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CN104056259A - 一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分 - Google Patents

一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分 Download PDF

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CN104056259A
CN104056259A CN201410112862.3A CN201410112862A CN104056259A CN 104056259 A CN104056259 A CN 104056259A CN 201410112862 A CN201410112862 A CN 201410112862A CN 104056259 A CN104056259 A CN 104056259A
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mice
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苏伟志
陈湘陵
黄浚宪
吴小俐
李光智
蔡佩瑜
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ProMD Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分，其中该有效成分为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。此外，本发明还提供了甘油醛-3-磷酸脱氢酶在制备治疗或预防过敏性疾病的药剂中的用途，以及在制备治疗或预防气喘或异位性皮肤炎的药剂中的用途。

Description

一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分
技术领域
本发明涉及一种抗过敏活性物质的用途，具体而言，该包含该抗过敏活性物质的组合物可用于制备预防或治疗过敏性疾病的药剂，尤其是气喘或异位性皮肤炎。
背景技术
过敏性疾病，例如过敏性湿疹、荨麻疹、反复发作的过敏性鼻炎、过敏性气喘及异位性皮肤炎，在台湾及其他已开发国家已成为严重的社会问题，广为人知的卫生假说为：婴幼儿接触免疫刺激病原体的机会愈少，愈容易引发过敏相关疾病的产生。相关研究指出，过敏性疾病发生时，人体内的免疫反应会使Th1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反应朝向Th2途径，形成体液免疫反应，例如IgE的产生及嗜伊红血球过多等，经由刺激Th1型免疫反应以调节、平衡过敏所引发Th2型免疫反应，将可达到改善过敏体质的效果。
但针对气喘的治疗，目前仍以药物治疗为主：如类固醇和抑制肥大细胞释放发炎物质的药物、气管扩张剂和免疫疗法等。然而，包括抗发炎药物和气管扩张剂在内的药物治疗仍无法真正的改变过敏免疫反应，仅为一种治标的方法。
于异位性皮肤炎治疗上,目前为局部涂抹类固醇(topical corticosteroids,TCS)(Lowenberg et al.,2008)或是局部免疫抑制剂(topical calcineurin inhibitors,TCI)(Hultsch et al.,2005;Kim et al.,2010)为最快速有效的方式。但是，仍有一些副作用的疑虑如长期使用类固醇会有皮肤萎缩、皮肤色素改变、皮肤出现血丝、甚至造成像妊娠纹般的扩张纹，且类固醇于人体吸收后可能影响贺尔蒙分泌。而免疫抑制剂也会造成皮肤灼热与刺激感等的副作用。因此，异位性皮肤炎的治疗仍需以有效改善皮肤发炎反应并且没有副作用为目标。
另一方面，减敏疗法虽能改变过敏免疫体质，但是通常需要较长的一段时间，且有时会出现一些副作用，并非所有的病人都能够使用。
因此，仍需开发具抗过敏活性的活性成分，以刺激免疫细胞、调节Th1/Th2免疫反应为作用机制。
发明内容
本发明基于发现甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphateDehydrogenase，G3PDH）具有抗过敏活性，可降低个体过敏反应，因而可开发为治疗或预防过敏性疾病的药剂，进一步验证其亦可开发为治疗或预防气喘或异位性皮肤炎的药剂。
因此，本发明一方面提供一种甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphate Dehydrogenase，G3PDH）或其具相同功能的变异体或片段在制备降低个体过敏反应的药剂中的用途。
在一方面，本发明提供一种甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备治疗或预防过敏性疾病的药剂中的用途。其中该过敏性疾病可为气喘或异位性皮肤炎。
另一方面，本发明所提供的甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
此外，本发明所提供的甘油醛-3-磷酸脱氢酶是选自由加氏乳酸杆菌（Lactobacillus gasseri）PM-A0005菌株(简称「PM-A0005菌株」)及其萃取物、区分物、次区分物或有效成分所组成的群组；其中该PM-A0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M207039。该PM-A0005菌株已于2007年1月5日申请专利，并记载在台湾专利第I356680号中。
在一方面。本发明所提供的PM-A0005菌株的萃取物、区分物及次区分物可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。
在另一方面,本发明所提供的甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。
除此之外,本发明提供一种加氏乳酸杆菌（Lactobacillus gasseri）PM-A0005菌株在制备治疗或预防异位性皮肤炎的药剂中的用途，其中该PM-A0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M207039。
根据本发明的实施例，该PM-A0005菌株的萃取物为溶菌酶分解该PM-A0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。在本发明一具体实施例中，该萃取物为以浓度为大于0且小于等于25%（w/w）或浓度为50-75%（w/w）的硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得，其萃取物编号分别为AS_0-25%或AS_50-75%。
根据本发明的实施例，该PM-A0005菌株萃取物的区分物为溶菌酶分解该PM-A0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得萃取物后，其再经离子交换层析（ion-exchange chromatography）分离而得。在本发明一具体实施例中，该区分物编号分别为IE1-2、IE1-3、IE3-2及IE3-3。
根据本发明另一实施例，该PM-A0005菌株萃取物的次区分物为溶菌酶分解该PM-A0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得的萃取物，其再经离子交换层析分离获得区分物后，再以胶体过滤层析法分离而得。在本发明一具体实施例中，该次区分物IE3-3G1的有效成分为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
本发明的各种具体实施例于下文详述。本发明的其他特征将可由下文有关该等各种具体实施例的详细叙述、图式及申请专利范围而清楚呈现。
附图说明
在本发明中所呈现的较佳具体实施例图式为阐述本发明为目的。应被理解的是,本发明并不局限于所示的较佳具体实施例。数据以平均值±SD表示。其中*:P＜0.05、**:P＜0.01、***:P＜0.001,成对t检定(paired t-test)。
图1A-1C显示该PM-A0005菌株的萃取物经离子交换层析进一步分离活性物质的结果；图1A为离子交换层析的条件设定；图1B为萃取物AS_0-25%所分离出3个区分物（fractions）；及图1C为萃取物AS_50-75%所分离出3个区分物；
图2A-2E显示将区分物IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3利用胶体过滤层析进一步分离活性物质的结果；图2A为胶体过滤层析的条件设定；图2B为区分物IE1-2所分离出1个次区分物（subfraction）IE1-2G1；图2C为IE1-3所分离出2个次区分物IE1-3G1和IE1-3G2；图2D为IE3-2所分离出3个次区分物IE3-2G1、IE3-2G2和IE3-2G3；及图2E为IE3-3所分离出5个次区分物IE3-3G1、IE3-3G2、IE3-3G3、IE3-3G4和IE3-3G5；
图3为在给予小鼠萃取物AS_50-75%（尘螨致敏-AS）及次区分物IE3-3G1（尘螨致敏-IE）后，以甲基胆碱诱发气管收缩并测量小鼠呼吸道阻力的结果，其中呼吸道阻力是以Penh表示；
图4A-4C为尘螨致敏小鼠的肺部组织变化评估，显示投予萃取物AS_50-75%和次区分物IE3-3G1可显着降低肺脏的发炎与细胞浸润现象；图4A为肺部细胞冲洗液的细胞计数结果；图4B为肺部细胞冲洗液的细胞分类；及图4C为肺部细胞冲洗液中胸腺活化调节趋化因子（thymus and activation-regulatedchemokine,TARC）浓度，其中尘螨致敏-AS组投予萃取物AS_50-75%；尘螨致敏-IE组投予次区分物IE3-3G1；
图5为尘螨致敏小鼠的肺部组织H&E染色结果，发现经投予萃取物AS_50-75%和次区分物IE3-3G1分别可有效地降低小鼠气管壁增厚及改善免疫细胞大量浸润等现象；其中对照组为正常小鼠；尘螨致敏组以以尘螨致敏；而尘螨致敏-AS组投予萃取物AS_50-75%；尘螨致敏-IE组则投予次区分物IE3-3G1；
图6A-6D为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠的生理特征。图6A为小鼠皮肤外观；图6B为Cutometer580测量皮肤含水量的结果；图6C为Cutometer580所测量的pH值；及图6D为利用Tewameter TM210仪器测量表皮水分经皮肤蒸发量(Trans-epidermal waterloss,TEWL)的结果；
图7A-7D为IE3-3G1或PBS以腹腔(intraperitoneal,i.p.)注射治疗以尘螨(Derp)或卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠生理特征；图7A为小鼠皮肤外观；图7B为以Cutometer580测量皮肤含水量的结果；图7C为Cutometer580所测量的pH值；及图7D为利用Tewameter TM210仪器测量表皮水分经皮肤蒸发量(Trans-epidermal water loss,TEWL)的结果；
图8A-8C为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其皮肤厚度及嗜酸性粒细胞浸润结果。图8A为致敏皮肤位置的苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin stain,H&E stain)切片结果；图8B为以H&E染色切片所测量的皮肤厚度；及图8C为每切片视图的嗜酸性粒细胞数目；
图9A-9C为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其皮肤厚度及嗜酸性粒细胞浸润结果。图9A为致敏皮肤位置的苏木精-伊红染色(H&E stain)切片结果；图9B为由H&E染色切片所测量的皮肤厚度；及图9C为每切片视图的嗜酸性粒细胞数目；
图10为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)的表达结果；
图11A-11B为剂量107CFU或109CFU鹅PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其兰格罕细胞(langerhans cells)的数目变化。图11A为致敏皮肤位置染色切片结果；图11B为每切片视图于表皮层或真皮层的兰格罕细胞细胞数目；
图12为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其TSLP表达结果；
图13A-13B为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其兰格罕细胞(langerhans cells)的数目变化。图13A为致敏皮肤位置染色切片结果；图13B为每切片视图于表皮层或真皮层的兰格罕细胞细胞数目；
图14A-14B为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其总IgE(图14A)及OVA-特异性IgE(图14B)的变化。
图15A-15B为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其总IgE(图15A)及OVA-特异性IgE(图15B)的变化；
图16为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠其以白血球凝集素(leucoagglutinin,PHA-L)或不同浓度OVA刺激脾脏细胞后,该脾脏细胞的增生能力变化结果；
图17A-17B为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其以PHA-L、不同浓度OVA(图17A)或Derp(图17B)刺激脾脏细胞后,该脾脏细胞的增生能力变化结果；
图18A-18C为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠其以PHA-L、不同浓度OVA刺激脾脏细胞后,其细胞激素IFN-γ(Interferon-γ)(图18A)、IL-17(图18B)及IL-10(图18C)的变化结果；
图19A-19C为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其以PHA-L、不同浓度Der p或OVA刺激脾脏细胞后,其细胞激素IFN-γ(图19A)、IL-17(图19B)及IL-10(图19C)的变化结果。
图20为剂量107CFU或109CFU的PM-A0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠其IL-17表达情形的染色切片结果；
图21为IE3-3G1或PBS以腹腔(i.p.)注射治疗以尘螨(Der p)或卵白蛋白(OVA)致敏的异位性皮肤炎小鼠其IL-17表达情形的染色切片结果；
图22为次区分物IE3-3G1的蛋白质二维电泳分析结果。编号1-编号5为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；编号6为果糖二磷酸醛缩酶；
图23以考马斯蓝染色及使用抗组胺酸（Histidine）抗体进行Western blot分析鉴定G3PDH重组蛋白质；其中M：蛋白质分子标记；1：次区分物IE3-3G1；2：G3PDH-His重组蛋白；
图24为G3PDH重组蛋白刺激小鼠树突细胞产生细胞激素IL-12（IL12p40）以评估对于免疫调节的功效的结果；其中以添加脂多醣（lipopolysaccharide，LPS）或PHA为正对照组，仅有细胞而未额外添加刺激物组为对照组；
图25为G3PDH重组蛋白刺激小鼠脾脏细胞产生细胞激素Interferon-γ（IFN-γ）以评估对于免疫调节的功效的结果；其中以添加LPS或PHA为正对照组，仅有细胞而未额外添加刺激物组为对照组。
具体实施方式
除非另有定义，此处所始有使用的技术及科学名词具有与本发明所属技术领域技术人员一般所了解的相同含义。此处所使用，如有矛盾的情形，以本文件（包括定义）为准。
本文所使用的「一」一词，如未特别指明，是指该冠词的文法上受词为一个或一个以上（即至少为一个）。例如「一成份」是指一成份或多于一成份。
本文所使用的「过敏性疾病」一词，是指过敏原、过敏原特异性的免疫球蛋白E(IgE)以及肥大细胞等的共同作用所引发的疾病。首先是过敏原与附在肥大细胞固定区（fragment constant,Fc）受体的免疫球蛋白E结合后，促使肥胖细胞进行去颗粒作用。而由颗粒释出一些介质如组织胺，白三烯素及趋化因子等，这些介质进而造成血管的通透性增加及气管的收缩而导致症状，同时也会吸引一些其他的细胞如中性白血球，嗜伊红性白血球等，导致相当程度的发炎反应，造成更进一步皮肤、黏膜组织或是血管的慢性发炎。过敏疾病包括但不限于异位性皮肤炎、过敏性鼻炎与气喘、以及一些特定的食物与昆虫叮咬引起的过敏。这些疾病会导致相当程度的发炎反应，造成皮肤、黏膜组织或是血管的慢性发炎。
本文所使用的「气喘」一词，是指因吸入具有诱发性的过敏原引起无法控制的气道过度反应，并伴随呼吸道结构的改变，包括但不限于上皮的增生、黏膜组织的变形、呼吸道平滑肌的增生、以及细胞外基质的增生。
本文所使用的「异位性皮肤炎」一词,是指一种皮肤炎的形式,其为一种复发性但不具有传染性的皮肤发炎及皮肤搔痒症状,包括但不限于神经性皮肤炎、内源性湿疹、屈部湿疹及婴儿湿疹。
本文所使用的「具相同功能的变异体」一词，是指一使用例如重组基因技术而得，藉由一或若干个氨基酸插入、缺失或取代不同于已知蛋白质氨基酸序列但不影响其功能的多肽。例如，氨基酸取代是以另一具有相似结构及/或化学性质的氨基酸置换一氨基酸的结果（意即保守氨基酸置换）。而保守氨基酸取代可基于涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性及/或两亲性质的相似性而进行。氨基酸插入或氨基酸缺失则较佳在约1至20个氨基酸范围内，更佳为1至10个氨基酸。允许的变化可通过使用重组基因技术在多肽分子中系统地使氨基酸插入、缺失或取代及鉴定所得重组变异体的活性及功能实验而找出具相同功能的变异体。本文所使用的「具相同功能的片段」一词，是指已知蛋白质或具相同功能变异体中提供相同功能的部位的氨基酸片段。例如，抗原决定部位的氨基酸序列。
本文所使用的「可接受」一词，是指该载剂必需与组合物的活性成分兼容（较佳为能稳定该活性成分）且对被治疗个体无害。
本文所使用的「有效量」一词，是指相较于未接受此量的对应个体，药物或药剂的用量造成所欲的药理或生理上的结果，或疾病、异常或副作用的治疗、治愈、预防、或改善，或减少疾病或异常的发生。服用的有效量或有效剂量可根据所使用的特定有效成分、服用模式、年龄、体型、以及所欲治疗个体的条件而改变。药剂的精确服用量则系依医师的判断进行投药且依个体差异而异。
根据本发明，发现甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphateDehydrogenase,G3PDH）具有非可预期的抗过敏活性。在本发明一具体实施例中，针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）进行小鼠树突细胞共培养实验，显示G3PDH可有效诱发小鼠树突细胞表达IL-12及刺激脾脏细胞表达IFN-γ，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效。因此，本发明提供甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备降低个体过敏反应的药剂中的用途。
因此，本发明提供甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备降低过敏性疾病以及气喘或异位性皮肤炎的药剂中的用途。
本发明的一实施例中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。但本发明所使用的甘油醛-3-磷酸脱氢酶当包含不同来源以及制程的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，或其具相同功能的变异体或片段。
根据本发明，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）为活性成分可进一步与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物，或一食品组合物。
根据本发明，包含以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为活性成分的组合物、萃取物、区分物、次区分物（subfraction）亦可用于制备治疗或预防气喘或异位性皮肤炎药剂。
根据本发明，该甘油醛-3-磷酸脱氢酶是分离自加氏乳酸杆菌（Lactobacillusgasseri）PM-A0005菌株，该PM-A0005菌株由东宇生物科技股份有限公司开发，于2007年4月6日寄存于中国典型培养物保藏中心，寄存编号CCTCC NO：M207039。并于2007年1月5日申请专利并于2012年1月21日取得台湾专利第I356680号。但于该已获准的专利中并未曾公开其具有预防或治疗过敏性气喘或异位性皮肤炎的功效，亦未公开其有效成分。
根据本发明，该PM-A0005菌株的萃取物可经由本技术领域所熟知的标准方法，例如利用溶菌酶分解菌体并以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。在本发明的一具体实施例中，是将该PM-A0005菌株以溶菌酶处理而释出细胞质内容物，接续以浓度递增的硫酸铵沉淀蛋白质以获得不同硫酸铵浓度的萃取物，根据不同的硫酸铵浓度可获得4个不同蛋白质萃取物，分别命名为AS_0-25%、AS_25-50%、AS_50-75%、AS_75-100%。将此4种蛋白质萃取物与小鼠树突细胞共同培养，发现AS_0-25%和AS_50-75%具有诱发小鼠树突细胞产生高于对照组（仅有细胞）3倍以上的IL-12表达量，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效；进而将AS_50-75%经腹腔注射投予小鼠，可显着降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，并显着抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象。因此证实该PM-A0005菌株的萃取物具有预防或治疗过敏性气喘的功效。
根据本发明，该PM-A0005菌株的区分物（fraction），可经由本技术领域所熟知的标准方法，自上述方法所获的萃取物，接续经离子交换层析（ion-exchangechromatography）分离而得。在本发明的一具体实施例中，进一步将萃取物AS_0-25%和AS_50-75%利用HiTrapTMDEAE-FF管柱以离子交换层析法分离活性物质。经由离子交换层析法，AS_0-25%可以分离出3个区分物IE1-1、IE1-2和IE1-3；AS_50-75%可以分离出3个区分物IE3-1、IE3-2和IE3-3。将此6种蛋白质区分物与小鼠树突细胞共同培养，发现该等区分物可诱发小鼠树突细胞产生高于对照组（仅有细胞）IL-12表达量，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效。其中IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3的IL-12表达量更高于对照组3倍以上。
根据本发明，该PM-A0005菌株的次区分物（subfraction），可经由本技术领域所熟知的标准方法，自上述方法所获的区分物以胶体过滤层析法（Gel-filtration chromatography）的方式进行更进一步的分离活性物质而得。在本发明的一具体实施例中，进一步将区分物IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3利用SephacrylTMS-300HR管柱给以胶体过滤层析分离，IE1-2可以分离出1个次区分物（subfraction）IE1-2G1；IE1-3可以分离出2个次区分物IE1-3G1和IE1-3G2；IE3-2可以分离出3个次区分物IE3-2G1、IE3-2G2和IE3-2G3；IE3-3可以分离出5个次区分物IE3-3G1、IE3-3G2、IE3-3G3、IE3-3G4和IE3-3G5。将此11种蛋白质次区分物与小鼠树突细胞共同培养，发现次区分物可诱发小鼠树突细胞产生高于对照组（仅有细胞）的IL-12表达量，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效，尤以IE3-3G1的IL-12表达量较对照组高出约7.3倍以上为最佳；其中将IE3-3G1经腹腔注射投予小鼠，可显着降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，并显着抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象，证实本发明的次区分物具有降低过敏反应，特别是预防或治疗过敏性气喘的功效。此外，在OVA或是Derp经皮致敏的小鼠以腹腔注射IE3-3G1后，显着减缓皮肤发炎现象，亦证明本发明次区分物具有降低预防或治疗异位性皮肤炎的功效。
本发明该PM-A0005菌株的萃取物、区分物及次区分物可进一步与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物，或一食品组合物。因其具有刺激免疫细胞IL-12表达的功效，可降低尘螨致敏小鼠的呼吸道阻力及抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象；亦可刺激抑制发炎的IL-10细胞激素,以降低经OVA或是Der p经皮致敏所造成的皮肤发炎反应，故可用于治疗或预防过敏性气喘或异位性皮肤炎。另外，该PM-A0005菌株本身亦具有治疗或预防异位性皮肤炎的功效。
根据本发明，可依本领域技术人员熟知或标准的方法，依需要选用适当的饮食用材料制成口服药物、食品或饮品。该食品或饮品包括但不限于乳品、发酵乳制品、饮料、运动饮料、营养添加物或保健食品、糖果或是胶质。
一些适当赋形剂的实施例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、褐藻酸盐、黄蓍树胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、纤维素、灭菌水、糖浆和甲基纤维素其中一种或几种。该组合物可另外包括润滑剂，湿润剂，乳化剂，悬浮剂，保存剂，甜味剂或调味剂其中一种或几种，其中润滑剂包括滑石粉、硬脂酸镁或矿物油其中一种或几种；保存剂包括羟基苯甲酸甲酯或丙酯其中一种或几种。
本发明进一步以下列实施例说明，其是提供示范的目的而非用以限制本发明。
实施例1PM-A0005菌株的制备
加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株以MRS培养基于37℃培养24小时，挑选单一菌落于5ml的无菌培养基（表1）于37℃培养20小时。第3天以无菌方式制作种子罐，取出菌液以50倍稀释于培养基中以37℃培养16小时。第4天将100ml菌液接种于含有3.5公升培养基的桌上型微处理控制发酵槽（型号：MajorScience,MS-F1）中进行发酵，于37℃、pH6.0条件下培养5.5小时。当发酵结束后，取出发酵菌液并使用高速离心机去除上清液留下菌泥，计数菌数达到109CFU。
表1
品名 英文名称 添加比例
葡萄糖 Glucose 2%
酵母抽出物 Yeast extract 3%
牛肉蛋白胨 Meat Peptone S2；编号：19518 3%
磷酸氢二钾 dipotassium phosphate 0.2%
硫酸镁 magnesium sulfate 0.005%
硫酸锰 manganese sulfate 0.001%
醋酸钠 sodium acetate 0.1%
柠檬酸铵 triammonium citrate 0.05%
碳酸钙 calcium carbonate 0.1%
Tween80 Tween80 0.1%
实施例2PM-A0005菌株萃取物的制备
将实施例1制备的PM-A0005菌株菌泥以PBS清洗3次，以50mM Tris-HCl（pH8.0）均匀悬浮菌液并加入1%溶菌酶（lysozyme），冰上静置反应2小时以释出细胞质内容物。溶菌酶反应后置于超高速离心机于4℃以22,500g离心30分钟，分成上清液（cytosolic fraction）及沉淀物（cell-wall fraction）两部分。将上清液置于冰浴并缓缓加入硫酸铵粉末至所需浓度（大于0且小于等于25％（w/w））；达到目标浓度后，继续搅拌10分钟并以22,500g于4℃离心30分钟，以适量体积的50mM Tris-HCl（pH8.0）回收沉淀的蛋白质，同时将离心后上清液继续以硫酸铵进行沈淀。重复以浓度为25-50%（w/w）、50-75%（w/w）及75-100%（w/w）硫酸铵进行沉淀，获得4种浓度的蛋白质萃取物，分别命名为AS_0-25%、AS_25-50%、AS_50-75%、AS_75-100%。使用透析膜（分子量6,000-8,000），将收集到的4种蛋白质萃取物置于5公升的50mM Tris-HCl（pH8.0）于4℃透析24小时，透析结束后使用高速离心机以4℃转速22,500g离心30分钟，收集上清液，并测量蛋白质浓度。
实施例3小鼠树突细胞的分离及介白素-12（IL-12）测定
牺牲小鼠取得腿骨并清除肌肉组织，以针筒注入5-10ml培养基将细胞冲出，将细胞悬浮液于4℃以1,500rpm离心10分钟，去除上清液。加入1ml红血球溶离缓冲液1分钟以去除红血球，随后加入9ml PBS于4℃以1,500rpm离心10分钟沉淀细胞。去除上清液，以PBS清洗2次后将细胞悬浮于培养基中，加入IL-4（1μl/ml）及GM-CSF（1.5μl/ml）共同培养促使细胞分化成树状细胞。培养8天后收集细胞并调整细胞浓度为4×106/ml。将树状细胞与待测物共同培养48小时，收取细胞培养的上清液。利用酵素免疫分析法（ELISA）侦测上清液中IL-12p40的含量。
将此4种蛋白质萃取物（10μg）与小鼠树突细胞共同培养，经由ELISA测量小鼠树突细胞的细胞激素IL-12（IL-12p40）分泌量以评估免疫调节功效。实验结果显示，AS_0-25%、AS_25-50%、AS_50-75%、AS_75-100%分别刺激小鼠树突细胞产生544.62pg/ml、315.90pg/ml、597.27pg/ml和159.80pg/ml的IL-12（表2），其中AS_0-25%和AS_50-75%可诱发小鼠树突细胞表达IL-12高于对照组（仅有细胞）3倍以上。
表2
实施例4PM-A0005菌株区分物的制备及活性测试
将实施例2所得经硫酸铵沉淀后的蛋白，经由离子交换树脂管柱层析系统（BioLogic Duo Flow Chromatography System,Bio-Rad）初步分离活性物质。使用的离子交换树脂管柱为DEAE-FF（HiTrapTM,GE Healthcare）。进行蛋白质层析前，以2倍以上管柱体积的缓冲液A（50mM Tris-HCl,pH8.5）充满离子交换管柱进行平衡，随后注入蛋白质样本，以6倍以上管柱体积的缓冲液A进行纯化，同时启动分划收集器收集流出物，每1ml收集1管。收集30ml后。利用缓冲液B（50mM Tris-HCl pH8.5，1M NaCl）提升盐度梯度冲提蛋白质，最后再以100%的缓冲液B洗出残余蛋白质。其中AS_0-25%的蛋白质萃取物可分离出IE1-1、IE1-2、IE1-3三种区分物（fraction）；AS_50-75%的蛋白质萃取物可分离出IE3-1、IE3-2、IE3-3三种区分物。
进一步将萃取物AS_0-25%和AS_50-75%以离子交换层析法（ion-exchangechromatography）分离活性物质（图1A）。经由离子交换层析，AS_0-25%可以分离出3个区分物（fraction），分别为IE1-1、IE1-2和IE1-3（图1B）；AS_50-75%可以分离出3个区分物IE3-1、IE3-2和IE3-3（图1C）。
将此6个区分物经由测量小鼠树突细胞的IL-12（IL12p40）分泌量以评估免疫调节功效。实验结果显示显示IE1-1、IE1-2、IE1-3、IE3-1、IE3-2和IE3-3分别刺激小鼠树突细胞产生IL-12达427.6pg/ml、1135.85pg/ml、1213.2pg/ml、258.87pg/ml、1098.41pg/ml和1850.39pg/ml（表3），其中IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3可诱发小鼠树突细胞表达IL-12高于对照组（仅有细胞）3倍以上。
表3
实施例5PM-A0005菌株次区分物的制备及活性测试
经实施例4离子交换树脂管柱层析分离所获得的区分物IE1-2、IE1-3、IE3-2、IE3-3再以胶体过滤管柱层析分离（SephacrylTMS-300HR Column,AmershamBioscience）。进行前，管柱与操作机器先以2倍以上管柱体积的缓冲液（50mMTris-HCl,pH9.5,50mM NaCl）进行平衡。取样本以针筒注入管柱，样本体积约为胶体体积的3%以下，再注入样本后以预定流速约0.5ml/min进行，收集所得的样本进行蛋白质定量及活性分析。
将区分物IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3利用胶体过滤层析（Gel-filtrationchromatography）（图2A）进行更进一步的分离活性物质。经由胶体过滤层析法，IE1-2可以分离出1个次区分物（subfraction）IE1-2G1（图2B）；IE1-3可以分离出2个次区分物IE1-3G1和IE1-3G2（图2C）；IE3-2可以分离出3个次区分物IE3-2G1、IE3-2G2和IE3-2G3（图2D）；IE3-3可以分离出5个次区分物IE3-3G1、IE3-3G2、IE3-3G3、IE3-3G4和IE3-3G5（图2E）。
将此11个经由胶体过滤层析纯化所获得的次区分物经由测量小鼠树突细胞的细胞激素IL-12（IL12p40）分泌量以评估免疫调节功效。实验结果显示IE1-2G1、IE1-3G1、IE1-3G2、IE3-2G1、IE3-2G2、IE3-2G3、IE3-3G1、IE3-3G2、IE3-3G3、IE3-3G4和IE3-3G5分别刺激小鼠树突细胞产生176.5pg/ml、559.63pg/ml、327.75pg/ml、813.38pg/ml、398.75pg/ml、234.50pg/ml、1493.63pg/ml、215.13pg/ml、203.63pg/ml、227.38pg/ml、245.50pg/ml的IL-12（表4），其中IE3-3G1可诱发小鼠树突细胞IL-12的表达，高于对照组（仅有细胞）7.3倍以上。
表4
实施例6PM-A0005菌株的有效成分可降低小鼠的过敏性气喘
材料与方法
1.以尘螨致敏的小鼠模型的制备
将家尘螨萃取物（Der p extract）和氢氧化铝混合均匀以腹腔注射方式致敏小鼠，每次注射时间间隔1周，共注射3次。第3次注射后1周，于气管内接种过敏原诱发反应。小鼠秤重后进行麻醉，以镊子夹出小鼠的舌头，再以微量注射器于喉咙滴进50μl的家尘螨抗原溶液（0.5mg/ml）。等待小鼠发出呛鼻声后松开镊子，放掉舌头，小鼠保持直立状态1分钟后，并以光照致恢复清醒。
2.支气管肺泡冲洗液的收集及白血球分类
以1ml低温无菌生理食盐水经由针头慢慢注入肺部致整个肺完全膨胀再回抽，如此反复三次后，将冲洗液置于冰上暂存。重复此冲洗步骤，将收集到的肺泡冲洗液（2次共约1.8ml），以1,200rpm、4℃离心10分钟。收集上清液保存于-70℃冰箱。将沉淀的细胞经伊红Y（eosinY）染色并计算细胞数目。取50-100μl支气管肺泡冲洗液，以cytospin离心机制作细胞抹片，进行刘氏染色（Liu’sstain）并以油镜观察白血球及计数。
3.组织切片染色
已固定的组织切片首先脱腊并复水（rehydrate），浸于蒸馏水后，以0.5%过碘酸反应15分钟，以自来水冲洗5分钟，再次浸于蒸馏水后，用希夫氏（Schiff’s）试剂反应5分钟，自来水冲洗5分后脱水并封片。在光学显微镜观察，醣蛋白及中性黏液呈红色，细胞核呈现蓝色。
4.小鼠呼吸道阻力测量
利用小动物无创呼吸道高反应系统（Unrestrained Whole BodyPlethysmography）（BUXCO）进行呼吸道阻力（enhance pulsed）测量，以喷雾的方式给予老鼠0mg/ml，6.25mg/ml，12.5mg/ml，25mg/ml，50mg/ml溶于PBS的甲基胆碱后，量测呼吸道阻力值（Penh value）做为评估标准。
5.小鼠脾脏细胞的分离及干扰素-γ（IFN-γ）测定
取小鼠脾脏添加适量PBS缓冲液并以玻棒捣碎至无碎片，混合均匀后以500rpm离心1分钟分离残余组织及脾脏细胞，将含有脾脏细胞的上清液以Ficoll分离（于16℃以720g离心25分钟），接续以PBS清洗3次，将细胞悬浮于RPMI-1640培养基，进行细胞计数并调整浓度至4×106个/ml。将脾脏细胞与待测物共同培养48小时，收取细胞培养的上清液并利用酵素免疫分析法（ELISA）侦测上清液中IFN-γ的含量。
结果
利用尘螨致敏小鼠气喘动物模式来评估萃取物AS_50-75%（AS）及次区分物IE3-3G1（IE）是否具有降低过敏反应的功效。以尘螨诱发小鼠呼吸道过敏气喘反应后，会引发呼吸道高度反应性（airway hyperresponse,AHR），此处利用非侵入性方式测量老鼠呼吸道对气管收缩剂甲基胆碱的抵抗力，以呼吸道阻力值（Penh value）来评估小鼠的肺部功能是否良好，Penh value越高代表小鼠呼吸道阻力大，其肺部状态差。如图3所示，由实验结果发现，正对照组（尘螨致敏组）随着给予甲基胆碱浓度的提升，而其Penh value也随的增加，但给予萃取物AS_50-75%（尘螨致敏-AS）和次区分物IE3-3G1（尘螨致敏-IE）的组别，其Penh value与正对照组相比显着性的下降，显示降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，缓解气喘。
进一步观察肺部细胞冲洗液，发现尘螨致敏小鼠其肺部细胞冲洗液中细胞数量大幅增加（图4A），显示肺脏有发炎、细胞浸润现象，相对于此，投予萃取物AS_50-75%和次区分物IE3-3G1可显着降低肺部细胞冲洗液中细胞数目，而由血球细胞分类结果可知嗜酸性白血球及嗜中性白血球比例大幅降低，显示有效抑制发炎现象（图4B）。此外，测量肺部细胞冲洗液中胸腺活化调节趋化因子（thymus and activation-regulated chemokine,TARC）浓度，结果显示投予AS_50-75%和IE3-3G1的小鼠其肺脏中TARC表达量相较于正对照组显着下降（图4C）。肺泡组织切片的H&E染色结果可发现，经投予AS_50-75%和IE3-3G1可有效地降低小鼠气管壁增厚及改善免疫细胞大量浸润等现象（图5）。
由上述结果可知，经投予萃取物AS_50-75%和次区分物IE3-3G1，可有效降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，并显着抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象，显示其可有效抑制小鼠呼吸道过敏反应、缓解气喘现象。
实施例7PM-A0005菌株及其有效成分可改善小鼠的异位性皮肤炎
材料与方法
1.以尘螨或卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠模型的制备
小鼠经皮致敏及实验动物模式如下:
小鼠经皮致敏模式系于小鼠麻醉后将1x1公分的纱布混合100μl的PBS溶液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH7.2,溶于1LddH2O)及50μg/只的尘螨萃取物或是100μg/只的卵白蛋白后固定于小鼠颈背部上。七天后拆除纱布并让小鼠休息十四天。重复上述步骤两次，并于第五十天时将小鼠牺牲。给予PM-A0005菌株的实验组别其经皮致敏模式同上，并且从第一天开始，每天分别喂食200μl的PBS缓冲液(对照组)、1x107CFU或是1x109CFU的PM-A0005菌株，并于第五十天牺牲小鼠。另外，给予IE3-3G1的实验组别其经皮致敏模式同上，并在每次固定纱布时,同时以腹部注射投予25μgIE3-3G1，总共三次，并于第五十天牺牲小鼠。
2.皮肤生理状况测量
小鼠麻醉后利用Cutometer580测量皮肤含水量以及pH值。而表皮水分经皮肤蒸发量则是利用Tewameter TM210仪器进行测量。
3.小鼠脾脏细胞增生反应及细胞激素分泌
取出小鼠脾脏并利用无菌针筒推进器尾端将脾脏磨碎，磨好的脾脏细胞悬浮液于4℃下以300g离心5分钟。去除上清液后以3ml红血球细胞(red bloodcell，RBC)裂解缓冲液回溶静置于冰上。接着以等体积cRPMI培养基(RPMI-1640培养基含有2mM L-麸酰胺酸(L-glutamine)、50mM2-巯基一醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)、0.5%青链霉素(Penicillin-Streptomycin)、1mM非必需氨基酸及胎牛血清(Fetal Bovine Serum)，pH7.2)终止反应并于4℃下以300g离心5分钟。最后以1ml cRPMI回溶细胞，计算细胞数目并调整细胞浓度至1x107/ml。
将脾脏细胞分别加入Der p、OVA或白血球凝集素(leucoagglutinin,PHA-L)共同培养48小时及72小时，并于前四个小时(第44及68小时)加入10μl八肽胆囊收缩素(cholecystokinin-8,CCK-8)，4小时后用450nm波长测量吸光值,再除以未给予细胞刺激的读值,所得比值即为脾脏细胞增生的情形。
另外，将脾脏细胞与Der p、OVA或PHA-L共同培养48小后，收取细胞培养的上清液并利用酵素免疫分析法(ELISA)侦测上清液中IFN-γ、IL-10及IL-17的含量。
4.流式细胞仪分析小鼠淋巴细胞分群
取出小鼠腋下淋巴结后利用含2%胎牛血清的RPMI将细胞数目调整至5x105个/管，并于4℃下以400g离心5分钟后去除上清液。依据CD3、CD4、CD25抗体所需浓度分别加入100μl/管，冰上避光作用30分钟以1ml含2%胎牛血清的RPMI回溶,并于4℃下以400g离心5分钟，再以固定及通透缓冲液进行处理，最后利用FACSCalibur流式细胞仪分析。
5.血清中免疫球蛋白E(IgE)抗体总量及血清中OVA及Der p特异性IgE测定
将IgE捕捉抗体（capture antibody)、OVA及Der p分别以涂覆缓冲液（coatingbuffer）（50mM碳酸盐涂覆缓冲液:0.015M Na2CO3、0.035M NaHCO3，pH9.6溶于1L ddH2O)稀释100倍后以100μl/孔的量加至96孔盘并于室温静置1小时。接着以TBST(50mM Tris-base、0.14M NaCl、0.05%Tween20，pH8.0溶于1LddH2O)冲洗,并加入200μl/孔的阻断缓冲液(50mM Tris-base,0.14M NaCl,1%BSA,pH8.0)静置于室温下并以TBST冲洗。每孔加入100μl已由样本/共轭稀释液(sample/conjugate diluents)(50mM Tris-base、0.14M NaCl、1%BSA，0.05%Tween20、pH8.0）稀释50倍的小鼠血清或已知浓度的小鼠IgE标准品，经室温反应1小时后，以TBST冲洗。接着加入HRP-共轭IgE侦测抗体(HRP-conjugated IgE detection antibody)并避光静置于室温下,以TBST冲洗后加入TMB（3，3'5，5'-Tetramethyl Benzidine)呈色。最后加入2N H2SO4终止呈色反应并用450nm波长测定吸光值。
6.组织切片染色
已固定的组织切片首先脱腊并于复水后分别进行免疫组织化学染色及苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin stain,H&E stain)。
A.免疫组织化学染色
复水后将玻片放入柠檬酸钠（Sodium Citrate）缓冲液（10mM Sodium Citrate,0.05%Tween20，pH6、溶于1L ddH2O)并于高压下在室温静置5分钟。放入TBST5分钟后，取出玻片以疏水笔(PAP pen)在组织外划圈并放入TBST浸润。接着在画好圈的组织滴上过氧化酶阻断剂(Peroxidase Blocking Agent)并以TSBT清洗。接着滴上蛋白质阻断剂(Protein Blocking Agent)并以TSBT清洗。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)、介白素-17(Interleukin-17)及兰格素(Langerin)的抗体分别利用一般抗体稀释液进行稀释。接着以TSBT清洗后滴上NovoLinkTM聚合物10分钟。以TSBT清洗后再加入DAB(3，3'-Diaminobenzidine)呈色5分钟并以蒸馏水终止反应，最后加入苏木精并以蒸馏水终止反应。待干燥后进行封片。
B.苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin stain,H&E stain)
复水后将玻片以苏木精染色5分钟，以自来水冲洗并再次浸于蒸馏水。接着以伊红染色30秒，并接续浸润于乙醇及二甲苯(xylene)，待干燥后进行封片。
结果
1.PM-A0005及其有效成分IE3-3G1可减缓异位性皮肤炎小鼠皮肤屏障功能缺失
喂食小鼠不同剂量(1x107CFU或1x109CFU)的PM-A0005相较于仅喂食PBS缓冲液或是不喂食的对照组，发现其小鼠皮肤较为平整光滑，且皮屑的产生减少(图6A)。而不论喂食不同剂量PM-A0005的组别或是对照组，测量小鼠皮肤含水量后发现各组别之间并无统计上的差异(图6B)。在喂食不同剂量PM-A0005的组别，其皮肤pH值有升高的现象(图6C)。而经皮肤水分散失量，不论有无喂食PM-A0005都没有统计上的差异(图6D)。
在以OVA或Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的小鼠，相较于仅腹腔注射PBS缓冲液的小鼠，可发现其小鼠皮肤的皱折减少也较为平整光滑，且皮屑的产生减少(图7A)。测量小鼠皮肤含水量，其腹腔注射IE3-3G1的小鼠高于仅腹腔注射PBS缓冲液小鼠的皮肤含水量，其中以OVA经皮致敏的组别具有显着的差异(图7B)。在OVA经皮致敏的小鼠，无论有无给予IE3-3G1，其小鼠皮肤pH值没有变化；而在Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的小鼠，其小鼠皮肤pH值低于仅以腹腔注射PBS的小鼠组别(图7C)。而在经皮肤水分散失量上，不论OVA或Der p经皮致敏并给予IE3-3G1只小鼠，相较于仅腹腔注射PBS缓冲液小鼠，其经皮肤水分散失量皆呈现下降(图7D)。
2.PM A0005及其有效成分IE3-3G1可减缓异位性皮肤炎小鼠的皮肤发炎反应
由苏木精-伊红染色的皮肤组织切片中、可发现在喂食PBS缓冲液或不喂食的对照组中、其表皮层和真皮层产生增厚，且同时产生大量免疫细胞的浸润(图8A及8B)及嗜酸性粒细胞(eosinophils)数量的增加(图8C)。而在喂食不同剂量PM-A0005的小鼠组别，其表皮层和真皮层增厚情形减缓且免疫细胞浸润减少(图8A及8B)、而嗜酸性粒细胞数目亦减少(图8C)。
在OVA或Der p经皮致敏并以腹腔注射PBS缓冲液的组别，其表皮层和真皮层均明显增厚，且同时产生大量免疫细胞的浸润(图9A及9B)及嗜酸性粒细胞数量的增加(图9C)。而在OVA或是Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别，其表皮层和真皮层增厚情形减缓且免疫细胞浸润减少(图9A及9B)、而嗜酸性粒细胞数目亦减少(图9C)。
3.PM-A0005及其有效成分IE3-3G1可减少表皮层TSLP产生并减少兰格罕细胞的转位
利用免疫组织化学染色后可发现喂食PBS缓冲液的组别或不喂食的对照组中，其表皮层的TSLP大量表达(图10)且兰格罕细胞位于真皮层的数目明显增加(图11A及11B)。相对于喂食不同剂量PM-A0005的小鼠组别，其表皮层的TSLP表达量明显减少(图10)且兰格罕细胞位于真皮层的数目亦明显减少(图11A及11B)。
在OVA或是Der p经皮致敏并以腹腔注射PBS缓冲液的组别、其表皮层的TSLP大量表达、而OVA或是Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别，其表皮层的TSLP表达量则明显减少(图12)。而腹腔注射PBS缓冲液的组别，不论是利用OVA或是Der p经皮致敏其兰格罕细胞位于真皮层的数目明显增多。而腹腔注射IE3-3G1的组别，其位于真皮层的兰格罕细胞数目明显减少（图13A及13B）。
4.PM-A0005及其有效成分IE3-3G1对于血清中总IgE以及特异性IgE的表达
小鼠在未处理前及每次经皮致敏后进行脸颊采血以收取血清并利用ELISA方式检测小鼠血清中的免疫球蛋白IgE。结果发现每天喂食不同剂量PM-A0005的小鼠组别与对照组比较后，其血清中总IgE量并无统计上的差异（图14A）。而OVA特异性IgE的表达量在喂食1x107CFU的PM-A0005组别相较对照组有明显下降(图14B)。
另外，比较喂食不同剂量PM-A0005的组别后，发现喂食剂量1x107CFU的小鼠相较于喂食剂量1x109CFU的小鼠，其OVA特异性IgE表达量略为减少(图14B)。而在OVA或Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别，其血清中总IgE的量和对照组织间并无统计上的差异（图15A）。而OVA特异性IgE和Der p特异性IgE在腹腔注射IE3-3G1或PBS的组别间亦无统计上的差异(图15B及15C)。
5.PM-A0005及其有效成分IE3-3G1对于脾脏细胞增生能力的影响
将脾脏细胞分别投予不同浓度PHA L或OVA并于72小时后测量吸光值。结果显示，喂食给予不同剂量PM-A0005的组别及对照组皆无影响脾脏细胞对于特定抗原OVA，或非特定抗原PHA-L的增生能力(图16)。
另外，将脾脏细胞分别投予不同浓度PHA-L、OVA或Der p、并于72小时后测量吸光值。在OVA经皮致敏并以腹腔注射PBS缓冲液或IE3-3G1的小鼠组别，其不会影响脾脏细胞对于特定抗原OVA或非特定抗原PHA-L的增生能力(图17A)。而在Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1只小鼠组别，相较于仅给予腹腔注射PBS缓冲液的小鼠组别，其脾脏细胞对于特定抗原Der p的增生反应有明显的下降(图17B)。
6.PM-A0005及其有效成分IE3-3G1影响小鼠脾脏细胞中细胞激素的分泌
在投予PHA-L后，喂食不同剂量PM-A0005小鼠相较于仅喂食PBS缓冲液的组别其IFN-γ分泌量均下降(图18A)。而IL-17在喂食不同剂量PM-A0005的组别，相较于喂食PBS缓冲液的组别，其分泌量亦呈下降（图18B）。另外，在抑制发炎反应的细胞激素IL-10表达量上、喂食剂量1x107CFU的PM-A0005组别相较于喂食PBS缓冲液的组别及不喂食的对照组，其表达量呈现上升；而在喂食剂量1x109CFU的PM-A0005组别相较于不喂食的对照组，其表达量亦呈上升。除此之外，喂食剂量1x107CFU相较于喂食剂量1x109CFU的PM-A0005，其IL-10的表达量更为提高(图18C)。
在投予PHA-L后，在IFN-γ的分泌量上，OVA经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别与腹腔注射PBS缓冲液的组别并没有差异。而Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别，相较于以腹腔注射PBS缓冲液的组别,其IFN-γ的分泌量明显上升(图19A)。而在IL-17的分泌量上，OVA经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别系低于以腹腔注射PBS缓冲液的组别,但Der p经皮致敏在IL-17的分泌量上没有统计差异(图19B)。另外，在抑制发炎反应的细胞激素IL-10表达量，OVA经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别，相较于以腹腔注射PBS缓冲液的组别，其脾脏细胞在投予特定抗原OVA后,其分泌出较多的IL-10，但Der p经皮致敏在IL-10表达量没有统计上差异(图19C)。
7.PM-A0005及其有效成分IE3-3G1可降低皮肤中的IL-17分泌量
小鼠皮肤组织藉由免疫组织化学染色后，可发现喂食不同剂量PM-A0005的组别，相较于喂食PBS缓冲液的组别及不喂食的对照组，其皮肤中的IL-17表达量明显下降(图20)。
另外，无论系以OVA或Der p经皮致敏并以腹腔注射IE3-3G1的组别，相较于以腹腔注射PBS缓冲液的组别，其IL-17表达量均呈现下降(图21)。
实施例8IE3-3G1有效成分鉴定
经胶体过滤管柱层析分离出来的次区分物IE3-3G1委托台湾成功大学医学院蛋白质体核心实验室进行二维电泳分析，并由LC-MS/MS进行蛋白质鉴定，接续比对Matrix Science数据库确认。
将次区分物IE3-3G1进行二维电泳分析以进行有效成分的鉴定。分析结果显示在40kD有5个蛋白质点、在25kD有1个蛋白质点，共有6个蛋白质点。接续以LC-MS/MS鉴定蛋白质，经由序列数据库比对后确认此6个蛋白质点编号1-编号5为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphate Dehydrogenase,G3PDH）、编号6为果糖二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphate Aldolase）（图22）。由二维电泳和LC-MS/MS蛋白质身分鉴定结果，得知本发明有效成分为约40kD的蛋白质，即甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）。
实施例9建构包含G3PDH基因的质体及G3PDH重组蛋白表达
为了进一步证实G3PDH为PM-A0005菌株中的有效成分，利用分子生物学的方式进行重组蛋白表达。根据基因体数据库的DNA序列设计含有限制酶切位点的引物（oligo-primer），利用聚合酶链式反应进行扩增，并与pET303/CT-His（Invitrogen,USA）表达载体进行DNA重组，以获得pET303-G3PDH-His重组载体。将pET303-G3PDH-His重组载体转染至E.coli DH5α感受态细胞中进行此重组载体的复制。以小量质粒提取试剂盒（mini plasmid extraction kit,Viogen,USA）纯化此重组载体，并以DNA测序确认。
首先，由NCBI基因数据库中搜寻出Lactobacillus gasseri G3PDH的基因序列(SEQ ID NO:2)，以专一性引物（表5）由加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株基因体以聚合酶链式反应扩增，再利用限制酶XbaI和XhoI切割，且纯化的pET303/CT-His载体同样使用XbaI和XhoI切割后，将酶切后的G3PDH基因与载体混合，并用DNA连接酶连结后以大肠杆菌培养及增殖，得到重组质体pET303-G3PDH-His，并经DNA测序确认基因序列。
表5
经前述DNA测序的G3PDH DNA序列，翻译成蛋白质的氨基酸序列，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
接着将pET303-G3PDH-His重组载体转化到BL21-DE5，并以菌落PCR确定转化成功。将含有重组质体pET303-G3PDH-His的BL21-DE5菌体于37℃培养于LB培养液中，当OD到达0.4时于将菌液移至26℃培养并加入IPTG诱导重组蛋白表达，随后于4℃下以4,000rpm离心20分钟沉淀菌体。利用溶菌酶（1mg/ml）溶解菌体，并于4℃下以22,500g离心30分钟去除沉淀物，使用能与His-tag做专一性结合带有镍离子的亲和性管住纯化上清液中重组蛋白，以分光亮度计于吸光值280nm量测蛋白质浓度，并以考马斯蓝（Coomassie Blue）染色及使用抗组氨酸（Histidine）抗体进行western bolt分析鉴定蛋白质纯度。结果显示G3PDH重组蛋白质的大量表达，得到较纯的重组蛋白G3PDH-His，并利用Anti-His抗体确认该重组蛋白含有His-tag(如图23)。
实施例10G3PDH可刺激免疫细胞分泌IL-12及IFN-γ
将G3PDH重组蛋白与小鼠树突细胞共同培养以评估对于免疫调节的功效，其中以添加LPS或PHA-L为正对照组，仅有细胞而未额外添加刺激物组为对照组，其结果表6所示。结果显示G3PDH可诱发小鼠树突细胞产生细胞激素IL-12平均达28235.06pg/ml，为对照组（仅有细胞）的44倍(如图24所示)。
表6
另一方面，将G3PDH重组蛋白与小鼠脾脏细胞共同培养以评估对于免疫调节的功效，其中以添加LPS或PHA为正对照组，仅有细胞而未额外添加刺激物组为对照组，其结果如表7所示。结果显示G3PDH可诱发小鼠脾脏细胞产生细胞激素IFN-γ平均达341.32pg/ml，为对照组（仅有细胞）的10倍(如图25所示)。
表7
总结，经由体外及体内试验的结果证实该加氏乳酸杆菌PM-A0005菌株及其萃取物、区分物、次区分物，以及其有效成分甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有刺激免疫细胞IL-10、IL-12及IFN-γ分泌的功效，因此可调控Th1型免疫反应而抑制免疫球蛋白，改善Th2免疫反应过剩的过敏现象及影响Th17细胞分化，因此可用于刺激免疫细胞、调节免疫反应。此外，上述成分亦可显着降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，并显着抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象及改善表皮层与真皮层增厚和免疫细胞浸润现象，因此可用于治疗或预防过敏性疾病及气喘及异位性皮肤炎。
相信本领域技术人员基于本文的叙述，无须进一步的例示即可将本发明应用至其最广泛的范围。因此，应了解此处所提供的叙述及申请专利范围是供例示目的而非以任何方式限制本发明的范畴。

Claims (16)

1.甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphate Dehydrogenase，G3PDH）或其具相同功能的变异体或片段在制备降低个体过敏反应的药剂中的用途。
2.甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备治疗或预防过敏性疾病的药剂中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其中该过敏性疾病为气喘。
4.如权利要求2所述的用途，其中该过敏性疾病为异位性皮肤炎。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中该甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中该甘油醛-3-磷酸脱氢酶是选自由加氏乳酸杆菌（Lactobacillus gasseri）PM-A0005菌株及其萃取物、区分物、次区分物或有效成分所组成的群组；其中该PM-A0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M207039。
7.如权利要求6所述的用途，其中该萃取物为溶菌酶分解该PM-A0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。
8.如权利要求7的所述用途，其中该萃取物为以浓度为大于0且小于等于25%或浓度为50-75%的硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。
9.如权利要求6所述的用途，其中该区分物为溶菌酶分解该PM-A0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得萃取物后，其再经离子交换层析（ion-exchangechromatography）分离而得。
10.如权利要求9所述的用途，其中该区分物为选自由IE1-2、IE1-3、IE3-2及IE3-3所组成的群组。
11.如权利要求6所述的用途，其中该次区分物为溶菌酶分解该PM-A0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得的萃取物，其再经离子交换层析分离获得区分物后，再以胶体过滤层析法（gel filtration chromatography）分离而得。
12.如权利要求11所述的用途，其中该次区分物为IE3-3G1。
13.如权利要求12所述的用途，其中该次区分物为IE3-3G1的有效成分为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
14.如权利要求6所述的用途，其中该PM-A0005菌株的萃取物、区分物及次区分物可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。
15.如权利要求1或2所述的用途，其中该甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。
16.一种加氏乳酸杆菌（Lactobacillus gasseri）PM-A0005菌株在制备治疗或预防异位性皮肤炎的药剂中的用途，其中该PM-A0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M207039。
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