CN115041108B - 聚电解质层层组装多酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及聚电解质层层组装多酶及其制备方法。本发明采用一种有效、可重复性高的层层组装固定多酶的方式，将碳酸钙作为模板，合理构造了分别带有聚阴离子和聚阳离子的微球，其利用酶分子表面所带电荷与微球表面电荷之间的静电相互作用进行层层固定。本发明的组装方式操作方便，步骤简洁，减少了酶的损失，使用聚阳离子微球载酶量高达87.70％，聚阴离子载酶量高达71.10％，以初始酶为参考，选择构建的体系相对酶活高达85％。

Description

聚电解质层层组装多酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，尤其涉及聚电解质层层组装多酶及其制备方法。

背景技术

生物酶通过多元酶级联反应将体内传递信号逐级放大，以此来维持生物体内反应的有序进行，生物体内酶的反应体系是错综复杂的，但在多元酶级联反应过程中，不同的酶互不干扰，作用迅速，有很强的催化性和专一性。并且以细胞作为微反应器能够区室化地提高酶的环境稳定性，不受外界的较多干扰。

目前已有报道将多酶通过与载体共固定以期获得目标产物，但这种多酶固定无法有效地反映出酶等活性物质在生物体内的真实反应途径和作用效果，因此有研究者尝试使用层层组装的方式模拟级联反应在限定区域内的定向传递。

目前多数报道的层层组装，是针对以酶的特定位点进行化学连接，此种方式会破坏酶的构象，并且在与位点的反应过程中可能会遮蔽酶的活性位点，降低酶的活性。也有研究者通过逐层矿化和随后选择去除矿物层，组装成了内外层进行酶的组装，但这种结构过于松散会导致酶的传递效率降低，过于紧密中间产物容易造成干扰，且随着酶数量的增加，需要操作的步骤会越发繁琐，失去了逐层组装的优势。因此合理构建层层组装方式，通过有序组装建立良好的催化反应体系成为了主要的研究对象。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了聚电解质层层组装多酶及其制备方法，本发明是一种有效、可重复性高的层层组装以固定多酶的方式，将碳酸钙作为模板，合理构造了分别带有聚阴离子和聚阳离子的微球，其利用酶分子表面所带电荷与微球表面电荷之间的静电相互作用进行层层固定。该组装方式操作方便，步骤简洁，减少了酶的损失，使用聚阳离子微球载酶量高达87.70％，聚阴离子载酶量高达71.10％，以初始酶为参考，选择构建的体系相对酶活高达85％。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提供一种聚电解质微球，以碳酸钙(CaCO₃)为模板，与聚阳离子电解质或聚阴离子电解质进行共沉淀，得到微米级的聚电解质微球。

本发明的第二个目的在于提供一种聚电解质微球的制备方法，包括以下步骤：

将钙源水溶液和聚阳离子或聚阴离子电解质混匀，加入碳酸盐水溶液进行反应，将反应液固液分离取固相，得到聚电解质微球。

在本发明的一个实施例中，所述钙源选自氯化钙、硝酸钙、氢氧化钙和氧化钙中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铵和碳酸氢钠中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述钙源和聚阳离子或聚阴离子电解质的质量比分别为33:1-2。

在本发明的一个实施例中，所述钙源与碳酸盐的摩尔比为1:2。

在本发明的一个实施例中，所述碳酸钠水溶液的加入速度为2mL/min-8mL/min。

本发明的第三个目的在于提供一种聚电解质层层组装多酶，由所述聚电解质微球制备所得。

本发明的第四个目的在于提供一种聚电解质层层组装多酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以所述聚电解质微球为固定模板，加入第一种酶混匀，固液分离取固相；

(2)依次逐层添加酶，按照步骤(1)重复固液分离取固相进行分层组装；

(3)添加去除剂，混匀，固液分离取固相，得到所述聚电解质层层组装多酶。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述第一种酶选自葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、念珠菌脂肪酶、α-淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶和辣根过氧化物酶中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述酶选自葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、念珠菌脂肪酶、α-淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶和辣根过氧化物酶中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述逐层添加酶的过程中，当相邻两种酶同时带相同电荷时，中间添加一层与酶所带电荷相反的聚阳离子或聚阴离子进行电荷填充。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述去除剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醛和聚乙二醇中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述去除剂与所述碳酸盐溶液中的碳酸盐的摩尔比为5:6。

本发明的第五个目的在于提供所述的聚电解质层层组装多酶在血糖检测、生产葡萄糖酸、清除过氧化氢、构建新型生物传感器或开发纳米生物催化剂中的应用。

本发明聚电解质微球和聚电解质层层组装多酶的具体制备方法如下：

本发明提供了一种以碳酸钙(CaCO₃)为模板，制备聚阳离子微球的方式。该种方式以氯化钙、碳酸钠、聚阳离子电解质聚丙烯胺盐酸盐(PAH)作为原料，通过共沉淀法制备，所得到的微球尺寸为微米级。制备的具体方式包括以下步骤：

步骤1：分别制备氯化钙水溶液、碳酸钠水溶液、PAH水溶液；

步骤2：混合氯化钙水溶液和PAH水溶液，使用磁力搅拌器搅拌或震荡摇匀；

步骤3：向步骤2所得到的混合液边搅拌边加入碳酸钠水溶液，完成加入后，立刻平行震荡或翻转震荡。之后进行沉淀，沉淀后将混合溶液离心；

步骤4：完成离心后去除上清液，连续水洗得到聚阳离子电解质微球；

在本发明的一个实施例中，步骤1中所述氯化钙水溶液的浓度为0.1mol/L-1.0mol/L，所述碳酸钠水溶液的浓度为0.05mol/L-0.5mol/L，所述PAH水溶液的浓度为2.0mg/mL-10.0mg/mL；

在本发明的一个实施例中，步骤2中所述中的搅拌或震荡在常温条件下进行即可，其中搅拌时间为10min-40min，转速为150r/min-250r/min，或选择震荡时间为5min-30min，转速为300r/min-400r/min。加入的氯化钙水溶液体积和加入的PAH水溶液体积相同；

在本发明的一个实施例中，步骤3中所述碳酸钠水溶液加入速率为2mL/min-8mL/min，过程中要不断搅拌，加完之后立刻300r/min-400r/min，震荡0.5min-3.0min，静置沉淀5min-20min。沉淀之后在8000r/min-10000r/min，时间6min-10min条件下离心；

在本发明的一个实施例中，步骤4中离心3-5次，清洗条件5000r/min-10000r/min，时间3min-8min，清洗时加入去离子水。

本方案还提供了以碳酸钙为模板，制备聚阴离子微球的方式。该种方式以氯化钙、碳酸钠、聚阴离子电解质聚苯乙烯磺酸钠(PSS)作为原料，通过共沉淀法制备，具体方式包括以下步骤：

步骤1：分别制备氯化钙水溶液、碳酸钠水溶液、PSS水溶液；

步骤2：加入氯化钙水溶液和PSS水溶液，使用磁力搅拌器搅拌或震荡摇匀；

步骤3：之后边搅拌边快速加入碳酸钠，完成加入后，立刻平行震荡或翻转震荡。随后进行沉淀，沉淀后将混合溶液离心；

步骤4：完成离心后去除上清液，连续水洗清洗得到聚阴离子电解质微球；

在本发明的一个实施例中，步骤1中所述氯化钙水溶液的浓度为0.1mol/L-1.0mol/L，碳酸钠水溶液的浓度为0.05mol/L-0.5mol/L，PSS水溶液的浓度为1.0mg/mL-5.0mg/mL；

在本发明的一个实施例中，步骤2中所述中的搅拌和震荡均在常温条件下进行即可，搅拌时间为10min-40min，转速为150r/min-250r/min，或选择震荡时间为5min-30min，转速为300r/min-400r/min。加入的氯化钙水溶液体积和PSS水溶液体积相同；

在本发明的一个实施例中，步骤3中所述碳酸钠水溶液加入速率为2mL/min-8mL/min，过程中要不断搅拌，加完之后立刻300r/min-400r/min，震荡3.0min-6.0min，静置沉淀30min-60min。沉淀之后在8000r/min-10000r/min，时间6min-10min条件下离心；

在本发明的一个实施例中，步骤4中去除上清液，该过程要缓慢操作，防止沉淀流出，离心3-5次，清洗条件5000r/min-10000r/min，时间3min-8min，清洗时加入去离子水。

本发明提供了以碳酸钙为模板，聚阳离子微球原位固定多种酶的制备方法。步骤如下：

步骤1：根据之前所述，提取PAH-CaCO₃微球；

步骤2：配置酶液，测定多酶体系中各个酶的等电点或表面电荷，并使用缓冲液进行电荷的调整；

步骤3：根据酶所测定的带电性质，设计使用聚阴离子电解质和聚阳离子电解质进行分层组装的方案；

步骤4：以PAH-CaCO₃为固定模板，加入第一种酶均匀震荡，进行沉淀，随后离心去上清，水洗；

步骤5：根据步骤3设计的方案，依次逐层添加酶，以步骤4为参考条件，进行分层组装的操作；

步骤6：添加去除剂，均匀震荡，离心去上清，水洗，最终可以得到层层组装的酶聚集体。

在本发明的一个实施例中，步骤1中的微球并未使用去除剂进行模板去除，离心去除上清液之后直接取用微球；

在本发明的一个实施例中，步骤2中的酶液浓度为0.1mg/mL-5.0mg/mL；用水或缓冲液配置酶液，缓冲液体系可用柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾。测定方式可用zeta电位仪进行测定，体系需稳定且具有重复操作性。

在本发明的一个实施例中，步骤3中的聚阴离子和聚阳离子电解质浓度分别为1.0mg/mL-5.0mg/mL和2.0mg/mL-10.0mg/mL；

在本发明的一个实施例中，步骤4中加入1mL-10mL酶液，200r/min-300r/min，震荡10min-30min，静置沉淀3min-10min，5000r/min-10000r/min离心5min-8min，随后去上清，水洗3-5次；

在本发明的一个实施例中，步骤5中每逐层添加一次酶，便在步骤4相同条件下进行操作。若相邻的两种酶同时带正电荷，中间可以添加一层PSS进行电荷填充，若相邻两种酶同时带负电荷，则中间添加一层PAH进行电荷填充。需要注意的是，如果使用PSS进行填充，则步骤4中震荡时间为20min-40min，静置沉淀30min-60min；

在本发明的一个实施例中，步骤6中得到的颗粒中加入4mL-10mL 0.1mol/L-4.0mol/L去除剂，去除剂为乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、乙二醛、聚乙二醇，浓度为0.1mol/L-0.4mol/L，pH控制在6-9之间；加入的去除剂体积为碳酸钠溶液体积的1-4倍，水浴震荡的条件为20℃-40℃，150r/min-300r/min，15min-60min。

本发明还提供了以碳酸钙为模板，聚阴离子微球原位固定多种酶的制备方法。步骤如下：

步骤1：根据之前所述，提取PSS-CaCO₃微球；

步骤2：配置酶液，测定多酶体系中各个酶的等电点或表面电荷，并使用缓冲液进行电荷的调整；

步骤3：根据酶所测定的带电性质，设计使用聚阴离子电解质和聚阳离子电解质进行分层组装的方案；

步骤4：以PSS-CaCO₃为固定模板，加入第一种酶均匀震荡，进行沉淀，随后离心去上清，水洗；

步骤5：根据步骤3设计的方案，依次逐层添加酶，以步骤4为参考条件，进行分层组装的操作；

步骤6：添加去除剂，均匀震荡，离心去上清，水洗，最终可以得到层层组装的酶聚集体。

在本发明的一个实施例中，步骤1中的微球并未使用去除剂进行模板去除，离心去除上清液之后直接取用微球；

在本发明的一个实施例中，步骤2中的酶液浓度为0.1mg/mL-5.0mg/mL，测定方式可用zeta电位仪进行测定，体系需稳定且具有重复操作性；用水或缓冲液配置酶液，缓冲液体系可用柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾。

在本发明的一个实施例中，步骤3中的聚阴离子和聚阳离子电解质浓度分别为1.0mg/mL-5.0mg/mL和2.0mg/mL-10.0mg/mL；

在本发明的一个实施例中，步骤4中加入1mL-10mL酶液，200r/min-300r/min震荡10min-30min，静置沉淀30min-60min，5000r/min-10000r/min离心5min-8min，随后去上清，水洗3-5次；

在本发明的一个实施例中，步骤5中每逐层添加一次酶，便与步骤4相同条件下进行操作。若相邻两种酶同时带正电荷，中间可以添加一层PSS进行电荷填充，若相邻两种酶同时带负电荷，则中间添加一层PAH进行电荷填充。需要注意的是，如果使用PSS进行填充，则步骤4中震荡时间为20min-40min，静置沉淀30min-60min；

在本发明的一个实施例中，步骤6中得到的颗粒中加入4mL-10mL 0.1mol/L-4.0mol/L去除剂，去除剂为乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、乙二醛、聚乙二醇，浓度为0.1mol/L-0.4mol/L，pH控制在6-9之间；加入的去除剂体积为碳酸钠溶液体积的1-4倍，水浴震荡的条件为20℃-40℃，150r/min-300r/min，15min-60min。

本发明的技术方案具有以下优点：

(1)本发明中的多酶体系是逐层进行组装，与现有技术中多酶混合液组装不同。逐层组装使酶分子在空间上的位置和级联反应顺序匹配，不仅能够避免多个酶分子之间直接接触可能造成的酶活抑制，解决了多酶混合液可能遮盖酶活性中心的问题，又缩短了传质距离，从而在整体上提高级联催化效率。同时利用静电相互作用在分层组装，方法简单重复率高，具有通用性。

(2)本发明使用氯化钙、碳酸钠和聚电解质原位组装形成微球的方式鲜有报道，该方法形成的微球不易破碎，分布均匀，可有效去除碳酸钙模板，形成最终的酶簇微粒。现有技术多为直接在碳酸钙外包裹聚电解质，易导致逐层组装中发生团聚。

(3)本发明使用的技术方案能够不断进行酶的逐层增加，不影响各种酶的基本性质，且未形成强结合力，过程温和快速，操作简单且重复性高。现有技术多为双酶固定，三酶研究较少，该方案为逐层组装提供了思路并以三酶固定验证了可行性。

(4)本发明使用的技术方案尝试得到的酶固定体系载酶量能达到70％以上，酶动力学参数未有较大改变，并且结合方式较多，可以得到较优秀的固定体系。现有技术中其他的固定方式并未有该种方式灵活易操作。

(5)本发明选择使用碳酸钙作为模板，使用聚阳离子电解质和聚阴离子电解质层层组装多酶，利用带电性质作为层层组装的驱动力，操作过程简便，重复性高，固定化酶活性高，并能有效达到有序固定酶的结果。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明实例1中制备的PAH-CaCO₃的SEM图；

图2为本发明实例2中制备的PSS-CaCO₃的SEM图；

图3为本发明实例3中制备的PAH、PSS、β-Gal、GOX和HRP表面电荷测定图；

图4为本发明实例3中制备的层层组装后结构的SEM图；

图5为本发明实例3中制备的去除模板后结构的SEM图；

图6为PAH-CaCO₃去除碳酸钙模板红外光谱图；

图7为本发明实例4中制备的层层组装后结构的SEM图；

图8为本发明实例4中制备的去除模板后结构的SEM图；

图9为本发明实例4中PSS-CaCO₃去除碳酸钙模板的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明聚电解质层层组装多酶的具体制备方法如下：

步骤1：制备浓度为0.1mol/L-1.0mol/L的氯化钙水溶液、浓度为0.05mol/L-0.5mol/L的碳酸钠水溶液、浓度为1.0mg/mL-5.0mg/mL的PSS水溶液、2.0mg/mL-10.0mg/mL的PAH水溶液。

步骤2：取氯化钙水溶液与PAH水溶液或PSS水溶液，在常温条件下使用磁力搅拌器搅拌10min-60min，转速为150r/min-250r/min或选择震荡10min-40min，转速为300r/min-400r/min；加入的氯化钙水溶液体积与PAH水溶液体积或PSS水溶液体积相同。

步骤3：碳酸钠水溶液加入速率为2mL/min-8mL/min，加入过程要不断搅拌，结束后立刻300r/min-400r/min震荡1min-6min，聚阴离子静置沉淀30min-60min或聚阳离子静置沉淀5min-20min，然后在8000r/min-10000r/min的转速下离心6min-10min。

步骤4：完成离心后去除上清液，为防止沉淀流失，可使用移液枪、针筒进行去除。连续水洗清洗，每次清洗后离心，得到聚阳离子电解质微球或聚阴离子微球。清洗条件5000r/min-10000r/min，时间3min-8min；

步骤5：根据步骤4，提取PAH-CaCO₃微球和PSS-CaCO₃微球；

步骤6：用水或缓冲液配置酶液，缓冲液体系可用柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠或磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，浓度为0.1mg/mL-5.0mg/mL。测定多酶体系中各酶的等电点或表面电荷，测定方式可用zeta电位仪进行测定，体系需稳定且具有重复操作性，可使用缓冲液进行酶电荷的调整。

步骤7：根据酶所带电荷性质，使用浓度为1.0mg/mL-5.0mg/mL的聚阴离子电解质，和浓度为2.0mg/mL-10.0mg/mL的聚阳离子电解质，进行多酶分层组装的准备；

步骤8：以PAH-CaCO₃为固定模板，加入带负电荷的酶200r/min-300r/min震荡10min-30min，静置沉淀3min-10min；以PSS-CaCO₃为固定模板，加入带正电荷的酶200r/min-300r/min震荡20min-40min，静置沉淀30min-60min。均在5000r/min-10000r/min离心5min-8min，随后去上清，水洗3-5次。

步骤9：根据步骤8依次添加带有不同正电荷或负电荷的酶，每逐层添加一次酶，便与步骤8相同条件下进行操作。若相邻的两种酶同为正电荷，则中间可以另外增加一层PSS进行电荷的填充，若同为负电荷，则两层之间可以增加PAH进行电荷的填充；

步骤10：加入4-10mL去除剂，去除剂为乙二胺四乙酸(EDTA)溶液、乙二醛、聚乙二醇，浓度为0.1mol/L-0.4mol/L，pH控制在6-9之间；加入的去除剂体积为碳酸钠溶液体积的1-4倍；水浴震荡的条件为20℃-40℃，15min-60min，均匀震荡，离心去上清，水洗，最终可以得到层层组装的酶聚集体，即聚电解质层层组装多酶。

实例1制备PAH-CaCO₃微球

(1)分别制备浓度为0.3mol/L的氯化钙水溶液、0.15mol/L的碳酸钠水溶液和4mg/mL的PAH水溶液；

(2)取1mL氯化钙水溶液和1mL PAH水溶液，以300r/min的转速震荡摇匀10min；

(3)然后以2-8mL/min的速度边搅拌边加入碳酸钠2mL，立刻以300r/min的转速震荡1min，之后静置沉淀10min，在8000r/min的转速下将混合溶液离心8min；

(4)完成离心后使用移液枪去除上清液，连续清洗3次，每次清洗后在8000r/min，5min的条件下离心，最终得到聚阳离子电解质微球(PAH-CaCO₃微球)；

对所得聚阳离子电解质微球进行结构表征，结果如图1所示。由图1可知，能够使用实施例1中的方式构造出PAH-CaCO₃微球结构，形成的微球整体结构完整，均一性高，稳定性强，不易在制备过程中受到破坏或损失。且该方法操作简单，重复性强，能够作为层层组装的基础结构。

实例2制备PSS-CaCO₃微球

(1)分别制备浓度为0.3mol/L的氯化钙水溶液、0.15mol/L的碳酸钠水溶液和2mg/ml的PSS水溶液；

(2)取1mL氯化钙水溶液和1mL PSS水溶液，以300r/min的转速震荡摇匀20min；

(3)然后以2-8mL/min的速度边搅拌边加入碳酸钠2mL，立刻以300r/min的转速震荡3min。之后静置沉淀30min，在8000r/min的转速下将混合溶液离心8min；

(4)完成离心后，使用移液枪去除上清液，连续8000r/min，5min清洗3次，得到聚阴离子电解质微球(PSS-CaCO₃微球)；

对所得聚阴离子电解质微球进行结构表征，结果如图2所示。由图2可知，能够使用实施例2中的方式构造出PSS-CaCO₃微球结构，形成的微球整体结构完整，分布均匀，球形结构增加了比表面积，能够在层层组装过程中为酶提供优越的环境。且该方法操作简单，重复性强，能够作为层层组装的基础结构。

实例3聚阳离子微球原位固定葡萄糖苷酶，葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶

(1)将实施例1中得到的PAH-CaCO₃微球不进行模板去除，直接用于多酶层层自组装；

(2)分别配置葡萄糖苷酶(β-Gal)、葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)酶液，浓度均为1mg/mL。β-Gal使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制，pH值为5.0；GOX使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠配制，pH值为6.0；HRP使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制，pH值为5.5。

测定多酶体系中各酶的等电点或表面电荷，测定方式可用Zeta电位仪进行测定，体系需稳定且具有重复操作性，可使用缓冲液进行酶电荷的调整。在该配置体系中，β-Gal和GOX表面带负电荷，HRP表面带正电荷。制备的表面电荷测定图如图3所示。

(3)以PAH-CaCO₃微球为起始可精简设计4种设计方案，如下所示；

①PAH-CaCO₃—β-Gal—PAH—GOX—HRP；

②PAH-CaCO₃—β-Gal—HRP—GOX；

③PAH-CaCO₃—GOX—PAH—β-Gal—HRP；

④PAH-CaCO₃—GOX—HRP—β-Gal。

(4)加入第一种酶1mL，以250r/min的转速均匀震荡15min，沉淀5min，8000r/min离心8min，随后去上清，水洗3次；

(5)根据设计方案逐层继续添加酶液，每次的添加量均为1mL，操作方式与步骤(4)相同，若相邻的两种酶同为正电荷，则中间可以另外增加一层PSS进行电荷的填充，若同为负电荷，则两层之间可以增加PAH进行电荷的填充，其中添加PAH水溶液的浓度为4mg/mL，PSS水溶液浓度为2mg/mL；

(6)添加4mL浓度为0.3mol/L且pH为7.5的EDTA溶液，25℃条件下水浴震荡30min，最终可以得到层层组装的酶聚集体，即聚电解质层层组装多酶。

所得聚电解质层层组装多酶的结构表征图如图4、图5和图6所示。由图4可知，能够使用实施例3中的方式构造出以PAH-CaCO₃微球结构为模板，层层组装3种酶的聚电解质层层组装多酶，其整体结构呈微球形态，形态均一且完整，该方法操作简单，重复性强，能够作为层层组装的基础结构。由图5可知，在图4结构的基础上，使用去除剂去除模板不造成形态的基本变化，能够将形成的酶簇微粒用于之后的应用当中。图6为去除碳酸钙模板红外光谱图，由图6可以看出，867.95cm^-1为碳酸根特征峰，去除模板后(下峰)无明显碳酸根特征峰，表明碳酸钙已通过EDTA完成去除。

实例4聚阴离子微球原位固定葡萄糖苷酶，葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶

(1)将实施例2中得到的PSS-CaCO₃微球不进行模板去除，直接用于该体系层层自组装；

(2)分别配置葡萄糖苷酶(β-Gal)、葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)酶液，浓度均为1mg/mL。β-Gal使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备，pH值为5.0；GOX使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配置，pH值为6.0；辣根过氧化物酶使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配置，pH值为5.5。

测定多酶体系中各酶的等电点或表面电荷，测定方式可用Zeta电位仪进行测定，体系需稳定且具有重复操作性，可使用缓冲液进行酶电荷的调整。在该配置体系中，β-Gal和GOX表面带负电荷，HRP表面带正电荷；制备的β-Gal、GOX和HRP表面电荷测定图如图3所示。(3)以PSS-CaCO₃微球分层固定，精简操作步骤，分别得到2种分层组装设计方案：

①PSS-CaCO₃—HRP—GOX—PAH—β-Gal；

②PSS-CaCO₃—HRP—β-Gal—PAH—GOX；

(4)加入第一种酶1mL，以250r/min的转速震荡20min，静置沉淀30min，8000r/min离心8min，随后去上清，水洗3次；

(5)根据步骤(3)中的设计方案逐层继续添加酶液，每次的添加量均为1ml，操作方式与步骤(4)相同，若相邻的两种酶同为正电荷，则中间可以另外增加一层PSS进行电荷的填充，若同为负电荷，则两层之间可以增加PAH进行电荷的填充，其中添加的PAH水溶液浓度为4mg/mL，PSS水溶液浓度为2mg/mL；

(6)添加4mL浓度为0.3mol/L且pH为7.5的EDTA溶液，25℃条件下水浴震荡30min，最终可以得到层层组装的酶聚集体，即聚电解质层层组装多酶。

所得聚电解质层层组装多酶的结构表征见图7、图8和图9。由图7可知，能够使用实施例4中的方式构造出以PSS-CaCO₃微球结构为模板，层层组装3种酶的聚电解质层层组装多酶，其整体结构呈微球形态，相对于PAH-CaCO₃形成的酶聚集体形态，PSS-CaCO₃形成的酶聚集体结构更加松散。该方法操作简单，重复性强。由图8可知，在图7结构的基础上，使用去除剂去除模板不造成形态的基本变化，能够将形成的酶簇微粒用于之后的应用当中。图9为去除碳酸钙模板红外光谱图，由图9可以看出，867.95cm^-1为碳酸根特征峰，去除模板后(下峰)无明显碳酸根特征峰，表明碳酸钙已通过EDTA完成去除。

测试例

每逐层添加酶进行电荷填充后，以5000r/min-10000r/min的转速离心5-8min，取上清液测定酶蛋白含量，与酶添加前以5000r/min-10000r/min的转速离心5min-8min，得到的上清液测定的蛋白含量做差值，所得到的差值和初始酶蛋白含量相比，可以分别计算出逐层组装中各层酶的载酶量。以聚阳离子微球做载体，之后逐层组装的GOX-PAH-β-Gal-HRR结构中β-Gal的最高载酶量能达87.70％，以初始酶为参考，测得的β-Gal的相对酶活高达85％。以聚阴离子微球做载体，之后逐层组装的HRP-β-Gal-PAH-GOX结构中GOX的载酶量可达71.10％。

对比例

为了更好地说明逐层组装在固定多酶的酶学性能，本发明通过多酶混合液进行原位组装。配置相同浓度的三种酶(β-Gal、GOD和HRP)，按照1:1:1的体积比将三种酶进行混合得到混合酶液，参考制备聚阳离子微球的方法，将其中的PAH更换为混合酶液，能够完成多酶的原位组装。最后测得的多酶载酶量为62％，其中β-Gal、GOD和HRP的相对酶活分别为80％，81％和76％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种聚电解质层层组装多酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以聚电解质微球为固定模板，加入第一种酶混匀，固液分离取固相；

（2）依次逐层添加酶，按照步骤（1）重复固液分离取固相进行分层组装；

（3）添加去除剂，混匀，固液分离取固相，得到所述聚电解质层层组装多酶；

步骤（1）中，所述第一种酶选自葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、念珠菌脂肪酶、α-淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶和辣根过氧化物酶中的一种或多种；

步骤（2）中，所述酶选自葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、念珠菌脂肪酶、α-淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶和辣根过氧化物酶中的一种或多种；

步骤（1）中，所述聚电解质微球的制备方法为：

将钙源水溶液和聚阳离子电解质或聚阴离子电解质混匀，加入碳酸盐水溶液进行反应，将反应液进行固液分离取固相，得到所述聚电解质微球；

步骤（2）中，所述逐层添加酶的过程中，当相邻两种酶同时带相同电荷时，中间添加一层与酶所带电荷相反的聚阳离子电解质或聚阴离子电解质进行电荷填充。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述钙源选自氯化钙、硝酸钙、氢氧化钙和氧化钙中的一种或多种；所述碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铵和碳酸氢钠中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述钙源和聚阳离子电解质或聚阴离子电解质的质量比分别为33:1-2。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碳酸盐水溶液的加入速度为2mL/min-8 mL/min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述去除剂选自乙二胺四乙酸、乙二醛和聚乙二醇中的一种或多种。

6.权利要求1-5任一项所述制备方法得到的聚电解质层层组装多酶。

7.根据权利要求6所述的聚电解质层层组装多酶在血糖检测、生产葡萄糖酸、清除过氧化氢、构建新型生物传感器或开发纳米生物催化剂中的应用。