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CN115819607A - 同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途 Download PDF

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CN115819607A
CN115819607A CN202211069993.9A CN202211069993A CN115819607A CN 115819607 A CN115819607 A CN 115819607A CN 202211069993 A CN202211069993 A CN 202211069993A CN 115819607 A CN115819607 A CN 115819607A
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set forth
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amino acid
cancer
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马心鲁
贾世香
严源
张玉华
周利
孙日龙
崔雪原
余灵菊
闫玉洁
金莹莹
李媛丽
陈思
刘雪梅
刁家升
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Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
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Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种同时靶向免疫效应细胞抗原CD3和肿瘤相关抗原的四价、同源二聚体型双特异性抗体分子，所述双特异性抗体分子从N端至C端依次包含第一和第二单链Fv和Fc片段；其中，第一单链Fv能够特异性结合肿瘤相关抗原，第二单链Fv能够特异性结合CD3，且第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连；所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。所述双特异性抗体能够显著抑制或杀伤肿瘤细胞，又具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用；此外，这种双特异性抗体为同源二聚体型，不存在重链及轻链错配问题，纯化步骤简单高效，表达量高、且其理化和体内稳定性都显著提高。

Description

同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途
相关申请
本申请要求2018年11月1日提交的中国专利申请CN 201811294887.4的优先权。以上所引用的优先权申请的内容全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体，以及这类抗体的用途，特别是其在治疗癌症中的用途。
背景技术
1985年，利用T细胞杀死肿瘤细胞的概念就已被提出(Stearz UD等,Nature,314:628-631,1985)。通常认为有效激活T细胞需要双重信号，第一信号来自抗原呈递细胞上MHC-抗原复合物与T细胞受体TCR-CD3的结合，第二信号为T细胞与抗原呈递细胞表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性共刺激信号。由于多数肿瘤细胞表面MHC的表达下调甚至缺失，从而使肿瘤细胞逃逸免疫杀伤。
双特异性抗体从作用机制上可分为双重信号阻断型和介导细胞功能型。通常，介导细胞功能型双特异性抗体指介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体。CD3分子表达于所有成熟T细胞表面，并与TCR呈非共价结合，形成完整的TCR-CD3复合物，共同参于对抗原刺激的免疫应答，是目前在双特异性抗体中应用最多且最成功的免疫效应细胞表面的触发分子。靶向CD3的双特异性抗体则能够分别结合T细胞表面CD3和肿瘤细胞表面抗原，从而拉近细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,Tc或CTL)与肿瘤细胞的距离，并直接激活T细胞，诱导T细胞直接杀伤癌细胞，而不再依赖于传统的T细胞的双重激活信号。但是，靶向T细胞抗原CD3的激动型抗体，例如，第一代应用于临床的靶向人CD3的小鼠单克隆抗体OKT3(Kung P等,Science,206:347-349,1979)，由于T细胞被过度激活而大量释放炎症因子，诸如白介素-2(IL-2)、TNF-α、IFN-γ和白介素-6(IL-6)，在临床上会引起严重的“细胞因子风暴综合症”(Hirsch R等,J.Immunol.,142:737-743,1989)，导致以发烧、寒战、头疼、恶心、呕吐、腹泻、呼吸窘迫、无菌性脑膜炎和血压过低为特征的“流感样”综合征。因而，开发靶向CD3的双功能抗体，如何削弱或避免过度的细胞因子风暴是首要考虑的问题。
近年来，为了解决将两个不同的半抗体进行正确装配问题，科学家们设计开发了多种结构的双特异性抗体。总体归结起来有两大类，一类双特异性抗体不含Fc区。这类结构双抗优点是分子量小，可以在原核细胞中表达，不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体Fc段，分子量较低，导致其半衰期较短，且这种形式的双抗极易聚合、稳定性差且表达量低，因而临床应用受到一定限制。目前已有报道的此类双特异性抗体包括BiTE、DART、TrandAbs、bi-Nanobody等。
另一类双特异性抗体保留Fc结构域。此类双抗形成IgG样结构，分子结构较大，并且由FcRn介导的细胞内吞和再循环过程，使其具有更长的半衰期；同时保留了Fc介导的部分或全部效应子功能，如抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)、补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞吞噬(ADCP)。目前已有报道的此类双特异性抗体包括Triomabs、kih IgG、Cross-mab、orthoFab IgG、DVD IgG、IgG scFv、scFv2-Fc等。而对于抗CD3双特异性抗体，目前除了TandAb和scFv-Fv-scFv构型外，其它抗CD3双特异性抗体的设计广泛采用单价抗CD3形式，主要因为二价抗CD3双特异性抗体很容易导致过度激活而诱发T细胞凋亡和大量细胞因子瞬时释放(Kuhn C等,Immunotherapy,8:889-906,2016)，并且更为严重的是它还可能引发非抗原依赖性地激活T细胞而打破免疫平衡。因此，现有技术中的抗CD3双特异性抗体多避免引入二价抗CD3抗体，例如triFab-Fc、DART-Fc和BiTE-Fc构型的双特异性抗体都采用非对称性设计(即异源二聚体型双抗)(Z Wu等,Pharmacology and Therapeutics,182:161-175,2018)，但这对其下游的生产带来很多挑战，如产生不希望出现的同源二聚体或错配的杂质分子，增加了双抗表达和纯化的难度。尽管“knobs-into-holes”技术的运用一定程度上解决了异源二聚体型双抗分子的重链间错配的问题，然而“轻链/重链错配”又带来了另一个挑战。防止重链-轻链错配的一种策略是将双特异性抗体的其中一条Fab的轻链和重链的部分结构域互换，形成Crossmab(杂交抗体)，该方法可以允许轻链/重链间选择性地配对。但这些方法的缺点是不能完全杜绝错配产物的生成，而任何错配分子的残留级分都很难从产物中分离，并且这种方法需要针对两个抗体序列进行大量的突变等基因工程改造，无法达到简单、通用的目的。
另外，对于含CD3特异性的IgG样结构的双特异性抗体，因具有FcγR结合能力，可能导致无限制的长久T细胞激活，且这种激活是非靶细胞限制性的，无论是否与靶抗原结合，在表达FcγR的组织内(例如在造血、淋巴和网状内皮系统内)，都发现了活化的T细胞。这种T细胞的全身性激活，将伴随着细胞因子的大量释放，这是一种在T细胞激活细胞因子或抗体的治疗应用过程中的严重不良反应。因此，对于这类介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体需要避免Fc介导的T细胞全身性激活，从而允许免疫效应细胞在靶细胞组织内的限制性激活，即专一性地依赖双特异性抗体与相应靶抗原的结合。
因此，本领域迫切需要开发在产品半衰期、稳定性、安全性和可生产性方面具有改善性能的新型双特异性分子。
发明内容
本发明目的是提供一种靶向免疫效应细胞抗原CD3和肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen,TAA)的四价、同源二聚体型双特异性抗体分子，这种双特异性抗体在体内能够显著抑制或杀伤肿瘤细胞，但对低表达TAA的正常细胞的非特异性杀伤作用显著降低，同时具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用，且其理化和体内稳定性都显著提高。
本发明第一方面，提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤相关抗原的第一单链Fv(抗-TAA scFv)、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv(抗-CD3 scFv)和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有效应子功能。
其中，第一单链Fv针对肿瘤相关抗原具有特异性，其所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽(L1)连接，所述VH、L1和VL以VH-L1-VL或VL-L1-VH的顺序排列，且所述连接肽L1的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；
示例性地，所述肿瘤相关抗原包含但不限于：CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD47、CD52、CD73、CD74、CD123、CD133、CD138、BCMA、CA125、CEA、CS1、DLL3、DLL4、EGFR、EpCAM、FLT3、gpA33、GPC-3、Her2、MEGE-A3、NYESO1、PSMA、TAG-72、CIX、叶酸盐结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR2、VEGFR3、钙黏素(Cadherin)、整合素(Integrin)、间皮素(Mesothelin)、Claudin18、αVβ3、α5β1、ERBB3、c-MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、B7蛋白家族、粘蛋白家族(Mucin)、FAP和肌腱蛋白(Tenascin)；优选地，所述肿瘤相关抗原为CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、BCMA、CS1、EpCAM、CEA、Her2、EGFR、CA125、Mucin1、GPC-3和Mesothelin。
例如，本发明表6-1中示例性的例举了一些优选的针对肿瘤相关抗原的第一单链Fv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD19，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：9、10和11所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：12、13和14所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：17、18和19所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：20、21和22所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：25、26和27所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：28、29和30所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iv)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：33、34和35所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：36、37和38所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD20，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：41、42和43所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：44、45和46所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：49、50和51所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：52、53和54所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：57、58和59所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：60、61和62所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iv)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：65、66和67所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：68、69和70所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD22，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：73、74和75所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：76、77和78所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：81、82和83所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：84、85和86所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD30，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：89、90和91所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：92、93和94所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：97、98和99所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：100、101和102所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合EpCAM，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：105、106和107所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：108、109和110所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：113、114和115所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：116、117和118所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合CEA，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：121、122和123所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：124、125和126所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：129、130和131所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：132、133和134所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：137、138和139所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：140、141和142所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合Her2，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：145、146和147所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：148、149和150所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：153、154和155所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：156、157和158所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：161、162和163所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：164、165和166所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合EGFR，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：169、170和171所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：172、173和174所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：177、178和179所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：180、181和182所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：185、186和187所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：188、189和190所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合GPC-3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：193、194和195所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ IDNO：196、197和198所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合Mesothelin，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：201、202和203所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQID NO：204、205和206所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合Mucin1，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：209、210和211所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：212、213和214所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：217、218和219所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：220、221和222所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合CA125，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：225、226和227所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ IDNO：228、229和230所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第一单链Fv特异性结合BCMA，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：233、234和235所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ IDNO：236、237和238所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD19，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iv)VH结构域包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD20，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iv)VH结构域包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD22，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合CD30，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：104所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合EpCAM，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合CEA，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：144所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合Her2，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：152所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：168所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合EGFR，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：175所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：176所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：183所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：184所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：192所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合GPC-3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：199所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：200所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合Mesothelin，其VH结构域包含如SEQ IDNO：207所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：208所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合Mucin1，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：215所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：216所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：223所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：224所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合CA125，其VH结构域包含如SEQ ID NO：231所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：232所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第一单链Fv特异性结合BCMA，其VH结构域包含如SEQ ID NO：239所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：240所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
其中，连接本发明所述第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成。
进一步地，所述柔性肽包含2个或更多个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。更优地，所述柔性肽包含G和S残基。最优地，所述柔性肽的氨基酸组成结构通式为GxSy(GGGGS)z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1。例如，在一优选实施例中，所述柔性肽的氨基酸序列为G2(GGGGS)3。
进一步地，所述刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列(如SEQ ID NO：257所示)或其截短的片段(以下统称为CTP)。优选地，所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：257N端的10个氨基酸，即SSSSKAPPPS(CTP1)；或所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：257C端的14个氨基酸，即SRLPGPSDTPILPQ(CTP2)；又如，另一实施例中，所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：257N端的16个氨基酸，即SSSSKAPPPSLPSPSR(CTP3)；再如，另一些实施例中，所述CTP刚性肽包含28个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第118位，终止于第145位，即SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(CTP4)。
例如，本发明表6-3中示例性的例举了一些优选的连接第一和第二单链Fv的连接肽L2的氨基酸序列。
在本发明的一优选实施例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：258所示，其柔性肽的氨基酸组成为G2(GGGGS)3，和其刚性肽的氨基酸组成为SSSSKAPPPS(即CTP1)。
其中，第二单链Fv针对免疫效应细胞抗原CD3具有特异性，其所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽(L3)连接，所述VH、L3和VL以VH-L3-VL或VL-L3-VH的顺序排列，且所述连接肽L3的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；
优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv在体外FACS结合分析测定中以大于约50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM的EC50值结合于效应细胞；更优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv不仅能与人CD3结合，还可与食蟹猴或恒河猴的CD3特异性结合。在本发明的一优选实施例中，所述双特异性抗体以132.3nM的EC50值与效应细胞特异性结合。
例如，本发明表6-2中示例性的例举了一些优选的抗-CD3 scFv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列。
优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：241、242和243所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：244、245和246所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：249、250和251所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：252、253和254所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：247所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：248所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
更优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：255所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：256所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。
其中，本发明所述Fc片段直接或通过连接肽L4与第二单链Fv相连，且所述连接肽L4包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；较优地地，所述连接肽L4选自Gly(G)和Ser(S)；更优选地，所述连接肽L4组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。本发明的一优选实施例中，所述Fc片段与第二单链Fv直接相连。
另一方面，本发明所述Fc片段包含来源于人免疫球蛋白重链恒定区的铰链区、CH2和CH3结构域，例如，在某些实施方案中，本发明所述Fc片段来源于例如选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地选自例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且，所述Fc片段与其所源自的天然序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个置换、缺失或添加)。
在一些优选实施方案中，所述Fc片段被改变，例如被突变，以修饰本发明所述双特异性抗体分子的性质(例如改变下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、效应细胞功能或补体功能)。
例如，本发明提供的双特异性抗体包含具有改变的效应子功能(例如降低或消除)的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如ADCC、ADCP、CDC等。通过替换抗体的Fc区中的氨基酸残基，以改变抗体对效应子配体(如FcγR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能的方法是本领域已知的(参见，例如EP 388,151A1；US 564,8260；US 562,4821；Natsume A等,Cancer Res.,68:3863-3872,2008；Idusogie EE等,J.Immunol.,166:2571-2575,2001；Lazar GA等,PNAS,103:4005-4010,2006；Shields RL等,JBC,276:6591-6604,2001；Stavenhagen JB等,Cancer Res.,67:8882-8890,2007；Stavenhagen JB等,Advan.Enzyme.Regul.,48:152-164,2008；Alegre ML等,J.Immunol.,148:3461-3468,1992；和Kaneko E等,Biodrugs,25:1-11,2011)。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸L235(EU编号)进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如L235E或L235A。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸234和235同时进行修饰，例如L234A和L235A(L234A/L235A)(EU编号)。
例如，本发明提供的双特异性抗体可包含具有延长的循环半衰期的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。研究发现M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S或者T250Q/M428L都能够延长抗体在灵长类动物中的半衰期。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN 201280066663.2、US 2005/0014934A1、WO 97/43316、US 5,869,046、US 5,747,03、WO 96/32478。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸M428(EU编号)进行修饰以增强FcRn受体的结合亲和力，例如M428L。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸250和428(EU编号)同时进行修饰，例如T250Q和M428L(T250Q/M428L)。
例如，本发明提供的双特异性抗体也可包含具有可以降低或消除Fc糖基化的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。例如，Fc变体包含正常存在于氨基酸位点297(EU编号)处的N-连接聚糖降低的糖基化。N297位糖基化对IgG的活性有很大影响，如果该位点糖基化被移除，则会影响IgG分子CH2上半部分的构象，从而丧失对FcγRs的结合能力，影响抗体相关的生物活性。在本发明的一些优选实施例中，对人IgG恒定区上的氨基酸N297(EU编号)进行修饰以避免抗体的糖基化，例如N297A。
例如，本发明提供的双特异性抗体也可包含具有消除电荷异质性的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。在工程细胞表达过程中发生的多种翻译后修饰会都会引起单克隆抗体的电荷异质性，而IgG抗体C末端赖氨酸的不均一性是其中的一个主要原因，重链C端的赖氨酸K可能在抗体生产过程中出现一定比例的缺失，从而造成电荷异质性，从而影响抗体的稳定性、有效性、免疫原性或药代动力学。在本发明的一些优选实施例中，将IgG抗体C末端的K447(EU编号)去除或缺失，以消除抗体的电荷异质性，提高表达产物的均一性。
本发明表6-4中示例性的例举了一些优选的Fc片段的氨基酸序列。与包含野生型人IgG Fc区的双特异性抗体相比，本发明提供的双特异性抗体所包含的Fc片段对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。例如，在本发明的一优选实施例中，双特异性抗体包含的Fc片段来自人IgG1，且具有L234A和L235A取代(L234A/L235A)，显示出对FcγRI降低的结合能力；此外，本发明提供的双特异性抗体包含的所述Fc片段还可以包含具有使其它一种或几种特性(例如，与FcRn受体结合能力、抗体糖基化或抗体电荷异质性等)改变的氨基酸取代。例如，在本发明的一优选实施例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：263所示，它与其所源自的天然序列相比具有L234A/L235A/T250Q/N297A/P331S/M428L的氨基酸置换或取代，且K447被缺失或删除。
本发明所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链通过Fc片段铰链区的链间二硫键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链自N端至C端依次由抗-TAA scFv、连接肽、抗-CD3 scFv和Fc片段组成；例如，本发明表6-5中示例性的例举了一些优选的双特异性抗体的氨基酸序列。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CD19和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：264所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：264所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：264所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CD19和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：283所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：283所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：283所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CD20和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：266所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：266所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：266所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CD22和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：268所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：268所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：268所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CD30和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：270所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：270所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：270所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人EpCAM和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：272所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：272所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：272所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人CEA和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：274所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：274所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：274所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人Her2和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：8所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：8所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：8所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人EGFR和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：277所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：277所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：277所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人GPC-3和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：279所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：279所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：279所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人Mesothelin和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：281所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：281所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：281所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人Mucin1和CD3，其氨基酸序列如下：
(i)SEQ ID NO：285所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：285所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：285所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。
本发明的第二方面，提供了编码上述双特异性抗体的DNA分子。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：265所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：267所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：269所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：271所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：273所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：275所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：276所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：278所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：280所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：282所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：284所示的核苷酸序列。
本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：286所示的核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了包含上述DNA分子的载体。
本发明的第四方面，提供了包含上述载体的宿主细胞；所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，优选为CHO细胞；
本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含上述双特异性抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。
本发明的第六方面，还提供了制备本发明所述双特异性抗体的方法，其包括：(a)获得双特异性抗体的融合基因，构建双特异性抗体的表达载体；(b)通过基因工程方法将上述表达载体转染到宿主细胞中；(c)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养上述宿主细胞；(d)分离、纯化产生的所述抗体。
其中，步骤(a)中所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种，优选地，所述表达载体为PCDNA3.1；
其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。
其中，步骤(d)通过常规的免疫球蛋白纯化方法，包含蛋白质A亲和层析和离子交换、疏水层析或分子筛方法分离、纯化所述双特异性抗体。
本发明的第七方面，提供了所述双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的用途；所述癌症的实例包括但不限于间皮瘤、鳞状细胞瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性上皮肿瘤、腺癌、黑色素瘤、肉瘤、急性和慢性白血病、淋巴瘤和脑膜瘤、霍奇金病、塞扎莱综合征、多发性骨髓瘤，肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、喉癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、子宫癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、胃癌、肾细胞癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝胆癌、骨癌、皮肤癌和血液癌，以及鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉头癌、喉下部癌、唾液腺癌、纵隔膜癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠和肛门区域的癌症、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌症、中枢神经系统癌症和浆细胞癌。。
本发明的第八方面，提供了所述双特异性抗体用于增强或刺激免疫应答或功能的方法，其包含对患者/受试者个体施用治疗有效量的所述双特异性抗体。
本发明的第九方面，提供了所述双特异性抗体用于治疗肿瘤、延迟其进展、降低/抑制其复发的方法，其包括将有效量的所述双特异性抗体给予或施用至所述患有以上疾病或病症的个体；所述肿瘤的实例包括但不限于间皮瘤、鳞状细胞瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性上皮肿瘤、腺癌、黑色素瘤、肉瘤、急性和慢性白血病、淋巴瘤和脑膜瘤、霍奇金病、塞扎莱综合征、多发性骨髓瘤，肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、喉癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、子宫癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、胃癌、肾细胞癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝胆癌、骨癌、皮肤癌和血液癌，以及鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉头癌、喉下部癌、唾液腺癌、纵隔膜癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠和肛门区域的癌症、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌症、中枢神经系统癌症和浆细胞癌。
本发明公开的技术方案，取得了有益的技术效果，概况如下：
1、本发明提供的双特异性抗体包含的抗-TAA scFv位于双抗的N端，空间构像发生变化，与TAA的结合能力在某些条件下可能减弱，尤其不易结合弱表达或低表达TAA的正常细胞，减少了非特异性杀伤，但对过表达或高表达TAA的细胞的结合特异性没有显著下降，表现出良好的体内杀伤效果。由此亦知，当靶抗原仅表达于肿瘤细胞上或本发明所述双特异性抗体仅与过表达靶抗原的肿瘤细胞特异性结合时，使得免疫效应细胞限制性仅在靶细胞组织内被激活，这使得所述双特异性抗体对正常细胞的非特异性杀伤以及细胞因子的伴随释放能够被降至最低，减小其在临床治疗中的毒副作用。
2、本发明提供的双特异性抗体选择的抗-CD3 scFv以微弱的结合亲和力(EC50值大于约50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM)与效应细胞特异性结合，此外因被包埋在抗-TAA scFv和Fc之间，且位于其N端的连接肽L3包含的CTP刚性肽和位于其C端的Fc片段，都部分“遮盖”或“屏蔽”了抗-CD3 scFv的抗原结合域，这种位阻效应使其以更微弱的结合亲和力(例如以大于1μM)与CD3结合，这使其对T细胞的活化刺激能力减弱，因而限制了细胞因子的过度释放，因而具有更高的安全性；另外，本发明采用的抗-CD3 scFv可同时结合人和食蟹猴和/或恒河猴的CD3天然抗原，使其临床前毒理学评价不需要再构建替代分子，且获得的有效剂量、毒性剂量和毒副反应更客观、准确，可以直接进行临床剂量的转换，降低临床研究的风险。再者，本发明提供的双特异性抗体创造性地采用了二价抗-CD3 scFv，这使得所述双特异性抗体在构型设计上规避了现有技术普遍所采用的异源二聚体型(所包含的抗-CD3 scFv为单价)的非对称结构，因而也不存在重链间错配的问题，简化了下游纯化步骤；并且出人意料地，在体外细胞结合试验中未观察到抗-CD3 scFv与T细胞的非特异性结合，且细胞激活程度(IL-2等细胞因子的释放)控制在安全、有效的范围内，即本发明采用的二价抗-CD3 scFv结构并未引起非抗原依赖地诱导T细胞的过度活化，而对其他包含二价抗-CD3结构域的双特异性抗体而言，T细胞被不可控地过度激活是普遍存在的，因而抗-CD3双特异性抗体在设计时一般避免引入二价抗-CD3结构。
3、本发明提供的双特异性抗体所包含的经修饰的Fc片段不具有FcγR结合能力，避免了由FcγR所介导的T细胞全身性激活，因而允许免疫效应细胞限制性地仅在靶细胞组织内被激活。
4、本发明提供的双特异性抗体为同源二聚体型，不存在重链及轻链错配的问题，下游生产工艺稳定，纯化步骤简单高效，表达产物均一，且其理化和体内稳定性都显著提高。
5、本发明提供的双特异性抗体因包含Fc片段，而具有较长的体内循环半衰期，药代动力学试验表明其在小鼠和食蟹猴体内的循环半衰期分别约40h和8h，这将大大降低其临床给药频率。
发明详述
缩写和定义
Her2 人表皮生长因子受体2
BiAb 双特异性抗体(bispecific antibody)
CDR 用Kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
EC50 产生50％功效或结合的浓度
ELISA 酶联免疫吸附测定
FR 抗体构架区：将CDR区排除在外的免疫球蛋白可变区
HRP 辣根过氧化物酶
IL-2 白细胞介素2
IFN 干扰素
IC50 产生50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统
mAb 单克隆抗体
PCR 聚合酶链式反应
V区 在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸到轻链的109位Kabat残基和重链的第113位残基。
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
KD 平衡解离常数
ka 结合速率常数
kd 解离速率常数
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
“CD19”是分化簇19多肽，是单通道I型跨膜糖蛋白，其含有两个Ig样C2型(免疫球蛋白样)结构域和一个相对较大的胞质尾，在哺乳动物物种中高度保守。CD19在几乎所有的B谱系细胞中和滤泡细胞中表达，对于B淋巴细胞分化是必需的，并且作为B细胞关键共受体与CD21、CD81和CD225一起发挥作用。因此，CD19常被用作B淋巴细胞发育、B细胞淋巴瘤以及B淋巴细胞白血病的生物诊断标志。此外，CD19中的突变与严重的免疫缺陷综合症相关。针对CD19靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括CD19的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CD19基因或cDNA转染的细胞表达。
“CD20”是分化簇20多肽，属于4次跨膜的蛋白质，为B淋巴细胞表面特有分化抗原，表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达，与抗体结合后无显著内化和脱落，不发生抗原凋变，可作为治疗B细胞淋巴瘤的理想作用靶点。CD20主要经ADCC、CDC等作用发挥抗肿瘤作用。近年来，针对CD20靶点的适应症不断被拓展，包括例如自身免疫性疾病(包括多发性硬化症(MS)、克隆氏症(CD))、炎症性疾病(例如溃疡性结肠炎(UC))等。针对CD20靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括CD20的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CD20基因或cDNA转染的细胞表达。
“CD22”是分化簇22多肽，具有Ig结构域，是成熟B细胞表面的一种跨膜受体。在人类体内，CD22主要抑制B细胞表面受体的过度激活，降低罹患自身免疫性疾病的风险(例如，全身性红斑狼疮)。与CD22相关的适应症包括例如B细胞淋巴瘤、急性与慢性白血病和其他B细胞发育异常和B细胞依赖自身免疫性疾病相关的病症。针对CD22靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括CD22的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CD22基因或cDNA转染的细胞表达。
“CD30”是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，属于I型跨膜糖蛋白，在生理上表达为激活的B和T淋巴细胞。CD30主要表达于淋巴起源的肿瘤，如所有的霍奇金淋巴瘤(HL)、某些B细胞淋巴瘤、某些T细胞淋巴瘤及NK细胞淋巴瘤，低表达于非病理状态下活化的T细胞、B细胞表面，在正常细胞不表达，因此可作为相应的肿瘤标志物及疾病诊断的指标。针对CD30靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。CD30该术语还包括CD30的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CD30基因或cDNA转染的细胞表达。
“EpCAM(上皮细胞粘附分子)”是一种跨膜糖蛋白，是最早发现于结肠癌的一种TAA。EpCAM不同程度的过表达于大多数人类肿瘤，包括例如肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌，与肿瘤诊断和预后判断密切相关。此外，EpCAM的过表达已在EpCAM抗体及肿瘤相关疫苗临床实验中被开发和应用。针对EpCAM靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括EpCAM的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以EpCAM基因或cDNA转染的细胞表达。
“CEA(癌胚抗原)”是一种酸性糖蛋白，是存在于肿瘤细胞表面的一种抗原，具有人类胚胎抗原特性，广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌中，包括例如胃肠道肿瘤、肝癌、胰腺癌，也可存在于小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、类癌中。因此，其可作为广谱肿瘤标志物，用于多种肿瘤的诊断及治疗。针对CEA靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括CEA的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CEA基因或cDNA转染的细胞表达。
“Her2(人类表皮生长因子受体2)”是人类表皮生长因子受体家族成员，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。除了可发生基因突变或扩增，her2的上调还可激活下游两个信号转导通路，引发瀑布式连锁反应，促进细胞无限增殖，最终导致癌症。此外，her2可启动多种转移相关机制增加肿瘤细胞转移能力。Her2基因的扩增或过表达发生在例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺腺癌、前列腺癌、侵袭性子宫癌等多种肿瘤中。针对Her2靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括Her2的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以Her2基因或cDNA转染的细胞表达。物种同源物包括恒河猴Her2。
“EGFR(表皮生长因子受体)”是表皮生长因子受体家族成员，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR的突变或过表达一般会引发肿瘤，在许多实体肿瘤包括例如胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中均存在EGFR的高表达或异常表达。针对EGFR靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括EGFR的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以EGFR基因或cDNA转染的细胞表达。
“GPC-3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)”是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员，在大多数胚胎组织中高表达，是一种细胞增殖的抑制因子。GPC-3的缺失可导致SGBS(过度生长综合症)，并且其过表达于HCC的早期组织中，与肝细胞癌(HCC)、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症相关。此外，GPC-3在恶性间皮瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢细胞癌等恶性肿瘤中表达沉默，而在正常组织中不表达或低表达，因此可作为多种肿瘤治疗和诊断的生物标记物。针对GPC-3靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括GPC-3的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以GPC-3基因或cDNA转染的细胞表达。
“Mesothelin(间皮素)”属于间皮素家族，是前原核巨细胞增强因子，可通过弗林蛋白酶转化酶蛋白水解切割成两条链：巨核细胞增强因子(MPF)和间皮素。间皮素是一种肿瘤分化抗原，通常存在于胸膜，腹膜和心包内衬的间皮细胞上。间皮素在多种肿瘤例如间皮瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等肿瘤中过表达并具有免疫原性，因此可被用作肿瘤标志物或治疗性癌症疫苗的抗原靶标。针对Mesothelin靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括Mesothelin的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞包括肿瘤细胞天然地表达，或由以Mesothelin基因或cDNA转染的细胞表达。
“Mucin1(细胞表面相关粘蛋白1)”是粘蛋白家族成员，在包括肺、乳腺、胃和胰腺等组织器官的上皮细胞的顶端表面上表达。Mucin1的过度表达，异常的细胞内定位以及糖基化变化均与癌症有关，包括但不限于结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和胰腺癌。通过免疫组织化学技术，可以在广泛的分泌性上皮细胞，间充质肿瘤(例如滑膜肉瘤和卵巢颗粒细胞瘤)，以及其肿瘤等同物中鉴定Mucin1。并且，Mucin1可区分来源于腺癌并通过细胞质扩散引起的间皮瘤(限于细胞膜和相关的微绒毛)。因此，Mucin1可用于诊断和治疗以上相关疾病或病症和其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括Mucin1的任何变体、同工型、和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以Mucin1基因或cDNA转染的细胞表达。
“CA125(糖类抗原125)”是一种卵巢癌相关抗原，起源于胎儿体腔上皮组织，普遍分布于胸膜、心包、腹膜、子宫内膜、生殖道和羊膜等间皮组织细胞表面。当这些部位发生恶性病变或受到炎症刺激时，血清中CA125的水平将显著升高。作为研究最多的卵巢癌标记物，CA125在卵巢癌早期筛查、诊断、治疗及预后的应用研究中均有报道。在卵巢癌良性囊肿瘤和恶性囊性上皮瘤的穿刺液中，CA125水平可明显升高。在消化道恶性肿瘤(如胰腺癌、肝癌、胃癌、肠癌)以及慢性胰腺炎、慢性肝炎、肝硬化、肺腺癌、盆腔炎性病变、子宫内膜异位症时，血清CA125水平也有升高。鉴于CA125在多种癌症与炎症中的研究，其可广泛用于筛查、诊断、治疗以上相关疾病。针对CA125靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括CA125的任何变体、同工型、和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以CA125基因或cDNA转染的细胞表达。
“BCMA(B细胞成熟抗原)”属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，优先在成熟B淋巴细胞中表达，并且表达在浆母细胞(即，浆细胞前体)和浆细胞的表面。在脾脏、淋巴结、胸腺、肾上腺和肝脏中均能检测到BCMA的RNA，多个B细胞系成熟后其BCMA mRNA的水平也增加。BCMA与白血病、淋巴瘤(如霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)等多种疾病有关，因此可作为涉及相关B细胞疾病的潜在靶标。针对BCMA靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的以及未来发现的相关疾病或病症。该术语还包括BCMA的任何变体、同工型、和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以BCMA基因或cDNA转染的细胞表达。
CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志，由6条肽链组成，以非共价键与T细胞抗原受体(TCR)组成TCR-CD3复合体，不仅参与TCR-CD3复合体的胞浆内组装，而且通过各多肽链胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)传递抗原刺激信号。CD3分子的主要功能为：稳定TCR结构，传递T细胞活化信号，当TCR特异性识别并结合抗原后，CD3参与将信号转导到T细胞胞浆内，作为诱导T细胞活化的第一信号，在T细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。
“CD3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分，由三个不同的链CD3ε，CD3δ和CD3γ组成。CD3在T细胞上通过例如抗CD3抗体对其的固定作用而产生的集中(clustering)，导致T细胞的活化，与T细胞受体介导的活化类似，但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。本发明的特异性识别T细胞表面受体CD3的第二功能域不受具体的限制，只要其能够特异性地识别CD3，例如但不限于在下列专利中提到的CD3抗体：US7,994,289，US6,750,325；US6,706,265；US5,968,509；US8,076,459；US7,728,114；US20100183615。优选地，本发明中使用的抗人CD3抗体与食蟹猴和/或恒河猴具有交叉反应性，例如但不限于下列专利中提到的抗人CD3抗体：WO 2016130726，US 20050176028，WO2007042261或WO 2008119565。该术语还包括任何CD3变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞天然地表达，或在以编码前述的链的基因或cDNA转染的细胞上表达。
术语“超变区”或“CDR区”或“互补决定区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基，是非连续的氨基酸序列。CDR区序列可以由IMGT、Kabat、Chothia和AbM方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。例如，超变区包含以下氨基酸残基：来自序列比对所界定的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，例如，轻链可变结构域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，参见Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.；和/或来自根据结构来界定的“超变环”(HVL)的残基，例如，轻链可变结构域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基，参见Chothia和Leskl,J.Mol.Biol.,196:901-917,1987。“构架”残基或“FR”残基为除本文定义的超变区残基之外的可变结构域残基。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。本领域技术人员可以明确地将每种系统赋予任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身之外的任何实验数据。例如，给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与每种“标准”编号序列对比同源区来确定。基于本文提供的序列的编号，确定序列表中任何可变区序列的编号方案完全在本领域技术人员的常规技术范围内。
术语“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，是通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相交联以形成抗原结合位点，接头序列一般由柔性肽组成，例如但不限于G2(GGGGS)3。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。对于scFv综述，可参见Pluckthun(1994)The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),第113卷,Rosenburg和Moore主编,Springer-Verlag,New York,第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。
术语“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。
术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分。
术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
术语“Fc”区指抗体重链恒定区片段，其包含至少铰链区、CH2和CH3结构域。
术语“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区，是包含完整抗原识别和结合位点的最小片段。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是指保留与抗原(如，Her2)特异性结合能力的抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(Parental Antibody)的抗原结合区或可变区。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当用摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段包括但不限于：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、Fd片段、互补决定区(CDR)片段、二硫键稳定性蛋白(dsFv)等；线性抗体(Linear Antibody)、单链抗体(例如scFv单抗体)(技术来自Genmab)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、单域抗体(Single Domain Antibody)(例如VH结构域抗体)、结构域抗体(技术来自AbIynx)；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如三链抗体、四链抗体等)；和工程改造抗体如嵌合抗体(Chimeric Antibody)(例如人源化鼠抗体)、异缀合抗体(Heteroconjugate Antibody)等。这些抗体片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。
术语“连接肽”是指连接两个多肽的肽，其中所述连接肽可以是两个免疫球蛋白可变区或一个可变区。连接肽的长度可以是0-30个氨基酸或0-40个氨基酸。在一些实施方案中，连接肽可以是0-25、0-20或0-18个氨基酸长度。在一些实施方案中，连接肽可以是不多于14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸长的肽。在其它实施方案中，连接肽可以是0-25、5-15、10-20、15-20、20-30或30-40个氨基酸长。在其它实施方案中，连接肽可以是约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。连接肽是本领域技术人员已知的。连接肽的制备可以采用本领域任何方法。例如，连接肽可以是合成来源的。
术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合多肽可包含具有CH1结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施例中，本申请的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本申请中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。如上文所述，但本技术领域的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。
术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端)恒定区。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
“结合”定义抗原上的特定表位与其对应抗体之间的亲和性相互作用，一般也理解为“特异性识别”。“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。和特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
术语“体内半衰期”指目的多肽在给定动物的循环中的生物半衰期，并表示为在动物中从循环和/或其他组织清除存在于该动物循环中的量的一半所需的时间。
术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.,48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.MoI.Biol.,48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
术语“Fc区”或“Fc片段”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。
通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括哺乳动物(例如人)IgG1、IgG2(IgG2A，IgG2B)、IgG3和IgG4。在人IgG1Fc区中，至少两个等位基因类型是已知的。在某些实施方案中，相对于哺乳动物Fc多肽氨基酸序列的序列，两条Fc多肽链的氨基酸序列中每100个氨基酸中具有10个左右氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，上述不同可以是延长半衰期的Fc改变、增加FcRn结合的改变、抑制Fcγ受体(FcγR)结合的改变和/或降低或去除ADCC和CDC的改变。
术语“Fc受体”或“FcR”指结合免疫球蛋白Fc区的受体。FcR可以是天然序列人FcR，也可以是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，以及这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种活化受体(小鼠中的FcγRI，FcγRIII和FcγRIV；人类中的FcγRIA，FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIb或等同的FcγRIIB)组成。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列。FcγRIIA的胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。FcγRIIB的胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997))。大多数天然效应细胞类型共表达一种或多种活化FcγR和抑制性FcγRIIb，而NK细胞选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)，但小鼠和人中不表达抑制性FcγRIIb。人类IgG1与大多数人类Fc受体结合，在其结合的活化性Fc受体的类型方面被认为等同于鼠类IgG2a。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie V等,Immunol Today,18:592-8,1997)；Ghetie V等,Nature Biotechnology,15:637-40,1997))。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中。术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer RL等,J.Immunol.,117:587,1976)和(Kim YJ等,J.Immunol.,24:249,1994))。
术语“人源化抗体”是指经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。非人抗体的CDR域外的大部分或全部氨基酸，例如小鼠抗体被来自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换，而一个或多个CDR区内的大部分或全部氨基酸未改变。小分子氨基酸的添加，删除，插入，替换或修饰是允许的，只要它们不会消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保留与原始抗体类似的抗原特异性。CDR的来源没有特别限制，可来源于任何动物。例如，可以利用源于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。可用于本公开的人类框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可以用于重链，REI可以用于轻链和EU、LAY和POM可以用于重链和轻链二者。或者，可以使用人种系序列；这些可在以下网址获得：http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php。在本公开的人源化抗体分子中，受体重链和轻链不一定需要衍生自相同的抗体，并且如果需要，可以包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。
术语“细胞因子”一般指由一种细胞群体释放的，作为细胞间介质对另一细胞起作用或者对生成该蛋白质的细胞具有自分泌影响的蛋白质。此类细胞因子的例子包括淋巴因子，单核因子；白介素(“IL”)，例如IL-2，IL-6，IL-17A-F；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，例如白血病抑制因子(“LIF”)。
术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的)之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出。(参见Malmqvist M等,Nature,361:186-187,1993)。kd/ka的比率等于解离常数KD(通常参见Davies C等,Annual.Rev.Biochem.,59:439-473,1990)。可用任何有效的方法测量KD、ka和kd值。
术语“交叉反应”是指本文所述的抗体结合来自不同物种的肿瘤相关抗原的能力。例如，本文所述的结合人TAA的抗体还可结合来自其它物种的TAA(例如，食蟹猴TAA)。交叉反应性可通过检测在结合测定法(例如，SPR、ELISA)中与纯化抗原的特定反应性，或与生理表达TAA的细胞的结合或以其它方式与生理表达TAA的细胞功能相互作用来测量。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括表面等离子共振(例如，Biacore)或类似技术(例如，Kinexa或Octet)。
术语“EC50”是指在使用抗体或其抗原结合片段进行的体外或体内测定中，诱导50％应答的抗体或其抗原结合片段的浓度的最大响应，即在最大响应和基线之间的一半。
“效应细胞”是指免疫系统的一种细胞，其表达一种或多种FcR并介导一种或多种效应器功能。优选地，该细胞表达至少一种类型的激活性Fc受体，例如人FcγRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。效应细胞也包括例如T细胞。他们可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。
术语“效应子功能”是指，那些可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括但不限于：Fc受体结合亲和性、ADCC、ADCP、CDC、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调、B细胞活化、细胞因子分泌、抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率等。改变抗体的效应子功能的方法是本领域已知的，例如通过在Fc区引入突变来完成。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指一种细胞毒性形式，Ig通过与细胞毒性细胞(例如NK细胞、中性粒细胞或巨噬细胞)上存在的FcR结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合到抗原附着的靶细胞上，然后通过分泌细胞毒素杀死靶细胞。检测抗体的ADCC活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与FcR(例如CD16a)之间的结合活性来评价。
术语“抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)”指一种细胞介导的反应，在该反应中，表达FcγR的非特异性细胞毒活性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起该靶细胞的吞噬。
术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”是指通过使补体成分C1q与抗体Fc结合来激活补体级联的细胞毒性形式。检测抗体的CDC活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与Fc受体(例如C1q)之间的结合活性来评价。
术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂和/或稳定剂”，是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂/或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤或感染)有效量是指，当单独使用或与另一种或多种治疗剂组合使用时，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤或感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，当单独使用或与另一种或多种治疗剂组合使用时，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。术语关于治疗的“有效”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性二者。药理学有效性是指药物促进患者病症或症状消退的能力。生理学安全性是指由于药物施用导致的细胞、器官和/或生物体水平上的毒性或者其它不良生理效果(不良作用)的水平。
对受试者的“治疗”或“疗法”是指以逆转、减轻、改善、抑制、减缓或防止与疾病有关的症状、并发症、病症或生化指标的出现、进展、发展、严重程度或复发为目的对受试者进行任何类型的干预或处理，或者向其施用活性剂。
术语“T细胞受体(TCR)”是存在于T细胞即T淋巴细胞表面上的特殊受体。体内T细胞受体以几个蛋白质的复合物存在。T细胞受体通常具有两个单独的肽链，通常是T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)链，在一些T细胞上是T细胞受体γ和δ(TCRγ和TCRδ)。复合物中其他蛋白质是CD3蛋白质：CD3εγ和CD3εδ异源二聚体，最重要的是，有六个ITAM基序的CD3ζ同源二聚体。CD3ζ上的ITAM基序可以被Lck磷酸化，反过来募集ZAP-70。Lck和/或ZAP-70也可以在许多其他分子上磷酸化酪氨酸，尤其是CD28、LAT和SLP-76，这允许围绕这些蛋白质的信号传导复合物聚集。
术语“双特异性抗体”指本发明的双特异性抗体，例如抗Her2抗体或其抗原结合片段可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如TAA、细胞因子和细胞表面受体)以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。例如，“双特异性抗体”是指包含两个可变结构域或scFv单位使得所得抗体识别两种不同抗原。本领域已知双特异性抗体的许多不同的形式和用途(Chames P等,Curr.Opin.Drug Disc.Dev.,12:.276,2009；Spiess C等,Mol.Immunol.,67:95-106,2015)。
术语“hCG-β羧基末端肽(CTP)”是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)。CTP含有37个氨基酸残基，它具有4个O-糖基化位点，糖侧链终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期(Fares FA等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4304-4308,1992)。
术语“糖基化”意思是低聚糖(含有连接在一起的两个或更多个单糖、例如连接在一起的2个到约12个单糖的碳水化合物)附着形成糖蛋白。低聚糖侧链通常通过N-或O-连接连接到糖蛋白的骨架上。本文公开的抗体的低聚糖通常是连接到Fc区的CH2结构域，作为N-连接的低聚糖。“N-连接的糖基化”是指碳水化合物类部分连接到糖蛋白链的天冬酰胺残基上。例如，技术人员可以识别鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD的CH2结构域中的每一个在残基297处有用于N-连接的糖基化的单一位点。
同源抗体
在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明所述，例如Her2×CD3双特异性抗体的期望的功能特性。
具有保守修饰的抗体
术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。
与新生儿受体(FcRn)结合亲和力改变的Fc变体
这里使用的“FcRn”指结合IgG抗体Fc区的至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。功能性FcRn蛋白包含经常被称为重链和轻链的两条多肽，轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。
本发明涉及对FcRn的结合被调节的抗体(调节包括增加以及降低结合)。例如：在有些情况下，增加的结合会导致细胞再循环抗体，并由此延长，例如治疗抗体的半衰期。有时，降低FcRn结合是合乎需要的，例如用作包含放射标记的诊断抗体或治疗抗体。另外，对FcRn的结合显示出增加，同时对其他Fc受体，例如FcγRs的结合被改变的抗体可以用于本发明。
本申请涉及包含调节对FcRn的结合力的氨基酸修饰的抗体。具有特殊意义的是在较低的pH时，对FcRn的结合亲和力显示出增加，而在更高的pH时，结合基本上不显示出改变的最低限度地包含Fc区的抗体或其功能性变体。
与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体
IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH 6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434(EU编号)中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian DC等,Nat.Rev.Immunol.,7:715-725,2007)。韩国专利号KR10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Hinton PR等,J.Immunol.,176:346-356,2006)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加、清除率降低、皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等,MAbs.Taylor&Francis,4:267-273,2012)。
其他可引起本发明抗体与FcRn亲和力增强的突变点包括但不限于以下氨基酸修饰：226,227,230,233,239,241,243,246,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,298,299,301,302,303,305,307,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,433,438,439,440,443,444,445,446，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。
与FcRn结合亲和力增强的Fc变体还包括其他一切公知的氨基酸修饰位点以及尚未被发现的氨基酸修饰位点。
在可选择的实施方式中，可以优化IgG变体使其具有增加或降低的FcRn亲和力，以及增加或降低的人FcγR，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和包括他们的等位基因变异的FcγRIIIb亲和力。
优先地，IgG变体的Fc配体特异性将决定它的治疗应用。给定IgG变体用于治疗目的将取决于靶抗原的表位或形式，以及待治疗的疾病或适应症。对大多数靶和适应症来说，增强的FcRn结合可是更优选的，因为增强的FcRn结合可以导致血清半衰期延长。较长的血清半衰期允许治疗时以较低的频率和剂量给药。为了使需要重复给药的适应症作出反应而施用该治疗剂时，这种特性可是特别优选的。对一些靶和适应症来说，当需要变体Fc具有增加的清除或降低的血清半衰期时，例如当Fc多肽用作显象剂或放射治疗剂时，降低的FcRn亲和力可是特别优选的。
可以通过现有技术的公知方法来评价该多肽对FcRn的亲和力。例如，本领域技术人员可以进行适当的ELISA测定。如实施例5.6中所阐述，适当的ELISA测定使得能够比较变体和亲本与FcRn的结合强度。在PH为7.0时，比较针对变体和亲本多肽检测到的特异性信号，如果变体的特异性信号比亲本多肽的特异性信号弱至少1.9倍，则它是本发明的优选的变体，更适于临床应用。
FcRn可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。
抑制FcγR结合的改变
本文所述“抑制FcγR结合的改变”是指Fc多肽链中抑制FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合的一个或多个插入、缺失或置换，所述结合如通过例如基于的竞争结合实验(PerkinElmer,Waltham,MA)测定。这些改变可包含在作为双特异性抗体一部分的Fc多肽链中。更具体地，抑制Fcγ受体(FcγR)结合的改变包括L234A、L235A或抑制N297位糖基化的任意改变，包括在N297的任意置换。此外，连同抑制N297位糖基化的改变一起，通过建立另外的二硫桥来稳定二聚体Fc区的另外的改变也被预期。抑制FcγR结合的改变的进一步实例包括在一条Fc多肽链中的D265A改变和在另一条Fc多肽链中的A327Q改变。上述一些突变描述于，如Xu D等,Cellular Immunol.,200:16-26,2000中，其中描述上述突变及其活性评估的部分以引用的方式并入本文。以上是根据EU编号。
例如，本发明提供的双特异性抗体抑制FcγR结合的改变所包含的Fc片段对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。
其他抑制FcγR结合的改变包含公知技术及未来可能被发现的位点及其修饰。
FcγR可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。
延长半衰期的Fc改变
本文所述“延长半衰期的Fc改变”是指与包含相同Fc多肽、但其不包含改变的相似Fc蛋白质的半衰期相比，Fc多肽链中延长包含改变的Fc多肽链的蛋白质的体内半衰期的改变。所述改变可包含在作为双特异性抗体一部分的Fc多肽链中。改变T250Q、M252Y、S254T和T256E(第250位的苏氨酸变为谷氨酰胺；第252位的甲硫氨酸变为酪氨酸；第254位的丝氨酸变为苏氨酸；和第256位的苏氨酸变为谷氨酸；根据EU编号进行编号)为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利7,083,784中。美国专利7,083,784中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。
同样地，M428L和N434S为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中。美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。
此外，按照本文含义，在以下位点之一处的任何置换都可被认为是延长半衰期的Fc改变：250、251、252、259、307、308、332、378、380、428、430、434、436。这些改变中的每一个或者这些改变的组合可用于延长本文所述双特异性抗体的半衰期。其它可用于延长半衰期的改变详细描述于2012年12月17日提交的国际申请PCT/US2012/070146(公开号:WO 2013/096221)中。这一申请中描述上述改变的部分以引用的形式并入本文。
延长半衰期的Fc改变还包括包含公知技术及未来可能被发现的位点及其修饰。
Fc可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。
制备双特异性抗体的方法
可采用本领域任何已知的方法制备本发明双特异性抗体。早期构建双特异性抗体的方法有化学交联法或杂合杂交瘤或四价体瘤法(例如，Staerz UD等,Nature,314:628-31,1985；Milstein C等,Nature,305:537-540,1983；Karpovsky B等,J.Exp.Med.,160:1686-1701,1984)。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出双特异性单克隆抗体。例如两种不同单克隆抗体的化学结合，或例如两个抗体片段如两个Fab片段的化学结合。杂合—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的。虽然这些技术用于制造BiAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标BiAb、低产率、生产费用高等。
最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一BiAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNLTM的基元的异源二聚(Chames&Baty,Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.,12:276-83,2009；Chames&Baty,mAbs,1:539-47)。相关纯化技术是公知的。
肿瘤表面抗原
术语“肿瘤表面抗原”指这样的抗原，它在或可以呈现在肿瘤细胞上或内部的表面上。一些癌细胞抗原也在一些正常细胞表面表达，这可以被称为肿瘤-相关抗原。当与正常细胞相比时，这些肿瘤-相关抗原可以在肿瘤细胞上过表达，或者由于与正常组织相比，肿瘤组织的结构较不紧密，所述抗原在肿瘤细胞中易与抗体结合。这些抗原可以只由肿瘤细胞呈现，而不由正常细胞呈现。肿瘤抗原也可以仅仅在肿瘤细胞上表达或可代表与正常细胞相比的肿瘤特异性突变。相应的抗原可以被称为肿瘤-特异性抗原。
“肿瘤相关抗原”可以在宿主中触发免疫反应，用于鉴定肿瘤细胞，并在癌症治疗中用作可能的候选。此抗原可能包括很好地躲避免疫系统的正常蛋白，通常以极少量产生的蛋白质，通常仅在某些发育阶段中产生的蛋白，或其结构由于突变被修改的蛋白。
大量的肿瘤抗原在本领域中是已知的，并且可以容易地确定通过筛选鉴定新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括：α-胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、BCMA、CS1、DLL3、DLL4、EpCAM、FLT3、gpA33、GPC-3、Her2、MEGE-A3、NYESO1、CIX、GD2、GD3、GM2、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸盐结合蛋白、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、胰腺癌粘蛋白、PD-1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR2、VEGFR3、钙黏素(Cadherin)、整合素(Integrin)、间皮素(Mesothelin)、Claudin18、αVβ3、α5β1、ERBB3、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、粘蛋白家族、FAP、肌腱蛋白(Tenascin)、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、致癌基因标记物以及致癌基因产物(参见，例如Sensi M等,Clin.Cancer Res.,12:5023-32,2006；Parmiani J等,J.Immunol.,178:1975-79,2007；Novellino L等,Cancer Immunol.Immunother.,54:187-207,2005)。优选地，本发明所述TAA为CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、BCMA、CS1、EpCAM、CEA、Her2、EGFR、Mucin1、CA125、GPC-3和Mesothelin。
该术语还包括TAA的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以TAA基因或cDNA转染的细胞表达。
TAA可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物，优选来自人的TAA。
靶细胞和在靶细胞上表达的靶细胞蛋白
如上文所述，双特异性抗体可结合至效应细胞蛋白和靶细胞蛋白。例如，所述靶细胞蛋白可以在癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病(例如炎性、自身免疫性疾病)的细胞表面表达。在一些实施方案中，该靶细胞蛋白能在靶细胞表面高度表达，尽管高水平的表达不是必需的。在一些实施方案中，该靶细胞蛋白在靶细胞表面不表达或低表达。
当靶细胞为癌细胞时，如本文所述的同源二聚体的双特异性抗体可结合至如上文所述的癌细胞抗原。癌细胞抗原可以是人蛋白或源自其它物种的蛋白。
在一些实施例中，所述靶细胞蛋白可以是在肿瘤细胞表面选择性表达或过表达或不表达的蛋白。
在一些实施例中，所述靶细胞蛋白可以是介导淋巴系统相关疾病的细胞表面的蛋白。
在其他方面，靶细胞可以是介导自身免疫性疾病或炎性疾病的细胞。例如，哮喘中的人嗜酸性粒细胞可以是靶细胞，在这种情况下，如含EGF样模体粘液样激素受体(EMR1)可作为靶细胞蛋白。可选地，在全身性红斑狼疮患者中过量人B细胞可作为靶细胞，在这种情况下，如CD19或CD20可作为靶细胞蛋白。在其它自身免疫性疾病中，过量人Th2T细胞可作为靶细胞，在这种情况下，如CCR4可作为靶细胞蛋白。同样地，靶细胞可以是介导如动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝硬化、硬皮病、肾移植纤维化、肾同种异体移植肾病或肺纤维化(包括特发性肺纤维化和/或独特型肺动脉高压)的纤维化细胞。对于所述纤维化病症，如成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)可以是靶细胞蛋白。
在一些实施例中，靶细胞蛋白可以是在感染的细胞表面选择性地表达的蛋白。例如，在乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染的情况下，所述靶细胞蛋白可以是在感染的细胞表面表达的HBV或HCV的包膜蛋白。在其他实施方案中，所述靶细胞蛋白可以是由人免疫缺陷病毒(HIV)在HIV感染的细胞上编码的gp120。
在一些实施例中，靶细胞可以是介导感染及感染性相关疾病的细胞。
在一些实施例中，靶细胞可以是介导免疫缺陷相关疾病的细胞。
在一些实施例中，靶细胞可以是介导其他相关疾病的细胞，包括公知技术及未来可能发展的部分。
双特异性抗体可结合至来自小鼠、大鼠、兔、新世界猴和/或旧世界猴物种等的靶细胞蛋白。所述物种包括但不限于以下物种：小家鼠(Musmusculus)；黑家鼠(Rattusrattus)；褐家鼠(Rattusnorvegicus)；食蟹猕猴，食蟹猴(Macacafascicularis)；阿拉伯狒狒(hamadryasbaboon)，埃及狒狒(Papiohamadryas)；大狒狒(Guineababoon)，几内亚狒狒(Papiopapio)；橄榄狒狒(olivebaboon)，东非狒狒(Papioanubis)；黄狒狒(yellowbaboon)，草原狒狒(Papiocynocephalus)；南非大狒狒(Chacmababoon)，豚尾狒狒(Papioursinus)，普通狨(Callithrixjacchus)，绒顶柽柳猴(SaguinusOedipus)和松鼠猴(Saimirisciureus)。
癌症
术语“癌症”是指以体内异常细胞的不受控生长为特征的一大类疾病。“癌症”包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。癌症也包括血液学恶性肿瘤。“血液学恶性肿瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和淋巴结肿瘤。
在优选的实施方案中，本发明双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物或组合疗法对癌症的治疗、预防或缓解是有用的。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。此类癌症的更特定实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
癌症或恶性病的其他实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃部癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发灶隐匿性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、转移性原发灶隐匿性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行迁移细胞癌、移行迁移肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤和位于以上所列出的器官系统中的除赘瘤以外任何其他过度增生性疾病。
组合疗法
本发明涵盖双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可与一或多种活性治疗剂(例如化学治疗剂)或其他预防或治疗模式(例如，辐射)组合的用途。在此类组合疗法中，各种活性剂经常具有不同的互补作用机制，组合疗法可能导致协同效应。组合疗法包含影响免疫反应(例如增强或活化反应)之治疗剂及影响(例如抑制或杀死)肿瘤/癌细胞之治疗剂。组合疗法可降低抗药性癌细胞发生的可能性。组合疗法可允许试剂中的一或多种试剂剂量减少，以减少或消除与试剂中之一或多种相关的不良作用。此类组合疗法可对潜在疾病、病症或病状具有协同的治疗或预防作用。
“组合”包括可以分开施用的疗法，例如针对单独投药分开调配(例如，可以在套组中提供)，及可以按单一调配物(亦即，“共调配物”)一起投与的疗法。在某些实施例中，本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可依次序施用。在其他实施例中，双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可同时施用。本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或免疫缀合物或药物组合物可以与至少一种其他(活性)药剂以任何方式组合使用。
用本发明双特异性抗体治疗可以与可有效针对待治疗病症的其他治疗组合。本发明抗体组合治疗的非限制性实例包括手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、DNA疗法、RNA疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法。
组合疗法还包括其他一切公知技术中已有的以及未来可能发展的部分。
附图说明
图1-1.双特异性抗体AB7K、AB7K4、AB7K5、AB7K6、AB7K7和AB7K8的构型分别如a、b、c、d、e和f所示。
图1-2、显示了双特异性抗体AB7K7表达质粒图谱。该表达质粒全长9293bp，含有9个主要基因片断，包括1.hCMV启动子；2.目标基因；3.EMCV IRES；4.mDHFR筛选基因；5.Syn中止序列；6.SV40启动子；7.卡拉霉素抗性基因；8.SV40中止序列；9.PUC复制子。
图1-3、AB7K7纯化样品的SEC-HPLC检测结果。
图1-4、AB7K7纯化样品的SDS-PAGE电泳结果。
图1-5、AB7K7在25℃加速实验的SDS-PAGE结果。
图1-6、AB7K7在冻融实验的SDS-PAGE结果。
图2-1、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K4与肿瘤细胞BT474结合的能力。
图2-2、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K5与肿瘤细胞BT474结合的能力。
图2-3、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K6与肿瘤细胞BT474结合的能力。
图2-4、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K7与肿瘤细胞BT474结合的能力。
图2-5、FACS检测双特异性抗体AB7K8与肿瘤细胞BT474结合的能力。
图2-6、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K4与效应细胞CIK结合的能力。
图2-7、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K5与效应细胞CIK结合的能力。
图2-8、FACS检测双特异性抗体AB7K6与效应细胞CIK结合的能力。
图2-9、FACS检测双特异性抗体AB7K和AB7K7与效应细胞CIK结合的能力。
图2-10、FACS检测双特异性抗体AB7K8与效应细胞CIK结合的能力。
图2-11、FACS检测双特异性抗体AB7K与食蟹猴T细胞结合的能力。
图2-12、ELISA检测5种Anti-Her2×CD3双特异性抗体与CD3和Her2分子结合的能力。
图2-13、酶标仪检测5种Anti-Her2×CD3双特异性抗体活化报告基因细胞株Jurkat T细胞的能力。
图2-14、CTP连接肽与抗-CD3 scFv VH结构建模。
图2-15、GS连接肽与抗-CD3 scFv VH结构建模。
图2-16、抗-CD3 Fv与CD3 epsilon链的分子对接模型。
图3-1、双抗AB7K4和AB7K7在NCG小鼠皮下共接种人CIK细胞和HCC1954细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图3-2、双抗AB7K7在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人乳腺癌细胞HCC1954的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图3-3、在不同给药频次下双抗AB7K7和AB7K8在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人乳腺癌细胞HCC1954的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图3-4、双抗AB7K7在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和SK-OV-3细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。图3-5、双抗AB7K7在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和HT-29细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。图3-6、双抗AB7K7在CD34免疫重建的NPG小鼠皮下接种人乳腺癌HCC1954细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图3-7、双抗AB7K7在PBMC免疫重建的NPG小鼠接种人乳腺癌HCC1954细胞的小鼠移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图4-1、双抗AB7K4和AB7K7在NCG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞的移植瘤模型中的抑瘤效果。
图4-2、双抗AB7K7在NPG小鼠皮下单独接种人乳腺癌HCC1954细胞的移植瘤模型中的抑瘤效果。
图4-3、正常食蟹猴多次给予双抗AB7K7和AB7K8的体重变化曲线。
图5-1、双抗AB7K7在SD大鼠中用两种ELISA方法检测时的药时曲线。
图5-2、双抗AB7K8在SD大鼠中用两种ELISA方法检测时的药时曲线。
图5-3、双抗AB7K7和AB7K8在食蟹猴体内的药时曲线。
图5-4、pH 6.0时双抗AB7K、AB7K5和AB7K7与FcRn结合能力测定。
图5-5、pH 7.0时双抗AB7K、AB7K5和AB7K7与FcRn结合能力测定。
图6-1、双抗AB9K在NOD-SCID小鼠皮下共接种人PBMC细胞和Huh-7细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图6-2、双抗AB9K在CD34免疫重建的NPG小鼠皮下接种人肝癌Huh-7细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图6-3、双抗AB9K在CD34免疫重建的NPG小鼠皮下接种人肝癌Huh-7细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图7-1、流式细胞检测双特异性抗体AB2K与CD20阳性肿瘤细胞结合的能力。
图7-2、双特异性抗体AB2K和AB7K7介导效应细胞杀伤Raji-luc细胞的能力。
图7-3、报告基因法检测双特异性抗体AB2K和AB7K7活化Jurkat NFATRE Luc细胞的能力。
图7-4、双抗AB2K在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图7-5、双抗AB2K在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
图8、正常食蟹猴多次给予双抗AB2K后的白细胞和淋巴细胞变化曲线。
图9-1、FACS检测Anti-CD19×CD3双特异性抗体与肿瘤细胞Raji结合的能力。
图9-2、FACS检测Anti-CD19×CD3双特异性抗体与效应细胞CIK结合的能力。
图9-3、FACS检测双特异性抗体AB1K2和AB23P10与食蟹猴T细胞结合的能力。
图9-4、ELISA检测4种Anti-CD19×CD3双特异性抗体与CD3和CD19分子结合的能力。
图9-5、酶标仪检测AB1K2和AB23P8双特异性抗体活化报告基因细胞株Jurkat T细胞的能力。
图9-6、酶标仪检测4种Anti-CD19×CD3双特异性抗体活化报告基因细胞株JurkatT细胞的能力。
图10-1、AB11K与高表达Mucin1抗原的肿瘤细胞以及与人或食蟹猴原代T细胞的结合。
图10-2、AB11K介导扩增的T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
图10-3、AB11K介导PBMC杀伤肿瘤细胞的能力。
图10-4、AB11K特异性活化T细胞的能力。
图11、双抗AB8K在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人皮肤癌A431细胞移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
具体实施方式
通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。
实施例一、不同结构的Anti-Her2×CD3双特异性抗体的设计和制备
1.1、不同结构双特异性抗体的设计
为了筛选到适宜构型的双特异性抗体，我们针对Her2和CD3设计了六种不同构型的双特异性抗体，其中AB7K5、AB7K6和AB7K8为单链二价双特异性抗体，AB7K、AB7K4和AB7K7为双链四价双特异性抗体(参见图1-1)，其中仅AB7K8不含Fc片段。具体地，上述四种构型的双特异性抗体的构型及其从N端至C端方向的组成及其氨基酸序列编号如表1-1所示。六种双特异性抗体的具体结构组成特性描述如下：
其中，双特异性抗体AB7K是由抗Her2的全长抗体的两条重链的C端通过连接肽(L1)各自连接一个抗CD3的scFv结构域所组成。AB7K包含的针对Her2的完整抗体的氨基酸序列参照单克隆抗体
Figure BDA0003829528250000411
的序列(IMGT数据库INN 7637)，其所包含的Fc片段来自人IgG1，且具有D356E/L358M突变(EU编号)。其连接肽L1由柔性肽和刚性肽组成，且柔性肽组成为GS(GGGGS)3，刚性肽为SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；其中抗CD3 scFv的VH和VL之间的连接肽L2的组成为(GGGGS)3。
其中，双特异性抗体AB7K4是由抗Her2的全长抗体的两条轻链的C端通过连接肽(L1)各自连接一个抗CD3的scFv结构域所组成。AB7K4包含的针对Her2的完整抗体的重链可变区氨基酸序列参照单克隆抗体
Figure BDA0003829528250000421
的可变区序列，其轻链氨基酸序列参照单克隆抗体
Figure BDA0003829528250000422
的轻链氨基酸序列(IMGT数据库INN 7637)。AB7K4重链包含的Fc片段来自人IgG1，且具有多个氨基酸的替换/取代，分别为L234A、L235A、T250Q、N297A、P331S和M428L(EU编号)，同时还删除/缺失了Fc片段C末端的K447(EU编号)。其连接肽L1由柔性肽和刚性肽组成，且柔性肽组成为G2(GGGGS)3，刚性肽为SSSSKAPPPS；其中抗CD3 scFv的VH和VL之间的连接肽L2的组成为(GGGGS)3。
其中，双特异性抗体AB7K5是由抗-Her2 scFv、Fc片段、连接肽L2和抗-CD3 scFv依次串联组成，抗-Her2 scFv和抗-CD3 scFv内部VH和VL之间分别由连接肽L1和L3连接。AB7K5所包含的针对Her2的scFv的氨基酸序列参照单克隆抗体
Figure BDA0003829528250000423
的可变区序列。AB7K5所包含的Fc片段来自人IgG1，且具有多个氨基酸的替换/取代，分别为C226S、C229S、L234A、L235A、T250Q、N297A、P331S、T366R、L368H、K409T和M428L(EU编号)。其中，C226S、C229S、T366R、L368H和K409T这5个位点的突变，可以防止Fc片段间发生聚合，从而促使其形成单链二价双特异性抗体；携带L234A/L235A/P331S突变的Fc片段去除了ADCC和CDC活性；携带T250Q/M428L突变可以增强Fc片段与受体FcRn的结合亲和力，从而延长其半衰期；N297A突变避免了抗体糖基化，且丧失对FcγRs的结合能力。另外，还删除/缺失了Fc片段C末端的K447(EU编号)，消除了抗体的电荷异质性。其连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成，且柔性肽均为G2(GGGGS)3，刚性肽为SSSSKAPPPS。而每个scFv内部的连接肽L1和L3的组成均为(GGGGS)3。
其中，双特异性抗体AB7K6是由抗-Her2 scFv、连接肽L2、抗-CD3 scFv和Fc片段依次串联组成，抗-Her2 scFv和抗-CD3 scFv内部VH和VL之间分别由连接肽L1和L3连接。AB7K6所包含的Fc片段来自人IgG1，且具有多个氨基酸的替换/取代，分别为C226S、C229S、L234A、L235A、T250Q、N297A、P331S、T366R、L368H、K409T和M428L(EU编号)。其中，C226S、C229S、T366R、L368H和K409T这5个位点的突变，可以防止Fc片段间发生聚合，从而促使其形成单链二价双特异性抗体；携带L234A/L235A/P331S突变的Fc片段去除了ADCC和CDC活性；携带T250Q/M428L突变可以增强Fc片段与受体FcRn的结合亲和力，从而延长其半衰期；N297A突变避免了抗体糖基化，且丧失对FcγRs的结合能力。另外，还删除/缺失了Fc片段C末端的K447(EU编号)，消除了抗体的电荷异质性。其连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成，且柔性肽均为G2(GGGGS)3，刚性肽为SSSSKAPPPS。而每个scFv内部的连接肽L1和L3的组成均为(GGGGS)3。
其中，双特异性抗体AB7K7是由抗-Her2 scFv、连接肽L2、抗-CD3 scFv和Fc片段依次串联组成，抗-Her2 scFv和抗-CD3 scFv内部VH和VL之间分别由连接肽L1和L3连接。AB7K7包含的针对Her2的scFv的氨基酸序列参照单克隆抗体
Figure BDA0003829528250000424
的可变区序列。AB7K7所包含的Fc片段来自人IgG1，且具有多个氨基酸的替换/取代，分别为L234A、L235A、T250Q、N297A、P331S和M428L(EU编号)，同时还删除/缺失了Fc片段C末端的K447(EU编号)。其连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成，且柔性肽均为G2(GGGGS)3，刚性肽为SSSSKAPPPS。而每个scFv内部的连接肽L1和L3的组成均为(GGGGS)3。
其中，双特异性抗体AB7K8是由抗-Her2 scFv、连接肽L2、抗-CD3 scFv和His标签依次串联组成，抗-Her2 scFv和抗-CD3 scFv内部VH和VL之间分别由连接肽L1和L3连接。AB7K8包含的针对Her2的scFv的氨基酸序列参照单克隆抗体
Figure BDA0003829528250000432
的可变区序列。AB7K8在抗-CD3 scFv的C末端添加His标签，组成为HHHHHHHH，以便于抗体纯化。其连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成，且柔性肽均为G2(GGGGS)3，刚性肽为SSSSKAPPPS。而每个scFv内部的连接肽L1和L3的组成均为(GGGGS)3。
上述六种双特异性抗体包含的抗CD3-scFv的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ IDNO：247和SEQ ID NO：248所示，且VH和VL之间由(GGGGS)3连接，该单克隆抗体(命名为CD3-3)特异性结合人类和食蟹猴CD3抗原，且与CD3具有微弱的结合亲和力。
表1-1：四种不同结构的针对Her2和CD3的双特异性抗体
Figure BDA0003829528250000431
备注：表中Ln代表不同结构单元之间的连接肽，n是以从双特异性抗体从N端至C端不同结构单元间所包含的连接肽的排列顺序依次编号。
1.2、双特异性抗体分子表达载体的构建
按常规分子生物学方法合成上述五种双特异性抗体的编码基因，并将获得的融合基因的编码cDNA分别插入到经PCDNA3.1改造后的真核表达质粒pCMAB2M的相应酶切位点间，其中AB7K和AB7K4的重链和轻链可以构建到一个载体中，或者分别构建在两个不同的载体上。例如，AB7K7的表达质粒图谱见图1-2，该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。质粒pCMAB2M还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，pCMAB2M表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而在存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增目的基因和DHFR基因(参见美国专利US4,399,216)。
1.3、双特异性抗体分子的表达
将上述构建的表达质粒转染哺乳动物宿主细胞系，以表达双特异性抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)，本实施例中宿主细胞选取CHO衍生细胞株DXB11。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染。在电穿孔中，用设置为300V电场和1500μFd电容的Gene Pulser电穿孔仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的5×107个细胞中加入50μg表达载体质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含0.6mg/mL G418的生长培养基。用极限稀释亚克隆转染子，并用ELISA方法测定各细胞系的分泌率。筛选出高水平表达双特异性抗体的细胞株。
为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约5(较佳地约15)μg/106(即百万)个细胞/24h的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养。然后，收集细胞上清并分离纯化双特异性抗体。
下文分别对几种构型的双特异性抗体的纯化工艺、稳定性、体外和体内生物学功能、安全性及药代动力学等进行成药性评价，以筛选出适宜构型的双特异性抗体。
1.4、双特异性抗体的纯化工艺及稳定性试验
抗体纯化一般采用三步纯化策略：粗纯(样品捕获)、中间纯化和精细纯化。在粗纯阶段，通常利用亲和层析对目的抗体进行捕获，可有效去除样品中的大量杂质，如杂蛋白和核酸、内毒素和病毒。中间纯化步骤较多地采用疏水层析或CHT羟基磷灰石层析以去除大部分的残留的杂质蛋白以及聚合体。精细纯化多采用离子交换层析或凝胶过滤层析(分子筛)以去除与目的抗体性质相近的残留的少量或微量的杂质蛋白，并进一步去除HCP、DNA等污染物。
本发明可以利用金属鳌合亲和层析柱(例如GE公司的HisTrap FF等)对融合His-tag的双特异性抗体AB7K8的培养上清进行粗纯。可以利用Protein A/G亲和层析柱(例如GE公司的Mabselect SURE等)对包含Fc的双特异性抗体AB7K4、AB7K5、AB7K6、AB7K和AB7K7进行粗纯。上述粗纯产物再经过中间纯化及精细纯化步骤，最终获得高纯度、高质量的纯化目的抗体，然后利用脱盐柱(例如GE公司的HiTrap desaulting等)将上述双特异性抗体保存缓冲液置换为PBS或其它合适的缓冲液。
(a)双链四价双特异性抗体AB7K7的纯化
以AB7K7为例，阐明该类四价同源二聚体构型双特异性抗体的具体纯化步骤和方案。
我们采用三步层析法对双特异性抗体AB7K7进行纯化。分别为亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA pure 25M。本实施例中采用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析级)。
第一步，亲和层析：采用GE公司的MabSelect Sure亲和层析介质或其它市售的亲和介质(例如博格隆公司的Diamond protein A等)进行样品捕获、浓缩以及部分污染物的去除。首先使用平衡buffer(20mM PB，140mM NaCl，pH 7.4)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；将经过澄清后的发酵液以100-200cm/h的线性流速上样，载量不高于20mg/m；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM PB，140mM NaCl，pH 7.4)以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer 1(50mMNaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用去污buffer 2(50mM NaAc-HAc，pH 5.0)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用洗脱buffer(40mM NaAc-HAc，pH 3.5)，以不高于100cm/h的线性流速洗脱目标产物，收集目标峰。
第二步，疏水层析：使用博格隆公司的Butyl HP或其它市售的疏水层析介质(例如GE的Butyl HP等)进行中间纯化，用于降低聚合体含量。目标蛋白聚合以后，聚合体和单体之间存在性质上的差异，包括电荷特性以及疏水性，我们使用疏水性的差异对二者进行分离。首先，使用平衡buffer(20mM PB，0.3M(NH4)2SO4，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；第二步阴离子交换层析分离得到的目标蛋白用2M(NH4)2SO4溶液调电导40-50ms/cm，然后上样，载量控制在<20mg/ml；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM PB，0.3M(NH4)2SO4，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；最后进行目标蛋白洗脱，使用洗脱buffer(20mM PB，pH 7.0)，分别以40％、80％和100％洗脱buffer，以不高于100cm/h的线性流速洗脱3-5个柱体积(CV)，对洗脱组分进行分段收集，分别送检SEC-HPLC。将单体百分比大于90％的目标组分合并进行下一步层析。
第三步，阴离子交换层析：使用博格隆公司的Q-HP或其它市售的阴离子交换层析介质(例如GE的Q HP、TOSOH的Toyopearl GigaCap Q-650、天地人和的DEAE Beads 6FF，赛分科技的Generik MC-Q、Merck的Fractogel EMD TMAE、Pall的Q Ceramic HyperD F)进行精细纯化，分离结构变异体、进一步去除HCP、DNA等污染物。首先使用平衡buffer(20mM PB，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；经第二步疏水层析分离得到的目标蛋白上样，收集流穿，上样完毕，使用平衡buffer(20mM PB，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；对流穿组分进行分段收集，分别送样进行蛋白含量、SEC-HPLC和电泳检测。
样品的SEC-HPLC纯度结果及SDS-PAGE电泳结果分见图1-3和图1-4，其中SEC-HPLC结果显示，三步层析后双特异性抗体的主峰纯度达95％以上，SDS-PAGE电泳带型符合预期，非还原电泳(180KDa)，还原后可得清晰的(90KDa)单链条带。
(b)单链二价双特异性抗体AB7K5和AB7K6的纯化
AB7K5以Protein A亲和层析和羟基磷灰石(CHT)层析对AB7K5进行纯化，经SEC-HPLC检测发现其纯度较低，且收率不高，还存在表达产量极低的问题。
另一单链二价双特异性抗体AB7K6同样存在工艺开发难度大的问题，AB7K6以Protein A亲和层析和分子筛层析Superdex 200进行两步纯化后，经SEC-HPLC检测后发现其纯度较难定量，主峰中有明显的“肩膀峰”；此外，其表达产量极低、且非常不稳定，在4℃冰箱中放置24h后，发现其SEC-HPLC结果中峰形变化，由两个峰变成一个主峰，根据出峰时间推测可能是它由单链转换成双链结构所致。综上可知，AB7K6目前的工艺开发难度较大，难以实现工艺放大和产业化。
综上，AB7K7相对于AB7K5和AB7K6，在工艺开发方面具有显著优势，具有产量高、纯化方法简单高效、下游工艺稳定等优点。我们还进一步考察了AB7K7在不同缓冲液体系、和不同储存条件下的理化稳定性。
c)双特异性抗体AB7K7稳定性试验
分别对AB7K7蛋白在柠檬酸盐(20mM柠檬酸盐、pH5.5)和组氨酸盐缓冲体系(20mM组氨酸盐、pH5.5)中的稳定性进行考察。将AB7K7蛋白在25℃的加速条件下贮存4周，对蛋白的稳定性进行评估。
将AB7K7蛋白分别换液至上述柠檬酸盐(F2)和组氨酸盐(F3)缓冲液中，调节浓度至0.5mg/mL，上述两种缓冲体系中均加入了8％蔗糖(w/v)和0.02％PS80(w/v)作为辅料。以0.22μm PES膜针式滤器过滤，分别分装至2mL的西林瓶中，每瓶0.8mL，分装完成后立即压塞轧盖。根据表1-2方案将样品放入不同的稳定性箱中，每个取样点取出样品进行检测分析，检测项目包括样品外观、浓度、SEC-HPLC检测样品纯度、HMW％和LMW％以及浊度测定(A340)。
表1-2：稳定性测试方案
Figure BDA0003829528250000461
备注：X＝外观、浓度、SEC-HPLC、SDS-PAGE(还原&非还原)；Y＝浊度(A340)
2种制剂配方在25℃贮存0～4周后的外观、浓度、浊度及SEC-HPLC检测结果见表1-3和表1-4，SDS-PAGE(还原/非还原)结果见图1-5。2个处方的外观、浓度结果均无明显变化；在SEC-HPLC结果中，F2和F3两个配方的SEC结果未发生明显变化，4周后纯度分别为97.9％和98.2％。SDS-PAGE(还原/非还原)结果与LMW％结果趋势基本一致，F2和F3变化较轻微。
为了解AB7K7蛋白在2种缓冲体系中的解折叠温度，通过DSF的方式检测了2种处方中的Tm(解折叠温度)与Tmonset(蛋白开始解折叠的温度)，结果见表1-5。2个处方的Tmonset值均较低，F2和F3的Tmonset值均小于45℃。
表1-3：25℃加速实验外观、浓度、浊度结果
Figure BDA0003829528250000462
*T0浊度检测样品为经历1轮冻融后样品
表1-4：25℃加速实验SEC-HPLC结果
Figure BDA0003829528250000471
表1-5：DSF结果
Tmonset(℃) Tm1(℃) Tm2(℃)
F2 42.0 46.0 60.5
F3 41.0 45.0 58.0
同时还进行3轮冻融实验，考察冻融(-70℃/室温，反复冻融3次)过程中AB7K7蛋白在上述2种缓冲体系中的稳定性情况，样品准备及测试方案同上。
样品外观、浓度、浊度和SEC-HPLC检测结果见表1-6，SDS-PAGE(还原/非还原)结果见图1-6。在SDS-PAGE(非还原)结果中，F2和F3两个处方经历3轮冻融后，各检项结果无明显变化。
表1-6：冻融实验外观、浓度、浊度与SEC-HPLC结果
Figure BDA0003829528250000472
*T0浊度检测样品为经历1轮冻融后样品。
实施例二、Anti-Her2×CD3双特异性抗体的体外生物学功能评价
2.1、双特异性抗体与效应细胞和靶细胞结合活性的测定(FACS)
a)利用流式分析法检测双特异性抗体与Her2阳性肿瘤细胞BT-474的结合活性
培养Her2表达阳性的肿瘤细胞BT-474细胞(上海中国科学院细胞库)，用0.25％胰酶消化，离心收集细胞。将收集的细胞用1％PBSB重悬，调整细胞密度为2×106个/ml，置于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，4℃封闭0.5h。封闭后的细胞离心弃上清，加入稀释好的一系列浓度的双特异性抗体，4℃孵育1h；离心去上清，用1％BSA的PBS溶液(PBSB)洗3遍，加入稀释好的AF488标记的山羊抗人IgG抗体或鼠抗6×His IgG抗体，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％PBSB洗两遍，每孔再用100μl 1％多聚甲醛(PF)重悬，流式细胞仪检测信号强度。再以平均荧光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体与肿瘤细胞BT-474结合的EC50值。
结果显示，不同结构的双特异性抗体和Her2过表达肿瘤细胞均具有良好的结合活性。图2-1～图2-5展示了不同结构的双特异性抗体和肿瘤细胞BT-474的结合曲线。根据表2-1所示，AB7K和AB7K4与肿瘤细胞结合的EC50在5nM左右，AB7K7与肿瘤细胞结合的EC50接近50nM，AB7K5和AB7K8与肿瘤细胞结合的EC50为100nM，而AB7K6与肿瘤细胞结合的EC50高达200nM以上。
表2-1：Anti-Her2×CD3双特异性抗体与肿瘤细胞BT474结合能力的测定
AB7K AB7K4 AB7K5 AB7K6 AB7K7 AB7K8
EC<sub>50</sub>(nM) 5.009 4.388 125.0 239.9 51.98 125.3
b)利用FACS检测双特异性抗体与人T细胞的结合活性
采用密度梯度离心法从人新鲜血液制备PBMC，用含10％热灭活FBS的1640培养基重悬，加入2μg/ml OKT3活化24h后，加入250IU/ml IL-2扩增培养7天，制备得到CIK细胞(Cytokine-Induced Killer cells)，经流式细胞分析仪检测细胞表面CD3表达呈阳性。待测样品制备及测定方法同实施例2.1a)。将1％PF重悬的细胞上机检测，以平均荧光强度，通过软件OriginPro 8进行分析，计算各双特异性抗体与人CIK细胞结合的EC50值。
结果显示各双特异性抗体与CIK细胞的结合存在较大差异(图2-6～图2-10)。如表2-2所示，AB7K的EC50约20nM，AB7K4的结果与其相当，AB7K7与其相差6倍以上，AB7K5、AB7K6、AB7K8与其均相差10倍以上。
表2-2：Anti-Her2×CD3双特异性抗体与效应细胞CIK结合能力的测定
AB7K AB7K4 AB7K5 AB7K6 AB7K7 AB7K8
EC<sub>50</sub>(nM) 20.51 19.44 375.2 241.7 132.3 504.1
c)通过FACS检测双特异性抗体与食蟹猴CIK细胞膜表面CD3的交叉反应性
采用密度梯度离心法从食蟹猴新鲜血液制备PBMC，用含10％热灭活FBS的1640培养基重悬，加入2μg/ml OKT3活化24h后，加入250IU/ml IL-2扩增培养7天，得到食蟹猴CIK细胞备用。将人CIK细胞和食蟹猴CIK细胞离心收集，接下来的实验过程与上述实施例相同。将1％多聚甲醛溶液重悬的细胞上机检测，以平均荧光强度，通过软件OriginPro 8进行分析，计算双特异性抗体分别与人CIK细胞和食蟹猴CIK细胞结合的EC50值。
如图2-11所示，双特异性抗体AB7K与食蟹猴T细胞也能很好的结合，并且其与食蟹猴T细胞结合的能力和人T细胞结合的能力大致相当，流式细胞仪检测其结合的EC50大约在26nM。双特异性抗体AB7K4、AB7K5、AB7K6、AB7K7和AB7K8同AB7K一样可以与食蟹猴T细胞特异性结合。
2.2、双特异性抗体与抗原的结合能力测定
通过双抗原夹心ELISA法鉴定双特异性抗体与可溶CD3和Her2的结合。
将Her2蛋白(北京义翘神州，货号10004-H08H4)以PBS稀释成0.1μg/ml的浓度，加入96孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜。然后用1％脱脂奶粉室温封闭1h。同时稀释各双特异性抗体，4倍梯度稀释，共11个浓度梯度。然后用PBST清洗96孔板，加入稀释好的双特异性抗体，设不加抗体的对照孔，室温孵育1h。将未结合的双特异性抗体以PBST洗去，将生物素化的CD3E&CD3D(ACRO Biosystem，货号CDD-H82W1)以50ng/ml混合streptavdin HRP(BD，货号554066)加入96孔板中，100μl/孔，室温孵育1h。其后，将96孔板以PBST清洗，加入TMB，100μl/孔，室温显色15min，然后加入0.2M H2SO4终止显色反应。用酶标仪检测A450-620nm的吸光值。通过软件OriginPro 8进行分析，计算双特异性抗体与两个抗原结合的EC50值。
结果显示各个双特异性抗体都能同时特异性地结合CD3和Her2分子，并且随抗体浓度的变化呈现良好的剂量依赖性(图2-12)。几种双特异性抗体与可溶CD3和Her2的结合能力如表2-3所示，其EC50值从0.03nM至3.8nM，相差了两个数量级。其中，AB7K的结合活性最好，AB7K4和AB7K7与其相差一个数量级，AB7K5和AB7K8的结合活性最弱。
表2-3：Anti-Her2×CD3双特异性抗体与CD3和Her2分子结合能力的测定
AB7K AB7K4 AB7K5 AB7K7 AB7K8
EC<sub>50</sub>(nM) 0.03128 0.1518 1.004 0.1398 3.815
2.3、报告基因细胞株评价双特异性抗体活化T细胞的能力
含有NFAT RE报告基因的Jurkat T细胞(BPS Bioscience，货号60621)，在双特异性抗体和靶细胞同时存在的情况下可以过表达萤光素酶，通过检测萤光素酶的活性来定量Jurkat T细胞的活化程度。以双特异性抗体的浓度做X轴，荧光素信号作为Y轴，拟合四参数曲线。
根据图2-13的实验结果表明，靶向Her2的单抗Herceptin并不能被活化Jurkat T细胞。只有当两个抗体都存在的情况下，T细胞才会被活化。各抗体活化Jurkat T细胞的能力显示在表2-4中，其中AB7K4活化T细胞的能力最强，AB7K8活化T细胞的能力最弱，其EC50值相差一个数量级。
表2-4：Anti-Her2×CD3双特异性抗体活化报告基因细胞株Jurkat T细胞能力的测定
AB7K AB7K4 AB7K5 AB7K7 AB7K8 Herceptin
EC<sub>50</sub>(nM) 0.02263 0.01338 0.05357 0.08952 0.1575 0.009907
2.4、双特异性抗体介导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力
正常培养的肿瘤细胞系，包括SK-BR-3、MCF-7、HCC1937、NCI-N87、HCC1954细胞(均购自上海中科院细胞库)作为靶细胞，用0.25％的胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度2×105个/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，培养过夜。按实验设计稀释相应抗体，50μl/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。然后加入5倍于靶细胞数的效应细胞(人PBMC或者扩增培养的CIK细胞)，100μl/孔，设置对照孔，无需加入效应细胞的孔则用相同体积的培养基补入。培养48h后，96孔板弃上清，用PBS洗3遍，加入含10％CCK-8完全培养基，100μl/孔，37℃孵育4h，用酶标仪检测A450-620nm的吸光值。通过软件OriginPro 8进行分析，计算并比较各双特异性抗体和同靶点单抗Herceptin介导杀伤肿瘤细胞的能力。
各双特异性抗体介导效应细胞杀伤肿瘤细胞的EC50值归纳在表2-5中，结果显示各双特异性抗体对Her2高表达的肿瘤细胞(例如SK-BR-3、NCI-N87和HCC1954)均呈现非常显著的杀伤作用，并且呈剂量依赖性。各双特异性抗体(尤其是AB7K7)对于低表达Her2的乳腺癌细胞MCF-7也表现出较好的杀伤效果。对于Herceptin耐药的细胞株HCC1954，各双特异性抗体也具有很好的杀伤作用，而对于Her2表达阴性(极少量表达)的细胞株HCC1937，各双特异性抗体只有在最高的两个浓度下才表现出杀伤作用。
表2-5：双特异性抗体介导PBMC杀伤不同肿瘤细胞的EC50值
Figure BDA0003829528250000501
备注：～表示约等于；-表示未进行检测。
2.5、采用计算机技术评估GS-CTP连接肽对抗-CD3 scFv与CD3分子结合能力的影响
采用计算机软件对含GS-CTP连接肽的抗-CD3 scFv VH进行结构建模，并对抗-CD3scFv与其抗原CD3 epsilon链的分子对接进行空间构象进行模拟和预测。
位于双抗AB7K7中抗-Her2 scFv和抗-CD3 scFv之间的GS-CTP连接肽序列为(GGGGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS)，前半部分为GS柔性肽(GGGGGGSGGGGSGGGGS)，后半部分为CTP刚性肽(SSSSKAPPPS)。刚性CTP部分(SSSSKAPPPS)与抗-CD3 scFv VH的N端相连。通过phyre2软件三维结构建模，结构上CTP肽段覆盖在抗-CD3 scFv VH的CDR1区上(图2-14)，可能会阻碍或不利于CD3抗体与其抗原的结合。对与GS连接肽(去除了CTP，仅包含GS柔性肽)相连接的抗-CD3 scFv的VH用phyre2软件进行三维结构建模，发现GS连接肽远离CDR区(图2-15)，并不会对抗原抗体结合造成影响。即使GS连接肽靠近CDR区，由于其自身的灵活性，可以自由移离抗原抗体结合区，因而也不会对抗原抗体结合产生影响。
进一步地，用Discovery Studio软件模拟抗-CD3 scFv及其抗原CD3 epsilon链的分子对接情况。由于双链抗-CD3 FV与抗-CD3 scFv的结构高度相似，采用双链抗-CD3 FV代替抗-CD3 scFv进行结构模拟。模拟结果显示抗原CD3 epsilon链与抗-CD3 Fv VH的CDR2和CDR3有结合，与CDR1区不结合(图2-16)，似乎表明覆盖在其VH CDR1区的CTP不会干扰抗-CD3 scFv与抗原的结合。但考虑到CD3分子为一个复合物，包括一个CD3 gamma链、一个CD3delta链和2个CD3 epsilon链，该CD3分子与TCR及Zeta链一起构成了T细胞受体复合物。尽管覆盖在抗-CD3 scFv VH CDR1上的CTP肽段不会直接干扰抗-CD3 scFv与其抗原CD3epsilon链的结合，但CTP肽段可能通过与T细胞受体复合物的某个组成蛋白进行空间结构上的接触，从而间接地影响到抗-CD3 scFv与其抗原CD3 epsilon链的结合。
由于覆盖在抗-CD3 scFv VH的CDR1区上CTP的存在，抗-CD3 scFv与其抗原结合亲和力被大大削弱，从而不会导致因T细胞被过度激活所致的细胞因子大量释放，避免了一些不必要的由T细胞介导的非特异性杀伤。
实施例三、Anti-Her2×CD3双特异性抗体在小鼠移植瘤模型中的药效学研究
3.1、NCG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人乳腺癌HCC1954细胞移植瘤模型
选取Her2表达阳性的人乳腺癌HCC1954细胞，观察双抗在NCG小鼠皮下共接种人CIK细胞和HCC1954细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
取正常人外周血，用密度梯度离心法(LymphoprepTM，人淋巴细胞分离液，STEMCELL)分离人PBMC细胞，然后用RPMI-1640培养液加入10％已灭活的FBS重悬，并且加入终浓度为1μg/ml的OKT3和250IU/ml的人IL-2；培养第三天后，300g离心5min后换液，用RPMI-1640加入10％已灭活FBS培养细胞，同时加入250IU/ml人IL-2；之后每2天添加新鲜的培养液，培养到第10天，收集CIK细胞。选取七至八周龄的雌性NCG小鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)，收集处于对数生长期的HCC1954细胞(ATCC)，将5×106个HCC1954细胞和5×105个CIK细胞混合，接种于NCG小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为7组，每组5只，分别腹腔给予相应药物，阳性对照组和PBS对照组均为每周给药两次，共给药3次，阳性对照组分别给予剂量为1mg/kg和3mg/kg的Herceptin(赫赛汀，罗氏)，PBS对照组给予相同体积的PBS溶液。给药组每天给予双抗AB7K4和AB7K7，给药剂量分别为0.1mg/kg和1mg/kg，共给药10次。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)＝[D×d2]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。
如图3-1所示，在给药后第33天，PBS对照组平均肿瘤体积为1494.61±500.28mm3；1mg/kg Herceptin给药组的平均肿瘤体积为1327.29±376.65mm3；3mg/kg Herceptin给药组的平均肿瘤体积为510.49±106.07mm3，TGI为65.84％，相对于PBS对照组无显著性差异。0.1mg/kg和1mg/kg AB7K4给药组的平均肿瘤体积分别为304.10±108.50mm3和79.70±58.14mm3，TGI分别为79.65％和94.67％，相对于PBS对照组均有显著性差异(P<0.05)。0.1mg/kg和1mg/kg AB7K7给药组的平均肿瘤体积分别为385.82±95.41mm3和209.98±51.74mm3，TGI分别为74.19％和85.95％，相对于PBS对照组均有显著性差异(P<0.05)。综上结果表明，不同剂量的双抗AB7K4和AB7K7均能在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制肿瘤细胞的生长，显示出良好的抗肿瘤效果；在同样1mg/kg的剂量下，双抗的抑瘤效果要明显优于单抗Herceptin。
3.2、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人乳腺癌HCC1954细胞移植瘤模型
选取Her2表达阳性的人乳腺癌HCC1954细胞，观察双抗对NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人乳腺癌细胞HCC1954的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的HCC1954细胞(ATCC)，将5×106个HCC1954细胞和5×105个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。待肿瘤生长6天后，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为3组，每组6只，分别腹腔给予相应药物，具体的，AB7K7给药组的剂量分别为0.1mg/kg和1mg/kg，每周给药2次；对照组给予相同体积的PBS溶液。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图3-2所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为821.73±201.82mm3；0.1mg/kg的AB7K7给药组的平均肿瘤体积为435.60±51.04mm3，TGI为50.83％，相对于对照组无显著性差异；1mg/kg的AB7K7给药组的平均肿瘤体积分别为40.98±12.64mm3，TGI为95.37％，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)。上述结果表明，在肿瘤生长到一定大小后再给予双抗AB7K7仍有良好的治疗效果，0.1mg/kg低剂量下有50％的抑瘤效果，而1mg/kg给药组6只小鼠中有4只小鼠肿瘤完全消退，另外2只的肿瘤体积也小于100mm3，小于分组时的体积(分组时该组的平均肿瘤体积为161.37±18.98mm3)，双抗AB7K7具有良好的的治疗肿瘤的作用。
此外，还考察了双抗AB7K7和AB7K8在上述移植瘤模型中，于两种给药频次下对肿瘤生长的抑制作用。根据上文所述方法获得CIK细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，将5×106个HCC1954细胞和5×105个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为6组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。具体的，对照组和Herceptin给药组均为每周给药2次，Herceptin的给药剂量为3mg/kg，对照组给予相同体积的PBS溶液；双特异性抗体AB7K7给药剂量为1mg/kg，AB7K8的给药剂量为0.7mg/kg，各设置了两种给药频率，QD组每天给药1次，连续给药10天，BIW组每周给药2次。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据上述公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图3-3所示，在给药后第25天，PBS对照组平均肿瘤体积为1588.12±120.46mm3；3mg/kg的Herceptin给药组的平均肿瘤体积为361.72±134.70mm3；AB7K7的QD给药组和BIW给药组的平均肿瘤体积分别为260.18±45.96mm3和239.39±40.62mm3，TGI分别为83.62％和84.93％，相对于PBS对照组均有极显著性差异(P<0.01)；AB7K8的QD给药组和BIW给药组的平均肿瘤体积分别为284.98±26.62mm3和647.14±118.49mm3，TGI分别为82.06％和59.25％，相对于PBS对照组均有极显著性差异(P<0.01)。从上述结果中可以看出，双特异性抗体AB7K7无论是QD组还是BIW组，抗肿瘤效果均优于Herceptin；在等摩尔剂量下，QD组AB7K8与AB7K7的抑瘤效果相当，而BIW组AB7K7显示出显著优于AB7K8的抗肿瘤效果，推测是由于AB7K8为BiTE构型的双特异性抗体，无Fc结构域，AB7K7较AB7K8而言半衰期更长，可以预见临床给药频次降低，获得更好的治疗效果。
3.3、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人卵巢癌SK-OV-3细胞移植瘤模型
选取Her2表达阳性的人卵巢癌SK-OV-3细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和SK-OV-3细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，然后用McCoy’s 5A培养液加入10％已灭活的FBS重悬，并且加入终浓度为1μg/ml的OKT3，以及250IU/ml人IL-2；第三天后，300g离心5min，去上清，用RPMI-1640加入10％已灭活FBS重悬细胞，同时加入250IU/ml人IL-2进行培养；每2天添加新鲜的培养液，培养至第10天，收集CIK细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的SK-OV-3细胞(购自中科院上海细胞库)，将3×106个SK-OV-3细胞和3×105个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。接种1h后，小鼠按体重随机分为7组，每组6只，分别腹腔给予相应药物，Herceptin和AB7K7给药组都分别给药1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg，给药频次均为每周给药2次，对照组给予相同体积PBS。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图3-4所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为834.09±45.64mm3；Herceptin在1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg剂量下的平均肿瘤体积分别为644.84±58.22mm3、884.95±38.63mm3和815.79±78.39mm3；AB7K7所有给药组的肿瘤均完全消退。上述结果表明，在卵巢癌SK-OV-3模型中，AB7K7在极低剂量0.04mg/kg下仍然能使肿瘤完全消退，显示出了极好的抗肿瘤效果。
3.4、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人结肠癌细胞HT-29细胞移植瘤模型
选取Her2表达阳性的人结肠癌HT-29细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和HT-29细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的HT-29细胞(购自中科院上海细胞库)，将3×106个HT-29细胞和3×106个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。接种1h后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，分别腹腔给予相应药物，具体的，Herceptin的给药剂量为3mg/kg，AB7K7给药组的剂量分别为3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg，所有的给药组均为每周给药2次，对照组给予相同体积PBS。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图3-5所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为1880.52±338.26mm3；3mg/kg Herceptin的平均肿瘤体积为1461.36±177.94mm3；AB7K7在3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg剂量给药组的平均肿瘤体积分别为13.94±7.06mm3、26.31±10.75mm3和10.47±6.71mm3，其中0.3mg/kg给药组有4只小鼠肿瘤完全消退，1mg/kg给药组有3只小鼠肿瘤完全消退，3mg/kg给药组有4只小鼠肿瘤完全消退。上述结果显示，在结肠癌HT-29模型中，Herceptin对此肿瘤模型基本无药效，而AB7K7在三个剂量下均有小鼠的肿瘤完全消退，极低剂量也显示出了极好的抗肿瘤效的果。
3.5、CD34免疫重建的NPG小鼠接种人乳腺癌HCC1954移植瘤模型
选取Her2表达阳性的人乳腺癌HCC1954细胞，观察双抗在CD34免疫重建的NPG小鼠皮下接种人乳腺癌HCC1954细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
使用CD34阳性选择磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司)从新鲜的脐带血中富集CD34阳性的造血干细胞，选取三至四周龄的雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，尾静脉注射CD34阳性的造血干细胞，在小鼠体内重建人的免疫系统。16周后，小鼠眼眶后静脉丛采血进行流式检测，人CD45比例大于15％的小鼠视为免疫重建成功。收集处于对数生长期的HCC1954细胞，将5×106个HCC1954细胞接种于免疫重建的小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为3组，每组6只，分别腹腔给予剂量为1mg/kg的AB7K7和Herceptin，对照组给予相同体积的PBS，每周给药2次，共给药6次。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图3-6所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为475.23±58.82mm3；Herceptin给药组的平均肿瘤体积为293.27±66.35mm3，TGI为38.29％，相对于对照组无显著性差异；AB7K7给药组的平均肿瘤体积为0.67±0.67mm3，TGI为99.86％，所有肿瘤都已基本消退，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)。综上结果表明，双抗AB7K7在CD34免疫重建模型中具有极好的抗肿瘤效果。
3.6、PBMC免疫重建的NPG小鼠接种人乳腺癌HCC1954细胞移植瘤模型
选取Her2表达阳性的HCC1954细胞，观察双抗在PBMC免疫重建的NPG小鼠接种人乳腺癌HCC1954细胞的小鼠移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，选取五至六周龄的雌性NPG小鼠，腹腔注射人PBMC细胞，在小鼠体内重建人免疫系统。PBMC注射7天后，收集处于对数生长期的HCC1954细胞，将5×106个HCC1954细胞接种于小鼠右侧背部皮下。PBMC注射13天后，眼眶后静脉丛采血进行流式检测，human CD45比例大于15％的小鼠视为免疫重建成功。PBMC注射14天后，免疫成功的小鼠按肿瘤体积和体重随机分为2组，每组6只，腹腔给予剂量为1mg/kg的AB7K7，对照组给予PBS，每周给药三次。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图3-7所示，在给药后第23天，PBS对照组平均肿瘤体积为1224.05±224.39mm3；AB7K7给药组的平均肿瘤体积为32.00±0.00mm3，TGI为97.41％，所有肿瘤都已消退，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.001)。综上结果表明，双功能特异性抗体AB7K7在PBMC免疫重建模型中有极好的抗肿瘤效果。
实施例四、Anti-Her2×CD3双特异性抗体的安全性评价
4.1、双特异性抗体不能介导对Her2表达阴性肿瘤细胞的非特异性杀伤
选取Her2表达阴性的人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞，观察双抗在NCG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞的移植瘤模型中是否会抑制肿瘤生长。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞。选取七至八周龄的雌性NCG小鼠，收集处于对数生长期的Raji细胞(购自中科院上海细胞库)，将5×106个Raji细胞和2×106个CIK细胞混合，接种于NCG小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为3组，每组5只，给药组分别腹腔给予剂量为1mg/kg的AB7K4和AB7K7，对照组给予相同体积PBS溶液，每天给药1次，连续给药10天。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图4-1所示，在给药后第25天，PBS对照组平均肿瘤体积为2439.88±193.66mm3；AB7K4给药组的平均肿瘤体积为2408.81±212.44mm3，AB7K7给药组的平均肿瘤体积为2598.11±289.35mm3，两个给药组平均肿瘤体积相对于对照组均无差异。综上结果表明，双抗AB7K4和AB7K7在Her2表达阴性的细胞株上均未观察到非特性杀伤，说明AB7K4和AB7K7在体内不会介导T细胞对于非靶点组织的杀伤(即专一性地依赖双特异性抗体与相应靶抗原的结合)，没有脱靶毒性，安全性高。
4.2、双特异性抗体杀伤肿瘤细胞依赖于T细胞的激活
选取Her2表达阳性的人乳腺癌HCC1954细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下单独接种人乳腺癌HCC1954细胞的移植瘤模型中是否抑制肿瘤生长。
选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的HCC1954细胞，将5×106个HCC1954细胞和Matrigel基质胶(Corning，货号：354234)以体积比1：1混匀，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。待肿瘤生长6天后，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为3组，每组6只，给药组分别腹腔给予剂量为3mg/kg的Herceptin和1mg/kg的AB7K7，对照组给予相同体积的PBS，每周给药2次。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图4-2所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为1311.35±215.70mm3；Herceptin给药组的平均肿瘤体积为273.98±60.10mm3；AB7K7给药组的平均肿瘤体积为1243.20±340.31mm3，相对于对照组无差异。综上结果显示，AB7K7在没有人免疫细胞存在的情况下并未抑制HCC1954皮下瘤的生长，表明双抗AB7K7需要通过免疫效应细胞介导才能杀伤肿瘤细胞，而不像Herceptin主要是依赖于FcγR介导的ADCC或CDC效应来杀伤肿瘤细胞，证明AB7K7所包含的Fc变体不能结合FcγR，则可以避免介导因其受体FcγR广泛表达所致的T细胞全身性激活，因而药物安全性更高。
4.3、双特异性抗体对正常食蟹猴的毒性评价
选取3-4岁的雌性成年食蟹猴(购于广州相观生物科技有限公司)，体重3-4kg，分成三组，每组一只，分别为溶媒对照组、AB7K7给药组和AB7K8给药组。给药方式为蠕动泵静脉滴注1h，分别于第0天(D0)、第7天(D7)、第21天(D21)和第28天(D28)给药，共给药4次，药物剂量逐次递增。同时每周对动物体重进行称量。给药剂量和体积如下表4-1所示。
于D0给药后，AB7K8给药组食蟹猴出现嗜睡、瞳孔缩小现象，第二天恢复正常，其他组无异常；D7给药后，AB7K7给药组食蟹猴在给药后2-3h出现呕吐症状，给药第二天恢复正常，其他组无异常；D21给药后，AB7K7给药组食蟹猴在给药后3h出现呕吐食物症状，并排泄果冻样粪便，AB7K8给药组在给药后1h出现呕吐食物症状，两组食蟹猴在给药后第二天均恢复正常；于D28给药后40到50min，AB7K7和AB7K8给药组均出现呕吐症状，3h后动物均排出的粪便均有胶冻样粘液，6h后，AB7K7给药组动物排腥臭味水样粪；24h后，动物均恢复正常，采食正常。食蟹猴的体重变化如图4-3所示，箭头表示给药时间，可以看到各组体重均无太大变化，且在正常生理值范围内波动。
表4-1：食蟹猴急性毒性评价给药安排
Figure BDA0003829528250000561
本实验过程中观察到的不同程度的腹泻，可能和肠道中相关受体的表达有关，推测是双抗抑制Her1/Her2或Her2/Her3的异二聚体后导致肠道氯离子失衡后造成的，属于药理作用的延伸，给药24h后即可恢复正常。而AB7K7达到3mg/kg的高给药剂量时，食蟹猴仍有良好的耐受性，而通过小鼠的药效实验结果显示，低剂量的AB7K7表现出很好的抗肿瘤效果，表明AB7K7的治疗窗口较宽，安全性较高。
实施例五、Anti-Her2×CD3抗体的药代动力学研究
5.1、双抗AB7K7在SD大鼠体内的药代动力学实验
AB7K7以1mg/kg的剂量，通过尾静脉给药方式注射入4只健康SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)。取血时间点分别为：1h、3h、6h、24h、72h、96h、120h、168h、216h和264h。每个时间点取一定量的全血，分离血清，然后采用两种ELISA方法测定血清中的药品浓度。
方法一、用抗AB7K7抗体A(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为0.5μg/mL。将AB7K7按照100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL和1.56ng/mL配置并建立标准曲线。用HRP标记抗AB7K7抗体B(安源医药科技(上海)有限公司，anti-herceptin-HRP)，使用浓度为1：5000，最后用TMB显色。利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表5-1。
方法二、检测SD大鼠血清中的药品浓度。用抗AB7K7抗体A(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为0.5μg/mL。将AB7K7按照5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL和0.078ng/mL配置并建立标准曲线。将鼠抗人IgG Fc-HRP(安源医药科技(上海)有限公司)按照1：5000加入，最后用TMB显色。利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表5-2。
图5-1显示了用两种不同检测方法检测AB7K7在大鼠体内的血药浓度，用两种不同的检测方法检测血药中的AB7K7浓度，得到的血药浓度基本一致，计算的药代参数大致相同，说明AB7K7在体内能够以完整分子形式进行代谢，从而保证其生物学功能。
表5-1：双抗AB7K7在SD大鼠中的药代动力学参数(方法一)
AB7K7 t<sub>1/2</sub>(h) AUC 0-inf_ob(ng/mL*h) Vz_obs(μg)/(ng/mL)) Cl_obs(μg)/(ng/mL)/h
药代参数 42.10 550236.77 0.02351 3.811E-4
表5-2：双抗AB7K7在SD大鼠中的药代动力学参数(方法二)
AB7K7 t<sub>1/2</sub>(h) AUC 0-inf_ob(ng/mL*h) Vz_obs(μg)/(ng/mL)) Cl_obs(μg)/(ng/mL)/h
药代参数 41.02 706126.89 0.01720 2.899E-4
5.2、双抗AB7K7在NPG模型鼠体内的药代动力学实验
NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)给药前一周接种HCC1954细胞(购自中科院细胞所)，接种密度为3.5×106/只。给药前两天复苏CIK细胞，培养24h后收集细胞静脉注射入小鼠体内。小鼠随机分为3组，每组四只。三个给药组给药剂量分别是：0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg。采血时间点分别为1h、3h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、216h和264h。每个时间点采一定量的全血，分离血清，然后采用ELISA方法测定血清中的药品浓度。
用抗AB7K7抗体A(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为0.5μg/mL。将AB7K7按照100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL和1.56ng/mL配置并建立标准曲线。用HRP标记抗AB7K7抗体B(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)，使用浓度为1：5000，最后用TMB显色。利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表5-3。从表5-3中可以看出，AB7K7在NPG模型鼠体内的药代参数与在SD大鼠体内的在数值上没有大的差异。
表5-3：双抗AB7K7在NPG模型鼠中的药代动力学参数
Figure BDA0003829528250000571
5.3、双抗AB7K8在SD大鼠体内的药代动力学实验
AB7K8分别以1mg/kg和3mg/kg的剂量，通过尾静脉给药方式注射入3只健康SD大鼠。取血时间点分别为：0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h和7h。每个时间点取一定量的全血，分离血清，然后采用ELISA方法检测血清中的药品浓度。
用抗AB7K8抗体C(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为2.5μg/mL。将AB7K8按照25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL和0.78ng/mL配置并建立标准曲线。用HRP标记抗-his的抗体(安源医药科技(上海)有限公司)，使用浓度为1：5000，最后用TMB显色。利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表5-4。
AB7K8在两种剂量下，得到药代参数T1/2基本一致，说明其在SD大鼠体内呈现线性代谢动力学。由于AB7K8不含Fc，所以其T1/2非常短，与AB7K7相比短了约20倍。
表5-4：双抗AB7K8在SD大鼠中的药代动力学参数
AB7K8 t<sub>1/2</sub>(h) AUC 0-inf_ob(ng/mL*h) Vz_obs(μg)/(ng/mL)) Cl_obs(μg)/(ng/mL)/h
1mg/kg IV 2.27 4623.14 0.17082 0.05191
3mg/kg IV 1.98 20608.77 0.10220 0.03579
5.4、双抗AB7K在SD大鼠体内的药代动力学实验
AB7K以0.8mg/kg的剂量，通过尾静脉给药方式注射入4只健康SD大鼠。取血时间点分别为：2h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、216h和264h。每个时间点取一定量的全血，分离血清，然后采用两种ELISA方法测定血清中的药品浓度。
方法一、用抗AB7K抗体A(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为1μg/mL。将AB7K按照20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL和0.3125ng/mL配置并建立标准曲线。加入25ng/mL的生物素标记的人CD3E&CD3D(Acro，货号CDD-H82W0)，孵育1h后加入1：500稀释的HRP标记的链霉亲和素(BDPharmingen，货号554066)，最后用TMB显色。利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表5-5。
表5-5：双抗AB7K的药代动力学参数
AB7K t<sub>1/2</sub>(h) AUC 0-inf_ob(ng/mL*h) Vz_obs(μg)/(ng/mL)) Cl_obs(μg)/(ng/mL)/h
药代参数 60.47 1022788.69 0.01726 1.985E-4
方法二、用抗AB7K的抗体A(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为1μg/mL。将AB7K按照20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL和0.3125ng/mL配置并建立标准曲线。加入鼠抗人IgG Fc-HRP(1：10000稀释)(安源医药科技(上海)有限公司)，孵箱1h，最后用TMB显色。
图5-2显示了用两种不同检测方法检测AB7K在大鼠体内的血药浓度，结果表明两种检测方法测得结果差异比较大。曲线的前两个点(2h，1D)的浓度还是很接近的，但是第二天之后，两种方法测得浓度差异很大，推测有可能抗-CD3 scFv与抗-Her2抗体重链之间的连接肽断裂了。AB7K在体内结构不稳定，从而无法发挥其生物学功能，而改进的AB7K7能够在体内以完整形式代谢，从而能正常发挥其生物学功能。
5.5、双抗AB7K7和AB7K8在食蟹猴体内的药代动力学实验
食蟹猴(购自广州相观生物科技有限公司)分成三个组，每组一只，性别雌性，体重在3-4kg。第一组(G1-1)为空白对照组；第二组(G2-1)AB7K7为给药组，给药剂量为0.3mg/kg；第三组(G3-1)为AB7K8给药组，给药剂量为0.2mg/kg。采血时间点分别为15min、1h、3h、6h、24h、48h、72h、96h、144h、192h、240h和288h，共13个时间点。取血收集血清，-80℃冻存，然后采用ELISA方法测定血清中的药品浓度。
用抗AB7K7抗体A(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)包板，包板浓度为0.5μg/mL。将AB7K7按照100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL配置并建立标准曲线。用HRP标记抗AB7K7抗体B(安源医药科技(上海)有限公司，mouse-anti-herceptin)，使用浓度为1：5000，最后用TMB显色。利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表5-6。
图5-3显示了AB7K7在大鼠体内的血药浓度，AB7K7在正常食蟹猴体内的T1/2仅为8个小时左右。AB7K8由于药时曲线上的点过少，无法计算药代参数。但是从药时曲线上可以看出，在正常食蟹猴体内AB7K7要比AB7K8半衰期长很多。
表5-6：双抗AB7K7在食蟹猴体内的药代动力学参数
AB7K7 t<sub>1/2</sub>(h) AUC 0-inf_obs ng/mL*h) Vz_obs(μg)/(ng/mL)) Cl_obs(μg)/(ng/mL)/h
药代参数 7.95 87995.48 0.1563 0.01364
5.6、通过ELISA技术评价双特异性抗体和FcRn的结合能力
将各个抗体用PBS溶液稀释成10μg/ml的浓度，加入96孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜。然后用1％脱脂奶粉室温封闭1h。同时分别用pH 6.0和7.0的稀释液稀释生物素biotin标记的FcRn蛋白(ACRO Biosystem，货号FCM-H8286)，4倍梯度稀释，共11个浓度梯度。分别用同pH的PBST清洗96孔板，加入使用相同pH稀释液稀释好的双特异性抗体，设不加抗体的对照孔，室温孵育1h。使用同pH的PBST溶液洗板，将链霉亲和素-HRP(BD，货号554066)加入96孔板中，100μl/孔，室温孵育0.5h。其后，将96孔板以PBST清洗，加入TMB，100μl/孔，室温显色15min，然后加入0.2M H2SO4终止显色反应。用酶标仪检测A450nm-620nm的吸光值。通过软件OriginPro 8进行分析，计算双特异性抗体与FcRn结合的EC50值。
结果显示了不同的pH条件下每个抗体和FcRn的结合能力不同，结合体内PK的数据，可以分析出双特异性抗体AB7K7的半衰期长于AB7K，但短于Herceptin，这可能更有利于临床应用(图5-4和图5-5)。
表5-7和表5-8分别显示了pH 6.0和7.0时各抗体与FcRn结合能力的测定结果。
表5-7：pH 6.0时双抗AB7K、AB7K5和AB7K7与FcRn结合能力的测定
Herceptin AB7K AB7K5 AB7K7
EC<sub>50</sub>(μg/ml) 2.591 0.8027 1.706 0.4630
表5-8：pH 7.0时双抗AB7K、AB7K5和AB7K7与FcRn结合能力的测定
Herceptin AB7K AB7K5 AB7K7
EC<sub>50</sub>(μg/ml) ～287.1 1.651 13.43 4.838
实施例六、scFv1-scFv2--Fc构型双特异性抗体的制备
根据上述对六种抗-Her2×CD3双特异性抗体的多方面研究结果，可以确定AB7K7这类scFv1-scFv2-Fc构型的双特异性抗体具有易于制备、纯化方法简单高效、且其在制备及存储过程中稳定性较好。更有利的是，它对正常细胞的非特异性杀伤作用微弱，且具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用等显著优势，成药性良好。
参照实施例一中双特异性抗体AB7K7的构型设计及制备方法，我们构建了一系列靶向免疫效应细胞抗原CD3分子和肿瘤相关抗原的双特异性抗体分子，这类双特异性抗体分子由两条相同的多肽链通过Fc片段铰链区的链间二硫键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链自N端至C端依次由抗-TAA scFv、连接肽、抗-CD3 scFv和Fc片段组成，以下具体描述了各双特异性抗体的每个结构单元的分子组成。
其中，所述肿瘤相关抗原包含但不限于：CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD47、CD52、CD73、CD74、CD123、CD133、CD138、BCMA、CA125、CEA、CS1、DLL3、DLL4、EGFR、EpCAM、FLT3、gpA33、GPC-3、Her2、MEGE-A3、NYESO1、PSMA、TAG-72、CIX、叶酸盐结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR2、VEGFR3、钙黏素(Cadherin)、整合素(Integrin)、间皮素(Mesothelin)、Claudin18、αVβ3、α5β1、ERBB3、c-MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、B7蛋白家族、粘蛋白家族(Mucin)、FAP和肌腱蛋白(Tenascin)；优选地，所述肿瘤相关抗原为CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、BCMA、CS1、EpCAM、CEA、Her2、EGFR、CA125、Mucin1、GPC-3和Mesothelin。
表6-1例举了一些优选的针对肿瘤相关抗原的第一单链Fv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列，其CDR区所含氨基酸残基根据Kabat规则定义。其中，抗-TAA scFv的VH和VL之间的连接肽氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3，4或5。
表6-1：双特异性抗体包含的抗-TAA scFv的氨基酸序列及其CDR区氨基酸序列
Figure BDA0003829528250000601
Figure BDA0003829528250000611
Figure BDA0003829528250000621
Figure BDA0003829528250000631
Figure BDA0003829528250000641
Figure BDA0003829528250000651
Figure BDA0003829528250000661
Figure BDA0003829528250000671
Figure BDA0003829528250000681
Figure BDA0003829528250000691
其中，抗-CD3 scFv在体外FACS结合分析测定中以大于约50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM的EC50值结合于效应细胞；更优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv不仅能与人CD3结合，还可与食蟹猴或恒河猴的CD3特异性结合。
表6-2中例举了一些优选的抗-CD3 scFv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列，其CDR区所含氨基酸残基根据Kabat规则定义。其中，抗-CD3 scFv的VH和VL之间的连接肽氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3，4或5。
表6-2：双特异性抗体包含的抗-CD3 scFv的氨基酸序列及其CDR区氨基酸序列
Figure BDA0003829528250000701
其中，连接抗-TAA scFv和抗-CD3 scFv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成；优选地，柔性肽的氨基酸组成结构通式为GxSy(GGGGS)z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1。而刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列(如SEQ ID NO：257所示)或其截短的片段；优选地，所述CTP刚性肽组成为SSSSKAPPPS(CTP1)。表6-3中例举了一些优选的连接抗-TAA scFv和抗-CD3 scFv的连接肽的氨基酸序列。
表6-3：连接抗-TAA scFv和抗-CD3 scFv的连接肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：258 G<sub>2</sub>(GGGGS)<sub>3</sub>CTP<sup>1</sup> GGGGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS
SEQ ID NO：259 (GGGGS)<sub>3</sub>CTP<sup>1</sup> GGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS
SEQ ID NO：260 GS(GGGGS)<sub>2</sub>CTP<sup>1</sup> GSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPS
SEQ ID NO：261 (GGGGS)<sub>1</sub>CTP<sup>4</sup> GGGGSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
其中，Fc片段直接或通过连接肽与抗-CD3 scFv相连，连接肽包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)，更优地自Gly(G)和Ser(S)，最优选地，所述连接肽组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。
Fc片段优选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且Fc是突变的，以修饰双特异性抗体分子的性质，例如，对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。此外，Fc片段还可以包含具有使其它一种或几种特性(例如，与FcRn受体结合能力、抗体糖基化或抗体电荷异质性等)改变的氨基酸取代。
表6-4中例举了一些具有一个或多个氨基酸突变的Fc片段的氨基酸序列。
表6-4：人IgG Fc氨基酸序列
Figure BDA0003829528250000711
表6-5中示例性的例举了一些优选的双特异性抗体的氨基酸及对应的核苷酸序列。
表6-5：几种scFv-scFv-Fc构型的双特异性抗体
抗体代码 靶点 氨基酸序列号 核苷酸序列号
AB1K1 Anti-CD19×CD3 SEQ ID NO：264 SEQ ID NO：265
AB1K2 Anti-CD19×CD3 SEQ ID NO：283 SEQ ID NO：284
AB2K Anti-CD20×CD3 SEQ ID NO：266 SEQ ID NO：267
AB3K Anti-CD22×CD3 SEQ ID NO：268 SEQ ID NO：269
AB4K Anti-CD30×CD3 SEQ ID NO：270 SEQ ID NO：271
AB5K Anti-EpCAM×CD3 SEQ ID NO：272 SEQ ID NO：273
AB6K Anti-CEA×CD3 SEQ ID NO：274 SEQ ID NO：275
AB7K7 Anti-Her2×CD3 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：276
AB8K Anti-EGFR×CD3 SEQ ID NO：277 SEQ ID NO：278
AB9K Anti-GPC-3×CD3 SEQ ID NO：279 SEQ ID NO：280
AB10K Anti-Mesothelin×CD3 SEQ ID NO：281 SEQ ID NO：282
AB11k Anti-Mucin1×CD3 SEQ ID NO：285 SEQ ID NO：286
实施例七、Anti-GPC-3×CD3双特异性抗体在小鼠移植瘤模型中的药效学研究
7.1、NOD-SCID小鼠皮下共接种人PBMC细胞和人肝癌Huh-7细胞移植瘤模型
选取GPC-3表达阳性的人肝癌Huh-7细胞，观察双抗在NOD-SCID小鼠皮下共接种人PBMC细胞和Huh-7细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，选取七至八周龄雌性NOD-SCID小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)，收集处于对数生长期的Huh-7细胞。将3×106个Huh-7细胞和3×106个PBMC细胞混合，接种于NOD-SCID小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为2组，每组6只，给药组腹腔给予1mg/kg AB9K，对照组给予相同体积PBS溶液，每天给药1次，连续给药6天。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图6-1所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为1311.03±144.89mm3；AB9K给药组的平均肿瘤体积为60.83±12.63mm3，TGI为95.36％，有1只小鼠的肿瘤完全消退，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)。以上结果表明，PBMC中大部分为未活化的原始T细胞，双抗AB9K能在动物体内激活原始T细胞，并且拉近T细胞与靶细胞Huh-7的距离，使得T细胞可以直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长，AB9K在1mg/kg的剂量下有非常好的抗肿瘤效果。
7.2、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞移植瘤模型
选取GPC-3表达阴性的人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞的移植瘤模型中的体内性抑瘤效果。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的Raji细胞，将5×106个Raji细胞和2×106个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为3组，每组5只，给药组腹腔给予剂量为1mg/kg的AB9K，对照组给予相同体积的PBS溶液，每天给药1次，连续给药10天。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
结果如图6-2所示，在给药后第26天，PBS对照组平均肿瘤体积为2636.66±196.62mm3；AB9K给药组的平均肿瘤体积为2739.57±220.13mm3，相对于对照组无显著性差异。综上结果表明，双抗AB9K在GPC-3表达阴性的细胞株上未观察到非特异性杀伤，说明双抗在体内不会介导T细胞对于非靶点组织的杀伤，没有药物毒性，安全性高。
7.3、CD34免疫重建的NPG小鼠接种人肝癌Huh-7细胞移植瘤模型
选取GPC-3表达阳性的人肝癌Huh-7细胞，观察双抗在CD34免疫重建的NPG小鼠皮下接种人肝癌Huh-7细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
根据实施例3.5中的方法制备CD34免疫重建的NPG小鼠。收集处于对数期的Huh-7细胞，将2.5×106个Huh-7细胞接种于免疫重建的小鼠右侧背部皮下。接种4天后，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为2组，每组7只，给药组腹腔给予1mg/kg AB9K，PBS对照组给予相同体积PBS溶液，每天给药1次直至实验结束。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图6-3所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为2102.84±275.71mm3；1mg/kg的AB9K给药组的平均肿瘤体积为325.01±282.21mm3，TGI为86.53％，有4只小鼠肿瘤完全消退，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)。以上结果表明，双抗AB9K在CD34免疫重建模型中有极好的抗肿瘤效果。
实施例八、Anti-CD20×CD3双特异性抗体的体外生物学功能评价和小鼠移植瘤模型中的药效学研究
8.1、利用流式分析法检测AB2K与CD20阳性肿瘤细胞的结合活性
培养Raji细胞(购自中科院细胞库)，离心收集细胞用1％PBSB重悬，调整细胞密度为2×106个/ml，置于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)。然后加入稀释好的一系列浓度的双特异性抗体，4℃孵育1h；离心去上清，用1％BSA的PBS溶液(PBSB)洗3遍，加入稀释好的AF488标记的山羊抗人IgG抗体(Jackson Immuno Research Inc.，货号109-545-088)或鼠抗6×his IgG抗体(R&D Systems，货号IC050P)，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％PBSB洗两遍，每孔再用100μl 1％多聚甲醛重悬，流式细胞仪检测信号强度。再以平均荧光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算AB2K与Raji细胞结合的EC50值。
如图7-1所示，AB2K可以很好的与CD20阳性细胞结合，其信号强度与抗体浓度成正比，计算得出AB2K与Raji细胞结合的EC50值约为69.97nM。
8.2、AB2K介导效应细胞靶向杀伤CD20阳性肿瘤细胞
正常培养的Raji-luc细胞(购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)，调整细胞密度1×105个/ml，加入96孔白色板中，40μl/孔。同时稀释一系列梯度的AB2K抗体，加入到上述96孔白板中，调整CIK细胞密度为5×105/ml，加入96孔白色板中，40μl/孔，使效靶比E：T＝5：1，37℃培养24h。24h后，取出白色板，每孔加入100μl One-Glo(Promega，货号E6120)溶液，室温放置至少3min。酶标仪检测冷发光值。以萤光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算AB2K杀伤Raji-luc细胞的EC50值。
如图7-2显示，AB2K介导效应细胞杀伤Raji-luc细胞的EC50只有42.8ng/ml，而且具有靶点特异性，作为阴性对照的AB7K7的EC50为229.5ng/ml，对Raji-luc细胞几乎没有杀伤作用。
8.3、报告基因细胞株评价双特异性抗体活化T细胞的能力
含有NFAT RE报告基因的Jurkat T细胞(BPS Bioscience，货号60621)，在双特异性抗体和CD20阳性Raji细胞同时存在的情况下可以过表达萤光素酶，通过检测萤光素酶的活性来定量Jurkat T细胞的活化程度。以双特异性抗体的浓度做X轴，荧光素信号作为Y轴，拟合四参数曲线。
如图7-3所示，AB2K可以特异性的活化Jurkat NFATRE Luc细胞，EC50值为0.2006μg/ml，且其浓度和信号强度成正比，而作为阴性对照的AB7K7几乎没有活化T细胞的能力。
8.4、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞移植瘤模型
选取CD20表达阳性的人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Raji细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的Raji细胞，将4×106个Raji细胞和8×105个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1h后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，分别腹腔给予相应药物，具体的，所有给药组均为每周给药2次，Rituxan(美罗华，罗氏制药)和双功能抗体AB2K分别都给予1mg/kg和0.1mg/kg。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图7-4所示，在给药后第24天，PBS对照组平均肿瘤体积为1766.84±155.62mm3；1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为647.92±277.11mm3，TGI为63.33％，相对于对照组有极显著性差异(P<0.01)；0.1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为1893.81±186.99mm3，无药效；AB2K的1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为116.18±39.50mm3，TGI为93.42％，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)；AB2K的0.1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为1226.03±340.05mm3，TGI为30.61％，相对于对照组无显著性差异。上述结果表明，双功能特异性抗体AB2K在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制肿瘤细胞的生长，在相同的剂量下，双抗的药效优于单抗Rituxan，显示出良好的抗肿瘤效果。
8.5、NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞移植瘤模型
选取CD20表达阳性的人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞，观察双抗在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和人Burkkit’s淋巴瘤Daudi细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的Daudi细胞(购自中科院细胞库)，将4×106个Daudi细胞和8×105个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1小时后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，分别腹腔给予相应药物，所有给药组均为每周给药两次。Rituxan和双功能抗体AB2K分别都给予1mg/kg和0.1mg/kg。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图7-5所示，在给药后第30天，PBS对照组平均肿瘤体积为889.68±192.13mm3；1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为241.51±44.91mm3，TGI为72.85％，相对于对照组有极显著性差异(P<0.01)；0.1mg/kg的Rituxan给药组的平均肿瘤体积为746.11±299.71mm3，相对于对照组无显著性差异；AB2K的1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为72.05±11.89mm3，TGI为91.9％，相对于对照组均有极显著性差异(P<0.01)；AB2K的0.1mg/kg给药组的平均肿瘤体积为75.36±11.81mm3，TGI为91.53％，相对于对照组有极显著性差异(P<0.01)。上述结果表明，双功能特异性抗体AB2K在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制肿瘤细胞的生长，在相同的剂量下，双抗的药效优于单抗Rituxan，低剂量的AB2K也显示出良好的抗肿瘤效果。
实施例九、Anti-CD20×CD3双特异性抗体的安全性评价
评价AB2K的毒性反应情况，为后续的毒性试验确定合适的剂量范围及观察指标。选取3-4岁的雌性成年食蟹猴(购自广州相观生物科技有限公司)，体重3-4kg，分为2组，每组1只，分为溶媒对照组和AB2K给药组。给药方式为蠕动泵静脉滴注1h，给药剂量和体积如下表7所示。分别于分别于第0天(D0)、第7天(D7)、第21天(D21)和第28天(D28)给药，共给药4次，药物剂量逐次递增。同时每周对动物体重进行称量。
表7、食蟹猴急性毒性评价给药安排
Figure BDA0003829528250000751
试验期间，周期性的监测动物的临床症状、体重、食量、体温、心电图、血压、临床病理指标(血细胞计数、凝血功能指标和血液生化)、淋巴细胞亚群、细胞因子、药物血浆浓度测定和毒代分析。给予AB2K后，食蟹猴的体征无异常反应，体重较为稳定，体温变化波动幅度与溶媒对照组相似，给药期间各动物未见死亡或濒死。如图8所示，AB2K组给药后食蟹猴的白细胞变化与对照组变化趋势相似；而首次给予0.06mg/kg的AB2K对淋巴细胞的影响不大；二次给药后1h至6h，给药组动物的淋巴细胞细胞数量急剧下降，24小时后恢复正常；随着给药次数的增加，尽管剂量不断增加，但AB2K对淋巴细胞的细胞数量减少的影响越来越弱。此外，首次给予AB2K后，促进了IL-2、IL-6、TNF-ɑ因子的释放，微弱刺激IL-5的释放，但未刺激IFN-γ的释放；随着给药次数的增加，AB2K对细胞因子的促释放作用越来越不明显，说明机体适应了双特异性抗体的刺激。
实施例十、Anti-CD20×CD3双特异性抗体的药代动力学评价
雌性食蟹猴分成2组，每组1只，体重在3-4kg。第一组为空白对照组，第二组为AB2K给药组，给药剂量为0.3mg/kg。采血时间点分别为15min、1h、3h、6h、10h、24h、30h、48h、54h、72h、96h和144h，共13个时间点。取血收集血清，-80℃冻存。
采用ELISA方法测定血清中的AB2K药物浓度，利用PKSolver软件计算药代动力学参数，具体参数见表8。结果表明，AB2K在正常食蟹猴体内的T1/2为8.5小时左右。
表8、双抗AB2K在食蟹猴体内的药代动力学参数
Figure BDA0003829528250000761
实施例十一、Anti-CD19×CD3双特异性抗体的体外生物学功能评价
11.1、双特异性抗体与效应细胞和靶细胞结合活性的测定(FACS)
a)利用流式分析法检测双特异性抗体与CD19阳性肿瘤细胞Raji的结合活性
培养CD19表达阳性的肿瘤细胞Raji细胞，离心收集细胞。将收集的细胞用1％PBSB重悬，调整细胞密度为2×106个/ml，置于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，4℃封闭0.5h。封闭后的细胞离心弃上清，加入稀释好的一系列浓度的双特异性抗体AB1K2及同型CD19双特异性抗体AB23P8、AB23P9和AB23P10，4℃孵育1h；离心去上清，用1％BSA的PBSB洗3遍，加入稀释好的AF647标记的山羊抗人IgG抗体，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％PBSB洗两遍，每孔再用100μl 1％PF重悬，流式细胞仪检测信号强度。再以平均荧光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体与肿瘤细胞Raji结合的EC50值。
结果显示，不同结构的双特异性抗体和CD19过表达肿瘤细胞均具有良好的结合活性。图9-1展示了不同结构的双特异性抗体和肿瘤细胞Raji的结合曲线。如表9-1所示，四个双特异性分子与Raji细胞结合的EC50均在nM级水平。
表9-1：Anti-CD19×CD3双特异性抗体与肿瘤细胞Raji结合能力的测定
AB1K2 AB23P8 AB23P9 AB23P10
EC<sub>50</sub>(nM) 1.393 1.924 2.600 2.678
b)利用FACS检测双特异性抗体与人T细胞的结合活性
采用密度梯度离心法从人新鲜血液制备PBMC，用含10％热灭活FBS的1640培养基重悬，加入2μg/ml CD3抗体活化24h后，加入250IU/ml IL-2扩增培养7天，制备得到扩增的T细胞，经流式细胞分析仪检测细胞表面CD3表达呈阳性。待测样品制备及测定方法同实施例11.1a)。将1％PF重悬的细胞上机检测，以平均荧光强度，通过软件GraphPad进行分析，计算各双特异性抗体与人T细胞结合的EC50值。
图9-2结果显示各双特异性抗体和CIK均具有良好的结合活性。如表9-2所示，AB1K2的EC50约为16nM，AB23P8的结果与其相当，AB23P9、AB23P10的EC50约为50nM和30nM。
表9-2：Anti-CD19×CD3双特异性抗体与效应细胞CIK结合能力的测定
AB1K2 AB23P8 AB23P9 AB23P10
EC<sub>50</sub>(nM) 15.69 16.69 49.52 32.41
c)通过FACS检测双特异性抗体与食蟹猴CIK细胞膜表面CD3的交叉反应性
采用密度梯度离心法从食蟹猴新鲜血液制备PBMC，用含10％热灭活FBS的1640培养基重悬，加入2μg/ml OKT3活化24h后，加入250IU/ml IL-2扩增培养7天，得到食蟹猴CIK细胞备用。将人CIK细胞和食蟹猴CIK细胞离心收集。待测样品制备及测定方法同实施例11.1a)。将1％多聚甲醛溶液重悬的细胞上机检测，以平均荧光强度，通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体分别与人CIK细胞和食蟹猴CIK细胞结合的EC50值。
如图9-3所示，双特异性抗体AB1K2和AB23P10与食蟹猴T细胞的结合能力几乎没有差别，流式细胞仪检测其结合的EC50大约在5.5nM，且两个双特异性抗体与食蟹猴T细胞的结合能力强于与人T细胞的结合能力。
11.2、双特异性抗体与抗原的结合能力测定
通过双抗原夹心ELISA法鉴定双特异性抗体与可溶CD3和CD19的结合。
将CD19蛋白(ACRO Biosystems，货号CD9-H5251)以PBS稀释成1μg/ml的浓度，加入96孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜。然后用1％脱脂奶粉室温封闭1h。同时稀释各双特异性抗体，用5倍梯度稀释，共10个浓度梯度。然后用PBST清洗96孔板，加入稀释好的双特异性抗体，设不加抗体的对照孔，室温孵育2h。将未结合的双特异性抗体以PBST洗去，将生物素化的CD3E&CD3D(ACRO Biosystem，货号CDD-H82W1)以50ng/ml混合Streptavdin HRP(BD，货号554066)加入96孔板中，100μl/孔，室温孵育1h。其后，将96孔板以PBST清洗，加入TMB，100μl/孔，室温显色15min，然后加入0.2M H2SO4终止显色反应。用酶标仪检测A450-620nm的吸光值。通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体与两个抗原结合的EC50值。
结果显示各个双特异性抗体都能同时特异性地结合CD3和CD19分子，并且随抗体浓度的变化呈现良好的剂量依赖性(图9-4)。几种双特异性抗体与可溶CD3和CD19的结合能力如表9-3所示，其EC50值从0.19nM至0.47nM，两端结合能力几乎相差无几。
表9-3：Anti-CD19×CD3双特异性抗体与CD3和CD19分子结合能力的测定
AB1K2 AB23P8 AB23P9 AB23P10
EC<sub>50</sub>(nM) 0.2185 0.1925 0.2211 0.4704
11.3、报告基因细胞株评价双特异性抗体活化T细胞的能力
含有NFAT RE报告基因的Jurkat T细胞，在双特异性抗体和靶细胞Raji细胞同时存在的情况下可以过表达萤光素酶，通过检测萤光素酶的活性来定量Jurkat T细胞的活化程度。以双特异性抗体的浓度做X轴，荧光素信号作为Y轴，拟合四参数曲线。
根据图9-5～图9-6的实验结果显示，在没有CD19过表达靶细胞的存在下，JurkatT细胞几乎不能被活化，只有当双抗及两端靶细胞都存在的情况下，T细胞才会被活化。各抗体活化Jurkat T细胞的能力显示在表9-4中，各双特异性抗体活化Jurkat T细胞的能力几乎相当。
表9-4：Anti-CD19×CD3双特异性抗体活化报告基因细胞株Jurkat T细胞能力的测定
AB1K2 AB23P8 AB23P9 AB23P10 Blincyto
EC<sub>50</sub>(nM) 1.080 1.123 0.8527 0.7093 2.714
11.4、双特异性抗体介导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力
正常培养的肿瘤细胞系，包括Raji-Luc、NALM6、Reh细胞(均购自上海中科院细胞库)作为靶细胞，收集细胞悬液，离心，调整细胞密度2×105个/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，培养过夜。按实验设计稀释相应抗体，50μl/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。然后加入5倍于靶细胞数的效应细胞(人PBMC或者扩增培养的CIK细胞)，100μl/孔，设置对照孔，无需加入效应细胞的孔则用相同体积的培养基补入。培养48h后，Raji-Luc细胞用Steady-Glo Luciferase Assay System(Promega)检测，其它细胞使用CytoTox96Non-Radio Cytotoxicity Assay(Promega)检测。以检测结果作为Y轴，双特异性抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算并比较各双特异性抗体介导杀伤肿瘤细胞的能力。
各双特异性抗体介导效应细胞杀伤肿瘤细胞的EC50值归纳在表9-5～表9-7中，结果显示各双特异性抗体对CD19高表达的肿瘤细胞均呈现非常显著的杀伤作用，其EC50达到pM级别，并且呈剂量依赖性。
表9-5：双特异性抗体介导CIK杀伤肿瘤细胞的EC50值
Figure BDA0003829528250000791
备注：-表示未进行检测。
表9-6：双特异性抗体介导PBMC杀伤肿瘤细胞的EC50值
Figure BDA0003829528250000792
备注：-表示未进行检测。
表9-7：双特异性抗体介导CIK杀伤不同肿瘤细胞的EC50值
EC<sub>50</sub>(pM) AB1K2 AB23P10 Blincyto
NALM6 - 4.402 77.29
Reh 1.709 1.640 11.87
备注：-表示未进行检测。
实施例十二、Anti-Mucin1×CD3双特异性抗体的体外生物学功能评价
12.1、AB11K与高表达Mucin1的肿瘤细胞以及与人或食蟹猴原代T细胞的结合活性
培养人乳腺癌细胞MCF-7、BT-549、HCC70、T-47D和HCC1954，人卵巢癌细胞SK-OV-3，人宫颈癌细胞Hela以及人结肠癌细胞HT-29，其中MCF-7、BT-549、T-47D、HCC1954、SK-OV-3、Hela和HT-29细胞购自中国科学院细胞库，HCC70购自南京科佰生物科技有限公司。上述细胞分别用胰酶消化后离心收集用1％PBSB重悬，分别调整细胞密度为5×105个/ml置于96孔板中，100μl/孔，4℃封闭30min；人或食蟹猴原代T细胞，离心收集细胞用1％PBSB重悬，分别调整细胞密度为5×105个/ml置于96孔板中，100μl/孔，4℃封闭30min。用1％PBSB洗涤细胞1次。然后100μl/孔加入稀释后的一系列浓度的AB11K，4℃孵育1h。离心去上清，用1％PBSB清洗2遍，加入稀释好的AF647goat anti human IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.1:250稀释)，100μl/孔，4℃避光孵育1h。离心去上清，洗板后150μl/孔加入4％PFA重悬细胞，流式细胞仪检测信号强度。以平均荧光强度作为Y轴，抗体摩尔浓度作为X轴，通过软件GraphPad Prism 6进行分析，计算AB11K与上述肿瘤细胞以及人或食蟹猴原代T细胞结合的EC50值。
如图10-1和表10-1所示，在细胞水平上，AB11K与上述肿瘤细胞以及人或食蟹猴原代T细胞有结合，其信号强度与抗体浓度成正比，计算得出AB11K与上述肿瘤细胞的结合EC50达到5nM-300nM之间，其中与T-47D和Hela结合最强，其次为HCC70、HCC1954、SKOV-3和BT-549，而与MCF-7和HT-29结合较弱，未达到上平台。AB11K与人或食蟹猴T细胞结合的EC50值分别为13.43nM和9.996nM，其与食蟹猴T细胞结合的能力和人T细胞结合的能力大致相当。
表10-1：AB11K与高表达Mucin1的肿瘤细胞或与人、食蟹猴T细胞结合的EC50结果
细胞名称 EC<sub>50</sub>(nM)
MCF-7 /
BT-549 287.2
HCC70 58.98
T-47D 5.053
HCC1954 81.24
Hela 5.515
SK-OV-3 93.72
HT-29 /
人T细胞 13.43
食蟹猴T细胞 9.996
12.2、AB11K介导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力
正常培养的MCF-7、BT-549、HCC70、T-47D、HCC1954、SK-OV-3、Hela以及HT-29细胞分别作为靶细胞，胰酶消化后调整细胞密度2×105个/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO2培养过夜。T细胞组加入对应靶细胞数5倍的效应细胞(扩增培养的T细胞)，PBMC组加入对应靶细胞数10倍的效应细胞(健康志愿者的PBMC)，100μl/孔。设置空白孔和无需加入效应细胞的孔。将AB11K用培养基稀释成50μg/mL，4倍比稀释后，50μl/孔加入96孔板，37℃、5％CO2培养48h。细胞培养板用PBS洗涤3次，去除悬浮细胞。加入含10％CCK-8的培养基，100μl/孔，37℃、5％CO2孵育4h。于450nm和620nm下读数，根据[OD450-OD620]数值计算抗体的特异性杀伤率，公式如下：
Figure BDA0003829528250000801
以特异性杀伤率(％)作为Y轴，抗体摩尔浓度作为X轴，通过软件GraphPad Prism6进行分析，计算AB11K介导杀伤肿瘤靶细胞的EC50。
如图10-2和10-3以及表10-2所示，双特异性抗体AB11K介导效应细胞杀伤高表达Mucin1的肿瘤细胞呈现出非常显著的杀伤作用，当扩增的T细胞作为效应细胞时，AB11K的最大特异性杀伤均达到99％以上，其中对MCF-7、BT-549、HCC70和T-47D的特异性杀伤效果最好，EC50达到100pM-200pM，其次为Hela、HCC1954和SK-OV-3，而特异性杀伤HT-29的效果较弱，EC50较大，约为1577pM。当PBMC作为效应细胞时，AB11K特异性杀伤MCF-7、BT-549的效果最好，最大特异性杀伤达到95％以上，EC50分别为131.2pM和955.9pM，其次为HCC1954和HCC70，而特异性杀伤Hela和HT-29的EC50较大，分别为4810pM和9550pM。
表10-2：AB11K介导效应细胞杀伤肿瘤细胞的EC50结果
Figure BDA0003829528250000811
12.3、双特异性抗体活化T细胞能力评价
含有NFAT RE报告基因的Jurkat T细胞(购自BPS Bioscience)，在双特异性抗体和Mucin1阳性细胞同时存在的情况下可以过表达萤光素酶，通过检测萤光素酶的活性来定量Jurkat T细胞的活化程度。
具体的，MCF-7、BT-549、HCC70、T-47D、HCC1954、SK-OV-3、Hela以及HT-29细胞胰酶消化后调整细胞密度2×105个/ml，50μl/孔加入96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养过夜。Jurkat-NFAT细胞调整细胞密度到2.5×106个/ml，40μl/孔。AB11K用培养基稀释成400μg/mL，4倍比稀释后，10μl/孔加入96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱中孵育4h。加入Steady-
Figure BDA0003829528250000813
Luciferase，100μl/孔，反应5min后，用酶标仪检测冷发光值。以荧光素强度作为Y轴，抗体的摩尔浓度做X轴，通过软件GraphPad Prism 6进行分析，计算双特异性抗体活化T细胞的EC50。
如图10-4和表10-3所示，AB11K可以特异性的活化Jurkat-NFAT细胞，EC50值均在nM级别，且其浓度和信号强度成正比。
表10-3：AB11K活化T细胞能力的EC50结果
Figure BDA0003829528250000812
实施例十三、Anti-EGFR×CD3双特异性抗体在小鼠移植瘤模型中的药效学研究
选取EGFR高表达的人皮肤癌A431细胞小鼠移植瘤模型对抗EGFR×CD3双功能特异性抗体AB8K、AB2K和Erbitux(爱必妥，默克里昂制药)进行体内抑制肿瘤生长药效学研究。
根据实施例3.1中的方法获得CIK细胞，收集处于对数生长期的A431细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，将3×106个A431细胞和1×106个CIK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1小时后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，腹腔给予相应的药物。所有给药组和对照组PBS组均为每周给药两次，AB2K和Erbitux的给药剂量为1mg/kg。AB8K的给药剂量设置为1mg/kg和0.1mg/kg。给药当天记为第0天，每周测量两次肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，并根据实施例3.1中的公式计算各组的肿瘤体积(mm3)和各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)。
如图11所示，在给药后第17天，PBS对照组平均肿瘤体积为1370.76±216.35mm3；1mg/kg的Erbitux给药组的平均肿瘤体积为1060.35±115.86mm3，相对于对照组无显著性差异；1mg/kg AB2K给药组的平均肿瘤体积为877.76±120.38mm3，相对于对照组无显著性差异；0.1mg/kg和1mg/kg的AB8K给药组的平均肿瘤体积分别为233.30±135.51mm3和8.14±8.14mm3，TGI分别为82.98％和98.36％，相对于对照组均有极显著性差异(p<0.01)，其中AB8K的1mg/kg剂量组的6只小鼠中有5只小鼠的肿瘤完全消退。AB2K为AB8K的同型对照，A431细胞不表达CD20，而AB2K在此模型中未能见到药效，由此说明双抗的结构相对较安全，不会引起非特异的杀伤作用。CIK细胞90％以上均为激活的T细胞，AB8K在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制和杀伤肿瘤细胞，在1mg/kg的剂量下能完全抑制肿瘤的生长，在0.1mg/kg的剂量下也显示出良好的抗肿瘤效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (45)

1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤相关抗原的第一单链Fv、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，且所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD19，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：9、10和11所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：12、13和14所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：17、18和19所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：20、21和22所示；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：25、26和27所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：28、29和30所示；
(iv)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：33、34和35所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：36、37和38所示。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD20，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：41、42和43所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：44、45和46所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：49、50和51所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：52、53和54所示；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：57、58和59所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：60、61和62所示；
(iv)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：65、66和67所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：68、69和70所示。
5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD22，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：73、74和75所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：76、77和78所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：81、82和83所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：84、85和86所示。
6.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD30，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：89、90和91所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：92、93和94所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：97、98和99所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：100、101和102所示。
7.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合EpCAM，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：105、106和107所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：108、109和110所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：113、114和115所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：116、117和118所示。
8.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CEA，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：121、122和123所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：124、125和126所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：129、130和131所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：132、133和134所示；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：137、138和139所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：140、141和142所示。
9.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合Her2，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：145、146和147所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：148、149和150所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：153、154和155所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：156、157和158所示；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：161、162和163所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：164、165和166所示。
10.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合EGFR，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：169、170和171所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：172、173和174所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：177、178和179所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：180、181和182所示；
(iii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：185、186和187所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：188、189和190所示。
11.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合GPC-3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：193、194和195所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：196、197和198所示。
12.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合Mesothelin，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：201、202和203所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：204、205和206所示。
13.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合Mucin1，其选自下组：
(i)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：209、210和211所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：212、213和214所示；
(ii)VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：217、218和219所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：220、221和222所示。
14.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CA125，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：225、226和227所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：228、229和230所示。
15.如权利要求1或3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD19，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：24所示的氨基酸序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：32所示的氨基酸序列；
(iv)VH结构域包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：40所示的氨基酸序列。
16.如权利要求1或4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD20，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：48所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：56所示的氨基酸序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：64所示的氨基酸序列；
(iv)VH结构域包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：72所示的氨基酸序列。
17.如权利要求1或5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD22，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：80所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：88所示的氨基酸序列。
18.如权利要求1或6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CD30，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：96所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：104所示的氨基酸序列。
19.如权利要求1或7所述的双特异性抗体，其特征在于，更优选地，所述第一单链Fv特异性结合EpCAM，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：112所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：120所示的氨基酸序列。
20.如权利要求1或8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CEA，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：128所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：136所示的氨基酸序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：144所示的氨基酸序列。
21.如权利要求1或9所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合Her2，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：152所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：160所示的氨基酸序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：168所示的氨基酸序列。
22.如权利要求1或10所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合EGFR，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：175所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：176所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：183所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：184所示的氨基酸序列；
(iii)VH结构域包含如SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：192所示的氨基酸序列。
23.如权利要求1或11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合GPC-3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：199所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：200所示的氨基酸序列。
24.如权利要求1或12所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合Mesothelin，其VH结构域包含如SEQ ID NO：207所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：208所示的氨基酸序列。
25.如权利要求1或13所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合Mucin1，其选自下组：
(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：215所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：216所示的氨基酸序列；
(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：223所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：224所示的氨基酸序列。
26.如权利要求1或14所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合CA125，其VH结构域包含如SEQ ID NO：231所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ IDNO：232所示的氨基酸序列。
27.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，且所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3。
28.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv在体外结合亲和力分析中以大于约50nM，或大于100nM，或大于300nM，或大于500nM的EC50值结合于效应细胞；更优选地，所述双特异性抗体的第二单链Fv不仅能与人CD3结合，还可与食蟹猴或恒河猴的CD3特异性结合。
29.如权利要求28所述的双特异性抗体，其特征在于，
所述第二单链Fv的VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：241、242和243所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：244、245和246所示；
所述第二单链Fv的VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：249、250和251所示；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：252、253和254所示。
30.如权利要求29所述的双特异性抗体，其特征在于，
所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：247所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：248所示的氨基酸序列；
所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：255所示的氨基酸序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：256所示的氨基酸序列。
31.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成；且所述柔性肽包含2个或更多个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；更优地，所述柔性肽包含G和S残基；最优地，所述柔性肽的氨基酸组成结构通式为GxSy(GGGGS)z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1；所述刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列或其截短的片段；优选地，所述刚性肽包含SSSSKAPPPS。
32.如权利要求31所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽包含如SEQ ID NO：258所示的氨基酸序列。
33.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，连接所述Fc片段与第二单链Fv的连接肽包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；较优选自Gly(G)和Ser(S)；更优选地，所述连接肽组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。
34.如权利要求1或33所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段包含来源于人免疫球蛋白重链恒定区的铰链区、CH2和CH3结构域；较优地，Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；较优地，Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区；更优地，Fc片段选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且，所述Fc片段与其所源自的天然序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。
35.如权利要求34所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段包含根据EU编号系统确定的L234A/L235A/P331S的氨基酸置换。
36.如权利要求35所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段还包含以下一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加：
(i)根据EU编号系统确定的M428L、T250Q/M428L、M428L/N434S或M252Y/S254T/T256E的氨基酸置换；
(ii)根据EU编号系统确定的N297A的氨基酸置换；
(iii)根据EU编号系统确定的K447的氨基酸缺失。
37.如权利要求36所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQID NO：263所示，它与其所源自的天然序列相比具有根据EU编号系统确定的以下6个氨基酸的置换或取代：L234A/L235A/N297A/P331S/T250Q/M428L；且缺失或删除了根据EU编号系统确定的K447。
38.编码如权利要求1-37任一项所述双特异性抗体的DNA分子。
39.包含如权利要求38所述DNA分子的载体。
40.包含如权利要求39所述载体的宿主细胞；所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。
41.一种药物组合物，所述组合物包含如权利要求1-37任一项所述的双特异性抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。
42.制备如权利要求1-37任一项所述双特异性抗体的方法，其包括：(a)获得双特异性抗体的融合基因，构建双特异性抗体的表达载体；(b)通过基因工程方法将上述表达载体转染到宿主细胞中；(c)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养上述宿主细胞；(d)分离、纯化产生的所述抗体；
其中，步骤(a)中所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种，优选地，所述表达载体为pCDNA3.4载体；
其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，优选为CHO细胞；
其中，步骤(d)通过常规的免疫球蛋白纯化方法，包含蛋白质A亲和层析和离子交换、疏水层析或分子筛方法分离、纯化所述双特异性抗体。
43.如权利要求1-37任一项所述双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解癌症/肿瘤的药物中的用途，所述癌症的实例包括但不限于间皮瘤、鳞状细胞瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性上皮肿瘤、腺癌、黑色素瘤、肉瘤、急性和慢性白血病、淋巴瘤和脑膜瘤、霍奇金病、塞扎莱综合征、多发性骨髓瘤，肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、喉癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、子宫癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、胃癌、肾细胞癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝胆癌、骨癌、皮肤癌和血液癌，以及鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉头癌、喉下部癌、唾液腺癌、纵隔膜癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠和肛门区域的癌症、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌症、中枢神经系统癌症和浆细胞癌。
44.如权利要求1-37任一项所述双特异性抗体用于增强或刺激免疫应答或功能的方法，其包含对患者/受试者个体施用治疗有效量的所述双特异性抗体。
45.如权利要求1-37任一项所述双特异性抗体用于治疗肿瘤、延迟其进展、降低/抑制其复发的方法，其包括将有效量的所述双特异性抗体给予或施用至所述患有以上疾病或病症的个体；所述肿瘤的实例包括但不限于间皮瘤、鳞状细胞瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性上皮肿瘤、腺癌、黑色素瘤、肉瘤、急性和慢性白血病、淋巴瘤和脑膜瘤、霍奇金病、塞扎莱综合征、多发性骨髓瘤，肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、喉癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、子宫癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、胃癌、肾细胞癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝胆癌、骨癌、皮肤癌和血液癌，以及鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉头癌、喉下部癌、唾液腺癌、纵隔膜癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠和肛门区域的癌症、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌症、中枢神经系统癌症和浆细胞癌。
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