CN107814833A

CN107814833A - 刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用

Info

Publication number: CN107814833A
Application number: CN201710942068.5A
Authority: CN
Inventors: 张子平; 王艺磊; 冯建军; 邹志华; 张鑫; 何亮华
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2037-10-11
Also published as: CN107814833B

Abstract

本发明涉及一种刺激隐核虫重组蛋白质疫苗，氨基酸序列为：NWVEKTAAADWKGTFVVTSSSCLASCGWKIGTTVVIADKASDATKVTWVGTAHTTDSTNVDVASGSCKYVSSVANAGTAGTAAEVLNNNDECVFATGMCTIMGQKQKSPAKVTFNRDTTLDTKPFQILYKQLAMVPKAQTTVQAAADQATDCDTKASLVDTTTDAKSIVGTLKLSKATCDKCSWDTTKDLKITQDATKKYMVTLAGTIKETTSGDCKNKLTASEACYVTKKDDKTFILVSCTTLDTTNKGIPIAITTANSKTTLTLTRTDSSSQACNVVGEIT。该发明克服了抑动抗原DNA序列难以在细菌中表达、市面上没有有效的预防海水鱼类刺激隐核虫感染的基因重组疫苗的缺点，具有可于大肠杆菌中表达、具有免疫原性、可预防海水鱼类的刺激隐核虫感染的优点。

Description

刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用，应用在海水鱼类疾病预防领域。

背景技术

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是造成多种海水鱼类(包括野生鱼类、观赏鱼类或养殖鱼类)感染海水白点病的病原生物。其被认为是造成最严重渔业经济损害的寄生虫之一，在全球各主要海水养殖区给养殖渔业带来巨大的经济损失。虽然可使用化学药品预防或治疗受刺激隐核虫感染的鱼类，但会造成严重的海洋污染，而且所生产的鱼类也会被污染，从而对食用者的健康造成危害。

刺激隐核虫的生命周期由四个阶段组成：滋养体(trophont)期、原分裂前体(protomont)期、分裂囊胞体(tomonts cyst)期及纤毛幼虫(theront)期，早期有关与刺激隐核虫分属动物分类学上不同门(phylum)的淡水小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)的研究显示体液免疫可藉由抑动(immobilize)纤毛幼虫达到预防感染的效果。

许多研究指出对于刺激隐核虫滋养体、原分裂前体及纤毛幼虫的免疫作用可在受感染鱼体中诱发更强的保护免疫力(protective immunity)，其中纤毛幼虫期可提供较强的保护免疫力。由于刺激隐核虫是绝对寄生虫，且截至目前为止，并无技术可以利用离体方式使刺激隐核虫完成整个生命周期，故而作为疫苗的纤毛幼虫仅能从受感染鱼体中得到，但要搜集到足够量的活体纤毛幼虫用于生产疫苗相当费时费力，成本高昂，难以在生产上应用。

抑动现象(immobilizationphenomenon)是在离体实验中，由经免疫过后的鱼体的血浆及黏膜抑制活体纤毛幼虫的运动，此现象可于鱼体内发生并提供鱼体保护，其是抗体结合寄生虫细胞及纤毛表面抗原造成该寄生虫无法移动。制动现象的目标抗原称为抑动抗原(immbolization antigens，iAg)，其特征在于锚定大量糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol，GPI)的表面膜蛋白。现有研究指出，从淡水小瓜虫中分离出的抑动抗原可于金鱼体内产生对抗淡水白点虫的免疫反应，并有效提供保护免疫力。然而因细菌无法使用该寄生虫的密码子，使该抑动抗原DNA序列在大肠杆菌中难以表达。

对动物而言，疫苗及其预防接种是控制动物病原疾病、保障养殖业持续发展的重要手段。鱼类疫苗目前已有一些细菌疫苗商品化，但病毒疫苗还很少，而寄生虫疫苗完全没有。因为鱼类疫苗存在免疫原力、生产成本和安全性等问题，大部分疫苗停留在实验室使用阶段，还未商品化生产。基因工程疫苗或重组蛋白疫苗是由已知蛋白质抗原(definedprotein antigen)或重组蛋白组成。基因重组疫苗具有表达量高、副效应小的优点，其不仅利于工业化生产，而且成本比传统疫苗更低廉。

因此提供一种可于大肠杆菌中表达、具有免疫原性、可预防海水鱼类的刺激隐核虫感染的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用己成为当务之亟。

发明内容

本发明共有三个发明目的：(一)为了克服现有抑动抗原DNA序列难以在细菌中表达、市面上没有有效的预防海水鱼类刺激隐核虫感染的基因重组疫苗的缺点，提供一种可于大肠杆菌中表达、具有免疫原性、可预防海水鱼类的刺激隐核虫感染的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗；(二)为了克服现有抑动抗原DNA序列难以在细菌中表达、市面上没有有效的预防海水鱼类刺激隐核虫感染的基因重组疫苗的缺点，提供一种可于大肠杆菌中表达、具有免疫原性、可预防海水鱼类的刺激隐核虫感染的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法；(三)为了克服现有抑动抗原DNA序列难以在细菌中表达、市面上没有有效的预防海水鱼类刺激隐核虫感染的基因重组疫苗的缺点，提供一种可于大肠杆菌中表达、具有免疫原性、可预防海水鱼类的刺激隐核虫感染的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的应用。

本发明的技术方案具体如下：

一种刺激隐核虫重组蛋白质疫苗，其氨基酸序列为：

NWVEKTAAADWKGTFVVTSSSCLASCGWKIGTTVVIADKASDATKVTWVGTAHTTDSTNVDVASGSCKYVSSVANAGTAGTAAEVLNNNDECVFATGMCTIMGQKQKSPAKVTFNRDTTLDTKPFQILYKQLAMVPKAQTTVQAAADQATDCDTKASLVDTTTDAKSIVGTLKLSKATCDKCSWDTTKDLKITQDATKKYMVTLAGTIKETTSGDCKNKLTASEACYVTKKDDKTFILVSCTTLDTTNKGIPIAITTANSKTTLTLTRTDSSSQACNVVGEIT。

编码该刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的cDNA的核苷酸序列为：

5’-CATATGCATCATCACCACCACCATAACTGGGTCGAAAAAACCGCAGCAGCAGATTGGAAAGGTACCTTTGTTGTTACCAGCAGCTCCTGTCTGGCAAGTTGCGGTTGGAAAATTGGCACCACCGTTGTTATTGCGGATAAAGCAAGCGACGCAACCAAAGTTACCTGGGTTGGTACCGCACATACCACCGATAGTACCAACGTTGACGTTGCAAGCGGTAGCTGTAAATACGTTAGCTCCGTTGCGAATGCAGGTACCGCAGGTACCGCAGCAGAAGTTCTGAACAACAACGACGAGTGCGTCTTTGCTACCGGTATGTGCACCATTATGGGCCAAAAACAGAAAAGCCCGGCGAAAGTCACCTTCAATCGCGATACCACCCTGGATACCAAACCGTTCCAGATCCTGTACAAACAGCTGGCGATGGTTCCGAAAGCACAAACCACCGTTCAAGCAGCAGCAGATCAAGCAACCGATTGCGATACCAAAGCAAGCCTGGTTGATACCACCACCGATGCAAAAAGCATCGTTGGCACCCTGAAACTGAGCAAAGCTACCTGCGATAAATGCAGCTGGGACACCACCAAAGACCTGAAAATCACCCAGGACGCGACCAAAAAATACATGGTCACCCTGGCAGGTACCATTAAAGAAACCACCTCTGGCGACTGCAAAAACAAACTGACCGCAAGCGAGGCTTGCTACGTCACCAAAAAAGACGACAAAACCTTCATTCTGGTTAGCTGTACCACCCTGGATACCACCAACAAAGGCATTCCGATTGCGATCACCACCGCAAATAGCAAAACCACCCTGACCCTGACCCGTACCGATAGTAGTTCACAAGCCTGTAACGTTGTTGGCGAAATTACCTAATGAAAGCTT-3’。

本申请提供一种刺激隐核虫重组蛋白质疫苗，编码其的cDNA通过优化、置换密码子能于大肠杆菌(E.coli)中表达，且该刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的免疫原性与刺激隐核虫纯化出的抑动蛋白相近，其能作为疫苗预防鱼类受刺激隐核虫的感染。

所述刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法，包括以下依序进行的步骤：

①取得刺激隐核虫的纤毛幼虫的mRNA；

②获得刺激隐核虫抑动蛋白cDNA：

对步骤①取得的刺激隐核虫的纤毛幼虫的mRNA进行逆转录、克隆、测序，从测序结果中找到刺激隐核虫抑动蛋白序列，并根据该刺激隐核虫抑动蛋白序列设计特异性引物，扩增获得刺激隐核虫抑动蛋白cDNA；

③密码子置换获得优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA：

对刺激隐核虫抑动蛋白cDNA进行测序及分析找出终止密码子TAA和TAG，将该终止密码子TAA和TAG置换为编码谷氨酰胺的密码子CAA和CAG，合成优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA，且该合成的优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA翻译出的重组刺激隐核虫抑动蛋白与从刺激隐核虫纯化出的刺激隐核虫抑动蛋白的免疫原性相近；

④构建重组质粒：将优化的刺激隐核虫抑动蛋白的cDNA插入到表达载体pET30a中，构建出重组质粒；

⑤重组刺激隐核虫抑动蛋白表达：将重组质粒转入大肠杆菌进行诱导表达，获得重组刺激隐核虫抑动蛋白，即刺激隐核虫重组蛋白质疫苗；

⑥诱导表达结果的分析鉴定：通过SDS-PAGE法确定步骤⑤获得的重组刺激隐核虫抑动蛋白为正确的表达产物。

于本申请中，该优化后的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA可顺利于大肠杆菌中表达该抑动抗原重组蛋白，并且其具有免疫原性(immunogenic)。而本申请经由免疫测试证实基于经由所述优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA编码的重组蛋白(即刺激隐核虫重组蛋白质疫苗)可做为疫苗，预防石斑鱼或其他海水鱼类遭刺激隐核虫感染。

所述刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法还包括依序设置在步骤⑥之后的步骤⑦重组刺激隐核虫抑动蛋白的放大培养和步骤⑧重组刺激隐核虫抑动蛋白的纯化。

通过上述方法可以实现刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的批量生产。

步骤④构建的具体步骤为：利用优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA作为模板，设计引物，在引物的两端分别加限制性酶切位点NdeI和Hind III，之后用该引物PCR扩增目的片段，扩增的目的片段通过限制性酶切位点NdeI和Hind III将优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA插入到表达载体pET30a中获得重组质粒pFNCJ。

将该重组质粒pFNCJ转化到Top10克隆菌株的感受态细胞中，然后均匀涂布到含50ug/mL的硫酸卡那霉素LB平板上，倒置于37℃培养箱过夜；从转化的平板中挑选单克隆，接种到含50ug/mL的硫酸卡那霉素的4mL LB培养基中，37℃摇床250rpm/m过夜；收集菌体，抽提质粒后测序验证质粒为重组质粒pFNCJ。

优选的重组质粒工艺参数可以达到最优的构建和转化效果。

步骤⑤重组刺激隐核虫抑动蛋白表达的具体步骤为：将构建好的重组质粒pFNCJ转化到BL21DE3的感受态细胞中，然后均匀涂布到含48-52ug/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，之后倒置于36-38℃培养箱过夜，从转化的平板中挑选单克隆，接种到含48-52ug/mL的硫酸卡那霉素的LB培养基中，36-38℃摇床580-620rpm/mim培养,待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.5mM，之后置于15-37℃诱导表达。

优选的诱导表达工艺参数可以确保重组刺激隐核虫抑动蛋白的表达效果。

步骤⑦重组刺激隐核虫抑动蛋白的放大培养的具体步骤为：培养转化入重组质粒pFNCJ的BL21DE3的感受态细胞，待其OD600＝0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，15℃诱导15-17h后收集菌体。

步骤⑧重组刺激隐核虫抑动蛋白的纯化的具体步骤为：包涵体采用pH8.0的50mMTris、含1％Triton X-100的150mM NaCl、5mM EDTA、2mM DTT洗涤后，以pH8.0的50mM Tris,150mM NaCl,8M Urea缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。

优化的刺激隐核虫抑动蛋白的放大培养和纯化工艺参数，能达到蛋白表达数量最大、表达效果最优的效果。

所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的应用为将所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗混入疫苗使用对象的饲料或食饵中、或混入水中浸泡疫苗使用对象、或注射疫苗使用对象，用于防止疫苗使用对象感染刺激隐核虫。

所述疫苗使用对象为水生生物，尤其是鱼类，例如黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)、异臂花鮨(Caprodon schlegelii)、红点九刺鮨(Cephalopholis aurantia)、青星九刺鮨(C.miniata)、细点牙鲷(Dentex dentex)、欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)、尖吻重牙鲷(Diploduspuntazzo)、单斑重牙鲷(D.sargus)、青石斑(Epinephelus awoara)、点带石斑(E.coioides)、鞍带石斑(E.lanceolatus)、三斑石斑(E.trimaculatus)、黑毛瓜子腊(Girella leonina)、臀斑髭鲷(Hapalogenys mucronatus)、棘箱鲀(Kentrocaprosaculeatus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、银纹笛鲷(Lutianus argentimaculatus)、赤鳍笛鲷(L.erythopterus)、白星笛鲷(L.stellatus)、角鳞鲀(Melichthys vidua)、真鲷(Pagrus major)、花软唇(Plectorhynchus cinctus)、茉莉花鳉(Poecilia latipinna)、魔鬼蓑鱼由(Pterois volitans)、黄锡鲷(Rhabdosargussarba)、金钱鱼(Scatophagus argus)、红甘鲹(Seriola dumerili)、银篮子鱼(Siganus oramin)、金头鲷(Sparus aurata)、布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)、海鲡(Rachycentron canadum)、青甘鲹(Seriola quinqueradiata)、克氏海葵鱼(Amphiprionclarkii)、白条海葵鱼(A.frenatus)、鞍斑海葵鱼(A.polymnus)或眼斑海葵鱼(A.ocellaris)等等。

所述刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的应用简便且可使用的疫苗使用对象广泛，具有良好的市场前景。

与现有技术相比，本发明申请具有以下优点：

1)本申请的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗通过密码子置换获得的优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA编码而成，其免疫原性与刺激隐核虫纯化出的抑动蛋白相近，其能作为疫苗预防鱼类受刺激隐核虫的感染；

2)所述刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法克服现有抑动抗原DNA序列难以在细菌中表达、市面上没有有效的预防海水鱼类刺激隐核虫感染的基因重组疫苗的缺点；

3)所述刺激隐核虫重组蛋白质疫苗应用多样，疫苗使用对象广泛，具有良好的市场前景。

附图说明

图1是SDS-PAGE法分析重组刺激隐核虫抑动蛋白于BL21(DE3)表达情况的电泳图；

图2是SDS-PAGE法分析包涵体中纯化结果的电泳图。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的描述。

实施例1

一、寄生虫体收集与培养

于宁德、莆田地区的鱼排收集受刺激隐核虫感染的鱼类后饲养于水温维持为25℃的水族箱中。从该水族箱底部收集囊胞体(tomont)后，使其产生纤毛幼虫并感染从福建海区养殖场购买的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)或珍珠龙胆(老虎斑E.fuscoguttatus X龙胆E.Lanceolatus)。

本申请所使用的寄生虫体培养的流程如下：利用毛笔或小型油漆刷从该水族箱底部轻轻地扫取并收集刺激隐核虫的囊胞体，并利用海水洗去多余的残渣或黏膜后，将该囊胞体利用过滤过的海水培养于培养皿上，并于室温培养3-7天。刺激隐核虫的纤毛幼虫(theront)会从囊胞体中产生，此时于4℃以1500g离心含有该纤毛幼虫的溶液10min后即可收集活体的纤毛幼虫，将该活体纤毛幼虫感染未被刺激隐核虫感染过的卵形鲳鲹或珍珠龙胆，随后可得约六百万只活体纤毛幼虫提供后续的人工感染试验。

二、刺激隐核虫抑动蛋白cDNA的获得

用Trizol试剂盒(Invitrogen公司产品)从收集到的活体纤毛幼虫分离mRNA进行逆转录、克隆，一部分送测序公司建库并测序，另一部分用以合成纤毛幼虫cDNA。从测序结果中找到了刺激隐核虫抑动蛋白序列。基于所述刺激隐核虫抑动蛋白序列设计特异性引物，以合成的纤毛幼虫cDNA为模板，扩增刺激隐核虫抑动蛋白cDNA。

三、密码子置换(Codon replacement)获得优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA

根据该刺激隐核虫抑动蛋白cDNA的序列，以软件DNASTAR进行分析找出终止密码子TAA和TAG，将该终止密码子TAA和TAG置换为编码谷氨酰胺的密码子CAA和CAG，即优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA，该优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA翻译出的刺激隐核虫抑动蛋白与从刺激隐核虫纯化出的刺激隐核虫抑动蛋白的免疫原性相近；委托商家合成所述优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA。

所述优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA的核苷酸序列为：

四、重组质粒的构建

构建了一个能在大肠杆菌表达重组刺激隐核虫抑动蛋白的重组质粒pFNCJ。所述重组质粒pFNCJ的构建方式为：利用优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA作为模板，设计引物，在引物的两端分别加限制性酶切位点NdeI和Hind III，之后用该引物PCR扩增目的片段，扩增的目的片段通过限制性酶切位点NdeI和Hind III将优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA插入到表达载体pET30a中，获得重组质粒pFNCJ。

五、利用大肠杆菌表达重组刺激隐核虫抑动蛋白

将构建好的重组质粒pFNCJ转化到BL21DE3的感受态细胞中，然后均匀涂布到含50ug/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，之后倒置于37℃培养箱过夜，从转化的平板中挑选单克隆，接种到含50ug/mL的硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床600rpm/mim培养,待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.5mM，之后置于15℃诱导表达。

所述刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的氨基酸序列为：

六、诱导表达结果的分析鉴定

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm,取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色,随后转入脱色液中,脱色至背景清晰。结果如图1所示，其中箭头标示的为正确的表达产物，每个泳道所上样品具体为：泳道M:SDS-PAGEProtein marker，泳道0:对照，泳道1:15℃诱导过夜，泳道2:37℃诱导4h。可见，表达产物正确。

七、重组刺激隐核虫抑动蛋白的放大培养

培养3L的转入重组质粒pFNCJ的BL21DE3的感受态细胞，待其OD600＝0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，15℃诱导15-17h后收集菌体。

八、重组刺激隐核虫抑动蛋白的纯化

收集菌体生成的包涵体，该包涵体(即重组刺激隐核虫抑动蛋白)采用含有50mMTris(pH8.0)、150mM NaCl(含1％Triton X-100)、5mM EDTA、2mM DTT的溶液洗涤后，以含有50mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl、8M Urea缓冲液的溶液溶解包涵体，同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果如图2所示，其中，每个泳道所上样品具体为：泳道M:SDS-PAGE Proteinmarker，泳道1:包涵体溶解离心后上清，泳道2:上清同Ni-IDA孵育后流出液，泳道3-13:不同浓度咪唑的洗脱的目标蛋白。可见，泳道4-6的蛋白纯度较高。

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集蛋白纯度较高的泳道4-6内的重组刺激隐核虫抑动蛋白，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，在缓冲液[1×PBS(pH 7.4)，1mMEDTA，4mM GSH，0.4mM GSSG]中复性,将复性后重组刺激隐核虫抑动蛋白于储存液1×PBS(含10％Glycerol,pH7.4)溶液中透析约6-8h。透析复性结束后，取上清用0.22um滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

九、以重组刺激隐核虫抑动蛋白(刺激隐核虫重组蛋白质疫苗)免疫石斑鱼的效果实验

将15ug浓度为0.15mg/ml的重组刺激隐核虫抑动蛋白与体积为100ul的弗氏完全佐剂混合，腹腔注射体重约为100g的珍珠龙胆，作为抑动蛋白免疫组；PBS对照组则注射等体积的生理盐水与弗氏完全佐剂。每组共注射两次，两次间隔7天，其中第二次注射时将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂。在第一次免疫注射后的第14天和28天分别取鱼血清，通过ELISA法测定其抗刺激隐核虫抑动蛋白的抗体滴度。

结果显示在第28天所取的鱼血清中，抗刺激隐核虫抑动蛋白抗体的滴度在免疫组显著地高于对照组。

十、人工感染实验

在15升小桶里以每升海水10⁵只的活纤毛幼虫感染2小时后连虫水一起转移至0.5吨大桶继续养殖观察死亡率。如2至3天后鱼体体表出现白点，则确认受到刺激隐核虫感染。本测试每日记录实验鱼体的死亡数目持续一周。

实验鱼体死亡率记录

利用下列公式计算专一性累积死亡率(cumulative mortality of the specificdeath，CMSD)：

CMSD(％)＝(死亡鱼体总数-非特定因素死亡数目/实验鱼体总数-非特定因素死亡数目)×100

统计

利用方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)及邓肯氏新多量程测试

(Duncan’s New Multiple Range Test，DMRT)分析CMSD，p值小于0.01及p值小于0.05可显示该结果具有统计显著性。利用统计软件SPSS 11.5绘制Kaplan-Meier存活曲线以表达经制动抗原刺激免疫反应的实验鱼体的累积死亡率。

人工感染实验结果

上表结果可见抑动蛋白免疫组的免疫保护率明显好于PBS对照组，刺激隐核虫重组蛋白质疫苗免疫效果明显。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：将构建好的重组质粒pFNCJ转化到BL21DE3的感受态细胞中，然后均匀涂布到含48ug/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，之后倒置于38℃培养箱过夜，从转化的平板中挑选单克隆，接种到含48ug/mL的硫酸卡那霉素的LB培养基中，38℃摇床580rpm/mim培养,待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.5mM，之后置于28℃诱导表达。

将所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗混入疫苗使用对象的饲料或食饵中，用于防止疫苗使用对象感染刺激隐核虫。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：将构建好的重组质粒pFNCJ转化到BL21DE3的感受态细胞中，然后均匀涂布到含52ug/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，之后倒置于36℃培养箱过夜，从转化的平板中挑选单克隆，接种到含52ug/mL的硫酸卡那霉素的LB培养基中，36℃摇床620rpm/mim培养,待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.5mM，之后置于37℃诱导表达。

将所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗混入水中浸泡疫苗使用对象，用于防止疫苗使用对象感染刺激隐核虫。

根据本发明提出的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用可选因素较多，可以设计出多种实施例，因此具体的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。为了具体的描述本发明，有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，选择以下实施例进行示例性说明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建农林大学

<120> 刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和用法

<130> 2017

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 283

<212> PRT

<213> 刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)

<400> 1

Asn Trp Val Glu Lys Thr Ala Ala Ala Asp Trp Lys Gly Thr Phe Val

1 5 10 15

Val Thr Ser Ser Ser Cys Leu Ala Ser Cys Gly Trp Lys Ile Gly Thr

20 25 30

Thr Val Val Ile Ala Asp Lys Ala Ser Asp Ala Thr Lys Val Thr Trp

35 40 45

Val Gly Thr Ala His Thr Thr Asp Ser Thr Asn Val Asp Val Ala Ser

50 55 60

Gly Ser Cys Lys Tyr Val Ser Ser Val Ala Asn Ala Gly Thr Ala Gly

65 70 75 80

Thr Ala Ala Glu Val Leu Asn Asn Asn Asp Glu Cys Val Phe Ala Thr

85 90 95

Gly Met Cys Thr Ile Met Gly Gln Lys Gln Lys Ser Pro Ala Lys Val

100 105 110

Thr Phe Asn Arg Asp Thr Thr Leu Asp Thr Lys Pro Phe Gln Ile Leu

115 120 125

Tyr Lys Gln Leu Ala Met Val Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Gln Ala

130 135 140

Ala Ala Asp Gln Ala Thr Asp Cys Asp Thr Lys Ala Ser Leu Val Asp

145 150 155 160

Thr Thr Thr Asp Ala Lys Ser Ile Val Gly Thr Leu Lys Leu Ser Lys

165 170 175

Ala Thr Cys Asp Lys Cys Ser Trp Asp Thr Thr Lys Asp Leu Lys Ile

180 185 190

Thr Gln Asp Ala Thr Lys Lys Tyr Met Val Thr Leu Ala Gly Thr Ile

195 200 205

Lys Glu Thr Thr Ser Gly Asp Cys Lys Asn Lys Leu Thr Ala Ser Glu

210 215 220

Ala Cys Tyr Val Thr Lys Lys Asp Asp Lys Thr Phe Ile Leu Val Ser

225 230 235 240

Cys Thr Thr Leu Asp Thr Thr Asn Lys Gly Ile Pro Ile Ala Ile Thr

245 250 255

Thr Ala Asn Ser Lys Thr Thr Leu Thr Leu Thr Arg Thr Asp Ser Ser

260 265 270

Ser Gln Ala Cys Asn Val Val Gly Glu Ile Thr

275 280

<210> 2

<211> 885

<212> DNA

<213> 刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)

<400> 2

catatgcatc atcaccacca ccataactgg gtcgaaaaaa ccgcagcagc agattggaaa 60

ggtacctttg ttgttaccag cagctcctgt ctggcaagtt gcggttggaa aattggcacc 120

accgttgtta ttgcggataa agcaagcgac gcaaccaaag ttacctgggt tggtaccgca 180

cataccaccg atagtaccaa cgttgacgtt gcaagcggta gctgtaaata cgttagctcc 240

gttgcgaatg caggtaccgc aggtaccgca gcagaagttc tgaacaacaa cgacgagtgc 300

gtctttgcta ccggtatgtg caccattatg ggccaaaaac agaaaagccc ggcgaaagtc 360

accttcaatc gcgataccac cctggatacc aaaccgttcc agatcctgta caaacagctg 420

gcgatggttc cgaaagcaca aaccaccgtt caagcagcag cagatcaagc aaccgattgc 480

gataccaaag caagcctggt tgataccacc accgatgcaa aaagcatcgt tggcaccctg 540

aaactgagca aagctacctg cgataaatgc agctgggaca ccaccaaaga cctgaaaatc 600

acccaggacg cgaccaaaaa atacatggtc accctggcag gtaccattaa agaaaccacc 660

tctggcgact gcaaaaacaa actgaccgca agcgaggctt gctacgtcac caaaaaagac 720

gacaaaacct tcattctggt tagctgtacc accctggata ccaccaacaa aggcattccg 780

attgcgatca ccaccgcaaa tagcaaaacc accctgaccc tgacccgtac cgatagtagt 840

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Claims

1.一种刺激隐核虫重组蛋白质疫苗，其特征在于：其氨基酸序列为：

2.根据权利要求1所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗，其特征在于：编码该刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的cDNA的核苷酸序列为：

3.根据权利要求1所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下依序进行的步骤：

①取得刺激隐核虫的纤毛幼虫的mRNA；

②获得刺激隐核虫抑动蛋白cDNA：

对步骤①取得的刺激隐核虫的纤毛幼虫的mRNA进行逆转录、克隆和测序，从测序结果中找到刺激隐核虫抑动蛋白序列，并根据该刺激隐核虫抑动蛋白序列设计特异性引物，扩增获得刺激隐核虫抑动蛋白cDNA；

③密码子置换获得优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA：

4.根据权利要求3所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于：还包括依序设置在步骤⑥之后的步骤⑦重组刺激隐核虫抑动蛋白的放大培养和步骤⑧重组刺激隐核虫抑动蛋白的纯化。

5.根据权利要求3所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于：步骤④构建重组质粒的具体步骤为：利用优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA作为模板，设计引物，在引物的两端分别加限制性酶切位点NdeI和Hind III，之后用该引物PCR扩增目的片段，扩增的目的片段通过限制性酶切位点NdeI和Hind III将优化的刺激隐核虫抑动蛋白cDNA插入到表达载体pET30a中获得重组质粒pFNCJ。

6.根据权利要求3所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于：步骤⑤重组刺激隐核虫抑动蛋白表达的具体步骤为：将构建好的重组质粒pFNCJ转化到BL21DE3的感受态细胞中，然后均匀涂布到含48-52ug/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，之后倒置于36-38℃培养箱过夜，从转化的平板中挑选单克隆，接种到含48-52ug/mL的硫酸卡那霉素的LB培养基中，36-38℃摇床580-620rpm/mim培养,待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.5mM，之后置于15-37℃诱导表达。

7.根据权利要求4所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于：步骤⑦重组刺激隐核虫抑动蛋白的放大培养的具体步骤为：培养转化入重组质粒pFNCJ的BL21DE3的感受态细胞，待其OD600＝0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，15℃诱导15-17h后收集菌体。

8.根据权利要求1-2任一项所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗的应用，其特征在于：将所述的刺激隐核虫重组蛋白质疫苗混入疫苗使用对象的饲料或食饵中、或混入水中浸泡疫苗使用对象、或注射疫苗使用对象，用于防止疫苗使用对象感染刺激隐核虫。