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CN114686428A - 细胞-多肽偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

细胞-多肽偶联物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114686428A CN202011609724.8A CN202011609724A CN114686428A CN 114686428 A CN114686428 A CN 114686428A CN 202011609724 A CN202011609724 A CN 202011609724A CN 114686428 A CN114686428 A CN 114686428A
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Abstract

本发明提供一种细胞‑多肽偶联物及其制备方法和应用，具体地，本发明提供一种细胞‑多肽偶联物，其包含免疫效应细胞以及共价连接至所述免疫效应细胞膜表面的特异性结合gp96的多肽。所述细胞‑多肽偶联物可显著提高NK细胞对肿瘤细胞(尤其是肝癌细胞或三阴乳腺癌细胞)的杀伤效果。

Description

细胞-多肽偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种细胞-多肽偶联物、其制备方法、及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌病理类型的15％-20％。三阴性乳腺癌预后差、危害大，目前临床上没有相应的靶向药物，仅放化疗有一定疗效。
NK细胞作为天然免疫的重要组成部分，对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用，并通过分泌细胞因子和趋化因子发挥免疫调节功能。与T细胞不同，NK细胞发挥杀伤活性不需要肿瘤细胞表达肿瘤抗原，并且对低表达或不表达MHC分子的肿瘤细胞杀伤活性更强。
过继性回输同种异体NK细胞已经在临床试验中用于血液类肿瘤(淋巴瘤、急性白血病等)和多种实体瘤(晚期胃癌和结直肠癌、胃肠部肿瘤的肝转移和儿童复发、难治性神经母细胞瘤等)的治疗，具有很好的安全性，不会引起移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)，但是仅具中等的治疗效果。可能的原因是NK细胞缺乏靶向性以及肿瘤浸润不足。为了提高NK细胞的靶向杀伤活性，目前的研究主要通过病毒载体构建靶向肿瘤抗原的CAR-NK细胞，但是即使采用慢病毒感染的方法，原代NK细胞的CAR载体转染效率依然低下；且病毒载体具有一定的安全隐患；CAR-NK制备周期较长，费用高昂。
因此，开发一种非转染的方式，提供特异性靶向杀伤三阴性乳腺癌的NK细胞的方法是目前的研究热点。
发明内容
本发明通过对NK细胞膜表面修饰特异性靶向gp96的多肽得到一种细胞-多肽偶联物，其可显著提高NK细胞对肿瘤细胞(尤其是肝癌细胞或三阴乳腺癌细胞)的杀伤效果。
细胞
本发明提供一种细胞-多肽偶联物，包含免疫效应细胞以及共价连接至所述免疫效应细胞膜表面的特异性结合gp96的多肽。
所述免疫效应细胞为T细胞、NK细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞为NK细胞。
本领域技术人员将理解，从人组织获得的原代细胞和现有细胞系两者均适用于工程化以获得本发明的细胞-多肽偶联物。例如，在一些实施方案中，所述NK细胞可来源于从受试者(如人)获得的原代细胞。
在一些实施方案中，原代NK细胞群可从哺乳动物受试者(如人受试者)的样品获得。所述样品或来源可以是脐带血、骨髓或外周血。
在一些方面，从所述细胞群分离表达一种或多种NK细胞特异性标记物的NK细胞。分离和鉴定NK细胞的方法是本领域熟知的，并且包括在Da hl be rg等人，Frontiers inImmunology，第6卷第605条第1-18页(2015)中讨论的那些方法。
在一些实施方案中，NK细胞可被鉴定为表达典型人NK细胞标记物(如KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD56和CD161)的那些细胞。
在一些实施方案中，可使用阳性或阴性选择来选择性地富集NK细胞。例如，可通过将细胞混合物暴露于固定的抗CD3抗体并除去未结合细胞来选择不表达CD3的NK细胞。根据本发明的一些实施方案，NK细胞包括CD56+CD3-细胞。根据本发明的一些实施方案，NK细胞包括CD56+CD16+CD3-细胞。
在一些实施方案中，NK细胞包括NK细胞系。在一些方面，NK细胞系允许产生更大量的细胞而不必扩增来源于受试者的少量NK细胞。细胞系还具有被良好表征的优点。
在一些实施方案中，所述细胞系是克隆细胞系。在一些实施方案中，所述细胞系来源于患有NK细胞白血病或淋巴瘤的患者。在一些实施方案中，所述NK细胞系包括NK-92、NKYS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1。
NK-92是NK样细胞系，其最初从患有大颗粒淋巴瘤的受试者的血液分离，并且随后在细胞培养中增殖。已描述了NK-92细胞系(Gong等人,1994；Klingemann,2002)。NK-92细胞具有为NK细胞特有的CD3-/CD56+表型。它们表达除CD16之外的所有已知NK细胞激活受体，但缺乏除NKG2A/CD94和ILT2/LIR1(以低水平表达)之外的所有已知NK细胞抑制性受体。此外，不同于从血液分离的多克隆NK细胞，NK-92是在类型和细胞表面浓度两个方面以一致性方式表达这些受体的克隆细胞系。类似地，当治疗地给予至人受试者时，NK-92细胞不是免疫原性的并且不引起免疫排斥反应。事实上，NK-92细胞在人体内耐受性良好，对正常组织没有已知的有害影响。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞表面连接有特异性结合gp96的多肽，所述多肽选自：
1)具有或包含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽(即，P37)；
2)与SEQ ID NO.1相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合)的多肽，所述多肽仍能特异性结合gp96；优选地，所述置换是保守置换；和，
3)与SEQ ID NO.1相比，具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞表面修饰有叠氮基团，所述多肽通过连接基团与所述免疫效应细胞表面的叠氮基团连接，其中所述连接基团选自DBCO、DIBO和BCN。
细胞群
在另一个方面，本发明提供一种细胞群，其包含多个前文所述的细胞-多肽偶联物。
在一些实施方案中，所述细胞-多肽偶联物占所述细胞群总数量的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
组合物
在另一个方面，本文提供了包含所述细胞-多肽偶联物的组合物。所述组合物包括用于给予(如以用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，将细胞-多肽偶联物与药学上可接受的载体一起配制。
在一些实施方案中，所述组合物含有前文所述的细胞-多肽偶联物或细胞群，以及药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体可包括与药物给予相容的所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等(Gennaro,2000,Remington:The science andpractice of pharmacy,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发性油类。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。药物载体应是适用于NK细胞的载体，如盐水溶液、右旋糖溶液或包含人血清白蛋白的溶液。
在一些实施方案中，组合物中细胞的数量以治疗有效量提供了细胞-多肽偶联物。在一些实施方案中，所述量是降低动物中与癌症相关的严重性、持续时间和/或症状的量。在某些其他实施方案中，治疗有效量是细胞的剂量，其导致相对于未给予本文所述组合物的患者(或动物)或一组患者(或动物)中癌症的生长或扩散，给予所述组合物的患者或动物中癌症的生长或扩散减少至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，所述组合物包含一定剂量的细胞-多肽偶联物，其为从或从约105至约1012个细胞、或约105至约108个细胞、或约106至约1012个细胞、或约108至约1011个细胞、或约109至约1010个细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含大于105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012个细胞或者大于约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012个细胞。
在一些实施方案中，组合物的体积是至少或至少约10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL，如从或从约10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL，包括端值。在一些实施方案中，所述组合物具有至少或至少约1×105个细胞/mL、5×105个细胞/mL、1×106个细胞/mL、5×106个细胞/mL、1×107个细胞/mL、5×107个细胞/mL或1×108个细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案，组合物的细胞密度介于或介于约1×105个细胞/mL至1×108个细胞/mL、1×105个细胞/mL至1×107个细胞/mL、1×105个细胞/mL至1×106个细胞/mL、1×106个细胞/mL至1×107个细胞/mL、1×106个细胞/mL至1×108个细胞/mL、1×106个细胞/mL至1×107个细胞/mL或1×107个细胞/mL至1×108个细胞/mL之间，包括端值。
取决于工程化NK细胞的方法，在将NK细胞配制成用于给予的组合物之前，培养NK细胞以使其扩增可能是必要的。在一些实施方案中，产生包含工程化NK细胞的组合物的方法包括培养或孵育工程化NK细胞，如在向有需要的个体给予NK细胞之前使细胞扩增至治疗有效量。
在一些实施方案中，富集的NK细胞(典型地>99％CD3阴性和>85％CD56+)在对所述细胞进行工程化修饰之前或之后在体外扩增。
在一些实施方案中，来源于受试者的扩增的原代细胞可在工程化修饰之前扩增和/或培养。在一些实施方案中，工程化原代细胞可在工程化之后且在给予至患者之前培养和/或扩增。
用于体外分离和大规模扩增NK细胞的技术是已知的。示例性程序描述于美国专利申请公开号2014/0086890中，其通过引用整体并入本文。本领域普通技术人员可鉴定用于扩增NK细胞的另外的方法，例如描述于Childs等人，Hematol.The Education Program，2013:234-246，2013中，其通过引用整体并入本文。
可通过流式细胞术分析未扩增和扩增的NK细胞的标记物(如CD56、CD16、TRAIL、FasL、NKG2D、LFA-1、穿孔素以及颗粒酶A和B)的表达。在一些例子中，在基线时并且在体外扩增后>10天测量一种或多种标记物的表达。铬释放测定可用于评估新鲜和扩增的NK细胞对癌细胞靶标的细胞毒性。本领域普通技术人员可鉴定评估NK细胞群(例如纯度)、生存力和/或活性的其他方法。
在一些实施方案中，可使用饲养细胞，或在细胞因子存在下培养NK细胞，其增强其生长和/或激活。如本文所用，“培养”包括提供NK细胞维持所需的化学和物理条件(例如温度、气体)以及生长因子。在一个实施方案中，培养NK细胞包括为NK细胞提供增殖的条件。可支持NK细胞增殖的化学条件的例子包括但不限于缓冲液、营养物、血清、维生素和抗生素以及细胞因子和典型地在生长(即培养)培养基中提供的其他生长因子。在一个实施方案中，NK培养基例如为L500。培养物可补充有氨基酸、抗生素和/或细胞因子，以促进最佳生存力、增殖、功能和/或存活。
在一些实施方案中，培养包含工程化NK细胞的细胞群在没有饲养层或或饲养细胞的情况下进行。在这些实施方案的一些中，工程化NK细胞可用生长因子培养。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21的生长因子。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子是IL-2或IL-2和IL-15。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子仅是IL-2。
在一些实施方案中，所述组合物进一步含有冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于冷冻保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。
在一些实施方案中，工程化NK细胞可在给予至患者之前在超低温下保存。工程化NK细胞还可在从哺乳动物受试者分离之后并在基因工程化之前在超低温下保存。例如，可分离淋巴细胞或工程化NK细胞的另一来源，在超低温下储存，并且然后处理以产生工程化NK细胞。可替代地，可分离、处理淋巴细胞或工程化NK细胞的另一来源以产生工程化NK细胞，并且然后在超低温下储存。
一种在超低温下小规模保存的典型方法描述于例如美国专利号6,0168,991中。对于小规模，细胞可通过在预先冷却的5％人白蛋白血清(HAS)中的低密度悬浮液(例如，浓度为约200×106/mL)在超低温下保存。可向HAS溶液中加入等量的20％DMSO。可将混合物的等分试样放入小瓶中，并在约-80℃的超低温室内冷冻过夜。
在一些实施方案中，冷冻保存的NK细胞通过解冻准备用于给予。在一些情况下，NK细胞可在解冻后立即给予至受试者。在这样的实施方案中，所述组合物无需任何进一步处理即可使用。在其他情况下，NK细胞在解冻后被进一步处理，如通过用药学上可接受的载体重悬、用激活剂或刺激剂孵育、或者在给予至受试者之前被激活洗涤并重悬在药学上可接受的缓冲液中。
用途或治疗方法
在另一个方面，本发明提供前文所述的细胞-多肽偶联物或者细胞群在制备药物或试剂中的用途，其中所述药物或试剂用于：
(1)抑制肿瘤细胞增殖；
(2)抑制肿瘤细胞生长；
(3)抑制肿瘤细胞侵袭；
(4)促进肿瘤细胞凋亡；和/或
(5)杀伤肿瘤细胞。
在一些实施方案中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞(优选三阴乳腺癌细胞)或肝癌细胞。
在另一个方面，本发明提供前文所述的细胞-多肽偶联物或者细胞群在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防肿瘤，例如乳腺癌(优选三阴乳腺癌)或肝癌。
在另一个方面，本发明提供一种治疗和/或预防肿瘤的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的如前文所述的细胞-多肽偶联物或者细胞群步骤。
在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用1×108～1×1010细胞/m2。
在一些实施方案中，所述的细胞-多肽偶联物或者细胞群对于所述个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述细胞-多肽偶联物或者细胞群对于所述个体而言是自体的。
所述工程化的NK细胞可通过任何方便的途径给予至受试者，包括肠胃外途径，如皮下、肌肉内、静脉内和/或硬膜外给予途径。
本文所述肿瘤包括但不限于：脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、前列腺肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为乳腺癌，例如三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述肿瘤为肝癌。
本文所述肿瘤细胞包括但不限于：脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾丸癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞，例如三阴性乳腺癌细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤为肝癌。
在某些实施方案中，所述乳腺癌细胞为MDA-MB-231。
在某些实施方案中，所述肝癌细胞为HepG2。
产生细胞-多肽偶联物或者细胞群的方法
基于糖代谢途径及生物化学等交叉学科发展，已广泛应用于临床前基础研究领域，并显示出较为广阔的生物医学应用前景。其中，叠氮修饰甘露糖(Ac4ManNAz)可有效地被细胞摄取，并通过糖代谢途径在其细胞表面表达出叠氮键，通过点击化学方式，可以与不同带有DBCO末端的小分子结合，用于细胞表面的功能化修饰，此过程简单易操作，且生物安全性高，无细胞毒副作用，为人工改造细胞提供新策略。
基于此，本发明进一步提供一种产生前文所述的细胞-多肽偶联物或者细胞群的方法，其包括以下步骤：
(1)提供免疫效应细胞；
(2)将所述免疫效应细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，获得表面修饰有叠氮基团的免疫效应细胞；
(3)将末端修饰有连接基团的特异性结合gp96的多肽通过点击化学方法(例如无铜点击化学方法)偶联至步骤(2)得到的免疫效应细胞，得到所述细胞-多肽偶联物或细胞群；
其中，所述连接基团选自DBCO、DIBO和BCN。
在一些实施方案中，所述方法的特征在于下述的一项或多项：
a)步骤(1)所述免疫效应细胞浓度为2-2.5×106细胞/mL，优选为2.5×106细胞/mL；
b)步骤(2)所述叠氮修饰的甘露糖为Ac4ManNAz，优选地，其浓度为40-50μM(例如45μM)；
c)步骤(2)所述培养时间为24-48小时(优选为36小时)；
d)步骤(2)所述培养结束后采用如下方法进行处理以获得表面修饰有叠氮基团的免疫效应细胞：350-450×g(例如400×g)室温离心5-10分钟(例如5分钟)，弃上清，生理盐水洗涤1～3遍；
e)步骤(3)包括以下操作：使用培养基(例如L500)重悬步骤(2)得到的细胞至浓度为2-2.5×106细胞/mL，加入4-5μM(优选为4μM)的末端修饰有连接基团的特异性结合gp96的多肽共孵育2-3小时(优选为3小时)；优选地，在孵育结束后，350-450×g(例如400×g)室温离心5-10分钟(例如5分钟)，弃上清，生理盐水洗1～3遍，得到所述细胞-多肽偶联物或细胞群；进一步优选地，将所得到的细胞-多肽偶联物或细胞群用生理盐水重悬至浓度为1-5×107细胞/mL备用；
f)步骤(3)中所述多肽与免疫效应细胞的比例为20-50ug多肽：1*106细胞。
在一些实施方案中，当所述连接基团为DBCO，所述多肽为P37时，所述末端修饰有连接基团的特异性结合gp96的多肽结构如下所示：
Figure BDA0002871066240000101
合成多肽的方法为本领域已知，可根据序列信息人工合成本发明所述P37。进一步将P37和DBCO或带有荧光素的DBCO或其它连接基团进行连接。
在一些实施方案中，所述无铜点击化学发生在DBCO和免疫效应细胞表面修饰的-N3之间。
术语定义
本发明中可能使用的分子生物学、微生物学以及重组DNA技术属于本领域已知技术。这些技术已在文献中被充分解释。详见，例如：Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloing：A Laboratory Mannual,(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach VolumesI&II,D.N.Glover ed.1985；Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait ed.1984；NucleicAcid Hybridization,B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1985；Transcription andTranslation,B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984；Animal Cell Culture,R.I.Freshney,ed.1986；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,1986；BPerbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning,1984.基于此，对本文中出现的术语定义如下。
如本文中使用的，术语“gp96蛋白”是指存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为96KD的热休克蛋白(又称GRP94)。gp96蛋白的氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且见于各种公共数据库(例如GenBank数据库，Genbank Accession NO.AY040226)。野生型gp96蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。因此，在本发明中，当涉及gp96蛋白的序列时，其使用SEQ ID NO.2所示的序列来进行描述。然而，本领域技术人员理解，可在SEQID NO.2中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换、缺失和/或添加)，而不影响gp96蛋白的生物学特性。因此，当涉及gp96蛋白时，本发明意欲包括SEQ ID NO.2所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了gp96蛋白的生物学特性。
本文所述P37多肽是一种可与gp96蛋白结合的多肽。该多肽含有α-螺旋序列，能够与gp96特异结合，阻断gp96分子内部基序重排和构象变化，进而干扰胞膜gp96与HER-2、uPAR或ER-a36的相互作用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。当涉及P37时，本发明意欲包含P37及其变体，所述“变体”是指这样的多肽，其氨基酸序列与P37的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有至少60％、至少70％、80％、85％、90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且其与PIBC具有相同的功能，所述“功能”可以是如下功能中的一个或者多个：(i)能够与gp96特异结合，(ii)能够阻断gp96分子内部基序重排和构象变化，(iii)能够干扰胞膜gp96与HER-2、uPAR或ER-a36的相互作用。
如本文中使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如在说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。
如本文中使用的，术语“大约”、“大约”应该被本领域技术人员理解，并将随其所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文，对于本领域技术人员而言，其含义不是清楚的，那么“大约”的意思是偏差不超过所述特定数值或范围的正负10％。
如本文中使用的，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。
如本文中使用的，术语“自体”是指源自个体自身组织内部或取自个体自身组织的细胞或组织。例如，在NK细胞的自体转移或移植中，供体和受体是同一个人。
如本文中使用的，术语“同种异体”是指属于或获自相同物种，但在遗传上不同的细胞或组织，并且因此在一些情况下，是免疫学不相容的。典型地，术语“同种异体”用于定义从供体移植到相同物种的受体的细胞。
如本文中使用的，术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。
如本文中使用的，术语“组合物”是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞或抗体)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。所述制剂通常呈允许活性成分(例如抗体)的生物活性有效的形式。
如本文中使用的，术语“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂等。
如本文所用，术语“个体”或“受试者”是哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。
如本文中使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
对受试者给予的药物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。
在一些实施方案中，在分离和工程化NK细胞后不久，向个体给予工程化NK细胞。在一些实施方案中，在分离和工程化1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天内，向个体给予工程化NK细胞。
附图说明
图1为实施例1中体外扩增NK细胞(CD3-CD56+)纯度的结果图。
图2为实施例2中NK细胞修饰P37多肽的结果图。
图3为实施例3中NK-Ac4ManN-P37和NK细胞体外杀伤三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果图。
图4为实施例4中NK-Ac4ManN-P37和NK细胞体外杀伤肝癌细胞系HepG2的结果图。
图5显示了实施例5中NK-Ac4ManN-P37和NK细胞以及多肽在体内杀伤三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果图。
图6显示了实施例6中NK-Ac4ManN-P37和NK细胞以及多肽在体内杀伤肝癌细胞系HepG2的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John 5Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行。
本发明涉及的gp96蛋白以及P37序列信息如下表所示。
序列信息简表
Figure BDA0002871066240000151
Figure BDA0002871066240000161
实施例1体外扩增NK细胞
人外周血单个核细胞购买自AllCells公司，产品目录号为PB004；EasysepTM HumanCD3 Positive Selection Kit II购买自STEMCELL公司，产品目录号为#17851；人细胞因子IL-2,IL21,IL15和IL12购买自上海近岸生物科技有限公司，产品目录号分别为：C013，CC45，C016和CI58。SuperCultureL500淋巴细胞无血清培养基购买自深圳达科为生物工程有限公司，产品目录号为：DKW-SCL5。DPBS购买自Thermo Fisher Scientific公司，产品目录号为：A1285601。流式抗体Anti-Human CD3 FITC和Anti-Human CD56 APC购买自ThermoFisher Scientific，产品目录号分别为11-0038-42和17-0567-41。
1.1用DPBS将细胞浓度调整至1×108cells/mL，转移至无菌5mL流式管中，按150μl/mL样品加入EasysepTM Human CD3 Positive Selection Kit II中的Human CD3Positive Selection Cocktail II，混匀，室温放置3min。
1.2将EasysepTM Human CD3 Positive Selection Kit II中的RapidSphereTM50100混匀，按90μl/mL样品加至步骤1.1的流式管中，混匀，室温放置3min。
1.3用DPBS将步骤2.2中5mL无菌流式管中的细胞悬液的体积补齐至2.5mL，轻轻混匀。
1.4将上述5mL无菌流式管置于磁铁中室温静置3min，拿起磁铁，将细胞倒于15mL无菌离心管中。
1.5从磁铁中取出5mL无菌流式管，向该5mL无菌流式管中加入2.5mL DPBS，重悬细胞。
1.6将1.5步5mL无菌流式管置于磁铁中室温静置3min，拿起磁铁，将细胞倒于步骤1.4中的15mL灭菌离心管中，并用含DPBS将细胞悬液体积补加至5mL，混匀。取20μl细胞悬液置于1.5mL EP管中计数。
1.7根据1.6步计数结果，用L500培养基将细胞浓度调整至1×106cells/mL，加入IL-2使其终浓度为1000IU/mL，另加入IL21、IL15和IL12，使其终浓度为50ng/mL，混匀。
1.8将细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO2培养箱中继续培养。
1.9在培养的第14天进行表型检测。
结果如图1所示体外扩增NK细胞(CD3-CD56+)纯度可达95％以上。
实施例2 NK-Ac4ManN-P37细胞修饰效率条件的优化
Ac4ManNA购买自Merck公司，产品目录号为900917。DBCO-P37-FITC委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
2.1使用L500培养基分别将NK细胞浓度调整至2×106或2.5×106细胞/mL。
2.2分别加入终浓度为40、45或50μM的Ac4ManNAz，在37℃5％CO2培养箱中分别孵育24、36或48小时。
2.3孵育结束后，400×g室温离心5分钟，弃上清，使用L500培养基重选细胞至浓度1×106细胞/mL，分别加入终浓度为4或5μM的DBCO-P37-FITC，并分别在37℃5％CO2培养箱中孵育2或3小时。
2.4孵育结束后，400×g室温离心5分钟，弃上清，生理盐水洗两遍后，使用生理盐水重悬NK-Ac4ManN-P37-FITC，并进行流式检测。
修饰效率如表1所示，在不同条件下修饰效率有较大差异，其中NK细胞浓度在2.5×106细胞/mL，加入Ac4ManNAz浓度为45μM，孵育36小时，而后加入4μM的DBCO-P37-FITC，最后孵育3小时的效果最佳，结果如图2所示大于95％的NK细胞都修饰上了P37多肽。
表1不同条件下NK细胞的修饰效率
Figure BDA0002871066240000181
Figure BDA0002871066240000191
Figure BDA0002871066240000201
实施例3 NK-Ac4ManN-P37细胞体外杀伤三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞活性检测
DBCO-P37委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。CFSE染料购自Thermo FisherScientific公司(货号C34554)。碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)购自Thermo FisherScientific，产品目录号：00-6990-50。
3.1胰蛋白酶消化MDA-MB-231细胞，调整细胞悬液浓度至2×105个细胞/mL，加入CSFE，使其终浓度为1μM，室温避光20min。
3.2离心收集细胞(1000rpm，5min)，用无血清培养基重悬细胞，混匀。37℃，避光，5min。离心收集细胞，用无血清培养基清洗两遍。用完全培养基重悬，计数，每个96孔里加入5万细胞。
3.3按照实施例1制备NK细胞作为对照细胞，按照实施例2制备方法制备NK-Ac4ManN-P37细胞，其中将DBCO-P37-FITC多肽替换为DBCO-P37多肽，制备NK-Ac4ManN-P37细胞作为实验细胞。
3.4将100μL的NK-Ac4ManN-P37细胞及对照细胞悬液或等体积的培养基(空白对照)以不同的效靶比(E:T＝0:1，2.5:1，5:1，10:1)加入96孔U型板中，37℃培养箱作用4-6h。
3.5收集细胞，用400μl PBS将细胞悬起，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记(临上样前2min再加入)，流式检测。
结果如图3所示，在效靶比10：1的条件下，NK-Ac4ManN-P37和NK细胞在体外都有杀伤活性，与NK细胞相比，NK-Ac4ManN-P37细胞的杀伤活性显著提高(P<0.01)，杀伤效率调高94.8％。
实施例4NK-Ac4ManN-P37细胞体外杀伤肝癌HepG2细胞活性检测
DBCO-P37委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。CFSE染料购自Thermo FisherScientific公司(货号C34554)。碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)购自Thermo FisherScientific，产品目录号：00-6990-50。
4.1胰蛋白酶消化HepG2细胞，调整细胞悬液浓度至1×105个细胞/mL，加入CSFE,使其终浓度为1μM，室温避光20min。
4.2离心收集细胞(1000rpm，5min)，用无血清培养基重悬细胞，混匀。37℃，避光，5min。离心收集细胞，用无血清培养基清洗两遍。用完全培养基重悬，计数，每个96孔里加入3万细胞。
4.3按照实施例1制备NK细胞作为对照细胞，按照实施例2制备方法制备NK-Ac4ManN-P37细胞，其中将DBCO-P37-FITC多肽替换为DBCO-P37多肽，制备NK-Ac4ManN-P37细胞作为实验细胞；
4.4将100μL的NK-Ac4ManN-P37细胞及对照细胞悬液或等体积的培养基(空白对照)以不同的效靶比(E:T＝0:1，2.5:1，5:1，10:1)加入96孔U型板中，37℃培养箱作用4-6h。
4.5收集细胞，用400μl PBS将细胞悬起，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记(临上样前2min再加入)，流式检测。
结果如图4所示，在效靶比10：1的条件下，NK-Ac4ManN-P37和NK细胞在体外都有杀伤活性，与NK细胞相比，NK-Ac4ManN-P37细胞的杀伤活性显著提高(P<0.05)，杀伤效率调高78.2％。
实施例5 NK-Ac4ManN-P37细胞抗三阴性乳腺癌体内活性检测
5.1将培养至对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下接种BALB/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只接种1000万细胞，建立移植瘤模型，之后在裸鼠体内经过3次传代用于接瘤实验。
5.2等到肿瘤生长到100mm3时将BALB/c裸鼠随机分为3组，每组5只，分别进行如下治疗处理，第1次处理当天记为第1天：
NK-Ac4ManN-P37组：将制备的NK-Ac4ManN-P37细胞(参考实施例2制备)悬于0.9％的生理盐水，进行静脉注射治疗，每次注射细胞数为1×107，体积200μl，每周给药一次，总共治疗二周；
NK组：将制备的NK细胞(参考实施例1制备)悬于0.9％的生理盐水，进行静脉注射治疗，每次注射细胞数为1×107，体积200μl，每周给药一次，总共治疗二周；
多肽组：以5mg/kg的剂量每天静脉注射一次。
对照组：用PBS缓冲液进行静脉注射治疗，注射体积同NK-Ac4ManN-P37治疗组，每周注射一次，总共二周。
5.3每周检测二次肿瘤体积，治疗二周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(对照组小鼠的肿瘤体积-多肽组小鼠肿瘤的体积)/对照组小鼠的肿瘤体积×100％。
NK-Ac4ManN-P37、NK治疗组以及多肽组的肿瘤抑制率结果如图5所示。结果表明，NK-Ac4ManN-P37、NK细胞以及多肽均能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231引起的乳腺癌肿瘤生长，且NK-Ac4ManN-P37组的治疗效果更优(P<0.01)，与单独的NK细胞和多肽相比，NK-Ac4ManN-P37对肿瘤生长的抑制提高了169％和118％。
实施例6 NK-Ac4ManN-P37细胞抗肝癌体内活性检测
6.1将培养至对数生长期的肝癌细胞HepG2皮下接种BALB/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只接种1000万细胞，建立移植瘤模型，之后在裸鼠体内经过3次传代用于接瘤实验。
6.2等到肿瘤生长到100mm3时将BALB/c裸鼠随机分为3组，每组5只，分别进行如下治疗处理，第1次处理当天记为第1天：
NK-Ac4ManN-P37组：将制备的NK-Ac4ManN-P37细胞(参考实施例2制备)悬于0.9％的生理盐水，进行静脉注射治疗，每次注射细胞数为1×107，体积200μl，每周给药一次，总共治疗二周；
NK组：将制备的NK细胞(参考实施例1制备)悬于0.9％的生理盐水，进行静脉注射治疗，每次注射细胞数为1×107，体积200μl，每周给药一次，总共治疗二周；
多肽组：以5mg/kg的剂量每天静脉注射一次。
对照组：用PBS缓冲液进行静脉注射治疗，注射体积同NK-Ac4ManN-P37治疗组，每周注射一次，总共二周。
6.3每周检测二次肿瘤体积，治疗二周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率的计算公式如下：(对照组小鼠的肿瘤体积-多肽组小鼠肿瘤的体积)/对照组小鼠的肿瘤体积×100％。
NK-Ac4ManN-P37、NK治疗组以及多肽组的肿瘤抑制率结果如图6所示。结果表明，NK-Ac4ManN-P37、NK细胞均能有效抑制肝癌细胞HepG2引起的肿瘤生长，且NK-Ac4ManN-P37组的治疗效果更优(P<0.05)，与单独的NK细胞相比，NK-Ac4ManN-P37对肿瘤生长的抑制提高了114％。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种细胞-多肽偶联物，包含免疫效应细胞以及共价连接至所述免疫效应细胞膜表面的特异性结合gp96的多肽。
2.权利要求1的细胞-多肽偶联物，其中所述多肽选自：
1)具有或包含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽；
2)与SEQ ID NO.1相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合)的多肽，所述多肽仍能特异性结合gp96；优选地，所述置换是保守置换；和，
3)与SEQ ID NO.1相比，具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。
3.权利要求1或2的细胞-多肽偶联物，所述免疫效应细胞为T细胞、NK细胞或巨噬细胞；优选为NK细胞(例如NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1)。
4.权利要求1-3任一项的细胞-多肽偶联物，其中所述免疫效应细胞表面修饰有叠氮基团，所述多肽通过连接基团与所述免疫效应细胞表面的叠氮基团连接，其中所述连接基团选自DBCO、DIBO和BCN。
5.一种细胞群，其包含多个权利要求1-4任一项所述的细胞-多肽偶联物；优选地，所述细胞-多肽偶联物占所述细胞群总数量的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
6.一种组合物，其含有权利要求1-4任一项所述的细胞-多肽偶联物或权利要求5所述的细胞群，以及药学上可接受的载体；
优选地，所述载体选自盐水溶液、右旋糖溶液或5％人血清白蛋白；
优选地，所述组合物中细胞浓度为1×105～1×108细胞/mL；
优选地，所述组合物中含有冷冻保护剂。
7.权利要求1-4任一项所述的细胞-多肽偶联物或者权利要求5所述的细胞群在制备药物或试剂中的用途，其中所述药物或试剂用于：
(1)抑制肿瘤细胞增殖；
(2)抑制肿瘤细胞生长；
(3)抑制肿瘤细胞侵袭；
(4)促进肿瘤细胞凋亡；和/或
(5)杀伤肿瘤细胞；
优选地，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞(优选三阴乳腺癌细胞)或肝癌细胞。
8.权利要求1-4任一项所述的细胞-多肽偶联物或者权利要求5所述的细胞群在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防肿瘤，例如乳腺癌(优选三阴乳腺癌)或肝癌。
9.一种制备权利要求1-4任一项所述的细胞-多肽偶联物或者权利要求5所述的细胞群的方法，其包括以下步骤：
(1)提供免疫效应细胞，例如来源于人外周血单个核细胞或NK92细胞系的NK细胞；
(2)将所述免疫效应细胞与叠氮修饰的甘露糖共培养，获得表面修饰有叠氮基团的免疫效应细胞；
(3)将末端修饰有连接基团的特异性结合gp96的多肽通过点击化学方法偶联至步骤(2)得到的免疫效应细胞，得到所述细胞-多肽偶联物或细胞群；
其中，所述连接基团选自DBCO、DIBO和BCN。
10.权利要求8的方法，其特征在于下述的一项或多项：
a)步骤(1)所述免疫效应细胞浓度为2-2.5×106细胞/mL，优选为2.5×106细胞/mL；
b)步骤(2)所述叠氮修饰的甘露糖为Ac4ManNAz，优选地，其浓度为40-50μM(例如45μM)；
c)步骤(2)所述培养时间为24-48小时(优选为36小时)；
d)步骤(2)所述培养结束后采用如下方法进行处理以获得表面修饰有叠氮基团的免疫效应细胞：350-450×g室温离心5-10分钟，弃上清，生理盐水洗涤1～3遍；
e)步骤(3)包括以下操作：使用培养基(例如L500)重悬步骤(2)得到的细胞至浓度为2-2.5×106细胞/mL，加入4-5μM(优选为4μM)的末端修饰有连接基团的特异性结合gp96的多肽共孵育2-3小时(优选为3小时)；优选地，在孵育结束后，350-450×g室温离心5-10分钟，弃上清，生理盐水洗1～3遍，得到所述细胞-多肽偶联物或细胞群；进一步优选地，将所得到的细胞-多肽偶联物或细胞群用生理盐水重悬至浓度为1-5×107细胞/mL备用；
f)步骤(3)中所述多肽与免疫效应细胞的投料比例为20-50ug多肽：1*106细胞。
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