CN115212350A - 水凝胶在制备高仿生人造血管材料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水凝胶在制备高仿生人造血管材料中的应用，所述的水凝胶为壳聚糖/聚乙二醇水凝胶或缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，将其涂覆脱细胞支架表面，制得高仿生人造血管材料。本发明的显著优点为通过水凝胶与脱细胞支架的使用，制备的高仿生人造血管材料可以有效保留脱细胞支架原始的力学仿生性能，具有优越的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶在制备高仿生人造血管材料中应用，属于组织工程领域。
背景技术
进入二十一世纪以来，心血管类疾病给人类带来新的严峻挑战。世界卫生组织(WHO) 就当前对人类健康造成威胁的重大疾病分析指出，心血管疾病已成为全球的头号死因。据世界卫生组织统计,全世界每年有1200万人死于心血管疾病，占总死亡人数的1/4。心血管疾病已被公认为是与癌症齐驱并驾的人类健康第一号杀手。心血管疾病是指心脏和血管疾患引起的，包括冠心病(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、血压升高(高血压)、风湿性心脏病、先天性心脏病、心力衰竭和周围动脉血管疾病等多种疾病的统称。近年来，随着我国国民饮食习惯的改变和人口老龄化问题的日益严重，心脑血管疾病的发病率逐年上升。2019年9月3日，柳叶刀在线发布了两项最新研究成果。聚焦了21个国家的常见发病率及死亡率，分别展示了低、中、高收入国家的常见死因。结果表明，心血管疾病在低收入和中等收入国家的死亡率远高于发达国家。
在冠心病、血管损伤、下肢动脉缺血等疾病的治疗过程中，通常需要进行冠状动脉搭桥术等多种血管移植手术，这导致了当前我国的血管移植物的缺口的日益扩大。当下，基于涤纶和聚四氟乙烯的人造血管已经被广泛运用于大口径血管(直径大于6mm)的重建过程中，然而上述材料在小口径血管(小于6mm)应用中，却存在着血栓栓塞、内膜增生以及通畅率低等缺点，因此，目前可应用于临床的具有良好血液相容性和通畅性的小口径血管十分缺乏，大多只能依靠自体血管移植。然而自体血管移植存在材料来源困难、血管蒂长度不足、直径不匹配等诸多缺点。
目前临床使用较为普遍的血管移植物主要包括人工合成材料血管和自体血管。自体血管由于其来源有限、供体牺牲大等缺点，无法广泛应用。而人工血管因来源广泛备受青睐。临床医学上使用最多人造血管材料是聚酯类材料，如涤纶和膨体聚四氟乙烯等。涤纶材料易加工性、本身的微孔结构以及优良的力学特性被广泛用于制备人工血管材料。但其表面的疏水特性较易诱导形成血栓，术后需服用抗凝药物，严重限制了其在临床的发展和应用。膨体聚四氟乙烯(ePTFE)材料的无抗原性、无致癌性、无毒性以及接近自体动脉的顺应性的特点，使得膨体聚四氟乙烯人造血管材料在临床中得到最广泛的应用。其虽具备良好的生物相容性，不易形成血栓等特点，但临床移植后期会出现管腔狭窄的问题，导致其在小口径血管移植手术中存在问题。性能优良的人造血管需具备与天然血管类似的各种性能，如良好的血液相容性、细胞相容性和内皮祖细胞的黏附和增殖能力等。同时，优异的人造血管材料也应该具有与正常血管生物力学性能相似的生物力学特性。此外，生物体代谢是持续进行的，天然血管也在不断更新中，而这种更新无疑具一定周期性，因此理想的人造血管不仅需要具备可生物降解性能，且其降解周期也应与生物体实际的降解周期相匹配。故寻找一种合适的理论和方法来构建各项性能优良，且与天然血管性能相近的人造血管材料在生命科学及仿生学的研究中尤为重要。
针对上述问题，国内外科研人员进行了长期的研究。研究表明，基于组织工程学的血管移植材料更能同时满足临床需要和力学仿生性能。其中，血管组织工程是利用生物可降解支架材料来制备、重建和再生血管替代材料的科学。基于脱细胞血管支架的人造血管材料在保持血管本身的降解速率和机械性能优势的同时，还可避免植入后的免疫排斥反应。然而，通过脱细胞方法制备的支架材料去除了血管内表面的内皮细胞层，只剩一个三维网状结构，因此必须对脱细胞支架表面进行覆膜改性。
因此，设计一种在保持脱细胞支架本身优势的基础上能够保证良好的生物相容性和仿生性能，维持植入部位的长期通畅，最终实现内皮化的复合材料，是血管组织工程的重点突破方向，也是实现临床应用的前提条件。利用组织工程学原理，联合支架材料、细胞和生物信号分子构建的组织工程小口径血管，为解决上述问题提供了新的思路，是目前最具潜力的解决方式之一。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供水凝胶在制备高仿生人造血管材料中应用。
技术方案：本发明所述水凝胶在制备高仿生人造血管材料中的应用，所述的水凝胶为壳聚糖/聚乙二醇水凝胶或缩醛化的聚乙烯醇水凝胶。
所述水凝胶是一种由具有交联的三维网状结构的水溶性高分子形成的以水为分散介质的凝胶结构。上述聚乙二醇或聚乙烯醇水溶性高分子遇水后，其内部的亲水基团会与水分子集合，而疏水基团则会遇水膨胀，使得水凝胶在水中不仅不会溶解，还会发生溶胀，可以吸收并锁住大量的水分。
进一步地，所述壳聚糖/聚乙二醇水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)配置NaOH水溶液，再加入无水乙醇，得到NaOH溶液；
(2)在NaOH溶液中边搅拌边加入壳聚糖，让其碱化；
(3)再加入环氧丙烷，置于恒温水浴中反应，得到产物；
(4)取出产物，将其置于盐酸和丙酮的混合液中洗涤，再将其置于丙酮和水的混合液中洗涤，真空抽滤，真空干燥，得到O-HPCS，反应机理如下式；
(5)配置O-HPCS水溶液，并加入聚乙二醇和戊二醛溶液，搅拌混合，静置得到壳聚糖/聚乙二醇水凝胶。
再进一步地，步骤(1)中，所述NaOH溶液的质量浓度6％～8％；步骤(2)中，所述NaOH溶液与壳聚糖的液固比为10～12mL：g，所述的碱化时间为6～8h；步骤(3) 中，所述的反应时间为24～36h；步骤(4)中，所述盐酸和丙酮的混合液中盐酸与丙酮的质量比为1:10～1:9，所述丙酮和水的混合液中丙酮与水的质量比9:1～10:1，所述真空干燥的温度为45～55℃，真空干燥时间为2～3h；步骤(5)中，所述聚乙二醇与戊二醛的固液比为0.1～0.2g：mL。
进一步地，所述缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)聚乙烯醇与水混合，加热溶解；
(2)加入甘油，继续加热；
(3)降温，分别加入甲醛和戊二醛，搅拌均匀，得到缩醛化的聚乙烯醇；
(4)将缩醛化的聚乙烯烘干，再升温继续干燥，冷却，用水浸泡冲洗，得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶。
聚乙烯醇缩醛化的基本反应方程式如下：
再进一步地，步骤(1)中，所述聚乙烯醇与水的质量比为1:30～5:90，所述加热的温度为90～100℃；步骤(2)中，所述甘油与聚乙烯醇的质量比为1：1～2，所述继续加热的时间为0.5h～1h；步骤(3)中，所述甲醛、戊二醛与聚乙烯醇的质量比为2:6:3～2:6:5，所述戊二醛的浓度为0.5～9％；步骤(4)中，所述烘干温度为40～60℃，烘干时间为2～3 h，所述再升温的温度为60～70℃，继续干燥的时间为1～2h，所述浸泡冲洗时间为0.5～1h。
进一步地，所述高仿生人造血管材料的制备方法包括以下步骤：
(1)制备壳聚糖/聚乙二醇水凝胶；
(2)将壳聚糖/聚乙二醇水凝胶涂抹在脱细胞支架表面，得到壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架CS/PEG/DCS；
(3)利用层层自组装方法将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，真空干燥，得到高仿生人造血管材料n-He-CS/PEG/DCS。
再进一步地，步骤(3)中，所述的层层自组装方法为浸泡提拉法，包括以下步骤：
(3.1)分别配置肝素钠溶液和壳聚糖溶液；
(3.2)将CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液浸泡后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中，取出用PBS缓冲溶液正面和反面冲洗，得到1-He-CS/PEG/DCS；
(3.3)将1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡，取出用PBS缓冲溶液正面反面冲洗，再将其浸泡在肝素钠溶液中，取出用PBS缓冲溶液正面反面冲洗，得到2-He-CS/PEG/DCS；
(3.4)重复(3.3)中步骤，制备成多层肝素/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，得到 n-He-CS/PEG/DCS。
更进一步地，步骤(3.1)中，所述肝素钠溶液的浓度为1～2g/L，壳聚糖溶液的浓度为1～2g/L，所述壳聚糖与肝素钠的质量比为1：1～2；步骤(3.2)中，所述CS/PEG/DCS 置于PBS缓冲溶液浸泡是时间为10～30min，浸泡在肝素钠溶液中的时间为10～15min；步骤(3.3)中，所述1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡时间为10～15min，浸泡在肝素钠溶液的时间为10～15min，步骤(3.4)中，所述n-He-CS/PEG/DCS中的n 为3～7。
进一步地，所述高仿生人造血管材料的制备方法包括以下步骤：
(1)制备不同缩醛化的聚乙烯醇水凝胶；
(2)制备不同缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物；
(3)将不同缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物涂抹在脱细胞支架表面，得到不同缩醛化肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架，即高仿生人造血管材料He/PVAn/DCS。
再进一步地，步骤(2)中，所述缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物的制备包括以下步骤：将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶干燥得到缩醛化的聚乙烯醇膜，再将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在肝素钠水溶液中，得到缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物。
再进一步地，所述干燥温度为40～60℃，干燥时间为2～3h，所述肝素钠水溶液的质量浓度为1～2％。
进一步地，所述脱细胞支架的制备方法包括以下步骤：
(1)将置于组织固定液中的血管取出并修剪外膜，浸入在生理盐水中；
(2)配置十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的混合溶液，将修剪后的血管浸泡在混合溶液中；
(3)将浸泡后的血管取出，用PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中，每天更换PBS缓冲溶液；
(4)取出浸泡完的血管，修剪成片，冷冻干燥，得到脱细胞支架DCS。
进一步地，步骤(2)中，所述十二烷基硫酸钠与聚乙二醇辛基苯基醚质量比为1:1～1:2，所述浸泡在混合溶液中时间为24～48h；步骤(3)中，所述浸泡在PBS缓冲溶液中时间为20～30天，所述每天更换PBS缓冲溶液的次数为1～2次；步骤(4)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-55℃，冷冻干燥时间为8～12h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
(1)脱细胞支架来源于天然血管，具备在机械性能和力学仿生性能方面的先天优势。与此同时，脱细胞支架具有优异的生物相容性，可以避免发生血栓栓塞及免疫排斥反应。脱细胞支架基底及水凝胶的选用使其具有优异的生物可降解性，可以在体内稳定的环境下被生物体自身降解且降解物无毒性，最后能被自体组织吸收。使用来源于天然血管的脱细胞支架材料一定程度上降低了植入体内后出现免疫排异反应和钙化的概率。
(2)层层自组装技术在基材表面进行交替沉积，从而形成稳定且完整的分子聚集体，利用此方法合成的自组装膜优点显著。聚乙二醇水凝胶覆膜后，改变了脱细胞血管支架的三维网状结构，但并不会改变脱细胞血管支架人造血管材料的机械性能，材料具有优异的力学仿生性能，可以承受血液在管腔内流动的过程中产生的压力变化，保持管腔的通畅性。层层自组装后，该人造血管材料的生物相容性显著提高，有利于内皮祖细胞及平滑肌细胞在上面贴附生长。
(3)不同缩醛化的肝素-聚乙烯醇水凝胶改性后，因其低弹性模量和良好的生物降解性能，不会对脱细胞支架的上述天然仿生学的优势造成较大的影响，且可以达到对脱细胞支架的覆膜作用并提高其血液相容性的目的。聚乙烯醇缩醛化改性后，不仅保持了聚乙烯醇水凝胶的特性，还有效提高了其耐水解性能。其作为高仿生人造血管材料改性的肝素溶液，可有效提高其抗凝血性能和生物形容性
(4)所述的高仿生人造血管材料包括使用脱细胞血管支架用于材料底物，同传统的人工合成血管材料相比，该高仿生人造血管材料具有更好的力学仿生性能和降解速率匹配性。此外，所选用材料具有来源广泛、价格优廉、能大规模生产应用的特点。
附图说明
图1是脱细胞支架的SEM图；
图2是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的SEM图；
图3是O-HPCS和CS/PEG的FT-IR图；
图4是CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS的XPS对比图；
图5是酸性橙标准曲线图；
图6是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的氨基含量柱状图；
图7是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的静态接触角图；
图8是新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的拉伸强度、断裂伸长率和爆破强度图；
图9是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、凝血酶原时间和复钙凝血时间图；
图10是n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的红细胞形貌图；
图11是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的MTT测试图；
图12是CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料的体外降解速率图；
图13是不同缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVAn(n＝1～6)电镜图；
图14是肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA4/DCS红外谱图；
图15是不同缩醛化程度的的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)SEM图；
图16是PVA/DCS和He/PVA4/DCS的XPS对比图；
图17是新鲜血管、DCS及He/PVAn/DCS(n＝1～6)的拉伸强度、断裂伸长率和爆破强度图；
图18是PVA/DCS和He/PVA4/DCS(n＝1～6)人造血管材料的活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、凝血酶原时间和复钙凝血时间图；
图19是He/PVAn/DCS(n＝1～6)的红细胞形貌图；
图20是He/PVAn/DCS(n＝1～6)的MTT测试图；
图21是PVA/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料的体外降解速率图；
图22是5-He-CS/PEG/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料植入体内两周后的B超图；
图23是5-He-CS/PEG/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料植入体内5个月后植入部位的CTA图；
图24是新鲜血管、He-Ch-5/PU/DCS、He/PVA4/DCS和5-He-CS/PEG/DCS应力-应变曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1制备三层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(3-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)的制备
将置于4％多聚甲醛组织固定液中的犬双侧颈动脉血管(南京市鼓楼医院血管外科提供) 取出并修剪外膜，浸入0.9％的生理盐水中。取0.5g的十二烷基硫酸钠及1g的聚乙二醇辛基苯基醚，溶于100mL去离子水中，配成浓度为1.5％的混合溶液，将修剪后的犬双侧颈动脉血管浸泡在混合溶液中48h。将浸泡后的犬双侧颈动脉血管取出，用PBS 缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中30天，每天更换溶液2次。取出浸泡完的犬双侧颈动脉血管，修剪成片，在冻干机中-55℃下冷冻干燥12h，得到脱细胞支架，记作 DCS。
2、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶的制备
称取1.5g的NaOH溶解在水中，将其配置成2.0mol/L的溶液，再加入5mL无水乙醇，将2.0mol/L的NaOH溶液倒三口烧瓶中，边搅拌边加入2g的壳聚糖，让其碱化8h。将2g环氧丙烷加入上述三口烧瓶中，置于50℃恒温水浴中反应36h。取出产物，将其置于质量比为1:9的盐酸和丙酮的混合液中洗涤5次，再将其置于质量比为9:1 的丙酮和水的混合液中洗涤5次，用真空泵抽滤后，置于55℃真空干燥箱内干燥2h，取出，得到O-羟丙基壳聚糖(O-HPCS)。取1.5g的O-HPCS置于100mL去离子水中配成溶液，并加入0.5g的聚乙二醇(PEG)和5mL 2％的戊二醛溶液，搅拌15min使其充分混合，静置得到壳聚糖/聚乙二醇水凝胶，记作CS/PEG。
3、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备
将制备好的DCS，置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将壳聚糖/聚乙二醇水凝胶涂抹在脱细胞支架表面，且保证其表面被均匀涂抹三次。并将其取出放置于50℃真空干燥箱中干燥直至完全脱水后取出。得到壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作 CS/PEG/DCS。
4、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备2g/L的肝素钠溶液和壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡15min，取出用 PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤1次，制得3-He-CS/PEG/DCS。
实施例2制备三层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(3-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)的制备
将置于4％多聚甲醛组织固定液中的犬双侧颈动脉取出并修剪外膜，浸入0.9％的生理盐水中。取0.5g的十二烷基硫酸钠及0.5g的聚乙二醇辛基苯基醚，溶于100mL去离子水中，配成浓度为1％的混合溶液，将修剪后的犬双侧颈动脉浸泡在混合溶液中24h。将浸泡后的犬双侧颈动脉取出，用PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中20天，每天更换溶液1次。取出浸泡完的犬双侧颈动脉，修剪成片，在冻干机中-45℃下冷冻干燥8h，得到脱细胞支架，记作DCS。
2、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶的制备
称取1.0g的NaOH溶解在水中，将其配置成1.5mol/L的溶液，再加入5mL无水乙醇，将1.5mol/L的NaOH溶液倒三口烧瓶中，边搅拌边加入2g的壳聚糖，让其碱化6h。将3g环氧丙烷加入上述三口烧瓶中，置于50℃恒温水浴中反应24h。取出产物，将其置于质量比为1:10的盐酸和丙酮的混合液中洗涤5次，再将其置于质量比为 10:1的丙酮和水的混合液中洗涤5次，用真空泵抽滤后，置于45℃真空干燥箱内干燥3 h，取出，得到O-羟丙基壳聚糖(O-HPCS)。取1.5g的O-HPCS置于100mL去离子水中配成溶液，并加入1.0g的聚乙二醇(PEG)和5mL 2％的戊二醛溶液，搅拌15min使其充分混合，静置得到壳聚糖/聚乙二醇水凝胶，记作CS/PEG。
3、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备
将制备好的DCS，置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将壳聚糖/聚乙二醇水凝胶涂抹在脱细胞支架表面，且保证其表面被均匀涂抹三次。并将其取出放置于50℃真空干燥箱中干燥直至完全脱水后取出。得到壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作 CS/PEG/DCS。
4、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备1g/L的肝素和2g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中10min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中10 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡15min，取出用 PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤1次，制得3-He-CS/PEG/DCS。
实施例3制备四层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(4-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)的制备
将置于组织固定液中的犬双侧颈动脉取出并修剪外膜，浸入0.9％的生理盐水中。取0.5g的十二烷基硫酸钠及1.0g的聚乙二醇辛基苯基醚，溶于100mL去离子水中，配成浓度为1.5％的混合溶液，将修剪后的犬双侧颈动脉浸泡在混合溶液中24h。将浸泡后的犬双侧颈动脉取出，用PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中30天，每天更换溶液2次。取出浸泡完的犬双侧颈动脉，修剪成片，在冻干机中-55℃下冷冻干燥8h，得到脱细胞支架，记作DCS。
壳聚糖/聚乙二醇水凝胶的制备及壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备同实施例1。
2、层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备2g/L的肝素和2g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡15min，取出用 PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤2次，制得4-He-CS/PEG/DCS。
实施例4制备四层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(4-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例2。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备1g/L的肝素和2g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤2次，制得4-He-CS/PEG/DCS。
实施例5制备五层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(5-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例1。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备2g/L的肝素和2g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡15min，取出用PBS 缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤3次，制得5-He-CS/PEG/DCS。
实施例6制备五层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(5-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例3。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备1g/L的肝素和1g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/L的PBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中15min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，在重复上述步骤3次，制得5-He-CS/PEG/DCS。
实施例7制备六层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(6-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例1。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备2g/L的肝素和2g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤4次，制得6-He-CS/PEG/DCS。
实施例8制备六层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(6-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例2。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备2g/L的肝素和1g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中30min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤4次，制得6-He-CS/PEG/DCS。
实施例9制备七层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(7-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例1。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备2g/L的肝素和2g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中10min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中15 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中15min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤5次，制得7-He-CS/PEG/DCS。
实施例10制备七层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架(7-He-CS/PEG/DCS)
1、脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)、壳聚糖/聚乙二醇水凝胶和壳聚糖/ 聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架的制备方法同实施例2。
2、利用层层自组装技术将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，制得到高仿生人造血管材料
1)分别制备1g/L的肝素和1g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/LPBS缓冲溶液，将制备好的CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液中10min后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中10 min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，得到一层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记作1-He-CS/PEG/DCS。
2)将制备的1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡10min，取出用 PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的壳聚糖，再将其浸泡在肝素钠溶液中10min，取出用PBS缓冲溶液正面反面各冲洗三次，去除表面由于物理吸附粘附的肝素钠，可得到二层肝素-壳聚糖/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，记做 2-He-CS/PEG/DCS，再重复上述步骤5次，制得7-He-CS/PEG/DCS。
实施例11CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料SEM表征
1、将实施例1制备的脱细胞支架用JSM-7600F型扫描电镜观察其形貌，测试结果如图1所示。图1是脱细胞支架的SEM图，由图1可以看出，经过阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠和非离子型表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚复配处理过的脱细胞支架 (DCS)呈现明显三维网状空间结构，表面无细胞，仅仅存在着少量的细胞碎屑，说明聚乙二醇辛基苯基醚和十二烷基硫酸钠混合溶液具有良好的脱除细胞效果。
2、将实施例1制备的CS/PEG/DCS以及实施例1、实施例3、实施例5、实施例7 和实施例9制备的n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料裁剪成长5mm，宽1mm的长条，用导电胶贴于铜台上，正侧面各喷金6次，用JSM-7600F型扫描电镜、观察其形貌，测试结果如图2所示。图2为CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料2000倍下的SEM图，其中a为CS/PEG/DCS，b为3-He-CS/PEG/DCS，c为 4-He-CS/PEG/DCS，d为5-He-CS/PEG/DCS，e为6-He-CS/PEG/DCS，f为 7-He-CS/PEG/DCS。由图2可以看出，a表面存在着少量的颗粒状物质，这说明壳聚糖已经和PEG水凝胶一起修饰到DCS上了，而随着聚电解质层的增加，b、c、d、e、f上颗粒状的物质数量越来越多，这是说明肝素和壳聚糖已经一层层的通过静电吸附作用吸附到CS/PEG/DCS上了，上述实验结果可以证明n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)已经成功制备。
实施例12对实施例1制备的O-羟丙基壳聚糖(O-HPCS)和壳聚糖/聚乙二醇水凝胶(CS/PEG)进行FT-IR红外分析
将实施例1制备完成的O-HPCS和CS/PEG使用美国Nicolet公司的Nexus670红外光谱仪器进行红外光谱的测试，结果如图3所示。图3为O-HPCS和CS/PEG的FTIR 图，由图3可以发现，分析结果表明O-HPCS的FTIR图和CS/PEG的FTIR图在3400cm-1处出现的强吸收峰是改性过后的壳聚糖上的-OH峰，在2900cm-1的吸收峰处是-CH3、 -CH2的伸缩振动峰，1375cm-1处属于O-H键的弯曲振动，O-HPCS的FTIR图中1065 cm-1、589cm-1处为O-HPCS的结晶敏感峰，而在CS/PEG的FTIR图上，两个结晶峰的强度均有所衰减，且结晶峰位置发生了偏移，这说明聚乙二醇的加入对O-HPCS的晶型结构发生了破坏。因此通过图3的FTIR图我们可以证明CS/PEG已经成功合成。
实施例13实施例1制备CS/PEG/DCS和实施例5制备的5-He-CS/PEG/DCS的X- 射线光电子能谱分析
将实施例1制备CS/PEG/DCS和实施例5制备的5-He-CS/PEG/DCS使用日本理学的D/max 2500VL/PC型X-射线光电子能谱分析仪，在单色Al Kα射线(150W，500μm 束斑)和20eV的能量穿过的条件下对其进行X-射线光电子能谱测试，结果如图4所示。图4是CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS的XPS对比图，其中a是CS/PEG/DCS，b 是5-He-CS/PEG/DCS。由图4可知，b上出现了S2p峰说明5-He-CS/PEG/DCS上存在着 S元素，这是由于5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料上的肝素具有S元素，因此可以证明5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料已经成功制备。
实施例14CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的表面壳聚糖氨基含量测定
1、酸性橙是一种溶于水显橙色的金黄色粉末状固体，含有单个磺酸基的酸性橙在pH＝2～3的条件下可以与材料表面的氨基发生等摩尔的吸附作用，从而可以计算出样品表面的氨基含量。图5是酸性橙标准曲线图，通过制备酸性橙标准溶液，得到了酸性橙标准方程，方程为Y＝1.39048X+0.03774(R2＝0.99411)。如图5所示，由于聚乙二醇和肝素中都不含伯胺而壳聚糖含伯胺，因此可以使用酸性橙来测定样品中的氨基含量，从而来确定人造血管材料中壳聚糖的含量。
2、具体实验步骤如下：
1)标准曲线绘制：在24孔板中，在第一、二个孔中加入浓度为5×10-4mol/L、pH＝12的酸性橙溶液150μL，再向第二个孔中加入150μL pH＝12的溶液等体积稀释第二个孔中的溶液。从第二个孔中取出150μL溶液加入到第三个孔中，并加入150μL pH＝12的去离子水溶液等体积稀释第三个孔中的溶液。依次逐级稀释，直到第七个孔。在第八个空中直接加入50μL pH＝12的去离子水溶液。同时取3组平行样，取平均值。用Bio Tek Synergy2酶标仪测定其在485nm时的吸光度，绘制出实验所需的标准曲线，具体实验结果如图5所示。
2)将CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料浸没在pH＝3、浓度为500μmol/L的酸性橙溶液中。置于摇床上使其充分反应12h后取出，使用pH＝3的溶液反复清洗样品5次以上，之后将其充分干燥。将所得的样品浸入pH＝12的溶液中，置于摇床上使其充分反应30min，释放出靠电荷吸附在样品表面的甲基橙。同时得出甲基橙标准曲线，求得甲基橙表面的吸附含量，具体结果见图6。图6是CS/PEG/DCS和 n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的氨基含量柱状图，由图6可知，由于CS-PEG 水凝胶表面存在着壳聚糖，因此CS/PEG/DCS中存在一定数量的氨基基团，即可以说明 CS-PEG已经成功修饰在DCS表面了。而随着聚电解质的层数的增加，人造血管材料的表面的氨基含量呈现不断增加的趋势，这是由于LbL技术中，肝素和壳聚糖是呈现交叉互穿的结构，因此人造血管材料表显示出氨基含量越来越高的趋势。上述实验结果可以证明，壳聚糖已经成功修饰到材料表面。即n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料已经成功制备。
实施例15CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的静态接触角测定
1、具体实验：将制备好的CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的人造血管材料裁剪为直径为1cm的圆片，使用Krüss公司的DSA100型光学接触角测试仪，以去离子水为测试液，液滴大小约为90μm左右，对各个样品进行静态接触角测试。每个样品测试时均测试3次，取3个平行样。
2、结果分析：图7是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的静态接触角图，其中，a为CS/PEG/DCS，b为3-He-CS/PEG/DCS，c为4-He-CS/PEG/DCS，d为 5-He-CS/PEG/DCS，e为6-He-CS/PEG/DCS，f为7-He-CS/PEG/DCS。从图7中可以看出，CS/PEG/DCS的静态接触角最小，是由于接枝在PEG上的CS是通过NaOH碱化过的壳聚糖，使得-COOH变为-COONa，在水中会转化为极性更强的-COO-，因此其静态水接触角会明显降低；而n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的随着聚电解质层的增加呈现先减后增的趋势，在聚电解质膜达到5层时静态接触角最低，当聚电解质膜多于5层时静态接触角略有上升，表面亲水性略微上升，但总体变化不大，整体均具有亲水表面。5-He-CS/PEG/DCS的接触角最小，表面亲水性最强，达到最好的亲水效果。亲水性强的材料由于在界面上形成水层，有利于去除生物物质，从而具有较好的抗凝血性能。
实施例16新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的拉伸性能和爆破强度测试
1、拉伸性能测试：将新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7) 人造血管材料用切片机裁切成宽3mm，跨度为20mm的哑铃形状测试条。室温下以拉伸速度为20mm/min，使用万能电子拉力机(INSTRON4200型)测试各个样品拉伸性能。每个样品测试时均测试3次，取3个平行样，结果如图8中a和b所示。
2、爆破强度测试：将新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7) 人造血管材料用制备成长为30mm，直径为5mm的圆柱形血管，将一段结扎，另一端链接三通器，三通器两端分别连接加压注入装置与压力测试装置，将37℃生理盐水持续注入样品中，注入速度为3mL/min，样品破裂时记入下压力值，即为爆破强度。每个样品测试时均测试3次，取3个平行样，结果如下图8中c所示。
3、结果分析：图8是新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7) 人造血管材料的拉伸强度、断裂伸长率和爆破强度图。其中，a是新鲜血管、DCS、 CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的拉伸强度图，b是新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的断裂伸长率图， c是新鲜血管、DCS、CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的爆破强度图。从图8中a和b中我们可以看出，DCS与新鲜血管相比而言，其拉伸强度会有所上升，断裂伸长率略微下降，但是两者之间总体来说几乎无明显差异，而通过水凝胶和聚电解质修饰过的DCS，随着聚电解质的层数的增加，拉伸强度呈现逐渐上升的趋势，但仍然与天然血管的拉伸强度接近，而断裂伸长率在5-He-CS/PEG/DCS呈现最佳的趋势，与新鲜血管相比最为接近，上述测试结果表明，通过肝素、壳聚糖和聚乙二醇水凝胶对DCS进行修饰之后，保持了DCS的力学仿生性能，使得制备的仿生人造血管材料，可以满足血流在血管管腔内流动时产生的压强要求。从图8中c可以发现，新鲜动脉血管的爆破强度在110KPa左右，而DCS的爆破强度是0KPa，这是由于DCS去掉了表层的组织细胞，形成了空间网状结构，生理盐水会直接从网状结构中流出，因为 DCS不具备爆破强度。而通过聚电解质和PEG水凝胶修饰过的DCS，将DCS的空间网状结构包埋了起来，其爆破强度会随着聚电解质层的增加而呈现上升的趋势，但各样品均与新鲜动脉血管的爆破强度基本接近。上述测试结果表明，通过肝素、壳聚糖和聚乙二醇水凝胶对DCS进行修饰之后，材料基本保持了DCS的力学仿生性能，使得制备的仿生人造血管材料，可以满足血流在血管管腔内流动时产生的压强要求。
实施例17对制得的人造血管材料进行体外凝血实验和复钙实验
1、体外凝血实验：APTT(活化部分凝血活酶时间)：取待测样品分别与血浆(0.1mL)充分混合，倒入凝血杯中，37℃培养5min后加入APTT试剂，继续培养5min，随后每个凝血杯中加入相同量的氯化钙溶液(0.1mL，0.025mol)，观察37℃时的血液凝固时间，将记录的凝固时间记为APTT值。每个样品试验3次，结果取其平均值。TT(凝血酶时间)：取乏血小板血浆与样品混合均匀，倒入凝血杯中，置于恒温(37℃)水浴中预热 5min后加正常参比血浆的TT，加入凝血酶0.1mL，以出现浑浊为起点，记录血凝时间。重复3次，取其平均值。PT(凝血酶原时间)：取待测样品与血浆充分混合，倒入凝血杯中，37℃培养5min后加入预温的PT试剂，记录血凝时间。重复3次，取其平均值。将CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料裁剪为直径为1cm左右的圆片，与健康兔血血浆混合均匀后，使用酶标仪(BioTeksynergy 2型)进行体外凝血时间测试，结果如图9所示。同时设置对照组(0.1mL血浆+APTT/PT/TT试剂)。
2、复钙实验：将制得的CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料在生理盐水(0.9％)中浸没24h，再将其放置在96孔板中，覆盖在孔板底部，37℃下恒温0.5h。加入预热的贫血小板血浆100μL，随后在96孔板中分别加入0.025mol/L CaCl2溶液，使用酶标仪测其在405nm波长处的O.D.值，重复3次，取其平均值。对照组：100μL CaCl2溶液+100μL血浆。复钙凝血时间实验结果如图9所示。
3、结果分析：图9是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、凝血酶原时间和复钙凝血时间图，其中a是 CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的活化部分凝血活酶时间图， b是CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的凝血酶时间图，c是 CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料的凝血酶原时间图，d是 CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料复钙凝血时间图。由图9中 a～c可知，与CS-PEG水凝胶修饰过的DCS相比，用聚电解质层改性过的人造血管材料的APTT、TT、PT的凝血时间都有一定的延长。这是由于通过层层自主装技术将肝素和壳聚糖通过静电吸附在人造血管材料表面时候，最外层的肝素可以有效提高血液相容性以及抗凝血能力，我们还可以发现在5-He-CS/PEG/DCS的时候APTT、TT、PT的数值均达到了最优值，这是由于肝素和壳聚糖是形成互穿网络结构的，当聚电解质层数增加到一定程度后，表面的肝素的含量反而会呈现下降的趋势。由上述实验结果，可以认为当聚电解质层数为5时，5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料具有最长的体外凝血时间和最佳的抗凝血性能。由图9中d可知，使用了肝素和壳聚糖修饰过的人造血管材料的 T1/2max复钙时间明显延长。这是由于抗凝血酶III(AT III)可以通过于凝血酶的活性中心以底物的形式结构，形成一种不可逆的复合物，从而抑制凝血酶的活性，而在加入肝素的情况下，可以使得整个反应的速度提高千倍以上，从而可以有效地提高了材料的血液相容性，使得复钙凝血时间呈现增加的趋势。实验结果说明使用聚电解质膜改性可以有效延长可溶性的纤维蛋白原转变为可溶性纤维蛋白的时间，从而达到延长血液凝固时间的目的。且从上图还可以看出，在聚电解质层数为5的时候，人造血管材料的T1/2max复钙时间最优异，即当聚电解质层数为5层时，材料具有最长的复钙时间和最佳的抗凝血性能，这是由于肝素和壳聚糖是形成互穿网络结构，当层数小于5的时候，表面肝素含量是随着层数增加呈上升趋势，当聚电解质层数增加到超过5层之后，表面的肝素的含量会呈现下降的趋势，即n为5时表面肝素含量最高，材料具有最长的复钙时间和最佳的抗凝血性能。
实施例18n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)血液相容性测试
1、具体实验：红细胞形貌实验是检验血液相容性的一种方法，将实施例1、3、5、 7、9制备的n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)裁剪为直径约6mm的圆片，分别置入离心管中，每个离心管中加入10mL生理盐水(0.9％)。取5mL的生理盐水与4mL的红细胞悬浊液混合均匀、稀释，得到稀释的红细胞悬浊液。取0.2mL稀释后的红细胞悬浊液分别加入上述离心管中，并充分混匀，再将离心管置于CO2恒温培养箱中恒温 (37℃)培养1h后取出，制成红细胞涂片，在显微镜下观察红细胞的形态。每个样品取3个平行样。同时设置空白对照组：10mL 0.9％生理盐水+0.2mL稀释红细胞悬浊液，实验结果如图10所示。
2、结果分析：图10是n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的红细胞形貌图，其中，a为空白对照组，b为3-He-CS/PEG/DCS，c为4-He-CS/PEG/DCS，d为5-He-CS/PEG/DCS， e为6-He-CS/PEG/DCS，f为7-He-CS/PEG/DCS。由图10可知，当红细胞与本发明中的血管材料接触后，其形态与对照组一致，红细胞形貌良好，均未发现明显变形及破裂情况。结果表明，经肝素和壳聚糖修饰的5-He-CS/PEG/DCS对红细胞几乎无毒性作用，即有良好的血液相容性。
实施例19CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料进行MTT毒性测试
1、具体实验：样品准备：分别取n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料，加入10mL浸取介质(10％胎牛血清)于37℃恒温振荡培养箱内浸取24h。MTT溶液配制：将MTT溶解在PBS中，制成浓度为5mg/mL的MTT溶液。将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，用细胞培养液稀释成浓度为4×104个/mL。取一个96孔培养板，每孔接种 200μL细胞悬浮液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。细胞贴壁后，吸出每孔的原培养液，实验组每孔加入200μL的样品浸取液(每组设置8孔)，同时，在没有细胞的孔板中设置空白对照组加入细胞培养液，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养 12h，24h，48h；之后每孔加入20μL配制的MTT溶液，培养5h后，弃去原液，每孔加入150μL二甲基亚砜，水平震荡5min，用酶标仪(BioTek synergy 2型)测得在 490nm波长处的吸光值O.D.。每样至少测试三次。CS/PEG/DCS的实验同 n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)人造血管材料。
实验组：内皮祖细胞+n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)+MTT。阴性对照组：内皮祖细胞+MTT。空白对照组：MTT。
结果计算：
式中：Dt—实验组样品吸光度；Dnc—阴性对照组样品吸光度；Db—空白对照组样品吸光度。实验结果如图11所示。
2、结果分析：图11为CS/PEG/DCS和n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的MTT测试结果。由图11可知，在12h时，CS/PEG/DCS的细胞存活率为97％，细胞毒性为1级，而在同一时间，n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的细胞存活率在98％-101％之间，细胞毒性为0级和1级，与CS/PEG/DCS相比，虽然n-He-CS/PEG/DCS的细胞存活率更高，但是其细胞毒性数值接近，不同的人造血管材料之间的细胞存活率差异较小。这是由于CS-PEG 水凝胶的生物相容性较为良好且细胞毒性较小，在短期的培养过程中，可以保证细胞的正常生存。而随着培养时间的增长，在24h时，CS/PEG/DCS的细胞存活率为92％，细胞毒性为1级；而n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)的细胞存活率却在104％-114％，其细胞毒性为0级。在48h时，CS/PEG/DCS的细胞相容性与n-He-CS/PEG/DCS(n＝3～7)之间的差异更大。以上实验结果证明，虽然CS-PEG水凝胶具有一定程度的细胞相容性，但是聚电解质的表面改性可以显著提高细胞相容性，且对较长时间的细胞相容性提升作用更为明显。对比不同聚电解质层数样品的48h细胞存活率实验结果。可以看出，在聚电解质层数3-5层时，细胞存活率由108％，增加至118％，呈上升趋势；而当聚电解质层数为7层时，细胞存活率则为111％，相比与聚电解质为5层时略有下降，但差异较小。上述实验结果表明当聚电解质层数为5时，人造血管材料具有最佳的细胞相容性。
实施例20CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料的体外降解实验
1、具体实验：由上认为当聚电解质层数为5时，即5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料具有最佳的综合性能。在后续的研究中，将以5-He-CS/PEG/DCS作为研究对象进行测试研究。把CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料裁剪成10mmx10mm的正方形状，用电子天平称量其重量为m0，将其放入离心管中，加入20mL PBS溶液，将其置于37℃恒温摇箱中，培育1d，7d，14d，30d，60d，90d，120d，180d，每周用新鲜的PBS缓冲液替换，将培育后的人造血管材料取出，放入真空干燥箱中50℃烘干，用电子天平称量其重量为m1，重量损失结果计算：Weight loss(％)＝(m0-m1)/m0×100％。结果如图12所示。
2、结果分析：图12为CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料的体外降解速率图，由图12可知，随着时间的增长，CS/PEG/DCS和5-He-CS/PEG/DCS的体外降解速率呈现从快到慢的趋势；在180天时，CS/PEG/DCS的剩余质量为33.7％，而 5-He-CS/PEG/DCS的剩余质量为44.2％。两者之间的体外降解周期及血管再生周期基本匹配，这说明了两者均具有良好的降解速度匹配性，其作为人造血管材料可以实现降解周期，与新血管的再生周期良好匹配，达到良好的仿生效果。
实施例21制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA1/DCS
1、脱细胞支架的制备
将置于组织固定液中的犬双侧颈动脉血管取出并修剪外膜，浸入0.9％的生理盐水中清洗。将清洗后的犬双侧颈动脉血管取出，放入1％聚乙二醇辛基苯基醚和0.5％十二烷基硫酸钠混合溶液中室温浸泡48h；将浸泡后的犬双侧颈动脉血管取出，用 0.01mol/L的PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中30天，每天更换溶液2次。取出浸泡完的犬双侧颈动脉血管，修剪成片，在冻干机中于-55℃冷冻干燥12h，得到脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)，记作DCS。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入6g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为0.5％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA1。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经40℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理2h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA1/DCS。
实施例22制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA2/DCS
1、脱细胞支架的制备
将置于组织固定液中的犬双侧颈动脉血管取出并修剪外膜，浸入0.9％的生理盐水中清洗。将清洗后的犬双侧颈动脉血管取出，放入0.5％聚乙二醇辛基苯基醚和0.5％十二烷基硫酸钠混合溶液中室温浸泡24h；将浸泡后的犬双侧颈动脉血管取出，用 0.01mol/L的PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中20天，每天更换溶液2次。取出浸泡完的犬双侧颈动脉血管，修剪成片，在冻干机中于-45℃冷冻干燥12h，得到脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)，记作DCS。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量10g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为1％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA2。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经40℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％肝素钠水溶液中，得到缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将到缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理2h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA2/DCS。
实施例23制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA3/DCS
1、脱细胞支架的制备
将置于组织固定液中的犬双侧颈动脉血管取出并修剪外膜，浸入0.9％的生理盐水中清洗。将清洗后的犬双侧颈动脉血管取出，放入1％聚乙二醇辛基苯基醚和0.5％十二烷基硫酸钠混合溶液中室温浸泡24h；将浸泡后的犬双侧颈动脉血管取出，用 0.01mol/L的PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中20天，每天更换溶液1次。取出浸泡完的犬双侧颈动脉血管，修剪成片，在冻干机中于-55℃冷冻干燥8h，得到脱细胞支架(Decellularizedscaffold，DCS)，记作DCS。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入6g甲醛和12g浓度为3％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA3。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经40℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理2h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA3/DCS。
实施例24制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA4/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例21。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为5％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA4。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经60℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理2h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA4/DCS。
实施例25制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA5/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例21。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为7％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA5。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经40℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，50℃处理2 h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA5/DCS。
实施例26制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA6/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例22。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为9％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA6。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经60℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理2h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA6/DCS。
实施例27制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA4/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例22。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入10g聚乙烯醇和180mL水，加热至95℃使其溶解；加入6g甘油，继续加热1h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为5％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在40℃处理3h,60℃处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗1h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA4。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经50℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为2％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，50℃处理2h，再升温至70℃继续处理1h，冷却后取出，浸泡冲洗1h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA4/DCS。
实施例28制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA5/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例22。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至100℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热0.5h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为7％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在40℃处理2h、60℃各处理1h，冷却后取出，浸泡冲洗1h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA5。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经60℃烘箱干燥2h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为2％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理1h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA5/DCS。
实施例29制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA3/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例21。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至90℃使其溶解；加入3g甘油，继续加热1h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为3％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在40℃、70℃各处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗1h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA3。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经40℃烘箱干燥3h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为1％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，50℃处理2h，再升温至70℃继续处理1h，冷却后取出，浸泡冲洗1h，除净杂质，得到肝素- 聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA3/DCS。
实施例30制备肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA6/DCS
1、脱细胞支架的制备同实施例21。
2、缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备
在500mL三颈烧瓶中，加入一定量6g聚乙烯醇和180mL水，加热至100℃使其溶解；加入4g甘油，继续加热1h；降温至30℃左右，加入4g甲醛和12g浓度为9％的戊二醛，搅拌均匀，制得缩醛化的聚乙烯醇；将缩醛化的聚乙烯醇均匀的铺满玻璃皿的底部，放于烘箱分别在60℃处理3h、70℃处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗0.5h，除净杂质；得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶，记作PVA6。
3、缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物的制备
将缩醛化的聚乙烯醇水凝胶铺于玻璃皿中经50℃烘箱干燥3h得到缩醛化的聚乙烯醇膜，将缩醛化的聚乙烯醇膜浸泡在浓度为2％的肝素钠水溶液中，得到缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物。
4、肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架的制备
将缩醛化的肝素-聚乙烯醇复合物均匀涂覆在脱细胞支架上，置于烘箱，60℃处理2 h，再升温至70℃继续处理2h，冷却后取出，浸泡冲洗1h，除净杂质，得到肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架，记作He/PVA6/DCS。
实施例31缩醛化的聚乙烯醇水凝胶扫描电镜测试
将实施例21～实施例26获得的一系列不同缩醛化的聚乙烯醇水凝胶(PVAn，n＝1～6) 真空干燥后用扫描电镜观察其外貌形态及特征，如图13所示。图13为不同缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVAn(n＝1～6)电镜图，其中，a为实施例21得到的缩醛化聚乙烯醇水凝胶PVA1，其中戊二醛浓度为0.5％；b实施例22得到的缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVA2，其中戊二醛浓度为1％；c实施例23得到的缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVA3，其中戊二醛浓度为3％；d实施例24得到的缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVA4，其中戊二醛浓度为5％； e实施例25得到的缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVA5，其中戊二醛浓度为7％；f实施例 26得到的缩醛化的聚乙烯醇水凝胶PVA6，其中戊二醛浓度为9％。由图13可知，a、b 和c中戊二醛浓度为0.5％、1％和3％时，聚乙烯醇水凝胶膜的表面不平滑，这是由于缩醛化反应不完全所致。当戊二醛浓度为5％时即图d，得到的聚乙烯醇膜表面较光滑平整，说明戊二醛浓度为5％时，得到的聚乙烯醇水凝胶膜较好；当戊二醛浓度大于5％时，即浓度到达7％时即图e，聚乙烯醇膜的表面开始出现胶凝现象，当浓度为9％时即图f，膜表面胶凝现象明显，说明在此浓度下，聚乙烯醇分子间交联增多，导致水凝胶膜的脆性增加，柔韧性不够，不能达到我们所期望的要求。由上述结果可知，当戊二醛浓度为5％时，缩醛化制得的聚乙烯醇水凝胶膜最好。
实施例32肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架材料He/PVA4/DCS表面覆膜进行红外表征
将实施例24获得的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架材料He/PVA4/DCS表面覆膜进行红外表征结果如图14所示。图14为肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVA4/DCS红外谱图，由图14可知，在1250cm-1附近的几条强吸收峰，是缩醛(C＝O＝C)的特征峰，其中 1150～1050cm-1的强吸收峰对应饱和脂肪醚(C-O-C)的反对称伸缩振动峰，是特征鉴别。由此可知，聚乙烯醇确实发生了缩醛化反应。在3400～3200cm-1附近有一个宽峰，对应多聚体间缔合氢键的特征峰，游离-OH平面变角在1250cm-1出现振动吸收峰，在 1500～1300cm-1对应-OH氢键缔合特征峰。通过以上结果，可看到只有部分的羟基进行缩醛化反应，体系中仍然有一部羟基是以多聚体分子间缔合氢峰形式存在，少量羟基以游离形式存在。
实施例33不同浓度缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6，即对应实施例21～26产物)表面覆膜进行扫描电镜表征
将实施例21～实施例26获得的不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)表面覆膜进行扫描电镜表征，结果如图15所示。图15为不同缩醛化程度的的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)的SEM图，其中， a为He/PVA1/DCS；b为He/PVA2/DCS；c为He/PVA3/DCS；d为He/PVA4/DCS；e为 He/PVA5/DCS；f为He/PVA6/DCS。由图15可知，a中表面键合的肝素较少，b～f中随着戊二醛浓度及缩醛化程度增加，其表面键合的肝素量也随之增加；但是从e开始出现胶凝现象且有细小裂纹出现，且f更严重，综上所述，d中戊二醛浓度为5％时，材料表面展现的性能良好，此时水凝胶性能较好，与键合肝素前的结果相符。
实施例34实施例24制备的PVA1/DCS和He/PVA4/DCS的X-射线光电子能谱分析
将实施例24制备PVA1/DCS和He/PVA4/DCS使用日本理学的D/max 2500VL/PC 型X-射线光电子能谱分析仪，在单色Al Kα射线(150W，500μm束斑)和20eV的能量穿过的条件下对其进行X-射线光电子能谱测试，结果如图16所示。图16是PVA1/DCS 和He/PVA4/DCS的XPS对比图，其中a是PVA1/DCS，b是He/PVA4/DCS。由图16可知，b上出现了S2p峰说明He/PVA4/DCS上存在着S元素，这是由于He/PVA4/DCS人造血管材料上的肝素具有S元素，因此可以证明He/PVA4/DCS人造血管材料已经成功制备。
实施例35对新鲜血管、脱细胞支架和不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架 He/PVAn/DCS(n＝1～6)进行机械性能拉伸度强度和断裂伸长率及爆破强度的表征
对新鲜血管、脱细胞支架、实施例21～实施例26获得的不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)进行机械性能拉伸度强度和断裂伸长率及爆破强度的表征的具体实验操作步骤同实施例16，具体结果如图17所示。图17是新鲜血管、DCS及He/PVAn/DCS(n＝1～6)的拉伸强度、断裂伸长率和爆破强度图。其中，a 为新鲜血管、DCS及He/PVAn/DCS(n＝1～6)拉伸强度图，b为新鲜血管、DCS及 He/PVAn/DCS(n＝1～6)断裂伸长率图。c为新鲜血管、DCS及He/PVAn/DCS(n＝1～6) 爆破强度图。其中，Fresh bloodvessel为新鲜血管，DCS为脱细胞血管支架。由图a和b可知，与新鲜血管相比，DCS的拉伸性能略有上升，断裂伸长率稍有增加，但总体来说两者差异较小。而经不同缩醛化程度的聚乙烯醇覆膜后，DCS的拉伸性能稍稍下降，其断裂伸长率显著增加。此现象表明，缩醛化的聚乙烯醇可显著改善血管材料的断裂伸长率。其中，随着戊二醛浓度的增加，其血管材料的拉伸强度和断裂伸长率均随之增大，在浓度为5％时达到最佳。而当浓度增加到7％和9％时，其对应血管材料的拉伸强度和断裂伸长率均有所降低，与前期实验结果一致。对比不同缩醛化程度样品He/PVAn/DCS (n＝1～6)，其拉伸强度和断裂伸长率几乎没有差异。上述结果表明，通过PVA覆膜、肝素沉聚后，并没有明显改变DCS的拉伸强度和断裂伸长率，仍然保证了其自身的机械性能。由图c可以发现，新鲜动脉血管的爆破强度在110KPa左右，而DCS的爆破强度是0KPa，这是由于DCS去掉了表层的组织细胞，形成了空间网状结构，生理盐水会直接从网状结构中流出，因为DCS不具备爆破强度。而通过肝素和PVA水凝胶修饰过的DCS，将DCS的空间网状结构包埋了起来，其爆破强度会随着聚电解质层的增加而呈现上升的趋势，但各样品均与新鲜动脉血管的爆破强度基本接近。上述测试结果表明，通过肝素和PVA水凝胶对DCS进行修饰之后，材料基本保持了DCS的力学仿生性能，使得制备的人造血管材料，可以满足血流在血管管腔内流动时产生的压强要求。
实施例36不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架人造血管材料He/PVAn/DCS (n＝1～6)的体外凝血实验和复钙化凝血时间测试
不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架人造血管材料He/PVAn/DCS(n＝1～6) 的体外凝血实验和复钙化凝血时间测试具体实验步骤同实施例17，具体结果如图18所示。图18是He/PVAn/DCS(n＝1～6)人造血管材料的活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、凝血酶原时间和复钙凝血时间图，其中，a是He/PVAn/DCS(n＝1～6)人造血管材料的活化部分凝血活酶时间图，b是He/PVAn/DCS(n＝1～6)人造血管材料的凝血酶原时间图，c是He/PVAn/DCS(n＝1～6)人造血管材料的凝血酶时间图，d是He/PVAn/DCS (n＝1～6)人造血管材料复钙凝血时间图。由图18中a-c可知，与对照组相比，用肝素和聚乙烯醇改性过的人造血管材料的APTT、TT、PT的凝血时间都有一定的延长。这是由于肝素可以有效提高血液相容性以及抗凝血能力，我们还可以发现He/PVA4/DCS 的时候APTT、TT、PT的数值均达到了最优值，由上述实验结果，可以认为当n＝4时， He/PVA4/DCS人造血管材料具有最长的体外凝血时间和最佳的抗凝血性能。在去钙离子的抗凝血浆中，再次加入适量的钙离子后，血浆发生凝固所经历的时间称为复钙时间。血浆钙化所需时间越久，表明其血液相容性越好。由图18中d可以看出，与对照组相比，肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架人造血管材料的T1/2max复钙时间明显延长，由10.5min 增加到18.2min～23.8min之间，复钙凝血时间明显延长。实验结果表明，肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架可以延长可溶性纤维蛋白原转变为可溶性纤维蛋白的时间，因而使血液凝固时间延长。这可以认为是由于肝素可以与抗凝血酶Ⅲ结合、因而可以抑制凝血酶发挥凝血功能，进而提高材料的血液相容性，促使复钙凝血时间延长。当n＝4时(实施例24 的产物)，He/PVA4/DCS的T1/2max复钙时间最长。由此可以认为，He/PVA4/DCS复钙时间最长。即当戊二醛浓度为5％，材料抗凝血改性效果最佳。
实施例37不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)血液相容性测试
不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)血液相容性测试的具体实验步骤同实施例18，实验结果如图19所示。图19为He/PVAn/DCS(n＝1～6)的红细胞形貌图，其中，a为对照组，b为He/PVA1/DCS，c为He/PVA2/DCS，d为 He/PVA3/DCS，e为He/PVA4/DCS,f为He/PVA5/DCS，g为He/PVA6/DCS。由图19 可知，当红细胞与本发明中的血管材料接触后，其形态与对照组一致，红细胞形貌良好，均未发现明显变形及破裂情况。结果表明，经肝素修饰的PVAn/DCS对红细胞几乎无毒性作用，即有良好的血液相容性。
实施例38不同缩醛化程度的肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6)进行MTT细胞毒性试验
1、具体实验：样品准备：分别取肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架He/PVAn/DCS(n＝1～6) 血管材料，加入10mL浸取介质(10％胎牛血清)于37℃恒温振荡培养箱内浸取24h。 MTT溶液配制：将MTT溶解在PBS中，制成浓度为5mg/mL的MTT溶液。将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，用细胞培养液稀释成浓度为4×104个/mL。取一个96孔培养板，每孔接种200μL细胞悬浮液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。细胞贴壁后，吸出每孔的原培养液，实验组每孔加入200μL的样品浸取液(每组设置8孔)，同时，在没有细胞的孔板中设置空白对照组加入细胞培养液，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h，24h；之后每孔加入20μL配制的MTT溶液，培养5h后，弃去原液，每孔加入150μL二甲基亚砜，水平震荡5min，用酶标仪(BioTek synergy 2型) 测得在490nm波长处的吸光值O.D.。每样至少测试三次。实验组：内皮祖细胞+ He/PVAn/DCS(n＝1～6)+MTT。阴性对照组：内皮祖细胞+MTT。空白对照组：MTT。
结果计算：
式中：Dt—实验组样品吸光度；Dnc—阴性对照组样品吸光度；Db—空白对照组样品吸光度。实验结果如图20所示。
2、结果分析：MTT法是检测细胞存活情况的一种常用方法，活细胞的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成不溶与水的蓝紫色结晶甲臢，而死亡的细胞并没有此功能。甲臢的量可用酶标仪在490nm处的光吸收值来表示，进而推测出活细胞的数量，若细胞数目多则测得的吸光度会稍大，细胞数目少或状态不好时，吸光度值会低些，从吸光度大小可判断出材料毒性的大小。图20为He/PVAn/DCS(n＝1～6)的MTT测试图。由图20 可知，在12h时，He/PVAn/DCS(n＝1～3)中DCS的细胞存活率达到95％～98％，细胞毒性为1级，但细胞存活率随戊二醛浓度增加而增加；He/PVAn/DCS(n＝4～6)中DCS 的细胞存活率达到100％～105％，细胞毒性为0级，但细胞存活率随戊二醛浓度增加而减小，He/PVA4/DCS的细胞存活率最高，为105％，细胞毒性最小，且不同缩醛化程度 He/PVAn/DCS(n＝1～6)样品之间的细胞存活率差异较小。n＝4,即戊二醛浓度为5％细胞存活率较大，与前期相容性实验结果一致。由上可知，当n为4时，即使用戊二醛浓度为5％进行缩醛化时得到的He/PVA4/DCS具有最佳的综合性能。
实施例39PVA/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料的体外降解实验
1、具体实验：由上认为当n＝4时，即He/PVA4/DCS人造血管材料具有最佳的综合性能。在后续的研究中，将以He/PVA4/DCS作为研究对象进行测试研究。把PVA/DCS 和He/PVA4/DCS人造血管材料裁剪成10mmx10mm的正方形，用电子天平称量其重量为m0，将其放入离心管中，加入20mL PBS溶液，将其置于37℃恒温摇箱中，培育1、 3、7、14、21、60、90、120和180天，每周用新鲜的PBS缓冲液替换，将培育后的人造血管材料取出，放入真空干燥箱中50℃烘干，用电子天平称量其重量为m1，重量损失结果计算：Weight loss(％)＝(m0-m1)/m0×100％，结果如图21所示。
2、结果分析：图21为PVA/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料的体外降解速率图，由图21可知，随着时间的增长，PVA/DCS和He/PVA4/DCS的体外降解速率呈现从快到慢的趋势；在180天时，PVA/DCS的剩余质量为37.9％，而He/PVA4/DCS的剩余质量为40.4％。两者之间的体外降解周期及血管再生周期基本匹配，这说明了两者均具有良好的降解速度匹配性，其作为人造血管材料可以实现降解周期，与新血管的再生周期良好匹配，达到良好的仿生效果。
实施例40n-He-CS/PEG/DCS、He/PVA4/DCS与He-Ch-5/PU/DCS的对比实验
1、制备He-Ch-5/PU/DCS：在前期研究中制备了He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料，其具体制备步骤如下：脱细胞支架(Decellularized scaffold，DCS)的制备方法同实施例1。将DCS浸泡在pH＝7.4的PBS中30min。将5.0g聚氨酯(PU)溶于50mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下得到0.1g/mL的PU溶液。将该PU溶液浸涂在DCS上，并重复三次浸涂，在真空干燥箱中于60℃烘干12h得到PU/DCS。分别制备1g/L的肝素和1g/L的壳聚糖溶液以及0.01mol/L的PBS缓冲溶液。PU/DCS在PBS缓冲溶液中浸泡30min，然后在肝素溶液中浸泡15min，获得He/PU/DCS。He/PU/DCS用PBS缓冲溶液洗涤，去除物理吸附在其表面的肝素钠。He/PU/DCS在壳聚糖溶液中浸泡15min 后，用PBS缓冲溶液洗涤，去除其表面物理吸附的壳聚糖，得到He-Ch-2/PU/DCS人造血管材料。同样，将He-Ch-2/PU/DCS血管材料在肝素和壳聚糖溶液中重复浸泡3次后制得He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料。
2、性能测试：采用力学拉伸试验设备(型号CMT6103，中国MTS)，试验速度为 10mm/min(n＝5)，检测新鲜血管、He-Ch-5/PU/DCS、He/PVA4/DCS和5-He-CS/PEG/DCS (50mm×20mm×1mm)的拉伸性能。根据试验得到的载荷与伸长数据绘制了应力-应变曲线，结果如图24所示。
3、结果分析：图24为新鲜血管、He-Ch-5/PU/DCS、He/PVA4/DCS和 5-He-CS/PEG/DCS应力-应变曲线图，其中图a为新鲜血管的应力-应变曲线，图b为 5-He-CS/PEG/DCS的应力-应变曲线，图c为He-Ch-5/PU/DCS的应力-应变曲线，d为 He/PVA4/DCS的应力-应变曲线。由图a和b可知，经水凝胶及壳聚糖肝素改性后的 5-He-CS/PEG/DCS血管材料，保持与新鲜血管相似的应力-应变曲线，这是由于PEG水凝胶具有较小的模量，不会对脱细胞支架的力学性能造成大的影响。从而可以保证所制备的血管材料保持与新鲜血管相匹配的力学性能。由图c可知，由于PU具有较高的弹性模量，对脱细胞支架进行覆膜改性后，会对脱细胞支架的力学性能造成较大改变，应力及应变均有大幅度提升，但是应力-应变曲线与新鲜血管相差较大；由图d可知，PVA 水凝胶覆膜后，He/PVA4/DCS具有较好的弹性和拉伸性能，同时应力应变曲线与新鲜血管相差不大，因此可认为He-Ch-5/PU/DCS无法实现与新鲜血管相匹配的机械性能，而水凝胶保持了与新鲜血管相匹配的机械性能，因而可认为He/PVA4/DCS和5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料具有较好的力学仿生性能，有望保持植入部位的长期通畅。
实施例41 5-He-CS/PEG/DCS和He/PVA4/DCS用于动物实验研究
1、具体实验：选用月龄为一个月且生长良好的香猪为实验对象，在标准状况下饲养 4周后开始实验。对照组：2只小香猪，颈动脉植入膨体聚四氟乙烯人造血管，实验组： 2只小香猪，颈动脉植入5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料，2只小香猪，颈动脉植入 He/PVA4/DCS人造血管材料；对比例实验：2只小香猪，颈动脉分别植入He-Ch-5/PU/DCS 人造血管材料。在植入本发明所合成的人造血管材料后，两周后进行B超监测。B超超声波检查是超声波检查的一种方式，是一种非手术的诊断性检查。在人体软组织以及血流动力学方面有着独到之处。在术后2周左右，使用美国SonoSite公司的L38e/10-5MHz 全数字彩色多普勒超声对小香猪的人造血管材料植入位置进行B超分析，观察血管内血流通畅情况，血管有无闭塞、扩张等情况，具体结果如图22所示。
2、结果分析：图22是5-He-CS/PEG/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料植入体内两周后的B超图，其中a为对照组膨体聚四氟乙烯人造血管，b为实验组 5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料，c为对比例He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料,d为 He/PVA4/DCS人造血管材料。图中有红色的区域代表有血流通过。图22中a膨体聚四氟乙烯人造血管材料植入位置有断断续续的血流通过，说明该处的人造血管材料已经形成血栓，导致该处的血流流通不畅，由此说明膨体聚四氟乙烯人造血管材料在猪体内无法起到替代正常血管的作用；而图22中b、c及d的植入位置呈现明显的红色，说明三种人造血管材料位置未形成血栓。对比三种不同的人造血管材料的B超图，可以明显的发现5-He-CS/PEG/DCS、He/PVA4/DCS人造血管材料及对比例He-Ch-5/PU/DCS的人造血管材料不易形成血栓，具有更好的血液相容性，可以替代正常血管的作用。
实施例42将实施例41中植入对照组膨体聚四氟乙烯人造血管和实验组 5-He-CS/PEG/DCS、He/PVA4/DCS人造血管材料及对比实验He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料五个月后，进行CTA检测
1、具体实验：CT血管造影(CTA，CT angiography)是将CT增强技术与薄层、大范围、快速扫描技术相结合，通过合理的后处理，清晰显示全身各部位血管细节。将实施例41中植入对照组膨体聚四氟乙烯人造血管和实验组5-He-CS/PEG/DCS、He/PVA4/DCS 人造血管材料及对比实验He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料五个月后，使用CT血管造影技术对其进行断面扫描观察，观察植入部位的血液流通情况，观察其通畅率，结果如图 23所示。
2、结果分析：图23是5-He-CS/PEG/DCS和He/PVA4/DCS人造血管材料植入体内 5个月后植入部位的CTA图，其中，a为对照组膨体聚四氟乙烯人造血管，b为实验组 5-He-CS/PEG/DCS人造血管材料，c为对比实验He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料，d为 He/PVA4/DCS人造血管材料。CTA是血管造影技术，通过构建血流的3D模型，可以很直观的观察血液的流动情况。从图23中a可以看出，经膨体聚四氟乙烯人造血管材料植入后，血管出现堵塞情况，植入位置仅有少量血液流通，但从原血管的侧面生长出新的支脉来；图23中b、c及d显示植入部位仅有轻微突起，且血液流通顺畅，无阻塞现象。说明5-He-CS/PEG/DCS、He/PVA4/DCS及He-Ch-5/PU/DCS人造血管材料可以起到天然血管的替代作用，是性能优异的血管替代材料。
Claims (11)
1.水凝胶在制备高仿生人造血管材料中的应用，其特征在于，所述的水凝胶为壳聚糖/聚乙二醇水凝胶或缩醛化的聚乙烯醇水凝胶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖/聚乙二醇水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)配置NaOH水溶液，再加入无水乙醇，得到NaOH溶液；
(2)在NaOH溶液中边搅拌边加入壳聚糖，让其碱化；
(3)再加入环氧丙烷，置于恒温水浴中反应，得到产物；
(4)取出产物，将其置于盐酸和丙酮的混合液中洗涤，再将其置于丙酮和水的混合液中洗涤，真空抽滤，真空干燥，得到O-HPCS；
(5)配置O-HPCS水溶液，并加入聚乙二醇和戊二醛溶液，搅拌混合，静置得到壳聚糖/聚乙二醇水凝胶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述NaOH溶液的质量浓度6％～8％；步骤(2)中，所述NaOH溶液与壳聚糖的液固比为10～12mL：g，所述的碱化时间为6～8h；步骤(3)中，所述的反应时间为24～36h；步骤(4)中，所述盐酸和丙酮的混合液中盐酸与丙酮的质量比为1:10～1:9，所述丙酮和水的混合液中丙酮与水的质量比9:1～10:1，所述真空干燥的温度为45～55℃，真空干燥时间为2～3h；步骤(5)中，所述聚乙二醇与戊二醛的固液比为0.1～0.2g：mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缩醛化的聚乙烯醇水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)聚乙烯醇与水混合，加热溶解；
(2)加入甘油，继续加热；
(3)降温，分别加入甲醛和戊二醛，搅拌均匀，得到缩醛化的聚乙烯醇；
(4)将缩醛化的聚乙烯烘干，再升温继续干燥，冷却，用水浸泡冲洗，得到缩醛化的聚乙烯醇水凝胶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚乙烯醇与水的质量比为1:30～5:90，所述加热的温度为90～100℃；步骤(2)中，所述甘油与聚乙烯醇的质量比为1：1～2，所述继续加热的时间为0.5h～1h；步骤(3)中，所述甲醛、戊二醛与聚乙烯醇的质量比为2:6:3～2:6:5，所述戊二醛的浓度为0.5～9％；步骤(4)中，所述烘干温度为40～60℃，烘干时间为2～3h，所述再升温的温度为60～70℃，继续干燥的时间为1～2h，所述浸泡冲洗时间为0.5～1h。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述高仿生人造血管材料的制备方法包括以下步骤：
(1)制备壳聚糖/聚乙二醇水凝胶；
(2)将壳聚糖/聚乙二醇水凝胶涂抹在脱细胞支架表面，得到壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架CS/PEG/DCS；
(3)利用层层自组装方法将肝素沉聚在壳聚糖/聚乙二醇/脱细胞支架表面，真空干燥，得到高仿生人造血管材料n-He-CS/PEG/DCS。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述的层层自组装方法为浸泡提拉法，包括以下步骤：
(3.1)分别配置肝素钠溶液和壳聚糖溶液；
(3.2)将CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液浸泡后取出，将其浸泡在肝素钠溶液中，取出用PBS缓冲溶液正面和反面冲洗，得到1-He-CS/PEG/DCS；
(3.3)将1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡，取出用PBS缓冲溶液正面反面冲洗，再将其浸泡在肝素钠溶液中，取出用PBS缓冲溶液正面反面冲洗，得到2-He-CS/PEG/DCS；
(3.4)重复(3.3)中步骤，制备成多层肝素/聚乙二醇水凝胶/脱细胞支架，得到n-He-CS/PEG/DCS。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3.1)中，所述肝素钠溶液的浓度为1～2g/L，壳聚糖溶液的浓度为1～2g/L，所述壳聚糖与肝素钠的质量比为1：1～2；步骤(3.2)中，所述CS/PEG/DCS置于PBS缓冲溶液浸泡是时间为10～30min，浸泡在肝素钠溶液中的时间为10～15min；步骤(3.3)中，所述1-He-CS/PEG/DCS置于制备好的壳聚糖溶液中浸泡时间为10～15min，浸泡在肝素钠溶液的时间为10～15min，步骤(3.4)中，所述n-He-CS/PEG/DCS中的n为3～7。
9.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述高仿生人造血管材料的制备方法包括以下步骤：
(1)制备不同缩醛化的聚乙烯醇水凝胶；
(2)制备不同缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物；
(3)将不同缩醛化肝素-聚乙烯醇复合物涂抹在脱细胞支架表面，得到不同缩醛化肝素-聚乙烯醇/脱细胞支架，即高仿生人造血管材料He/PVAn/DCS。
10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于，所述脱细胞支架的制备方法包括以下步骤：
(1)将置于组织固定液中的血管取出并修剪外膜，浸入在生理盐水中；
(2)配置十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的混合溶液，将修剪后的血管浸泡在混合溶液中；
(3)将浸泡后的血管取出，用PBS缓冲溶液冲洗，并浸泡在PBS缓冲溶液中，每天更换PBS缓冲溶液；
(4)取出浸泡完的血管，修剪成片，冷冻干燥，得到脱细胞支架DCS。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述十二烷基硫酸钠与聚乙二醇辛基苯基醚质量比为1:1～1:2，所述浸泡在混合溶液中时间为24～48h；步骤(3)中，所述浸泡在PBS缓冲溶液中时间为20～30天，所述每天更换PBS缓冲溶液的次数为1～2次；步骤(4)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-55℃，冷冻干燥时间为8～12h。
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2021
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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