CN106399554A - 老年性黄斑病变的相关基因的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于人唾液中DNA用于评估老年性黄斑病变患病风险的检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括有用于扩增如下基因的引物组：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236。本发明试剂盒通过抽提唾液中上皮细胞DNA进行PCR重测序，分析测序结果，结合基因突变情况，以及其他与老年性黄斑病变相关的风险因子进行分析，评估患病风险，快速准确的鉴别不同的风险人群。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用唾液DNA进行老年性黄斑病变患病风险评估的检测试剂盒。属生物技术领域。
背景技术
老年性黄斑病变(AMD)也叫年龄相关性黄斑病变，是西方国家50岁及其以上人群中首要致盲眼病，随着人口老龄化的逐渐发展，我国AMD的患病率亦呈逐渐增多的趋势。老年性黄斑病变又称年龄相关性黄斑病变，是一种由多种因素共同作用的疾病，有研究表明75％-85％的黄斑病变是由遗传基因缺陷导致，此外也受非遗传/环境因素影响，如吸烟、年龄、饮食等。黄斑病变还是糖尿病的并发症之一，大大提高了黄斑病变的发病率。
老年性黄斑病变是由于视网膜色素上皮细胞老化，吞噬代谢功能衰退，玻璃膜液沉积形成玻璃膜疣，或脉络膜新生血管增多，从而引发的黄斑区病理改变，严重者会导致不可逆性致盲。
老年性黄斑病变虽然危害严重，但是该疾病的高危人群可以通过早期预防，早期干预明显的降低疾病的发生率。由于该疾病与遗传基因缺陷有很大的关联，目前基因检测技术发展迅速，我们将结合基因检测的方法评估个人患病风险，根据不同患病风险给予不同健康指导。
老年性黄斑病变由于早期症状并不明显且病变之后会严重者可造成不可逆转性致盲的后果，而目前老年性黄斑病变的常规检测手段只能在黄斑病变有明显症状后作出诊断，可能会延误最佳治疗时机。本发明提供的一种试剂盒，可通过基于检测发现个人是否携带有致病基于缺陷，并结合包括教育程度，BMI，年龄，吸烟史等影响因子，来总体评估个体的患病风险，快速准确的鉴别不同风险人群，对于老年性黄斑病早期预警的筛查具有重大的指导意义。
发明内容
根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于检测如下19个SNP位点的物质的新用途，以及提供了一种用于评价或辅助评价(特别是早期的评价或辅助评价)待测人患老年性黄斑病变的风险性的产品：rs10490924位点、rs10737680位点、rs13081855位点、rs13278062位点、rs1864163位点、rs2230199位点、rs3130783位点、rs334353位点、rs3812111位点、rs429608位点、rs4420638位点、rs4698775位点、rs5749482位点、rs6795735位点、rs8017304位点、rs8135665位点、rs920915位点、rs943080位点和rs9542236位点。
本发明所提供的新用途具体为：用于检测所示19个SNP位点的物质在制备评价或辅助评价特别是早期的评价或辅助评价)待测人患老年性黄斑病变的风险性的产品中的应用。
根据本发明的一个实施方案，提供了一组特异性强、灵敏度高的用于检测老年性黄斑病变风险的寡核苷酸。所述寡核苷酸由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.38所示碱基序列的寡核苷酸组成，其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增rs10737680基因的上、下游引物，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为扩增rs4420638基因的上、下游引物，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6分别为扩增rs1864163基因的上、下游引物，SEQ ID No.7和SEQID No.8分别为扩增rs3130783基因的上、下游引物，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10分别为扩增rs429608基因的上、下游引物，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分别为扩增rs8017304基因的上、下游引物，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分别为扩增rs6795735基因的上、下游引物SEQ ID No.15和SEQ ID No.16分别为扩增rs8135665基因的上、下游引物，SEQ ID No.17和SEQ ID No.18分别为扩增rs943080基因的上、下游引物，SEQ ID No.19和SEQ ID No.20分别为扩增rs9542236基因的上、下游引物，SEQ ID No.21和SEQ ID No.22分别为扩增rs10490924基因的上、下游引物，SEQ ID No.23和SEQ ID No.24分别为扩增rs3812111基因的上、下游引物，SEQ ID No.25和SEQ ID No.26分别为扩增rs920915基因的上、下游引物，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28分别为扩增rs2230199基因的上、下游引物，SEQ ID No.29和SEQ ID No.30分别为扩增rs5749482基因的上、下游引物，SEQ ID No.31和SEQ ID No.32分别为扩增rs13081855基因的上、下游引物，SEQ ID No.33和SEQ ID No.34分别为扩增rs13278062基因的上、下游引物，SEQ ID No.35和SEQ ID No.36分别为扩增rs4698775基因的上、下游引物，SEQ ID No.37和SEQ ID No.38分别为扩增rs334353基因的上、下游引物。
根据本发明的另一实施方案，提供了一种检测老年性黄斑病变风险的试剂盒。所述试剂盒包括有用于扩增如下基因的引物组：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236。
进一步地，所述的引物组是由如下的引物对所组成：用于扩增rs10737680基因的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于扩增rs4420638基因的引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于扩增rs1864163基因的引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；用于扩增rs3130783基因的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于扩增rs429608基因的引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于扩增rs8017304基因的引物对：SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12；用于扩增rs6795735基因的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；用于扩增rs8135665基因的引物对：SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；用于扩增rs943080基因的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于扩增rs9542236基因的引物对：SEQ ID No.19和SEQID No.20；用于扩增rs10490924基因的引物对：SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；用于扩增rs3812111基因的引物对：SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于扩增rs920915基因的引物对：SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于扩增rs2230199基因的引物对：SEQ ID No.27和SEQID No.28；用于扩增rs5749482基因的引物对：SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；用于扩增rs13081855基因的引物对：SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；用于扩增rs13278062基因的引物对：SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；用于扩增rs4698775基因的引物对：SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；用于扩增rs334353基因的引物对：SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；
进一步地，所述试剂盒还包括如下物质中的至少一种：Taq DNA聚合酶，10×buffer，dNTP，Mg2+和ddH2O。
进一步地，所述试剂盒中还含有记载有如下内容的可读性载体：
(1)根据待测个体的基因测序结果，生成了基因分数(Genetic score)如下，其中βi是每个位点的权重，Gi是每个位点的基因型。
(2)根据待测者的基因分数以及其他相关风险因子建立风险回归模型如下：
Y'i＝b0+b1GSi+b2X1i+…+bkXki
根据本发明的另一实施方案，提供了一种检测老年性黄斑病变风险的方法，包括以下步骤：
1)提取样品DNA；
2)进行实时荧光PCR定量扩增并纯化，其中，使用的引物为用于扩增rs10737680基因的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于扩增rs4420638基因的引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于扩增rs1864163基因的引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；用于扩增rs3130783基因的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于扩增rs429608基因的引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于扩增rs8017304基因的引物对：SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12；用于扩增rs6795735基因的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；用于扩增rs8135665基因的引物对：SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；用于扩增rs943080基因的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于扩增rs9542236基因的引物对：SEQ ID No.19和SEQID No.20；用于扩增rs10490924基因的引物对：SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；用于扩增rs3812111基因的引物对：SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于扩增rs920915基因的引物对：SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于扩增rs2230199基因的引物对：SEQ ID No.27和SEQID No.28；用于扩增rs5749482基因的引物对：SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；用于扩增rs13081855基因的引物对：SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；用于扩增rs13278062基因的引物对：SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；用于扩增rs4698775基因的引物对：SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；用于扩增rs334353基因的引物对：SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；
3)以纯化后的PCR产物为模板进行Snapshot PCR，其中，使用的引物为用于扩增rs10737680基因的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于扩增rs4420638基因的引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于扩增rs1864163基因的引物对：SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；用于扩增rs3130783基因的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于扩增rs429608基因的引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于扩增rs8017304基因的引物对：SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12；用于扩增rs6795735基因的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；用于扩增rs8135665基因的引物对：SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；用于扩增rs943080基因的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于扩增rs9542236基因的引物对：SEQ IDNo.19和SEQ ID No.20；用于扩增rs10490924基因的引物对：SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22；用于扩增rs3812111基因的引物对：SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于扩增rs920915基因的引物对：SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于扩增rs2230199基因的引物对：SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；用于扩增rs5749482基因的引物对：SEQ ID No.29和SEQID No.30；用于扩增rs13081855基因的引物对：SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；用于扩增rs13278062基因的引物对：SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；用于扩增rs4698775基因的引物对：SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；用于扩增rs334353基因的引物对：SEQ ID No.37和SEQID No.38；
4)结果分析，根据基因突变情况，以及与老年性黄斑病变相关的风险因子进行分析，评估患病风险。
本发明相对于现有技术具有如下特点：
本发明的试剂盒可快速准确的鉴别不同的风险人群，做到早期检测，早期预防，对于老年性黄斑病早期预警的筛查具有重大的指导意义。
附图说明
图1为PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测图谱。其中，M为marker标准品，1-15为待测唾液样本；
图2为不同样本多重SNAPSHOT电泳结果；
图3为同一SNP位点不同样本的基因型结果；
图4为ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1引物设计
本发明试剂盒中使用Snapshot，可以检测多重的SNP，通常选择6－12个位点做一个组合。对目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计2条引物，其中一条是目的片段的扩增，长度在19－37bp左右，Tm值在60度左右。另外一条的引物的是延伸ddNTP，设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。本实施例所用的目的SNP位点及引物如表1所示。
本发明所使用的引物是由上海南方基因科技有限公司合成。
表1PCR引物序列
实施例2用于检测老年黄斑病变风险的试剂盒的组成(保存于-20℃)
1)多重PCR扩增反应液，其包括：Taq DNA聚合酶，10×buffer(15Mm Mg2+)，dNTP，Mg2+(25Mm)，ddH2O，和用于扩增如下基因的引物组：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236；。
2)Snapshot PCR反应液，其包括：用于扩增如下基因的引物组：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236；
其中，用于扩增rs10737680基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的核苷酸序列；用于扩增rs4420638基因的上游引物和下游引物分别是SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；用于扩增rs1864163基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；用于扩增rs3130783基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；用于扩增rs429608基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；用于扩增rs8017304基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；用于扩增rs6795735基因的上游引物和下游引物分别是：SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14所示的核苷酸序列；用于扩增rs8135665基因的上游引物和下游引物分别是SEQ IDNo.15和SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；用于扩增rs943080基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；用于扩增rs9542236基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；用于扩增rs10490924基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；用于扩增rs3812111基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24所示的核苷酸序列；用于扩增rs920915基因的上游引物和下游引物分别是SEQ IDNo.25和SEQ ID No.26所示的核苷酸序列；用于扩增rs2230199基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；用于扩增rs5749482基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的核苷酸序列；用于扩增rs13081855基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的核苷酸序列；用于扩增rs13278062基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.33和SEQ IDNo.34所示的核苷酸序列；用于扩增rs4698775基因的上游引物和下游引物分别是SEQ IDNo.35和SEQ ID No.36所示的核苷酸序列；用于扩增rs334353基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示的核苷酸序列。
下述实施例将具体描述使用本发明试剂盒对老年黄斑病变风险风险进行分析评估。
实施例3样品采集
1.样品来源
本实施例病例样本均来自于武警总医院，已初步确诊为老年性黄斑病变患者；此外还使用正常人的唾液样本作为参照。
2.采集唾液样本
本发明使用江苏健康云生物科技有限公司的型号为JKY-B的唾液采集器采集人的唾液，具体步骤如下：
1)将唾液吐进漏斗，直至液体唾液(而非气泡)的量达到刻度线(2毫升)处。
2)单手持采集器，令其处于直立状态，另一只手逆时针小心拧下整个漏斗部分(丢弃即可)，待唾液完全流入下面的采样管即可。
3)用蓝色的管盖将采样管顺时针盖好并旋紧，摇晃5秒钟，使唾液与保存液充分混合。
4)将充分混合后的采样管保存用于后续处理。
实施例4提取样本中DNA
本发明采用盐析法来提取唾液脱落空腔细胞中的DNA，所采用的试剂配置方法如下：
1)细胞核裂解液：
2)TE缓冲液：
| 组分 | 规格 |
| Tris-HCl | 10mmol/L |
| EDTA | 1mmol/L |
| pH | 8.0 |
提取DNA的具体方法如下：
1)将唾液样本置于1.5mL离心管中；
2)向离心管中加入细胞核裂解液400μl，蛋白酶K 20μl震荡之后将离心管置于65℃环境中30min，期间震荡2次；
3)取出离心管，4000r/min离心20min；
4)向离心管中加入200μl5mol/L NaCl混合均匀，将离心管中的液体尽量转移到新的标记好的相应的离心管中；
5)将离心管15 106×g离心5min之后，将上清液转移到新的标记好的相应离心管中；
6)加入等体积的异丙醇，充分混匀，15 106×g离心5min之后，弃上清；
7)瞬时离心，将离心管管底乙醇吸出，振荡培养箱37℃放置5min，加入TE缓冲液50μl，即最终得到个人的基因组DNA。
随后，为评估验证采用盐析法提取利用唾液中的DNA进行基因检测的可行性，对提取的基因组DNA进行了浓度和纯度检测，
用PUEX紫外分光光度计检测DNA的紫外吸收值，计算DNA的量和纯度。根据计算结果将DNA稀释为10ng/μl。
紫外吸收值测定结果显示，A260/A280比值在1.54-1.96之间，均值为1.79，A260/A230比值在0.55-1.8之间，均值为1.14。总体来说，当A260和A280的比值为1.6-2.0时，可以认为获得了纯的DNA。
并进行DNA分子质量检测，4μl DNA与2μl上样缓冲液混合，0.8％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相。
实施例5Snapshot PCR
1.片段扩增
将引物稀释到100mM，加入的TE缓冲液的量为660000/MW，如分子量为7003，则加入660000/7003＝94.2ul。做试验前将一组的引物加双蒸水稀释成10mM。所使用的反应体系如下：
表2多重PCR扩增体系
| 组分 | 用量 |
| 10×缓冲液(15Mm Mg2+) | 1μL |
| 引物(10Mm) | 0.4μL |
| 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(10Mm) | 0.3μL |
| Taq DNA聚合酶(5u/ul) | 0.1μL |
| 模板DNA | 1μL |
| Mg2+(25Mm) | 0.52μL |
| 双蒸水(ddH2O) | 6.68μL |
| 总用量 | 10μL |
多重PCR反应采用Touch－down的PCR反应程序:
95℃15min；
94℃40s，63℃1min，每个循环下降0.5℃，72℃1.5min，15个循环；
94℃40s，56℃40s，72℃1.5min，25个循环；
72℃8min；结束后4℃保存。
随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。
2.PCR产物的纯化
采用SAP和Exo I纯化酶，其中SAP去除多余的dNTP和引物，Exo I去除单链引物和其他单链DNA产物。
反应体系如下：
PCR产物6μL+2μL酶混合液(含2U SAP和2U ExoI)，振荡混匀；
反应条件如下：
37℃孵育保温1hr，然后75℃保温15min以灭活SAP和Exo I酶。
纯化好的模板可以在4℃保存24hr或-20℃长期保存。
3.Snapshot PCR扩增
混合模板：以纯化后的PCR产物作为Snapshot PCR的模板，每种各取2μL，混合。本发明也可将质粒直接作为模板用于反应。
混合Snapshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2μLM。(每个SNP引物加1-2ul到500ul DDH2O中)。Snapshot PCR反应体系如下：
表3Snapshot PCR反应体系
| 组分 | 用量(μL/样本) | 标准品(μL) |
| 反应混合液 | 0.5 | 5 |
| 混合PCR产物 | 2 | 2 |
| 混和引物 | 1.2 | 1 |
| 蒸馏水 | 1.3 | 2 |
| 总体积 | 5μL | 10μL |
其中，反应混合液包括：DNA模板、引物、DNA聚合酶、脱氧单核苷酸、缓冲体系。
PCR循环条件为：
96℃10sec→(96℃10sec→50℃(53℃)5sec→60℃30sec)×25循环→60℃30sec→4℃
4.Snapshot PCR产物的纯化
在5μL上述Snapshot PCR产物中加入0.5USAP或者1U CIP，震荡混匀，37℃保温。
1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr或-20℃长期保存。
5.310、3100、3730电泳样品制备
将Snapshot PCR产物进行电泳，电泳体系如下：
表4电泳反应体系
| 试剂 | 用量(μL) |
| Hi-Di Formamide | 9.25 |
| GS-120LIZ | 0.1 |
| SNaPshot产物 | 1 |
| 总体积 | 10.35μL |
95℃变性5min→迅速冰冷4min。
每个电泳样本都加入了LIZ－120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。
6.GeneMapper4.0软件分析
GeneMapper4.0软件分析结果见图2和图3。其中，图2为不同样本多重SNAPSHOT电泳结果。图3中结果显示1个SNP位点在3个样本中的基因型结果，其中第一个样本在该位点的基因分型为G/A,第二个样本的基因分型为AA，第三个样本的基因分型为GG。
GeneMapper4.0软件分析后输出结果如表5所示。
表5测序后输出结果
选取两个样本作为示例，其分析结果如表5所示，通过与19个基准SNP作对比，发现所述两个样本均有约13个基因分型与基准SNP有变化，会增加或降低疾病的发生率。
实施例6测序结果分析
1.构建模型
收集整理与黄斑病变相关的19个基因位点，所述基因位点为rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236，并详细检验这些位点及相关强度，结果见表6。
表6检测位点列表
| SNP | Chr | 位点 | Ref | Alt | 权重 |
| rs10490924 | 10 | 124214448 | G | T | ‐1.02 |
| rs10737680 | 1 | 196679455 | A | C | 0.89 |
| rs13081855 | 3 | 99481539 | G | T | ‐0.21 |
| rs13278062 | 8 | 23082971 | G | T | ‐0.14 |
| rs1864163 | 16 | 56997233 | G | A | 0.20 |
| rs2230199 | 19 | 6718387 | G | C | ‐0.35 |
| rs3130783 | 6 | 30774357 | G | A | 0.15 |
| rs334353 | 9 | 101908365 | T | G | ‐0.12 |
| rs3812111 | 6 | 116443735 | T | A | 0.10 |
| rs429608 | 6 | 31930462 | G | A | 0.55 |
| rs4420638 | 19 | 45422946 | A | G | 0.26 |
| rs4698775 | 4 | 110590479 | G | T | ‐0.13 |
| rs5749482 | 22 | 33059665 | G | C | ‐0.27 |
| rs6795735 | 3 | 64705365 | C | T | 0.10 |
| rs8017304 | 14 | 68785077 | G | A | ‐0.10 |
| rs8135665 | 22 | 38476276 | C | T | ‐0.14 |
| rs920915 | 15 | 58688467 | C | G | ‐0.12 |
| rs943080 | 6 | 43826627 | C | T | 0.14 |
| rs9542236 | 13 | 31819325 | T | C | ‐0.10 |
根据待测个体的基因测序结果，生成了基因分数(Genetic score)如下，其中βi是每个位点的权重(见表1)，Gi是每个位点的基因型。
然后根据待测者的基因分数以及其他相关风险因子建立风险回归模型如下：
Y'i＝b0+b1GSi+b2X1i+…+bkXki (2)
其中，GS为公式(1)所列的个人基因分数，X1…Xk为相关的风险因子，包括教育程度，BMI，年龄，吸烟史等。整个模型可以利用R统计软件“glm”功能获得最优值。对于家族数据，必须考虑家族成员之间的相关性，因此使用R统计软件“geepack”功能获得最优值。
本发明的风险评估模型是以欧美现有的疾病数据库为基础，并根据收集的中国人的样本数据进行修改与完善，逐渐将其完善为完全适合中国人的风险评估模型。其中，本发明模型的优点体现在以下几个方面：
1)完善了每个基因突变的在中国人群中的频率；
2)完善各个风险因子在适用人群的频率分布。吸烟，发病年龄等因素对于模型的估计有很大的影响，因此我们分别估计这些环境因素对于我们特定适用人群的影响，并把这些调整之后的影响因子加入模型；
3)预测模型的更新与完善。本模型是根据400个病人对照生成的，随着未来数据量的增加，预测模型可以根据更大量的数据，利用公式(1)(2)重新进行模拟，可以进一步提高预测的准确度
2.患病风险评估
模型构建完成之后，本发明对模型的功效进行了评估。为了兼顾敏感性和特异性，使用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)。每个模型使用10次交叉验证对结果进行验证，并使用1000次模拟以获得稳定的交叉验证结果。
利用所建立的模型，对病人样本进行分析以评估个人患病风险，从而快速准确的鉴别不同的风险人群。
本实施例检测了包括ARMS2,HTRA1,CFH在内共19个与老年性黄斑病变相关的基因位点，利用风险回归模型以及米天基因数据库进行分析，并得出疾病的患病风险。具体结果参见表7。
表7风险评估
与图4显示的ROC曲线结果相比较，可以看出本发明的模型预测结果经过多个样本的拟合有较高的准确度。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州米天基因科技有限公司
<120> 老年性黄斑病变的相关基因的检测试剂盒
<130>
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> rs10737680基因上游引物
<400> 1
gatttggaac cagagcctga 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> rs10737680基因下游引物
<400> 2
cccgaaataa gacctccatc t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> rs4420638基因上游引物
<400> 3
cccacaggga aaattctcat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> rs4420638基因下游引物
<400> 4
atacctggct ggcagaaatg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> rs1864163基因上游引物
<400> 5
cgttgtggag agtgtgctgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> rs1864163基因下游引物
<400> 6
caactggtcc caaaggagag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> rs3130783基因上游引物
<400> 7
acctggccca agagcttaat 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> rs3130783基因下游引物
<400> 8
tctcagacct cctattcatt tcc 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> rs429608基因上游引物
<400> 9
gtttgggatt tcattcatcc t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> rs429608基因下游引物
<400> 10
ccaaagaggg ctacaacttg g 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> rs8017304基因上游引物
<400> 11
ccatccatgc tgtgccttc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> rs8017304基因下游引物
<400> 12
gcccacgcct ttagaatgg 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> rs6795735基因上游引物
<400> 13
caggacaaac tcagcaagcc 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> rs6795735基因下游引物
<400> 14
aagaactcag gcagggcag 19
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> rs8135665基因上游引物
<400> 15
gatgtgattc cttgtttgca ct 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> rs8135665基因下游引物
<400> 16
tttcctggga gagattagaa gac 23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> rs943080基因上游引物
<400> 17
gcctgagatg gcaagtctgt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> rs943080基因下游引物
<400> 18
cagtgtcagg tggtgctgag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> rs9542236基因上游引物
<400> 19
ttacatctgc catgcctctg 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> rs9542236基因下游引物
<400> 20
tcaggtcaag tgaactcaca gc 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> rs10490924基因上游引物
<400> 21
cctgcatgtg tacctttcaa ga 22
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> rs10490924基因下游引物
<400> 22
caggtttggc tggctttcg 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> rs3812111基因上游引物
<400> 23
ataatgggca ggcaaggag 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> rs3812111基因下游引物
<400> 24
accaccttct ccaccacttg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> rs920915基因上游引物
<400> 25
cccagtctcg ggtatgtctt 20
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> rs920915基因下游引物
<400> 26
tccttccact atctctctct tga 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> rs2230199基因上游引物
<400> 27
gcatgtgaac atcccattca 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> rs2230199基因下游引物
<400> 28
accctttcca gtgtctgcac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> rs5749482基因上游引物
<400> 29
agtcgttttg ccacttggtc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> rs5749482基因下游引物
<400> 30
aaaggcaggc tgaatcactc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> rs13081855基因上游引物
<400> 31
gcctgctagc aacaaattca c 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> rs13081855基因下游引物
<400> 32
caagcagaac aaatgccaag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> rs13278062基因上游引物
<400> 33
ggcgtgttta gggtggtatg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> rs13278062基因下游引物
<400> 34
tgaaaggaag ggcacgaata 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> rs4698775基因上游引物
<400> 35
gatttggaac cagagcctga 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> rs4698775基因下游引物
<400> 36
cccgaaataa gacctccatc t 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> rs334353基因上游引物
<400> 37
cccacaggga aaattctcat 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> rs334353基因下游引物
<400> 38
atacctggct ggcagaaatg 20
Claims (8)
1.用于检测如下19个单核苷酸多态性位点的物质在制备检测老年性黄斑病变风险的产品中的应用：
rs10490924位点、rs10737680位点、rs13081855位点、rs13278062位点、rs1864163位点、rs2230199位点、rs3130783位点、rs334353位点、rs3812111位点、rs429608位点、rs4420638位点、rs4698775位点、rs5749482位点、rs6795735位点、rs8017304位点、rs8135665位点、rs920915位点、rs943080位点和rs9542236位点。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述“用于检测如下19个单核苷酸多态性位点的物质”为权利要求3所述的寡核苷酸或权利要求4-7任一所述的试剂盒。
3.一组检测老年性黄斑病变风险的寡核苷酸，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.38所示碱基序列的寡核苷酸组成，其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增rs10737680基因的上、下游引物，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为扩增rs4420638基因的上、下游引物，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6分别为扩增rs1864163基因的上、下游引物，SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增rs3130783基因的上、下游引物，SEQ ID No.9和SEQID No.10分别为扩增rs429608基因的上、下游引物，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分别为扩增rs8017304基因的上、下游引物，SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分别为扩增rs6795735基因的上、下游引物SEQ ID No.15和SEQ ID No.16分别为扩增rs8135665基因的上、下游引物，SEQ ID No.17和SEQ ID No.18分别为扩增rs943080基因的上、下游引物，SEQ ID No.19和SEQ ID No.20分别为扩增rs9542236基因的上、下游引物，SEQ ID No.21和SEQ ID No.22分别为扩增rs10490924基因的上、下游引物，SEQ ID No.23和SEQ ID No.24分别为扩增rs3812111基因的上、下游引物，SEQ ID No.25和SEQ ID No.26分别为扩增rs920915基因的上、下游引物，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28分别为扩增rs2230199基因的上、下游引物，SEQ ID No.29和SEQ ID No.30分别为扩增rs5749482基因的上、下游引物，SEQ ID No.31和SEQ ID No.32分别为扩增rs13081855基因的上、下游引物，SEQ ID No.33和SEQ ID No.34分别为扩增rs13278062基因的上、下游引物，SEQ ID No.35和SEQ ID No.36分别为扩增rs4698775基因的上、下游引物，SEQ ID No.37和SEQ ID No.38分别为扩增rs334353基因的上、下游引物。
4.一种老年性黄斑病变风险的检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下基因的引物组：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物组是由如下的引物对所组成：用于扩增rs10737680基因的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于扩增rs4420638基因的引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于扩增rs1864163基因的引物对：SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6；用于扩增rs3130783基因的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于扩增rs429608基因的引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于扩增rs8017304基因的引物对：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；用于扩增rs6795735基因的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；用于扩增rs8135665基因的引物对：SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；用于扩增rs943080基因的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于扩增rs9542236基因的引物对：SEQ ID No.19和SEQ ID No.20；用于扩增rs10490924基因的引物对：SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；用于扩增rs3812111基因的引物对：SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于扩增rs920915基因的引物对：SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于扩增rs2230199基因的引物对：SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；用于扩增rs5749482基因的引物对：SEQ ID No.29和SEQID No.30；用于扩增rs13081855基因的引物对：SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；用于扩增rs13278062基因的引物对：SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；用于扩增rs4698775基因的引物对：SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；用于扩增rs334353基因的引物对：SEQ ID No.37和SEQID No.38。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下物质中的至少一种：
Taq DNA聚合酶，10×buffer，dNTP，Mg2+和ddH2O。
7.根据权利要求4-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有记载有如下内容的可读性载体：
(1)根据待测个体的基因测序结果，生成了基因分数如下，其中βi是每个位点的权重，Gi是每个位点的基因型；
(2)根据待测者的基因分数以及其他相关风险因子建立风险回归模型如下：
Y'i＝b0+b1GSi+b2X1i+…+bkXki。
8.一种检测老年性黄斑病变风险的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样品DNA；
2)进行实时荧光PCR定量扩增并纯化，其中，使用的引物为用于扩增rs10737680基因的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于扩增rs4420638基因的引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于扩增rs1864163基因的引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；用于扩增rs3130783基因的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于扩增rs429608基因的引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于扩增rs8017304基因的引物对：SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12；用于扩增rs6795735基因的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；用于扩增rs8135665基因的引物对：SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；用于扩增rs943080基因的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于扩增rs9542236基因的引物对：SEQ ID No.19和SEQID No.20；用于扩增rs10490924基因的引物对：SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；用于扩增rs3812111基因的引物对：SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于扩增rs920915基因的引物对：SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于扩增rs2230199基因的引物对：SEQ ID No.27和SEQID No.28；用于扩增rs5749482基因的引物对：SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；用于扩增rs13081855基因的引物对：SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；用于扩增rs13278062基因的引物对：SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；用于扩增rs4698775基因的引物对：SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；用于扩增rs334353基因的引物对：SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；
3)以纯化后的PCR产物为模板进行Snapshot PCR，其中，使用的引物为用于扩增rs10737680基因的引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于扩增rs4420638基因的引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于扩增rs1864163基因的引物对：SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；用于扩增rs3130783基因的引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于扩增rs429608基因的引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于扩增rs8017304基因的引物对：SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12；用于扩增rs6795735基因的引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；用于扩增rs8135665基因的引物对：SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；用于扩增rs943080基因的引物对：SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于扩增rs9542236基因的引物对：SEQ IDNo.19和SEQ ID No.20；用于扩增rs10490924基因的引物对：SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22；用于扩增rs3812111基因的引物对：SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于扩增rs920915基因的引物对：SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于扩增rs2230199基因的引物对：SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；用于扩增rs5749482基因的引物对：SEQ ID No.29和SEQID No.30；用于扩增rs13081855基因的引物对：SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；用于扩增rs13278062基因的引物对：SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；用于扩增rs4698775基因的引物对：SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；用于扩增rs334353基因的引物对：SEQ ID No.37和SEQID No.38；
4)结果分析，根据待测个体的基因测序结果，生成了基因分数，其中βi是每个位点的权重，Gi是每个位点的基因型；
随后，根据待测者的基因分数以及其他相关风险因子建立风险回归模型如下：
Y'i＝b0+b1GSi+b2X1i+…+bkXki
利用风险回归模型，对待测样本进行分析评估。
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|---|---|
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2016
- 2016-11-10 CN CN201610986614.0A patent/CN106399554A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170215 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |