Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN116462769A - 一种嵌合受体及其应用 - Google Patents

一种嵌合受体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116462769A
CN116462769A CN202211564465.0A CN202211564465A CN116462769A CN 116462769 A CN116462769 A CN 116462769A CN 202211564465 A CN202211564465 A CN 202211564465A CN 116462769 A CN116462769 A CN 116462769A
Authority
CN
China
Prior art keywords
domain
cells
cell
cancer
chimeric receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211564465.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘靖
张世都
叶群瑞
董军纪
宋益哲
李凯峰
李利佳
李文佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sunshine Lake Pharma Co Ltd filed Critical Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Publication of CN116462769A publication Critical patent/CN116462769A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001117—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR] or CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种嵌合受体及其应用，其包括：第一胞外结构域，其包括特异性靶向4‑1BB的结构域；以及第一跨膜结构域；所述嵌合受体还包括第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括激活信号转导结构域；所述第一胞外结构域还包括第一铰链区，所述第一铰链区与所述第一跨膜结构域相连接。该嵌合受体在与CAR分子在免疫细胞如T细胞共表达时，体内存续性较强，增强了CAR阳性免疫细胞对4‑1‑BB阳性NK/T细胞和CAR靶标抗原阳性细胞的杀伤持续性。此外，共表达嵌合受体CR和CAR分子的免疫细胞显示出增强的肿瘤杀伤能力、更优的CAR‑T体内存续性和降低的HVG反应。

Description

一种嵌合受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种嵌合受体及其应用。
背景技术
未经过HLA配型同种异体细胞进行异源移植时，移植宿主的免疫细胞会对异源细胞产生免疫排斥(Host anti-Graft，HVG，宿主抗移植物反应)，NK和T细胞对其攻击，导致移植细胞死亡，无法长时间发挥细胞功能。现异体器官移植主要依靠HLA配型来降低免疫排斥，同时服用免疫抑制剂对急性、慢性排斥进行抑制。
在通用化CAR-T使用中，无法使用免疫抑制剂的方式来解决HVG问题。现有的方案如敲除T细胞HLA相关基因，并未能消除HVG反应：敲除B2M基因后CAR-T细胞能躲避宿主T细胞攻击，但无法躲避NK细胞攻击。
在未解决HVG问题的情况下，现有的通用型CAR-T细胞在FCA(氟达拉滨+环磷酰胺+阿伦单抗)深度清淋的患者中体内存续时间也只有1个月左右，无法达到个性化CAR-T长达一年的体内存续时间，导致通用型CAR-T细胞整体治疗效果不理想，患者治疗后复发率较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制宿主抗外源免疫细胞HVG反应的嵌合受体，其特异识别4-1-BB靶标，并且不包括激活信号转导结构域，从而避免了与CAR共表达时胞内信号转导过强的问题，可有效提高对4-1-BB阳性NK/T细胞的杀伤持续性。
为此，本发明的第一方面提供一种嵌合受体(Chimeric Receptor，CR)，所述嵌合受体包括：
(i)第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1BB的结构域；以及
(ii)第一跨膜结构域；和
(iii)第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括刺激信号转导结构域；
所述第一胞外结构域还包括第一铰链区，所述第一铰链区与所述第一跨膜结构域相连接。
在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1BB的结构域；以及第一跨膜结构域；所述嵌合受体不包括胞内结构域。
在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1BB的结构域；以及第一跨膜结构域；第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括刺激信号转导结构域。
进一步，所述特异性靶向4-1BB的结构域包括抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、或4-1BBL胞外结构域或其变体。
进一步，所述抗4-1BB抗体或其抗原结合片段选自下组：Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、骆驼科动物VHH、纳米抗体)。
进一步，所述抗4-1BB抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述4-1BBL为人4-1BBL。
在一些实施方式中，所述4-1BBL胞外结构域包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第一铰链区包括选自下组蛋白质的铰链区的一种或两种以上的组合：IgG、CD8、CD28。
在一些实施方式中，所述第一铰链区包括CD8铰链区，其包括如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第一铰链区包括IgG的CH3结构域，其包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第一铰链区包括IgG的CH3结构域和CD8铰链区。
在一些实施方式中，所述第一铰链区包括IgG的CH3结构域和CD8铰链区。
在一些实施方式中，所述第一跨膜结构域选自下组蛋白质的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、CD3ζ、CD34。
在一些实施方式中，所述第一跨膜结构域包括CD8跨膜结构域，其包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
进一步，所述第一共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域中一个或多个：CD28、ICOS、4-1BB、OX20、OX40、CD27、CD30、HVEM。
在一些实施方式中，所述第一共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，其包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
进一步，所述第一胞内结构域不包括来自CD3ζ的胞内结构域。
进一步，所述嵌合受体还包括第一信号肽或第一前导序列。
在一些实施方式中，所述第一信号肽或第一前导序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
更进一步，所述嵌合受体分子还包括连接子，氨基酸序列如SEQ ID NO：21或SEQID NO：23所示。
在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1BBL胞外结构域或其变体，IgG的CH3结构域，CD8铰链区，CD8跨膜结构域，4-1BB共刺激结构域。
在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1BBL胞外结构域或其变体，IgG的CH3结构域，CD8铰链区，CD8跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1BBL胞外结构域或其变体，CD8铰链区，CD8跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述嵌合受体包括：4-1BBL胞外结构域或其变体，CD8铰链区，CD8跨膜结构域，4-1BB共刺激结构域。
在一些优选的实施方式中，所述嵌合受体包括：
(i)第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1BB的结构域；以及
(ii)第一跨膜结构域；和
(iii)第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括激活信号转导结构域。
第二方面，本发明提供一种分子组合，所述分子组合包括本发明第一方面所述的嵌合受体，和嵌合抗原受体(CAR)；所述嵌合抗原受体包括：
(iv)第二胞外结构域，所述第二胞外结构域包括抗原结合结构域；
(v)第二跨膜结构域；以及
(vi)第二胞内结构域，所述第二胞内结构域包括第二共刺激结构域，以及刺激信号转导结构域。
异体CART细胞进行移植时，会激活受者的免疫系统，导致受者出现针对异源移植物(CART)的免疫排斥反应，主要表现为部分受者T细胞攻击异源CART细胞。申请人在研究过程中发现，表达CR的CAR-T细胞，能有效攻击和清除被异体抗原激活的异源T细胞，从而使得CAR-T细胞异体移植后，能有效避免受者T细胞介导的免疫排斥，提高异体CAR-T的体内存续能力和细胞功能，进而增强肿瘤治疗效果。
进一步，所述抗原结合结构域为抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述抗原结合结构域包含选自下组的抗体或其抗原结合片段：Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab)2、三特异性Fab三聚体(Fab)3、Fv、单链Fv蛋白(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、骆驼科动物VHH、纳米抗体)。
进一步，所述抗原结合结构域为人源化抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)。
进一步，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：B细胞成熟抗原(BCMA)、CD4、CD7、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域结合CD19、CD20、CD22、BCMA。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
进一步，所述第二胞外结构域还包括第二铰链区，所述第二铰链区与所述第二跨膜结构域相连接。
在一些实施方式中，所述第二铰链区包括选自下组蛋白质的铰链区的一种或两种以上的组合：IgG、CD8、CD28。
在一些实施方式中，所述第二铰链区包括CD8铰链区，其包括如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第二跨膜结构域选自下组蛋白质的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、CD3ζ。
在一些实施方式中，所述第二跨膜结构域包括CD8跨膜结构域，其包括如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。
进一步，所述第二共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域：CD28、ICOS、4-1BB、OX20、OX40、CD27、CD30、HVEM。
在一些实施方式中，所述第二共刺激结构域包括CD28共刺激结构域，其包括如SEQID NO：8所示的氨基酸序列。
进一步，所述刺激信号转导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
进一步，所述刺激信号转导结构域分离自选自下组的蛋白质或多肽：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在一些实施方式中，所述刺激信号转导结构域分离自CD3ζ。
在一些实施方式中，所述刺激信号转导结构域包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
进一步，所述嵌合抗原受体还包括第二信号肽或第二前导序列。
在一些实施方式中，所述第二信号肽或第二前导序列包括以下氨基酸序列：SEQID NO：10。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：CD8铰链区，CD8跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域以及第二胞内结构域；优选地，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原；优选地，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：BCMA、CD4、CD7、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD171、癌胚抗原；优选地，所述第二胞内结构域包括第二共刺激结构域，以及激活信号转导结构域；优选地，所述第二共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域中的一个或多个：CD28、ICOS、4-1BB、OX20、OX40、CD27、CD30、HVEM；优选地，所述激活信号转导结构域分离自选自下组的蛋白质或多肽：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在一些优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：结合肿瘤抗原结合结构域，CD8铰链区，CD8跨膜结构域，CD28共刺激结构域，CD3ζ信号转导结构域。
在一些更优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：结合CD19的抗原结合结构域，CD8铰链区，CD8跨膜结构域，CD28共刺激结构域，CD3ζ信号转导结构域。
需要特别说明的是，本发明所述的CR分子，可以与任意结构的CAR分子在T细胞中共表达，不限于前面所述的CAR分子，只要其能够达到本发明所述的任一技术效果，比如增强的肿瘤杀伤能力、更优的CAR-T体内存续性、降低的HVG反应或降低的肿瘤复发率，均在本发明的保护范围内。
本发明的第三方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合受体和/或本发明第二方面所述的分子组合。
本发明的第四方面，提供一种载体，所述载体包含本发明第一方面所述的嵌合受体和/或本发明第二方面所述的分子组合。
进一步，所述载体是病毒载体或非病毒载体。
进一步，所述病毒载体选自下组：腺病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、猿猴病毒载体。
本发明的第五方面，提供一种细胞，所述细胞包括本发明第一方面所述的嵌合受体、本发明第二方面所述的分子组合、本发明第三方面所述的核酸分子、或本发明第四方面所述的载体。
进一步，所述细胞为真核细胞或原核细胞。
进一步，所述细胞为免疫细胞。
进一步，所述细胞选自下组：T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞。
在一些实施方式中，所述免疫细胞为T细胞。
在一些实施方式中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞(CAR-T)。
在一些实施方式中，所述免疫细胞为T细胞受体转导的T细胞(TCR-T)。进一步，所述免疫细胞缺少TRAC、TRBC、4-1BB和/或CD3蛋白的内源性表达；优选地，所述细胞缺少TRAC和/或4-1BB蛋白的内源性表达。申请人在研究过程中发现，CR-CAR T细胞存在一定程度的自杀伤能力，导致其增殖和扩增能力有所下降，而CR-CAR T细胞在进一步敲除4-1BB基因后，增殖能力可出现回升。
根据本发明的技术方案，当所述嵌合受体和嵌合抗原受体表达在TRAC、TRBC或者CD3基因敲除的T细胞时，能获得真正意义上通用的CAR-T细胞。此类型细胞不表达TCR分子，无GVHD(移植物抗宿主反应)，并能够避免HVG反应。
需要特别说明的是，本发明的所述的嵌合分子(CR)，在某些情况下可以扩展到于T细胞受体嵌合型T细胞(TCR-T)中表达。
本发明的第六方面，提供一种药物组合物，其包括本发明第五方面所述的细胞和药学上可接受的载体。
本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的嵌合受体、第二方面所述的分子组合、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、第五方面所述的细胞或第六方面所述的药物组合物在制备抑制免疫排斥反应的药物中的应用。
本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述的嵌合受体、第二方面所述的分子组合、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、第五方面所述的细胞或第六方面所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
进一步，所述癌症包括肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、头颈癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤等。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下进步：
本发明提出了新型嵌合分子——嵌合受体CR分子，其特异识别4-1BB靶标，并且不包括激活信号转导结构域，在与CAR分子在免疫细胞如T细胞共表达时，体内存续性较强，增强了CAR阳性免疫细胞对4-1-BB阳性NK/T细胞和CAR靶标抗原阳性细胞的杀伤持续性。
本发明还提供了包含嵌合受体和嵌合抗原受体的分子组合，及相应的载体、细胞等。当细胞(例如T细胞)共表达CR分子和CAR后，其能够特异识别4-1-BB阳性T/NK细胞并进行杀伤，并且具有良好的持续性，从而解决异体移植时产生的HVG问题。另一方面，共表达CR分子和CAR分子的细胞显示出增强的肿瘤杀伤能力，包括能够识别低抗原丰度的肿瘤细胞、更优的CAR-T代谢和分化表型、更优的CAR-T体内存续性，从而提高通用型CAR-T细胞体内存续时间，降低肿瘤复发率。
附图说明
图1：CR#1分子结构图；
图2：CR#2分子结构图；
图3：CR#3分子结构图；
图4：CR#4分子结构图；
图5：CD19-CAR分子结构；
图6CR#1CR#4分子和FMC63-CAR在T原代细胞中的表达情况；
图7CD19-UCART细胞刺激48小时后CD137表达情况；
图8不同CR(CR#1-CR#4)CAR-T对4-1BB+细胞48小时杀伤后残余靶细胞比率；
图9与异源T细胞孵育7天后，表达各CR分子的UCART细胞(CD3-细胞)剩余情况；
图10T细胞在不同剂量sgRNA-CAS9电转后，4-1BB阳性细胞比率；
图11表达CR#1分子的CAR-T和敲除4-1BB后的CR#1-CAR-T在磁珠刺激过程中增殖情况对比，CAR-T为对照组；
图12表达CR#1分子的CAR-T和敲除4-1BB后的CR#1-CAR-T在磁珠刺激级后续扩增过程中增殖情况对比，CAR-T为对照组。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
定义
除非另外定义，本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中通常使用的相同的含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
如本文中使用的，术语“4-1BB”和“4-1BB受体”具有相同含义并且可互换使用，又称CD137或TNFRSF9，其是指4-1BB受体的任何形式，以及保留4-1BB受体的至少一部分活性的变体、同种型和物种同系物。在一些实施例中，4-1BB包括来自所有哺乳动物物种的天然序列4-1BB，例如人、犬、猫、马和牛；在另一些实施例中，4-1BB来自人。
如本文中使用的，术语“抗4-1BB抗体”表示能够特异性识别并结合至4-1BB的抗体。
如本文中使用的，术语“4-1BBL”，又称4-1BB配体、CD137L或TNFSF9，其是4-1BB受体的高亲和力配体，4-1BBL上的受体结合位点位于其胞外结构域。以人4-1BBL(NP_003802.1)为例，在本发明的一些实施方式中，提供了包括人4-1BBL的胞外结构域的第一胞外结构域，并提供了如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本公开内容提供了修饰的免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)、或T细胞受体(TCR)，其表现出与新抗原的特异性结合。CAR可包含能够结合T细胞表面蛋白，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的抗原相互作用结构域。
抗原结合结构域可包含能够结合抗原的任何蛋白质或分子，例如T细胞表面蛋白。抗原结合结构域的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，重组抗体，人抗体，人源化抗体，鼠抗体或其功能衍生物，变体或片段。包括但不限于Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，单链Fv(scFv)，微抗体，双抗体和单结构域抗体如重链可变结构域(VH)，骆驼科动物衍生的纳米抗体的轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv和scFv中的至少一种。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指能够以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，包括单链结合分子，基于细胞色素b562的结合分子，纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架(例如，adnectin)，脂质运载蛋白支架，杯芳烃支架，A域和其他支架。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物，变体或片段。例如，抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可包含scFV。scFv可以衍生自已知可变区序列的抗体。在一些实施方案中，scFv可衍生自获自可获得的小鼠杂交瘤的抗体序列。scFv可以从肿瘤细胞或原代细胞的全体外显子测序中获得。在一些实施方案中，可以改变scFv。例如，可以以各种方式修改scFv。在一些情况下，可以突变scFv，使得scFv可以对其靶标具有更高的亲和力。在一些情况下，scFv对其靶标的亲和力可以针对在正常组织上以低水平表达的靶标进行优化。可以进行该优化以最小化潜在的毒性，例如高细胞因子血症。在其他情况下，克隆对靶膜结合形式具有更高亲和力的scFv可优于其可溶形式对应物。如果某些靶标也可以以不同水平的可溶形式检测，并且它们的靶向可以引起非预期的毒性，例如高细胞因子血症，则可以进行该修饰。
可以通过跨膜结构域将本系统的CAR的抗原结合结构域与细胞内信号传导结构域连接。跨膜结构域可以是跨膜区段。受试者CAR的跨膜结构域可以将CAR锚定到细胞的质膜，例如免疫细胞。在一些实施方案中，跨膜区段包含多肽。连接CAR的抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜多肽可具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含具有至少1个(例如，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个)氨基酸取代，缺失和多肽的多肽序列。插入与内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，例如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽通过抗原结合结构域将信号从细胞的细胞外区域传递至细胞内区域。CD28的天然跨膜部分可用于CAR。在其他情况下，CD8α的天然跨膜部分也可用于CAR。
在一个方面，本公开内容提供了一种通用性CAR(UCAR)免疫细胞，其特征在于，a.所述UCAR免疫细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)；b.所述UCAR免疫细胞用于治疗T细胞肿瘤患者；c.所述UCAR免疫细胞的CAR包含靶向T细胞表面蛋白的抗体或抗体的可变区；d.所述UCAR免疫细胞并非来自患者自体；在一些实施例中，UCAR免疫细胞是UCAR-T细胞。
在一些实施例中，UCAR-T细胞敲除了TCR基因的全部或部分(如TRAC)，或者HLA基因的全部或部分(如B2M)。敲除上述基因，一方面可以避免UCAR-T细胞攻击患者自体细胞，另一方面可避免患者自体T细胞攻击UCAR-T细胞。
在一些实施例中，基因敲除采用锌指核糖核酸酶(ZFN)技术体系；在一些实施例中，基因敲除采用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术体系；在一些实施例中，基因敲除采用CRISPER系统；在一些实施例中，基因敲除采用CRISPER-Cas9系统。
在一些实施例中，UCAR-T细胞敲除了TRAC基因；在另一些实施例中，UCAR-T细胞同时敲除了TRAC、4-1BB基因。
如本文中使用的，术语“氨基酸”表示包含丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺(Gln，Q)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)的天然存在的羧基α-氨基酸的组。
如本文中使用的，术语“载体”指用于将与其可操作地相关联的特定基因引入靶细胞中并且指导所述特定基因的表达的核酸分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。本发明的表达载体包括表达盒。表达载体允许大量稳定的mRNA的转录。一旦表达载体进入靶细胞内，则通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。本发明中可使用的载体包括但不限于：病毒载体，例如腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、杆状病毒、仙台病毒、麻疹病毒、猿猴病毒载体；非病毒载体，例如质粒、脂质复合物(阳离子脂质体-DNA复合物)、多聚复合物(阳离子聚合物-DNA复合物)和蛋白质-DNA复合物等。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”，指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。在本发明的实施方式中，宿主细胞可以为免疫细胞。
如本文所使用的，术语“免疫细胞”指免疫系统的细胞，所述免疫细胞可以分类为淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞和NK细胞)、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是巨噬细胞。在一些实施例中，免疫细胞是工程化免疫细胞，意味着所述免疫细胞已经被基因修饰以表达非天然存在的蛋白质(例如，嵌合受体、嵌合抗原受体)或包含外源核酸；和/或，所述免疫细胞已经被修饰以缺失某些内源基因(例如，TRAC基因、TRBC基因、CD3基因)编码蛋白的表达。
术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包括胸腺细胞、原初T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或任何其他T细胞亚群。
本文所述的“CAR-T”、“CART”均指嵌合抗原受体T细胞。
如本文所用，术语“T细胞受体”(TCR)是指能够特异性地与靶抗原相互作用的异质细胞表面受体。如本文所用，“TCR”包括但不限于天然存在和非天然存在的TCR；全长TCR及其抗原结合部分；嵌合TCR；TCR融合构建体；以及合成TCR。
实施例1CR受体分子和CAR分子构建及表达
1、不同嵌合受体蛋白的氨基酸序列设计如下：
CR#1受体：信号肽+4-1-BBL蛋白(去除跨膜结构域)+CH3 Hinge+CD8Hinge+CD8 TM(跨膜域)+4-1-BB共刺激结构域。CR分子结构示意图见图1。
CR#2受体：信号肽+4-1-BBL蛋白(去除跨膜结构域)+CH3 Hinge+CD8Hinge+CD8 TM(跨膜域)。受体分子结构示意图见图2。
CR#3受体：信号肽+4-1-BBL蛋白(去除跨膜结构域)+CD8 Hinge+CD8 TM(跨膜域)+4-1-BB共刺激结构域。结构示意图见图3。
CR#4受体：信号肽+4-1-BBL蛋白(去除跨膜结构域)+CD8 Hinge+CD8 TM(跨膜域)。结构示意图见图4。
CD19-CAR分子：FMC63+CD8 Hinge+CD8 TM(跨膜域)+CD28共刺激结构域或4-1BB共刺激结构域+CD 3zeta。见图5。
CR受体分子氨基酸序列和对应DNA序列如表1所示：
表1CR#1受体分子：
表2CR#2分子：
表3CR#3分子：
表4CR#4分子：
带有信号肽的anti-CD19 FMC-CAR氨基酸序列如下：
MGVKVLFALICIAVAEADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSEFTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：16)
带有信号肽的anti-CD19 FMC-CAR DNA表达序列如下：
ATGGGCGTCAAGGTCCTGTTCGCCCTGATCTGCATCGCCGTCGCCGAGGCCGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCTTCATCATCTTTTGGGTCCGCAGCAAGCGGAGCAGAGGCGGCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCTGGCCCCACCAGAAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCCGGGACTTTGCCGCCTACAGAAGCCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG(SEQ ID NO：17)将设计的构建的不同CR结构和CD19-CAR的核苷酸序列送至苏州金唯智生物科技有限公司合成后经过BamH I和SalI双酶切后连入Piggybac表达载体pPBEF(本公司自行构建载体)，转入stbl3感受态中扩增提取质粒备用。
2、T细胞激活，电转CR-PB质粒
2.1取CD3+阳性细胞(活力98.5％，活细胞5X106)2mL，加入到含有5mL AIM-V的15mL离心管中，500g、5min离心收集细胞弃上清，用10mL AIM-V培养基(含20IU/mL的IL-2)重悬细胞后转移到10cm平皿中培养，取180mL CD3/28磁珠，加入4mL缓冲液洗涤，放入磁力架2min，移去上清液，取180μLAIM-V培养基(含20IU/mL的IL-2)重悬后，加入至细胞液中，混匀，放入培养箱培养，培养24小时后进行病毒转染。
2.2将细胞取出置于15mL离心管中，放入磁力架2min，吸出细胞液于另一个干净的15mL离心管中。取10μL细胞液，加入10μL AO/PI染液(staining solution)，混匀加入至细胞计数板中，活力98.41％、活细胞密度4.01X106，取3mL细胞液，500g离心5min，弃去上清。
计数后，确定需要电转的孔数，分装于12孔板中，每孔1.5mL培养基，提前半小时于37℃培养箱中预热；
2.3配制电转液(100μL体系)：82μL P3 primary cell solution+18μLsupplement，混匀备用。电转试剂盒为Lonza P3 primary cell electroporation kit。
取5.0E+6细胞分装于1.5mL EP管中，100g，室温，10min离心后弃上清，再用1mLPBS(钙、镁离子free)洗一遍，100g，室温，10min离心，弃上清；
电转：100μL电转液中加入CR-PB质粒(4μg)、CD19-CAR-PB质粒(4μg)和Pbase质粒(4μg)，轻柔混匀后，重悬细胞，转入电转杯，电转程序FI-115。电击后转移到提前孵育有1.5mL培养基的12孔板中，再另取500μL培养基洗电转杯，细胞液转入12孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养。
电转后12小时，细胞离心去除电转液，以10^6cells/mL密度铺板培养到第三天(富集当天)进行CAR和CR质粒表达检测。
3、流式检测CAR和CR分子表达
3.1收集不同组CAR-T细胞，每组约106个，共计1个阴性对照组T细胞和10个实验组。
3.2 500g，5min离心收集细胞，弃上清；加入500μL PBS重悬，离心500g，5min，重复2次，弃上清。阴性对照组加入200μL PBS重悬，放入4℃保存。
3.3实验组加入500μLPBS重悬，加入1μL FTIC标记的anti-FMC63抗体，4℃避光孵育30min；孵育完成后4℃，500g，5min，离心收集细胞弃上清；加入500μL PBS重悬，4℃，500g，5min，离心收集细胞弃上清，重复3次，加入200μL PBS重悬，用于流式检测CAR表达。
3.4实验组加入200μL PBS重悬，加入0.4μL R-Phycoerythrin affinipure goatanti-human IgG Fcγfragment specific抗体，避光孵育20min；孵育完成后500g，5min，离心收集细胞弃上清；加入500μL PBS重悬，4℃，500g，5min，离心收集细胞弃上清，重复3次，加入200mL PBS重悬，用于流式检测CR分子表达。
利用Piggy-bac质粒结合电转，可实现CAR分子和CR分子转导，各蛋白均能在人T细胞中表达，且正确定位于细胞膜上。结果如图6。
流式结果显示，5个分子均能在细胞膜定位，使用活细胞染色流式检测到。
实施例2CR-CAR T细胞对4-1BB+细胞杀伤能力检测
1、CD19-UCAR-T细胞进行抗原激活，表达4-1BB
1.1制备CD19抗原包被的孔板：2μg/mL CD19蛋白2mL/孔在6孔板中4℃包被过夜或者室温包被6个小时。包被好后，吸走蛋白，PBS洗涤一次，备用；
1.2复苏CD19-UCART细胞，2.0E+6总细胞用2mLCTSTMOpTmizerTMTCell Expansion培养基重悬后，加入到包被好的孔中，培养48小时；
1.3取出1.0E+6细胞，进行4-1BB表达率流式检测：350g，5min离心收集细胞，弃上清；加入500μL PBS重悬，离心350g，5min，重复2次，弃上清。200μL Staining buffer重悬后，加入20μL anti-human CD137抗体，室温避光孵育20min。加入500μL PBS重悬，离心350g，5min，重复2次，最后用200μL PBS重悬孵育好的细胞上机检测。流式检测图见图7，阳性率为67.40％，未刺激的UCAR-T为对照组，阳性率为5.76％，证明CD19刺激有效。
2、CR-CAR-T与4-1BB+UCAR-T共孵育，检测杀伤效果。
2.1按照CR+/CD137+为1:1的数量，把刺激后的UCAR-T与表达CR的CAR-T细胞进行共孵育，对照组为不表达CR的CAR-T与刺激后的UCAR-T共孵育组。同时设立单独组作为对照。共孵育孔每孔CR+CR-CAR-T加入6.0E+4/孔，CD137+UCAR-T同样6.0E+4/孔；单独孵育组则分别支架CR-CAR-T或UCAR-T。
2.2孵育48小时后，进行总细胞计数，并进行CD3/CAR抗体染色。CD3-CAR+细胞为靶细胞UCAR-T，CD3+细胞为CR-CAR-T细胞。48小时后各共孵育组中CD3-CAR+细胞数与UCAR-T单独孵育组中CD3-CAR+细胞数进行对比，可以得出共孵育后靶标UCART细胞变化比率。结果见图8：
结果显示四种CR-CART分子均对4-1BB+细胞具有特异杀伤能力，且CR#1-CART和CR#3-CART杀伤能力最强。
实施例3TCR ko型CR-CAR T细胞对异体T细胞免疫排斥抑制能力
1、TCR KO型CR-CAR T制备
1.1复苏T细胞，2.0E+6总细胞用2ml CTSTMOpTmizerTMT Cell Expansion培养基重悬后，加入到包被好的孔中，培养25小时；
1.2利用电转仪向T细胞转导CR和CAR表达质粒及TRAC-RNP
配制电转液(100μL体系)：82μL P3 primary cell solution+18μL supplement，混匀备用。电转试剂盒为lonza P3 primary cell electroporation kit。
取5.0E+6细胞分装于1.5mL EP管中，100g，室温，10min离心后弃上清，再用1mLPBS(钙、镁离子free)洗一遍，100g，RT，10min离心，弃上清；
电转：100μL电转液中加入CR-PB质粒(4μg)、CD19-CAR-PB质粒(4μg)和Pbase质粒(4μg)，以及5μL电转液中4μg TRAC sgRNA+4μg CAS9共孵育RNP复合物。(sgRNA序列为mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO：18)。轻柔混匀后，重悬细胞，转入电转杯，电转程序FI-115。电击后转移到提前孵育有1.5mL培养基的12孔板中，再另取500μL培养基洗电转杯，细胞液转入12孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养。
1.3电转后12小时去除电转液，加入CD3/28抗体磁珠(20μL磁珠1E6细胞)进行刺激，记为Day0，刺激至Day2利用磁铁去除磁珠，继续培养至D8。检测CR、CAR表达及CD3-比率情况。
2、CR-UCAR-T与异体T细胞共孵育，检测UCAR-T持续情况。
2.1复苏异源T细胞，按照2.0E+6总细胞用2mL CTSTMOpTmizerTMT Cell Expansion培养基重悬后进行培养，不进行激活。
2.2异源T细胞复苏后24小时，按照CR+CR-UCART细胞/异体T细胞为1:4的数量比，把扩增得到的CR-UCART与异源T细胞进行共孵育，对照组为不表达CR分子的UCART与异源T细胞共孵育组。同时设立单独组作为对照。共孵育孔每孔CR+CR-UCART加入1.0E+5/孔，异源T细胞则为4.0E+5/孔；单独孵育组则分别支架CR-CART或UCART，对照组为不表达CR分子的UCART，总细胞数与CR-UCART相同，与4.0E+5异源T细胞共孵育。
2.3孵育7天后，进行总细胞计数，并进行CD3/CR抗体染色。CD3+细胞为异体T细胞，CD3-细胞为UCART细胞。各共孵育组中UCART细胞数进行对比，可以得出表达CR分子是否能抵抗异体T细胞对UCART的攻击。结果见图9：
结果显示，表达CR分子的UCAR T细胞均能抵抗异体T细胞对UCART细胞的攻击(CR#1和#3抵抗能力较强，CR#2和#4相对较弱)，不表达CR分子的对照组UCAR T(CD3-细胞)几乎消失。
实施例4 4-1BB敲除对CR#1-CAR-T细胞同族杀伤的影响
1、4-1BB KO型CR#1-CAR-T制备
1.1设计4-1BB SgRNA序列为mA*mC*mA*UUUAACGAUCAGAAACGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*Mu(SEQ IDNO：19)
1.2复苏T细胞，6孔板每孔中2.0E+6总细胞用2ml CTSTMOpTmizerTMTCellExpansion培养基重悬后，培养24小时后进行电转；
1.3利用电转仪向T细胞转导CR#1和CAR表达质粒，扩增
配制电转液(100μL体系)：82μL P3 primary cell solution+18μL supplement，混匀备用。电转试剂盒为Lonza P3 primary cell electroporation kit。
取5.0E+6细胞分装于1.5ml EP管中，100g，室温，10min离心后弃上清，再用1mlPBS(钙、镁离子free)洗一遍，100g，RT，10min离心，弃上清；
4-1BB KO CR-CART实验组电转：100μL电转液中加入CR#1-PB质粒(4μg)、CD19-CAR-PB质粒(4μg)和Pbase质粒(4μg)以及5μL电转液中8μgTRAC sgRNA+8μg CAS9共孵育RNP复合物。轻柔混匀后，重悬5.0E+6细胞，转入电转杯，电转程序FI-115。
CAR-T对照组电转：100μL电转液中加入CD19-CAR-PB质粒(4μg)和Pbase质粒(4μg)。轻柔混匀后，重悬5.0E+6细胞，转入电转杯，电转程序FI-115。
CR-CART对照组电转：100μL电转液中加入CR#1-PB质粒(4μg)、CD19-CAR-PB质粒(4μg)和Pbase质粒(4μg)。轻柔混匀后，重悬5.0E+6细胞，转入电转杯，电转程序FI-115。
对于不同剂量下sgRNA电转后对T细胞的4-1BB的敲除效果，进行了摸索，见图10。由图10结果可知，随着sgRNA剂量的增加，4-1BB的敲除效果增加。
2、4-1BB KO CR-CART细胞、CR-CART对照细胞和CAR-T在D3-D12过程中增殖检测。
2.1电转后12小时去除电转液，再培养24小时后加入CD3/28抗体磁珠(25μL磁珠1E6细胞)进行刺激，记为Day 3。刺激到Day 7去除磁珠。
2.2每天进行细胞计数，记录各点细胞数目。
将上述细胞悬液转移至15ml离心管中，于离心机中300g，5min离心；吸弃上清，轻弹细胞沉淀，向离心管中加入1ml人成纤维细胞无血清完全培养基重悬，并取20μl细胞悬液于1.5ml EP管中进行AO/PI 20μl(1:1)染色进行计数。
结果如图11和图12所示。结果显示，由于CR分子靶向4-1BB+细胞产生的同族杀伤效应，CR#1-CART增殖能力显著弱于CART组，但是进行4-1BB敲除后，在敲除效率较低的情况下，4-1BB+KO型CR#1增殖能力也出现明显回升。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (18)

1.一种嵌合受体，其特征在于，所述嵌合受体包括：
(i)第一胞外结构域，所述第一胞外结构域包括特异性靶向4-1BB的结构域；以及
(ii)第一跨膜结构域；和
(iii)第一胞内结构域，所述第一胞内结构域包括第一共刺激结构域，并且不包括激活信号转导结构域；
所述第一胞外结构域还包括第一铰链区，所述第一铰链区与所述第一跨膜结构域相连接。
2.如权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于，所述特异性靶向4-1BB的结构域包括抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、或4-1BBL胞外结构域或其变体；
优选地，所述4-1BBL胞外结构域包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于，所述第一铰链区包括选自下组蛋白质的铰链区的一种或两种以上的组合：IgG、CD8、CD28；
优选地，所述第一铰链区包括CD8铰链区，其包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
优选地，所述第一铰链区包括IgG的CH3结构域，其包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
优选地，所述第一铰链区包括IgG的CH3结构域和CD8铰链区。
4.如权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于，所述第一跨膜结构域选自下组蛋白质的跨膜结构域：CD4、CD8、CD28、CD3ζ；
优选地，所述第一跨膜结构域包括CD8跨膜结构域，其包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于，所述第一共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域：CD28、ICOS、4-1BB、OX20、OX40、CD27、CD30、HVEM；
优选地，所述第一共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，其包括如SEQID NO：5所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于，所述嵌合受体还包括第一信号肽或第一前导序列；
优选地，所述第一信号肽或第一前导序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
7.一种分子组合，其特征在于，所述分子组合包括权利要求1-6任一项所述的嵌合受体，和嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包括：
(iv)第二胞外结构域，所述第二胞外结构域包括抗原结合结构域；
(v)第二跨膜结构域；以及
(vi)第二胞内结构域，所述第二胞内结构域包括第二共刺激结构域，以及激活信号转导结构域。
8.如权利要求7所述的分子组合，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域以及第二胞内结构域。
9.如权利要求8所述的分子组合，其特征在于，所述抗原结合结构域结合选自下组的抗原：BCMA、CD4、CD7、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD171、癌胚抗原；
优选地，所述抗原结合结构域结合CD19、CD20、CD22、BCMA；
优选地，所述抗原结合结构域包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
10.如权利要求8所述的分子组合，其特征在于，所述第二共刺激结构域选自下组蛋白质的共刺激结构域中的一个或多个：CD28、ICOS、4-1BB、OX20、OX40、CD27、CD30、HVEM；
优选地，所述第二共刺激结构域包括CD28共刺激结构域，其包括如SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列；
优选地，所述激活信号转导结构域分离自选自下组的蛋白质或多肽：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d；
优选地，所述激活信号转导结构域分离自CD3ζ，包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
11.如权利要求7～10任一项所述的分子组合，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括第二信号肽或第二前导序列；
优选地，所述第二信号肽或第二前导序列包括以下氨基酸序列：SEQ IDNO：10。
12.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-6任一项所述的嵌合受体和/或权利要求7-11任一项所述的分子组合。
13.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1-6任一项所述的嵌合受体和/或权利要求7-11任一项所述的分子组合；
优选地，所述载体是病毒载体或非病毒载体；
优选地，所述病毒载体选自下组：腺病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、猿猴病毒载体。
14.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求1-6任一项所述的嵌合受体、权利要求7-11任一项所述的分子组合、权利要求12所述的核酸分子、或权利要求13所述的载体；
优选地，所述细胞为真核细胞或原核细胞；
优选地，所述细胞为免疫细胞；
优选地，所述细胞选自下组：T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞；
优选地，所述免疫细胞为T细胞；
优选地，所述免疫细胞为T细胞受体转导的T细胞。
15.如权利要求14所述的细胞，其特征在于，所述细胞缺少TRAC和/或4-1BB蛋白的内源性表达。
16.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求14所述的细胞和药学上可接受的载体。
17.权利要求1-6任一项所述的嵌合受体、权利要求7-11任一项所述的分子组合、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14-15任一项所述的细胞或权利要求16所述的药物组合物在制备抑制免疫排斥反应的药物中的应用。
18.权利要求1-6任一项所述的嵌合受体、权利要求7-11任一项所述的分子组合、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14-15任一项所述的细胞或权利要求16所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用；
优选地，所述癌症包括肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、头颈癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
CN202211564465.0A 2022-04-02 2022-12-07 一种嵌合受体及其应用 Pending CN116462769A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022103461127 2022-04-02
CN202210346112 2022-04-02
CN202211123228 2022-09-15
CN2022111232280 2022-09-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116462769A true CN116462769A (zh) 2023-07-21

Family

ID=87175959

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211564465.0A Pending CN116462769A (zh) 2022-04-02 2022-12-07 一种嵌合受体及其应用
CN202211563854.1A Active CN116640226B (zh) 2022-04-02 2022-12-07 一种抑制宿主抗外源免疫细胞hvg反应的嵌合受体

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211563854.1A Active CN116640226B (zh) 2022-04-02 2022-12-07 一种抑制宿主抗外源免疫细胞hvg反应的嵌合受体

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN116462769A (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103965361B (zh) * 2013-02-06 2018-10-30 上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司 一种t细胞信号的嵌合分子转换器及其用途
ES2686968T3 (es) * 2013-05-06 2018-10-23 China Pharmaceutical University Proteínas de fusión bifuncionales para inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral y para activar las respuestas inmunitarias adaptativas y los genes y usos de las mismas
CN104177499B (zh) * 2013-05-27 2019-01-08 上海雅科生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用
MX2017006250A (es) * 2014-11-14 2017-11-17 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno que comprenden un trimero de ligando de la familia de tnf.
CN107723275B (zh) * 2017-10-20 2020-09-04 重庆精准生物技术有限公司 通用型car-t细胞及其制备方法和应用
CN109970864A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 一种双向激活共刺激分子受体及其用途
CN109970865B (zh) * 2017-12-28 2022-10-04 上海细胞治疗研究院 一种cd137双向激活共刺激分子受体及其用途
TW202031894A (zh) * 2018-11-01 2020-09-01 中國大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司 用於t細胞工程之組合物及方法
CN110272493A (zh) * 2019-06-05 2019-09-24 南京凯地生物科技有限公司 靶向cd19的特异性嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和临床应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116640226A (zh) 2023-08-25
CN116640226B (zh) 2024-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7106610B2 (ja) 導入遺伝子の遺伝子タグおよびその使用方法
JP2023091037A (ja) Ｇタンパク質共役受容体を標的化するキメラ抗原受容体およびその使用
AU2023233207A1 (en) Chimeric antigen receptors (CARs), compositions and methods of use thereof
EP3039040B1 (en) Anti cd30 chimeric antigen receptor and its use
CN107337737B (zh) 一种嵌合抗原受体及其应用
CN111995688B (zh) 靶向cd123和nkg2d配体的双特异嵌合抗原受体及应用
WO2016172703A2 (en) Kappa myeloma antigen chimeric antigen receptors and uses thereof
CN109266667B (zh) 靶向cd5的嵌合抗原受体及其应用
EP3833682B1 (en) Suicide module compositions and methods
WO2015179833A1 (en) Compositions and methods for treating antibody resistance
CN112442508B (zh) 靶向cd22和cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN116640226B (zh) 一种抑制宿主抗外源免疫细胞hvg反应的嵌合受体
EP4289867A1 (en) Chimeric antigen receptor with endogenous protein molecule replacing single domain antibody
WO2023232899A1 (en) Anti-steap1 car
CN108424463B (zh) 一种堆积型的嵌合抗原受体及其制备方法
CN115466331B (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN114031690B (zh) 靶向ccr1和nkg2d配体的嵌合抗原受体及其应用
WO2023286840A1 (ja) 抗ＥＧＦＲｖｉｉｉ抗体、ポリペプチド、前記ポリペプチドを発現する細胞、前記細胞を含む医薬組成物、前記細胞の製造方法、及び、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド又はベクター
WO2023150698A2 (en) Chimeric ilt receptor compositions and methods
WO2021188454A1 (en) Engineered cell compositions and methods of use thereof
CN117813384A (zh) 嵌合抗原受体、表达前述受体的细胞、包含前述细胞的医药组合物、前述细胞的制造方法、及包含编码前述嵌合抗原受体的碱基序列的多核苷酸或载体
CN118324924A (zh) 一种包含人源化cll1抗体的嵌合抗原受体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 523808 No.1, Gongye North Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province

Applicant after: Guangdong Dongyangguang Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 523808 No.1, Gongye North Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province

Applicant before: SUNSHINE LAKE PHARMA Co.,Ltd.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination