CN115211404B - 一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法 - Google Patents
一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115211404B CN115211404B CN202210859128.8A CN202210859128A CN115211404B CN 115211404 B CN115211404 B CN 115211404B CN 202210859128 A CN202210859128 A CN 202210859128A CN 115211404 B CN115211404 B CN 115211404B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- pumpkin seed
- freeze
- solution
- mice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 147
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 241000408747 Lepomis gibbosus Species 0.000 title claims abstract description 126
- 235000020236 pumpkin seed Nutrition 0.000 title claims abstract description 126
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 89
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims abstract description 83
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims abstract description 83
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims abstract description 51
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 43
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 40
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 claims abstract description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 27
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 12
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003517 fume Substances 0.000 claims description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 46
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 abstract description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 11
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 abstract description 9
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000007815 allergy Effects 0.000 abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 abstract description 4
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 124
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 42
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 17
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 17
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 17
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 16
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 3
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004913 chyme Anatomy 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 2
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSFODEXXVBBYOC-UHFFFAOYSA-N 8-[4-(dimethylamino)butan-2-ylamino]quinolin-6-ol Chemical compound C1=CN=C2C(NC(CCN(C)C)C)=CC(O)=CC2=C1 BSFODEXXVBBYOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 101100082036 Danio rerio pou3f3a gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 206010034829 Pharyngeal oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 208000011318 facial edema Diseases 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000007661 gastrointestinal function Effects 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- -1 salt ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/02—Breeding vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/50—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for rodents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D7/00—Devices or methods for introducing solid, liquid, or gaseous remedies or other materials into or onto the bodies of animals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Birds (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本申请公开了一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，属于动物医学领域。该模型的构建方法包括：将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液。蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉。将冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液。将冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液。将多只3‑4周龄的BALB/c小鼠适应性喂养3周，于21，28，35，42，49，56天分别对每只小鼠经腹腔注射150μL致敏液致敏小鼠。第62天给每只小鼠灌胃含有8mg‑10mg南瓜籽蛋白的缓冲液。该模型不仅能够全面表现人类南瓜籽蛋白过敏的典型特征，而且还能提供多次采血机会和大量过敏血清，为食品/药品的安全性评价提供技术支撑，为食物过敏机制研究奠定基础。
Description
技术领域
本申请涉及动物医学技术领域，尤其涉及一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法。
背景技术
南瓜籽是消费者喜爱的植物种籽坚果，其蛋白含量高达35％，蛋白质中必需氨基酸比例与人体所需要的氨基酸模式相似。南瓜籽蛋白作为食品加工中一种理想的基础原料，已广泛应用于酱油、饮料、饼干和火腿肠等食品的生产。但是，南瓜籽蛋白也具有致敏性风险，研究表明，南瓜籽蛋白与芝麻、核桃、荞麦籽等种籽储存蛋白间存在交叉致敏特性。过敏患者在摄入南瓜籽蛋白后可引起头晕、呕吐、面部和咽部水肿等症状，严重时引发哮喘和死亡。
为了保障食品安全，需要对南瓜籽蛋白过敏的发生机制及控制策略进行研究，而致敏动物模型是深入研究过敏机制的基础工具。因此，构建一个既能全面表现人类南瓜籽蛋白过敏典型特征、又能提供大量过敏血清以满足研究需求的动物模型迫在眉睫。
发明内容
本申请实施例的目的在于构建一个既能全面表现人类南瓜籽蛋白过敏典型特征、又能提供大量过敏血清以满足研究需求的动物模型。
本发明实施例提供了一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，包括：
将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液；
将所述蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉；
将所述冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液；
将所述冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液；
将多只3-4周龄的BALB/c小鼠适应性喂养3周，于21，28，35，42，49，56天分别对每只小鼠经腹腔注射150μL所述致敏液致敏小鼠；
第62天给每只小鼠灌胃含有8mg-10mg南瓜籽蛋白的缓冲液。
在一种可能的实现方式中，在所述将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液之前，还包括：
以g/mL计，取南瓜籽仁与液氮按照2：1的重量体积比在粉碎机中进行研磨得到南瓜籽糜；
将所述南瓜籽糜与脂肪溶剂多次混合、离心、沉淀得到南瓜籽脱脂沉淀物；
将所述南瓜籽脱脂沉淀物在通风橱中晾干，得到所述南瓜籽脱脂粉。
在一种可能的实现方式中，以g/mL计，所述南瓜籽脱脂粉与所述浸提缓冲液的重量体积比为1：8。
在一种可能的实现方式中，所述浸提缓冲液中包括50mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA和1mmol/L DTT，且所述缓冲液的pH值为7.4。
在一种可能的实现方式中，所述将所述蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉，具体包括：
使用直径为16mm，截留分子量为7kDa的透析袋对所述蛋白液进行透析；
将透析后的所述蛋白液经真空冷冻干燥得到所述冻干蛋白粉。
在一种可能的实现方式中，所述将所述冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液，具体包括：
以mg/mL计，将所述冻干蛋白粉与蒸馏水按照1：0.22的重量体积比复溶得到冻干蛋白溶解液。
在一种可能的实现方式中，所述将所述冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液，具体包括：
将所述冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂按照10：1的体积比混合乳化，得到致敏液。
本发明实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供了一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，该南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法包括：将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液。蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉。将冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液。将冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液。将多只3-4周龄的BALB/c小鼠适应性喂养3周，于21，28，35，42，49，56天分别对每只小鼠经腹腔注射150μL致敏液致敏小鼠。第62天给每只小鼠灌胃含有8mg-10mg南瓜籽蛋白的缓冲液。本申请实施例提供的南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，通过对小鼠进行少量多次腹腔注射致敏液、灌胃南瓜籽蛋白缓冲液激发，成功构建了南瓜籽蛋白致敏小鼠模型，模型小鼠可以很好模拟人体南瓜籽蛋白过敏的典型特佂。同时，在模型构建过程中通过低剂量长期致敏延长了小鼠的致敏状态，从而增加了小鼠的采血次数，不仅提高了采血量，也增加了致敏血清量，进而能够满足后续研究的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对本发明实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的溶剂对照组实验方案图；
图2为本申请实施例提供的佐剂对照组实验方案图；
图3为本申请实施例提供的短期致敏组实验方案图；
图4为本申请实施例提供的低剂量长期致敏组实验方案图；
图5为本申请实施例提供的小鼠体重变化(solvent control-溶剂对照组，adjuvant control-佐剂对照组，short term-短期致敏组，long term-低剂量长期致敏组)；
图6为本申请实施例提供的小鼠脾脏指数变化；
图7为本申请实施例提供的小鼠胸腺指数变化；
图8为本申请实施例提供的小鼠直肠温度变化；
图9为本申请实施例提供的小鼠过敏临床症状评分；
图10为本申请实施例提供的小鼠血清总IgE含量测定(不同字母代表两组差异显著，p<0.05)；
图11为本申请实施例提供的小鼠血清中特异性IgE含量测定；
图12为本申请实施例提供的小鼠血清中组胺的含量测定；
图13为本申请实施例提供的小鼠六次采血过程中总IgE和组胺含量的测定；
图14为本申请实施例提供的小鼠血清中IL-4(Th2型细胞因子)含量测定；
图15为本申请实施例提供的小鼠血清中IL-13(Th2型细胞因子)含量测定；
图16a为本申请实施例提供的溶剂对照组中小鼠的结肠切片(20倍目镜)；
图16b为本申请实施例提供的佐剂对照组中小鼠的结肠切片(20倍目镜)；
图16c为本申请实施例提供的短期致敏组中小鼠的结肠切片(20倍目镜)；
图16d为本申请实施例提供的低剂量长期致敏组中小鼠的结肠切片(20倍目镜)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，该方法包括：
步骤101：将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液。具体地，将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提三次得到蛋白液
步骤102：将蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉。在实际应用中，透析能够降低高盐溶液对小鼠心脑血管及其他器官的伤害。
步骤103：将冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液。
步骤104：将冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液。
步骤105：将多只3-4周龄的BALB/c小鼠适应性喂养3周，于21，28，35，42，49，56天分别对每只小鼠经腹腔注射150μL所述致敏液致敏小鼠。具体地，常用于研究食物致敏机制的动物模型有BALB/c小鼠、C3H/HeJ小鼠、Wistar大鼠和BN大鼠等。相比较而言，BALB/c小鼠具有易感性较强、抗体产生率较高和售价低廉等优点，所以BALB/c小鼠适于搭建致敏模型。另外，南瓜籽蛋白过敏属于免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)介导的I型食物过敏反应，发病患者血清中IL-4、IL-13等Th2型细胞因子的含量较高，BALB/c小鼠能够很好地模拟人体免疫细胞的反应，在发敏后释放IL-4、IL-13等Th2型细胞因子，以便在实验时准确衡量致敏原的致敏性高低。
步骤106：第62天给每只小鼠灌胃含有8mg-10mg南瓜籽蛋白的缓冲液。在实际应用中，在第62天给每只小鼠灌胃400μL-500μL浓度为20mg/mL的南瓜籽蛋白缓冲液。具体地，灌胃激发时所使用的南瓜籽蛋白缓冲液的配置方法是，取适量冻干蛋白粉溶于水中，充分摇匀。
本发明实施例提供了一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，该南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法包括：将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液。蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉。将冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液。将冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液。将多只3-4周龄的BALB/c小鼠适应性喂养3周，于21，28，35，42，49，56天分别对每只小鼠经腹腔注射150μL致敏液致敏小鼠。第62天给每只小鼠灌胃含有8mg-10mg南瓜籽蛋白的缓冲液。本申请实施例提供的南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，通过对小鼠进行少量多次腹腔注射致敏液、灌胃南瓜籽蛋白缓冲液激发，成功构建了南瓜籽蛋白致敏小鼠模型，模型小鼠可以很好模拟人体南瓜籽蛋白过敏的典型特佂。同时，在模型构建过程中通过低剂量长期致敏延长了小鼠的致敏状态，从而增加了小鼠的采血次数，不仅提高了采血量，也增加了致敏血清量，进而能够满足后续研究的需求。
进一步地，在将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液之前，还包括：
以g/mL计，取南瓜籽仁与液氮按照2：1的重量体积比在粉碎机中进行研磨得到南瓜籽糜；将南瓜籽糜与脂肪溶剂多次混合、离心、沉淀得到南瓜籽脱脂沉淀物；将南瓜籽脱脂沉淀物在通风橱中晾干，得到所述南瓜籽脱脂粉。具体地，南瓜籽脱脂粉由下列方法制备：
以g/mL计，取南瓜籽仁与液氮按照2：1的重量体积比在粉碎机中进行研磨得到南瓜籽糜；
以g/mL计，将南瓜籽糜与丙酮按照1：10的重量体积比混合，在4℃下磁力搅拌脱脂2h，后经8000rpm离心20min得到一次沉淀；
以g/mL计，将一次沉淀与乙醚按照1：10的重量体积比混合，在4℃下磁力搅拌脱脂2h，后经8000rpm离心20min得到二次沉淀；
以g/mL计，将二次沉淀与丙酮按照1：10的重量体积比混合，在4℃下磁力搅拌脱脂2h，后经8000rpm离心20min得到三次沉淀；
以g/mL计，将三次沉淀与乙醚按照1：10的重量体积比混合，在4℃下磁力搅拌脱脂2h，后经8000rpm离心20min得到四次沉淀；
将四次沉淀在通风橱中晾干，得到所述南瓜籽脱脂粉。
通过将南瓜籽糜与丙酮和乙醚各溶解两次，使得南瓜籽糜内的脂肪能够溶解的更加彻底，从而保证制备出来的南瓜籽蛋白的蛋白纯度更高，进而使得构建的致敏小鼠模型效果更好。
进一步地，以g/mL计，南瓜籽脱脂粉与浸提缓冲液的重量体积比为1：8。
在实际应用中，浸提缓冲液包括50mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、0.1mmol/LEDTA和1mmol/L DTT，且缓冲液的pH值为7.4。具体地，南瓜籽蛋白的等电点值约为5，清蛋白占比为12％，球蛋白占比为26％，醇溶蛋白占比为8％，谷蛋白占比为54％，且主要由分子量为20kDa和35kDa的两条亚基构成。由于南瓜籽蛋白中谷蛋白含量最高，所以南瓜籽蛋白溶解性较差，为了提升南瓜籽蛋白的溶解性，本发明实施例采用pH值为7.5的50mmol/L Tris-HCl浸提缓冲液，避免南瓜籽蛋白发生等电点沉淀。另外，浸提缓冲液中还添加了200mmol/LNaCl、0.1mmol/L EDTA和1mmol/L DTT，高浓度的NaCl可与蛋白质竞争结合水中的离子，从而促进蛋白质的溶解；EDTA作为多元弱酸可络合蛋白质表面的阳离子，在提升蛋白质溶解性的同时稳定体系的pH值；DTT能够还原蛋白质二、三四级结构中的二硫键，破坏蛋白的球状分子结构，舒展的蛋白结构更易于与缓冲液中的离子结合，从而提升蛋白的溶解度、增加南瓜籽蛋白的提取率。
具体地，将蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉，具体包括：
使用直径为16mm，截留分子量为7kDa的透析袋对蛋白液进行透析；将透析后的蛋白液经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉。在实际应用中，选用直径为16mm，截留分子量7kDa的透析袋对蛋白液进行透析，不仅能够去除蛋白液中的盐离子，也能够避免将南瓜籽蛋白透析至外部透析液中。
在实际应用中，将冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液，具体包括：
以mg/mL计，将冻干蛋白粉与蒸馏水按照1：0.22的重量体积比复溶得到冻干蛋白溶解液。
进一步地，将冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液，具体包括：
将冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂按照10：1的体积比混合乳化，得到致敏液。在实际应用中，致敏液中的南瓜籽蛋白浓度为4.60mg/mL。
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细阐述。
以下内容是浸提缓冲液配方的选择
1.目的
为了构建南瓜籽蛋白致敏动物模型，需要制备浓度较高且无毒性的南瓜籽蛋白溶液。南瓜籽蛋白中谷蛋白占比约54％，导致南瓜籽蛋白的溶解性较差。本实施例主要采用六种不同配方的浸提缓冲液浸提南瓜籽中的致敏蛋白，并比较六种不同配方的浸提缓冲液所浸提的南瓜籽蛋白浓度，以选取最适合浸提南瓜籽蛋白的浸提缓冲液。
2.材料与试剂
本实施例中所用材料与试剂均可由市场购得。具体地，本实验中所用的材料与试剂通过下述渠道购得。
南瓜籽仁陕西省西安市雁塔区高新路枫叶广场华润万家超市；
丙酮陕西省西安市新城区奕辰煊仪器设备供应站；
乙醚陕西省西安市新城区奕辰煊仪器设备供应站；
乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA) 北京全式金生物公司；
十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS) 北京全式金生物公司；
二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT) 北京全式金生物公司；
pH7.5的Tris-HCl 北京索莱宝公司；
NaCl 陕西省西安市新城区奕辰煊仪器设备供应站；
Bradford蛋白质浓度测定试剂盒 北京索莱宝公司。
3.主要仪器
GL-20B高速冷冻离心机 上海安亭实验仪器厂；
S21-1恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器厂；
AR2140电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；
Multiskan FC酶标仪 美国Thermo公司；
2500A磨粉机 上海安亭实验仪器厂；
TF-JH通风橱 北京太极傲飞实验室设备有限公司；
LGJ-10冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂。
4.操作方法
1)南瓜籽脱脂
①以g/mL计，取南瓜籽仁与液氮按照2：1的重量体积比在2500A磨粉机中进行研磨得到南瓜籽糜；
②先使用AR2140电子天平称取100g南瓜籽糜，再将100g南瓜籽糜与1000mL丙酮混合得到一次混合液，然后使用S21-1恒温磁力搅拌器将一次混合液在4℃下磁力搅拌脱脂2h，最后使用GL-20B高速冷冻离心机将一次混合液经8000rpm离心20min得到一次沉淀；
③先将一次沉淀与乙醚按照1：10的重量体积比混合得到二次混合液，然后使用S21-1恒温磁力搅拌器将二次混合液在4℃下磁力搅拌脱脂2h，最后使用GL-20B高速冷冻离心机将二次混合液经8000rpm离心20min得到二次沉淀；
④先将二次沉淀与丙酮按照1：10的重量体积比混合得到三次混合液，然后使用S21-1恒温磁力搅拌器将三次混合液在4℃下磁力搅拌脱脂2h，最后使用GL-20B高速冷冻离心机将三次混合液经8000rpm离心20min得到三次沉淀；
⑤先将三次沉淀与乙醚按照1：10的重量体积比混合得到四次混合液，然后使用S21-1恒温磁力搅拌器将四次混合液在4℃下磁力搅拌脱脂2h，最后使用GL-20B高速冷冻离心机将四次混合液经8000rpm离心20min得到四次沉淀；
⑥将四次沉淀在TF-JH通风橱中晾干，得到南瓜籽脱脂粉。
2)浸提缓冲液的配制
在南瓜籽蛋白浸提之前，按照表1所示的配方及pH值分别对六种浸提缓冲液进行配制，以供后续实验使用。
表1-浸提缓冲液配方
| 编号 | 配方 | pH |
| 1 | 50mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT | 6.5 |
| 2 | 50mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，10mmol/LSDS，1mmol/L DTT | 7.4 |
| 3 | 50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT | 7.4 |
| 4 | 50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT | 7.4 |
| 5 | 50mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT | 7.4 |
| 6 | 50mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT | 8.0 |
3)南瓜籽蛋白提取
将南瓜籽脱脂粉与六种浸提缓冲液均按照质量体积比1：8混合得到六种混合液，再使用S21-1恒温磁力搅拌器将六种混合液分别在4℃下磁力搅拌24h得到六种蛋白浓浆，然后使用GL-20B高速冷冻离心机将六种蛋白浓浆分别在4℃下以15000r/min离心15min，最后分别收集离心完成的六种蛋白浓浆的上清液。
4)蛋白质浓度检测
使用Bradford蛋白质浓度测定试剂盒分别对六种蛋白浓浆的上清液中的蛋白质浓度进行检测。
蛋白质浓度测定完成后，以BSA(牛血清白蛋白)作为标准蛋白，制作蛋白浓度标准曲线，然后用考马斯亮蓝G250对浸提缓冲液中的蛋白质进行染色，调整Multiskan FC酶标仪的吸收波长为595nm，测量各浸提缓冲液中的吸光度，最后选取蛋白质含量最高上清液进行冻干，得到南瓜籽蛋白冻干粉。
5.实验结果
六种浸提缓冲液中的南瓜籽蛋白浓度分别如下：1号为3.39±0.58mg/mL，2号为2.58±0.26mg/mL，3号为3.55±0.71mg/mL，4号为4.15±0.21mg/mL，5号为5.52±0.37mg/mL，6号为4.51±0.47mg/mL(如表2)。
表2-六种浸提缓冲液中的南瓜籽蛋白浓度表
6.实验结论
在六种浸提缓冲液中，5号浸提缓冲液中的南瓜籽蛋白浓度最高，为5.52±0.37mg/mL。由表2可知，1号浸提缓冲液与5号浸提缓冲液的配方相同，但是由于1号浸提缓冲液的pH值为6.5，与南瓜籽蛋白的等电点较为接近，所以1号浸提缓冲液的蛋白溶解度比5号浸提缓冲液差。2号浸提缓冲液中添加了十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，由于SDS中的十二烷基部分是疏水结构，而磺酸钠部分是亲水结构，所以SDS的疏水结构可插入蛋白质的疏水结构内部以破坏蛋白质的疏水作用力，从而瓦解蛋白质的三、四级结构，SDS的添加可以增加蛋白质的溶解度，但同时也会导致部分蛋白质发生变性，从而损害南瓜籽蛋白的致敏活性。3号浸提缓冲液、4号浸提缓冲液和5号浸提缓冲液中NaCl的浓度逐步增加，与此对应的是，浸提缓冲液中的蛋白质浓度也逐步增加，当NaCl浓度为200mmol/L时，蛋白质的浓度在本实验中达到最高。然而，若NaCl的浓度过高，也会导致蛋白质变性，因此本实验中设置的NaCl浓度变化范围为100mmol/L-200mmol/L。6号浸提缓冲液中，pH值为8.0，但蛋白浓度较之5号而言有所降低。综上所述，本发明中选用5号浸提缓冲液对南瓜籽中的蛋白进行浸提。
以下内容是比较短期致敏和低剂量长期致敏所构建的致敏小鼠模型的效果
1.目的
短期致敏是致敏小鼠模型构建时常用的致敏方式，本部分研究的目的是通过比较短期致敏和低剂量长期致敏构建模型的效果，确定一种既能全面表现人类南瓜籽蛋白过敏典型特征、又能提供大量过敏血清以满足研究需求的动物模型。
2.试验对象及材料
1)动物准备
4周龄的雌性BALB/c小鼠24只(SPF级)，体重8g-12g，由成都达硕实验动物有限公司提供，西北大学动物房饲养，自由饮食和饮水。饲养环境：温度22℃-25℃；湿度：40％-60％。
2)材料与试剂
本实施例中所用材料与试剂均可由市场购得。具体地，本实验中所用的材料与试剂通过下述渠道购得。
氢氧化铝佐剂(Imject Alum Adjuvant) 赛默飞世尔科技有限公司；
pH7.5的Tris-HCl 北京索莱宝科技有限公司；
免疫球蛋白E(IgE)检测试剂盒 武汉云克隆科技股份有限公司；
组胺(Histamine，HA)检测试剂盒 武汉云克隆科技股份有限公司；
IL-4检测试剂盒 上海鑫乐生物科技有限公司；
IL-13检测试剂盒 上海鑫乐生物科技有限公司；
4％多聚甲醛溶液 陕西省西安市新城区奕辰煊仪器设备供应站。
3)主要仪器
Multiskan FC酶标仪美国Thermo公司；
MX-F漩涡混匀仪美国赛洛捷克仪器公司。
4)分组建模
将24只小鼠适应性喂养3周，然后随机分为溶剂对照组(solvent control)，佐剂对照组(adjuvant control)，短期致敏组(short-term)和低剂量长期致敏组(long-term)，每组6只。试验流程如图1，图2，图3和图4所示。
致敏：将南瓜籽蛋白冻干粉在蒸馏水中复溶得到冻干蛋白溶解液，在冻干蛋白溶解液中按照体积比为10：1加入氢氧化铝佐剂(即10mL冻干蛋白溶解液中加入1mL氢氧化铝佐剂)，反复震荡溶液使其乳化均匀，制得蛋白浓度为4.60mg/mL的致敏液。
短期致敏组：在21、28、35、42天给小鼠腹腔注射200μL致敏液；
低剂量长期致敏组：在21、28、35、42、49、56天给小鼠腹腔注射150μL致敏液；
溶剂对照组：在21、28、35、42、49、56天给小鼠腹腔注射200μL的Tris-HCl缓冲液。具体地，Tris-HCl缓冲液的配方为50mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA和1mmol/L DTT，且Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4。
佐剂对照组：按照体积比10：1混合Tris-HCl缓冲液和氢氧化铝佐剂形成注射佐剂，分别在21、28、35、42、49、56天给小鼠腹腔注射200μL该佐剂。
激发：低剂量长期致敏组小鼠在第62天进行激发，将200mg南瓜籽冻干蛋白粉与10mL蒸馏水混合，充分搅拌后制得蛋白液，然后给每只小鼠灌胃500μL蛋白液。短期致敏组小鼠在第49天进行激发，每只灌胃500μL蛋白液。溶剂对照组和佐剂对照组均在第62天激发，每只小鼠灌胃500μLTris-HCl缓冲液。
5)标本采集
血清
短期致敏组小鼠在第49天进行摘除眼球取血。具体操作如下：剪除小鼠胡须，摘除一侧眼球，用1.5mL离心管收集血液，然后脱颈处死小鼠。血液在室温放置2h，然后在3000r/min，4℃条件下离心10min，离心结束后取上层血清装入另外的EP管，-80℃下保存。
低剂量长期致敏组小鼠需在第45、49、52、56、59天进行内眦静脉取血，第62天进行摘除眼球取血。内眦静脉取血过程如下：操作者使用左手拇指、食指和中指固定住小鼠头部，之后挤压小鼠头部使得小鼠眼球突出，然后右手持毛细管从眼内眦部、与鼠面成45°夹角旋转刺入，最后固定小鼠身体，放松四肢，调整到血从毛细管后方顺利滴出，用1.5mL离心管收集血液，取血完成将毛细管轻轻拔出，使用干棉球按压小鼠眼眶止血。血液室温放置2h，然后在3000r/min，4℃条件下离心10min，离心结束后取上层血清装入另外的EP管，-80℃下保存。
溶剂对照组和佐剂对照组小鼠在第62天进行摘眼球取血，具体操作流程与短期致敏组小鼠一致。
结肠组织：将小鼠解剖，取2cm结肠组织，置于4％多聚甲醛固定液中固定，用于病理切片制作。
3.研究方法
1)过敏表观症状评分
本实验将小鼠临床症状分为6个等级：0＝“无症状”；1＝“抓鼻子和头”；2＝“活动减少或呼吸频率增加”；3＝“气喘，呼吸困难，眼睛和/或嘴巴周围发红，脱发”；4＝“口服刺激后抽搐或不动”；5＝“死亡”。临床评分4、5分为严重过敏症状，2、3分为中度过敏症状，1分为轻度过敏症状。小鼠灌胃激发0.5h后小鼠产生过敏症状，并根据过敏症状进行评分。
2)血清中各种因子的含量检测
依照免疫球蛋白E(IgE)检测试剂盒的使用说明书、组胺(Histamine，HA)检测试剂盒的使用说明书、IL-4检测试剂盒的使用说明书和IL-13检测试剂盒的使用说明书分别测量小鼠血清中总IgE、南瓜籽蛋白特异性IgE、组胺、IL-4和IL-13的含量。
3)小鼠结肠组织病理学染色观察
小鼠解剖、取肠道组织浸泡后，送往陕西依科生物技术服务有限公司进行石蜡包埋、石蜡切片以及苏木精-伊红染色。
4)数据统计
数据用“平均值±标准差”表示，样本之间均数差异显著性检验采用ANOVA分析，如果有显著性差异，采用LSD(方差齐)和Benferroni(方差不齐)方法进行两两比较。当方差不齐时采用秩和检验，使用SPSS20.0统计软件进行数据分析。认为P＜0.05为差异显著，数据间显著性差异以小写字母a、b、c等标注。
4.研究结果
1)各组小鼠过敏体征的比较
如图5所示，溶剂对照组小鼠的平均体重约为28.06±3.01g，佐剂对照组小鼠的平均体重约为25.21±2.09g，短期致敏组小鼠的平均体重约为17.89±3.32g，低剂量长期致敏组小鼠的平均体重约为18.20±1.52g。由上述数据可以得出，短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠的体重明显低于溶剂对照组和佐剂对照组，这说明短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠均出现过敏。这是由于食物过敏容易引起机体内多处发生炎症，也常引起胃肠道功能受损，因此过敏小鼠的体重往往较之正常小鼠有所降低。
如图6和图7所示，溶剂对照组小鼠的脾脏指数和胸腺指数明显低于短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠。脾脏指数和胸腺指数越高，说明机体内免疫反应的强度越高，小鼠的脾脏/胸腺指数较高，说明免疫器官和免疫细胞处于活跃状态，过度免疫反应(即过敏)发生的概率较高，从而说明短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠均出现过敏。
如图8所示，与溶剂对照组和佐剂对照组相比，短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠的体温出现明显降低，这是由于过敏小鼠机体内血管扩张，大脑供血量减少，供应体温中枢的血液也随之减少，体温出现反射性下降，从而说明短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠均出现过敏。
如图9所示，溶剂对照组和佐剂对照组的小鼠过敏症状评分较低，说明此二组小鼠均未出现明显的过敏症状。短期致敏组小鼠和低剂量长期致敏组小鼠过敏症状评分较高，且低剂量长期致敏组小鼠的过敏症状评分高于短期致敏组小鼠，这说明低剂量长期致敏使小鼠产生的过敏症状比短期致敏更为明显。
2)小鼠血清中总IgE及南瓜籽蛋白特异性IgE含量测定
如图10所示，溶剂对照组的小鼠血清中总IgE含量为9.08±0.73ng/mL，佐剂对照组的小鼠血清中总IgE含量为8.98±1.23ng/mL，短期致敏组的小鼠血清中总IgE含量为26.08±2.53ng/mL，低剂量长期致敏组的小鼠血清中总IgE含量为28.66±0.59ng/mL。由上述数据可知，短期致敏组和低剂量长期致敏组中小鼠血清中的总IgE含量明显高于溶剂对照组和佐剂对照组。与短期致敏组相比，低剂量长期致敏组的小鼠血清中总IgE含量更高，这说明低剂量长期致敏可以使小鼠的血清中产生更多的IgE。
如图11所示，溶剂对照组和佐剂对照组中，小鼠血清中的南瓜籽蛋白特异性IgE含量比较相似，其值比短期致敏组低了56.36％，比低剂量长期致敏组低了52.08％，短期致敏组和低剂量长期致敏组中的南瓜籽蛋白特异性IgE含量没有显著差异。说明相较于溶剂对照组和佐剂对照组，短期致敏组和低剂量长期致敏组均引起了免疫反应。
3)小鼠血清中组胺含量的测定
如图12所示，溶剂对照组小鼠血清中的组胺含量为10.06±1.04ng/mL，佐剂对照组小鼠血清中的组胺含量为9.97±3.91ng/mL，短期致敏组小鼠血清中的组胺含量为40.15±5.25ng/mL，低剂量长期致敏组小鼠血清中的组胺含量为39.44±3.97ng/mL，溶剂对照组和佐剂对照组小鼠血清中的组胺含量比较接近。由上述数据可知，短期致敏和低剂量长期致敏组小鼠血清中的组胺含量明显高于溶剂对照组和佐剂对照组。
对于低剂量长期致敏组小鼠，本实验还在实验第45、49、52、56、59、62天进行采血，并检测了血液中总IgE和组胺的含量。如图13所示，6次采血得到的血清中，总IgE和组胺均处于较高水平，且在第62天采血得到的血清中，总IgE和组胺的含量在6次采样中达到最高值，这说明在南瓜籽蛋白大剂量灌胃时小鼠产生严重的过敏反应。
4)小鼠血清中Th2型细胞因子含量的测定
如图14、15所示，与溶剂对照组和佐剂对照组相比，短期致敏组和低剂量长期致敏组小鼠血清中Th2型细胞因子(IL-4，IL-13)含量均显著升高，但短期致敏和低剂量长期致敏这两种模式间并没有产生显著差异，这说明在短期致敏和低剂量长期致敏模式下，小鼠均能发生明显的免疫反应。
5)组织病理学观察
镜下观察HE染色切片，可见溶剂对照组和佐剂对照组中，小鼠肠粘膜结构完整，上皮细胞排列紧密，固有层的肠腺丰富，杯状细胞较多，没有明显的炎症迹象(图16a、图16b)。短期致敏组和低剂量长期致敏组的小鼠结肠组织出现大量破碎细胞核和炎症浸润(图16c、图16d)。
6)各组小鼠采血量及血清体积的比较
短期致敏组在第49天进行摘除眼球采血，平均每只小鼠采血量约为500μL，血清体积约为200μL。低剂量长期致敏组在第45、49、52、56、59天进行内眦静脉取血，第62天进行摘除眼球取血，采血次数共计6次，平均每只小鼠采血量约为700μL，血清体积约为320μL。溶剂对照组和佐剂对照组在第62天进行摘除眼球采血，平均每只小鼠采血量约为500μL，血清体积约为200μL。由上述数据可以得出，与短期致敏组相比较，低剂量长期致敏组的采血量和血清量相对较高。
5.实验结论
南瓜籽致敏小鼠模型的构建主要包括两个部分：致敏和发敏，而致敏原所处的缓冲液体系、致敏原的致敏模式均会影响小鼠的发敏程度，在本部分研究中，通过对小鼠分组建模，对短期致敏和低剂量长期致敏模式构建模型的效果进行了比较。通过实验结果可以得出，与短期致敏组比较，低剂量长期致敏组的小鼠血清中的总IgE含量更高，过敏症状更为明显，采血次数更多，可获得的致敏血清量更多。因此，通过低剂量长期致敏的模式，即对小鼠进行少量多次腹腔注射致敏液、灌胃南瓜籽蛋白缓冲液激发，成功构建了南瓜籽蛋白致敏小鼠模型，该小鼠模型的过敏症状明显，能够很好模拟人体南瓜籽蛋白过敏的典型特佂。同时，在模型构建过程中通过低剂量长期致敏延长了小鼠的致敏状态，从而增加了小鼠的采血次数，不仅提高了采血量，也增加了致敏血清量，进而为进一步研究南瓜籽蛋白的致敏机理提供技术支撑和物质基础，以满足后续研究的需求。
本说明书中的各个实施方式采用递进的方式描述，各个实施方式之间相同或相似的部分互相参见即可，每个实施方式重点说明的都是与其他实施方式的不同之处。
以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对本申请限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：
将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液；
将所述蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉；
将所述冻干蛋白粉在蒸馏水中复溶后得到冻干蛋白溶解液，具体包括：
以mg/mL计，将所述冻干蛋白粉与蒸馏水按照1：0.22的重量体积比复溶得到冻干蛋白溶解液；
将所述冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂混合乳化，得到致敏液，具体包括：
将所述冻干蛋白溶解液与氢氧化铝佐剂按照10：1的体积比混合乳化，得到致敏液；
将多只3-4周龄的BALB/c小鼠适应性喂养3周，于21，28，35，42，49，56天分别对每只小鼠经腹腔注射150μL所述致敏液致敏小鼠；
第62天给每只小鼠灌胃含有8mg-10mg南瓜籽蛋白的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，其特征在于，在所述将南瓜籽脱脂粉经浸提缓冲液反复浸提多次得到蛋白液之前，还包括：
以g/mL计，取南瓜籽仁与液氮按照2：1的重量体积比在粉碎机中进行研磨得到南瓜籽糜；
将所述南瓜籽糜与脂肪溶剂多次混合、离心、沉淀得到南瓜籽脱脂沉淀物；
将所述南瓜籽脱脂沉淀物在通风橱中晾干，得到所述南瓜籽脱脂粉。
3.根据权利要求1所述的南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，其特征在于，以g/mL计，所述南瓜籽脱脂粉与所述浸提缓冲液的重量体积比为1：8。
4.根据权利要求1所述的南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述浸提缓冲液中包括50mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA和1mmol/L DTT，且所述缓冲液的pH值为7.4。
5.根据权利要求1所述的南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述将所述蛋白液透析后经真空冷冻干燥得到冻干蛋白粉，具体包括：
使用直径为16mm，截留分子量为7kDa的透析袋对所述蛋白液进行透析；
将透析后的所述蛋白液经真空冷冻干燥得到所述冻干蛋白粉。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210859128.8A CN115211404B (zh) | 2022-07-21 | 2022-07-21 | 一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210859128.8A CN115211404B (zh) | 2022-07-21 | 2022-07-21 | 一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115211404A CN115211404A (zh) | 2022-10-21 |
| CN115211404B true CN115211404B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=83614199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210859128.8A Active CN115211404B (zh) | 2022-07-21 | 2022-07-21 | 一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115211404B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2318525C1 (ru) * | 2006-06-29 | 2008-03-10 | ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЯРИЗОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ Th2-ИНДУЦИРОВАННОГО ОТЕКА |
| KR20080098156A (ko) * | 2007-05-04 | 2008-11-07 | 한국과학기술연구원 | 아토피성 피부질환 마우스 및 이를 이용한 아토피성피부질환 예방제, 치료제 또는 화장료 조성물의 스크리닝방법 |
| CN101936999A (zh) * | 2010-07-28 | 2011-01-05 | 南京林业大学 | 检测白果过敏蛋白的双抗体夹心elisa方法 |
| CN103645328A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-19 | 中国计量学院 | 一种花生致敏蛋白Arah2标准品的制备方法 |
| CN104965053A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-10-07 | 南昌大学 | 一种大豆食品致敏性的检测评价方法 |
| CN113892461A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-01-07 | 中国农业大学 | 小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法 |
-
2022
- 2022-07-21 CN CN202210859128.8A patent/CN115211404B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2318525C1 (ru) * | 2006-06-29 | 2008-03-10 | ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЯРИЗОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ Th2-ИНДУЦИРОВАННОГО ОТЕКА |
| KR20080098156A (ko) * | 2007-05-04 | 2008-11-07 | 한국과학기술연구원 | 아토피성 피부질환 마우스 및 이를 이용한 아토피성피부질환 예방제, 치료제 또는 화장료 조성물의 스크리닝방법 |
| CN101936999A (zh) * | 2010-07-28 | 2011-01-05 | 南京林业大学 | 检测白果过敏蛋白的双抗体夹心elisa方法 |
| CN103645328A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-19 | 中国计量学院 | 一种花生致敏蛋白Arah2标准品的制备方法 |
| CN104965053A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-10-07 | 南昌大学 | 一种大豆食品致敏性的检测评价方法 |
| CN113892461A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-01-07 | 中国农业大学 | 小麦面筋蛋白经皮致敏小鼠模型的构建方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Allergenicity assessment of Buchanania lanzan protein extract in Balb/c mice;Sachin Kumar et.al.;International Immunopharmacology(第63期);第170-182页 * |
| SD幼鼠食物过敏模型的建立与评价;刘俊红;吴斌;赖乾坤;林春;;临床儿科杂志(第10期);第953-958页 * |
| 大鼠嗜碱性白血病粒细胞系RBL-2H3和RBL-1细胞模型在评价食品潜在致敏性中的比较;孙娜;周催;王翠燕;孙璐;车会莲;;农业生物技术学报(第12期);第1465-1472页 * |
| 对虾原肌球蛋白不同致敏途径对BALB/c小鼠致敏性的影响;傅玲琳;谢梦华;王;王海燕;王彦波;;食品科学(第13期);第166-175页 * |
| 甘薯可溶性蛋白的分离提取及特性研究;木泰华, 孙艳丽, 刘鲁林, 常洪瑞, 薛友林, 魏益民;食品研究与开发(第05期);第16-20页 * |
| 白果蛋白过敏动物模型的试验研究;杨剑婷;吴彩娥;李莹莹;贾韶千;范龚健;潘红梅;;中国农业科学(第17期);第3616-3623页 * |
| 花生致敏蛋白Ara h1和Ara h2纯化鉴定方法研究进展;田阳;饶欢;陶莎;薛文通;;粮食与油脂(第07期);第1-4页 * |
| 花生致敏蛋白Ara h2提取纯化及免疫分析;田阳;饶欢;陶莎;薛文通;;粮食与油脂(第12期);第29-32页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115211404A (zh) | 2022-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baldo et al. | IgE antibodies to wheat flour components Studies with sera from subjects with bakers' asthma or coeliac condition | |
| Burks et al. | Identification of a major peanut allergen, Ara h I, in patients with atopic dermatitis and positive peanut challenges | |
| Hochwallner et al. | Cow’s milk allergy: From allergens to new forms of diagnosis, therapy and prevention | |
| Li et al. | Effects of high hydrostatic pressure treatment on allergenicity and structural properties of soybean protein isolate for infant formula | |
| Varjonen et al. | Antigliadin IgE–indicator of wheat allergy in atopic dermatitis | |
| CN107176995A (zh) | 一种生物活性多肽skvlpvpekavpypq及其制备方法和应用 | |
| BRPI0413240B1 (pt) | processo para preparar um isolado de proteína do linho | |
| CN107200782A (zh) | 一种生物活性多肽vavvkkgsnfq及其制备方法和应用 | |
| CN104371016B (zh) | 过敏原提取物 | |
| CN115211404B (zh) | 一种南瓜籽蛋白致敏小鼠模型的构建方法 | |
| CN106011115A (zh) | 一种羔羊第四胃有效成分提取物的制备方法及用途 | |
| Marsh et al. | Rapidly released allergens from short ragweed pollen: I. Kinetics of release of known allergens in relation to biologic activity | |
| Sampson et al. | Food allergy and the potential allergenicity-antigenicity of microparticulated egg and cow's milk proteins. | |
| Thompson | Reduction of phytic acid concentration in protein isolates by acylation techniques | |
| GIERHART et al. | Effects of ribonucleic acid removal methods on composition and functional properties of Candida utilis | |
| CN104056259A (zh) | 一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分 | |
| Aas et al. | Studies of hypersensitivity to fish | |
| Ding | Effects of emulsifier on emulsification, physical and chemical properties of soybean protein | |
| JP7394866B2 (ja) | カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法 | |
| Bousfiha et al. | Modulation of IgE immunoreactivity to broad bean proteins after food processing in a Moroccan population | |
| CN108530513B (zh) | 小麦粉过敏原高效提取剂及其使用方法 | |
| CN110064052A (zh) | 一种英国梧桐花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
| Ramos et al. | Functional characterization of acetylated Brazil nut (Bertholletia excelsa HBK) kernel globulin | |
| RU2779914C1 (ru) | Способ получения днк-содержащего препарата для перорального применения и препарат, полученный этим способом | |
| Penttila et al. | Cellular and humoral responses in coeliac disease. 1. Wheat protein fractions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |