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CN115074341B - 第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用 - Google Patents

第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用 Download PDF

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Abstract

第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用。本公开涉及一种提高酯酶活性的方法、一种具有酯酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备酯酶的方法和酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用。本公开实现了对酯酶进行关键位点的氨基酸优化，改善了酯酶在生物制药、生物修复以及低温洗涤等领域的应用中的使用效果。

Description

第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用
相关申请
本申请是申请日为2021年04月28日，申请号为202110469012.9的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种提高酯酶活性的方法、一种具有酯酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备酯酶的方法和酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用。
背景技术
酯酶是一类能够催化各种酯键断裂和形成的酶，其结构通常由N端的盖子结构域和C端的α/β水解酶催化域组成。N端的盖子结构域通常是位于活性中心正上方的两个α螺旋，C端催化域包含了多个磷酸化位点的Ser-Asp-His催化三联体，以及稳定四面体中间态的氧阴离子洞，这些结构对于酯酶的催化特征以及工程设计至关重要。大多数酯酶具有一定的立体选择性、区域选择性以及广泛的底物谱，能够应用于多种工业领域，而冷适应性的酯酶因其低温活性而具有稳定产物以及节能环保的特点，因而在生物制药、生物修复以及低温洗涤等领域的应用受到广泛关注。
极端微生物在自然进化中适应了高温、低温、高压等极端环境，是极端酶基因资源的优质来源。目前生产的酶制剂品种较为单一，不能满足工业需求，因而仍需要对具有特殊性能的酶资源进行开发。目前发现的生物酶热稳定性普遍较差，不利于工业应用，因而对酶热稳定性的改良变得尤为重要。
因此，亟需提供一种对酯酶进行优化的方法，提高该降解酶效率，增强酶热稳定性。
发明内容
为了进一步满足实际应用的需求，本公开提供了一种提高酯酶活性的方法、一种具有酯酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备酯酶的方法和酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用。
本公开第一方面提供了一种提高酯酶活性的方法，该方法包括将野生型酯酶的待突变氨基酸残基中的一个或多个进行突变改造，其特征在于，所述野生型酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述待突变氨基酸残基包括第132位丝氨基酸残基、第163位苏氨酸残基、第238位丝氨酸残基和第285位酪氨酸残基；所述突变改造为氨基酸残基的取代。
本公开第二方面提供了一种具有酯酶活性的蛋白，所述蛋白为如SEQ ID NO.2所示的野生型酯酶的氨基酸序列经过取代1、2、3或4个氨基酸衍生的蛋白；并且，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本公开第三方面提供了一种编码第二方面所述的蛋白的基因，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.3、4、5或6所示的DNA分子。
本公开第四方面提供了一种重组载体，其中，所述重组载体插入有第二方面所述的基因。
本公开第五方面提供了一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括第二方面所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第四方面所述的重组载体。
本公开第六方面提供了一种制备酯酶的方法，其中，所述方法包括：将第五方面所述的转化体接种于培养基中进行培养，得到培养后的物料。
本公开第七方面提供了一种酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用，其中，所述酯酶含有第二方面所述的蛋白。
通过上述技术方案，本公开提供了一种提高酯酶活性的方法、具有酯酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备酯酶的方法和酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用，在酯酶的优化改造中具有重要的应用价值。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是酯酶DcaE4及突变体S132的酶活性。
图2是酯酶DcaE4及突变体T163的酶活性。
图3是酯酶DcaE4及突变体S238的酶活性。
图4是酯酶DcaE4及突变体Y285的酶活性。
图5是酯酶DcaE4及突变体的最适温度(A)热稳定性(B)及40℃(C)和50℃(D)半衰期测定。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供了一种提高酯酶活性的方法，该方法包括将野生型酯酶的待突变氨基酸残基中的一个或多个进行突变改造，其特征在于，所述野生型酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述待突变氨基酸残基包括第132位丝氨基酸残基、第163位苏氨酸残基、第238位丝氨酸残基和第285位酪氨酸残基；所述突变改造为氨基酸残基的取代。
根据本公开，其中，可选地，所述突变改造包括如下(a)～(d)中的至少一者：
(a)将第132位丝氨基酸残基突变为丙氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酰氨残基、谷氨酸残基和络氨酸残基中的一种；
(b)将第163位苏氨酸残基突变为丙氨酸残基、组氨酸残基、亮氨酸残基、天冬酰氨残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基中的一种；
(c)将第238位丝氨酸残基突变为天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、精氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、天冬酰氨残基、络氨酸残基、脯氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基中的一种；
(d)将第285位酪氨酸残基突变为色氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基、精氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、谷氨酸残基、半胱氨酸残基中的一种。
其中，上述(a)～(d)的突变改造可以在同一酯酶中任意地组合。
优选地，所述突变改造包括如下(i)～(iv)中的任意一者：
(i)将第132位丝氨基酸残基突变为丙氨酸残基；
(ii)将第163位苏氨酸残基突变为丙氨酸残基；
(iii)将第238位丝氨酸残基突变为天冬酰胺残基；
(iv)将第285位酪氨酸残基突变为苯丙氨酸残基。
本公开第二方面提供了一种具有酯酶活性的蛋白，所述蛋白为如SEQ ID NO.2所示的野生型酯酶的氨基酸序列经过取代1、2、3或4个氨基酸衍生的蛋白；并且，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本公开，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、4、5或6所示。
本公开第三方面提供了一种编码第二方面所述的蛋白的基因，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.7、8、9或10所示的DNA分子。
本公开第四方面提供了一种重组载体，其中，所述重组载体插入有第二方面所述的基因。
根据本公开，其中，所述重组载体可以是重组表达载体或是重组克隆载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为SEQ ID NO.11、12、13或14所示的DNA分子。
其中，SEQ ID NO.12与SEQ ID NO.11不同的是：SEQ ID NO.12核苷酸序列中的第5659位碱基为G；SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.11不同的是：SEQ ID NO.13核苷酸序列中的第6026位碱基为T；SEQ ID NO.14与SEQ ID NO.11不同的是：SEQ ID NO.14核苷酸序列中的第5885位碱基为A。
本公开第五方面提供了一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括第二方面所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第四方面所述的重组载体。
根据本公开，所述基因工程菌可以是野生型的基因工程菌或人工改造的基因工程菌，例如为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和丝状真菌中的至少一种。
本公开第六方面提供了一种制备酯酶的方法，其中，所述方法包括：将第五方面所述的转化体接种于培养基中进行培养，得到培养后的物料。
其中，培养基和培养条件可以为已知的各种合适的选择。培养后的物料含有本公开第一方面提供的具有酯酶活性的蛋白，因而具有酯酶酶活性，可以根据需要直接作为酯酶组合物使用，也可以根据需要纯化出本公开第一方面提供的具有酯酶活性的蛋白，再进行使用。
本公开第七方面提供了一种酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用，其中，所述酯酶含有第二方面所述的蛋白。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例构建表达耐辐射异常球菌DcaE4基因及突变体的重组大表达肠杆菌工程菌株。
本公开中表达质粒pET28a为德国默克公司市售产品；大肠杆菌BL21(DE3)为北京诺唯赞公司市售产品；定点突变试剂盒(Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2)购自南京诺维赞公司。
1.根据耐辐射异常球菌基因组中的DcaE4基因序列设计PCR特异性引物：DcaE4-F：5′CCATGGCTGATATCGGATCCATGCCCGTAGACCCCAACCT 3′(SEQ ID NO.12)；DcaE4-R：5′CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGCCGCGCAGTTGCTCG 3′(SEQ ID NO.13)；定点饱和突变引物序列：S132N-F：5′-GCGCCGGTAGACGACGCCCTGGCGNNKGTGGTCTGGGC-3′(SEQ ID NO.14)；S132N-R：5′-GGCGGCGTGCGCGGCGGCCCAGACCACMNNCGCCAGGG-3′(SEQ ID NO.15)；T163N-F：5′-GACAGCGCGGGGGCCAACCTCGCCNNKGTCACGGCG-3′(SEQ ID NO.16)；T163N-R：5′-CGTCACGCGACCGCAGCGCCGTGACMNNGGCGAGGT-3′(SEQ ID NO.17)；S238N-F：5′-ACGCCTCGCCGCTCAACGCTGAGNNKCTCGCGGGGTT-3′(SEQ ID NO.18)；S238N-R：5′-ACCAGGGCCGGCGGCAACCCCGCGAGMNNCTCAGCG-3′(SEQ ID NO.19)；Y285N-F：5′-GCATGATTCACGGTNNKGCCAACATGACCGCGTTT-3′(SEQ IDNO.20)；Y285N-R：5′-GGCGAAACCGTMNNTCATGCCGGGGCCGGGGCGGTA-3′(SEQ ID NO.21)；其中，M＝A/C；K＝G/T；N＝A/G/C/T。
2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。
3.PCR产物经胶回收后，通过重组酶连接于经过Bamh I/Hind III双酶切获得的含有粘性末端的pET-28a载体上，构建大肠杆菌表达载体pET28a-DcaE4。
4.将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为BL21-pET28a-DcaE4。
5.按照选定的突变位点Ser238、Ser132、Thr163和Tyr285进行定点饱和突变，设计引物，引物中包含突变位点，使用定点突变试剂盒进行突变体表达载体的构建。以野生型质粒(pET28a-DcaE4)为模板进行反向PCR，扩增整个质粒。
6.PCR反应结束后取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带正确就进行纯化，纯化后的DNA进行DpnI消化去甲基化，然后进行重组反应。
将重组产物转入大肠杆菌BL21(DE3)，通过测序鉴定阳性克隆用于后续实验。
本实施例的实验结果：本公开成功构建表达DcaE4的重组大肠杆菌工程菌株，同时筛选获得了Ser238、Ser132、Thr163和Tyr285定点饱和突变的DcaE4突变体的重组表达大肠杆菌工程菌株。通过基因测序选择突变为四种不同类型氨基酸的突变体，Ser132位点所选择的突变体为S132A、S132W、S132V、S132P、S132R、S132H、S132Q、S132E、S132Y。Thr163位点所选择的突变体为T163A、T163H、T163L、T163N、T163R、T163K、T163C、T163E。Tyr285位点所选择的突变体为Y285W、Y285F、Y285V、Y285R、Y285H、Y285S、Y285E、Y285C。Ser238位点所选择的突变体为S238D、S238R、S238H、S238K、S238N、S238Y、S238P、S238V、S238W。
具体序列如下：
实施例2
本实施例为酯酶DcaE4突变体的酶活特性检测实验。
本实施例的实验材料包括：重组工程菌株：实施例1得到的酯酶DcaE4和DcaE4突变体的重组表达菌株；酶活测定试剂：底物溶液：分别将0.3％对硝基苯酚辛酸酯pNPC(C8))溶于异丙醇中，4℃保存；缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5,0.11％阿拉伯胶)；底物测试液：底物溶液分别与缓冲液按1:3的比例混匀后作为底物测试液使用。
本实施例的实验方法包括：
1、重组蛋白的诱导表达与纯化：以1％的接种量将菌种接种到20mL加了抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；以OD600为0.1的初始浓度的接种量将菌液转接到500mL加了卡那霉素的LB液体培养基中。37℃培养至菌液浓度0.6～0.8，加入IPTG(终浓度0.1μmol/L)进行蛋白诱导表达，诱导条件为25℃，6～8h。诱导后的菌液离心收集菌体，用NTA-0重新悬浮菌体。菌液超声破碎，超声破碎后的样品离心30min，分别收集破碎液上清和沉淀，离心得到的破碎上清液即为粗酶液，破碎样品用于后续实验。
2、亲和层析纯化重组酯酶蛋白：取出镍柱，待乙醇流完后首先用去离子水清洗镍柱两遍，然后用NTA-0平衡柱子，流速保持在1mL/min。粗酶液挂柱，穿透两次。用配置好的NTA-10，NTA-30，NTA-50，NTA-80，NTA-100，NTA-150，NTA-200，NTA-250，NTA-300梯度洗脱，使用蛋白检测液检测蛋白，收集洗脱峰，用SDS-PAGE检测所得蛋白大小与纯度。使用超滤离心置换蛋白溶液的缓冲液，从而去除蛋白溶液中的咪唑，所得的蛋白溶液即为酶液。
3、酯酶蛋白的活力测定：酯酶活力测定通用的比色法和通用模式底物对硝基苯酯类化合物进行。检测原理是，通过水解对硝基苯酯类化合物底物生成对硝基苯酚(pNP)，pNP呈黄色并且在410nm处有吸收峰，通过检测产物pNP的含量来确定酯酶的酶活。1个酶活单位(U)定义为：单位时间内释放1μmol的产物pNP所需要的酶量。1.5mL离心管中加入600μL底物测试液，并加入适当稀释后的酶液25μL；对照组加入25μL pH＝8的Tris-HCl缓冲液。30℃下孵育5min后，加入500μL 95％的乙醇终止反应。在410nm下测定吸光值，计算酶活。
温度对酶活性的影响及酶的热稳定性研究：酶液加入pH 8的Tris-HCl缓冲液中，分别在不同温度(5，10，20，30，40，50，60，70℃)下测定脂肪酶/酯酶的降解活力，反应5min，确定脂肪酶的最适温度。进一步研究脂肪酶/酯酶的热稳定性：将纯化后的酶液分别于5，10，20，30，40，50℃下保温6h，每隔1h在最适温度下测定剩余酶活力，以最高酶活力为100％计算相对酶活。
本实施例的实验结果：
对DcaE4野生型及突变体蛋白的酶活进行测定，对DcaE4的Ser238、Ser132、Thr163和Tyr285位点的突变体蛋白经纯化后稀释到同一浓度(40μg/mL)，30℃、pH＝8的条件下以底物pNPC8测定酶活，结果如图1～4所示。与野生型DcaE4酯酶活性相比，Ser132位点只有S132A和S132V与野生相比没有显著变化，其余突变体的酶活均有不同程度的降低。Thr163位点的突变中，除了T163A、T163L和T163C之外，其它的突变均造成酶活不同程度的降低。Tyr285位点的突变中只有Y285F的酶活与野生型相比无显著变化，其它的突变体显著下降。Ser238位点中突变为S238N的酶活则显著上升，突变体S238P、S238V、S238W和S238K的酶活与野生型相比显著下降，其余的突变体酶活无显著变化。
选择酶活没有显著变化的突变体S132A、S132V、T163A、T163L、T163C、Y285F和S238N进行温度稳定性的测定，分别测定各突变体和野生型DcaE4的最适温度(图5A)、20～60℃保温1h后的剩余酶活(图5B)以及在40℃和50℃的半衰期(图5C和图5D)。如图所示，各突变体和野生型酯酶的最适温度仍然是30℃。通过一级失活模型计算出各个突变体及野生型酯酶DcaE4的半衰期，结果如表1所示。突变体在40和50℃的半衰期均有所提升，其中S132A在40和50℃的半衰期分别提升了44.29％和89.89％，T163A在40和50℃的半衰期分别提升了89.59％和119.11％，Y285F在40和50℃的半衰期分别提升了59.41％和65.79％，S238N在40℃和50℃的半衰期分别提升了47.15％和70.10％。这些突变体中热稳定性提升最高的是T163A。
表1各突变体在40℃和50℃的半衰期
实施例3
本实施例为酯酶DcaE4突变体对杀虫剂的降解能力分析。
本实施例的实验材料包括：酯酶蛋白：实施例2纯化获得的DcaE4及突变体S132A、T163A、Y285F和S238N；杀虫剂：西维因(CAR)购自阿拉丁公司；甲氰菊酯(FEN)、顺式氯氰菊酯(α-CYP)、溴氰菊酯(DEL)购自Dr.Ehrenstorfer公司。
本实施例的实验方法包括：
1、酯酶酶解体系：为了测定酯酶DcaE4及突变体对杀虫剂的降解情况，将纯化的酶蛋白浓缩后再用Tris-HCl(50mM,pH＝8)稀释到同一浓度40μg/mL，在一定量的酶液中分别添加西维因、甲氰菊酯、顺式氯氰菊酯以及溴氰菊酯(终浓度50μg/mL)，对照组使用高温灭活的酶液添加相同浓度的杀虫剂，反应体系混匀后于30℃保温8h进行酶解反应。
2、样品制备：将反应液加入等体积的乙酸乙酯，涡旋振荡萃取10min，随后静置1h，取一定量的上层有机相氮吹至干，加入甲醇复溶，所得样品使用有机滤膜过滤后用于色谱检测。
色谱条件：色谱柱：Agilent Poroshell 120SB-C18(2.1mm×75mm,2.7μm)；流动相A：水(含10mM甲酸铵和0.1％甲酸)；流动相B：甲醇(含10mM甲酸铵和0.1％甲酸)；梯度洗脱(0～2min,10％B；2～6min,10％→40％B；6～10min,40％→80％B；10～12min,80％→95％B；12～16min,95％B；16～18min 95％→5％B；18～20min,5％B)；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；运行时间：20min；
质谱条件：采用安捷伦喷射流电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM模式采集；干燥气温度：350℃；干燥气流速：12L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：3500V；
本实施例的实验结果：
对酯酶降解活性进行测定，结果显示DcaE4对所测四种杀虫剂都有降解功能，其中DcaE4对西维因的降解速率最快，8h的降解率达到了100％，对甲氰菊酯、顺式氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率依次降低，分别为85.19％、54.19％、34.23％。
经8h的敷育，DcaE4及其突变体对浓度为50μg/mL的西维因(CAR)、甲氰菊酯(FEN)、顺式氯氰菊酯(α-CYP)和溴氰菊酯(DEL)分别具有85.83％～93.26％、54.01％～61.95％、30.45％～40.96％、26.64％～35.37％的降解率，突变体的整体降解趋势与野生型类似，CAR、FEN、α-CYP和DEL的降解率依次降低，但是各个突变体对不同杀虫剂的降解有所差异，其中S238N对四种杀虫剂的降解率与野生相比都有了显著的提升，降解率提升了6.08％～7.94％(表2)。除此之外其它的突变体并未对杀虫剂的降解率产生显著的影响。
表2 DcaE4及突变株对杀虫剂和毒素的降解率
Enzymes CAR(％) FEN(％) α-CYP(％) DEL(％)
WT 87.18±0.44 54.01±2.39 33.29±2.04 27.29±2.68
S132A 85.83±0.71 56.25±1.12 30.45±0.62 28.22±5.14
T163A 86.35±1.23 55.17±1.18 34.33±2.84 27.27±4.57
Y285F 88.42±0.52 58.84±1.25 34.61±4.08 26.64±2.32
S238N 93.26±0.33 61.95±0.98 40.96±1.30 34.05±1.23
本公开利用定点突变方式对耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans中的低温酯酶DcaE4进行了关键位点的氨基酸优化；DcaE4酯酶蛋白中Ser238位点的突变能够显著提高酶活；突变体S238N的催化效率和稳定性均有提高，且对四种杀虫剂的降解率显著提升；Ser132位、Thr163位点和Tyr285位点对酯酶结构至关重要，突变体S132A、T163A和Y285F显著提高酯酶的稳定性。
本公开提供的一种提高酯酶活性的方法、具有脂肪酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、制备酯酶的方法和酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用，均为酯酶在生物制药、生物修复以及低温洗涤等领域的应用中奠定了基础，满足酯酶在工业中的需求。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用
<130> 20217CAAS-B-ZW
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (132)..(132)
<223> The 'Xaa' at location 132 stands for Ala, Trp, Val, Pro, Arg, His,Gln, Glu, or Tyr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (163)..(163)
<223> The 'Xaa' at location 163 stands for Ala, His, Leu, Asn, Arg, Lys,Cys, or Glu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (238)..(238)
<223> The 'Xaa' at location 238 stands for Asn, Asp, Arg, His, Lys, Asn,Tyr, Pro, Val, or Trp.
<220>
<221> UNSURE
<222> (285)..(285)
<223> The 'Xaa' at location 285 stands for Phe, Trp, Val, Arg, His, Ser,Glu, or Cys.
<400> 1
Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala
20 25 30
Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg
35 40 45
Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr
50 55 60
His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe
65 70 75 80
Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala
85 90 95
Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val
100 105 110
Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp
115 120 125
Ala Leu Ala Xaa Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn
145 150 155 160
Leu Ala Xaa Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro
180 185 190
Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr
195 200 205
Asp Glu Arg Met Arg Phe Phe Gly Gln Met Tyr Leu Ala Arg Pro Glu
210 215 220
Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Xaa Leu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg
245 250 255
Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser
260 265 270
Ala Glu Tyr Arg Pro Gly Pro Gly Met Ile His Gly Xaa Ala Asn Met
275 280 285
Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val
290 295 300
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly
305 310
<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> 耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)
<400> 2
Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala
20 25 30
Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg
35 40 45
Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr
50 55 60
His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe
65 70 75 80
Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala
85 90 95
Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val
100 105 110
Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp
115 120 125
Ala Leu Ala Ser Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn
145 150 155 160
Leu Ala Thr Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro
180 185 190
Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr
195 200 205
Asp Glu Arg Met Arg Phe Phe Gly Gln Met Tyr Leu Ala Arg Pro Glu
210 215 220
Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Ser Leu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg
245 250 255
Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser
260 265 270
Ala Glu Tyr Arg Pro Gly Pro Gly Met Ile His Gly Tyr Ala Asn Met
275 280 285
Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val
290 295 300
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly
305 310
<210> 3
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala
20 25 30
Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg
35 40 45
Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr
50 55 60
His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe
65 70 75 80
Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala
85 90 95
Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val
100 105 110
Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp
115 120 125
Ala Leu Ala Ala Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn
145 150 155 160
Leu Ala Thr Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro
180 185 190
Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr
195 200 205
Asp Glu Arg Met Arg Phe Phe Gly Gln Met Tyr Leu Ala Arg Pro Glu
210 215 220
Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Ser Leu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg
245 250 255
Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser
260 265 270
Ala Glu Tyr Arg Pro Gly Pro Gly Met Ile His Gly Tyr Ala Asn Met
275 280 285
Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val
290 295 300
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly
305 310
<210> 4
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala
20 25 30
Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg
35 40 45
Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr
50 55 60
His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe
65 70 75 80
Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala
85 90 95
Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val
100 105 110
Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp
115 120 125
Ala Leu Ala Ser Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn
145 150 155 160
Leu Ala Ala Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro
180 185 190
Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr
195 200 205
Asp Glu Arg Met Arg Phe Phe Gly Gln Met Tyr Leu Ala Arg Pro Glu
210 215 220
Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Ser Leu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg
245 250 255
Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser
260 265 270
Ala Glu Tyr Arg Pro Gly Pro Gly Met Ile His Gly Tyr Ala Asn Met
275 280 285
Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val
290 295 300
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly
305 310
<210> 5
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala
20 25 30
Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg
35 40 45
Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr
50 55 60
His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe
65 70 75 80
Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala
85 90 95
Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val
100 105 110
Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp
115 120 125
Ala Leu Ala Ser Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn
145 150 155 160
Leu Ala Thr Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro
180 185 190
Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr
195 200 205
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210 215 220
Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Asn Leu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg
245 250 255
Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser
260 265 270
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275 280 285
Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val
290 295 300
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly
305 310
<210> 6
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala
20 25 30
Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg
35 40 45
Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr
50 55 60
His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe
65 70 75 80
Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala
85 90 95
Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val
100 105 110
Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp
115 120 125
Ala Leu Ala Ser Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn
145 150 155 160
Leu Ala Thr Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro
180 185 190
Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr
195 200 205
Asp Glu Arg Met Arg Phe Phe Gly Gln Met Tyr Leu Ala Arg Pro Glu
210 215 220
Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Ser Leu Ala
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg
245 250 255
Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser
260 265 270
Ala Glu Tyr Arg Pro Gly Pro Gly Met Ile His Gly Phe Ala Asn Met
275 280 285
Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val
290 295 300
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly
305 310
<210> 7
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcccgtag accccaacct gtaccaactt ctgctgcaac tctcgcaggc gcctgaaccc 60
gccggactgg aagaactgcg ggcgggcgtg atcgccaacg cggcgcgcag ccccaaacgt 120
ccggtgacta ttggcgaagt ccgtgacctg agcgtggcgg gcgcggaggg ctccctgccc 180
gcccgcctgt accaccccgc cgggcaggcc cccgcgtccg gctggccgct gacggtgttc 240
ttccacggtg gcggcttcgt ggtctacgac ctcgacaccc acgacgcgct gtgccgcgag 300
ctgtgcgcga cgtcgggcgc ggcggtgctg agcgtggcct accgcctcgc gcccgaagcc 360
cgctttcccg cgccggtaga cgacgccctg gcggctgtgg tctgggccgc cgcgcacgcc 420
gccgaactcg gcgcagacgc ggggcgactc gcggtggcgg gcgacagcgc gggggccaac 480
ctcgccaccg tcacggcgct gcggtcgcgt gacgagggcg gcccggcttt gcgggcgcag 540
cttctcattt accccgccgc cgatttcgag caccccgaac gctaccccag ccgccaggaa 600
aacggacgcg gctatttcct cactgacgag cggatgcgct ttttcggaca gatgtacctt 660
gctcgcccgg aagacgccgc gcatccccac gcctcgccgc tcaacgctga gagtctcgcg 720
gggttgccgc cggccctggt cctgaccgcc gaattcgacc ccctgcgcga tgaaggcgcc 780
gcttacgccg aagctctcaa ggccgctggc gtaagcgccg agtaccgccc cggccccggc 840
atgattcacg gttacgccaa catgaccgcg ttttcgcccg tcgccgcaca actgattgac 900
gaggcgggcg tatggctcgg cgagcaactg cgcggctga 939
<210> 8
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcccgtag accccaacct gtaccaactt ctgctgcaac tctcgcaggc gcctgaaccc 60
gccggactgg aagaactgcg ggcgggcgtg atcgccaacg cggcgcgcag ccccaaacgt 120
ccggtgacta ttggcgaagt ccgtgacctg agcgtggcgg gcgcggaggg ctccctgccc 180
gcccgcctgt accaccccgc cgggcaggcc cccgcgtccg gctggccgct gacggtgttc 240
ttccacggtg gcggcttcgt ggtctacgac ctcgacaccc acgacgcgct gtgccgcgag 300
ctgtgcgcga cgtcgggcgc ggcggtgctg agcgtggcct accgcctcgc gcccgaagcc 360
cgctttcccg cgccggtaga cgacgccctg gcgagtgtgg tctgggccgc cgcgcacgcc 420
gccgaactcg gcgcagacgc ggggcgactc gcggtggcgg gcgacagcgc gggggccaac 480
ctcgccgccg tcacggcgct gcggtcgcgt gacgagggcg gcccggcttt gcgggcgcag 540
cttctcattt accccgccgc cgatttcgag caccccgaac gctaccccag ccgccaggaa 600
aacggacgcg gctatttcct cactgacgag cggatgcgct ttttcggaca gatgtacctt 660
gctcgcccgg aagacgccgc gcatccccac gcctcgccgc tcaacgctga gagtctcgcg 720
gggttgccgc cggccctggt cctgaccgcc gaattcgacc ccctgcgcga tgaaggcgcc 780
gcttacgccg aagctctcaa ggccgctggc gtaagcgccg agtaccgccc cggccccggc 840
atgattcacg gttacgccaa catgaccgcg ttttcgcccg tcgccgcaca actgattgac 900
gaggcgggcg tatggctcgg cgagcaactg cgcggctga 939
<210> 9
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcccgtag accccaacct gtaccaactt ctgctgcaac tctcgcaggc gcctgaaccc 60
gccggactgg aagaactgcg ggcgggcgtg atcgccaacg cggcgcgcag ccccaaacgt 120
ccggtgacta ttggcgaagt ccgtgacctg agcgtggcgg gcgcggaggg ctccctgccc 180
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ttccacggtg gcggcttcgt ggtctacgac ctcgacaccc acgacgcgct gtgccgcgag 300
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cgctttcccg cgccggtaga cgacgccctg gcgagtgtgg tctgggccgc cgcgcacgcc 420
gccgaactcg gcgcagacgc ggggcgactc gcggtggcgg gcgacagcgc gggggccaac 480
ctcgccaccg tcacggcgct gcggtcgcgt gacgagggcg gcccggcttt gcgggcgcag 540
cttctcattt accccgccgc cgatttcgag caccccgaac gctaccccag ccgccaggaa 600
aacggacgcg gctatttcct cactgacgag cggatgcgct ttttcggaca gatgtacctt 660
gctcgcccgg aagacgccgc gcatccccac gcctcgccgc tcaacgctga gaatctcgcg 720
gggttgccgc cggccctggt cctgaccgcc gaattcgacc ccctgcgcga tgaaggcgcc 780
gcttacgccg aagctctcaa ggccgctggc gtaagcgccg agtaccgccc cggccccggc 840
atgattcacg gttacgccaa catgaccgcg ttttcgcccg tcgccgcaca actgattgac 900
gaggcgggcg tatggctcgg cgagcaactg cgcggctga 939
<210> 10
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgcccgtag accccaacct gtaccaactt ctgctgcaac tctcgcaggc gcctgaaccc 60
gccggactgg aagaactgcg ggcgggcgtg atcgccaacg cggcgcgcag ccccaaacgt 120
ccggtgacta ttggcgaagt ccgtgacctg agcgtggcgg gcgcggaggg ctccctgccc 180
gcccgcctgt accaccccgc cgggcaggcc cccgcgtccg gctggccgct gacggtgttc 240
ttccacggtg gcggcttcgt ggtctacgac ctcgacaccc acgacgcgct gtgccgcgag 300
ctgtgcgcga cgtcgggcgc ggcggtgctg agcgtggcct accgcctcgc gcccgaagcc 360
cgctttcccg cgccggtaga cgacgccctg gcgagtgtgg tctgggccgc cgcgcacgcc 420
gccgaactcg gcgcagacgc ggggcgactc gcggtggcgg gcgacagcgc gggggccaac 480
ctcgccaccg tcacggcgct gcggtcgcgt gacgagggcg gcccggcttt gcgggcgcag 540
cttctcattt accccgccgc cgatttcgag caccccgaac gctaccccag ccgccaggaa 600
aacggacgcg gctatttcct cactgacgag cggatgcgct ttttcggaca gatgtacctt 660
gctcgcccgg aagacgccgc gcatccccac gcctcgccgc tcaacgctga gagtctcgcg 720
gggttgccgc cggccctggt cctgaccgcc gaattcgacc ccctgcgcga tgaaggcgcc 780
gcttacgccg aagctctcaa ggccgctggc gtaagcgccg agtaccgccc cggccccggc 840
atgattcacg gtttcgccaa catgaccgcg ttttcgcccg tcgccgcaca actgattgac 900
gaggcgggcg tatggctcgg cgagcaactg cgcggctga 939
<210> 11
<211> 6289
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160
ggtcgcggat ccatgcccgt agaccccaac ctgtaccaac ttctgctgca actctcgcag 5220
gcgcctgaac ccgccggact ggaagaactg cgggcgggcg tgatcgccaa cgcggcgcgc 5280
agccccaaac gtccggtgac tattggcgaa gtccgtgacc tgagcgtggc gggcgcggag 5340
ggctccctgc ccgcccgcct gtaccacccc gccgggcagg cccccgcgtc cggctggccg 5400
ctgacggtgt tcttccacgg tggcggcttc gtggtctacg acctcgacac ccacgacgcg 5460
ctgtgccgcg agctgtgcgc gacgtcgggc gcggcggtgc tgagcgtggc ctaccgcctc 5520
gcgcccgaag cccgctttcc cgcgccggta gacgacgccc tggcggctgt ggtctgggcc 5580
gccgcgcacg ccgccgaact cggcgcagac gcggggcgac tcgcggtggc gggcgacagc 5640
gcgggggcca acctcgccac cgtcacggcg ctgcggtcgc gtgacgaggg cggcccggct 5700
ttgcgggcgc agcttctcat ttaccccgcc gccgatttcg agcaccccga acgctacccc 5760
agccgccagg aaaacggacg cggctatttc ctcactgacg agcggatgcg ctttttcgga 5820
cagatgtacc ttgctcgccc ggaagacgcc gcgcatcccc acgcctcgcc gctcaacgct 5880
gagagtctcg cggggttgcc gccggccctg gtcctgaccg ccgaattcga ccccctgcgc 5940
gatgaaggcg ccgcttacgc cgaagctctc aaggccgctg gcgtaagcgc cgagtaccgc 6000
cccggccccg gcatgattca cggttacgcc aacatgaccg cgttttcgcc cgtcgccgca 6060
caactgattg acgaggcggg cgtatggctc ggcgagcaac tgcgcggctg aaagcttgcg 6120
gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag 6180
gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct 6240
aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 6289
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccatggctga tatcggatcc atgcccgtag accccaacct 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcgagtgcg gccgcaagct ttcagccgcg cagttgctcg 40
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgccggtag acgacgccct ggcgnnkgtg gtctgggc 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcggcgtgc gcggcggccc agaccacmnn cgccaggg 38
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacagcgcgg gggccaacct cgccnnkgtc acggcg 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtcacgcga ccgcagcgcc gtgacmnngg cgaggt 36
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgcctcgcc gctcaacgct gagnnkctcg cggggtt 37
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
accagggccg gcggcaaccc cgcgagmnnc tcagcg 36
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcatgattca cggtnnkgcc aacatgaccg cgttt 35
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggcgaaaccg tmnntcatgc cggggccggg gcggta 36

Claims (7)

1.一种提高酯酶活性的方法，该方法包括将野生型酯酶的待突变氨基酸残基中的一个进行突变改造，其特征在于，所述野生型酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述待突变氨基酸残基为第238位丝氨酸残基；所述突变改造为将第238位丝氨酸残基突变为天冬酰胺残基。
2.一种具有酯酶活性的蛋白，所述蛋白为如SEQ ID NO.2所示的野生型酯酶的氨基酸序列经过取代1个氨基酸衍生的蛋白；并且，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
3.编码权利要求2所述的蛋白的基因，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO. 9所示的DNA分子。
4.一种重组载体，其中，所述重组载体插入有权利要求3所述的基因。
5.一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括权利要求3所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体包括权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备酯酶的方法，其中，所述方法包括：将权利要求5所述的转化体接种于培养基中进行培养，得到培养后的物料。
7.一种酯酶在降解对硝基苯酯类化合物中的应用，其中，所述酯酶含有权利要求2所述的蛋白。
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