CN115850385A - 一种促表达肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种适用于胰岛素肽链及GLP‑1相关靶点激动剂多肽重组表达的促表达肽及其应用。基于本发明促表达肽构建的重组基因工程菌，对于一些难以表达或表达量低的胰岛素前体蛋白、GLP‑1及其相关多靶点激动多肽前体，可显著增强其表达量，有效降低生产成本，商业化前景广阔。

Description

一种促表达肽及其应用

本申请要求2022年7月4日提交的申请号为202210788609.4的专利申请的全部优先权。该申请的全部内容全部以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种促表达肽及其应用。

背景技术

随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。据统计数据显示，我国糖尿病患者人数超过1亿，同时还有超过1.5亿的隐形糖尿病前期患者。糖尿病已经成为第三大慢性疾病。

糖尿病是由遗传和环境因素长期相互作用导致的复杂的慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺乏导致，以高血糖为特征的疾病，分为I型糖尿病和II型糖尿病，其中II型糖尿病(T2DM)在我国糖尿病患者中占到了95％以上的比例。

而治疗糖尿病最主要的药物就是胰岛素及其衍生物、胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)受体激动剂(GLP-1RAs)及其相关多靶点共激动剂。上述药物均为蛋白或多肽类药物。

已知的获取胰岛素方法包括动物组织提取和基因工程表达，而采用基因工程表达人胰岛素及其类似物早已成为工业主流手段。基因工程中表达胰岛素的微生物主要分为2类，分别是大肠杆菌及酵母菌。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。但是，对于部分具备特殊结构或氨基酸序列组成的多肽，如胰岛素前体、部分GLP-1多肽和GLP-1相关多靶点激动剂多肽，其往往难以表达或表达量低，无法满足商业化使用需求。为此，有时需要增加一段促表达肽，促表达肽连接于引导肽之后，能够显著增强融合蛋白表达量，并最终通过酶切等处理后得到目的蛋白片段。目前，对于能够进一步增强上述蛋白或多肽高表达的促表达肽及使用所述促表达肽构建的具备高表达潜力的表达载体及其重组工程菌研究相对较少。

因此，获得适于多种难以表达或表达量低的蛋白或多肽的促表达肽，并基于其构建具备高表达能力的重组工程菌，以能够提高多肽或蛋白表达量，有效降低生产成本，仍有较大需求。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种促表达肽，基于该促表达肽构建的重组工程菌能够高效表达胰岛素肽链前体、GLP-1相关靶点激动剂多肽。

如本文所用，术语“目的蛋白”是指希望获得高表达量的目的产物或其前体蛋白。

如本文所用，术语“引导肽”是指连接于目标多肽或蛋白，引导蛋白可溶表达、分泌，或帮助目标多肽或蛋白正确折叠实现可溶表达的多肽序列，也称为“前导肽”、“先导肽”、“分泌肽”。

如本文所用，术语“促表达肽”是指连接在引导肽后和目的蛋白或多肽前，进一步增强目的蛋白或多肽的表达量，或能够促进难以通过常规引导肽表达的目的蛋白或多肽的表达的多肽序列。

术语“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸序列的分子，无论长度、翻译后修饰或功能。

如本文所用，术语“胰岛素”包括天然胰岛素和胰岛素类似物。

如本文所用，术语“天然胰岛素”是指为51个氨基酸残基多肽(5808道尔顿)的激素，其在许多关键细胞过程中起重要作用。人胰岛素的成熟形式由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808Da的A链(GlyAl-AsnA21)和B链(PheB1-ThrB30)。该分子通过两个链间(A20-B19，A7-B7)和一个链内二硫键(A6-A11)稳定。本发明的胰岛素包括天然的、通过合成提供的或基因工程化的(例如重组的)来源，在本发明的各种实施方式中，胰岛素可以是人天然胰岛素，也可以是胰岛素类似物。

如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指胰岛素的改变形式，其是胰岛素的更快速作用形式或更长效作用形式。这样的类似物的非限制性实例包括赖脯胰岛素、德谷胰岛素(Insulin Degludec)、门冬胰岛素(Insulin Aspart)和甘精胰岛素(Glargine Insulin)。“赖脯”胰岛素类似物在初级结构上与人胰岛素基本相同，通过交换B28位置处的赖氨酸和B29位置处的脯氨酸而不同于人胰岛素。它是一种短效胰岛素类似物。“甘精”胰岛素类似物通过在A21处用天冬酰胺替换甘氨酸，以及在B链的C末端添加两个精氨酸残基而不同于人胰岛素。在pH4.0下配制和注射甘精胰岛素溶液。这些修饰将等电点提高至更中性的pH，降低了生理条件下的溶解度，并且导致甘精胰岛素在注射位置沉淀，从而减慢了吸收。甘精胰岛素是一种持续20～24小时的长效类似物。

如本文所用，术语“胰岛素前体”是指天然胰岛素或胰岛素类似物的胰岛素A链和B链连接而成的单链分子，其具体为通过C肽连接胰岛素B链和胰岛素A链而成。

如本文所用，术语“多核酸片段”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷酸链。本发明的核酸片段可以是脱氧核糖核酸片段(DNA)或核糖核酸片段(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。可以根据本文提供的方法使用的编码胰岛素的核酸片段可以是编码胰岛素多肽或其前体(包括胰岛素原和前胰岛素原)的任何核酸片段。

如本文所用，术语“编码序列”是指一种多核苷酸序列，当其置于适当的控制序列的控制下时被转录成mRNA，mRNA被翻译成多肽。编码序列的边界通常由位于mRNA的5'端的开放阅读框的开始的起始密码子和位于mRNA的开放阅读框的3'端的终止密码子确定。

术语“GLP-1多肽”通常指GLP-1(7-37)多肽及其类似物。GLP-1(7-37)多肽是指由人天然GLP-1多肽的第7～37位氨基酸组成的多肽，而GLP-1(7-37)多肽类似物是指对人天然GLP-1(7-37)氨基酸进行修饰获得的多肽，所述修饰包括去除和/或取代(置换)和/或添加(延长)一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是人工合成的氨基酸。

术语“GLP-1相关多靶点激动剂多肽”是指同时具备激活GLP-1受体和其他糖尿病相关多靶点受体的共激动剂的多肽，所述靶点包括但不限于葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体、胰高血糖素(GCG)受体。所述共激动剂可以是GLP-1受体和GIP受体双靶点共激动剂(GLP-1/GIP共激动剂)、GLP-1受体和GCG受体双靶点共激动剂(GLP-1/GCG共激动剂)，也可以是GLP-1受体、GIP受体和GCG受体三靶点共激动剂(GLP-1/GIP/GCG共激动剂)。

本发明第一方面提供了如SEQ ID NO:1所示的多肽作为构建重组大肠杆菌工程菌的促表达肽的用途。如SEQ ID NO:1所示的多肽作为促表达肽，可以高效表达一些难以表达的目的蛋白或多肽，或显著增强表达量低的目的蛋白或多肽，尤其是适用于胰岛素前体、GLP-1多肽、GLP-1相关多靶点激动剂多肽等。

本发明第二方面提供了一种包含目的蛋白的融合蛋白，融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和目的蛋白片段依次连接而成，其中，促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，酶切位点的氨基酸序列选自K或DDDDK(SEQ ID NO:2)。酶切位点K可采Lys-C酶进行水解，DDDDK酶切位点可采用肠激酶进行水解。

作为本发明技术方案的一种改进，引导肽可以是本领域常规的引导肽序列，优选为FKFEFKFE(SEQ ID NO:7)或FEFKFEFK(SEQ ID NO:8)。

其中，目的蛋白选自胰岛素前体、GLP-1多肽和GLP-1相关多靶点激动剂多肽，以提高其表达量。作为本发明的具体实施方式，目的蛋白氨基酸序列选自：SEQ ID NO:3～SEQID NO:6。

其中，本发明中所涉及的蛋白或多肽的氨基酸序列具体如表1所示：

表1

本发明第三方面提供了一种用于编码上述融合蛋白的多核苷酸片段。作为本发明的具体实施方式，多核苷酸片段的序列如SEQ ID No:9～SEQ ID No:16的任一项所示。

本发明第四方面提供了一种表达载体，表达载体包含上述多核苷酸片段，其中，表达载体为重组pET-30a(+)表达载体。

本发明第五方面提供了一种重组大肠杆菌工程菌，重组大肠杆菌工程菌包含上述表达载体，大肠杆菌优选自BL21(DE3)。进一步的，本发明的重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：

(1)合成编码本发明融合蛋白的多核苷酸片段；

(2)将多核苷酸片段克隆到表达质粒中，构建得到重组表达载体；

(3)将表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌工程菌。

优选地，本发明的多核苷酸序列如SEQ ID No:9～SEQ ID No:16的任一项所示；本发明的质粒优选为pET-30a(+)；本发明的大肠杆菌优选为BL21(DE3)。

本发明第六方面提供了一种制备上述的重组大肠杆菌工程菌的方法，包括如下步骤：

(1)合成编码本发明融合蛋白的多核苷酸；

(2)将所述多核苷酸克隆到表达质粒中，构建得到重组表达载体；

(3)将表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌工程菌。

优选地，本发明的多核苷酸序列如SEQ ID No:9～SEQ ID No:16的任一项所示；本发明的质粒优选为pET-30a(+)；本发明的大肠杆菌优选为BL21(DE3)。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明提出一种可以显著提高目的蛋白在大肠杆菌中表达量的促表达肽及重组基因工程菌，对于一些难以表达或表达量低的胰岛素前体蛋白、GLP-1及其相关多靶点共激动多肽前体，可显著增强其表达量。

附图说明

图1～图3为本发明实施例的电泳图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1长效酰化胰岛素衍生物的制备

(1)设计融合蛋白序列，具体如表2所示：

表2

其中“/”表示不含有该序列。

(2)质粒构建：构建如表2所述融合蛋白的编码序列，分别对应为表3中的融合蛋白编号1～8，具体的编码多核苷酸片段如表3所示。

表3

分别通过Nde1及Xho1位点，将构建的编码核苷酸片段插入原核表达质粒pET-30a中并测序验证，得到重组表达质粒。

(3)重组工程菌构建：向30μL BL21(DE3)中加入构建的重组表达质粒，冰浴30min，42℃热激30s～90s，冰浴2min后加入500μL LB培养基，37℃震荡培养1小时，涂至LB固体培养板上，37℃静置过夜，挑取单克隆加入5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜，取500μL过夜菌液，加入500μL 50％的甘油菌混匀，得到甘油冻存菌，-80℃保存。

(4)摇瓶表达

挑取冻存菌株加入50mL LB培养基中，37℃震荡过夜，按照1/100的比例将过夜菌液加入到LB液体培养基中，4小时后加入0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达。37℃恒温震荡培养24小时。7000rpm离心20分钟收菌。

(5)SDS-PAGE电泳检测表达结果：

获得的电泳检测表达结果如图1～图3所示：

在图1中，泳道1为编号2的融合蛋白的表达结果，泳道2为编号1的融合蛋白的表达结果。

从图1中可以看出，在使用本发明促表达肽的融合蛋白(编号1)构建的重组工程菌，明显可以看到目的蛋白的表达，而不含有本发明促表达肽的融合蛋白(编号2)构建的重组工程菌中，其基本无目的蛋白表达，或者说表达量非常低。

在图2中，泳道1为编号3的融合蛋白的表达结果；泳道2为编号4的融合蛋白的表达结果；泳道3为编号3的融合蛋白未诱导对照(在步骤3中不进行IPTG诱导表达的步骤)。

从图2中可以看出，不含有本发明促表达肽的融合蛋白(编号4)构建的重组工程菌经诱导后，其表达情况与未诱导的编号3构建的重组工程菌的表达情况相似，基本无目的蛋白表达，或者说表达量非常低；而使用本发明促表达肽的融合蛋白(编号3)构建的重组工程菌可以看到明显的目的蛋白的表达。

在图3中，泳道1为编号为5的融合蛋白的表达结果，泳道2为编号为6的融合蛋白的表达结果，泳道3为编号为5的融合蛋白的未诱导表达(即在步骤3中不进行IPTG诱导表达的步骤)；泳道4为编号为7的融合蛋白的表达结果，泳道5为编号为8的融合蛋白的表达结果，泳道6为编号为7的融合蛋白的未诱导表达(即在步骤3中不进行IPTG诱导表达的步骤)。

从图3中同样可以看出，不含有本发明促表达肽的融合蛋白构建的重组工程菌经诱导后，目的蛋白基本无表达，或者说表达量非常低；而使用本发明促表达肽的融合蛋白构建的重组工程菌可以看到明显的目的蛋白的表达。结果如上所述，使用本发明促表达肽的序列构建的重组基因工程菌，经诱导后均能观察到明显的目的蛋白表达，而未使用本发明促表达肽的序列构建的重组基因工程菌，和未经诱导的含有本发明促表达肽的序列构建的重组基因工程菌，基本无目的蛋白表达，或者说表达量非常低。可见，本发明促表达肽的效果显著。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (11)

1.如SEQ ID NO:1所示的多肽作为构建重组大肠杆菌工程菌中促表达肽的用途。

2.一种包含目的蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和目的蛋白片段依次连接而成，所述促表达肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述酶切位点的氨基酸序列选自K、DDDDK。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的蛋白选自胰岛素前体、GLP-1多肽、GLP-1相关多靶点激动剂多肽。

5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述引导肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8所示。

6.一种用于编码权利要求2～5任一项所述融合蛋白的多核苷酸片段。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求6所述的多核苷酸片段。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组pET-30a(+)表达载体。

9.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌包含权利要求7或8所述的表达载体，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)。

10.根据权利要求9所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：

(1)合成如权利要求6所述的多核苷酸片段；

(2)将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

(3)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。

11.一种制备权利要求9所述的重组大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)合成如权利要求6所述的多核苷酸片段；

(2)将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)，构建得到表达载体；

(3)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。

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