RU2729737C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF882, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ В30-ДЕЗТРЕОНИН-ИНСУЛИН, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО В30-ДЕЗТРЕОНИН-ИНСУЛИН - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного В30-дезтреонин-инсулина человека. Рекомбинантный В30-дезтреонин-инсулин получают в составе гибридного полипептида, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозинкиназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А. Для этого используют рекомбинантную плазмидную ДНК pF882 и штамм-продуцент Escherichia coli BL21/pF882. Изобретение обеспечивает синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы, позволяет увеличить долю В30-дезтреонин-инсулина в гибридном белке до 49,5% и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг0-А-(В30-дезтреонин-инсулин). 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

Description

Области техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного В30-дезтреонин инсулин для получения инсулинового аналога инсулинадеглудек и может быть использовано для приготовления лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии. Данное изобретение может быть использовано для получения В30-дезтреонин-инсулина (проинсулинадеглудек), имеющего в своем составе цепь B с делецией треонина B30, С- пептид и цепь А. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая гибридный tac-промотор, терминатор рибосомного оперона Е. coli, искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из короткой лидерной последовательности фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, пептидного линкера GlyHis6GlySerArg, сайтапротеолиза «Арг», цепи B с делецией треонина B30, сайта протеолиза «АргАрг», С-пептида, сайт протеолиза «Арг» и цепи А. Более подробно, предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pF882, кодирующая гибридный полипептид,

в котором последовательность MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А,

с молекулярной массой 1,4 МДа (4534 п.о.),

содержащая:

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийностьплазмиды;

- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg, с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора,

- уникальные сайты узнавания рестрикционнымиэндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI - 115, BamHI – 176, SpeI – 435, HindIII – 441, BglII – 1869, NdeI – 2473, AatII – 4465.

Также предложен штамм Escherichiacoli - продуцента гибридного полипептида с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина (проинсулина деглудек). При этом, биосинтез гибридного полипептида индуцируется изопропилтиогалактопиранозидом, уровень его биосинтеза составляет не ниже 4% от массы влажного осадка клеточной биомассы.

Настоящее изобретение позволяет получать гибридный полипептид с высокой долей инсулина деглудек (49,5%) и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг₀-А-(В30-дезтреонин-инсулин). Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма – продуцента полипептиднойчасти инсулинового аналога деглудек.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время сахарный диабет представляет собой серьезнейшую медицинскую и социально-экономическую проблему во всем мире. В связи с этим разработка и внедрение современных методов терапии сахарного диабета является одним из наиболее приоритетных направлений медицины и фармацевтической промышленности (1).

Эффективная заместительная инсулинотерапия как основной способ терапии инсулинозависимого сахарного диабета, имеет, в связи с этим, особое значение. Природные и рекомбинантные инсулины уже не способны в полной мере удовлетворить потребности клиницистов и пациентов. Сегодняшняя медицина требует использования более современных противодиабетических препаратов, таких как аналоги человеческого инсулина короткого и пролонгированного действия (2-5).

У здоровых людей пики выделения инсулина непосредственно связаны с приемом пищи. Между приемами пищи уровень эндогенного инсулина снижается до базального уровня. У здорового человека приблизительно 50% выделяемого за сутки инсулина является базальным (6). Подобный профиль лучше всего может быть воспроизведен путем применения пролонгированного инсулина в сочетании с инсулином короткого действия. Постпрандиальные пики активности эндогенного инсулина могут быть имитированы путем введения препаратов инсулина короткого действия, тогда как для воссоздания базального уровня инсулина используют инсулины в комплексе с нейтральным протамином Хагедорна (инсулин НПХ) или аналоги человеческого инсулина пролонгированного действия (7).

Одним из аналогов человеческого инсулина длительного действия является инсулин деглудек (Tresiba, «NovoNordisk»). Инсулин деглудек является человеческим инсулином, у которого удалена аминокислота треонин в положении B30, а к лизину в положени B29 присоединен остаток пальмитиновой кислоты. Ацилированиежирнокислотным хвостом по лизину B29 приводит к обратимому связыванию с альбумином, циркулирующим в крови и увеличивает длительность действия гормона (8-10).

В составе лекарственной формы присутствует фенол и цинк, что приводит к тмоу, что инсулин деглудек находится в стабильной дигексамерной форме, при этом жирные кислоты расположены между гексамерами(10, 11). Олигомерная структура инсулина деглудек детерминирует продолжительность действия, в то время как сродство с альбумином плазмы, предположительно, обеспечивает эффект амортизации и уменьшает изменчивость профиля действия за счет более равномерного поглощения в кровоток (8, 10).

Клиническая оценка применения в терапии инсулина деглудек показала эффект снижения глюкозы, который сохраняется до 42 часов с одновременным снижением эпизодов ночной гипогликемии по сравнению с применением другого инсулина пролонгированного действия гларгин(10, 12).При этом, число пациентов с сахарным диабетом 1 типа, которым необходим аналог инсулина, в частности, инсулин деглудек, растет с каждым годом.

Таким образом, разработка способов получения гибридного полипептида, входящего в состав инсулинового аналога деглудек, является актуальной медицинской задачей.

В настоящее время наиболее перспективной является технология получения инсулина и инсулиновых аналогов с использованием методологии экспрессии гена проинсулина человека в клетках Escherichiacoli в составе гибридных белков в виде нерастворимых "телец включения" (13). Структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида), экспрессируемого в известных штаммах продуцентах инсулина человеческого, представляет собой лидерный пептид, сайт протеолиза «Арг» или «Лиз» или «Лиз Арг», цепь B, сайт протеолиза «АргАрг», С-пептид, сайт протеолиза «Лиз Арг», цепь А (Фиг. 2).

Необходимость включать лидерные пептиды в состав гибридного полипептида связана с низкой стабильностью проинсулина в клетках Escherichiacoli, время полужизни которого составляет 2 минуты (4). В качестве лидерных последовательностей, защищающих проинсулин от протеолитической деградации, используют глутатион-трансферазу(14), иммуноглобулин, связывающий (IgG) домен белка А из S.aureus X(15), интерлейкин-2 (16) и др.

Технологическая схема получения инсулина и инсулиновых аналогов из гибридного полипептида характеризуется следующими этапами: наращивание биомассы клеток штамма-продуцента, выделение телец включения, денатурация гибридного полипептида, ренатурация гибридного полипептида. Следующим этапом технологического процесса является ферментативный гидролиз с использованием смеси двух ферментов: трипсина и карбоксипептидазы B. Трипсин осуществляет гидролиз пептидной связи преимущественно после аргинина, карбоксипептидаза B отщепляет положительно заряженные аминокислоты с C-конца (лизин и аргинин). В результате совместного гидролиза трипсином и карбоксипептидазой B образуется нативный инсулин.

К недостаткам использованных ранее генетических конструкций для экспрессии гибридного полипептида относятся:

1. Низкая доля конечного продукта - инсулина. Это связанно с тем, что лидерные пептиды представляют собой достаточно протяженные аминокислотные последовательности и составляют от 40 до 60% массы гибридного полипептида.

2. Образование близкородственной примеси Арг₀-А-(В30-дезтреонин-инсулин)-инс в результате гидролиза трипсином пептидной связи после а.к. лизин между С-пептидом и А-цепью (фиг. 2).

Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому изобретению являются рекомбинантные плазмиды ДНК pPINS07 и pHINS11, обеспечивающие синтез гибридных полипептидов, имеющих в своем составе IgG-связывающий домен стафилококкового белка А (17) и N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (18), соответственно.

Патент РФ №2144957 описывает штамм E.coli JM109/pPINS07, обеспечивающий синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 25-30%. Плазмида pPINS07 детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором единственный IgG-связывающий домен стафилококкового белка А соединен через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Преимущества предложенного конструкта заключаются в высоком уровне экспрессии гибридного полипептида и в его эффективной ренатурации (рефолдинге) и, как следствие, высоком выходе правильно свернутого полипептида. Существенным недостатком данной рекомбинантной плазмидной ДНК pPINS07 является то, что она кодирует полипептид с низкой долей инсулина, составляющего около 33% (17).

Патент РФ №2354702 описывает рекомбинантную плазмидную ДНК pHINS11 и штамм E.coli JM109/ pHINS11. Данная плазмида детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека и обеспечивает его высокую экспрессию. Использование этих конструкций в технологическом процессе позволяет получать высокоочищенный инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не менее 27,5 МЕ/мг. Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза гибридного полипептида и более высокая доля инсулина в гибридном полипептиде (38%) по сравнения с рекомбинантной плазмидой pPINS07 (33%), однако стадия ренатурации продуцируемого гибридного полипептида недостаточно эффективна (18).

Общим недостатком гибридных полипептидов в описанных патентах является сайт протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью, допускающий образование близкородственной примеси Арг₀-А-(В30-дезтреонин-инсулин).

Задачей предлагаемого изобретения является конструирование плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень индуцируемой экспрессии гибридного полипептида с высокой долей полипептидной части инсулина деглудек и модифицированным сайтом протеолиза между С-пептидом и
А-цепью с целью предотвращения возможности образования близкородственной примеси Арг₀-А-(В30-дезтреонин-инсулин) при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.

Поставленная задача решается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК pF882 и штамма Escherichiacoli BL21/pF882, обеспечивающего синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы.

Описание фигур

На Фиг. 1 показана молекулярная структура инсулина деглудек (9).

На Фиг. 2 представлена структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида) в штаммах продуцентах инсулина.

На Фиг. 3 показана структура последовательности ДНК, полученной методом химического синтеза.

На Фиг. 4 показано Расположение праймеров на плазмиде pF173 для сайт-направленного мутагенеза сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью.

На Фиг. 5 Первичная структура EcoRI/HindIII-фрагмента плазмиды pF882, кодирующая гибридный полипептид. Подчеркнуты инициирующий и терминирующие кодоны, обозначены сайты узнавания рестриктаз.

На Фиг. 6 Физическая карта рекомбинантной плазмиды pF882. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции, pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды, Ptac - гибридный промотор транскрипции, rrnB - терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, Лидерный пептид - MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), и пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, Продеглудек - В30-дезтреонин-инсулина (проинсулин деглудек), LacI - транскрипционный репрессор, регулирующий транскрипцию Tac-промотора, а также праймеры Pr033 и Pr039.

Подробное описание изобретения

Согласно изобретению, предложена рРекомбинантнаяплазмидная ДНК pF882, кодирующая гибридный полипептид,

в котором последовательность MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А,

с молекулярной массой 1,4 МДа (4534 п.о.),

содержащая:

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийностьплазмиды;

- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg, с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора,

- уникальные сайты узнавания рестрикционнымиэндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI- 115, BamHI – 176, SpeI – 435, HindIII – 441, BglII – 1869, NdeI – 2473, AatII – 4465.

Также предложен штамм Escherichiacoli BL21/pF882 - продуцент гибридного полипептида с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина (проинсулина деглудек), трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.Кроме того, предложен гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, полученный с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.

Авторы настоящего изобретению установили, что при существенном сокращении размера гибридного полипептида за счет использования короткой лидерной последовательности, состоящей из 31 аминокислоты и изменении сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью на «Арг» можно достичь высоких выходов целевого пептида.

В составе лидерного пептида имеется короткая последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, образующая выраженную пространственную структуру типа «альфа-спираль». Наличие N-концевого альфа-спирального участка в гибридном полипептиде положительно влияет на уровень ренатурации гибридного полипептида.

Настоящее изобретение позволяет увеличить долю полипептидной части инсулинадеглудек в гибридном полипептиде до 49,5% и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг₀-А-(В30-дезтреонин-инсулин). Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма – продуцента полипептидной части инсулинового аналога деглудек.

Исходной плазмидой для создания экспрессионного вектора pF265 послужила плазмида pF019, представляющая собой рекомбинантный вектор pBR322 (8), в которой методами молекулярного клонирования полностью удалили ген устойчивости к тетрациклину (пример 1).

На следующем этапе синтезировали фрагмент ДНК размером 1,6 кб, содержащий следующие элементы и сайты рестрикции (Фиг. 2):

- Tacпромотер и Lac оператор для контроля экспрессии гибридного полипептида (9), фланкированный сайтами рестрикции XhoI и EcoRI.

- Терминатор транскрипции rnnB оперона штамма K-12 ER3413 (REGION: 4143199..4143361), перед которым расположен сайт рестрикции HindIII.

- LacI ген штамма K-12 ER3413 (REGION: 365804 to 367006) с сайтом рестрикции BglII на 3’-конце. Введение LacI гена в экспрессионную конструкции решает задачу контроля экспрессии гибридного полипептида при использовании широкого круга штаммов-хозяев, включая BL21, характеризующийся повышенной стабильностью рекомбинантных полипептидов за счет удаления клеточных протеаз lon иompT.

Синтезированный фрагмент ДНК и плазмиду pF019 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции XhoI и BglII в течение 3-х часов при 37^оС. Соответствующие ДНК-фрагменты выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coliвыделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.

Таким образом, получали экспрессионный вектор pF20 на основе плазмидной ДНК pBR322, содержащий Таспромотер, rnnB терминатор и LacI ген, кодирующий транскрипционный репрессор Таспромотера, а также сайты рестрикции EcoRI и HindIII для последующей вставки гена, кодирующего гибридный полипептид.

ДНК последовательность гибридного полипептида, содержащую в качестве лидерного пептида IgG-связывающий домен белка А из Staphylococcusaureus, пептидный линкер His6GlySerArg и проинсулина человека, вырезали из плазмидной ДНК pPIN07 (6) с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI / HindIII и вставляли по соответствующим сайтам рестрикции в экспрессионный вектор pF20 описанным выше способом, при этом в получаемом векторе появлялся сайт рестрикции BamHI, образованный кодирующей последовательностью двух аминокислот пептидного линкера GlySer (GGATCC). В результате получали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF100.

На следующим этапе получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF173 после замены ДНК последовательности IgG-связывающего домена белка А из StaphylococcusaureusДНК последовательностью, кодирующей более короткий лидерный пептид MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, представляющий собой фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), регулируемой фактором роста гепатоцитов (пример 2). Аминокислотная последовательность LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp локализована в альфа-спиральном участке белка TKS (№ 3D структуры в базе данных PDB: 3F1I). Наличие альфа-спирального участка в способствует эффективной ренатурации гибридного полипептида.

Методом сайт-направленного мутагенеза в рекомбинантнойплазмидной ДНКpF173 удаляли кодон «aag» в положении 373-375, соответствующий аминокислоте лизин сайта протеолиза«Лиз Арг» между С-пептидом и
А-цепью проинсулина (пример 3). Описанным способомполучали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF265 для экспрессии проинсулина в составе гибридного полипептида.

На последнем этапе методом сайт-направленного мутагенеза в рекомбинантнойплазмидной ДНК pF265удаляли кодон «acc», соответствующий треонинуB30 (пример 4). В результате получали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF882, кодирующую гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина (проинсулина деглудек) и характеризующаяся следующими признаками:

имеет молекулярную массу 1,4 МДа (4534п.о.);

состоит из следующих структурных элементов (Фиг.6):

BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);

ROP ген, регулирующий копийностьплазмиды;

XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген следующего состава:

последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, цепь B инсулина с делецией треонина B30, сайт протеолиза «АргАрг», С-пептид, сайт протеолиза «Арг», цепь А инсулина;

HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, а также транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора;

содержит уникальные сайты узнавания рестрикционнымиэндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 115,BamHI – 176, SpeI – 438, HindIII – 444, BglII – 1872, NdeI – 2476, AatII– 4468.

Преимуществами предложенной плазмидной ДНК конструкции являются высокая доля полипептидной части инсулинадеглудек в гибридном полипептиде (49,5%), наличие в составе лидерного пептида последовательности, образующей пространственную структуру типа «альфа-спирали» для улучшения эффективности ренатурации гибридного полипептида, модификация сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью, исключающая образование близкородственной примеси Арг₀-А-(В30-дезтреонин-инсулин) при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с В30-дезтреонин-инсулина (проинсулином деглудек)электрокомпетентные клетки штамма реципиента Escherichiacoli BL21 трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК pF882 методом электропорации согласно описанной методике (21) и высевали на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина.

Полученный штамм-продуцент Escherichiacoli BL21/pF882 характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки: Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1x3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного полипептида.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые; край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, при оптимальном рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование промежуточной генетической конструкции pF019.

ПЦР-продукт размером 2.8 кб, полученный в результате амплификации плазмиды pBR322 с праймерами Pr033 (5’ – ccaacgtaac agatct (BglII) aacagctcgaa ctcgag ( XhoI) ttgaagacgaaagggcctcg – 3’) и Pr039 (5’– ccaaccgtaac agatct ( BglII ) ctgtggaacacctacatctg- 3’), вырезали из геля, очищали с использованием набора Qiagen. После инкубации с эндонуклеазой рестрикции BglIIв течение 3-х часов при 37^оС очищенный ДНК-фрагмент лигировали с помощью T4 ДНК лигазы и использовали для трансформации XL1-Blue штамма E.coli(AgilentTechnology, 200249) методом электропорации(10). Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) подтверждали секвенированием. Описанным выше способом получали плазмиду pF019, представляющую собой фрагмент плазмиды pBR322 с полной делецией гена устойчивости к тетрациклину.

Пример 2. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF173.

Для введения в состав проинсулина короткого лидерного пептида синтезировалипраймеры pr096 (tcaacgtaac gaattc tatgctgtattatgaaggcctgcaggacggcagcagccaccaccatcatcatcatggatcccg) и pr130 (tgcctggcggcagtagcgcg). Праймер pr096 имеет в своем составе сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI; область, кодирующую аминокислотную последовательность лидерного пептида; последовательность, соответствующую пептидному линкеру His6GlySerArg конструкции pF100.

В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,

- 0,1 нгплазмидной ДНК pF100,

- 1 мкл смеси 10 мМdNTP,

- 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. TaqДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 ThermalCycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96^оС (5 мин), 30 циклов – 96^оС (15 сек), 55^оС
(15 сек), 72^оС (30 сек).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру 600 п.о., вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE(Трис-борат-ЭДТА)c использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.

Вырезанный из геля ПЦР-продукт и плазмиду pF100 инкубировались с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII в течение 3-х часов при 37^оС. Соответствующие ДНК-фрагменты (330 п.о. и 4,2 кб) выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coliвыделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 с помощью сайт-направленного мутагенеза плазмиды pF173.

Для модификации сайта протеолиза«Лиз Арг» между С-пептидом и
А-цепью проинсулина синтезировалиолигонуклеотидыPr237 (cgtggtatcgttgaacagtg) и Pr238 (ctgcagagaaccttccagag), содержащие фосфатную группу с 5’- конца (Фиг. 4).

В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,

- 0,1 нгплазмидной ДНК pF173,

- 1 мкл смеси 10 мМdNTP,

- 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. TaqДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 ThermalCycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96^оС (5 мин), 30 циклов – 96^оС (15 сек), 55^оС (15 сек), 72^оС (3 мин).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру плазмиде pF173 (4,5 кБ), вырезали из геля и очищался с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBEc использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 концы выделенного из геля ПЦР-продукта лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (10 мкл) использовали для трансформации штамма BL21 методом электропорации(10).После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с ампициллином, из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получали рекомбинантнуюплазмиднуюДНК pF265, экспрессирующую проинсулин в составе гибридного полипептида.

Пример 4. Получение конечной генетической конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК pF882.

Для делециикодона «acc», соответсвующеготреонинуB30,синтезировалиолигонуклеотиды:

Tyr Thr Pro Lys ArgArg

c tacaccccgaagcgtcgt

1) Pr1266, 3' - g atgtggggcttcgcagcattccttccgaggagattgttg - 5';

Glu Ala Glu Asp Leu Gln

2) Pr1267, 5'- ttccatcgaggagaaccaaaggtgaagctgaagacctgcag- 3',

жирным шрифтом отмечены сайты узнавания для эндонуклеазы рестрикции BseRI;

3) Pr23 (ccacctgacgtctaagaaacc);

4) Pr166 (cataccgcgaaaggttttgcg);

5) Pr130 (tgcctggcggcagtagcgcg).

В состав реакционной смеси 1 (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,

- 0,1 нгплазмидной ДНК pF265,

- 1 мклсмеси 10 мМdNTP,

- 0,5 мкл каждого праймераPr1266 и Pr23 (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. TaqДНК полимеразы.

В состав реакционной смеси 2 (100 мкл) входили следующие компоненты:

- 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,

- 0,1 нгплазмидной ДНК pF265,

- 1 мкл смеси 10 мМdNTP,

- 0,5 мкл каждого праймераPr1267 и Pr166 (10 мкМ),

- 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

- 2 ед. TaqДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 ThermalCycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96^оС (5 мин), 30 циклов – 96^оС (15 сек), 55^оС
(15 сек), 72^оС (30 сек).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBEc использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400. ПЦР-продукты реакционных смесей 1 и 2, соответствующиеразмерам 378 и 416 п.о., вырезались из геля и очищались с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit.

После инкубации с эндонуклеазой рестрикции BseRIв течение 3-х часов при 37^оС очищенные ДНК-фрагменты лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (1 мкл) использовали как матрицу для ПЦР с праймерами Pr23 и Pr130 (0,5 мкл каждого праймераc концентрацией10 мкМ). В состав реакционной смеси 3 (100 мкл) также входили: 10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы, 1 мкл смеси 10 мМdNTP, 2 ед. Pfu ДНК-полимеразы, 2 ед. TaqДНК полимеразы.

ПЦР-продукт реакционной смеси 3, соответствующий размеру 756 п.о., вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA RecoveryKit.Вырезанный из геля ПЦР-продукт и плазмиду pF265 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII в течение 3-х часов при 37^оС. Соответствующие ДНК-фрагменты (326 п.о. и 4,2 кб) выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорацииС2523 (NEB) штамма E.coliвыделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.

В результате получали рекомбинантнуюплазмидную ДНК pF882, экспрессирующую гибридный полипептид, имеющий в своем составе:

цепь B с делецией треонина B30,

сайт протеолиза «АргАрг» между цепью B и С-пептидом,

сайт протеолиза «Арг» между С-пептидом и цепью А.

Пример 5. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида.

Индивидуальную колонию клеток штамма E. coli BL21, содержащуюрекомбинантную плазмидную ДНК pF882,инокулировали2 мл LB среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, растили в термошейкере при 37ºС в течение 22 часов при перемешивании (170 об./мин). После измерения оптической плотности OD₆₀₀ ночной культуры засевали 40 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина (ODстартовая₆₀₀ = 0,1) и растили 1-2 часа при 37°С на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) до достижения оптической плотности OD₆₀₀ = (0,8 ± 0,2). 20 мл культуры переносили в другую колбу (контроль без индукции), к оставшимся 20 мл добавляли 10 мкл 1М ИПТГ (изопропил-бета-галактопиранозид) (конечная концентрация ИПТГ – 0,5 мМ). После 4 часов инкубирования на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) клеточные культуры центрифугировали (15 мин, 3000 rpm), определяли массу влажного осадка клеток, замораживали.Содержание гибридного полипептида в % от массы влажного осадка измеряли методом капиллярного электрофореза.Уровень экспрессии составил не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы.

Источникиинформации:

1.	King H, Aubert RE, Herman WH. Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes care. 1998 Sep;21(9):1414-31. PubMed PMID: 9727886.
2.	Bolli GB, Owens DR. Insulin glargine. Lancet. 2000 Aug 5;356(9228):443-5. PubMed PMID: 10981882.
3.	Meece JD, Campbell RK. Insulin lispro update. The Diabetes educator. 2002 Mar-Apr;28(2):269-77. PubMed PMID: 11924304.
4.	Dunn CJ, Plosker GL. Insulin lispro: a pharmacoeconomic review of its use in diabetes mellitus. PharmacoEconomics. 2002;20(14):989-1025. PubMed PMID: 12403639.
5.	Home PD, Ashwell SG. An overview of insulin glargine. Diabetes/metabolism research and reviews. 2002 Sep-Oct;18 Suppl 3:S57-63. PubMed PMID: 12324987.
6.	Nakashima E, Kuribayashi N, Ishida K, Taketsuna M, Takeuchi M, Imaoka T. Efficacy and safety of stepwise introduction of insulin lispro mix 50 in Japanese patients with type 2 diabetes inadequately controlled by oral therapy. Endocrine journal. 2013;60(6):763-72. PubMed PMID: 23459461.
7.	Roach P, Woodworth JR. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of insulin lispro mixtures. Clinical pharmacokinetics. 2002;41(13):1043-57. PubMed PMID: 12403642.
8.	Jonassen I, Havelund S, Hoeg-Jensen T, Steensgaard DB, Wahlund PO, Ribel U. Design of the novel protraction mechanism of insulin degludec, an ultra-long-acting basal insulin. Pharmaceutical research. 2012 Aug;29(8):2104-14. PubMed PMID: 22485010. Pubmed Central PMCID: PMC3399081. Epub 2012/04/10.
9.	Дедов ИИ, Шестакова МВ. Инсулин деглудек – новый аналог инсулина сверхдлительного действия. Сахарный диабет. 2014;2:91–104.
10.	Селиванова О.М., Гришин С.Ю., Глякина А.В., Садгян А.С., Ушакова Н.И., Галзитская О.В. Анализ аналогов инсулина и стратегия их дальнейшей разработки. Успехибиологическойхимии. 2018;58:313–46.
11.	Whittingham JL, Havelund S, Jonassen I. Crystal structure of a prolonged-acting insulin with albumin-binding properties. Biochemistry. 1997 Mar 11;36(10):2826-31. PubMed PMID: 9062110. Epub 1997/03/11.
12.	Sorli C, Warren M, Oyer D, Mersebach H, Johansen T, Gough SC. Elderly patients with diabetes experience a lower rate of nocturnal hypoglycaemia with insulin degludec than with insulin glargine: a meta-analysis of phase IIIa trials. Drugs & aging. 2013 Dec;30(12):1009-18. PubMed PMID: 24170235. Pubmed Central PMCID: PMC3832772. Epub 2013/10/31.
13.	Баирамашвили ДИ. Генноинженерный инсулин человека: успехи и перспективы. Рос хим ж (Ж Рос об-ва им ДИ Менделеева). 2005;XLIX(1):34-45.
14.	Berg H, Walter M, Mauch L, Seissler J, Northemann W. Recombinant human preproinsulin. Expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus. Journal of immunological methods. 1993 Sep 15;164(2):221-31. PubMed PMID: 8370928.
15.	Jonasson P, Nilsson J, Samuelsson E, Moks T, Stahl S, Uhlen M. Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide. European journal of biochemistry / FEBS. 1996 Mar 1;236(2):656-61. PubMed PMID: 8612642.
16.	Castellanos-Serra LR, Hardy E, Ubieta R, Vispo NS, Fernandez C, Besada V, et al. Expression and folding of an interleukin-2-proinsulin fusion protein and its conversion into insulin by a single step enzymatic removal of the C-peptide and the N-terminal fused sequence. FEBS letters. 1996 Jan 8;378(2):171-6. PubMed PMID: 8549827.
17.	КоробкоВГ, БолдыреваЕФ, ШингароваЛН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин человека, и штамм бактерий Escherichia coli – продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека: Патент РФ №2144957; 1999.
18.	Шматченко ВВ, Шматченко НА, Байдусь АН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHINS11, кодирующая гибридный белок – предшественник инсулина человека, клетка Escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной ДНК pPHINS11, штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHINS11 - продуцент гибридного белка – предшественника инсулина человека и способ получения инсулина человека2006. Available from: http://bd.patent.su/2263000-2263999/pat/servl/servletc85e.html.
19.	Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW, et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene. 1977;2(2):95-113. PubMed PMID: 344137. Epub 1977/01/01. eng.
20.	de Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983 Jan;80(1):21-5. PubMed PMID: 6337371.
21.	Lessard JC. Transformation of E. coli via electroporation. Methods in enzymology. 2013;529:321-7. PubMed PMID: 24011058. Epub 2013/09/10.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	Zakrytoe Aktsionernoe Obshchestvo "FARM-Kholding"
<120>	Recombinant Plasmid DNA pF882 encoding Hybrid polypeptide comprising proinsulindegludec, and proinsulin degludec- comprising hybrid polypeptide producer bacterial strain Escherichia coli
<140>	RU 2019116129
<141>	2019-05-23
<160>	1
<210>	1
<211>	10
<212>	PRT
<213>	E. coli
<400>	1
GlyHisHisHisHisHisHisGlySerArg

<210>	2
<211>	9
<212>	PRT
<213>	E. coli
<400>	2
MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp

<210>	3
<211>	11
<212>	PRT
<213>	E. coli
<400>	3
HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg

<210>	4
<211>	9
<212>	PRT
<213>	E. coli
<400>	4
HisHisHisHisHisHisGlySerArg

<210>	5
<211>	8
<212>	PRT
<213>	E. coli
<400>	5

LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp

<210>	6
<211>	53
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	6
ccaacgtaacagatct 16 aacagctcgaactcgag 17 ttgaagacgaaagggcctcg 20
<210>	8
<211>	79
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	8
tcaacgtaacgaattct 17 atgctgtattatgaaggcctgcaggacggcagcagccaccac 42 catcatcatcatggatcccg 20

<210>	9
<211>	20
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	9
tgcctggcggcagtagcgcg

<210>	10
<211>	20
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	10
cgtggtatcgttgaacagtg

<210>	11
<211>	20
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	11
ctgcagagaaccttccagag
<210>	12
<211>	19
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	12
c tac acc ccg aag cgt cgt

<210>	13
<211>	40
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	13
g atg tgg ggc ttc gca gca 19 ttccttccgaggagattgttg 21

<210>	14
<211>	41
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	14
ttccatcgaggagaaccaaaggt 23 gaagctgaagacctgcag 18

<210>	15
<211>	21
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	15
ccacctgacgtctaagaaacc

<210>	16
<211>	21
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	16
cataccgcgaaaggttttgcg

<210>	17
<211>	20
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	17
tgcctggcggcagtagcgcg

<210>	18
<211>	714
<212>	DNA
<213>	E. coli
<400>	18
tttgtttaactttaagaaggagagaattctatgctgtattatgaa45 aaacaaattgaaattcttcctctcttaagatacgacataatactt45 ggcctgcaggacggcagcagccaccaccatcatcatcatggatcc45 ccggacgtcctgccgtcgtcggtggtggtagtagtagtacctagg45 cgttttgttaaccaacacctgtgcggttctcacctggttgaagct45 gcaaaacaattggttgtggacacgccaagagtggaccaacttcga45 ctgtacctggtttgcggtgaacgtggtttcttctacaccccgaag45 gacatggaccaaacgccacttgcaccaaagaagatgtggggcttc45 cgtcgtgaagctgaagacctgcaggttggtcaggttgaactg42 gcagcacttcgacttctggacgtccaaccagtccaacttgac42 ggtggtggtccgggtgctggtagcctgcaaccgctggctctggaa45 ccaccaccaggcccacgaccatcggacgttggcgaccgagacctt45 ggttctctgcagcgtggtatcgttgaacagtgctgcacctctatc45 ccaagagacgtcgcaccatagcaacttgtcacgacgtggagatag45 tgctctctgtaccagctggaaaactactgcaactagtaagcttag45 acgagagacatggtcgaccttttgatgacgttgatcattcgaatc45

<210>	19
<211>	105
<212>	PRT
<213>	E. coli
<400>	19
MetLeuTyrTyrGlu5 GlyLeuGlnAspGlySerSerHisHisHisHisHisHisGlySer15 ArgPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAla15 LeuTyrLeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLys15 ArgArgGluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeu14 GlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGlu15 GlySerLeuGlnArgGlyIleValGluGlnCysCysThrSerIle15 CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn11

Claims (11)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pF882 для экспрессии в Escherichia coli В30-дезтреонин-инсулина человека в составе гибридного полипептида, имеющая карту плазмиды, как показано на Фиг. 6, с молекулярной массой 1,4 МДа (4534 п.о.),

кодирующая гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозинкиназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью В30-дезтреонин-инсулина, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19,

при этом плазмидная ДНК pF882 содержит:

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, включающий ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость бактериальных клеток к ампициллину; участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды;

- XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором нуклеотидная последовательность соответствует SEQ ID NO: 18;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора;

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRI - 115, BamHI – 176, SpeI – 435, HindIII – 441, BglII – 1869, NdeI – 2473, AatII – 4465.

2. Штамм Escherichia coli BL21/pF882 - продуцент гибридного полипептида с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина человека, при этом штамм получен путем трансформации рекомбинантной плазмидной ДНК pF882 по п. 1.

3. Гибридный полипептид В30-дезтреонин человека, в котором последовательность MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозинкиназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с последовательностью В30-дезтреонин-инсулина человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

Images