CN114569710A - 一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明旨在解决激隐核虫疫苗制备成本较高且免疫保护效果不佳的技术问题，提供了一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法，首次鉴定出四膜虫中的交叉保护性抗原tubulin蛋白，并在大肠杆菌中对tubulin基因进行重组表达，以其作为抗原制备疫苗，大大提高了石斑鱼抗刺激隐核虫感染的能力。其免疫保护效果远高于利用四膜虫全虫蛋白或纤毛蛋白制备的异源疫苗。

Description

一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备 方法

技术领域

本发明属于刺激隐核虫疫苗制备领域，具体涉及一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法。

背景技术

刺激隐核虫病是由一种海水纤毛虫——刺激隐核虫引起的致死性寄生虫病，被列为国家《一、二、三类动物疫病病种名录》中水生动物二类疫病。近年来，刺激隐核虫病对我国海水养殖鱼类危害严重，每年给我国造成10亿元以上的经济损失，极大制约了海水养殖业的健康发展。腹腔注射灭活的刺激隐核虫，可引起鱼类产生抗刺激隐核虫的免疫保护作用，说明疫苗接种是防治刺激隐核虫病的有效方法(Yoshinaga et al，1997；Luo et al，2007；Hatanaka and Hirazawa，2008)。但目前刺激隐核虫仅能通过活鱼进行传代，无法规模化生产，使得虫体的繁殖成本高昂，很难满足生产需求。

纤毛虫是一类体表遍布纤毛的原生动物，其可作为抗原免疫动物引起宿主产生交叉免疫保护。使用嗜热四膜虫全虫或其纤毛蛋白浸泡免疫虹鳟，能使受免鱼获得对多子小瓜虫的免疫保护(Wolf et al.，1982)。注射梨形四膜虫纤毛蛋白的斑点叉尾鮰产生了对多子小瓜虫的获得性免疫保护，并可引起鱼类产生特异性抗体(Goven et al.，1980；Govenet al.，1981；Dickerson et al.，1984；Clark et al.，1988)。值得注意的是，虽然注射梨形四膜虫全虫蛋白的金鱼产生了对多子小瓜虫及其他几种体外寄生性纤毛虫的免疫保护，并在获免金鱼的血清及黏液中检测出特异性抗体(Ling et al.，1993)，但是并非接种所有梨形四膜虫虫株都可以提供较强的免疫保护(Houghton et al.，1992)。我们发现通过接种嗜热四膜虫可提高石斑鱼抗刺激隐核虫感染的能力，并在注射嗜热四膜虫的石斑鱼血清中发现可识别刺激隐核虫的特异性抗体。尽管四膜虫全虫蛋白或纤毛蛋白能作为抗原制备异源疫苗，给受免鱼提供一定程度的免疫保护，但四膜虫的体外大规模培养制备疫苗仍需较高成本，提取纤毛蛋白制备疫苗更是费时费力费钱；同时，四膜虫全虫蛋白或纤毛蛋白中存在许多非保护性抗原，以其作为抗原免疫鱼会引起鱼类产生与保护无关的应答，从而削弱鱼类针对特定病原的保护力。因此，鉴定四膜虫中的交叉保护性抗原，表达重组蛋白制备疫苗，既经济廉价又可提高免疫保护效果。

本发明从嗜热四膜虫中鉴定了一种tubulin抗原，并在大肠杆菌中对tubulin基因进行重组表达，以其作为抗原制备疫苗，发现重组tubulin蛋白疫苗能提高石斑鱼抗刺激隐核虫感染的能力。

发明内容

本发明旨在解决激隐核虫疫苗制备成本较高且免疫保护效果不佳的技术问题，提供了一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法，首次鉴定出四膜虫中的交叉保护性抗原tubulin蛋白，并在大肠杆菌中对tubulin基因进行重组表达，以其作为抗原制备疫苗，大大提高了石斑鱼抗刺激隐核虫感染的能力。其免疫保护效果远高于利用四膜虫全虫蛋白或纤毛蛋白制备的异源疫苗。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

一、交叉抗原的鉴定

1、刺激隐核虫传代

将卵形鲳鲹暂养于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；晚上加入孵出时间在2h内的刺激隐核虫幼虫感染卵形鲳鲹，刺激隐核虫感染浓度为20000幼虫/尾鱼，感染时将水位控制在40L/尾鱼，静水暂养，感染2h后将卵形鲳鲹转移到新的海水池中流水暂养；感染2d后，即可观察到卵形鲳鲹体表及鳃上有大量的白点，然后将卵形鲳鲹转移到特定的刺激隐核虫收虫器；次日早上，收集固着在收虫器杯底的刺激隐核虫包囊，将包囊放入灭菌海水于28℃孵育，2d后即有大量幼虫孵出，显微计数孵化2h内的幼虫浓度，进行下一批的传代感染。

2、抗血清的制备

为制备嗜热四膜虫免疫石斑鱼血清，首先用含青霉素、链霉素和两性霉素B的PYY培养液复苏实验室保存的嗜热四膜虫，30℃静置培养2-3天后将嗜热四膜虫转移至NEFF培养液中进行培养，然后依次用含1倍10μM巴龙霉素、3倍10μM巴龙霉素、5倍10μM巴龙霉素、7倍10μM巴龙霉素的NEFF培养液进行选择培养；筛选后转移至大体积NEFF培养液中扩大培养，收集嗜热四膜虫并用PBS溶液洗涤3次，最后用PBS溶液重悬，并计数嗜热四膜虫数量；

将PBS溶液重悬的嗜热四膜虫与等体积的弗氏完全佐剂混合后进行乳化，注射免疫10尾石斑鱼，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫14天后，将嗜热四膜虫和等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，对首次免疫的10尾石斑鱼进行加强免疫，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫42天后，以每尾鱼4000刺激隐核虫幼虫的剂量对石斑鱼进行攻毒，于攻毒后第3天采集石斑鱼的血清。

3、交叉抗原鉴定

提取刺激隐核虫总蛋白，与步骤2采集的石斑鱼血清混合，置于摇床上4℃孵育过夜；向刺激隐核虫总蛋白与石斑鱼血清混合溶液中加入结合了抗石斑鱼IgM抗体的亲和纯化柱，于摇床上4℃孵育过夜；离心后去除上清，保留沉淀；用PBS溶液洗涤沉淀后，将沉淀产物进行质谱分析，鉴定与抗石斑鱼IgM抗体结合的刺激隐核虫蛋白；

对质谱结果分析：发现在所有鉴定到的刺激隐核虫蛋白中，tubulin蛋白得分最高，说明嗜热四膜虫tubulin是引起石斑鱼血清与刺激隐核虫蛋白产生交叉反应的主要抗原，因此，嗜热四膜虫tubulin蛋白可作为潜在的交叉抗原制备疫苗。

二、重组蛋白的表达纯化

1、重组tubulin蛋白表达载体构建

(1)pMD18T-Tt-tubulin质粒的提取

为适应大肠杆菌表达系统，将嗜热四膜虫tubulin蛋白的基因序列进行密码子优化；合成密码子优化后的嗜热四膜虫tubulin基因序列，并将tubulin基因克隆至pMD18T载体中，获得pMD18T-Tt-tubulin质粒，再把pMD18T-Tt-tubulin质粒转化到大肠杆菌DH5α中；

按以下步骤提取pMD18T-Tt-tubulin质粒：

a、将带有pMD18T-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌DH5α接种到LB平板上进行复苏，挑取单菌落至5mL含有20μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、180rpm振荡培养过夜；

b、10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留沉淀细菌；

c、向沉淀中加入250μL含有RNAase的Solution I进行重悬；

d、向重悬液中加入250μL Solution II，上下颠倒5次，室温静置2min；

e、再加入350μL Solution III，上下颠倒10次，13,000×g离心10min；

f、将回收柱装在2mL收集管上；

g、吸取步骤e中的离心上清至回收柱，10,000×g离心1min，弃滤液；

h、向回收柱中加入650μL无水乙醇稀释的Wash buffer，10,000×g离心1min，弃滤液；

i、重复h步骤1次；

j、13,000×g离心2min甩干回收柱；

k、丢弃收集管，将回收柱装在新的EP管上，再向回收柱中加入30μL水溶解2min，13,000×g离心1min，质粒即位于洗脱液中；

1、取少量洗脱液，测定其中质粒的浓度，其余样品备用。

(2)pET32a-ΔTRX质粒的提取

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取pET32a-ΔTRX质粒；

(3)酶切和连接转化

对提取的pMD18T-Tt-tubulin质粒和pET32a-ΔTRX质粒分别进行酶切，酶切体系为：2μL pMD18T-Tt-tubulin质粒或pET32a-ΔTRX质粒、10μL 10×QuickCut Buffer、2μLEcoR I、2μL Kpn I和84μL水；将酶切溶液混匀后，于37℃反应30min；酶切溶液进行电泳后，分别回收tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体；

使用T4连接酶将酶切后回收的tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体进行连接，连接体系为：3μL pET32a-ΔTRX、2μL tubulin和5μL T4连接酶；将连接体系混匀后，16℃连接过夜，再置于冰上冷却；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆菌，其中即含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒。

2、重组tubulin蛋白表达菌的筛选

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取阳性克隆菌的pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒，再转入大肠杆菌BL21中；挑取含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌BL21，接种于5mL含有20μg/mL氨苄青霉素LB培养液中，37℃、180rpm振荡培养；当菌液OD600达到0.6时，将菌液分成2份：一份作为诱导组，向其中加入IPTG至终浓度为1mM；另一份作为对照组，不加任何试剂；两份菌液继续培养2h后，10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留细菌沉淀；在沉淀中加入80μL水重悬细菌，再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min；将两份处理后的细菌样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后取下胶块，使用考马斯亮蓝染色液进行染色，再使用脱色液进行脱色。结果如图1所示，诱导组细菌为第2泳道，诱导组细菌表达出约55kDa的tubulin重组蛋白，而未诱导的对照组无此条带。

3、重组tubulin蛋白的纯化

挑取上一步骤筛选的可以表达tubulin重组蛋白的细菌(即含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌BL21)，接种到5mL LB培养液中过夜培养，再将5mL菌液转接到500mL LB培养液中，37℃振荡培养4h后，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养2h；8,000×g离心菌液10min，弃上清，保留细菌沉淀；向细菌沉淀中加入50mL含50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和10mM lmidazole的Lyse buffer重悬细菌，将重悬的菌液于冰上超声破碎，破碎条件为：250W、10s超声、10s间隔，共超声30min；8,000×g离心超声破碎的细菌10min，弃上清，保留沉淀；使用含100mM NaH₂PO₄和10mM Tris-HCl的2M、4M、6M尿素溶液依次洗涤沉淀，最后将沉淀溶解在8M尿素中；嗜热四膜虫tubulin重组蛋白组要溶解在8M尿素里，再使用镍柱从尿素溶液中纯化tubulin重组蛋白，步骤如下：

a、将镍填料装入亲和层析管中，再加入10倍填料体积的平衡溶液过柱；

b、关闭柱子底部的开关，加入含重组tubulin蛋白的8M尿素溶液，4℃过夜；

c、打开柱子底部的开关，收集流出液；

d、加入10倍填料体积的Wash buffer过柱，收集流出液；

e、重复d步骤一次；

f、加入5倍填料体积Elution buffer过柱，收集洗脱液，从而获得纯化的重组tubulin蛋白液；

取部分步骤f收集的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳。如图1第3泳道所示，经镍柱亲和纯化后，得到单一重组tubulin蛋白条带。

三、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护测试

1、免疫

将石斑鱼暂于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；将石斑鱼分为实验组和对照组；将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，通过皮肤下注射对实验组石斑鱼进行首次免疫；首次免疫两周后，将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，对首次免疫的石斑鱼进行加强免疫；对照组分别注射PBS与等体积弗氏完全佐剂、等体积弗氏不完全佐剂的乳化物。

2、刺激隐核虫攻毒

将对照组和免疫组的石斑鱼分别转移到装有10L海水的箱子中，每箱放置1尾鱼，静水暂养，往每个箱子中加入4,000刺激隐核虫幼虫感染石斑鱼2h，然后将石斑鱼捞出并转移到玻璃缸中流水暂养；刺激隐核虫感染2d后，将石斑鱼再次分装于各个箱子中，每箱1尾鱼，静水暂养，于2d后收集箱底的包囊；在解剖镜下计数从每尾石斑鱼脱落的包囊数量，收集的包囊数量与感染幼虫剂量的比值即为感染率。

结果表明：首次免疫六周后，相对于未免疫的对照组，重组tubulin蛋白免疫石斑鱼组的感染率显著降低。

四、抗刺激隐核虫疫苗的制备

将纯化后的重组tubulin蛋白液，再分别与等体积的弗氏完全佐剂和等体积的弗氏不完全佐剂混合，于冰上使用匀浆机进行乳化，制成首次免疫疫苗和加强免疫疫苗，于4℃保存。

附图说明

图1为重组tubulin蛋白的表达情况。其中，M泳道为蛋白Marker，1、2、3泳道分别表示对照组细菌、1mM IPTG诱导组细菌、纯化后的tubulin重组蛋白。

具体实施方式

一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

一、交叉抗原的鉴定

1、刺激隐核虫传代

将卵形鲳鲹暂养于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；晚上加入孵出时间在2h内的刺激隐核虫幼虫感染卵形鲳鲹，刺激隐核虫感染浓度为20000幼虫/尾鱼，感染时将水位控制在40L/尾鱼，静水暂养，感染2h后将卵形鲳鲹转移到新的海水池中流水暂养；感染2d后，即可观察到卵形鲳鲹体表及鳃上有大量的白点，然后将卵形鲳鲹转移到特定的刺激隐核虫收虫器；次日早上，收集固着在收虫器杯底的刺激隐核虫包囊，将包囊放入灭菌海水于28℃孵育，2d后即有大量幼虫孵出，显微计数孵化2h内的幼虫浓度，进行下一批的传代感染。

2、抗血清的制备

为制备嗜热四膜虫免疫石斑鱼血清，首先用含青霉素、链霉素和两性霉素B的PYY培养液复苏实验室保存的嗜热四膜虫，30℃静置培养2-3天后将嗜热四膜虫转移至NEFF培养液中进行培养，然后依次用含1倍10μM巴龙霉素、3倍10μM巴龙霉素、5倍10μM巴龙霉素、7倍10μM巴龙霉素的NEFF培养液进行选择培养；筛选后转移至大体积NEFF培养液中扩大培养，收集嗜热四膜虫并用PBS溶液洗涤3次，最后用PBS溶液重悬，并计数嗜热四膜虫数量；

将PBS溶液重悬的嗜热四膜虫与等体积的弗氏完全佐剂混合后进行乳化，注射免疫10尾石斑鱼，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫14天后，将嗜热四膜虫和等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，对首次免疫的10尾石斑鱼进行加强免疫，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫42天后，以每尾鱼4000刺激隐核虫幼虫的剂量对石斑鱼进行攻毒，于攻毒后第3天采集石斑鱼的血清。

3、交叉抗原鉴定

提取刺激隐核虫总蛋白，与步骤2采集的石斑鱼血清混合，置于摇床上4℃孵育过夜；向刺激隐核虫总蛋白与石斑鱼血清混合溶液中加入结合了抗石斑鱼IgM抗体的亲和纯化柱，于摇床上4℃孵育过夜；离心后去除上清，保留沉淀；用PBS溶液洗涤沉淀后，将沉淀产物进行质谱分析，鉴定与抗石斑鱼IgM抗体结合的刺激隐核虫蛋白；

对质谱结果分析：发现在所有鉴定到的刺激隐核虫蛋白中，tubulin蛋白得分最高，说明嗜热四膜虫tubulin是引起石斑鱼血清与刺激隐核虫蛋白产生交叉反应的主要抗原，因此，嗜热四膜虫tubulin蛋白可作为潜在的交叉抗原制备疫苗。

二、重组蛋白的表达纯化

1、重组tubulin蛋白表达载体构建

(1)pMD18T-Tt-tubulin质粒的提取

为适应大肠杆菌表达系统，将嗜热四膜虫tubulin蛋白的基因序列进行密码子优化；合成密码子优化后的嗜热四膜虫tubulin基因序列，并将tubulin基因克隆至pMD18T载体中，获得pMD18T-Tt-tubulin质粒，再把pMD18T-Tt-tubulin质粒转化到大肠杆菌DH5α中；

按以下步骤提取pMD18T-Tt-tubulin质粒：

a、将带有pMD18T-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌DH5α接种到LB平板上进行复苏，挑取单菌落至5mL含有20μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、180rpm振荡培养过夜；

b、10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留沉淀细菌；

c、向沉淀中加入250μL含有RNAase的Solution I进行重悬；

d、向重悬液中加入250μL Solution II，上下颠倒5次，室温静置2min；

e、再加入350μL Solution III，上下颠倒10次，13,000×g离心10min；

f、将回收柱装在2mL收集管上；

g、吸取步骤e中的离心上清至回收柱，10,000×g离心1min，弃滤液；

h、向回收柱中加入650μL无水乙醇稀释的Wash buffer，10,000×g离心1min，弃滤液；

i、重复h步骤1次；

j、13,000×g离心2min甩干回收柱；

k、丢弃收集管，将回收柱装在新的EP管上，再向回收柱中加入30μL水溶解2min，13,000×g离心1min，质粒即位于洗脱液中；

1、取少量洗脱液，测定其中质粒的浓度，其余样品备用。

(2)pET32a-ΔTRX质粒的提取

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取pET32a-ΔTRX质粒；

(3)酶切和连接转化

对提取的pMD18T-Tt-tubulin质粒和pET32a-ΔTRX质粒分别进行酶切，酶切体系为：2μL pMD18T-Tt-tubulin质粒或pET32a-ΔTRX质粒、10μL 10×QuickCut Buffer、2μLEcoR I、2μL Kpn I和84μL水；将酶切溶液混匀后，于37℃反应30min；酶切溶液进行电泳后，分别回收tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体；

使用T4连接酶将酶切后回收的tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体进行连接，连接体系为：3μL pET32a-ΔTRX、2μL tubulin和5μL T4连接酶；将连接体系混匀后，16℃连接过夜，再置于冰上冷却；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆菌，其中即含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒。

2、重组tubulin蛋白表达菌的筛选

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取阳性克隆菌中的pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒，再转入大肠杆菌BL21中；挑取含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌BL21，接种于5mL含有20μg/mL氨苄青霉素LB培养液中，37℃、180rpm振荡培养；当菌液OD600达到0.6时，将菌液分成2份：一份作为诱导组，向其中加入IPTG至终浓度为1mM；另一份作为对照组，不加任何试剂；两份菌液继续培养2h后，10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留细菌沉淀；在沉淀中加入80μL水重悬细菌，再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min；将两份处理后的细菌样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后取下胶块，使用考马斯亮蓝染色液进行染色，再使用脱色液进行脱色。结果如图1所示，诱导组细菌为第2泳道，诱导组细菌表达出约55kDa的tubulin重组蛋白，而未诱导的对照组无此条带。

3、重组tubulin蛋白的纯化

挑取上一步骤筛选的可以表达tubulin重组蛋白的细菌(即含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌BL21)，接种到5mL LB培养液中过夜培养，再将5mL菌液转接到500mL LB培养液中，37℃振荡培养4h后，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养2h；8,000×g离心菌液10min，弃上清，保留细菌沉淀；向细菌沉淀中加入50mL含50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和10mMImidazole的Lyse buffer重悬细菌，将重悬的菌液于冰上超声破碎，破碎条件为：250W、10s超声、10s间隔，共超声30min；8,000×g离心超声破碎的细菌10min，弃上清，保留沉淀；使用含100mM NaH₂PO₄和10mM Tris-HCl的2M、4M、6M尿素溶液依次洗涤沉淀，最后将沉淀溶解在8M尿素溶液中；嗜热四膜虫tubulin重组蛋白组要溶解在8M尿素溶液里，再使用镍柱从尿素溶液中纯化tubulin重组蛋白，步骤如下：

a、将镍填料装入亲和层析管中，再加入10倍填料体积的平衡溶液过柱；

b、关闭柱子底部的开关，加入含重组tubulin蛋白的8M尿素溶液，4℃过夜；

c、打开柱子底部的开关，收集流出液；

d、加入10倍填料体积的Wash buffer过柱，收集流出液；

e、重复d步骤一次；

f、加入5倍填料体积Elution buffer过柱，收集洗脱液，从而获得纯化的重组tubulin蛋白液；

取部分步骤f收集的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳。如图1第3泳道所示，经镍柱亲和纯化后，得到单一重组tubulin蛋白条带。

三、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护测试

1、免疫

将石斑鱼暂于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；将石斑鱼分为实验组和对照组；将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，通过皮肤下注射对实验组石斑鱼进行首次免疫(0.1ml/尾)；首次免疫两周后，将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，对首次免疫的石斑鱼进行加强免疫(0.1ml/尾)；相对应的，对照组分别注射PBS与等体积弗氏完全佐剂、等体积弗氏不完全佐剂的乳化物(注射剂量均为0.1ml/尾)。

2、刺激隐核虫攻毒

将对照组和免疫组的石斑鱼分别转移到装有10L海水的箱子中，每箱放置1尾鱼，静水暂养，往每个箱子中加入4,000刺激隐核虫幼虫感染石斑鱼2h，然后将石斑鱼捞出并转移到玻璃缸中流水暂养；刺激隐核虫感染2d后，将石斑鱼再次分装于各个箱子中，每箱1尾鱼，静水暂养，于2d后收集箱底的包囊；在解剖镜下计数从每尾石斑鱼脱落的包囊数量，收集的包囊数量与感染幼虫剂量的比值即为感染率。

结果表明：首次免疫六周后，相对于未免疫的对照组，重组tubulin蛋白免疫石斑鱼组的感染率显著降低。

四、抗刺激隐核虫疫苗的制备

将纯化后的重组tubulin蛋白液，再分别与等体积的弗氏完全佐剂和等体积的弗氏不完全佐剂混合，于冰上使用匀浆机进行乳化，制成首次免疫疫苗和加强免疫疫苗，于4℃保存。

Claims (1)

1.一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

一、交叉抗原的鉴定

(一)、刺激隐核虫传代

将卵形鲳鲹暂养于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；晚上加入孵出时间在2h内的刺激隐核虫幼虫感染卵形鲳鲹，刺激隐核虫感染浓度为20000幼虫/尾鱼，感染时将水位控制在40L/尾鱼，静水暂养，感染2h后将卵形鲳鲹转移到新的海水池中流水暂养；感染2d后，即可观察到卵形鲳鲹体表及鳃上有大量的白点，然后将卵形鲳鲹转移到特定的刺激隐核虫收虫器；次日早上，收集固着在收虫器杯底的刺激隐核虫包囊，将包囊放入灭菌海水于28℃孵育，2d后即有大量幼虫孵出，显微计数孵化2h内的幼虫浓度，进行下一批的传代感染。

(二)、抗血清的制备

为制备嗜热四膜虫免疫石斑鱼血清，首先用含青霉素、链霉素和两性霉素B的PYY培养液复苏实验室保存的嗜热四膜虫，30℃静置培养2-3天后将嗜热四膜虫转移至NEFF培养液中进行培养，然后依次用含1倍10μM巴龙霉素、3倍10μM巴龙霉素、5倍10μM巴龙霉素、7倍10μM巴龙霉素的NEFF培养液进行选择培养；筛选后转移至大体积NEFF培养液中扩大培养，收集嗜热四膜虫并用PBS溶液洗涤3次，最后用PBS溶液重悬，并计数嗜热四膜虫数量；

将PBS溶液重悬的嗜热四膜虫与等体积的弗氏完全佐剂混合后进行乳化，注射免疫10尾石斑鱼，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫14天后，将嗜热四膜虫和等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，对首次免疫的10尾石斑鱼进行加强免疫，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫42天后，以每尾鱼4000刺激隐核虫幼虫的剂量对石斑鱼进行攻毒，于攻毒后第3天采集石斑鱼的血清。

(三)、交叉抗原鉴定

提取刺激隐核虫总蛋白，与上一步骤采集的石斑鱼血清混合，置于摇床上4℃孵育过夜；向刺激隐核虫总蛋白与石斑鱼血清混合溶液中加入结合了抗石斑鱼IgM抗体的亲和纯化柱，于摇床上4℃孵育过夜；离心后去除上清，保留沉淀；用PBS溶液洗涤沉淀后，将沉淀产物进行质谱分析，鉴定与抗石斑鱼IgM抗体结合的刺激隐核虫蛋白；

对质谱结果分析：发现在所有鉴定到的刺激隐核虫蛋白中，tubulin蛋白得分最高，说明嗜热四膜虫tubulin是引起石斑鱼血清与刺激隐核虫蛋白产生交叉反应的主要抗原，因此，嗜热四膜虫tubulin蛋白可作为潜在的交叉抗原制备疫苗。

二、重组蛋白的表达纯化

(一)、重组tubulin蛋白表达载体构建

(1)pMD18T-Tt-tubulin质粒的提取

为适应大肠杆菌表达系统，将嗜热四膜虫tubulin蛋白的基因序列进行密码子优化；合成密码子优化后的嗜热四膜虫tubulin基因序列，并将tubulin基因克隆至pMD18T载体中，获得pMD18T-Tt-tubulin质粒，再把pMD18T-Tt-tubulin质粒转化到大肠杆菌DH5α中；

按以下步骤提取pMD18T-Tt-tubulin质粒：

a、将带有pMD18T-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌DH5α接种到LB平板上进行复苏，挑取单菌落至5 mL含有20μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、180rpm振荡培养过夜；

b、10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留沉淀细菌；

c、向沉淀中加入250μL含有RNAase的Solution I进行重悬；

d、向重悬液中加入250μL Solution II，上下颠倒5次，室温静置2min；

e、再加入350μL Solution III，上下颠倒10次，13,000×g离心10min；

f、将回收柱装在2mL收集管上；

g、吸取步骤e中的离心上清至回收柱，10,000×g离心1min，弃滤液；

h、向回收柱中加入650μL无水乙醇稀释的Wash buffer，10,000×g离心1min，弃滤液；

i、重复h步骤1次；

j、13,000×g离心2min甩干回收柱；

k、丢弃收集管，将回收柱装在新的EP管上，再向回收柱中加入30μL水溶解2min，13,000×g离心1min，质粒即位于洗脱液中；

l、取少量洗脱液，测定其中质粒的浓度，其余样品备用。

(2)pET32a-ΔTRX质粒的提取

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取pET32a-ΔTRX质粒；

(3)酶切和连接转化

对提取的pMD18T-Tt-tubulin质粒和pET32a-ΔTRX质粒分别进行酶切，酶切体系为：2μLpMD18T-Tt-tubulin质粒或pET32a-ΔTRX质粒、10μL 10×QuickCut Buffer、2μL EcoR I、2μL Kpn I和84μL水；将酶切溶液混匀后，于37℃反应30min；酶切溶液进行电泳后，分别回收tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体；

使用T4连接酶将酶切后回收的tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体进行连接，连接体系为：3μL pET32a-ΔTRX、2μL tubulin和5μL T4连接酶；将连接体系混匀后，16℃连接过夜，再置于冰上冷却；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆菌，其中即含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒。

(二)、重组tubulin蛋白表达菌的筛选

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取阳性克隆菌的pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒，再转入大肠杆菌BL21中；挑取含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌BL21，接种于5mL含有20μg/mL氨苄青霉素LB培养液中，37℃、180rpm振荡培养；当菌液OD600达到0.6时，将菌液分成2份：一份作为诱导组，向其中加入IPTG至终浓度为1mM；另一份作为对照组，不加任何试剂；两份菌液继续培养2h后，10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留细菌沉淀；在沉淀中加入80μL水重悬细菌，再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min；将两份处理后的细菌样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后取下胶块，使用考马斯亮蓝染色液进行染色，再使用脱色液进行脱色。

(三)、重组tubulin蛋白的纯化

挑取上一步骤筛选的可以表达tubulin重组蛋白的细菌，接种到5mL LB培养液中过夜培养，再将5mL菌液转接到500mL LB培养液中，37℃振荡培养4h后，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养2h；8,000×g离心菌液10min，弃上清，保留细菌沉淀；向细菌沉淀中加入50mL含50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和10mM Imidazole的Lyse buffer重悬细菌，将重悬的菌液于冰上超声破碎，破碎条件为：250W、10s超声、10s间隔，共超声30min；8,000×g离心超声破碎的细菌10min，弃上清，保留沉淀；使用含100mM NaH₂PO₄和10mM Tris-HCl的2M、4M、6M尿素溶液依次洗涤沉淀，最后将沉淀溶解在8M尿素中；嗜热四膜虫tubulin重组蛋白组要溶解在8M尿素里，再使用镍柱从尿素溶液中纯化tubulin重组蛋白，步骤如下：

a、将镍填料装入亲和层析管中，再加入10倍填料体积的平衡溶液过柱；

b、关闭柱子底部的开关，加入含重组tubulin蛋白的8M尿素溶液，4℃过夜；

c、打开柱子底部的开关，收集流出液；

d、加入10倍填料体积的Wash buffer过柱，收集流出液；

e、重复d步骤一次；

f、加入5倍填料体积Elution buffer过柱，收集洗脱液，从而获得纯化的重组tubulin蛋白液；

取部分步骤f收集的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳。如图1第3泳道所示，经镍柱亲和纯化后，得到单一重组tubulin蛋白条带。

三、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护测试

(一)、免疫

将石斑鱼暂于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；将石斑鱼分为实验组和对照组；将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，通过皮肤下注射对实验组石斑鱼进行首次免疫；首次免疫两周后，将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，对首次免疫的石斑鱼进行加强免疫；对照组分别注射PBS与等体积弗氏完全佐剂、等体积弗氏不完全佐剂的乳化物。

(二)、刺激隐核虫攻毒

将对照组和免疫组的石斑鱼分别转移到装有10L海水的箱子中，每箱放置1尾鱼，静水暂养，往每个箱子中加入4,000刺激隐核虫幼虫感染石斑鱼2h，然后将石斑鱼捞出并转移到玻璃缸中流水暂养；刺激隐核虫感染2d后，将石斑鱼再次分装于各个箱子中，每箱1尾鱼，静水暂养，于2d后收集箱底的包囊；在解剖镜下计数从每尾石斑鱼脱落的包囊数量，收集的包囊数量与感染幼虫剂量的比值即为感染率；

结果表明：首次免疫六周后，相对于未免疫的对照组，重组tubulin蛋白免疫石斑鱼组的感染率显著降低。

四、抗刺激隐核虫疫苗的制备

将纯化后的重组tubulin蛋白液，再分别与等体积的弗氏完全佐剂和等体积的弗氏不完全佐剂混合，于冰上使用匀浆机进行乳化，制成首次免疫疫苗和加强免疫疫苗，于4℃保存。

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