中添加L7(163.54mg，323.48μmol，2.5当量)和P9(200mg，129.39μmol，1当量)。将HOBt(69.93mg，517.56μmol，4当量)、DIPEA(50.17mg，388.17μmol，3当量)在DMF(1mL)中以及I2(39.41mg，155.27μmol，1.2当量)在DMF(1mL)中的储备溶液添加至小瓶中。将反应混合物在15℃搅拌12h。通过LCMS示踪监测反应进程。将混合物过滤，然后通过添加EtOAc(20mL)沉淀。在过滤之后，获得作为浅黄色泡沫的粗制产物保护的G4S-P9(261mg，116.45μmol，90.00％收率，90％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.283min，对于C95H136FN23O25 2+，质量计算为1009.005[M+2H-Boc]2+，m/z，实测1009.5[M+2H]2+。LCMS条件：Flash RP-18e 25-2mm，流量为0.8mL/min，用包含0.02％TFA的10％-80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
向烘干的小瓶中添加保护的G4S-P9(261mg，129.39μmol，1当量)和DCM(5mL)。将TFA(6.70g，58.75mmol，4.35mL，454.08当量)添加到小瓶中。将反应混合物在20℃搅拌2h。通过LCMS监测反应进程。将反应混合物浓缩并通过制备型HPLC(TFA条件；柱：WatersXbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-70％，30min)纯化。获得作为白色泡沫的G4S-P9(206mg，98.61μmol，76.21％收率，100％纯度，2TFA)。
LCMS(ESI):RT＝2.497min，对于C95H136FN23O25 2+，质量计算为930.945[M+2H]2+，m/z，实测931.0[M+2H]2+。LCMS条件：Chromolith Flash RP-RP-C18 25-3mm，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
向烘干小瓶中添加DIBAC-suc-OSu(39.68mg，98.61μmol，1当量)和G4S-P9(206mg，98.61μmol，1当量，2TFA)。将DMF(2mL)和DIPEA(38.23mg，295.83μmol，3当量)添加至小瓶中。将反应混合物在20℃搅拌1h。通过LC-MS监测反应进程。将反应物过滤并通过制备型HPLC(中性条件；柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(10mMNH4HCO3)-ACN]；B％：0％-50％，30min)纯化。获得作为白色泡沫的LP6(112mg，52.13μmol，52.87％收率，100％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.419min，对于C105H133FN24O25 2+，质量计算为1074.49[M+2H]2+，m/z，实测1074.8[M+2H]2+。LCMS条件：Waters Xbridge C18 30*2.0mm，3.5μm。流动相：A)在水中的0.05％NH3H2O；B)ACN。梯度：在5.8min内0％B增加至95％B；在95％B保持1.1min；然后在6.91min时返回至0％B，并且保持0.09min。流量1.0mL/min。
HPLC：RT＝3.58min。HPLC条件：流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2ML/1LNH3*H2O，在5分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在60％保持2分钟；柱：Xbridge Shield RP-18，5μm,2.1*50mm。
1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 8.40(s,1H)7.52(br t,J＝6.82Hz,2H)7.35-7.46(m,3H)7.27-7.34(m,2H)7.19-7.25(m,1H)7.05-7.15(m,4H)6.95(br d,J＝5.75Hz,4H)6.86-6.91(m,1H)6.74-6.82(m,5H)6.70(br d,J＝8.13Hz,1H)4.98(br d,J＝14.51Hz,1H)4.61(br s,1H)4.38-4.46(m,2H)4.29(br s,2H)4.16-4.21(m,1H)4.09-4.12(m,2H)3.89-4.01(m,6H)3.79-3.88(m,10H)3.57-3.77(m,7H)3.28-3.36(m,3H)3.16(br s,4H)3.09(brs,1H)2.82-2.89(m,1H)2.76(br d,J＝3.75Hz,2H)2.61-2.70(m,1H)2.37-2.48(m,6H)2.16(s,6H)1.53-1.81(m,8H)1.28(br d,J＝3.38Hz,3H)1.17-1.22(m,6H)1.11(br d,J＝6.00Hz,6H)0.92(br t,J＝7.44Hz,3H)。
5.7(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(2S)-2-[[4-(128-氮杂三 环十六烷-8(14),9(15),10(16),12(18),63,65(68)-己烯-33-炔-128-基)-4-氧代-丁酰 基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙 酰基]氨基]丁氧基]-2-乙基-67-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲 基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯 基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲 基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]- 2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP7)的 制备
从L8(50mg，32.35μmol，1当量)以及P9(32.71mg，64.70μmol，2当量)开始，使用与实施例6中描述的相同程序获得作为白色固体的LP7(15mg，6.74μmol，53.21％收率，96.47％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.845min,m/z，对于C105H133FN24O25，计算为1075.5[M+2H]2+，m/z，实测1074.6[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝3.55min。流动相：流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.5ML/1LNH3H2O*H2O，在5分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在60％保持2分钟。
图28描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP8、LP9、LP10和LP11的合成。
5.8(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[[4-(2-氮杂三环 [10.4.0.04,9]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基)-4-氧代丁酰基]氨基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2- [[(1S)-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2- [[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑- 5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙 酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基] 氨基]-4-氧代-丁酸(LP8)的制备
向P8(20mg，12.73μmol，1当量)和L9(8.83mg，38.18μmol，3.0当量)在H2O(0.25mL)和t-BuOH(0.5mL)中的溶液中添加CuSO4·5H2O(635.45μg，2.55μmol，0.2当量)和(2R)-2-[(1S)-1,2-二羟乙基]-4-羟基-5-氧代-2H-呋喃-3-甲酸钠(1.01mg，5.09μmol，0.4当量)。将混合物在20℃搅拌1.5h。LCMS示踪显示材料消失，并且主要观察到期望的产物。将绿色溶液过滤，以给出粗制产物。将粗制产物通过反相HPLC(20g硅闪柱，0％～60.1％CH3CN/H2O(0.4％AcOH)梯度的洗脱液@18mL/min)纯化。将期望的流体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的化合物61(15mg，8.24μmol，64.78％收率，99.090％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.764min，对于C23H43N11O6，质量计算为901.95,m/z，实测902.3[M+H]+。LC-MS方法A：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm柱，流量为1.2mL/min，用包含0.75ML/4LTFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)的梯度洗脱。
向61(17mg，9.43μmol，1当量)和DIBAC-suc-OSu(5.05mg，12.55μmol，1.33当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(2.44mg，18.86μmol，3.28μL，2.0当量)。将溶液在15℃搅拌1h。LCMS显示反应完全转化，并且观察到期望的产物。将溶液过滤并通过制备型HPLC(中性条件：柱：Durashell C18(L)100*10mm*5μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：12％-52％，12min)纯化。将期望的流体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的化合物LP8(7.0mg，3.21μmol，30.42％收率，95.745％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝1.337min，m/z，对于C105H135FN22O23，计算为1045.50[M+2H]2+，实测1046.1。LCMS条件：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.8mL/4L NH3·H2O，在2分钟内使用10％-80％(溶剂B)的梯度，并且以1ml/min的流量在80％保持0.48分钟；柱：XBridge C183.5μm2.1*30mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃；
HPLC：RT＝2.868min，流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2mL/1L NH3·H2O，在6分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以0.8ml/min的流量在80％保持2分钟；柱：Xbridge Shield C18，5μm,2.1*50mm。
5.9(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[[(1S,8R)-9-双环[6.1.0] 壬-4-炔基]甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2- 乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧 代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2- [[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁 酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP9)的制备
向化合物61(14.55mg，8.07μmol，1当量)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(BCN-CO-PNP)(5.81mg，18.41μmol，2.28当量)和DIPEA(2.09mg，16.14μmol，2.81μL，2.0当量)。将溶液通过制备型HPLC(FA条件)(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：0％-55％，45min)纯化，以给出作为白色固体获得的LP9(3.6mg，1.79μmol，22.21％收率，98.54％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.040min，对于C97H134FN21O23，质量计算为989.89[M+2H]2+，实测990.6。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm；
HPLC：RT＝9.89min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
5.10(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[(2-环辛-2-炔-1-基氧基乙酰基)氨基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3- [[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2- (1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-3-羟 基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP10)的制备
向61(14mg，7.76μmol，1当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酸酯(5.18mg，18.53μmol，2.39当量)和DIPEA(2.01mg，15.53μmol，2.70μL，2.0当量)。将溶液在20℃搅拌1小时。LCMS显示反应完全转化，并且观察到期望的产物。将混合物用CH3CN稀释，并且将粗制产物通过制备型HPLC(FA条件：柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：5％-55％,35min)纯化。将期望的流体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的LP10(2.6mg，1.26μmol，13.08％收率，95.26％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.805min，m/z，对于C96H134FN21O23，计算为983.99[M+2H]2+，实测984.7。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm。
HPLC：RT＝9.74min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；HPLC：RT＝9.89min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm，5μm。
5.11(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基) 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙 基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代- 乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2- [[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁 酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP11)的制备
在20℃将P8(10mg，6.36μmol，1当量)、抗坏血酸钠(504.18μg，2.54μmol，0.4当量)和CuSO4·5H2O(317.72μg，1.27μmol，0.2当量)在t-BuOH(0.8mL)和H2O(0.4mL)中的混合物搅拌2h。LCMS显示P8被完全消耗。将反应物过滤，以给出剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini NX C18 150*40mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-60％，25min)纯化，以给出作为白色固体的LP11(4.32mg，2.18μmol，34.31％收率)。
LCMS：(ESI)：RT＝3.121min，m/z，对于C94H138FN21O25，计算为990.01[M+2H]2+，m/z，实测990.6[M+2H]2+；流动相：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。
附接HPLC(ES8584-1120-P1C1)。RT＝3.75min，99.72％纯度。HPLC方法：柱：Ultimate XB-C18，3μm，3.0*50mm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4LTFA(溶剂B)，在7分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持0.5分钟。
图29描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP12的合成。
5.12(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(162-氮杂三环十六烷-6(12),7(13),8 (14),10(16),109,111(114)-己烯-31-炔-162-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]丁氧基]-2-乙基-113-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二 甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯 基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[6-(1H-咪唑-5-基)己酰基氨基]-3-(2H-四 唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰 基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP12)的制备
在15℃向P11(30mg，14.65μmol，1当量，TFA)和L11(22.43mg，14.65μmol，1当量)在DMF(1.5mL)中的溶液中添加DIPEA(9.47mg，73.25μmol，12.76μL，5当量)。将混合物在15℃搅拌1h。LCMS示踪显示反应完成。将混合物过滤，以给出作为黄色油状物的粗制品，并且将剩余物通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：0％-80％，30min)纯化，以给出作为白色固体的LP12(25mg，8.18μmol，47.72％收率，95.49％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.970min,m/z，对于C144H217FN19O43，计算为973.18[M+3H]3+，m/z，实测974.0[M+3H]3+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：Rt＝2.53；流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2ML/1L NH3·H2O，在5分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在80％保持2分钟；柱：Xbridge Shield RP-18，5μm，2.1*50mm。
图30描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP13和LP14的合成。
5.13(3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2- [(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基)氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨 基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]- 3-羟基-丙酰基]氨基]-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(157-氮杂三环十六烷-8(14),9(15),10 (16),12(18),104,106(109)-己烯-31-炔-157-基)-4-氧代丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙酰基氨基]丁氧基]-2-乙基-108-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二 甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP13)的制备
在15℃向P4(10mg，6.89μmol，1当量)和L12(10.55mg，6.89μmol，1当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(4.45mg，34.44μmol，6.00μL，5当量)。将混合物在15℃搅拌1h。LCMS显示反应完全转化。将混合物过滤，以给出作为黄色油状物的粗制品，将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30mm，10μm；流动相：[水(10mMNH4HCO3)-ACN]；B％：10％-50％，55min)纯化，以给出作为白色固体的LP13(11mg，3.84μmol，36.67％收率)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.965min,m/z，对于C140H213FN18O44，计算为717.38[M+4H]2+，m/z，实测717.8[M+4H]4+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝3.97；流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2ML/1L NH3·H2O，在5分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在60％保持2分钟；柱：Xbridge Shield RP-18，5μm，2.1*50mm，波长：220nm&215nm&254nm。
5.14(3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2- [(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基)氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨 基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]- 3-羟基-丙酰基]氨基]-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[4-(121-氮 杂三环十六烷-8(14),9(15),10(16),12(18),59,61(64)-己烯-31-炔-121-基)-4-氧代-丁 酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨 基]丁氧基]-2-乙基-63-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基) 丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP14)的制备
向P4(40mg，27.56μmol，1当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加HOBt(14.89mg，110.22μmol，4当量)、DIPEA(10.68mg，82.67μmol，14.40μL，3当量)和L7(34.83mg，68.89μmol，2.5当量)；然后添加在DMF(0.5mL)中的I2(8.39mg，33.07μmol，6.66μL，1.2当量)。将反应混合物在20℃搅拌16小时。向反应物中添加EtOAc(15mL)并且使白色固体沉淀。将混合物离心3min(5000R)以得到固体。然后将固体溶解在H2O(10mL)和CAN(2mL)中。将溶液冻干，以给出作为白色固体的粗制保护的化合物62(59mg，23.01μmol，83.50％收率，75％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.882min，对于C90H130FN21O25，质量计算为1923.94961.9[M+2H]2+，m/z，实测962.5[M+2H]2+；流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在3分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
在0℃向保护的化合物62(59mg，30.68μmol，1当量)在DCM(0.5mL)中的溶液中添加TFA(0.5mL)。然后将混合物加热至20℃并且在20℃搅拌2小时。LCMS示踪显示反应物被完全消耗，并且检测到期望的MS。在30℃在减压下去除溶剂，以给出粗制品。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX C18 75*30mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：0％-60％，35min)纯化，以给出作为白色固体的化合物62(11mg，5.91μmol，13.86％收率，95％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.936min，对于C81H114FN21O23，质量计算为1767.82884.2[M+2H]2+，m/z，实测884.2[M+2H]2+；流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。ESI源，正离子模式；波长220nm&254nm，烘箱温度50℃。
HPLC：RT＝6.05min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃在20℃向化合物62(11mg，6.23μmol，1当量)和DIBAC-suc-OSu(2.76mg，6.85μmol，1.1当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(4.02mg，31.13μmol，5.42μL，5.0当量)。然后将混合物在20℃搅拌2小时。LCMS示踪显示反应物被完全消耗，并且检测到期望的MS。将其通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX C18 75*30mm*3μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：0％-60％，35min)纯化。获得作为白色固体的LP14(10mg，4.62μmol，74.28％收率，95％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.939min，对于C100H127FN22O25质量计算为2054.92,m/z，实测1028.0[M+2H]2+。流动相：在水中的1.5mL/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75mL/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5 C18 20*2.0mm波长：UV 220nm；柱温：50℃。
HPLC：RT＝3.75min流动相：水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，在5分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在60％保持2分钟；柱：Xbridge Shield RP-18，5μm，2.1*50mm；波长UV 220nm,215nm&254nm；柱温：40℃。
图31描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP15和LP16的合成。
5.15(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[4-(134-氮杂 三环十六烷-11(19),12(20),13(21),15(23),69,71(74)-己烯-38-炔-134-基)-4-氧代丁 酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨 基]丁氧基]-2-乙基-73-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-4-(3,5-二甲基苯基)-1-(苯基氨基 甲酰基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯 基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲 基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]- 2-甲基丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP15) 的制备
向烘干小瓶中添加L7(47.33mg，93.62μmol，2.5当量)和P23(65mg，37.45μmol，1当量，TFA)。将HOBt(20.24mg，149.78μmol，4当量)、DIPEA(14.52mg，112.34μmol，19.57μL，3当量)在DMF(0.5mL)中以及I2(11.40mg，44.94μmol，9.05μL，1.2当量)在DMF(2毫升)中的储备溶液添加至小瓶中。将反应混合物在20℃搅拌16h。LCMS示踪显示反应完成。向反应物中添加EtOAc(15mL)并且使白色固体沉淀。将混合物离心3min(5000R)，以给出作为白色固体的粗制产物63(60mg，27.82μmol，74.29％收率和97.06％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.940min，对于C96H132FN23O23，计算为997m/z[M-Boc+3H]2+，m/z，实测997.5m/z[M-Boc+3H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
在20℃将63(60mg，28.66μmol，1当量)在TFA(1mL)和DCM(1mL)中的溶液搅拌2h。LCMS示踪显示反应完成。将反应物在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制品。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-60％，30min)纯化，以给出作为白色固体的64(45mg，22.72μmol，79.27％收率，97.81％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.890min，对于C92H124FN23O23，计算为968.96m/z[M+2H]2+，m/z，实测969.5m/z[M+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
附接HPLC(ES8584-719-P1C1)。RT＝4.18min，97.81％纯度。HPLC方法A：流动相：在1min内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内在水中的5％ACN(0.1％TFA)至100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01min时返回至在水中的1.0％CAN(0.1％TFA)，并且保持2分钟。流量：1.2ml/min。
在18℃向64(40mg，19.50μmol，1当量，TFA)和DIBAC-suc-OSu(7.85mg，19.50μmol，1当量)在DMF(1.5mL)中的溶液中添加DIPEA(12.60mg，97.51μmol，16.98μL，5当量)。将反应物在18℃搅拌2h。LCMS示踪显示反应完成。将粗制品通过制备型HPLC(柱：Waters XbridgePrep OBD C18150*40mm*10μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：0％-50％，35min)纯化，以给出作为白色固体的LP15(27mg，12.07μmol，55.75％收率，99.42％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.948min，对于C111H137FN24O25，计算为1112.51m/z[M+2H]2+，m/z，实测1113.1m/z[M+2H]2+；如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
反相HPLC：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2ML/1L NH3·H2O，在5分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在80％保持2分钟；柱：XbridgeShield RP-18,5μm,2.1*50mm。波长：220nm&215nm&254nm，柱温：40℃。
5.16(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(2S)-2-[[4-(134-氮杂 三环十六烷-11(19),12(20),13(21),15(23),69,71(74)-己烯-38-炔-134-基)-4-氧代-丁 酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基] 丁氧基]-2-乙基-73-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-4-(3,5-二甲基苯基)-1-(苯基氨基甲酰 基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2- [[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3- 氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲 基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP16)的制 备
从P23(70mg，43.16μmol，1当量)、L8(43.64mg，86.32μmol，2当量)和DIBAC-suc-OSu(3.92mg，9.75μmol，1当量)开始，使用与实施例15描述的相同程序制备作为白色固体的LP16(10mg，4.25μmol，34.87％收率，94.53％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.845min，对于C111H137FN24O25，质量计算为1112.51[M+2H]2+，m/z，实测1112.9[M+2H]2+；流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.8mL/4L NH3·H2O，在2分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1ml/min的流量在80％保持0.48分钟；
HPLC：RT＝3.73min，94.53％纯度。流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的2.0ML/4L NH3*H2O，在4分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在60％保持2分钟；
图32描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP17的合成。
5.17(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(2S)-2-[[2- [[2-[[2-[[2-[[4-(144-氮杂三环十六烷-8(14),9(15),10(16),12(18),68,70(73)-己烯- 33-炔-144-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基] 氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3- 羟基-丙酰基]氨基]丁氧基]-2-乙基-72-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4- (3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3- (2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]- 2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰 基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代- 丁酸(LP17)的制备
向烘干的小瓶中添加L7(26.17mg，51.76μmol，2当量)、P9(40.00mg，25.88μmol，1当量)和4A MS(5mg)。将HOBt(6.99mg，51.76μmol，2当量)、DIPEA(5.02mg，38.82μmol，6.76μL，1.5当量)在DMF(0.1mL)中以及I2(3.94mg，15.53μmol，3.13μL，0.6当量)在DMF(0.1mL)中的储备溶液添加至小瓶中。将反应混合物在15℃搅拌48h。通过LC-MS监测反应进程。将混合物过滤，然后通过添加EtOAc(3mL)沉淀。在过滤之后，获得作为白色泡沫的保护的G4S-P9(50mg，22.31μmol，86.20％收率，90％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.907min，对于C95H136FN23O25 2+，质量计算为1009.005[M+2H]2+，m/z，实测1010.4[M+2H]2+。LCMS条件：Merck，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
反相HPLC：RT＝8.87min。HPLC条件：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.12％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
向烘干的小瓶中添加保护的G4S-P9(35mg，17.35μmol，1当量)和DCM(1mL)。将TFA(1.54g，13.51mmol，1mL，778.42当量)添加到小瓶中。将反应混合物在20℃搅拌3h。通过LC-MS监测反应进程。LCMS(ESI):RT＝0.832min，对于C95H136FN23O25 2+，质量计算为930.945[M+2H]2+，m/z，实测931.3[M+2H]2+。LCMS条件：Merck，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。将反应混合物浓缩，以给出作为黄色固体的粗制产物67(35mg，粗制)。
向烘干的小瓶中添加L7(19.02mg，37.61μmol，2当量)和化合物67(35mg，18.81μmol，1当量)。将HOBt(10.16mg，75.23μmol，4当量)和DIPEA(7.29mg，56.42μmol，9.83μL，3当量)在DMF(0.5mL)中以及I2(5.73mg，22.57μmol，4.55μL，1.2当量)在DMF(0.5mL)中的储备溶液添加至小瓶中。将反应混合物在15℃搅拌24h。通过LC-MS监测反应进程。将混合物过滤，然后通过添加EtOAc(6mL)沉淀。在过滤之后，获得作为浅黄色泡沫的粗制产物保护的G4S-G4S-P9(40mg，13.38μmol，71.12％收率，78％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.400min，对于C106H153FN28O31 2+，质量计算为1166.56,m/z，实测1166.9[M+2H]2+。LCMS条件：Merck，RP-18e 25-2mm柱，流量为0.8mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝8.10min。HPLC条件：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.12％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
向烘干的小瓶中添加保护的G4S-G4S-P9(40mg，17.15μmol，1当量)和DCM(2mL)。将TFA(3.08g，27.01mmol，2mL)添加到小瓶中。将反应混合物在20℃搅拌2h。通过LC-MS监测反应进程。将反应物浓缩，以给出剩余物，然后通过制备型HPLC(TFA条件；柱：Waters XbridgePrep OBD C18 150*30mm，10μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-60％，16min)纯化。获得作为白色泡沫的化合物68(15mg，6.62μmol，38.58％收率，96％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.744min，对于C97H137FN28O29 2+，质量计算为1088.505[M+2H]2+，m/z，实测1089.2[M+2H]2+。LCMS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
HPLC：RT＝3.89min。HPLC条件：流动相：在1min内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内在水中的5％ACN(0.1％TFA)至在水中的100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01min时返回至在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)，并且保持两分钟。流量：1.2ml/min。
向DIBAC-suc-OSu(3.37mg，8.36μmol，1.3当量)在DMF(0.3mL)中的溶液中添加化合物68(14mg，6.43μmol，1当量)和DIPEA(4.16mg，32.17μmol，5.60μL，5当量)。将混合物在20℃搅拌2小时。通过LC-MS监测反应进程。将反应混合物用DMSO(2mL)稀释并且通过制备型HPLC(中性条件；柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10μm；流动相：[水(10mMNH4HCO3)-ACN]；B％：0％-60％，55min)纯化。获得作为白色泡沫的LP17(1.73mg，0.65μmol，10.15％收率，93％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.531min，对于C116H150FN29O31 2+，质量计算为1232.05[M+2H]2+，m/z，实测1232.4[M+2H]2+。LCMS条件：流动相：A)在水中的0.05％NH3H2O；B)ACN。梯度：在5.8min内0％B增加至95％B；在95％B保持1.1min；然后在6.91min时返回至0％B，并且保持0.09min。流量1.0mL/min；柱：Waters Xbridge C18 30*2.0mm，3.5μm。
HPLC：RT＝2.17min。HPLC条件：流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.2ML/1LNH3·H2O，在5分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1.2ml/min的流量在80％保持2分钟；柱：Xbridge Shield RP-18，5μm，2.1*50mm。
图33描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP18和LP20的合成。
5.18(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(2S)-2-[3-[[(1S,8R)- 9-双环[6.1.0]壬-4-炔基]甲氧羰基氨基]丙酰基氨基]-3-[(2R,4S,5S)-3,4,5-三羟基-6- (羟甲基)四氢吡喃-2-基]氧基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙 酰基]氨基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基 苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)- 2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基- 3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲 基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP18)的制 备
将L13(22.92mg，25.88μmol，2当量)、PyBOP(13.47mg，25.88μmol，2当量)和DIPEA(6.69mg，51.76μmol，9.01μL，4当量)在DMF(0.1mL)中的溶液在25℃搅拌5分钟。将P9(20mg，12.94μmol，1当量)在DMF(0.1mL)中的溶液添加至该混合物中，将反应物在25℃搅拌5min。将混合物用EtOAc(15mL)稀释，以给出沉淀，将该沉淀离心3min(5000R)，以给出作为白色固体的粗制产物。将剩余物用水(2mL)和ACN(2mL)稀释。将溶液通过冻干干燥，以给出作为白色固体的化合物69(25mg，8.53μmol，65.95％收率，82.384％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝2.376min，m/z，对于C115H148FN23O34，计算为1207.03[M+2H]2+，m/z，实测1207.4[M+2H]2+；流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在3分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。
在25℃向化合物69(20mg，8.29μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加NH2NH2.H2O(488.04μg，8.29μmol，0.2mL,85％纯度，1当量)。将反应物在25℃搅拌1h。LCMS显示反应完全转化。将混合物过滤，以给出剩余物，将该剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：0％-60％，30min)纯化，以给出作为白色固体的化合物70(15mg，7.38μmol，71.28％收率，99.58％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝0.791min,m/z，对于C92H130FN23O28，计算为1011.97[M+2H]2+，m/z，实测1012.2[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用MERCK RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：Rt＝3.47min。流动相：在1min内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内从在水中的5％ACN(0.1％TFA)至100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01min时返回至在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)，并且保持两分钟。流量：1.2ml/min。
将化合物70(18mg，8.90μmol，1当量)和L14(6.88mg，17.79μmol，2当量)在PBS缓冲液(0.45mL,pH＝8.2和DMF(0.9mL)中的溶液在25℃搅拌6h。LCMS显示反应完成。将反应物过滤，以给出剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：0％-60％，35min)纯化，以给出作为白色固体的LP18(7.5mg，3.24μmol，36.45％收率，98.18％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝1.595min，m/z，对于C106H147FN24O31，计算为1135.53[M+2H]2+，m/z，实测1136.0[M+2H]2+；流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在2.0分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.48分钟；Chromolith Flash RP-C18 2.1-30mm。
HPLC：RT＝8.17min，98.18％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm，5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟。
5.19(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(2S)-2-[[4-(153-氮杂 三环十六烷-8(18),10(20),12(22),15(25),77(79),81(85)-己烯-42(44)-炔-153-基)-4- 氧代-丁酰基]氨基]-3-[6-[[4-(153-氮杂三环十六烷-8(18),10(20),12(22),15(25),77 (79),81(85)-己烯-42(44)-炔-153-基)-4-氧代-丁酰基]氧基甲基]-3,4,5-三羟基四氢吡 喃-2-基]氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁氧 基]-2-乙基-84-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨 基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)- 3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代丙酰基] 氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨 基]-3-羟基丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP20)的制备
在25℃向70(7.90mg，18.54μmol，2.5当量)的溶液中添加在DMF(0.5mL)中的DIPEA(4.79mg，37.07μmol，6.46L，5当量)。将反应物在25℃搅拌16h。然后添加H2O(2.5mL)，并且在25℃搅拌2h。LCMS显示反应完成。将反应物过滤，以给出作为黄色溶液的剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.04％NH3H2O+10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：17％-47％，8min)纯化，以给出作为白色固体的LP20(3.7mg，1.52μmol，20.82％收率，95.093％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝1.328min，m/z，对于C111H143FN24O30，计算为1155.52[M+2H]2+，m/z，实测1156.0[M+2H]2+；流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.8mL/4L NH3·H2O，在2分钟内使用10％-80％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1ml/min的流量在80％保持0.48分钟；柱：XBridge C183.5μm 2.1*30mm；波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃。
HPLC：RT＝1.328min，92.31％纯度。HPLC方法A：流动相：在水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)中的0.8mL/4L NH3.H2O，在5分钟内使用0％-60％(溶剂B)的洗脱梯度，并且以1ml/min的流量在60％保持0.48分钟；柱：Xbridge Shield RP18，5μm，2.1*50mm；波长UV 220nm&254nm。
图34描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP19的合成。
5.20(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[4-[4-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[(2-环辛-2-炔-1-基氧基乙酰基)氨基]乙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]丁氧基]-2-乙 基-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2- [[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3- 氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲 基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP19)的制 备
向P9(25mg，16.17μmol，1当量)、L15(16.35mg，32.35μmol，2.0当量)和HOBt(4.37mg，32.35μmol，2.0当量)、DIPEA(3.14mg，24.26μmol，4.23μL，1.5当量)在DMF(0.3mL)中的无色溶液中添加I2(2.87mg，11.32μmol，2.28μL，0.7当量)在DMF(0.25mL)中的溶液。将溶液在20℃搅拌1小时。LCMS示踪显示反应完全转化，并且观察到期望的产物。将溶液用EtOAc(25mL)处理，通过离心5min(5000R)收集形成的沉淀物。将收集的白色固体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的化合物71(45mg，21.11μmol，93.25％收率，94.65％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.880min，m/z，对于C95H126FN23O23，计算为958.97[M-Boc+2H]2+，实测959.0。LC-MS方法A：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm柱，流量为1.2mL/min，用包含0.75ML/4LTFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝4.43min。流动相：在1min内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内从在水中的5％ACN(0.1％TFA)至100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01min时返回至在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)，并且保持两分钟。流量：1.2ml/min。
向71(35mg，17.35μmol，1当量)在DCM(1mL)的溶液中添加TFA(1.54g，13.51μmmol，1mL，778.42当量)。将溶液在20℃搅拌1小时。LCMS示踪显示反应完全转化，并且观察到期望的产物。将溶液在真空中浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过反相HPLC(0.4％AcOH)(20g柱，0％～44％CH3CN/H2O梯度的洗脱液@25mL/min)纯化。将期望的流体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的72(18mg，8.91μmol，51.35％收率，92.108％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.815min，m/z，对于C86H120FN23O23，计算为930.94[M+2H]2+，实测931.2。LC-MS方法A：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm柱，流量为1.2mL/min，用包含0.75ML/4LTFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)的梯度洗脱。
向72(17mg，9.13μmol，1当量)和L16(5.10mg，18.27μmol，2.0当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(2.36mg，18.27μmol，3.18μL，2当量)。将溶液在20℃搅拌1小时。LCMS示踪显示反应完全转化，并且观察到期望的产物。将溶液通过制备型HPLC(FA条件：柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：0％-50％，35min)纯化。将期望的流体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的LP19(8.36mg，4.12μmol，36.34％收率，99.72％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.379min，m/z，对于C96H132FN23O25，计算为1012.98[M+2H]2+，实测1013.7。LCMS条件：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm；
HPLC：RT＝8.70min，流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
图35描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP21的合成。
5.21((3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(163-氮杂三环十六烷-7(13),8 (14),9(15),11(17),108,110(113)-己烯-33-炔-163-基)-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]丙酰基氨基]丁氧基]苯基]-1-氨基甲酰基-丁基]氨基]-1-[[4-(2-乙基-4-甲氧 基-苯基)苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2R,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯 基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲 基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]- 2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP21) 的制备
在氮气下在25℃以一份向P24(15mg，9.69μmol，1当量)和L17(22.25mg，14.54μmol，1.5当量)在DMF(1mL)中的混合物中添加DIPEA(6.26mg，48.46μmol，8.44μL，5当量)。将混合物在25℃搅拌2h。LCMS示踪显示反应完全转化。将反应混合物在真空中浓缩，以给出剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：20％-50％，55min)纯化，以给出纯产物。将产物悬浮在水中(10mL)，将混合物在干冰/乙醇浴中冷冻，并且然后冻干至干燥，以获得作为白色固体的期望的产物LP21(8.2mg，2.70μmol，27.86％收率，97.5798％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝0.924min，对于C144H213FN20O45，质量计算为2961.50[M+H]+、987.167[M+3H]3+，m/z，实测988.8[M+3H]3+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith FlashRP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC条件：RT＝14.496min，反相HPLC如下进行：使用Gemini-NX 5u C18 110A150*4.6mm柱，流量为1.0mL/min，用包含0.1％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图36描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP22的合成。
5.22(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[2-[2-[[4-[202-[[131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142-十二羟 基-126,127,128,129,130-五(羟甲基)-240,241,242,243,244,245,246,247,248,249, 250,251-十二氧杂七环四十烷-125-基]甲基]-187,189,202,203-四氮杂四环十九烷-8 (14),10(16),11(17),12(18),112(114),115(117),123,187(189)-辛烯-203-基]-4-氧代- 丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丁氧基]-2-乙基-116-苯基]苯基]甲基]-2-氧 代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2R,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基- 2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]- 3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟 基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP22)的制备
在N2下在25℃向化合物LP4(5mg，1.69μmol，1当量)在DMF(0.3mL)中的混合物以一整份添加化合物L18(环糊精-N3，4.38mg，4.39μmol，2.6当量)。将混合物在25℃搅拌12小时。LCMS和HPLC示踪显示反应完全。将剩余物通过制备型HPLC(中性：柱：Waters Xbridge150*25 5u；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：20％-50％，7min)纯化，以给出作为白色固体的LP22(1.66mg，4.03e-1μmol，23.88％收率，96.149％纯度)。
HPLC：RT＝11.976min，反相HPLC如下进行：使用Gemini-NX 5u C18 110A 150*4.6mm柱，流量为1.0mL/min，用包含0.1％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS(ESI):RT＝0.877min，对于C74H120N3O30，质量计算为3956.84[M+H]+、1318.95[M+3H]3+，实测1320.2[M+3H]3+。如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图37描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP23的合成。
5.23(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-[4-[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[201-[[130,131,132, 133,134,135,136,137,138,139,140,141-十二羟基-125,126,127,128,129-五(羟甲基)- 239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250-十二氧杂七环四十二烷-124-基] 甲基]-186,188,201,202-四氮杂四环十九烷-7(13),9(15),10(16),11(17),112(114),115 (117),122,186(188)-辛烯-202-基]-4-氧代-丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基] 丁氧基]苯基]丁基]氨基]-1-[[4-(2-乙基-4-甲氧基-苯基)苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨 基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2- [[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁 酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP23)的制备
从LP21(9.3mg，3.10μmol，1当量)和L18(环糊精-N3,3.7mg，3.7μmol，1.2当量)开始，遵循实施例22中的相同程序获得作为白色固体的LP 23(3.5mg，8.84e-1μmol，50.00％收率，100％纯度)。
HPLC条件：RT＝8.14min，如下进行反相LC-HPLC：使用YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm，流量为1.5mL/min，用包含0.1％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.1％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
LCMS(ESI):RT＝0.868min，对于C75H102FN18O17，质量计算为3958.82[M+H]+、1319.61[M+H]3+，实测1321.5[M+H]3+。如下进行反相LC-MS：使用Chromolith Flash RP-18e 25-3mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.04％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.06％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
图38描绘了根据本公开内容的接头-有效载荷LP24的合成。
5.24(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[2-乙基-4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[[(68S,69R,71S)-106,107,108-三氮杂三环十二 烷-72(107),106(108)-二烯-71-基]甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲 基]三唑-120-基]丁氧基]-61-苯基]苯基]甲基]-2-氧代乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S, 3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基) 乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基] 氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨 基]-4-氧代-丁酸(LP24)的制备
将LP9(1.13mg，0.571μmol，1当量)和NaN3(44.54μg，0.685μmol，1.2当量)在DMSO(0.1mL)中的混合物在37℃搅拌16h。LCMS显示反应完成。将粗制产品LP24(1.15mg，0.569μmol，100.00％收率)直接送去进行生物测定，而无任何进一步纯化。
LCMS：(ESI)：RT＝3.561min，m/z，对于C97H135FN24O23，计算为1011.51[M+2H]2+，实测1012.0[M+2H]2+；使用方法D进行反相LC-MS。
图39描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP25)的合成路线
5.25(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[2-乙基-4-[4-[2-[2-[2-[2-[[(65R,66S,68R)-102,103,104-三氮杂三环十二烷- 69(103),102(104)-二烯-68-基]甲氧基羰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基羰基氨 基]丁氧基]-59-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3- (2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]- 2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰 基]氨基]-2-甲基丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁 酸(LP25)的制备
将LP5(1.12mg，0.577μmol，1当量)和NaN3(45.01μg，0.692μmol，1.2当量)在DMSO(0.1mL)中的混合物在37℃搅拌16h。LCMS显示反应完成。将粗制产物LP25(1.14mg，4.42e-1μmol，76.68％收率，77％纯度)直接送去进行生物测定，而无任何进一步纯化。
LCMS：(ESI)：RT＝3.571min，m/z，对于C105H134FN27O25，计算为992.49[M+2H]2+，实测993.0[M+2H]2+；使用方法B进行反相LC-MS。
图40描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP26)的合成路线
5.26(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[2-乙基-4-[4-[[(2S)-3-羟基-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[4-氧代-4-(112,113,114, 131-四氮杂四环十九烷-8(14),10(16),11(17),12(18),61(64),65,73(113),112(114)-辛 烯-131-基)丁酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丙酰基] 氨基]丁氧基]-63-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3- (2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙氨基]-2, 2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基] 氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸 (LP26)的制备
将LP18(1mg，4.65e-1μmol，1当量)和NaN3(36.31μg，0.559μmol，1.2当量)在DMSO(0.1mL)中的混合物在37℃搅拌16h。LCMS显示反应完成。将粗制产品LP26(1.02mg，0.465μmol，100.00％收率)直接送去进行生物测定，而无任何进一步纯化。
LCMS：(ESI)：RT＝3.259min，m/z，对于C105H134FN27O25，计算为1096.0，实测1096.7[M+2H]2+；使用方法F进行反相LC-MS。
图41描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP27和LP28)的合成路线。
5.27(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-(2-氮杂 三环[10.4.0.04,9]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基)-4-氧代-丁酰基] 氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁 氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨 基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟 基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨 基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]- 3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP27)的制备
向LP11(70mg，35.37μmol，1当量)和DIBAC-suc-OSu(19.92mg，49.51μmol，1.4当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(9.14mg，70.74μmol，12.32μL，2当量)。将混合物在25℃搅拌1小时。LCMS显示反应完全转化，并且观察到期望的产物。将溶液过滤并通过制备型HPLC(中性条件：柱：Phenomenex Gemini-NX 80*30mm*3μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：25％-55％，9min)纯化。将期望的流体在冷冻干燥器中冻干，以给出作为白色固体的LP27(24.87mg，10.56μmol，29.8％收率，96.235％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.316min，m/z，对于C113H150FN22O27，计算为2266.09[M+H]+、756.03[M+3H]3+，实测756.3[M+3H]3+，LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
HPLC：RT＝9.17min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
5.28(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]- 1-[[4-[2-乙基-4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-氧代-4-(3,4,5,13-四氮杂四环 [13.4.0.02,6.07,12]十九烷-1(15),2(6),3,7(12),8,10,16,18-辛烯-13-基)丁酰基]氨 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧 基]苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2- [[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3- 氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲 基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP28)的制 备
向LP27(3mg，1.32μmol，1当量)在DMSO(0.5mL)中的溶液中添加NaN3(258.14μg，3.97μmol，3当量)。将混合物在25℃搅拌1小时。LC-MS显示LP27被完全消耗并且检测到一个具有期望质量的主峰。向反应物添加NH4Cl溶液(5mL)。将水性层分离并且用EtOAc(5mL*2)提取。将有机层合并并且用水/盐水＝1/1(400mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以给出作为棕色油状物的产物。将剩余物通过制备型HPLC(TFA条件；柱：WatersXbridge BEH C18 100*25mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：15％-55％，16min)纯化，以给出作为白色固体获得的LP28(1.02mg，4.23e-1μmol，31.99％收率，95.869％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.512min，m/z，对于C113H151FN25O27，计算为2309.11[M+H]+，对于C113H152FN25O27，计算为1155.56[M+2H]2+，实测1155.5[M+2H]2+。LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult5C18 20*2.0mm。
HPLC：RT＝4.024min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
图42描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP29)的合成路线
步骤1：(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-[[[4-(2-氨基-2-氧代-乙氧基)苯基]-(2,4- 二甲氧基苯基)甲基]氨基甲酰基]-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-1-[[4-[4-(4-叠氮基 丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-3-叔丁氧基-2-[[(2S, 3R)-3-叔丁氧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-3-叔丁氧基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-(9H-芴-9-基 甲氧羰基氨基)-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁 酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-4-氧代-丁 酸叔丁酯(LP29-2)的制备
在10min内在25℃向LP29-1A(86.20mg，264.94μmol，1当量)在DMF(10mL)中的溶液中添加HATU(181.33mg,476.89μmol,1.8当量)和DIPEA(136.96mg，1.06mmol，184.59μL，4当量)。然后将溶液添加到LP29-1(1g，264.94μmol，50％纯度，1当量)中，并且混合物在20℃用N2鼓泡2h。在完成之后，将混合物过滤，用DMF(30mL*3)、DCM(30mL*3)洗涤收集的树脂，以给出在固相上的粗制产物，将粗制产物在20％哌啶/DMF(10mL)中溶胀，并且混合物在25℃用N2鼓泡2小时。在完成之后，过滤混合物，并且用DMF(100mL*3)、DCM(100mL*3)洗涤收集的树脂，以给出作为白色固体的结合在树脂上的粗制产物LP29-2(264.94μmol，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝3.923min，m/z，对于C102H141FN19O20，计算为1448.70，实测1450.40[M-4*tBu-C17H17NO4+7H]+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤2：(3S)-4-[[(1S)-2-[[(1S)-1-[[[4-(2-氨基-2-氧代-乙氧基)苯基]-(2,4- 二甲氧基苯基)甲基]氨基甲酰基]-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-1-[[4-[4-(4-叠氮基 丁氧基)-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-3-叔丁氧基-2-[[(2S, 3R)-3-叔丁氧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-3-叔丁氧基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2- (叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-叔丁氧基苯基)丙酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨 基]丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸叔丁酯(LP29-3)的合成
在10min内在25℃向LP29-2A(222.39mg，659.12μmol，5当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加HATU(90.22mg，237.28μmol，1.8当量)和DIPEA(68.15mg,527.30μmol,91.85μL,4当量)。然后将溶液添加到LP29-2(131.82μmol，1当量)，并且混合物在25℃用N2鼓泡1h。在完成之后，将混合物过滤，并且用DMF(50mL*3)、DCM(50mL*3)洗涤收集的树脂，以给出作为黄色固体的结合在树脂上的粗制产物LP29-3(131.82μmol，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝3.990min，m/z，对于C78H102FN19O18，计算为806.88，实测807.3[M-5tBu-Boc-C17H17NO4]2+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤3：(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧 基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2- 乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-[[[4-(2-氨基-2-氧代-乙氧基)苯基]-(2,4-二甲氧 基苯基)甲基]氨基甲酰基]-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3- [[(2S)-3-叔丁氧基-2-[[(2S,3R)-3-叔丁氧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-3-叔丁氧基-2- [[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-叔丁氧基苯基)丙酰基]氨基]- 2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基3-(2- 氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨基]丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸叔丁酯(LP29-4) 的合成
向LP29-3(22.23μmol，1当量)和LP29-3A(17.78mg，43.64μmol，2当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加抗坏血酸钠(21.61mg，109.09μmol，5当量)、TBTA(11.58mg，21.82μmol，1当量)和CuI(20.78mg，109.09μmol，5当量)。将混合物在25℃搅拌2小时。在完成之后，过滤混合物，并且用DMF(50mL*3)、DCM(50mL*3)洗涤收集的树脂，以给出作为绿色固体的结合在树脂上的粗制产物LP29-4(22.23μmol，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝3.085min，m/z，对于C97H139FN20O26，计算为1010.51，实测1011.0[M+2H]2+，LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在0.7分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以1.5mL/min的流量在95％保持0.4分钟；柱：Agilent Pursult 5C18 20*2.0mm。
步骤4：(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧 基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2- 乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧 代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2- [[(2S)-2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基) 丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-(2-氟苯基)-2-甲基-丙酰基]氨 基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP29)的合成
使树脂结合的化合物LP29-4(22.23μmol，1当量)经历通过使用TFA混合物(TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5,10mL)的酸性裂解，将混合物在25℃摇动2小时。在0℃将混合物过滤，并且用t-BuOMe(100mL)稀释滤液，以给出沉淀，将该沉淀离心(5000R)10min。将剩余物通过制备型HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：17％-57％，9min)纯化，以给出作为白色固体的产物LP29(7.55mg，3.69μmol，16.58％收率，98.63％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.133min，m/z，对于C97H139FN20O26质量计算为1010.51,实测1011.0[M+2H]2+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝3.77min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
图43描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP30)的合成路线
5.30(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((2H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-3-(4’- (4-(4-(25-氨基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁氧 基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-(((S)-1-氨基-5-(4-(23-羟基-3-氧代-6,9,12,15, 18,21-六氧杂-2-氮杂二十三烷基)苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨 基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14,20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)- 5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八 烷-28-酸(LP30)的制备
向P35(15mg，7.51μmol，1当量)在H2O(0.09mL)中的溶液中添加CuSO4.5H2O(1.88mg，7.51μmol，1.0当量)、(2R)-2-[(1S)-1,2-二羟乙基]-4-羟基-5-氧代-2-呋喃-3-甲酸钠(1.49mg，7.51μmol，1.0当量)在DMSO(0.03mL)中的溶液，随后是在H2O(0.03mL)中的TBTA(1.99mg，3.76μmol，0.5当量)以及LP30-1(6.12mg，15.02μmol，2.0当量)在DMSO(0.03mL)中的溶液。将混合物在30℃搅拌2.5小时。LCMS显示检测到期望的MS。将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Waters X-bridge BEH C18 100*25mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：5％-42.5％，12min)纯化，以获得作为白色固体的LP30(2mg，8.15e-1μmol，10.85％收率，98％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.628min，对于C112H174FN22O35，质量计算为2406.23[M+H]+、802.74[M+3H]3+，实测802.20[M+3H]3+。LC-MS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6.0分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate3μm，C18,2.1*30mm。波长：UV 220nm&254nm；柱温：50℃。
HPLC：RT＝6.32min，98％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
图44描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP31)的合成路线
5.31(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2- 氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙 氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰 基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3- (2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]- 2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰 基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代- 丁酸(LP31)的制备
向P8(40mg，25.45μmol，1当量)和LP31-1(29.71mg，50.90μmol，2当量)在DMSO(0.1mL)和H2O(0.4mL)中的溶液中添加TBTA(6.75mg，12.72μmol，0.5当量)、CuSO4.5H2O(6.35mg，25.45μmol，1当量)和抗坏血酸钠(5.04mg，25.45μmol，1当量)。将混合物在37℃搅拌4小时。LC-MS显示检测到期望的质量。将绿色溶液过滤，以给出粗制产物。将剩余物通过制备型HPLC(TFA条件；柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：23％-53％，10min)纯化，以获得作为黄色胶状物的LP31(批次1：11.59mg，5.21μmol，20.48％收率，96.94％纯度)和(批次2：11.13mg，4.95μmol，19.45％收率，95.86％纯度)。
批次1：LCMS(ESI):RT＝3.160min，m/z，对于C102H153FN21O29，计算为2155.10[M+H]+，对于C102H154FN21O29，计算为1078.05[M+2H]2+，实测1078.6[M+2H]2+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.48min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
批次2：LCMS(ESI):RT＝3.147min，m/z，对于C102H153FN21O29，计算为2155.10[M+H]+，对于C102H154FN21O29，计算为1078.05[M+2H]2+，实测1078.6[M+2H]2+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.48min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm，5μm。
图45描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP32)的合成路线
5.32(2S)-2-[[(2S)-3-[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙 氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基- 苯基]苯基]-2-[[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)- 3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧 代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基- 丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]- 5-(3,5-二甲基苯基)戊酸(LP32)的制备
向LP31-1(35mg，22.25μmol，1当量)在H2O(1mL)中的溶液中添加CuSO4.5H2O(5.56mg，22.25μmol，1当量)和NaVc(4.41mg，22.25μmol，1当量)的溶液、TBTA(5.90mg，11.13μmol，0.5当量)的溶液以及P41(18.14mg，44.51μmol，2当量)在DMSO(0.25mL)中的溶液。将混合物在40℃搅拌12小时。将反应混合物用H2O(3mL)和ACN(2mL)稀释，然后将混合物过滤。将滤液通过制备型HPLC(柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(TFA)-ACN]；B％：20％-60％，10min)纯化，以给出LP31(1mg，0.46μmol，10.11％收率，91％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.910min，m/z，对于C94H136FN20O26，计算为991.05[M+H]+，实测990.9[M+H]+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝7.56min；流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在100％保持5分钟；柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm。
图46描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP33)的合成路线
步骤1：(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(4S)-5- 叔丁氧基-4-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基] 甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3- [[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2- (1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟 基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP33-2)的合成
向LP11(10mg，5.05μmol，1当量)和LP33-1(2.9mg，5.5μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(1.96mg，15.16μmol，2.64μL，3当量)。将混合物在20℃搅拌12小时。LC-MS显示LP11被完全消耗并且检测到一个具有期望质量的主峰。LCMS(ESI):RT＝4.030min，m/z，对于C118H163O30N22F，计算为796.6[M+3H]3+，实测796.5。流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV220nm，254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。将反应物通过制备型HPLC(柱：O-phenomenexclarity RP 150*10mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：20％-70％，20min)纯化，以给出产物LP33-2(8mg，3.12μmol，61.70％收率，93％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.003min，m/z，对于C118H163O30N22F，计算为1194.17[M+2H]+/2，实测1194.3。流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm，254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
步骤2：((3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(4S)-4- 氨基-5-叔丁氧基-5-氧代戊酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲 酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2- [[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨 基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁 酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧 代-丁酸(LP33-3)
向LP32-2(8mg，3.35μmol，1当量)在THF(0.5mL)中的溶液中添加N-乙基乙胺(2.45mg，33.52μmol，3.45μl,10当量)。将混合物在20℃搅拌3小时。LC-MS显示LP32-3被完全消耗，并且检测到一个具有期望质量的主峰。LCMS(ESI):RT＝3.070min，m/z，对于C118H153O28N22F，计算为1082.5[M+2H]2+，实测1082.9。流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm，254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。将反应混合物在减压下浓缩，以给出作为无色油状物的LP33-3(7mg，粗制)。
步骤3：(2S)-2-氨基-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[4-[4-[4-[(2S)-3- [[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-[[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-2- [[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑- 5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙 酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基] 氨基]丙酰基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3-乙基-苯氧基]丁基]三唑-4-基]甲氧基]乙氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-5-氧代-戊酸(LP 33)
向LP33-3(7mg，3.23μmol，1当量)在DCM(0.5mL)中的溶液中添加TFA(770.00mg，6.75mmol，500.00μl,2088.06当量)。将混合物在20℃搅拌1小时。LC-MS显示LP32-4被完全消耗，并且检测到一个具有期望质量的主峰。LCMS(ESI):RT＝2.977min，m/z，对于C99H145O28N22F，计算为1054.52[M+2H]2+，实测1054.9。流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm，254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。将反应混合物过滤，以给出剩余物。将剩余物通过制备型HPLC(柱：O-phenomenex clarity RP 150*10mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：15％-65％，25min)纯化，以给出作为白色固体的产物LP33(2.1mg，9.66e-1μmol，29.87％收率，97％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝2.950min，m/z，对于C99H145O28N22F，计算为1054.52[M+2H]+/2，实测1054.9。流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；波长：UV 220nm，254nm；柱温：50℃；MS电离：ESI。
UPLC RT＝3.277min，流动相：在水中的0.05％TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.05％TFA(溶剂B)，在5分钟内使用洗脱梯度5％-95％(溶剂B)，并且以0.6mL/分钟的流量在95％保持3分钟；柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm,2.1x100mm。
图47描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP34)的合成路线
步骤1：[(2-氯苯基)-二苯基-甲基]2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酰基]氨 基]乙酸酯(LP34-2)的制备
将LP34-1(20g，21.01mmol，32.8％纯度，1当量)在DMF(200mL)中的混合物摇动30min，并且添加2-[[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酰基]氨基]乙酸(37.23g，105.06mmol，5当量)和DIPEA(27.16g，210.11mmol，36.60mL，10当量)在DMF(200mL)中的溶液。将所得混合物在20℃摇动12h。将所得混合物在20℃摇动12h。向混合物添加MeOH(100mL)并且摇动另外2h。将粗制产物WUXI-262-2(26.68g，粗制)作为黄色固体用于下一步骤，而无进一步纯化。
步骤2：(4S)-4-[[(2S)-1-[(2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]- 5-[[(1S,2R)-1-[[2-(羧甲基氨基)-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2-羟基-丙基]氨基]-5-氧 代-戊酸(LP34-3)的制备
在Liberty Lite自动化微波多肽合成仪上进行固相多肽合成。将LP34-2树脂(0.43mmol,1当量)根据标准用DMF(10mL)溶胀300s。在肽合成仪上遵循标准操作：a)去保护：向树脂容器中添加20％哌啶/DMF(5mL)的溶液，在90℃用N2搅拌2min。然后排空容器，并且在20℃用DMF(3mL×3)洗涤。b)偶联(每个氨基酸与5.0当量一式三份反应)：将氨基酸(2.5mmol，5当量)在DMF(5mL)、DIC(2mL)和oxyma(1mL)中的溶液添加至容器中，并且在90℃用N2搅拌10min。对所有氨基酸重复a)和b)。使树脂经历通过使用TFA混合物(TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解，然后过滤，并且将滤液用t-BuOMe稀释，以给出沉淀物，将沉淀物离心(5000R)10min，以获得作为白色固体的产物P34-3(0.6g，粗制，TFA)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)13.13-11.71(m,2H),8.52-7.97(m,7H),7.85-7.59(m,1H),5.06(br s,1H),4.48-4.28(m,2H),4.26-4.16(m,1H),4.12(br s,1H),4.04-3.94(m,1H),3.90-3.68(m,5H),2.35-1.72(m,9H),1.64-1.44(m,2H),1.03(d,J＝6.3Hz,3H),0.96-0.87(m,6H)。
步骤3：(4S)-5-[[(1S,2R)-1-[[2-(羧甲基氨基)-2-氧代-乙基]氨基甲酰基]-2- 羟基-丙基]氨基]-4-[[(2S)-1-[(2S)-4-甲基-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-丙-2-炔氧基 乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]戊酰基]吡咯烷-2- 羰基]氨基]-5-氧代-戊酸(LP34-5)的制备
向LP34-3(45mg，65.54μmol，1当量，TFA)和LP34-4(36.54mg，65.54μmol，1当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(16.94mg，131.07μmol，22.83μl，2当量)。将溶液在20℃搅拌1h。LCMS显示观察到了期望的产物。(ESI)：RT＝2.455min，对于C47H77N19O19N6质量计算为992.08[M+H]+，实测991.6[M+H]+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate3μm，C18,2.1*30mm；将混合物用CH3CN(2mL)稀释。将剩余物通过制备型HPLC(TFA条件；柱：Welch XtimateC18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，10min)纯化。获得作为无色油状物的LP34-5(50mg，49.54μmol，75.59％收率，98.2％纯度)，通过LCMS确认：ES17478-97-P1D2，HPLC：ES17478-97-p1C1和HNMR：ES17478-97-P1B1。
(ESI)：RT＝3.158min，对于C47H77N19O19N6，质量计算为992.08[M+H]+，实测991.6[M+H]+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度0％-60％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate3μm，C18，2.1*30mm；
HPLC：RT＝3.69min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度1％-100％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在100％保持5分钟；柱：Ultimate XB-C18，3μm,3.0*50mm。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.20-8.06(m,4H),7.61(d,J＝8.0Hz,1H),4.62-4.50(m,1H),4.34(br dd,J＝4.4,8.0Hz,1H),4.31-4.24(m,1H),4.19(dd,J＝4.0,8.0Hz,1H),4.14(d,J＝2.4Hz,2H),4.04-3.96(m,1H),3.82-3.73(m,4H),3.60-3.47(m,34H),2.41-2.25(m,4H),1.99-1.82(m,4H),1.80-1.69(m,1H),1.67-1.56(m,1H),1.50-1.35(m,2H),1.32-1.22(m,1H),1.03(d,J＝6.4Hz,3H),0.88(t,J＝7.2Hz,6H)。
步骤4：(4S)-4-[[(2R)-1-[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[5-[4-[4- [(2S)-3-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-[[(2S)-3-羧基-2- [[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2- (1H-咪唑-5-基)乙氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基] 氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基- 丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3-乙基-苯氧基]戊基]三唑-4-基]甲氧 基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]-4-甲基-戊酰 基]吡咯烷-2-羰基]氨基]-5-[[(1S,2R)-1-[[2-(羧甲基氨基)-2-氧代-乙基]氨基甲酰 基]-2-羟基-丙基]氨基]-5-氧代-戊酸(LP34)的制备
向P8(15mg，9.54μmol，1当量)、LP34-5(19.00mg，19.17μmol，2.01当量)在DMSO(0.8mL)和H2O(0.8mL)中的溶液中添加CuSO4.5H2O(2.38mg，9.54μmol，1当量)、抗坏血酸钠(1.89mg，9.54μmol，1当量)和1-(1-苄基三唑-4-基)-N,N-双[(1-苄基三唑-4-基)甲基]甲胺(2.5mg，4.77μmol，0.5当量)。将所得混合物在25℃搅拌3h。LCMS显示观察到了期望的产物。(ESI)：RT＝3.677min，对于C120H175N26O36FH，质量计算为2562.25[M+H]+、1282.6[M+2H]2+，实测1282.2[M+2H]2+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4LTFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate3μm，C18,2.1*30mm；将混合物用MeOH(2mL)稀释，过滤并且将滤液送至制备型HPLC。将剩余物通过制备型HPLC(TFA条件)纯化。柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：28％-58％,8min。获得作为白色固体的LP34(8.9mg，3.33μmol，34.85％收率，96.3％纯度)。
LCMS RT＝3.682min，对于C120H175N26O36FH，质量计算为2562.25[M+H]+、1282.6[M+2H]2+，实测1282.2[M+2H]2+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate3μm，C18，2.1*30mm。
HPLC：RT＝4.34min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度1％-100％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在100％保持5分钟；柱：Ultimate XB-C18，3μm,3.0*50mm。
图48描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP35)的合成路线
(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(4S)-4-[[(2S)- 2-[[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-甲基-戊酰基]氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-5-[[2- [[(1S)-2-(羧甲基氨基)-1-(羟甲基)-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-5-氧代- 戊酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑- 1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基) 丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S, 3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰 基]氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基] 氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP35)的制备
LP11(6.0mg，2.72μmol，1.0当量,2TFA)和PBS缓冲液(无K，100mM，pH＝7.20)(7.2mL)的溶液测量pH为7.2。添加LP35-1(9.62mg，13.59μmol，5.0当量)和MTG(Ajinomoto-TI，51.6mg)。将所得混合物在37℃搅拌16h。通过LCMS监测反应进程。在完成之后，将反应混合物用AcOH水溶液(1％v/v,7.2mL)猝灭。获得的固体用DMF/H2O(3mL,1/1)冲洗，并且然后通过制备型HPLC(柱：O-Xbridge C18 150*10mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：10％-65％，20min)纯化，以获得作为白色固体的LP35(2.62mg，0.926μmol，34.1％收率，98.3％纯度，TFA盐)。
LCMS：(ESI)：RT＝3.62min，m/z，对于C126H184FN27O36，计算为1335.17[M+2H]2+，实测1335.6；在220nm处纯度为100％。LCMS条件：Xtimate C18 2.1*30mm，3μm；在水中的1.5mL/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75mL/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8mL/min的流量在80％保持0.5分钟。
UPLC：RT＝7.15min，在220nm处纯度为98.38％。UPLC方法：Waters ACQUITY UPLCBEH C18 1.7μm,2.1*100mm；在1L水中的0.05％TFA(溶剂A)和在1L乙腈中的0.05％TFA(溶剂B)，在11分钟内使用洗脱梯度3％-100％(溶剂B)，并且以0.4mL/分钟的流量在100％保持4分钟。
图49描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP36、LP37、LP38、LP39、LP40、LP41)的合成路线。
5.36(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[[[(2S)-2-[[2-[[2-[[2-(2-氨基乙酰基) 氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]甲基]三唑-1-基] 丁氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基] 氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S, 3R)-3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙 酰基]氨基]-3-(1H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰 基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP36)的制备
在Liberty Lite自动化微波多肽合成仪上进行固相多肽合成。将LP36-1(0.43mmol,1当量)根据标准用DMF(10mL)溶胀300s。在肽合成仪上遵循标准操作：a)去保护：向树脂容器中添加20％哌啶/DMF(5mL)的溶液，在90℃用N2搅拌2min。然后排空容器，并且在20℃用DMF(3mL×3)洗涤。b)偶联(每个氨基酸与5.0当量一式三份反应)：将氨基酸(2.5mmol，5当量)在DMF(5mL)、DIC(2mL)和oxyma(1mL)中的溶液添加至容器中，并且在90℃用N2搅拌10min。对所有氨基酸重复a)和b)。使树脂经历使用TFA混合物(TFA/TIPS/H2O＝95:2.5:2.5)的酸性裂解，然后过滤，并且滤液用t-BuOMe稀释以得到沉淀，将其离心(5000R)10min，以给出粗制产物。
LP36如SPPS的一般程序中描述的制备。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：WelchXtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：0％-40％，15min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物LP36(13.9mg，6.25μmol，1.44％收率，97.58％纯度，2TFA)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.715min，m/z，对于C89H123FN26O23，计算为971.46，[M+2H]2+；实测971.9[M+2H]2+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RPC1825-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝6.62min。HPLC条件：流动相：在1分钟内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内在水中的5％ACN(0.1％TFA)至100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01分钟时返回至在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)，并且保持两分钟。流量：1.2ml/min。柱：Ultimate XB-C18，3μm,3.0*50mm。
HRMS(ESI):m/z，对于C89H121FN26O23，计算为1941.91[M+H]+、971.46[M+2H]2+，实测1942.9299[M+H]+、971.9736[M+2H]2+。
UPLC：RT＝5.824min。条件：流动相：在1L水中的0.05％TFA(溶剂A)和在1L乙腈中的0.05％TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度30％-80％(溶剂B)，并且以0.4mL/分钟的流量在80％保持5分钟；柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm，2.1*100mm；
5.37LP37如与LP36相同地获得。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Welch XtimateC18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：0％-40％，15min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物LP37(5mg，2.50μmol，1.25％收率，97％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.800min，对于C89H121FN26O23，质量计算；971.45[M/2+H]+，实测971.0；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RPC1825-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝6.61min。流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；柱：WELCH Ultimate LP-C18 150*4.6mm 5μm；波长：UV 220nm&215nm&254nm；柱温：40℃。
HRMS-TOF：C89H122N26O23F[M+H]＝1942.9573。流动相：在水中的0.1％FA(溶剂A)和在ACN中的0.051％FA(溶剂B)；洗脱梯度：在1.3分钟内5％-95％(溶剂B)，并且以1.2ml/分钟的流量在95％保持0.7分钟；柱：Agilent Poroshell HPH-C182.7μm，2.1*50mm；离子源：AJS ESI源；离子模式：正；雾化气体：氮气；干燥气体(N2)流量：8L/min；雾化器压力：35psi；气体温度：325℃；鞘气温度：350℃；鞘气流：11L/min；毛细管电压：3.5KV；碰撞电压：300V。
UPLC：RT＝4.595min，质量计算。流动相：在1L水中的0.05％TFA(溶剂A)和在1L乙腈中的0.05％TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度0％-95％(溶剂B)，并且以0.6mL/分钟的流量在95％保持4分钟；柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 2.1*50mm，1.8μm；柱温：40℃。
5.38LP38如与LP36相同地获得。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Welch X timateC18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，15min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物LP38(52.17mg，8.87μmol，2.53％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.723min，对于C96H134FN29O27[M+2H]2+，质量计算为1071.99，对于C96H135FN29O27[M+3H]3+，质量计算为714.99；实测1072.40[M+2H]2+、实测715.30[M+3H]3+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C18 25-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC RT＝9.00min，95％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；
5.39LP39如与LP36相同地获得。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Welch XtimateC18 100*40mm*3μm；流动相：[柱：Waters X-bridge BEH C18 100*25mm*5μm；流动相：[水(0.05％NH3H2O)-ACN]；B％：5％-32％，11min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物LP39(20mg，8.75μmol，2.50％收率，95％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.711min，对于C97H135FN30O27[M+2H]2+，质量计算为1085.49，对于C97H136FN30O27[M+3H]3+，质量计算为724.30；实测1085.90[M+2H]2+、实测725.30[M+3H]3+；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RP-C1825-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC RT＝8.99min，95％纯度。HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；
5.40 LP40如与LP36相同地获得。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：6％-46％，20min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物LP40(3.5mg，1.38μmol，3.94e-1收率，97.99％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.740min，对于C108H152FN35O33[M+2H]2+，质量计算为1243.05，对于C108H153FN35O33[M+3H]3+，质量计算为829.03；实测829.4[M+2H]2+、实测1243.30[M+3H]3；如下进行反相LCMS：使用X Bridge C18 3.5μm 2.1*30mm，流量为0.8ml/min，用10％至80％乙腈(溶剂B)和在水中的NH3·H2O(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC RT＝6.50min，纯度97.99％；HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A 150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟；
5.41LP41如与LP36相同地获得。将粗制产物通过制备型HPLC(柱：Welch XtimateC18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：6％-46％，20min)纯化，以获得作为白色固体的纯产物LP41(4.5mg，1.89μmol，0.54％收率，98.52％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝2.590min，对于C103H145FN32O31[M+2H]2+，质量
计算为1173.21，对于C103H146FN32O31[M+3H]3+，质量计算为782.47；实测1172.90[M+2H]2+、实测782.30[M+3H]3；如下进行反相LCMS：使用X Bridge C18 3.5μm 2.1*30mm，流量为0.8ml/min，用10％至80％乙腈(溶剂B)和在水中的NH3·H2O(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC RT＝6.54min，纯度98.52％；HPLC方法A：柱：YMC-Pack ODS-A150*4.6mm,5μm；在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ml/min的流量在80％保持5分钟。
图50描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP42)的合成路线
步骤1：(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[[[(2S)-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[2- [2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[(18-叔丁氧基-18-氧代-十八烷酰基)氨基]-5-氧 代-戊酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨 基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]甲基]三唑-1-基]丁 氧基]-2-乙基-苯基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨 基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)- 3-羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰 基]氨基]-3-(1H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基] 氨基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP42-2)的制备
向LP42-1(45.75mg，54.07μmol，1.5当量)和HATU(16.45mg，43.25μmol，1.2当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(13.98mg，108.13μmol，18.83μL，3当量)。将混合物在20℃搅拌0.1小时。添加LP36(70mg，36.04μmol，1当量)并且将混合物在20℃搅拌1小时。LCMS显示反应完全转化。将反应混合物逐滴添加到MTBE(40mL)中。通过离心收集沉淀的黄色固体。获得作为浅黄色固体的LP42-2(110mg，25.49μmol，70.71％收率，64.18％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.670min，m/z，对于C132H199FN29O35，计算为1385.23[M+2H]2+；m/z实测1385.8；LCMS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。柱：Xtimate C 18 2.1*30mm，3μm。
步骤2：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(1S)-2-[[1-[4- [4-[4-[(2S)-3-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-[[(2S)-3-羧 基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2- [[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(1H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁 酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3-乙基-苯氧基]丁 基]三唑-4-基]甲基氨基]-1-(羟甲基)-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代- 乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨 基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八烷酸 (LP42)的制备
向LP42-2(110mg，25.49μmol，64.18％纯度，1当量)在DCM(1mL)中的溶液中添加TFA(1.54g，13.51mmol，1mL，529.95当量)。将混合物在20℃搅拌1小时。LCMS显示反应完全转化。将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：10％-50％，40min)纯化，以给出作为白色固体的期望的化合物LP42(24mg，8.68μmol，17.03％收率，96.11％纯度)。
LCMS：(ESI)：Rt＝3.943min，m/z，对于C124H184FN29O35，计算为1329.17，[M+2H]2+；m/z，实测1329.6；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RPC1825-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝8.52min。HPLC条件：流动相：在1分钟内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内从在水中的5％ACN(0.1％TFA)至在水中的100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01分钟时返回至在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)，并且保持两分钟。流量：1.2ml/min。柱：Ultimate XB-C 18，3μm，3.0*50mm。
HRMS(ESI):m/z，对于C124H183FN29O35，计算为2657.33[M+H]+、1329.665[M+2H]2+，实测2657.33[M+H]+、1329.6703[M+2H]2+。
UPLC：RT＝5.411min。条件：流动相：在1L水中的0.05％TFA(溶剂A)和在1L乙腈中的0.05％TFA(溶剂B)，在6分钟内使用洗脱梯度0％-95％(溶剂B)，并且以0.4mL/分钟的流量在95％保持4分钟；柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm,2.1*100mm。
图51描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP43)的合成路线
步骤1：(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[[[2-[[2-[[2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[2- [[2-[[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[(18-叔丁氧基-18-氧代-十八烷 酰基)氨基]-5-氧代-戊酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基] 氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]乙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯 基]苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2-氧代-乙基] 氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2- [[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(1H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁 酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP43-1)的制备
向LP42-1(41mg，18.89μmol，1当量)和HATU(8.62mg，22.67μmol，1.2当量)在DMF(0.3mL)中的溶液中添加DIPEA(7.32mg，56.67μmol，9.87μL，3当量)。将混合物在20℃搅拌0.1小时。添加LP39(23.98mg，28.34μmol，1当量)并且将混合物在20℃搅拌1.5小时。LCMS显示反应完全转化。将反应混合物逐滴添加到MTBE(40mL)中。通过离心收集沉淀的黄色固体。LP43-1(80mg，12.56μmol，66.49％收率，47.08％纯度)作为浅黄色固体。
LCMS(ESI):RT＝4.603min，m/z，对于C140H213FN33O39，计算为999.85[M+3H]3+；m/z，实测1000.3；LCMS条件：流动相：在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4LTFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟。柱：Xtimate C 18 2.1*30mm，3μm。
步骤3：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[(1S)-2-[[2-[[2- [[2-[[2-[[1-[4-[4-[4-[(2S)-3-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨 基]-2-[[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3- 羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基] 氨基]-3-(1H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨 基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3- 乙基-苯氧基]丁基]三唑-4-基]甲基氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧 代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-1-(羟甲基)-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨 基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧 基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代- 十八烷酸(LP43)的制备
向LP43-1(80mg，12.56μmol，47.08％纯度，1当量)在DCM(0.7mL)中的溶液中添加TFA(2.31g，20.26mmol，1.5mL，1612.83当量)。将混合物在20℃搅拌3小时。LCMS显示反应完全转化。将剩余物通过制备型HPLC(柱：O-phenomenex clarity RP 150*10mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：30％-52％，20min)纯化，以提供作为白色固体的期望的化合物LP43(1.8mg，0.571μmol，4.55％收率，91.60％纯度)。
LCMS：(ESI)：RT＝3.883min，m/z，对于C132H196FN33O39，计算为1443.21，[M+2H]2+；m/z，实测1443.8；如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash RPC1825-3mm，流量为0.8ml/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
HPLC：RT＝8.30min。HPLC条件：流动相：在1分钟内在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)至在水中的5％ACN(0.1％TFA)；然后在5分钟内从在水中的5％ACN(0.1％TFA)至在水中的100％ACN(0.1％TFA)；在100％ACN(0.1％TFA)保持2分钟；在8.01分钟时返回至在水中的1.0％ACN(0.1％TFA)，并且保持两分钟。流量：1.2ml/min。柱：Ultimate XB-C 18，3μm，3.0*50mm。
HRMS(ESI):m/z，对于C132H195FN33O39，计算为2885.42[M+H]+、1442.21[M+2H]2+，实测1442.21[M+H]+、1443.7161[M+2H]2+。
UPLC：RT＝5.316min。条件：流动相：在1L水中的0.05％TFA(溶剂A)和在1L乙腈中的0.05％TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度0％-95％(溶剂B)，并且以0.4mL/分钟的流量在80％保持5分钟；柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm，2.1*100mm。
图52描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP44)的合成路线
步骤1：(8S,14S,17S,20S,23S,26S)-8-((1H-四唑-5-基)甲基)-26-(((S)-1- (((S)-1-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-3-(4’-(4-(4-((S)-60-(叔 丁氧基羰基)-81,81-二甲基-39,48,57,62,79-五氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32, 35,41,44,50,53,80-十七氧杂-38,47,56,61-四氮杂八十烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁 氧基)-2’-乙基-[1,1’-联苯]-4-基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酰基)-17-(2-氟苄基)-14, 20-双((R)-1-羟乙基)-23-(羟甲基)-1-(1H-咪唑-5-基)-5,5,17-三甲基-4,6,9,12,15, 18,21,24-八氧代-3,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十八烷-28-酸(LP44-2)的合成
向LP30(40mg，18.56μmol，1当量)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIPEA(7.2mg，55.68μmol，10μL，3当量)和LP44-1(22mg，22.27μmol，1.2当量)。将所得混合物在20℃搅拌0.5h。LCMS显示反应完成，并且观察到期望的产物。将混合物倒入冰冷的MTBE中，然后过滤，并且将滤饼在真空中干燥。获得作为无色油状物的LP44-2(55mg，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝6.396min，对于C145H230FN24O41，质量计算为2982.66[M+H]+、746.44[M+4H]4+，实测747.2[M+4H]4+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm。
步骤2：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2- [2-[[1-[4-[4-[4-[(2S)-3-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-(3,5-二甲基苯基)丁基]氨基]-2- [[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[[2- [[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨基]-3-(1H- 四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]-3-羟基-丁 酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3-乙基-苯氧基]丁 基]三唑-4-基]甲氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基] 乙氧基]乙基氨基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八烷酸(LP44-2)的制备
将LP44-2(55mg，18.26μmol，1当量)在TFA(0.5mL)和DCM(0.5mL)溶液在20℃搅拌1h。LCMS显示反应完成，并且观察到期望的产物。(ESI)：RT＝4.219min，对于C137H214FN24O41，质量计算为2870.53[M+H]+、1436.27[M+2H]2+，实测1436.2[M+2H]2+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm。将反应溶液在真空中浓缩。将剩余物通过制备型HPLC(TFA条件；柱：O-phenomenex clarity RP 150*10mm*5μm；流动相：[水(0.075％TFA)-ACN]；B％：40％)纯化。获得作为白色固体的期望的合物LP44(12mg，4.05μmol，22.19％收率，96.97％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝4.243min，对于C137H214FN24O41，质量计算为2870.53[M+H]+、1436.27[M+2H]2+，实测1436.4[M+2H]2+。如下进行反相LCMS：使用Chromolith Flash，在水中的1.5ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的0.75ML/4L TFA(溶剂B)，在6分钟内使用梯度10％-80％(溶剂B)，并且以0.8ml/min的流量在80％保持0.5分钟；柱：Xtimate 3μm，C18，2.1*30mm。
HPLC RT＝9.13min。HPLC条件：流动相：在水中的2.75ML/4L TFA(溶剂A)和在乙腈中的2.5ML/4L TFA(溶剂B)，在10分钟内使用洗脱梯度10％-80％(溶剂B)，并且以1.5ML/min的流量在80％保持5分钟；柱：Ultimate XB-C18，3μm,3.0*50mm。
图53描绘了GLP-1R激动剂接头-有效载荷(LP45)的合成路线
步骤1：(3S)-4-[[(1S)-1-[[4-[4-[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-[2-[2- [[2-[2-[2-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[(18-叔丁氧基-18-氧代-十八酰基)氨基]-5-氧代-戊 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基甲基]三唑-1-基]丁氧基]-2-乙基-苯基] 苯基]甲基]-2-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-羟基乙氧基) 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]苯基]丁基]氨 基]-2-氧代-乙基]氨基]-3-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3-羟 基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基]氨 基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨基]- 3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]-4-氧代-丁酸(LP45-2)的制备
向LP29(210mg，87.33μmol，1当量)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIPEA(22.57mg，174.66μmol，30.42μL，2当量)和LP45-1(168.93mg，174.66μmol，2当量)。将混合物在25℃搅拌1小时。LCMS显示LP29被完全消耗并且检测到一个具有期望质量的主峰。将反应混合物在H2O(20mL)中分配并且用EtOAc(10mL×3)提取。将有机相分离，用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩，以给出剩余物。获得作为黄色油状物的期望的化合物LP45-2(200mg，粗制)。
LCMS(ESI):RT＝5.154min，对于C155H248FN25O47，质量计算为3231.78[M+H]+，对于C155H251FN25O47，计算为1077.9[M+3H]3+，实测1078.45[M+3H]3+。LCMS方法A：MERCK，RP-18e25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的5％至95％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
步骤2：18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[4- [4-[4-[(2S)-3-[[(1S)-1-氨基甲酰基-4-[4-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-羟基乙氧 基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]苯基]丁 基]氨基]-2-[[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[3-(2-氟苯基)-2-[[(2S,3R)-3- 羟基-2-[[2-[[(2S)-2-[[3-[2-(1H-咪唑-5-基)乙基氨基]-2,2-二甲基-3-氧代-丙酰基] 氨基]-3-(2H-四唑-5-基)丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]-2-甲基-丙酰基]氨 基]-3-羟基-丁酰基]氨基]-3-羟基-丙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-3-氧代-丙基]苯基]-3- 乙基-苯氧基]丁基]三唑-4-基]甲氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨 基]-1-羧基-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八烷酸(LP45)的制备
LP45-2(200mg，61.87μmol，1当量)在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(2mL)中的溶液。将混合物在微波下在90℃搅拌2小时。LCMS显示LP45-2被完全消耗并且检测到一个具有期望质量的主峰。LCMS(ESI):RT＝3.575min，对于C147H233FN25O47，质量计算为3119.65[M+H]+，对于C147H235FN25O47，计算为780.7[M+4H]4+，实测781.0[M+4H]4+。LCMS方法A：MERCK，RP-18e25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。将反应混合物在真空下浓缩，以给出粗制品。将剩余物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 150*30mm*5μm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：36％-56％，10.5min)纯化，以获得作为白色固体的LP45(18.03mg，5.75μmol，9.29％收率，99.51％纯度)。
LCMS(ESI):RT＝3.550min，m/z，对于C147H233FN25O47，计算为3119.65[M+H]+，对于C147H235FN25O47，计算为780.7[M+4H]4+，实测781.0[M+4H]4+。LC-MS方法A：MERCK，RP-18e 25-2mm柱，流量为1.5mL/min，用包含0.02％TFA的10％至80％乙腈(溶剂B)和包含0.04％TFA的水(溶剂A)的梯度洗脱。
实施例6.制备型HPLC纯化粗制肽模拟物
制备型HPLC在Shimadzu LC-8a液相色谱仪上进行。将溶解于DMF或水中的粗制肽溶液注入柱中，并且用ACN在水中的线性梯度洗脱。使用不同的方法。(参见一般信息)。洗脱的期望产物在级分中，并且通过冻干各自的HPLC级分获得作为无定形粉末的纯肽模拟物。通常，在制备型HPLC纯化之后，发现总回收率在40％～50％收率的范围内。
制备型HPLC方法A：使用FA条件(柱：Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：40％-70％，7min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法B：使用TFA条件(柱：YMC-Exphere C18 10μm300*50mm，12nm；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-45％，55min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法C：使用中性条件(柱：Phenomenex Gemini-NX150*30mm*5μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：21％-51％，11min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法D：使用中性条件(柱：Waters Xbridge 150*255u；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：20％-50％，7min)以获得纯产物。
制备型HPLC方法E：使用FA条件(柱：Phenomenex Luna C18 250*50mm*10μm；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：55％-86％，21min)以获得纯产物。
实施例7.抗体-药物缀合物的制备
7.1通用位点特异性缀合
本实施例显示了两种用于有效载荷与包含其Q-标签的抗体的位点特异性ATDC缀合的方法。用LP1-LP11和抗GLP1R抗体mAb1-mAb13或对照抗体mAb1-mAb6制备ATDC 1-30，如下表3中总结的。根据本公开内容的ADC的ES-MS结果和DAR值总结在表3中。
表3.位点特异性GLP1抗体-药物缀合物
7.2通用两步缀合方案
该方法包括两个步骤过程，如图54中示出的。第一步是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)介导的第一接头(La)，例如小分子胺，例如叠氮化物-PEG3-胺与抗体的附接，其中使用过量的胺试剂以避免抗体链的潜在交联。第二步将炔烃连接的有效载荷接头有效载荷(LP)与加叠氮化物标签的缀合物经由应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)附接。
一般程序如下。
步骤1：制备包含两个叠氮基基团的位点特异性叠氮基官能化抗体药物缀合物。
将包含Q-标签的抗GLP1R人类IgG抗体或同种型对照抗体与100-200摩尔当量的叠氮基-PEG3-胺(L1，MW 218.26g/mol)混合。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(Zedira,Darmstadt,Germany,每mg抗体1U MTG)混合，导致在1-10mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物伴随温和地摇动在25℃-37℃孵育4-72小时，同时通过ESI-MS监测反应。在完成后，过量的胺和MTG通过尺寸排阻色谱(SEC)或蛋白A柱色谱去除。缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。附接叠氮基接头的抗体(Ab-N3)导致DAR2缀合物的质量增加402Da。缀合物的单体纯度>95％。
步骤2：经由叠氮基官能化抗体(Ab-N3)与包含炔烃的接头-有效载荷之间的[2+3]点击反应制备表1中的位点特异性缀合物。
通过将在PBS(pH 7.4)中的叠氮基官能化抗体(Ab-N3，1-20mg/mL)与溶解在有机溶剂诸如DMSO或DMA(10-20mg/mL)中以使反应混合物包含5％-15％的有机溶剂(v/v)的≥3摩尔当量的接头-有效载荷在25℃-37℃孵育1-48小时同时温和地摇动，制备位点特异性抗体药物缀合物。通过ESI-MS监测反应。在完成后，过量量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC、HIC和ESI-MS表征。缀合物单体纯度>95％。
在具体实施例中，将包含重链N-末端Q-标签的36mg抗GLP1R小鼠IgG抗体COMP mAb1与150摩尔当量的叠氮基-PEG3-胺(L1，MW 218.26g/mol)混合。将所得溶液与微生物转谷氨酰胺酶(每mg抗体1U mTG，Zedira,Darmstadt,Germany)混合，产生在4.0mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在37℃孵育18小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将在PBS(pH 7.4)中的浓缩的位点特异性抗体叠氮基缀合物(2.9mg/mL)与5摩尔当量的接头-有效载荷(LP4)在10mg/mL的DMSO中混合。将另外的DMSO添加至10％总DMSO(v/v)中，并且将溶液在25℃温和地摇动22小时。通过ESI-MS监测反应。在完成后，过量量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC、HIC和ESI-MS表征。缀合物单体纯度为99.7％。附接药物的抗体导致DAR2缀合物的质量增加5931Da。
S7.3通用一步缀合方案
该方法包括微生物转谷氨酰胺酶(MTG)介导的接头有效载荷(LP)与抗体的附接，如图55中示出的。
一般程序如下。
将包含Q-标签的抗GLP1R人类IgG抗体或同种型对照抗体与10-20摩尔当量的接头有效载荷(LP11，MW 1979.24g/mol)混合；添加Tris-HCl以将pH升高至pH 7.4左右。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(Zedira,Darmstadt,Germany,每mg抗体1U MTG)混合，导致在1-10mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物伴随温和地摇动在25℃-37℃孵育4-72小时，同时通过ESI-MS监测反应。在完成后，过量量的接头-有效载荷、蛋白聚集体和MTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC、HIC和ESI-MS表征。缀合物单体纯度>95％。
在具体实施例中，将1.5mg包含重链N-末端Q-标签的抗GLP1R人类IgG抗体mAb 6与15摩尔当量的接头-有效载荷(LP11)在10mg/mL的DMSO中混合。将另外的DMSO添加至10％的总DMSO(v/v)中，随后是1M Tris-HCl pH 8，使Tris浓度达到25mM(pH～8)。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(Zedira,Darmstadt,Germany,每mg抗体1U MTG)混合，导致在3.0mg/mL的最终抗体浓度。将溶液置于37℃并且温和地摇动23小时。通过ESI-MS监测反应。在完成后，过量量的接头-有效载荷、蛋白聚集体和MTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC、HIC和ESI-MS表征。附接药物的抗体导致DAR2缀合物的质量增加3924Da。
实施例8.有效载荷和接头-有效载荷的体外表征
8.1人类GLP1R cAMP累积测定(环AMP确定)
试验化合物激动GLP1R的功能活性使用基于细胞的测定来评价。对于测定，利用过表达全长人类GLP-1R的HEK293细胞，并且评价下游cAMP积累作为人类GLP-1R刺激的量度。对于测定，使用自动化Bravo液体处理平台，在PP-384微孔板中，将化合物在DMSO中以1μM的起始浓度5倍连续稀释。使用Echo液体处理器将稀释的化合物转移至OptiPlates(100nL/孔)中。将HEK293/hGLP1R细胞在37℃水浴中解冻，用HBSS洗涤2次，并且重悬在测定缓冲液(HBSS+5mM HEPES+500μM IBMX+0.1％BSA)中。在添加化合物之后，然后将HEK293细胞以1×105个细胞/孔(10μL)接种到包含稀释化合物的384OptiPlates中。在离心之后，将测定板在23℃孵育30min。通过添加10μL包含来自环AMP免疫测定试剂盒(Cisbio,Cat#62AM4PEJ)的D2-cAMP和cAMP抗体的裂解缓冲液来终止反应。在孵育一小时后，在EnVision板读取器上在665/615nm处读取测定板。每孔的cAMP水平使用通过GraphPad Prism产生的标准曲线计算。活性百分比根据公式(％活性＝100％*(cAMP水平-LC)/(HC-LC))计算。EC50值由10点响应曲线(GraphPad Prism)上的四参数逻辑方程拟合。
如表4中示出的，测试有效载荷和接头-有效载荷显示cAMP激活，EC50值范围为39pM至>11nM，使GLP1R激动最强的具有<1nM的EC50值。参考化合物GLP1显示cAMP激活，EC50值为28pM。
表4.有效载荷和接头-有效载荷在cAMP累积测定中的活性
P# cAMP EC50(nM)
GLP1 0.028
P3 1.433
P4 0.156
P5 0.115
P6 0.853
P7 2.055
P8 0.497
P9 0.050
P10 0.047
P11 1.028
P12 0.039
P13 0.914
P14-S 0.727
P15-R 0.117
P16-S 0.544
P17-R 11.240
P18 0.370
P19 0.156
P20 0.370
P21 0.427
P22 0.603
P23 0.198
P24 0.136
LP5 0.044
LP6 0.436
LP7 0.378
LP8 0.412
LP9 0.078
LP10 0.982
LP15 0.649
LP16 1.038
LP11 0.318
LP18 0.458
LP19 0.558
LP20 0.314
LP22 2.706
LP23 0.534
8.2血浆稳定性
测量了本公开内容的有效载荷和接头有效载荷的血浆稳定性。对于测定，在实验之前，将汇集的冷冻血浆(人类、小鼠或猴)在冷水或37℃水浴中解冻。将血浆以4000rpm离心5min，如果观察到任何凝块，随后将其去除。如果需要，将pH调节至7.4±0.1。为了制备化合物和阳性对照，通过用90μL DMSO稀释10μL其储备溶液制备1mM中间溶液；通过用90μL超纯水稀释10μL其储备溶液制备阳性对照(丙胺太林)的1mM中间溶液。随后，通过用180μL45％MeOH/H2O稀释20μL中间溶液(1mM)制备每种化合物的100μM给药溶液。用2μL给药溶液(100μM)对98μL血浆进行加标，以达到2μM的最终浓度，一式两份。然后将样品在37℃在水浴中孵育。收集四组时间点：(A)对于2小时测试，在0min、10min、30min、60min和120min收集样品；(B)对于24小时测试，在0min、10min、60min、240min和1440min收集样品；(C)对于3天测试，在0小时、24小时、48小时和72小时收集样品；(D)对于7天试验，在0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时收集样品。在每个时间点，添加400μL终止溶液(在50％ACN/MeOH中的200ng/mL甲苯磺丁脲加200ng/mL拉贝洛尔)以使蛋白沉淀并且充分混合。然后将样品板以4,000rpm离心10min。从每个孔中转移等分试样的上清液(50μL)，并且与100μL超纯水混合。然后将样品以800rpm摇动大约10min，然后提交用于LC-MS/MS分析。
如表5A中示出的，大多数测试有效载荷和接头-有效载荷在人类血浆中是高度稳定的，具有在一天血浆测定中>48小时的T1/2值以及在7天血浆测定中>14天的T1/2值；参考化合物GLP1在人类血浆中是不稳定的，并且显示了<10分钟的T1/2值。如表5B中示出的，在猴血浆中测试的本公开内容的一个接头有效载荷(LP11)具有>49.4小时的T1/2值。在小鼠血浆稳定性中测试的本公开内容的两个接头有效载荷(LP11和LP23)具有在3天测定中>6天的T1/2值，或在2小时测定中>4小时的T1/2值。
表5A.有效载荷和接头-有效载荷的人类血浆稳定性
*在A中测试1天；在B中测试2小时；在C中测试3天；在D中测试7天。
表5B.接头-有效载荷的猴和小鼠血浆稳定性
下表5C总结了具有下文示出结构的接头-有效载荷LP11的测试的参数。
表5C.LP11表征
8.3 hERG测定
为了确定本公开内容的化合物是否对hERG钾通道活性具有影响，进行基于细胞的测定。对于该测定，将稳定表达hERG钾通道的CHO细胞铺板，并且在加湿和控制空气(5％CO2)的培养箱中在37℃培养至少2天，然后用于电生理实验。然后使用TrypLE收获细胞并且重悬在生理溶液(10mM HEPES、80mM NaCl、4mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、5mM葡萄糖、60mMNMDG，pH 7.4)中。将测试化合物溶解在水中以获得不同测试浓度的储备溶液。将储备溶液进一步稀释到外部电生理记录溶液(10mM HEPES、140mM NaCl、4mM KCl、2mM CaCl2、1mMMgCl2、5mM葡萄糖，pH 7.4)中以达到用于测试的最终浓度。在室温使用NanionSyncroPatch 384PE，384孔自动化膜片钳平台(内部记录溶液：10mM HEPES、10mM NaCl、10mM KCl、110mM KF、10mM EGTA、pH 7.2)进行记录。用于电生理记录的电压指令方案示意图示于图56中。应用一次40μL的媒介物添加，随后是300s的基线记录期。然后以每种浓度添加40μL剂量的化合物，暴露时间不少于300s。要求记录结果在记录持续期间通过质量控制，否则孔被弃去，并且化合物被重新测试，所有这些都由PatchControl自动化设置。对每种化合物以及阳性对照(阿米替林)测试了五种浓度(0.3μM、3μM、10.00μM、30.00μM和100.00μM)。每个浓度获得至少2个重复。使用DataControl、Excel 2013(Microsoft)和GraphPadPrism 5.0进行数据分析。曲线拟合与IC50值计算通过GraphPad Prism 5.0进行。如果在测试的最低浓度获得的抑制超过50％，或者在测试的最高浓度获得的抑制少于50％，则IC50值分别报告为少于最低浓度或高于最高浓度。测试化合物对全细胞hERG电流的IC50值总结于表6中。
表6.测试化合物对全细胞hERG电流的IC50
8.4 Ames测定
该Mini-Ames研究的目的是评价试验品LP11在存在和不存在代谢激活(S9混合物)的情况下在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株TA98和TA100的基因组中诱导回复突变的能力。
如下执行测试物品的Mini-Ames测定：在存在和不存在S9混合物的情况下，同时使用6个孔的阴性/溶剂对照(DMSO)，并且使用3个孔的阳性对照(在存在S9的情况下2μg/孔单独的TA98、0.2μg/孔单独的TA100或0.4μg/孔TA98+TA100)。在存在和不存在S9混合物的情况下，测试物品的测试剂量水平为每孔1000μg、400μg、160μg、64μg、25μg、10μg、4μg和1.5μg，每个剂量以一式三份测试。该研究使用细菌菌株的新鲜培养物和新鲜试验物品制品执行。
对于试验物品LP11，在任何试验菌株中，在有或没有S9混合物的任何剂量水平都没有观察到明显的细胞毒性。在任何测试菌株中，在有或没有S9混合物的任何剂量水平，没有观察到明显的沉淀物(在孵育时间段之后通过裸眼观察)。
在存在或不存在S9混合物的情况下，相对于同时的阴性/溶剂对照在任何剂量水平，LP11在两个菌株TA98或TA100中都没有诱导回复突变菌落(revertant colonies)的平均数增加多于2.0倍。也没有观察到剂量响应。
对于该研究中使用的两种测试菌株，阴性/溶剂对照观察到的回复突变菌落的平均数与实验室历史阴性对照数据相当。与同时的阴性/溶剂对照相比，在存在和不存在S9混合物的情况下，所有阳性对照诱导回复突变菌落的平均数预期增加大于3倍，从而确认了菌株的响应性。
确认了该测定中使用的所有试验菌株的基因型。结论是，在该研究的条件下，该Mini-Ames研究是有效的，并且LP11对于致突变性是阴性的。
8.5体外ADME
为了评价LP的体外ADME特性，进行微粒体稳定性测定以确定内在清除率，并且进行血浆蛋白结合测定以了解分布潜力。结果列于下文表7和表8中。
表7.肝微粒体稳定性
进行测定以确定本公开内容的化合物的血浆蛋白结合。对于测定，在实验当天，血浆在冷水中解冻，并且以3220rpm离心5分钟以去除任何凝块。检查所得血浆的pH值。
96孔平衡透析装置(Cat#1006)和分子量截止值为12-14kDa的HTD 96a/b纤维素膜条(Cat#1101)从HTDialysis LLC,Gales Ferry,CT获得，并且遵循制造商的说明组装透析装置。(<http://www.htdialysis.com/>)。
对于透析，将试验化合物和对照化合物溶解在DMSO中以达到10mM储备溶液。DMSO工作溶液以400μM制备。为了制备装载基质，将化合物工作溶液(5μL)以1:200的比例添加至空白基质(995μL)中并且充分混合。为了制备用于回收率确定的时间零点(T0)样品，将50μL等分试样的装载基质以一式三份转移到样品收集板上。立即将样品与相对的空白缓冲液匹配，以获得每个孔中最终体积为100μl的1:1基质/透析缓冲液(v/v)。向这些T0样品中添加500μL终止溶液。然后将其连同其他透析后样品一起储存在2℃-8℃，等待进一步处理。为了装载透析装置，将150μL的装载基质的等分试样以一式三份转移至每个透析孔的供体侧，并且将150μL的透析缓冲液装载至孔的接收者侧。将透析板置于缓慢旋转(约100rpm)的摇动平台上的在37℃具有5％CO2的加湿的培养箱中持续4小时。在透析结束时，从透析装置的缓冲液侧和基质侧取50μL等分试样的样品。将这些样品转移到新的96孔板中。将每种样品与等体积的相对的空白基质(缓冲液或基质)混合，以在每个孔中达到最终体积为100μl的1:1基质/透析缓冲液(v/v)。将所有样品通过添加500μL含内标的终止溶液进一步处理。将混合物涡旋并且以4000rpm离心约20分钟。然后取出100μL所有样品上清液的等分试样进行LC-MS/MS分析。单个空白样品通过将50μL空白基质转移至96孔板中，并且向每个孔中添加50μL空白PBS缓冲液来制备。空白血浆必须与孔的血浆侧使用的血浆物种相匹配。然后，遵循与透析样品相同的样品处理方法，通过添加500μL含内标的终止溶液，进一步处理基质匹配样品。
使用以下公式计算未结合百分比、结合百分比和回收率值百分比：
其中[F]是膜的缓冲液(接收者)侧上的分析物浓度或分析物/内标的峰面积比，[T]是膜的基质(供体)侧的分析物浓度或分析物/内标的峰面积比，并且[T0]是在时间零时装载基质样品中的分析物浓度或分析物/内标的峰面积比。下表8总结了血浆蛋白结合测定结果。
表8.血浆蛋白结合测定结果
实施例9.GLP1R肽模拟物有效载荷和接头-有效载荷针对GPCR家族成员的活性
为了测试GLP1R激动剂有效载荷和GLP1R激动剂接头-有效载荷(LP)的体外活性，开发了基于细胞的cAMP响应萤光素酶报告物测定。使用用于产生稳定的细胞系的标准方法产生表达环AMP响应元件(CRE)-萤光素酶报告物的人类胚胎肾细胞(HEK293)，其表达加Myc标签的全长人类GLP1R(保藏号NP_002053的氨基酸1至463)；称为HEK293/Myc-hGLP1R/Cre-Luc细胞系)、全长人类抑胃多肽受体(GIPR)(保藏号NP_000155.1的氨基酸1至466；称为HEK293/Myc-hGIPR/Cre-Luc细胞系)、全长人类胰高血糖素样肽2受体(GLP2R)(保藏号NP_004237的氨基酸1至553；称为HEK293/Myc-hGLP2R/Cre-Luc细胞系)或全长人类胰高血糖素受体(GCGR)(保藏号NP_000151.1的氨基酸1至477；称为HEK293/Myc-hGCGR/Cre-Luc细胞系)。使用识别Myc标签的抗体，通过流式细胞术确认受体的细胞表面表达。
对于生物测定，将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板在96孔透明底部白色板(Corning,#356693)中的80μL补充有0.1％FBS的Opti-MEM中。将细胞在37℃在5％CO2中孵育过夜。包括有效载荷、接头有效载荷和阳性对照配体[人类GLP1(R&D Systems,#5374)、人类GIP(R&D Systems,#2084)、人类GCG(R&D Systems,#6927)或人类GLP2(R&D Systems,#2258)]的测试试剂在具有0.1％FBS的Opti-MEM中连续稀释，并且然后以10μL/孔的每个测试浓度添加至细胞。将板在37℃在5％CO2中孵育5.5小时。对于终点测量，添加100μL/孔的One-Glo试剂(Promega,#E6051)，并且将板在室温保存5-10分钟。萤光素酶活性在Envision多标签板读取器(Perkin Elmer)上以发光模式测量。获得相对光单位(RLU)值，并且用GraphPad Prism软件(GraphPad)使用非线性回归分析结果。
如表9和图6A-图6D中示出的，有效载荷和接头-有效载荷显示在HEK293/Myc-hGLP1R/Cre-Luc细胞系中激活，EC50值范围为3.32pM至71.5pM。有效载荷和接头有效载荷在评价的其他细胞系中没有显示出可测量的活性。所有阳性对照参考配体(人类GLP1、GIP、GLP 2和GCG)如预期的那样激活单个细胞系。
表9.GLP1R、GIPR、GLP2R和GCGR细胞系中GLP1R有效载荷和接头-有效载荷激动剂的CRE依赖性报告物活性
N/A＝无活性
GLP1R测定的参考值＝GLP1
GIPR测定的参考值＝GIP
GLP2R测定的参考值＝GLP2
GCGR测定的参考值＝GCG
实施例10.体外血浆稳定性
为了确定携带GLP1R激动剂P8的ATDC抗GLP1R mAB2-LP11的血浆稳定性，将ATDC与来自不同物种的血浆一起体外孵育，并且评价药物抗体比(DAR)。抗GLP1R mAB2是生物素化的抗Fc抗体。
将ATDC溶液掺入到汇集的C57BL/6小鼠、食蟹猴(Cyno)或IgG耗尽的人类血浆(BioIVT)中，最终浓度为50μg/mL，并且随后在ThermoMixer C(Eppendorf,Cat#2231000574)上在37℃孵育。在第0天、第1天、第2天、第3天和第7天取出100μL等分试样，并且然后立即冷冻储存在-80℃，直到分析。
对于DAR分析，使用DynaMag-2磁架(Life Technologies,Cat#12321D)通过免疫亲和捕获从血浆样品中纯化ATDC。首先，将生物素化的抗人类Fc抗体(Regeneron产生的试剂)固定在Dynabeads M280链霉抗生物素蛋白珠(Invitrogen,Cat#60210)上。将包含ATDC的每种血浆样品在室温以950rpm与0.5mg珠伴随温和地摇动混合2小时。然后将珠用500μL HBS-EP pH 7.4缓冲液(GE Healthcare,Cat#BR100188)洗涤三次，用500μL水洗涤一次，并且用在水中的500μL 10％乙腈(VWR Chemicals,Cat#BDH83640.100E)洗涤一次。在洗涤后，通过将珠在室温与70μL的30:70乙腈:水(v/v)中1％甲酸孵育15分钟来洗脱ATDC。将50μL洗脱的样品通过添加50μL 10mM TCEP(Sigma,Cat 646547-10X1ML)进一步还原，并且在ThermoMixer C中在37℃孵育20min。
然后将还原的ATDC样品注入到0.3×50mm 1.7μm的BEH300 C4柱(Waters,Cat#186009260)上用于分离，并且通过Synapt G2-Si质谱仪(Waters)进行检测。使用的流量为10μL/min(流动相A：在水中的0.1％甲酸；流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸)。HPLC梯度在3.5-6.5分钟之间洗脱ATDC，对应于25％-40％的流动相B。将获得的光谱使用Maxent 1软件(Waters)用以下参数解卷积：质量范围：20-60kDa；m/z范围：800-2500Da；分辨率：1.0Da/通道；半高宽度：0.8Da；最小强度比：33％；最大迭代次数：15。DAR基于对应于解卷积光谱中单个DAR物种的峰强度来计算。
在小鼠、食蟹猴或IgG耗尽的人类血浆中孵育7天之后，在抗GLP1R mAb2-LP11的DAR方面没有观察到显著改变。结果示于表10和图57中。表10.抗GLP1R mAB2-LP11在小鼠、猴和人类血浆中37℃孵育7天的体外稳定性。
实施例11.萤光素酶报告物测定
为了测试本公开内容的GLP1R激动剂有效载荷、GLP1R激动剂接头-有效载荷(LP)和抗GLP1R抗体拴系的药物缀合物(ATDC)的活性，开发了基于细胞的cAMP响应性萤光素酶报告物测定。为了产生测定细胞系，将萤火虫萤光素酶基因置于位于最小启动子上游的cAMP响应元件(CRE)的控制下，并且转染到HEK293细胞中，并且本文中称为HEK293/CRE-Luc细胞。然后将HEK293/CRE-Luc细胞工程化为表达全长人类GLP1R(保藏号NP_002053的氨基酸1至463)，并且本文中称为HEK293/CRE-Luc/hGLP1R细胞。
对于测定，将细胞以10,000或20,000个细胞/孔接种到96孔板中的测定培养基(Optimem、0.1％BSA、100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，292μg/ml L-谷氨酰胺)中，并且孵育过夜。在100％DMSO中制备游离有效载荷或LP的三倍系列稀释液，转移至新鲜的测定培养基中，并且以0.2％的最终恒定DMSO浓度添加至细胞中。板中的最后一个孔用作空白对照，仅包含测定培养基和0.2％DMSO(未处理的孔)，并且绘制为3倍系列稀释的持续。4-6小时后，在将One-GloTM试剂(Promega,Cat#E6130)添加至每个孔中之后，确定萤光素酶活性。在Envision光度计(PerkinElmer)上测量相对光单位(RLU)，并且EC50值使用12点剂量响应曲线(GraphPad Prism)上的四参数逻辑方程确定。信噪比(S/N)通过取剂量响应曲线上最高RLU与未处理孔中RLU的比例来确定。EC50和S/N值总结在表11中。跨越几个实验(A、B和D)产生数据，在每个实验中以P8用作参考标准，以计算有效载荷相对效力[(P8EC50/有效载荷EC50)*100]和相对S/N[(有效载荷SN/P8SN)*100]。
如表11中示出的，HEK293/CRE-Luc/hGLP1R细胞中，有效负载和接头-有效负载EC50值范围为3.97pM至1.95nM，并且相对效力(％P8)范围为0.3％至133.8％。大多数测试的有效载荷达到了类似的最大活性，相对S/N值(％P8)范围为68.6％至116.27％。还包括GLP1配体用于参考，并且其在HEK293/CRE-Luc/hGLP1R细胞中增加CRE依赖性萤光素酶活性，EC50为14.3pM，相对效力为37.2％，并且相对S/N为96.8％。在不存在hGLP1R表达的情况下(HEK293/CRE-Luc细胞)，所有测试的激动剂对萤光素酶活性具有最小的影响，S/N值≤1.7并且EC50值>200.0nM。
表11.HEK293/CRE-Luc/hGLP1R细胞中GLP1R有效载荷和接头-有效载荷激动剂的CRE依赖性报告物活性
NT＝未测试
>＝由于结合在测试的抗体浓度范围内没有达到饱和，可能无法准确确定EC50值。EC50被报告为大于测试的最高浓度
GLP1R激动剂接头有效载荷经由N末端重链或轻链Q标签与抗hGLP1R抗体缀合。在如以上关于游离GLP1R有效载荷和接头-有效载荷激动剂描述的HEK293/CRE-Luc/hGLP1R报告物测定中测试几种所得抗GLP1R抗体拴系的药物缀合物(ATDC)的活性。如表12中示出的，在HEK293/CRE-Luc/hGLP1R细胞中抗GLP1R ATDC增加CRE依赖性萤光素酶报告物活性，EC50值范围为21.7pM至112pM，并且相对效力值(％P8)范围为14.5％至126％。大多数测试的ATDC达到了类似的最大活性，相对S/N值(％P8)范围为87.4％至158.4％。抗GLP1R ATDC在不表达hGLP1R的报告物细胞(HEK293/CRE-Luc)中是无活性的。非结合ATDC倾向于比抗GLP1R ATDC较少活性，EC50值范围为1.92nM至74.6nM，并且相对效力值(％P8)范围为<0.1％至1.4％。一组选择的结果示于图10中。
表12.HEK293/CRE-Luc/hGLP1R细胞中抗GLP1R ATDC的CRE依赖性报告物活性
NT＝未测试
>＝由于结合在测试的抗体浓度范围内没有达到饱和，可能无法准确确定EC50值。EC50被报告为大于测试的最高浓度
在单独的实验中，在HEK293/CRE-Luc/hGLP1R报告物测定中评价了未缀合的抗GLP1R抗体竞争抗GLP1R ATDC活性的能力。在该实验中，在不存在或存在恒定量(0.01nM、0.1nM、1.0nM、10nM或100nM)的未缀合的抗GLP1R抗体的情况下，将报告物细胞与剂量滴定的抗GLP1R ATDC一起孵育。EC50值报告于表13中，并且EC50值相对于单独的ATDC条件的倍数改变(EC50倍数改变)计算如下：ATDC+未缀合的mAb的EC50/单独的ATDC的EC50。如表13中示出的，多达10nM的未缀合的mAb浓度对抗GLP1R ATDC活性具有最小的影响，EC50倍数改变值少于或等于1.5。100nM的最高测试的未缀合的抗体浓度将EC50值降低4.0倍。未结合对照ATDC不受未缀合的抗GLP1R抗体存在的影响。
表13.在存在未缀合的抗GLP1R抗体的情况下抗GLP1R ATDC的CRE依赖性报告物活性
实施例12.抗GLP1R mAb ATDC对饮食诱导的肥胖GLP1R人源化小鼠体重和血糖的影响
为了确定三种抗GLP1R抗体拴系的药物缀合物(ATDC)对肥胖动物体重和血糖降低影响，将人类GLP1R替代小鼠GLP1R的表达纯合的小鼠(称为GLP1R人源化小鼠)置于高脂肪饮食(60％kcal％脂肪)6个月。将44只9月龄雄性GLP1R人源化小鼠根据其第0天的体重分为6组，每组5至8只小鼠。在分组之后，在第0天将每组皮下施用25mg/kg COMP抗GLP1R mAb1-LP4(n＝8)、抗GLP1R mAb3-LP11(n＝8)、抗GLP1R mAb4-LP11(n＝5)、对照抗GLP1R mAb(n＝7)、同种型对照mAb ATDC(n＝8)或参考化合物(n＝8)。
该研究中使用的对照抗GLP1R mAb是高亲和力抗GLP1R抗体，在没有任何药物缀合的情况下，它不激活GLP1R或使GLP1R失活。对照抗GLP1R mAb是美国公布第US20060275288A1号中描述的抗体5A10，该美国公布通过引用以其整体并入本文。对照抗GLP1R mAb没有Q标签。COMP抗GLP1R mAb1-LP4包含具有N末端重链Q-标签的相同对照抗GLP1R mAb。同种型对照mAb ATDC是本文描述的GLP1肽模拟物，与不与GLP1R人源化小鼠中任何蛋白结合的抗体缀合。参考化合物在GLP1类似物和接头区段中具有与度拉鲁肽(dulaglutide)相同的氨基酸序列，但由具有三个突变(P16E；V17A；G19插入)的hFc制成。
在施用后的第3天和第7天以及从第14天至第56天的每周，记录动物的体重，并且用手持血糖仪测量它们的血糖水平。计算每组从第0天开始每个时间点体重变化百分比的平均值±SEM，并且示于表14中。计算每组在每个时间点血糖水平的平均值±SEM，并且示于表15中。通过双向ANOVA，随后进行Bonferroni事后检验进行统计分析，将对照抗体组与其他五组进行比较。结果也示于图39和图40中。
在施用对照抗GLP1R mAb的动物中，体重和血糖水平是稳定的，具有与标称处理(即出血、笼子改变)相关的波动。与对照抗GLP1R mAb组的动物相比，施用同种型对照mAbATDC的动物在体重变化百分比或血糖水平方面没有显示显著差异。在施用参考化合物的动物中，在第3天和第7天观察到体重降低，而葡萄糖仅在第3天降低。在施用抗GLP1R mAbATDC的动物中，体重降低分别持续42天、56天和28天，这取决于GLP1R ATDC的剂量，而所有测试的GLP1R ATDC的血糖降低7天。
总之，单次施用测试的三种抗GLP1R mAb ATDC导致肥胖动物的长期体重减轻。
表14.GLP1R ATDC对肥胖GLP1R人源化小鼠体重变化百分比的影响
与对照抗GLP1R mAb组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
表15.GLP1R ATDC对肥胖GLP1R人源化小鼠血糖水平的影响
与对照抗GLP1R mAb组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
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***
由于可以对以上描述的主题进行各种改变，而不偏离本公开内容的范围和精神，因此意图将以上描述中包含的或在所附权利要求中定义的所有主题解释为本公开内容的描述性和说明性的。本公开内容的许多修改和变化鉴于以上教导是可能的。因此，本描述意图涵盖落入所附权利要求范围内的所有这样的替代、修改和变化。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料通过引用以其整体特此并入，就像物理上存在于本说明书中一样。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 包含GLP1肽模拟物的抗体-药物缀合物及其用途
<130> 250298.000250
<140>
<141>
<150> 63/077,983
<151> 2020-09-14
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
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Leu Leu Gln Leu Leu Gln
1 5
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<400> 24
Leu Leu Gln Gly Arg
1 5

Claims (106)

1.一种化合物，具有式(A)的结构：
BA-(L-P)m(A)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
(P-IIA)和
其中是所述有效载荷附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自键、–(CH2)2-6–NH–、–(CH2)2-6–Tr–和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
2.一种化合物，具有式(I)的结构：
BA-L-P (I)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
L是不可裂解的接头；
P是具有选自由以下组成的组的结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷附接至L的附接点；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中BA是靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中所述靶向GLP1R的抗体是GLP1R激动剂抗体。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述靶向GLP1R的抗体是5A10、9A10、AB9433-I、h38C2、PA5-111834、NLS1205、MAB2814、EPR21819或glutazumab。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中所述接头L与所述BA的一条或两条重链附接。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述接头L与所述BA的一个或两个重链可变结构域附接。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中所述接头L与所述BA的一条或两条轻链附接。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述接头L与所述BA的一个或两个轻链可变结构域附接。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中所述接头L经由谷氨酰胺残基与BA附接。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基被引入所述BA的一条或两条重链的N末端。
12.根据权利要求10或11所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基被引入至所述BA的一条或两条轻链的N末端。
13.根据权利要求10所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基天然存在于所述BA的CH2结构域或CH3结构域中。
14.根据权利要求10所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至所述BA中。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基是Q295或N297Q。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中所述接头L经由赖氨酸残基与BA附接。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是非糖基化的。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是去糖基化的。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中所述抗原结合片段是Fab片段。
20.根据权利要求1和3-19中任一项所述的化合物，其中m是1。
21.根据权利要求1和3-19中任一项所述的化合物，其中m是从2至4的整数。
22.根据权利要求20所述的化合物，其中m是2。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的化合物，其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp不存在或是与所述P共价附接的第二接头，其中当Lp不存在时，Y也不存在。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中Y-Lp不存在。
25.根据权利要求23所述的化合物，其中Y具有选自由以下组成的组的结构：
其中Q是C或N。
26.根据权利要求23或24所述的化合物，其中Lp包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中所述PEG区段包括2个与30个之间的EG单元。
28.根据权利要求26或27所述的化合物，其中所述PEG区段包括4个与24个之间的EG单元。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的化合物，其中所述PEG区段包括4个EG单元或8个EG单元或12个EG单元或24个EG单元。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的化合物，其中所述PEG区段包括4个EG单元。
31.根据权利要求26-29中任一项所述的化合物，其中所述PEG区段包括8个EG单元。
32.根据权利要求23所述的化合物，其中Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
或其三唑位置异构体，
其中p是从1至36的整数。
33.根据权利要求23或24所述的化合物，其中所述Lp包括选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸。
34.根据权利要求33所述的化合物，其中所述Lp包括1个至10个甘氨酸。
35.根据权利要求33所述的化合物，其中所述Lp包括1个至6个丝氨酸。
36.根据权利要求33所述的化合物，其中所述Lp包括1个至10个甘氨酸和1个至6个丝氨酸。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的化合物，其中所述Lp包括4个甘氨酸和1个丝氨酸。
38.根据权利要求33-37中任一项所述的化合物，其中所述Lp选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)(SEQ ID NO:1)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)(SEQ ID NO:2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S-G4S)(SEQ ID NO:3)。
39.根据权利要求33-38中任一项所述的化合物，其中所述Lp包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。
40.根据权利要求35-38中任一项所述的化合物，其中所述丝氨酸残基包括糖类基团。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的化合物，其中所述丝氨酸残基包括葡萄糖基团。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的化合物，其中所述Lp具有选自由以下组成的组的结构：
其中Y是包含三唑的基团，并且P是有效载荷，并且其中Rc选自H和葡萄糖，g是从1至10的整数，并且s是从0至4的整数。
43.根据权利要求33-41中任一项所述的化合物，其中所述Y-Lp具有选自由以下组成的组的结构：
以及或其三唑位置异构体。
44.根据权利要求23-43中任一项所述的化合物，其中La包括具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段。
45.根据权利要求44所述的化合物，其中所述PEG区段包括4个EG单元或8个EG单元或12个EG单元或24个EG单元。
46.根据权利要求45所述的化合物，其中所述PEG区段包括8个EG单元。
47.根据权利要求23-46中任一项所述的化合物，其中所述La具有选自由以下组成的组的结构：
48.根据权利要求23-45中任一项所述的化合物，其中La包括选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸。
49.根据权利要求46所述的化合物，其中所述La包括1个至10个甘氨酸和1个至6个丝氨酸。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的化合物，其中所述La包括4个甘氨酸和1个丝氨酸。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的化合物，其中所述La选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)(SEQ ID NO:1)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SG4)(SEQ ID NO:2)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(G2S-G2S-G2)和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(G4S-G4)(SEQ ID NO:3)。
52.根据权利要求46所述的化合物，其中La包括具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。
53.根据权利要求46-52中任一项所述的化合物，其中所述La选自由以下组成的组：
54.根据权利要求23-53中任一项所述的化合物，其中La包括–(CH2)2-24-链。
55.根据权利要求54所述的化合物，其中La包括–(CH2)2-24-链、具有1个至36个EG单元的PEG区段和选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸的组合。
56.根据权利要求55所述的化合物，其中La选自由以下组成的组：
57.根据权利要求1-43中任一项所述的化合物，其中P具有结构
58.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是H；X2是X3选自–(CH2)2-6–NH–和–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；n是1，并且X4是H。
59.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
60.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
61.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH2OH，并且X7是H。
62.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–Tr–，其中Tr是三唑部分；n是1；X4是H，并且X5是
63.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3；X7是并且X8是-NH2。
64.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X8是H。
65.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时都是H；X7是并且X8是H。
66.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3；X7是并且X8是
67.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
68.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
69.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H；X6在每次出现时独立地选自H和-CH3，并且X7是
70.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是H；X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1，并且X4是H。
71.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是H，并且X5是
72.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是0；X4是苯基，并且X5是
73.根据权利要求1-44中任一项所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；n是1；X4是苯基，并且X5是
74.根据权利要求1-43中任一项所述的化合物，其中P具有结构
75.根据权利要求74所述的化合物，其中X1是X2是X3是–(CH2)2-6–NH–；X4是H，并且X5是
76.根据权利要求1-75中任一项所述的化合物，其中P具有选自由以下组成的组的结构：
结构
77.根据权利要求1-76中任一项所述的化合物，其中所述化合物在血浆中具有长于7天的半衰期。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的化合物，其中所述化合物不与除了GLP1R之外的G蛋白偶联受体(GPCR)结合。
79.一种药物组合物，包含根据权利要求1-78中任一项所述的化合物。
80.一种药物剂型，包含根据权利要求1-78中任一项所述的化合物。
81.一种选择性地靶向细胞表面上的GLP1R的方法，所述方法用根据权利要求1-78中任一项所述的化合物选择性地靶向细胞表面上的GLP1R。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
84.根据权利要求81-83中任一项所述的方法，其中所述细胞是胰腺细胞、脑细胞、心脏细胞、血管组织细胞、肾细胞、脂肪组织细胞、肝细胞或肌细胞。
85.一种增强有相应需要的个体的GLP1R活性的方法，包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1-78中任一项所述的化合物、根据权利要求79所述的组合物或根据权利要求80所述的剂型。
86.一种降低有相应需要的个体的血糖水平的方法，包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1-78中任一项所述的化合物、根据权利要求79所述的组合物或根据权利要求80所述的剂型。
87.一种降低有相应需要的个体的体重的方法，包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1-78中任一项所述的化合物、根据权利要求79所述的组合物或根据权利要求80所述的剂型。
88.一种治疗有相应需要的个体的GLP1R相关状况的方法，包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1-78中任一项所述的化合物、根据权利要求79所述的组合物或根据权利要求80所述的剂型。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述GLP1R相关状况是II型糖尿病、肥胖、肝病、冠状动脉疾病或肾病。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述GLP1R相关状况是II型糖尿病和/或肥胖。
91.根据权利要求81-89中任一项所述的方法，其中根据权利要求1-78中任一项所述的化合物、根据权利要求79所述的组合物或根据权利要求80所述的剂型被皮下、静脉内、皮内、腹膜内或肌内施用。
92.一种制备权利要求1的具有式(A)结构的化合物的方法：
BA-(L-P)m(A)，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少m个谷氨酰胺残基Gln的BA与至少m当量的化合物L-P接触，以及
b)分离所产生的式(A)化合物。
93.一种制备权利要求2的具有式(I)结构的化合物的方法：
BA-L-P(I)，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA与化合物L-P接触，以及
b)分离所产生的式(I)化合物。
94.一种制备权利要求1的具有式(A)结构的化合物的方法：
BA-(L-P)m(A)，
其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp是与所述P共价附接的第二接头，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少m个谷氨酰胺残基Gln的BA与包括叠氮化物或炔烃部分的第一接头La接触；
b)使步骤a)的产物与至少m当量的化合物Lp-P接触，其中所述第二接头Lp包括叠氮化物或炔烃部分，其中La和Lp能够反应产生三唑，以及
c)分离所产生的式(A)化合物。
95.一种制备权利要求2的具有式(I)结构的化合物的方法：
BA-L-P(I)，
其中所述接头L具有式(L’)的结构：
-La-Y-Lp-(L’)，
其中La是与所述BA共价附接的第一接头；
Y是包含三唑的基团，并且
Lp是与所述P共价附接的第二接头，
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA与包括叠氮化物或炔烃部分的第一接头La接触；
b)使步骤a)的产物与化合物Lp-P接触，其中所述第二接头Lp包括叠氮化物或炔烃部分，其中La和Lp能够反应产生三唑，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
96.一种化合物，具有选自由式(P-IB)、式(P-IIB)和式(P-IIIB)组成的组的结构：
(P-IIIB)，其中：
X1选自H；
X2选自
X3选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH2，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
97.一种化合物，具有式(II)的结构：
其中：
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和-CH3，条件是当X3是-CH3时，n是1，并且Ra在至少一次出现时选自–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
n是0或1；
m是从0至3的整数；
Ra在每次出现时独立地选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
以及其药学上可接受的盐。
98.根据权利要求96所述的化合物，其中P具有选自由以下组成的组的结构：
结构
99.一种化合物，具有式(C)的结构：
其中：
Lp不存在或者是包括以下一种或更多种的接头：氨基甲酸酯基团；环糊精；具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段；–(CH2)2-24-链；三唑；选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸；
Q是选自-NH2、-N3、的部分，其中A是C或N；
X1选自H；
X2选自
X3选自-CH3、–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和–(CH2)2-6–Tr–(CH2)1-6–NH2，其中Tr是三唑部分；
n是0或1；
X4选自-NH2、-OH和-N(H)(苯基)；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
Ar选自
X9选自-NH2、并且
m是从1至4的整数
或其药学上可接受的盐。
100.一种化合物，具有式(III)的结构：
其中：
Lp不存在或者是包括以下一种或更多种的接头：氨基甲酸酯基团；环糊精；具有1个至36个-CH2CH2O-(EG)单元的聚乙二醇(PEG)区段；选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸及其组合的一种或更多种氨基酸；
Q是选自-N3、的部分，其中A是C或N；
X1选自H；
X2选自
X3选自–(CH2)2-6–NH2、–(CH2)2-6–N3和-CH3，条件是当X3是-CH3时，n是1，并且Ra在至少一次出现时选自–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
n是0或1；
Ra在每次出现时独立地选自H、-CH3、–(CH2)2-6–NH2和–(CH2)2-6–N3；
X4选自H和苯基；
X5选自-OH、-NH2、-NH-OH和
X6在每次出现时独立地选自H、-OH、-CH3和-CH2OH；
X7选自H、
X8选自H、-OH、-NH2和
以及其药学上可接受的盐。
101.根据权利要求99所述的化合物，具有选自由以下组成的组的结构：
结构
或其药学上可接受的盐。
102.一种抗体-药物缀合物，包含任选地通过接头与有效载荷缀合的靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段，所述有效载荷具有选自由以下组成的组的结构：
结构
或其药学上可接受的盐。
103.一种抗体-药物缀合物，包含靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段以及具有以下结构的有效载荷：
其中是所述有效载荷直接或通过接头附接至所述抗体或其抗原结合片段的附接点。
104.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述有效载荷具有以下结构：
105.一种抗体-药物缀合物，包含靶向胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的抗体或其抗原结合片段以及具有以下结构的接头-有效载荷：
其中是所述接头-有效载荷附接至所述抗体或其抗原结合片段的附接点。
106.根据权利要求105所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头-有效载荷具有以下结构：
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