CN115316672B - 一种花生肽-钙螯合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生肽‑钙螯合物的制备方法，它涉及功能性营养物质的化学合成技术领域。包括以下步骤：将100mg花生肽超滤组分溶解于5mL去离子水中，在50℃、pH 8.0的条件下，置于恒温加热磁力搅拌器中，然后加入100mg的无水氯化钙并用保鲜膜封口，在恒温震荡条件下搅拌1h；反应完成后加入9倍体积的无水乙醇静止3h；将得到的沉淀，以9000r/min离心20min后收集沉淀，冷冻干燥得到目标产物花生肽‑钙螯合物。本发明制备方法简单，制备得的花生肽‑钙螯合物的钙螯合活性效果好。
Description
技术领域
本发明涉及的是功能性营养物质的化学合成技术领域，具体涉及一种花生肽-钙螯合物的制备方法。
背景技术
花生肽是花生蛋白的深加工产品，其营养成分丰富，氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量高达38.29％，具有完全独立的吸收机制。且花生肽的溶解性、稳定性都优于花生蛋白，可直接被小肠吸收，迅速补充营养，直接参与人体氨基酸和蛋白质的合成，促进蛋白质活性基团发挥作用，增强免疫力，具有抗氧化等生物活性。此外，花生肽具有良好的金属离子螯合能力，以花生肽制备肽-钙、锌螯合物具有很大的优势，食物中的膳食纤维和植酸盐的存在阻碍了肠道对钙、锌的吸收，因为它们可以与金属离子形成不溶性复合物，降低其生物利用度。而花生肽与钙、锌螯合形成螯合物可以避免这些现象的发生，显著提高了金属离子的溶解度和稳定性，提高其吸收利用率。因此，钙、锌螯合肽生物利用率高、吸收快，是一种理想的钙锌同补剂。
钙是人体维持正常生理代谢所必需的营养元素，在人体生长发育过程中起着极其重要的作用。缺钙会导致许多疾病如骨质疏松症、佝偻病等症状。由于我国居民膳食结构存在缺陷，导致人们饮食中缺少钙的优质来源，钙缺乏成为了我国常见的营养性疾病。实际上我国居民日均钙摄入量仅为推荐量的一半，钙摄入量严重不足。鉴于钙在机体中的重要作用，以及钙缺乏造成的疾病，钙营养补充剂的制备已成为研究热点。
现有的花生肽-钙螯合物的制备方法比较复杂，而且制备的花生肽-钙螯合物的钙螯合活性不佳，因此，本发明设计了一种更为有效的花生肽-钙螯合物的制备方法。
发明内容
针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种花生肽-钙螯合物的制备方法，制备方法简单，制备得的花生肽-钙螯合物的钙螯合活性效果好，
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种花生肽-钙螯合物的制备方法，包括以下步骤：将100mg花生肽超滤组分(<3kDa，3-10kDa，>10kDa)溶解于5mL去离子水中，在50℃、pH 8.0的条件下，置于恒温加热磁力搅拌器中，然后加入100mg的无水氯化钙并用保鲜膜封口，在恒温震荡条件下搅拌1h。反应完成后加入9倍体积的无水乙醇静止3h；将得到的沉淀，以9000r/min离心20min后收集沉淀，冷冻干燥得到目标产物花生肽-钙螯合物。
所述的花生肽超滤组分采用<3kDa。
所述的花生肽-钙螯合物螯合得率的测定：
测定反应液中反应物总质量和螯合后螯合物总质量：
螯合物得率(％)＝(m1/m2)×100％ (1)
式中：m1为螯合后螯合物总质量(g)；m2为反应液中反应物总质量(g)。
采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶分离色谱柱将具有高钙螯合活性的超滤组分<3kDa进行分离纯化，得到钙螯合活性效果最好的FPPDVA氨基酸序列，将FPPDVA进行肽-钙螯合物的制备。
本发明的有益效果：本发明的制备方法简单，在超滤组分(<3kDa，3-10kDa，>10kDa)的钙螯合力及螯合物得率测定中，超滤组分<3kDa的钙螯合活性效果最好。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明；
图1为本发明的钙离子浓度标注曲线图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
参照图1，本具体实施方式采用以下技术方案：一种花生肽-钙螯合物的制备方法，包括以下步骤：将100mg花生肽超滤组分(<3kDa，3-10kDa，>10kDa)溶解于5mL去离子水中，在50℃、pH 8.0的条件下，置于恒温加热磁力搅拌器中，然后加入100mg的无水氯化钙并用保鲜膜封口，在恒温震荡条件下搅拌1h。反应完成后加入9倍体积的无水乙醇静止3h；将得到的沉淀，以9000r/min离心20min后收集沉淀，冷冻干燥得到目标产物花生肽-钙螯合物。
值得注意的是，所述的花生肽超滤组分采用<3kDa。
值得注意的是，所述的花生肽-钙螯合物螯合得率的测定：
测定反应液中反应物总质量和螯合后螯合物总质量：
螯合物得率(％)＝(m1/m2)×100％ (1)
式中：m1为螯合后螯合物总质量(g)；m2为反应液中反应物总质量(g)。
此外，采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶分离色谱柱将具有高钙螯合活性的超滤组分<3kDa进行分离纯化，得到钙螯合活性效果最好的FPPDVA氨基酸序列，将FPPDVA进行肽-钙螯合物的制备。
本具体实施方式花生肽经过酶解、超滤处理后得到不同分子量的三种组分(<3kDa，3-10kDa，>10kDa)。利用钙螯合力为指标筛选出钙螯合活性最优组分。为了获取更高钙螯合活性的花生钙螯合肽，且氨基酸序列明确，采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析分离纯化，随后对获得的钙螯合活性最优组分进行NANO-HPLC-MS/MS结构鉴定，最后通过固相合成技术获得合成肽，并从中筛选出钙螯合活性效果最优的活性肽用于花生肽-钙螯合物的制备。
实施例1：
1、将100mg实验室提供的花生肽超滤组分(<3kDa，3-10kDa，>10kDa)溶解于5mL去离子水中，在50℃、pH 8.0的条件下，置于恒温加热磁力搅拌器中，然后加入100mg的无水氯化钙并用保鲜膜封口，在恒温震荡条件下搅拌1h。反应完成后加入9倍体积的无水乙醇静止3h。将得到的沉淀，以9000r/min离心20min后收集沉淀，冷冻干燥得到目标产物花生肽-钙螯合物。
2、花生肽-钙螯合物螯合得率的测定
测定反应液中反应物总质量和螯合后螯合物总质量：
螯合物得率(％)＝(m1/m2)×100％(公式2-1)
式中：m1为螯合后螯合物总质量(g)；m2为反应液中反应物总质量(g)。
3、花生肽-钙螯合物钙螯合力的测定：
3.1本实验采用邻甲酚酞络合比色法测定样品中的钙离子含量，其原理是钙与络合剂在pH值为11.0±0.1的碱性缓冲溶液中反应后成紫红色络合物，最大吸收波长为570nm，其中二价离子的干扰可用8-羟基喹啉消除，其钙离子浓度与吸收值呈线性相关关系。
3.2标准曲线
分别取标准钙工作液(10μg/mL)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，分别加入去离子水配制成体积为1mL的溶液，再分别加入工作显色液5mL，摇匀，于570nm处测定吸光值，绘制标准曲线。
根据试验方法，以吸光度大小作为X(横坐标)轴，钙离子浓度作为(纵坐标)Y轴，得到标准曲线如图1所示，其标准曲线回归方程为：y＝0.0584x+0.0281，相对系数R2＝0.9911。
3.3钙螯合力的测定
在试管中加入1mL、5mmol/L的CaCl2溶液和2mL、0.2mol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液，再加入1mL、1mg/mL的样品，置于摇床水浴锅中37℃反应2h，取出后10000r/min常温离心10min，采用邻甲酚酞络合比色法测定上清液中可溶性钙结合量。
4.Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析分离纯化
将花生肽Sephadex G-25组分(F1，F2，F3，F4)中钙螯合力及螯合物得率最优的组分经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析分离纯化(凝胶过滤柱60cm×1cm)。检测波长291nm。将样品溶解(浓度：80mg/mL；上样量：1.5mL)通过0.22μm孔径的滤膜后注入色谱柱中，以0.8mL/min的流速梯度洗脱色谱柱，绘制洗脱曲线，收集不同样品组分并立即冻干，-20℃储存备用。
5、NANO-HPLC-MS/MS结构鉴定
将收集得到的肽经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。应用系统为串联EASY-nanoLC 1200的Q ExactiveTMPlus质谱仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)。使用Acclaim PepMap C18分析柱(75μm x 25cm)分离肽。共上样3μL样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，色谱梯度(流动相A相：0.1％甲酸水溶液；流动相B相：含0.1％甲酸的ACN溶液)。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS：扫描范围(m/z)＝200-1800；分辨率＝70000；AGC target＝3e6；最大注入时间＝50ms；扫描电荷＝1-6；(2)HCD-MS/MS(top 20)：分辨率＝17500；隔离窗口＝2m/z；AGC target＝1e5；最大注入时间＝45ms；碰撞能量＝28；动态排除时间＝30s。使用分析软件PEAKS测定氨基酸序列。
6钙螯合活性肽的合成
选择LC-MS/MS鉴定的肽，由江苏吉泰肽业科技有限公司采用固相合成法合成花生活性肽，使用高效液相色谱纯化肽。用均含有0.01％TFA的溶剂A：水(H2O)和溶剂B：乙腈(ACN)线性梯度洗脱肽，流速为1mL/min。使用UV检测在220nm下监测分离。然后对肽进行Agilent-6125B质谱(MS)分析。最后采用液相色谱-串联质谱联用(LC-ESI-MS/MS)技术测定合成肽的分子量。用RP-HPLC对合成肽的纯度进行检测，合成肽的纯度>95％。
本实施例实验中获得的数据均用三次重复试验测定的平均值±标准偏差(SD)表示，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件对各项指标数据进行单因素方差分析(ANOVE，LSD)，P<0.05时表示数据间差异显著(用不同字母标记)。使用Origin8.0软件做图。
7、结果：
(1)在超滤组分(<3kDa，3-10kDa，>10kDa)的钙螯合力及螯合物得率测定中，组分<3kDa的钙螯合力(9.13±0.11μg/mL)显著高于3-10kDa(7.82±0.02μg/mL)、>10kDa(7.54±0.31μg/mL)组分的钙螯合力(P<0.05)。超滤组分<3kDa的螯合物得率(32.38％)高于3-10kDa组分的螯合物得率(18.92％)(P>0.05)，但低于>10kDa组分的螯合物得率(45.76％)(P<0.05)。表明超滤组分<3kDa的钙螯合活性效果最好。
(2)采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶分离色谱柱将具有高钙螯合活性的超滤组分<3kDa进行分离纯化，得到4个组分分别命名为F1、F2、F3、F4。对4个组分进行钙螯合力及螯合物得率的测定。结果显示，F1组分的钙螯合力(9.31±0.02μg/mL)显著高于F2(4.68±0.28μg/mL)、F3(4.85±0.09μg/mL)、F4(4.77±0.06μg/mL)组分的钙螯合力(P<0.05)。F1组分的螯合物得率(43.42％)显著高于F2(19.62％)、F3(9.63％)、F4(4.18％)组分的螯合物得率(P<0.05)。表明F1组分的钙螯合活性效果最好。
(3)采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶分离色谱柱将具有高钙螯合活性的F1组分进行分离纯化，得到2个组分分别命名为C1、C2。对2个组分进行钙螯合力的测定。结果显示，C1组分的钙螯合力(7.95±0.06μg/mL)显著高于C2组分的钙螯合力(3.63±0.29μg/mL)(P<0.05)，表明C1组分的钙螯合活性效果最好。
(4)采用NANO-HPLC-MS/MS对C1组分进行分子量及氨基酸序列鉴定。根据钙螯合活性肽具备的氨基酸序列特点，在肽段可信度≥95％的鉴定结果中进行筛选。筛选出7种满足具有钙螯合活性氨基酸的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为FPEFQ、FPPDVA、LPDPVP、LPEGQF、FPDL、FPDVP、LPEPV。然后进行钙螯合力的测定。结果显示，FPPDVA的钙螯合活性显著优于另外6种合成肽(P<0.05)，钙螯合力达到15.67±0.39μg/mL，其次是FPEFQ(6.96±0.42μg/mL)、LPDPVP(7.06±0.36μg/mL)、LPEGQF(6.61±0.16μg/mL)、FPDL(6.37±0.16μg/mL)、FPDVP(9.70±0.25μg/mL)、LPEPV(5.77±0.48μg/mL)，表明FPPDVA的钙螯合活性效果最好，将FPPDVA进行肽-钙螯合物的制备。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (1)
1.一种花生肽-钙螯合物，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为FPEFQ、FPPDVA、LPDPVP、LPEGQF、FPDL、FPDVP或LPEPV。
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