CN116087529B - 一种用于检测胸苷激酶i的酶促化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种用于检测胸苷激酶i的酶促化学发光试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测胸苷激酶I的酶促化学发光试剂盒及其制备方法，所述胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒包括试剂A、试剂B，其中试剂A为包被有SA‑B‑TK1抗体1的磁珠悬液；试剂B为携带酶标抗体TK1抗体2的碳纳米管微粒悬液。该试剂盒的制备方法包括以下步骤：S1(1)将活化的链霉亲和素(SA)加入磁珠悬液，得到包被SA的磁珠悬液；(2)将磁珠悬液与生物素化TK1抗体1进行偶联，得到SA‑B‑TK1抗体1标记磁珠；S2(1)将羧基化的碳纳米管分散在PBS溶液中，再加入EDC/NHS活化液，搅拌后，离心洗涤后得到经过活化处理的碳纳米管；(2)向装有活化碳纳米管的容器中加入HRP、GOD、TK1抗体2，反应得到HRP‑GOD‑双酶标记抗体复合物。所述试剂盒的检测灵敏度高，抗干扰性能优异。
Description
技术领域
本发明涉及胸苷激酶I检测试剂领域，尤其涉及一种用于检测胸苷激酶I的酶促化学发光试剂盒及其制备方法。
背景技术
胸苷激酶(thymidinekinase，TK)是嘧啶核苷酸补救合成途径的重要酶之一，包括2种同工酶：细胞质胸苷激酶(TK1)和线粒体胸苷激酶(TK2)。TK2活性只有TK1的5％，主要存在于静止组织中，虽然在增殖细胞中也存在，但含量很低。TK1是评估增殖细胞增殖度的重要标志，是细胞周期S期(合成期)的特殊酶，也是DNA合成和损伤修复的关键酶之一，浓度与细胞增殖状态紧密联系。
TK1催化脱氧胸苷磷酸化生成脱氧胸苷一磷酸(thymidinemonophosphate，TMP)，进而形成脱氧胸苷三磷酸(thymidinetriphosphate，TTP)参与DNA合成。正常状态下，成人体内TK1含量极少，当机体出现大量增殖细胞时，细胞急剧增殖、坏死，TK1释放到外周血的概率成倍增加，导致TK1活性及含量都会升高，可超过正常水平的2～100倍。
因此组织和血清中的TK1活性和含量变化可以作为监控肿瘤细胞增殖水平的指标，定量反映患者体内肿瘤细胞的增殖速度。TK1作为一种较好的细胞增殖标志物，可用于临床体检筛查、评估手术效果、监测化疗进程、预测复发风险和判断肿瘤预后等。诸多实验证明，TK1可用于健康体检、肿瘤筛查、疗效监测和预后评价，是一种灵敏有效的肿瘤增长标志物。检测肿瘤标志物的方法有酶联免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学免疫分析、胶体金标记免疫分析等。
目前，TK1的检测试剂盒少，现有的TK1检测试剂盒的检测灵敏度不高，抗干扰能力弱，因此，现有的TK1的检测试剂盒还有待进一步发展。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种用于检测胸苷激酶I的酶促化学发光试剂盒及其制备方法和应用，其对TK1的检测灵敏度提高，且抗干扰性能强，该方案具体如下：
一方面，本申请提供一种胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒，其包括试剂A、试剂B，其中试剂A为包被有SA-B-TK1抗体1的磁珠悬液；试剂B为携带酶标抗体TK1抗体2的碳纳米管微粒悬液。
试剂A中，所述包被有SA-B-TK1抗体1的磁珠，其上的TK1抗体1是通过生物素(B)-链霉亲和素(SA)偶联结构连接在磁珠表面的；由于1分子的链霉亲和素具有四个生物素的结合位点，进而通过两者的配合实现信号放大作用，提高试剂盒对样品中胸苷激酶I的检测灵敏度。
试剂B中，携带酶标抗体TK1抗体2的碳纳米管微粒上，其包被的酶有两种，分别为HRP(辣根过氧化物酶)和GOD(葡萄糖氧化酶)。这两种酶共同作为信号标记物，协同配合，达到更好的信号放大作用，大幅度地提高试剂盒的检测灵敏度和抗干扰性能。原理为：葡萄糖氧化酶(GOD)是一种需氧脱氢酶。葡萄糖氧化酶在氧气的存在的条件下能将葡萄糖转化为葡萄糖酸，产生H2O2。而HRP(辣根过氧化物酶)在H2O2作用下，催化供氢体，供氢体被氧化后发生显色，以便仪器检测。本申请中采用的供氢体为4-CN。
优选地，所述胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒还包括酶催化底液，所述酶催化底液为：含有0.5～10mmol/L的4-CN、1～20mmol/L的葡萄糖的PBS溶液。该酶催化底液是向PBS溶液中添加4-CN和葡萄糖，其中，4-CN的浓度为0.5～10mmol/L，葡萄糖的浓度为1～20mmol/L。
优选地，PBS的浓度为0.05mol/L，底液的pH为7.6。
优选地，所述胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒，还包括TK1校准品和TK1质控品。可直接采用现有的TK1校准品和TK1质控品。
另一方面，本申请还提供一种前述的胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
S1、试剂A的制备：
(1)将活化的链霉亲和素(SA)加入到前述磁珠悬液，得到包被有SA的磁珠悬液；
(2)将上述包被有SA的磁珠悬液与生物素化TK1抗体1在溶液中进行偶联，磁分离器上处理后，得到SA-B-TK1抗体1标记磁珠，即试剂A；
S2、试剂B的制备：
(1)将羧基化的碳纳米管进行活化处理：将羧基化的碳纳米管分散在PBS溶液中，再加入EDC/NHS活化液，搅拌后，离心洗涤后得到经过活化处理的碳纳米管，将其分散在PBS溶液中；
(2)向装有活化碳纳米管的容器中加入HRP、GOD、TK1抗体2，在低温条件下持续搅拌10～15h，离心洗涤处理后得到HRP-GOD-双酶标记抗体复合物，将其分散在PBS溶液中，得到试剂B。
优选地，上述步骤S1的(1)步骤中，磁珠上连接了作为加长臂的氨基-PEG6-羧酸，方法为：向活化磁珠悬液中加入作为加长臂的氨基-PEG6-羧酸，室温孵育1h，得到氨基-PEG6-磁珠。
在磁珠上先连接上氨基-PEG6-羧酸，可以保证磁珠不易受大分子的空间位阻的影响，更好的暴露连接位点，从而显著提高磁珠的SA的包被效率。
在上述基础上，优选地，步骤S2之后还设置有以下步骤：
S3、制备标准品和质控品；用稀释液将人体血清稀释一定倍数后配制成基础缓冲液，用该基础缓冲液将TK1抗原稀释成不同浓度的标准品，并用基础缓冲液将TK1抗原制备成高浓度和低浓度质控品。
本发明具有以下有益效果：
所述胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒中，包被抗体1的磁珠通过链霉亲和素(SA)和生物素(B)的配合提高了对抗体1的包被效率，实现信号放大作用；在此基础上，本试剂盒采用两种标记物，在携带酶标抗体TK1抗体2的碳纳米管微粒上包被HRP和GOD两种酶，通过两者的协同配合，进一步提高信号放大效果，基于上述多个方面的改进，本申请的试剂盒对样品中胸苷激酶I的检测灵敏度和抗干扰性能显著提高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒的制备
本实施例提供一种胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒，其主要包括：试剂A和试剂B，此外还可包括：校准品、质控品、酶催化底液等。
具体制备方法如下：
1、试剂A的制备
(1)磁珠的活化：
吸取200μL的磁珠微粒(浓度为2mg/mL)到EP管中，置于磁分离器上处理2～5min后弃去上清液，保留沉淀，接着向管中加入200μL的PBS缓冲液(0.1M)，吹打均匀后，置于磁分离器上分离并弃去上清液，按照此操作重复洗涤2～4次。接着，加入100μL的前述PBS缓冲液进行重悬，并加入10mg/mL的EDC活化剂200μL，置于振荡器上反应20min，置于磁分离器上分离3min后弃去上清液。
本实施例选择Bioeast Mag-COOH磁性微球，其表面有羧基(COOH)修饰，在碳化二亚胺(EDC)活化下可与蛋白共价结合。
(2)加长臂与磁珠的连接：
将上一步得到的活化磁珠中加入氨基-PEG6-羧酸溶液(体积为磁珠悬液的1～2倍体积)，室温孵育1h，得到氨基-PEG6-磁珠；通过磁分离器分离未连接的加长臂和废液。
(3)磁珠表面连接链霉亲和素(SA)：
将足量的活化的链霉亲和素(SA)加入到前述氨基-PEG6-磁珠溶液中，室温孵育2h后；置于磁分离器上分离4min，除去未结合的链霉亲和素，最终形成SA-PEG6-磁珠；
(4)生物素(Biotin)标记TK1抗体1
采用现有方法制备，如：生物素与待标记的鼠抗人TK1抗体1的摩尔比为(10～15):1，进行如下操作：
将生物素溶解于去离子水中，得到生物素溶液；将生物素溶液与TK1抗体1溶液进行混合，在室温反应40～60min；预清洗脱盐柱：取一只脱盐柱，剪去底部塞子，放入15mL的收集管中，1000转离心2min，弃去滤液。加2.5mL PBS溶液于脱盐柱中，1000转离心2min，弃去滤液，重复2-3次。将脱盐柱放入一个新的收集管中，加样，1000转离心2min，收集滤液，即是纯化的标记蛋白(注：如果样本含量小于l mL，加入100μL的超纯水在已被吸收的样本上面，增加蛋白回收)。分装成100μL/支，放置-80℃。
(5)SA-B-TK1抗体1标记磁珠的制备
将25μL的上述链霉亲和素磁珠(0.06～1μg/mL)和50μL的所述生物素化鼠抗人TK1抗体1溶液进行偶联，用0.1mol/L的PBS缓冲液稀释至总体积为500μL，在25℃条件下孵育过夜，待偶联完成后，加入甘氨酸溶液淬灭液(1mol/L，pH为8.0)室温混匀30min；随后，置于磁分离器上分离4～10min，弃去上清液，用0.1％BSA的0.01M的PBS缓冲液洗2次，洗涤去除未参与反应的物质，得到SA-B-TK1抗体1标记磁珠，即试剂A。
2、试剂B的制备
(1)碳纳米管的羧基化：
将碳纳米管在40℃的H2SO4(98％)、HNO3(68％)、蒸馏水混合溶液(1:3:6)中超声处理4～7h，进行离心洗涤后，在50～55℃下干燥处理，即得到羧基化的碳纳米管。
(2)碳纳米管的活化
取4mg羧基化的碳纳米管分散在1mL的0.01M的PBS(pH7.4)中，再加入3mL新制的0.4molL-1EDC活化液中，在室温下剧烈搅拌3～5h后，离心和洗涤后得到经过活化处理的碳纳米管，将其分散在0.01M的PBS中(pH 7.4)。
(3)碳纳米管的双酶和抗体标记
向装有活化碳纳米管的试管中加入200μLHRP(1mg/L)、200μLGOD(1mg/L)、100μL兔抗人TK1抗体2，持续搅拌12h。接着进行离心洗涤处理后，得到HRP-GOD-双酶标记抗体复合物，再将其分散在1mL的PBS中(0.01M，pH7.4)，得到试剂B，在4℃下储存以备使用。
实施例2胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒的检测方法
1、采用的试剂盒包括以下成分：
本实施例采用实施例1制备的试剂盒，其中，试剂A和试剂B，校准品、质控品、酶催化底液，分别独立包装。检测仪器采用科斯迈500s化学发光检测仪。
2、具体检测方法包括以下步骤：
1)A试剂中加入待测样品，100μL/孔，37℃孵育60min；
2)加B试剂：每孔加入两滴或100μL的酶标记物；
3)温育：用封口膜将条板封好(防止污染)，37℃温育60分钟；
4)洗板：取出反应板，磁性分离洗涤后，甩尽板中液体，洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
5)每孔加入酶催化底液各50μL，充分混匀，催化反应15～20min；
其中，所述酶催化底液为含有1mmol/L的4-CN、1mmol/L葡萄糖的PBS溶液(0.1mol/L，pH 7.4)。
6)测定：用半自动发光仪，测定各孔OD值；
7)结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
对比例1
本实施例制备的试剂盒实施例1的差异仅在于：试剂A中，磁珠并未连接加长臂。其制备方法参考实施例1。
对比例2
本实施例制备的试剂盒实施例1的差异仅在于：磁珠表面连接加长臂，但是并未连接链霉亲和素(SA)和亲和素，磁珠的加长臂直接连接鼠抗人TK1抗体1；其他与实施例1相同，制备方法参考实施例1。
对比例3
本实施例制备的试剂盒实施例1的差异仅在于：试剂B采用的是仅用HRP这一种酶标记TK1抗体2。其他与实施例1相同，制备方法参考实施例1。
验证实施例
对实施例1制备的胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒进行性能检测，同时用对比例1～3的试剂盒进行同步实验，进行对比。
1、精密度(重复性)评估
(1)实验方法：
选取肿瘤患者的高浓度和低浓度尿样作为样品进行检测，同一板内各检测20次，计算批内精密度；同时每个浓度水平每天检测一批，每批重复检测2次，连续检测6天，共12次，计算批间精密度。
(2)实验结果及分析：
从表1和表2的结果可知，本申请的试剂盒的批内和批间检测精密度高，远优于对比例1～3的技术效果。
表1实施例1的精密度测试结果
表2各对比例的精密度测试结果
2、干扰实验
(1)实验方法：
本次评估采用了两种常见血清干扰物质，分别是血红蛋白和甘油三酯，将一定浓度的干扰物分别加入到高浓度TK1和低浓度TK1的血清待测样本中，设为干扰物质样本，加入的干扰物的体积不超过总体积的5％，对照组同时添加相同体积的PBS作为对照样本，然后对两组样本分别进行测试，每个浓度检测3次，计算得到干扰率。通过上述方法对实施例1的试剂盒以及对比例1～3进行测试。
公式如下：
干扰率＝(干扰物质样本的测定浓度－对照组样本的测定浓度)/对照组样本的测定浓度*100％。
(2)实验结果及分析
从表3的结果可知，本申请提供的试剂盒对较高浓度的胆红素和甘油三酯都具有较好的抗干扰能力，干扰率低，远低于现有此类试剂盒的干扰率。
同时采用对比例1～3进行上述抗干扰实验，比较其平均干扰率(同一浓度干扰物的高浓度水平样本和第浓度水平样本的干扰率平均数)，从表4的结果可知，本申请实施例1提供的试剂盒的干扰率远低于对比例1～3。从该结果可知，本申请采用HRP和GOD这两种酶作为标记物以及链霉亲和素和生物素的设置都极大地提高了试剂盒的抗干扰性能。
表3实施例1的试剂盒的干扰率检测结果
表4各对比例的平均干扰率检测结果
3、正确度评估
对实施例1的试剂盒内已知浓度的TK1质控品平行测定三次，计算质控品测定结果的均值，结果见下表5，可知，该试剂盒的浓度偏差低至0.655％。
表5正确度评估结果
4、灵敏度(最低检测限)：
对校准品重复检测10次，将OD值均值加上2倍标准差所对应的浓度值，即得到灵敏度数值，按照此方法得到该试剂盒的最低检测限为0.001ng/ml，而对比例2～3的最低检测限不低于0.05ng/ml。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒，其特征在于，包括试剂A、试剂B，其中试剂A为包被有SA-B-TK1抗体1的磁珠悬液；试剂B为携带酶标抗体TK1抗体2的碳纳米管微粒悬液；
试剂A中，所述包被有SA-B-TK1抗体1的磁珠，其上的TK1抗体1是通过生物素(B)-链霉亲和素(SA)偶联结构连接在磁珠表面的；磁珠是提前连接了作为加长臂的氨基-PEG6-羧酸；
试剂B中，携带酶标抗体TK1抗体2的碳纳米管微粒上，其包被的酶有两种，分别为HRP和GOD。
2.根据权利要求1所述的胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒，其特征在于，还包括酶催化底液，所述酶催化底液为：含有0.5～10mmol/L的4-CN、1～20mmol/L的葡萄糖的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒，其特征在于，还包括TK1校准品和TK1质控品。
4.一种如权利要求1所述的胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、试剂A的制备：
(1)将活化的链霉亲和素(SA)加入到磁珠悬液，得到包被有SA的磁珠悬液；
(2)将上述包被有SA的磁珠悬液与生物素化TK1抗体1在溶液中进行偶联，磁分离器上处理后，得到SA-B-TK1抗体1标记磁珠，即试剂A；
S2、试剂B的制备：
(1)将羧基化的碳纳米管进行活化处理：将羧基化的碳纳米管分散在PBS溶液中，再加入EDC/NHS活化液，搅拌后，离心洗涤后得到经过活化处理的碳纳米管，将其分散在PBS溶液中；
(2)向装有活化碳纳米管的容器中加入HRP、GOD、TK1抗体2，在低温条件下持续搅拌10～15h，离心洗涤处理后得到HRP-GOD-双酶标记抗体复合物，将其分散在PBS溶液中，得到试剂B；
步骤S1的(1)步骤中，磁珠上提前连接了作为加长臂的氨基-PEG6-羧酸，方法为：向活化磁珠悬液中加入作为加长臂的氨基-PEG6-羧酸，室温孵育1h，得到氨基-PEG6-磁珠。
5.根据权利要求4所述的胸苷激酶I酶促化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S2之后还设置有以下步骤：
S3、制备标准品和质控品；用稀释液将人体血清稀释一定倍数后配制成基础缓冲液，用该基础缓冲液将TK1抗原稀释成不同浓度的标准品，并用基础缓冲液将TK1抗体抗原制备成高浓度和低浓度质控品。
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