CN118324924A - 一种包含人源化cll1抗体的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体及其应用，该嵌合抗原受体包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:1所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中的原始和幼稚髓系细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情危重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。婴幼儿比成人易发生AML，本病占小儿白血病的30％。目前的治疗方法有：化疗、支持治疗、造血干细胞移植。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区(Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv)、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体(Variable Lymphocyte Receptors，VLR)衍生而来；其中最为常见的来源就是scFv抗体。CAR-T细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。目前，CAR-T细胞免疫疗法在多种血液系统肿瘤的治疗中取得了显著的成效，如：用于治疗B细胞淋巴瘤的CD19 CAR-T和用于治疗多发性骨髓瘤的BCMA CAR-T已有上市药物。然而，由于AML的异质性，较难发现治疗AML的理想CAR-T靶点，现有针对AML的靶点有CD33、CD123、LeY、NKG2D等，但这些靶点均未有上市的CAR-T药物。
研究发现，CLL1(C-type Lectin-like Molecule 1，C-型凝集素样分子-1)是有治疗AML前景的理想靶标，因为CLL1在正常造血干细胞中不表达，在AML原始细胞和白血病干细胞中高表达，因此寻找以CLL1为靶点的、适合药物的嵌合抗原受体，尤其是以CLL1为靶点的、适合CAR-T细胞治疗药物的嵌合抗原受体具有现实意义。
发明内容
本申请提供了一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体及其应用，发明人针对自主开发的靶向CLL1的鼠源抗体进行了人源化改造以在保留其功能性和特异性的同时，降低其异源性。在此基础上，发明人将经过人源化改造的scFv抗体作为CLL1CAR结构的胞外抗原识别结构域，以此构建了嵌合抗原受体表达载体、制备了靶向CLL1的CAR-T细胞，还在细胞水平验证了CLL1 CAR以及CLL1 CAR-T细胞的多项指标。
本申请提供了一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体，其包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：所述CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；
所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ IDNO:1所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:3所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:4所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
本申请还提供了一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体，其包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：所述CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；
所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，CLL1胞外抗原识别结构域包括选自以下结构中的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区的氨基酸来源于CD8α；进一步可选地，所述铰链的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区的氨基酸序列来源于CD8α；进一步可选地，所述跨膜区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述胞内信号传导区来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ；进一步可选地，所述胞内信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，所述共刺激信号传导区来源于CD28或4-1BB；进一步可选地，所述共刺激信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α；进一步可选地，所述引导肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
再一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一种嵌合抗原受体的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在某些实施方式中，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列包含：
1)编码如SEQ ID NO:19所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:17所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:48所示；或
2)编码如SEQ ID NO:19所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:18所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:49所示；或
3)编码如SEQ ID NO:24所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:50所示；和编码如SEQ ID NO:22所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:51所示。
再一方面，本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
上述载体在某些实施方式中，为表达载体；在某些实施方式中，载体为病毒载体；在某些实施方式中，载体为慢病毒载体。
本申请还提供了一种经工程化的免疫效应细胞，其包含上述嵌合抗原受体、上述分离的核酸分子，或上述载体。
上述经工程化的免疫效应细胞在某些实施方式中，所述经工程化的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、诱导性多能干细胞、诱导性多能干细胞分化成的T细胞、诱导性多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种。
上述经工程化的免疫效应细胞在某些实施方式中，所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。
上述经工程化的免疫效应细胞在某些实施方式中，T淋巴细胞为αβT淋巴细胞或γδT淋巴细胞。
上述经工程化的免疫效应细胞在某些实施方式中，所述经工程化的免疫效应细胞的表面可以表达或表达有本申请所述的嵌合抗原受体。
本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料。
上述药物组合物在某些实施方式中，药学上可接受的辅料包括保护剂。
上述药物组合物在某些实施方式中，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。
上述药物组合物在某些实施方式中，药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。
上述药物组合物在某些实施方式中，药物组合物为静脉注射剂。
本申请还提供上述嵌合抗原受体、分离的核酸分子、载体或经工程化的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。
上述应用在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述应用在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
本申请还提供了一种治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述经工程化的免疫效应细胞或药物组合物施用于具有治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。
上述方法在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述方法在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为静脉注射。
上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为将有效量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物以单次注射的方式施用于受试者。
上述方法在某些实施方式中，有效量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物为1×105至1×107个细胞/kg的剂量。
本申请还提供了一种药物，其包含上述经工程化的免疫效应细胞或药物组合物，用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。
上述药物在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述药物在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
附图说明
图1表示了本申请实施例2中各种CLL1 CAR的结构示意图，在该示意图中从上到下分别为：CD8a信号肽、抗CLL1 scFv、CD8a铰链区和跨膜区、4-1BB、CD3δ。
图2A和图2B表示了本申请实施例4中各种CLL1 CAR-T细胞在不同效靶比对不同靶细胞的裂解杀伤效果；其中：图2A中靶细胞是HL60-luc；图2B中靶细胞是K562-CLL1-luc。
图3表示了本申请实施例5中各种CLL1 CAR-T细胞被不同靶细胞激活后的细胞因子IFN-γ因子释放情况，从左至右的三组分别为K562、K562-CLL1、HL60作为靶细胞；其中:每一组中从左到右依次表示阳性对照BG1805、1-3LH、1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、1-3LH-Q3、3-67LH、3-67LH-Q1和3-67LH-Q2细胞被靶细胞激活后的细胞因子IFN-γ因子释放情况。
图4表示了本申请实施例6中各种CLL1 CAR-T细胞在持续性增殖实验中，单轮中被阳性靶细胞激活后的增殖情况。
图5表示了本申请实施例中小鼠体内药效试验结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“抗体”具有本领域常规的含义，在本申请中以最广泛的含义使用，通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，重链和轻链的V区分别简称为VH和VL，重链和轻链的C区分别简称为CH和CL。在抗体可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区(hypervariable regions，HVR)；在L链、H链的V区中各有三个高变区，该部位因在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，故高变区又称互补性决定区(complementarity determining region，CDR)。抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。抗体的6个CDR区共同决定了抗体对相应抗原的识别能力和特异性。本领域技术人员应当理解，当本申请限定了6个CDR区的氨基酸序列时，抗体对相应抗原的识别能力和特异性是可预期的。
在本申请中，术语“抗原结合部位”具有本领域常规的含义，是指抗体上可特异性识别并结合抗原的关键部位，包括VH和/或VL区。
在本申请中，术语“scFv”具有本领域常规的含义，是指单链可变区(Single ChainVariable Fragment，缩写为scFv)，其是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽(linker，连接序列)连接而成的抗体。
在本申请中，术语“Sc(Fv)2”等未具体解释的名词也都具有本领域常规的含义。
本申请中，术语“人源化抗体”也称为经过人源化改造的抗体，其具有本领域常规的含义，人源化改造的方法是已知的，进行人源化改造的目的是，基本保留亲本抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应，有利应用于人体。例如，在CDR获自兔抗体的情况下，可合成引物(参考WO98/13388中描述的方法可以获得相应引物)，将其用于将兔抗体的CDR与人抗体的框架区(FR)连接。对于与CDR相连接的人抗体FR而言，要选择能使得CDR区形成良好的抗原结合位点的那些。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括胞外抗原识别结构域(例如，结合肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T(ChimericAntigen Receptor T)细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。
在本申请中，术语“胞外抗原识别结构域”是指抗原识别结构域(AntigenRecognition Domain，ARD)。CAR细胞治疗产品(如CAR-T细胞)之所以能特异性识别和/或结合到肿瘤细胞表达的靶抗原，依赖于胞外抗原识别结构域，到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区(Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv)、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体(Variable Lymphocyte Receptors，VLR)衍生而来。到目前为止，最为常见的来源就是抗体的scFv段，scFv包括抗体重链可变区和轻链可变区，它们之间由肽链连接。
本申请中，术语“特异性识别和/或结合”是指CAR和特异性靶标之间的识别和/或结合，是以比CAR结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标。
在本申请中，术语“铰链区”是指作用于胞外抗原识别结构域与跨膜结构域之间的连接段，这个区域通过给予抗原识别结构域一定的活动范围，允许CAR识别抗原。目前使用的铰链区主要来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种。此外，典型的铰链区还包含一些残基，这些残基参与CAR二聚化，有助于增强抗原的敏感性。
在本申请中，“跨膜区”是指连接着CAR结构的细胞内和细胞外成分的跨膜结构域。不同的跨膜结构域可以一定程度上影响CAR的表达和稳定性，但是并不直接参与信号传递，通过相互作用可以提高下游信号传递。所述跨膜区可以来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种。
在本申请内，术语“细胞内结构域”包括胞内信号传导区，还可以包括共刺激信号传导区。
在本申请中，术语“胞内信号传导区”是负责表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。所述胞内信号传导区可以来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种。
在本申请中，术语“共刺激信号传导区”之所以存在，是因为除了抗原特异性信号的刺激之外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。在一些实施例中，CAR还可以包括一个或多个共刺激信号传导区，其中，共刺激信号传导区可以来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上。
在本申请中，术语“引导肽”，是指胞外抗原识别结构域(如scFv序列)前的短肽，其作用是引导细胞内合成的重组蛋白质输出到细胞外。常用的引导肽有人CD8α信号肽，或者人GM-CSF受体α信号肽。
在本申请中，决定CAR-免疫细胞治疗效果的关键因素之一是对肿瘤靶抗原的选择。在本申请中，所选择的肿瘤靶抗原“CLL1”具有本领域常规的含义，其还被称为KLR1、CLEC12A，其是一种II型跨膜糖蛋白，是与免疫调节相关的C型凝集素样受体大家族的成员。研究发现，CLL1(C-type Lectin-like Molecule 1)是有治疗AML前景的理想靶标，因为CLL1在正常造血干细胞中不表达，在AML原始细胞和白血病干细胞中高表达。但对抗原靶点的选择不一定是单一的。通过选择合适的靶点，能优化CAR-T细胞的抗肿瘤活性。因此胞外抗原识别结构域还可以包含靶向以下任一种靶点的胞外抗原识别序列：CD33、CD123、CD70、FLT3、BCL2、LeY。针对二个或大于二个靶点的胞外抗原识别结构域中包括针对不同靶点的VH区和VL区，不同区域之间也通过连接序列直接连接或间接连接，其排列方式可以通过以下形式的任意一种：靶点1VL-靶点1VH-靶点2VL-靶点2VH，靶点2VL-靶点2VH-靶点1VL-靶点1VH，靶点1VL-靶点2VL-靶点2VH-靶点1VH，靶点2VL-靶点1VL-靶点1VH-靶点2VH，上述“-”代表通过连接序列连接。
在本申请中，术语“连接序列”通常是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区，其将本发明的抗体、嵌合抗原受体的任何结构/区域连接在一起。连接序列可由不同的氨基酸残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成，以便相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可使用较长的连接序列。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除从天然状态下经人工手段获得后，经过人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其可以是从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，CAR基因转导/转染和靶基因表达时，基因转导/转染方法主要包括病毒和非病毒的方法。如：通过γ反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒相关病毒载体、质粒DNA依赖的载体、转座子依赖的基因转移、mRNA介导的基因转导。
术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。术语“转座子”是指不连续的DNA片段，具有在染色体位点之间迁移和携带基因信息的能力，如：睡美人SB系统和来源于鳞翅目昆虫的PB系统。在一些实施例中，还可以使用电转的方法将mRNA转导进T细胞。
在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫效应细胞可以选自以下组：T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T淋巴细胞、多能干细胞分化成的NK细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、诱导性多能干细胞分化成的T细胞(iPSC-T)、诱导性多能干细胞分化成的NK细胞(iPSC-NK)和胚胎干细胞中的一种或多种。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指适合施用于患者的药物组合物，其可以包含本申请所述的免疫效应细胞，还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，如：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂，如：细胞冻存液。在一些实施例中，本申请的药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、马、猪、牛、羊或猴。
在本申请中，术语“包含”、“包括”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下本领域技术人员可接受的波动范围，如：在±0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的范围内变动。
人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、相应核酸分子、相应载体、相应细胞、相应药物组合物
一方面，本申请提供了一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:1所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:3所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:4所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
在抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。
另一方面，本申请还提供了一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，采用了KABAT规则进行CDR的划分。
上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，为CLL1 scFv抗体或CLL1 Sc(Fv)2抗体。
上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，所述CLL1scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、如SEQID NO:21所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。在上述描述中，“-”表示相互连接，并且在上述描述中“-”具有方向性，其表示从氨基酸的N端向C端的连接；
进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。
再一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在一些实施例中，编码上述人源化CLL1抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：
1)编码如SEQ ID NO:19所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:48所示；或
2)编码如SEQ ID NO:19所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:49所示；或
3)编码如SEQ ID NO:24所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:50所示；和编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:51所示。
再一方面，本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。载体可以任意地选自以下载体地一种或几种：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
再一方面，本申请还提供了一种细胞，其包含上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、核酸分子或载体。
再一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞，以及药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包括但不限于：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。
包含人源化CLL1抗体或其抗原结合部位的抗体药物、抗体药物偶联物
一方面，本申请提供了一种抗体药物，其包含上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位。
上述抗体药物在一些实施例中，所述抗体药物为单特异性抗体药物、双特异性抗体药物、三特异性抗体药物或四特异性抗体药物。
另一方面，本申请还提供了一种抗体药物偶联物，其包含上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位。抗体药物偶联物，即antibody-drug conjugate，简称ADC，其是通过一个化学链将具有生物活性的小分子药物连接到抗体上，抗体作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。
人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、相应核酸分子、相应载体、相应细胞的应用
一方面，本申请提供一种上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞在制备用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的药物中的应用。
上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
另一方面，本申请还提供了上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞在制备用于诊断与CLL1的表达相关的疾病或病症的检测试剂中的应用。
上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
再一方面，本申请还提供了一种治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的包含上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞的药物施用于具有治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。
上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
上述方法在一些实施例中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如口服、静脉注射、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
上述方法在一些实施例中，针对不同的适应症，给药剂量可以不同；针对病情严重程度不同的患者，给药剂量也可以不同。
上述方法在一些实施例中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述非人类动物可以包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、马、猪、牛、羊、兔或猴。
再一方面，本申请还提供了一种药物，其包含上述任一种人源化CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞，用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。
上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。CLL1嵌合抗原受体、相应核酸分子、相应载体、相应免疫效应细胞、药物组合物一方面，本申请提供了一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体，其包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：所述CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；
所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ IDNO:1所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:3所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:4所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
另一方面，本申请还提供了一种靶向CLL1的嵌合抗原受体，其包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：所述CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；
所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，采用了KABAT规则进行CDR的划分。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区序列包含如SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
本申请通过实验验证了5条人源化scFv抗体，以及根据这些人源化抗体组成的嵌合抗原受体均能在保持功能性和特异性的同时，降低其异源性。尤其是，优选了3条人源化scFv抗体及其嵌合抗原受体。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，CLL1胞外抗原识别结构域包括选自以下结构中的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列、如SEQID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列；
可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在上述描述中，“-”表示相互连接，并且在上述描述中“-”具有方向性，其表示从氨基酸的N端向C端的连接。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区的氨基酸来源于CD8α；进一步可选地，所述铰链区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区的氨基酸序列来源于CD8α；进一步可选地，所述跨膜区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，其中所述胞内信号传导区来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ；进一步可选地，所述胞内信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，所述共刺激信号传导区来源于CD28或4-1BB；进一步可选地，所述共刺激信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α；进一步可选地，所述引导肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述嵌合抗原受体包括如SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
再一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一种嵌合抗原受体的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在一些实施例中，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列包含：
1)编码如SEQ ID NO:19所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:17所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:48所示；或
2)编码如SEQ ID NO:19所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:18所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:49所示；或
3)编码如SEQ ID NO:24所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:50所示；和编码如SEQ ID NO:22所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:51所示。
再一方面，本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。载体可选子以下的任意一种或几种：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
上述载体在一些实施例中，为表达载体；在另一些实施例中，载体为病毒载体；在另一些实施例中，载体为慢病毒载体。
再一方面，本申请还提供了一种经工程化的免疫效应细胞，其包含上述嵌合抗原受体、上述分离的核酸分子，或上述载体。
上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、诱导性多能干细胞、诱导性多能干细胞分化成的T细胞、诱导性多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种。
上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。
上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，T淋巴细胞为αβT淋巴细胞或γδT淋巴细胞。
上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞的表面可以表达或表达有本申请所述的嵌合抗原受体。
再一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包括但不限于：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。
上述药物组合物在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂。
上述药物组合物在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。
上述药物组合物在一些实施例中，药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。
上述药物组合物在一些实施例中，药物组合物为静脉注射剂。
制备方法和用途
一方面，本申请还提供了制备经工程化的免疫效应细胞的方法，其包括以下的步骤：向免疫效应细胞中转导本申请所述的载体。
上述方法在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T细胞、多能干细胞分化成的NK细胞、诱导性多能干细胞、诱导性多能干细胞分化成的T细胞、诱导性多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种。
上述方法在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。
上述方法在一些实施例中，T淋巴细胞为αβT淋巴细胞或γδT淋巴细胞。
另一方面，本申请还提供上述嵌合抗原受体、分离的核酸分子、载体或经工程化的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。
上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
再一方面，本申请还提供了一种治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述经工程化的免疫效应细胞或药物组合物施用于具有治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。
上述方法在一些实施例中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。例如，施用的方式可以通过静脉注射的方式施用于受试者。在一些实施例中，有效剂量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物可以单次施用于受试者，也可以在一定期间内分次施用于受试者，如：每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。
上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
上述方法在一些实施例中，所述施用的方式为静脉注射。
上述方法在一些实施例中，所述施用的方式为将有效量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物以单次注射的方式施用于受试者。
上述方法在一些实施例中，有效量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物为1×105至1×107个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，针对不同的适应症，给药剂量可以不同；针对病情严重程度不同的患者，给药剂量也可以不同。施用剂量范围可以是1×105个CAR阳性T细胞/kg至1×107个CAR阳性T细胞/kg，例如，1×105个CAR阳性T细胞/kg至1×106个CAR阳性T细胞/kg、1×106个CAR阳性T细胞/kg至1×107个CAR阳性T细胞/kg、0.5×106个CAR阳性T细胞/kg、0.6×106个CAR阳性T细胞/kg、0.7×106个CAR阳性T细胞/kg、0.8×106个CAR阳性T细胞/kg、0.9×106个CAR阳性T细胞/kg、1.0×106个CAR阳性T细胞/kg、1.1×106个CAR阳性T细胞/kg、1.2×106个CAR阳性T细胞/kg、1.3×106个CAR阳性T细胞/kg、1.4×106个CAR阳性T细胞/kg、1.5×106个CAR阳性T细胞/kg、1.6×106个CAR阳性T细胞/kg、1.7×106个CAR阳性T细胞/kg、1.8×106个CAR阳性T细胞/kg、1.9×106个CAR阳性T细胞/kg、2.0×106个CAR阳性T细胞/kg。
上述方法在一些实施例中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述非人类动物可以包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、马、猪、牛、羊、兔或猴。
再一方面，本申请还提供了一种药物，其包含上述经工程化的免疫效应细胞或药物组合物，用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。
上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。
上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、经工程化的免疫效应细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2ndedition,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
实施例1、1-3抗体、3-67抗体的人源化改造设计
在之前的工作中，发明人开发了多个靶向CLL1的抗体，将其相应的scFv抗体作为CLL1 CAR结构的胞外抗原识别结构域，并以此构建了CAR表达载体、制备了靶向CLL1的CAR-T细胞，还在细胞水平验证了CLL1 CAR以及CLL1 CAR-T细胞的多项指标，进而从中选择了表现好的2条scFv抗体1-3、3-67，这2条scFv抗体均为鼠源序列，为了降低其异源性，对这2条scFv抗体进行了人源化改造的设计。
1、针对鼠源1-3scFv抗体的人源化改造设计：在对鼠源1-3scFv抗体(本申请中也称为1-3LH)进行人源化改造设计时，共产生3条人源化scfv序列，分别为1-3LH-Q1、1-3LH-Q2和1-3LH-Q3，这3条人源化scFv序列中的轻链部分有2种设计方式，即1-3LH VL1、1-3LHVL2，其重链部分也有2种设计方式，即1-3LH VH1、1-3LH VH2。
2、针对鼠源3-67scFv抗体的人源化改造设计：在对鼠源3-67scFv抗体(本申请中也称为3-67LH)进行人源化改造设计时，共产生2条人源化scFv序列，分别为3-67LH-Q1、3-67LH-Q2，这2条人源化scFv序列中的轻链部分有2种设计方式，即3-67LHVL1、3-67LHVL2，其重链部分也有2种设计方式，即3-67LHVH1、3-67LHVH2。
上述5条人源化后的scFv抗体的结构组成如表1所示。
表1、5条人源化后的scFv抗体的结构组成
表1中所用连接序列均如SEQ ID NO.32所示。
鼠源1-3scFv抗体、3-67scFv抗体以及人源化后的各抗体的VH和VL如表2所示；鼠源1-3scFv抗体、3-67scFv抗体以及人源化后的各抗体的氨基酸序列如表3所示。
表2、鼠源1-3scFv抗体、3-67scFv抗体以及5条人源化抗体的VH和VL
表3、鼠源1-3scFv抗体、3-67scFv抗体以及5条人源化抗体的氨基酸序列
| scFv名称 | 氨基酸序列编号 | scFv名称 | 氨基酸序列编号 |
| 1-3LH | SEQ ID NO.:25 | 3-67 LH | SEQ ID NO.:29 |
| 1-3LH-Q1 | SEQ ID NO.:26 | 3-67 LH-Q1 | SEQ ID NO.:30 |
| 1-3LH-Q2 | SEQ ID NO.:27 | 3-67 LH-Q2 | SEQ ID NO.:31 |
| 1-3LH-Q3 | SEQ ID NO.:28 |
实施例2、CLL1 CAR-T细胞的获得
选择在细胞水平验证5条人源化scFv抗体的功能，我们选择在二代CAR结构上对各条候选人源化scFv抗体进行筛选。在各个CAR结构中，均采用了CD8α引导链为信号肽(如SEQID NO:42所示)，铰链区(如SEQ ID NO:43所示)和跨膜区(如SEQ ID NO:44所示)采用CD8α的结构，以4-1BB为胞内共刺激信号(如SEQ IDNO:45所示)，CD3δ为T细胞激活信号(如SEQID NO:46所示)，结构示意图如图1所示，具体各CLL1 CAR的氨基酸序列如表4所示(各CLL1CAR的名称与其scFv相对应，如：1-3LH CAR中使用的scFv即是表3中对应的1-3LH，1-3LH-Q1CAR中使用的scFv即是表3中对应的1-3LH-Q1)。采用BG1805作为阳性对照，其scFv氨基酸序列如本申请SEQ ID NO:52所示，具体CAR氨基酸序列如本申请SEQ ID NO:53所示。
表4、各种CLL1 CAR序列
| CAR名称 | 序列编号 | CAR名称 | 序列编号 |
| 1-3LH CAR | SEQ ID NO:35 | 3-67 LH CAR | SEQ ID NO:39 |
| 1-3LH-Q1 CAR | SEQ ID NO:36 | 3-67 LH-Q1 CAR | SEQ ID NO:40 |
| 1-3LH-Q2 CAR | SEQ ID NO:37 | 3-67 LH-Q2 CAR | SEQ ID NO:41 |
| 1-3LH-Q3 CAR | SEQ ID NO:38 | BG1805 CAR | SEQ ID NO:53 |
具体获得CLL1 CAR-T细胞的方法如下：
1、慢病毒载体的构建
根据表4中各种CLL1 CAR的序列，分别人工合成5条根据候选人源化scFv抗体构建的CLL1 CAR结构、2条根据鼠源scFv抗体构建的CLL1 CAR结构、1条阳性对照BG1805 CAR。
将编码上述8种CLL1 CAR结构的核苷酸序列分别构建到空慢病毒载体(厂家：SBI公司，货号：CD500-CD800，如WO2021/121227实施例1中记载的进行常规抗性改造)中获得CAR表达载体，随后将CAR表达载体和三种包装质粒一起转染293T细胞，经过收集纯化之后得到有功能性的慢病毒载体。三种包装质粒分别是pMD2.G(购自Biovector公司，产品号Biovector012259)，pMDLg/pRRE(购自Biovector公司，产品号Biovector012251)，pRSV-Rev(购自Biovector公司，产品号Biovector012253)。
2、通过慢病毒转导的方式制备相应8种CLL1CAR-T细胞。
转导实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行，简述转导步骤如下：
1)分选T细胞
从人单采血细胞中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后从PBMC细胞中分选获得T细胞。
2)对T细胞进行激活处理
将分离的T细胞用完全淋巴细胞培养液(X-VIVO15培养基+5％ FBS+300IU/ml IL-2或X-VIVO15培养基+5％ FBS+5ng/ml IL-15+10ng/ml IL-7)进行重悬，使终浓度为(1～3)×106个细胞/ml，按1ulbeads/1×106cells加入CD3/CD28磁珠刺激，混匀后置于培养箱培养，培养条件为37℃+5％ CO2，培养时间至少24小时。
3)慢病毒转导T细胞
取出激活培养的T细胞，用含终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene)的单纯X-VIVO15培养基重悬，混匀获得细胞悬液，并按每800ul细胞悬液(含2×106细胞)缓慢加入200ul的慢病毒载体，混匀后放入孔板，并于培养箱培养，培养条件为37℃+5％ CO2，培养时间至少4-6小时。
4)转导后T细胞的扩增培养
取出转导后的细胞，用完全淋巴细胞培养液培养，隔天传代，使细胞密度维持在(0.8～2)×106个细胞/ml，以备后续实施例使用。
分别使用包含有编码表4中CAR结构的核苷酸序列的慢病毒感染T细胞后，获得的T细胞分别按其CAR序号进行命名，比如使用1-3LH CAR获得的T细胞即命名为1-3LHCAR-T细胞、使用1-3LH-Q1 CAR获得的T细胞即命名为1-3LH-Q1 CAR-T细胞。接下来，我们在细胞水平对各CLL1 CAR结构进行筛选，以确定各个人源化CLL1 scFv的优劣。
实施例3、各CLL1 CAR在T细胞表面表达的检测
CAR分子的检测：对实施例2中获得的转导后培养7天的8种CLL1 CAR-T细胞表面表达的CAR蛋白分子进行检测，我们用FITC荧光标记的CLL1抗原(厂家：ACRObiosystems，货号：CLA-HF247 25ug)对实施例2中获得的5条根据候选人源化scFv抗体构建的CLL1 CAR-T细胞、2条根据鼠源scFv抗体构建的CLL1 CAR-T细胞、1条根据阳性对照scFv抗体构建的CLL1 CAR-T细胞和UTD细胞(未转导CAR的T细胞)进行染色，并通过流式细胞术进行CAR分子阳性比例检测分析，检测结果如表5所示：5条根据候选人源化scFv抗体构建的CLL1 CAR-T细胞表面均有相应CAR表达，且根据鼠源1-3scFv对应的3条人源化scFv(即：1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、1-3LH-Q3)、鼠源3-67scFv对应的2条人源化scFv(即：3-67LH-Q1、3-67LH-Q2)构建的CAR-T细胞表面的CAR表达率相比于根据其鼠源scFv构建的CAR-T细胞表面的CAR表达率显著提高，与阳性对照的CAR表达率相当或略高。
表5、T细胞表面表达的CAR分子的检测结果
实施例4、各CLL1 CAR-T细胞的杀伤实验
细胞杀伤实验：将实施例2中获得的转导后培养6天的8种CLL1 CAR-T细胞和UTD细胞(未转导CAR的T细胞)分别与靶细胞按照效应细胞与靶细胞不同效靶比(3:1或9:1，固定靶细胞为每孔1×104个)的条件，在X-VIVO15培养基中共培养12小时后，通过检测靶细胞中稳定表达的荧光素酶活性检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤比例，每孔做3个重复。靶细胞分别采用HL60-luc细胞、K562-CLL1-luc细胞、K562-luc细胞，其中：HL60-luc细胞是稳定表达荧光素酶活性(用带有编码荧光素酶的核苷酸序列的慢病毒感染靶细胞，然后将所得细胞经鉴定得到稳定表达荧光素酶的细胞系，荧光素酶基因的GenBank：MK484106.1)且内源表达CLL1的阳性靶细胞、K562-CLL1-luc是稳定表达荧光素酶活性且外源表达CLL1的阳性靶细胞、K562-luc是稳定表达荧光素酶活性且不表达CLL1的阴性靶细胞。在阴性靶细胞K562-luc体系中，各效应细胞对阴性靶细胞均无明显杀伤；在阳性靶细胞体系中，细胞杀伤结果如图2A-图2B所示。图2A显示了各效应细胞在阳性靶细胞HL60-luc体系中的杀伤效果，效靶比为9：1时，除了UTD细胞以外，各效应细胞对靶细胞的杀伤差异不明显，均可以达到80％以上；效靶比为3：1时，1-3LH系列中经过人源化改造的各组(即1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、1-3LH-Q3)的杀伤效果均明显优于1-3LH CAR-T细胞，3-67LH系列中经过人源化改造的各组(即3-67LH-Q1、3-67LH-Q2)的杀伤效果也明显优于3-67LH CAR-T细胞，阳性对照BG1805在效靶比为3：1时，杀伤效果较好。图2B显示了各效应细胞在阳性靶细胞K562-CLL1-luc体系中的杀伤效果，效靶比为3：1和9:1时，各效应细胞对靶细胞对均有明显杀伤，但各效应细胞对靶细胞的杀伤差异不明显。
实施例5、各CLL1 CAR-T细胞进行细胞因子释放实验
细胞因子释放实验：将实施例2中获得的转导后6天的8种CLL1 CAR-T细胞和UTD细胞(未转导CAR的T细胞)分别与靶细胞按照效靶比1:1的条件，在X-VIVO15培养基中共培养24h后，通过ELISA方法检测细胞上清中IFN-γ的浓度。靶细胞分别采用HL60细胞、K562-CLL1细胞、K562细胞。结果如图3所示：1-3LH系列中经过人源化改造的各组(即1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、1-3LH-Q3)相比未经人源化改造的1-3LH组，IFN-γ的释放量显著提高，3-67LH系列中经过人源化改造的各组(即3-67LH-Q1、3-67LH-Q2)相比未经人源化改造的3-67LH组，IFN-γ的释放量显著提高。阳性对照BG1805的IFN-γ的释放量也较高。
实施例6、持续增殖性试验
抗原刺激可以激活CAR-T细胞使CAR-T细胞增殖，而T细胞的持续激活会导致细胞耗竭，耗竭的T细胞的增殖能力和效应功能都会有所下降，我们通过检测CLL1 CAR-T细胞在多轮抗原刺激实验后CD3+细胞的增殖情况(即T细胞的增殖情况)，确定其持续增殖性。
抗原刺激(以HL60细胞作为抗原)之前，将各组CAR-T细胞(1-3LH、1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、1-3LH-Q3、3-67LH、3-67LH-Q1、3-67LH-Q2、BG1805)的CAR阳性比例都利用UTD调整到了50％的水平，在持续性增殖实验中，将各组CAR-T细胞分别与阳性靶细胞HL60按照效靶比2:1在24孔板中进行共培养，每孔2ml X-VIVO15培养基，每组细胞重复3孔。用荧光标记的CD3抗体(厂家：BioLegend，货号：300312)进行CD3染色，通过流式细胞术进行检测分析，显示T细胞的增殖情况(CD3是区分是否为T细胞的标记物)，根据体积倍数的换算计算CD3阳性细胞的细胞数，然后根据计算结果各组再取出一定量CAR-T细胞按照效靶比2:1加入对应的阳性靶细胞进行新一轮刺激，每隔2天一次，如此重复进行多轮刺激，多轮刺激中任意单轮的增殖结果如图4所示：1-3LH系列在D9、D12和D15进行检测，1-3LH组相对于其经过人源化的各组的CAR+T细胞增殖更好，在D20进行检测，1-3LH组的增殖不如其经过人源化的1-3LH-Q1组和1-3LH-Q2组；3-67系列在D9进行检测，3-67LH组相对于其经过人源化的组3-67LH-Q1的增殖效果更好，但不如其经过人源化的组3-67LH-Q2的增殖效果好，在D12、D15、D20进行检测，3-67LH组的增殖不如其经过人源化的各组。1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、3-67LH-Q1、3-67LH-Q2在实验第20天时仍能快速增殖，1-3LH-Q3的持续增殖能力略弱于1-3LH-Q1和1-3LH-Q2，在后续实验中重点对1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、3-67LH-Q1、3-67LH-Q2进行验证，同时1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、3-67LH-Q1、3-67LH-Q2在实验第20天时的增殖优于阳性对照BG1805组。在本申请中，经过多轮刺激后的细胞几乎全为CAR+细胞，因此CAR+表达率不再作为重要指标。
实施例7、CAR-T细胞的特异性
为了进一步检验体外试验中挑选出来的CAR-T细胞(1-3LH-Q1、1-3LH-Q2、3-67LH-Q1、3-67LH-Q2)的特异性，我们通过设计蛋白水平和细胞水平的试验对人源化CLL1scFv抗体的特异性进行评估，并采用BG1805作为阳性对照scFv抗体。
1、蛋白水平的特异性检测
我们用荧光标记的CD19蛋白(购自ACRO biosystems，货号CD9-HP2H3)、CS1蛋白(购自ACRO biosystems，货号SL7-HP2H3)、BCMA蛋白(购自ACRO biosystems，货号BCA-HF254)、GPC3蛋白(购自ACRO biosystems，货号GP3-HF2H1)、EGFR vIII蛋白(购自ACRObiosystems，货号EGI-HP2E3)、CD33蛋白(购自ACRO biosystems，货号CD3-HF224)6种抗原蛋白按照如下方法对体外试验中相对表现更好的4种CLL1CAR-T细胞以及阳性对照BG1805CAR-T细胞进行蛋白水平的特异性检测：取每种CAR-T细胞5×105个，用PBS洗涤细胞一次，200g离心5min，弃上清，细胞重悬到200ul PBS中，加入0.1ug上述荧光标记的抗原蛋白，4℃避光孵育20min，用PBS洗涤细胞一次，200g离心5min，弃上清，细胞重悬到200ul PBS中，以流式细胞术检测CAR-T细胞与各荧光标记的蛋白的结合情况。具体检测结果如表6所示：各个表达有CLL1的CAR-T细胞均不能与CD19蛋白、CS1蛋白、BCMA蛋白、GPC3蛋白、EGFRvIII和CD33蛋白结合，即CLL1 CAR在蛋白水平显示出非常好的特异性。
表6、蛋白水平检测CAR-T细胞特异性结果
备注：“-”表示检测到CAR-T细胞不与该蛋白结合，“+”表示检测到CAR-T细胞与该蛋白结合。
2、细胞水平的特异性检测
CD107a在膜上的表达被认为是活化细胞毒性淋巴细胞(CD8+T细胞和NK细胞)的标志物，当细胞毒性淋巴细胞给予特定抗原刺激即发生免疫激活，表达CD107a，因此可作为检测CAR-T细胞特异性的手段。
我们用细胞系HL60(人早幼粒急性白血病细胞)、ovcar3(人卵巢腺癌细胞)、RAJI(人淋巴瘤细胞)、MM.1S(人多发性骨髓瘤细胞)、SK-MEL1(人皮肤黑色素瘤细胞)、A549(人肺癌细胞)、HUH7(人肝癌细胞)和786-0(人肾癌细胞系)这8种不同组织来源的细胞系按照如下方法与5种CLL1 CAR-T细胞以及BG1805 CAR-T细胞进行细胞共培养，在细胞水平对CLL1 CAR的特异性进行评估。具体步骤为：肿瘤细胞和转染及未转染的T细胞进行计数，用X-VIVO培养基将肿瘤细胞调整至2×106/ml，T细胞调整至1×106/ml。对于杀伤板每孔加20ul的用荧光标记的CD107a抗体，然后每孔加100ul的T细胞和100ul的肿瘤细胞，加完后400r/min离心3分钟。37℃5％CO2培养箱培养60分钟。60分钟后每孔加入20ul的golgi stop工作液(3mlX-VIVO培养基加2ul golgi stop(BD GolgiStopTMProtein TransportInhibitor，CAT：554724))培养箱培养2.5小时。取CD3和CD8抗体等体积混合，混匀后每孔加10ul，培养箱培养30分钟。30分钟后1500r/min离心5分钟，甩去上清，加250ul FACS buffer(PBS+0.5％BSA)，混匀。1500r/min离心5分钟，甩去上清。每孔加200ul FACS buffer(PBS+0.5％BSA)混匀，转移到已标记好的流式管中，再补200-300ul的含FACS buffer(PBS+0.5％BSA)上机检测。分析CD3+&CD8+阳性细胞群里CD107a的荧光信号。具体检测结果如表7所示，4种待测CLL1 CAR-T细胞以及阳性对照BG1805 CAR-T细胞只能识别CLL1阳性表达细胞系HL60并被其激活生成CD107a，而不会被其它7种靶细胞激活生成CD107a，这5种CLL1 CAR显示出很好的特异性。
表7、细胞水平检测CAR-T细胞特异性结果
备注：在CLL1表达一行中，“-”表示该肿瘤细胞表面不表达CLL1，“+”表示该肿瘤细胞表面表达CLL1。在其余行中，“-”表示未检测到CD107a信号，“+”表示检测到CD107a信号。
实施例8、体内药效试验
在体外药效学研究的基础上，为了进一步筛选并确定人源化抗体的功能，我们开展了人源化CLL1 CAR-T的体内药效学试验。利用NPG小鼠建立HL60-GFP-Luc急性髓系白血病动物模型，通过尾静脉回输CLL1 CAR-T细胞并监控和评估其动物体内的肿瘤清除效果。具体步骤如下：将HL60-GFP-Luc细胞(用带有编码GFP蛋白和荧光素酶的核苷酸序列的慢病毒感染HL60细胞，然后将所得细胞经鉴定得到稳定表达GFP蛋白和荧光素酶的细胞系。荧光素酶用于提供荧光信号，同一种细胞系，荧光信号越弱说明肿瘤细胞残留越少，杀伤越强，荧光素酶基因的GenBank：MK484106.1；GFP蛋白用于方便稳定细胞系筛选，为已知序列，序列如SEQ ID NO.54所示)以1×106个/0.2mL/只体积接种于雌性NPG小鼠尾静脉，细胞接种后第5天按照肿瘤成像信号强度进行随机分组，共7组(分组信息见表8)，将供试品回输，供试品回输剂量以CAR+细胞计。
表8、CAR-T细胞体内药效实验分组
注：各CAR-T细胞组以CAR+细胞计数，5×106CAR+细胞/0.2mL/只小鼠，各组给药体积为200μL/只。
通过尾静脉单次给予供试品，CAR-T回输后Day0至Day14，每周进行活体成像2次，此后改为每周一次，记录小鼠肿瘤成像信号值。结果如图5所示：与未转导T细胞的阴性对照Mock-T组和阴性对照PBS组相比，各CLL1 CAR-T组在体内均具有清除肿瘤细胞的能力，在测试剂量下均能够显著抑制肿瘤生长；其中：3个供试组1-3LH-Q1CAR-T细胞组、1-3LH-Q2CAR-T细胞组、3-67LH-Q2 CAR-T细胞组表现更好，与阳性对照BG1805 CAR-T细胞组相比也有相似或更好的表现。
序列描述
SEQ ID NO:1鼠源抗体1-3LH的VH，即1-3LH VH；
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAKLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYWYDEGHAMDSWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:2鼠源抗体1-3LH的VL，即1-3LH VL；
DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:3鼠源抗体3-67 LH的VH，即3-67 LH VH；
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASDYIFTSYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNAKFKSKATLTVDKSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCTRVMWFASYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:4鼠源抗体3-67 LH的VL，即3-67 LH VL；
DIQLTQTTASLSASLGDRVTINCKTSQDIRNNLNWYQQKPDGTIKLLIYSTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTITNLDQEDIATYFCQQGNTLPLTFGSGTKLEIKSEQ ID NO:5鼠源抗体1-3LH的VH CDR1；SYVMH
SEQ ID NO:6鼠源抗体1-3LH的VH CDR2；YINPYNDGTKYNEKFKG
SEQ ID NO:7鼠源抗体1-3LH的VH CDR3；GYYWYDEGHAMDS
SEQ ID NO:8鼠源抗体1-3LH的VL CDR1；KASQDVSTAVA
SEQ ID NO:9鼠源抗体1-3LH的VL CDR2；SASYRYT
SEQ ID NO:10鼠源抗体1-3LH的VL CDR3；QQHYSTPLT
SEQ ID NO:11鼠源抗体3-67LH的VH CDR1；SYYLY
SEQ ID NO:12鼠源抗体3-67LH的VH CDR2；EINPSNGGTNFNAKFKS
SEQ ID NO:13鼠源抗体3-67LH的VH CDR3；VMWFASYAMDY
SEQ ID NO:14鼠源抗体3-67LH的VL CDR1；KTSQDIRNNLN
SEQ ID NO:15鼠源抗体3-67LH的VL CDR2；STSKLHS
SEQ ID NO:16鼠源抗体3-67LH的VL CDR3；
QQGNTLPLT
SEQ ID NO:17鼠源抗体1-3LH的VL的人源化设计方式之一1-3LH VL1；DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP SRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:18鼠源抗体1-3LH的VL的人源化设计方式之二1-3LH VL2；DIQMTQSLSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP DRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO:19鼠源抗体1-3LH的VH的人源化设计方式之一1-3LH VH1；QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGTKYNEKFKGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHAMDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:20鼠源抗体1-3LH的VH的人源化设计方式之二1-3LH VH 2；QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVRQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRAKLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHAMDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:21鼠源抗体3-67LH的VL的人源化设计方式之一3-67LH VL1；DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQDIRNNLNWYQQKPGKTIKLLIYSTSKLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:22鼠源抗体3-67LH的VL的人源化设计方式之二3-67LH VL2；DIQLTQSPSSLSASVGDRVTINCKTSQDIRNNLNWYQQKPGKTIKLLIYSTSKLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLDPEDFATYFCQQGNTLPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:23鼠源抗体3-67LH的VH的人源化设计方式之一3-67LH VH1；
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTSYYLYWVRQAPGQGLEWMGEINPSNGG
TNFNAKFKSRVTLTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVMWFASYAMDYWGQGT
TVTVSS
SEQ ID NO:24鼠源抗体3-67LH的VH的人源化设计方式之二3-67LH VH2；
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTSYYLYWVRQAPGQGLEWIGEINPSNGG
TNFNAKFKSRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRVMWFASYAMDYWGQGT
TVTVSS
SEQ ID NO:25 1-3LH scFv；
DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVP
DRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGS
GGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYI
NPYNDGTKYNEKFKGKAKLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYWYDEGHA
MDSWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:26 1-3LH-Q1 scFv；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP
SRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGG
GGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYIN
PYNDGTKYNEKFKGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHAM
DSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:27 1-3LH-Q2 scFv；
DIQMTQSLSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP
DRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSG
GGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYI
NPYNDGTKYNEKFKGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHA
MDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:28 1-3LH-Q3 scFv；
DIQMTQSLSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP
DRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSG
GGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVRQKPGQGLEWIGYIN
PYNDGTKYNEKFKGRAKLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHAM
DSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:29 3-67LH scFv；
DIQLTQTTASLSASLGDRVTINCKTSQDIRNNLNWYQQKPDGTIKLLIYSTSKLHSGVPS
RFSGSGSGTDYSLTITNLDQEDIATYFCQQGNTLPLTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGG
GGSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASDYIFTSYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPSN
GGTNFNAKFKSKATLTVDKSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCTRVMWFASYAMDYWG
QGTSVTVSS
SEQ ID NO:30 3-67LH-Q1 scFv；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQDIRNNLNWYQQKPGKTIKLLIYSTSKLHSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGG
GSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTSYYLYWVRQAPGQGLEWMGEINPSN
GGTNFNAKFKSRVTLTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVMWFASYAMDYWGQ
GTTVTVSS
SEQ ID NO:31 3-67LH-Q2 scFv；
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTINCKTSQDIRNNLNWYQQKPGKTIKLLIYSTSKLHSGVPS
RFSGSGSGTDYTLTISSLDPEDFATYFCQQGNTLPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGG
GGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTSYYLYWVRQAPGQGLEWIGEINPSN
GGTNFNAKFKSRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRVMWFASYAMDYWGQ
GTTVTVSS
SEQ ID NO:32连接序列1；
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:33连接序列2；
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
SEQ ID NO:34连接序列3；
GGGGS
SEQ ID NO:35 1-3 LH CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVP
DRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGS
GGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYI
NPYNDGTKYNEKFKGKAKLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYWYDEGHA
MDSWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEE
GGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR
KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
ALPPR
SEQ ID NO:36 1-3 LH-Q1 CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP
SRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGG
GGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYIN
PYNDGTKYNEKFKGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHAM
DSWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI
WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG
GCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK
NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA
LPPR
SEQ ID NO:37 1-3 LH-Q2 CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIQMTQSLSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP
DRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSG
GGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYI
NPYNDGTKYNEKFKGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHA
MDSWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEE
GGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR
KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
ALPPR
SEQ ID NO:38 1-3 LH-Q3 CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIQMTQSLSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVP
DRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSG
GGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVRQKPGQGLEWIGYIN
PYNDGTKYNEKFKGRAKLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYWYDEGHAM
DSWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI
WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG
GCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK
NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA
LPPR
SEQ ID NO:39 3-67 LH CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIQLTQTTASLSASLGDRVTINCKTSQDIRNNLNWYQQKPDGTIKLLIYSTSKLHSGVPS
RFSGSGSGTDYSLTITNLDQEDIATYFCQQGNTLPLTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGG
GGSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASDYIFTSYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPSN
GGTNFNAKFKSKATLTVDKSSNTAYMQLRSLTSEDSAVYYCTRVMWFASYAMDYWG
QGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL
AGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE
GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSEQ ID NO:403-67 LH-Q1 CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQDIRNNLNWYQQKPGKTIKLLIYSTSKLHSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGG
GSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTSYYLYWVRQAPGQGLEWMGEINPSN
GGTNFNAKFKSRVTLTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVMWFASYAMDYWGQ
GTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLA
GTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:41 3-67 LH-Q2 CAR；
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQLTQSPSSLSASVGDRVTINCKTSQDIRNNLNWYQQKPGKTIKLLIYSTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLDPEDFATYFCQQGNTLPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTSYYLYWVRQAPGQGLEWIGEINPSNGGTNFNAKFKSRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRVMWFASYAMDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:42CD8α引导链；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:43CD8α铰链区；
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:44CD8α跨膜区；
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:45 4-1BB胞内共刺激信号；
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:46CD3δ激活信号；
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:47编码如SEQ ID NO:19所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCTTCTGTGA
AGGTGTCTTGTAAAGCCTCTGGCTATACATTTACCTCCTACGTGATGCACTGGGTCA
GACAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGATATATCAACCCCTACAATGATG
GCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACACTGACAAGCGACACCA
GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCTGT
GTACTACTGCGCCAGAGGCTACTACTGGTACGACGAGGGCCACGCCATGGACAGCT
GGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCAGC
SEQ ID NO:48编码如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；
GATATCCAAATGACCCAGAGCCCATCTTCTCTGTCTGCTTCTGTGGGCGACAGAGTC
ACCATTACATGCAAGGCTTCTCAGGACGTGTCCACAGCTGTCGCCTGGTATCAGCA
GAAGCCCGGCAAGTCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTACACAG
GCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGATCTGGATCCGGCACCGATTTTACCTTCACCATCA
GCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTATTGTCAGCAACACTACAGCACA
CCTCTGACCTTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:49编码如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；
GATATCCAGATGACACAGAGCCTCTCTAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGACAGGGT
GACCATTACATGCAAGGCCAGCCAGGACGTGTCCACCGCCGTGGCCTGGTATCAGC
AAAAGCCCGGCAAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTACACA
GGCGTGCCTGATCGGTTCAGCGGATCTGGATCTGGCACCGACTTCACCTTCACCATC
AGCTCCGTTCAACCTGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCACTACAGCAC
ACCTCTGACCTTTGGCGCTGGCACCAAACTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:50编码如SEQ ID NO:24所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；
CAGGTGCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGCGCCAGCGTGA
AGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGATTACATCTTCACGAGCTACTACCTGTATTGGGTGC
GGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCAACCCCAGCAACGG
CGGCACAAACTTCAACGCCAAGTTCAAGAGCAGAGTCACACTGACCGTGGACACC
TCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCG
TGTACTACTGTACCAGGGTGATGTGGTTCGCCTCTTACGCCATGGACTACTGGGGCC
AGGGCACAACAGTGACCGTTTCCAGC
SEQ ID NO:51编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTCGGAGATAGAGTGACCATCAATTGCAAAACCAGCCAGGACATCAGAAACAACCTGAACTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCAAGACCATCAAACTGCTGATCTACAGCACATCAAAGCTCCACAGCGGCGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGCTCTGGCACCGACTATACACTGACCATCAGCAGCCTGGACCCTGAGGACTTTGCTACATACTTCTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTCTGACCTTTGGCGGTGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:52阳性对照BG1805 scFv；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS
TRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGQGTKLEIKGGGGS
GGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQRL
EWMGRINPYNGAASHNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGWDY
DGGYYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:53阳性对照BG1805氨基酸序列
MALPVTALLLPLALLLHAARP
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAS
TRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGQGTKLEIKGGGGS
GGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMHWVRQAPGQRL
EWMGRINPYNGAASHNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGWDY
DGGYYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG
LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC
RFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM
GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPR
SEQ ID NO:54编码GFP蛋白的核苷酸序列
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacgg
ccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcac
caccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgcta
ccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc
ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcga
gctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccaca
acgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacg
gcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaac
cactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttc
gtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
Claims (19)
1.一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体，其包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：所述CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；
所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ IDNO:1所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:3所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:4所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
2.一种包含人源化CLL1抗体的嵌合抗原受体，其包含靶向CLL1的胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述靶向CLL1的胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：所述CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区经过人源化改造；
所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ IDNO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；
或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，CLL1胞外抗原识别结构域包括选自以下结构中的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、如SEQID NO:21所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
更进一步可选地，所述连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；
可选地，所述铰链区的氨基酸来源于CD8α；
进一步可选地，所述铰链区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；
可选地，所述跨膜区的氨基酸序列来源于CD8α；
进一步可选地，所述跨膜区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；
可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；
进一步可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ；
更进一步可选地，所述胞内信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述细胞内结构域还包括共刺激信号传导区；
可选地，所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；
进一步可选地，所述共刺激信号传导区来源于CD28或4-1BB；
更进一步可选地，所述共刺激信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；
可选地，其中所述引导肽来源于CD8α；
进一步可选地，所述引导肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
11.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的分离的核酸分子，其中，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列包含：
1)编码如SEQ ID NO:19所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:17所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:48所示；或
2)编码如SEQ ID NO:19所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示；和编码如SEQ ID NO:18所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:49所示；或
3)编码如SEQ ID NO:24所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:50所示；和编码如SEQ ID NO:22所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:51所示。
13.一种载体，其包含权利要求11或12所述的分离的核酸分子；
可选地，所述载体为表达载体；
进一步可选地，所述载体为病毒载体；
更进一步可选地，所述载体为慢病毒载体。
14.一种经工程化的免疫效应细胞，其包含权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求11或12所述的分离的核酸分子，或权利要求13所述的载体。
15.根据权利要求14所述的经工程化的免疫效应细胞，其中，所述经工程化的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、诱导性多能干细胞、诱导性多能干细胞分化成的T细胞、诱导性多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种；
可选地，所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞；
进一步可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞；
更进一步可选地，所述T淋巴细胞为αβT淋巴细胞或γδT淋巴细胞。
16.根据权利要求14或15所述的经工程化的免疫效应细胞，其中，所述经工程化的免疫效应细胞的表面可以表达或表达有权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体。
17.一种药物组合物，其包括权利要求14-16中任一项所述的经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料；
可选地，所述药学上可接受的辅料包括保护剂。
进一步可选地，所述药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，所述药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞；
可选地，所述药物组合物为静脉注射剂。
19.权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求11或12所述的分离的核酸分子、权利要求13所述的载体或权利要求14-16中任一项所述的经工程化的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症；
可选地，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤；
进一步可选地，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。
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-
2023
- 2023-01-10 CN CN202310032691.2A patent/CN118324924A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |