CN116179682B - 一种检测年龄相关性黄斑变性的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测年龄相关性黄斑变性的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括引物组合，所述引物组合包括CFH‑F1524、CFH‑R1668、ARMS2‑F359、ARMS2‑R490、HTRA1‑F1043和HTRA1‑R1119，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑6所示。还提供了一种引物组合在制备年龄相关性黄斑变性试剂盒中的应用，所述试剂盒在检测年龄相关性黄斑变性的灵敏性和特异性较高，对于年龄相关性黄斑变性的检测、筛查、预后评估或病情监测具有重要作用。

Description

一种检测年龄相关性黄斑变性的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测年龄相关性黄斑变性的试剂盒及其应用。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(Agerelated Macular Degeneration，AMD)是一种以视力进行性损害、引起视网膜黄斑区光感受器和视网膜色素上皮退行性改变和新生血管生成为特征的年龄相关性疾病，它是老年人视力下降的常见原因，其主要症状为无明显诱因下出现在视网膜黄斑区域的慢性、退行性改变。根据其临床表现、病理改变的不同分为：萎缩型年龄相关性黄斑变性(nonexudative senile macular degeneration，干性AMD)、渗出型年龄相关性黄斑变性(exudative senile macular degeneration，湿性AMD)。

AMD分为早期AMD、中期AMD、进展期AMD和晚期AMD。早期AMD表现为无症状、无视力下降。中期以中等大小的一个或多个玻璃膜疣形成为特征，视野中心出现较淡的暗点；中期AMD临床特征为黄斑中心凹2个视盘直径大小内可见数量较多的在65-125μm的中等大小的玻璃膜疣或一个及以上直径大小125μm大玻璃膜疣。进展期AMD可出现地图样萎缩灶、视网膜色素上皮脱落等，根据眼底的不同表现以及AMD分型，在干性和湿性AMD均会出现进展期。晚期以视网膜色素上皮色素沉着，脱失为特征，中心视力下降。

AMD是一种复杂的、退行性和进行性疾病，涉及多种遗传和环境等因素，致病的分子机制尚不明确，目前提出的主要因素包括遗传因素、视网膜细胞衰老、环境异常、紫外线照射、慢性炎症、氧化应激、心血管疾病等全身性疾病等。目前AMD的治疗包括药物治疗和非药物治疗，药物治疗主要包括抗氧化剂治疗、抗血管内皮生长因子治疗，包括雷珠单抗、阿柏西普、阿西替尼片、PDGF抑制剂等。非药物治疗包括光动力治疗法、经瞳孔温热疗法等。

中国专利CN110066870A公开了hsa-miR-382-5p作为生物标志物在制备诊断视网膜变性疾病的试剂盒中的应用，并公开了一种视网膜变性疾病的诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测hsa-miR-382-5p表达量的试剂。该专利发现hsa-miR-382-5p表达量升高可作为视网膜变性疾病的辅助诊断依据，帮助实现视网膜变性疾病的早期诊断。hsa-miR-382-5p对视网膜的损伤性作用，提示其可用于制备和筛选用于治疗视网膜变性疾病的药物。该专利提供了新的视网膜变性疾病的检测标记物和治疗靶点，为该疾病的诊断和治疗提供了全新的分子信息和生物学基础。

中国专利CN107974500A公开了一种年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，所述标志物为循环lncRNA标志物，所述循环lncRNA标志物为GAS5。并提供了一种年龄相关黄斑变性早期诊断的试剂盒，所述试剂盒包括上述的标志物。该专利通过lncRNA表达芯片检测早期AMD患者及对照组之间lncRNA的表达差异，从所有差异表达的lncRNA中选取3个进行验证，然后扩大样本，通过荧光定量PCR的方法进行特异lncRNA的表达，比较差异lncRNA在AMD患者及对照组中的含量，最终验证得出GAS5作为诊断标志物的可行性。

但目前现有技术中具体针对年龄相关性黄斑变性的检测试剂盒的灵敏性和特异性都欠佳，有进一步优化的空间。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种检测年龄相关性黄斑变性的试剂盒及其应用，所述试剂盒的检测灵敏度高、特异性强。

如本文所用，术语“黄斑”指灵长类动物中的中央视网膜区域，与周边视网膜相比，其含有更高相对浓度的感光细胞，特别是视杆和视锥细胞。

如本文所用，术语“引物”是指具有短游离3'-端羟基的核酸序列，其是可与互补模板形成碱基对的短核酸序列，并且作为模板链复制的起始点。引物可以在合适的温度下在合适的缓冲液中，在聚合用试剂(例如DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同的核苷三磷酸的存在下引发DNA合成。

如本文所用，术语“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。出于本发明的目的，诊断为确定年龄相关性黄斑变性是否发病。

如本文所用，术语“样本”或“样品”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样本也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样本进行的测试可以提供与受试者有关的信息。

本发明的引物可以通过氨基磷酸酯固体支持方法或其它众所周知的方法化学合成。该核酸序列也可以使用本领域已知的许多方法进行修饰。该修饰的非限制性实例包括甲基化、封端，用一个或多个天然核苷酸的同系物取代，以及核苷酸之间的修饰，例如修饰成不带电的连接子(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的连接子(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

一方面，本发明提供了一种用于检测年龄相关性黄斑变性的试剂盒，所述试剂盒包括引物组合，所述引物组合包括CFH-F1524、CFH-R1668、ARMS2-F359、ARMS2-R490、HTRA1-F1043和HTRA1-R1119，所述引物组合的核苷酸序列如下：

所述引物CFH-F1524的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述引物CFH-R1668的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述引物ARMS2-F359的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述引物ARMS2-R490的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述引物HTRA1-F1043的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述引物HTRA1-R1119的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述年龄相关性黄斑变性包括干性老年黄斑变性和湿性老年黄斑变性。

优选地，所述引物的浓度为10μmol/L。

优选地，所述的试剂盒可用于年龄相关性黄斑变性的检测、筛查、预后评估或病情监测。

优选地，所述试剂盒包括但不限于逆转录聚合酶链反应试剂盒、脱氧核糖核酸芯片试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒、化学发光免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒。

优选地，上述试剂盒包括RNA抽提体系、RNA反转录体系和反应体系；

进一步优选地，所述RNA抽提体系包括Trizol、氯仿、无水乙醇、DEPC和异丙醇。

进一步优选地，所述RNA反转录体系包括反转录引物、反转录酶和dNTPs。

进一步优选地，所述反应体系包括DNA聚合酶、促进酶反应的金属离子、荧光染料和缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括内参引物；

进一步优选地，所述内参引物为GAPDH内参引物，所述GAPDH内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8所示。

进一步优选地，所述缓冲液选自PBS缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液中的至少一种。

可选的，上述试剂盒还可以包括用于PCR扩增的芯片。

可选择的，所述试剂盒还包括临床上用于年龄相关性黄斑变性的筛查、预后评价、病情监测的其他试剂。

优选地，所述的试剂或试剂盒检测的临床样本包括但不限于：房水样本、血浆样本、血清样本、体液样本、组织样本、细胞样本、脑脊液样本。

进一步优选地，所述的试剂或试剂盒检测的临床样本为房水样本。

再进一步优选地，所述检测为体外检测。

优选地，所述的检测对象包括人和非人哺乳动物。

进一步优选地，所述非人哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠、猴、狗、狼。

又一方面，本发明提供了一种引物组合在制备年龄相关性黄斑变性试剂盒中的应用，所述引物组合包括CFH-F1524、CFH-R1668、ARMS2-F359、ARMS2-R490、HTRA1-F1043和HTRA1-R1119，所述引物CFH-F1524的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述引物CFH-R1668的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物ARMS2-F359的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述引物ARMS2-R490的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述引物HTRA1-F1043的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述引物HTRA1-R1119的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述引物的浓度为10μmol/L。

优选地，上述试剂盒包括RNA抽提体系、RNA反转录体系和反应体系；

进一步优选地，所述RNA抽提体系包括Trizol、氯仿、无水乙醇、DEPC和异丙醇。

进一步优选地，所述RNA反转录体系包括反转录引物、反转录酶和dNTPs。

进一步优选地，所述反应体系包括DNA聚合酶、促进酶反应的金属离子、荧光染料和缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物；

进一步优选地，所述内参引物为GAPDH内参引物，所述GAPDH内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8所示。

进一步优选地，所述缓冲液选自PBS缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液中的至少一种。

优选地，所述试剂盒的检测样本选自房水样本、血浆样本、血清样本、体液样本、组织样本、细胞样本、脑脊液样本中的至少一种。

进一步优选地，所述试剂盒的检测样本为房水样本。

发明的有益效果：

本发明提供的试剂盒在检测年龄相关性黄斑变性时，其特异性较强、灵敏度较高，可用于年龄相关性黄斑变性的诊断和病情发展的判断，在临床上具有使用前景。

附图说明

图1为实验组与对照组房水中CFH、ARMS2和HTRA1基因表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种检测年龄相关性黄斑变性试剂盒

包括以下组分：

(1)下表1所示的引物：

表1引物的具体序列

(2)阳性对照品和空白对照品：

阳性对照品本实施例中使用的为从房水中提取的总RNA。空白对照品为RNasefree H₂O。

(3)10×Buffer、MgCl₂、dNTPs、荧光染料和Taq酶。

实施例2一种年龄相关性黄斑变性的检测方法

本实施例使用实施例1的试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：

(1)样本提取和反转录：使用RNA提取试剂盒对样本进行总RNA的提取，并立即使用反转录试剂盒将提取的RNA转为cDNA,cDNA应置于-20℃保存，保存时间应不超过6个月且应避免反复冻融；反转录的cDNA A260/A280应在1.8-2.0之间。

(2)试剂准备：

引物组合配制的浓度为10μM。

(3)PCR体系配制：

按照以下体系配制PCR反应体系：

表2.

	浓度	用量
			Buffer	10×	4μL
MgCl2	2mM	4μL
			dNTPs	2.5μM	4μL
Taq酶	2U/μL	5μL
			荧光染料	/	2μL
引物组合	10μM	2.5μL
			模板(cDNA)	/	5μL
纯水	/	补足至40μL

(4)PCR扩增：

将完成加样的PCR反应管放入PCR仪内，总体系设为40μL，运行以下程序：

(5)结果分析：

根据PCR数据，通过2^-ΔΔCt法分析实验组和对照组房水中相关基因表达量，并用SPSS22.0软件进行方差分析。其中，实验组与对照组的内参基因均选用GAPDH基因，实验组ΔCt＝实验组的Ct值-内参基因GAPDH的Ct值，对照组ΔCt＝对照组的Ct值-内参基因GAPDH的Ct值，-ΔΔCt＝-(实验组ΔCt-对照组ΔCt)，将-ΔΔCt值代入2^-ΔΔCt，把对照组中任一基因的表达量设为1，则得到的2^-ΔΔCt值为实验组中基因的相对表达量。

使用ROC曲线来评价试剂盒的诊断效能。然后将两组数据的2^-ΔCt值通过R语言绘制ROC曲线图分别计算相关基因的CUT OFF值和AUC值。

实施例3试剂盒检测临床样本

一、材料与方法

1、研究对象

选取58例年龄相关性黄斑变性患者作为实验组以及54例对照者作为对照组，所有入选患者签署知情同意书。

2、实验组入选标准

(1)年龄为50岁或以上；

(2)通过眼底照相(funds photography，FP)，光学相干断层扫描(opticalcoherencetomography，OCT)，荧光血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)检查，结合视力改变，诊断为年龄相关黄斑变性的患者。

AMD诊断标准：

(1)矫正视力<0.5，可有视物变形，眼前有注视性暗影。

(2)眼底照相：有融合的边界不清的玻璃疣，黄斑区视网膜下出血。

(3)OCT：表现为视网膜色素上皮/脉络膜毛细血管层的红色反射光带，局限性增厚。CNV是较大范围的不规则增厚，同时伴有视网膜色素上皮/脉络膜毛细血管层的变形，境界清楚。

(4)眼底荧光血管造影(FFA)：呈现透见荧光时，表现视网膜色素上皮萎缩，色素沉着处可有遮蔽荧光，后期有荧光素渗漏。

3、排除标准

(1)眼前节的炎症，如活动性结膜炎、角膜炎、葡萄膜炎等；

(2)患有AMD以外的眼底病变，如黄斑裂孔、黄斑水肿、高度近视、视网膜血管阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变等眼底疾病；

(3)全身疾病糖尿病、恶性肿瘤、阿兹海默病、脑卒中以及自身免疫系统疾病等器质性疾病；

(4)其他原因的无法完成相关检查和研究的。

4、对照组纳入标准

年龄、性别与实验组患者匹配。

5、对照组排除标准

(1)眼前节的炎症，如活动性结膜炎、角膜炎、葡萄膜炎等；

(2)患有AMD以外的眼底病变，如黄斑裂孔、黄斑水肿、高度近视、视网膜血管阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变等眼底疾病；

(3)全身疾病糖尿病、恶性肿瘤、阿兹海默病、脑卒中以及自身免疫系统疾病等器质性疾病；

(4)其他原因的无法完成相关检查和研究的。

临床试验信息如下表3所示：

表3.

6、房水的收集和标本处理

在签署知情同意书后收集实验组和对照组健康人群的房水，实时荧光定量PCR，具体操作包括以下步骤：

(1)取0.05mL房水样本移至离心管中，加入1mL Trizol，移液枪吸打至细胞完全裂解；

(2)加入氯仿，振荡15s，室温静置3-5min；

(3)放入离心机，在4℃，12000g条件下离心15min，取出离心管，吸取上清液；

(4)向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀；

(5)在4℃，12000g条件下离心10min，离心后弃上清。

(6)加入1mL 75％乙醇，离心管上下颠倒，12000g离心5min，弃去上清；

(7)重复上述步骤(6)；

(8)室温晾干加入的DEPC溶解；

(9)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

(10)采用反转录试剂盒将获得的RNA逆转录成cDNA，得到的cDNA放于-20℃中保存。

(11)按照上述实施例2中的方法配制PCR反应体系。

(12)将混合好的PCR管放入PCR仪器中，运行以下程序：

数据处理：

根据PCR数据，通过2^-ΔΔCt法分析实验组和对照组房水中CFH、ARMS2和HTRA1基因表达量，并用SPSS22.0软件进行方差分析。其中，实验组与对照组的内参基因均选用GAPDH基因，实验组ΔCt＝实验组的Ct值-内参基因GAPDH的Ct值，对照组ΔCt＝对照组的Ct值-内参基因GAPDH的Ct值，-ΔΔCt＝-(实验组ΔCt-对照组ΔCt)，将-ΔΔCt值代入2^-ΔΔCt，把对照组中CFH的表达量设为1，则得到的2^-ΔΔCt值为实验组中CFH、ARMS2和HTRA1的相对表达量。

使用ROC曲线来评价试剂盒的诊断效能。然后将两组数据的2^-ΔCt值通过R语言绘制ROC曲线图分别计算CFH、ARMS2和HTRA1的CUT OFF值(为特异度和敏感度最优时2^-ΔCt值)、AUC值。

实验结果：

统计结果发现，实验组与对照组房水中CFH、ARMS2和HTRA1基因表达量相比呈现高表达状态，且*P＜0.05，结果如图1所示。实验组的房水样本中CFH的CUT OFF值为7.18，AUC值为1.000，灵敏度为99.3％，特异度为100％，ARMS2的CUT OFF值为11.24，AUC值为1.000，灵敏度为99.5％，特异度为100％，HTRA1的CUT OFF值为10.33，AUC值为0.935，灵敏度为91.3％，特异度为100％，详见表4。说明所选的3个目的基因的表达水平能够很好地区分老年黄斑变性。在最佳cut-off值下，采用交并集判断的方式，目的基因相应的敏感性大于99.3％，特异性都为100％。该结果说明本发明的试剂盒在年龄相关性黄斑变性的检测中的灵敏度和特异性较高。

表4.

	CFH	ARMS2	HTRA1
				AUC	1.000	1.000	0.935
Cut-off	7.18	11.24	10.33
				Accuracy(％)	100	100	93
Sensitivity(％)	99.3	99.5	91.3
				Specificity(％)	100	100	100

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种引物组合在制备年龄相关性黄斑变性检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组合包括CFH-F1524、CFH-R1668、ARMS2-F359、ARMS2-R490、HTRA1-F1043和HTRA1-R1119，所述引物CFH-F1524的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述引物CFH-R1668的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述引物ARMS2-F359的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述引物ARMS2-R490的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，所述引物HTRA1-F1043的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，所述引物HTRA1-R1119的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA抽提体系、RNA反转录体系、反应体系中的一种或多种；

所述RNA抽提体系包括Trizol、氯仿、无水乙醇、DEPC和异丙醇；

所述RNA反转录体系包括反转录引物、反转录酶和dNTPs；

所述反应体系包括DNA聚合酶、促进酶反应的金属离子、荧光染料和缓冲液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括内参引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述内参引物为GAPDH内参引物，所述GAPDH内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测样本选自房水样本、血浆样本、血清样本、体液样本、组织样本、细胞样本、脑脊液样本中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为房水样本。