CN114350591A - 一种在压力条件下培养细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在压力条件下培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，加压培养所述细胞。本发明所述方法先预先形成承载细胞的凝胶，凝胶的形成不受海绵环的影响，可形成高质量的凝胶，凝胶内细胞所受的压力相同，细胞生长也不受海绵环影响。
Description
技术领域
本发明涉及机械力传导、力学生物效应培养领域，具体而言，涉及一种在压力条件下培养细胞的方法。
背景技术
目前针对力学生物效应对细胞影响的研究广泛开展，借助压力培养系统(例如Flexcell压力培养系统)模拟人体机械微环境改变，探索机械压力的力学生物效应、细胞感受机械压力的机制成为研究热点。目前常见的压力培养方式是借助Flexcell细胞力学加载系统，将配置好含细胞的配胶液体直接加载到压力培养板的海绵环中，依靠液体的表面张力在海绵环中形成凝胶，再行加压培养。
发明人发现，现有方法存在形成凝胶效果差，配胶液体容易从海绵环内渗漏，可重复性差，凝胶承载的细胞量少，凝胶大小不一，无法保证压力培养时每块胶所受压力相同等缺陷。为解决上述缺陷，特提出本发明。
发明内容
本发明提供一种在压力条件下培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，加压培养所述细胞。
现有技术在Flexcell压力培养板的海绵环中直接添加配胶液体，借助液体表面张力防止液体外漏。配胶液体非常容易外漏，并且会渗透至海绵间隙中，pH值会发生变化，影响成胶和细胞生长。海绵环高度限制了添加的液体量，无法保证一次培养大量细胞，液体外漏无法保证每块凝胶体积一致，实验体系不稳定，重复性差，无法同时制备多个凝胶。海绵环内凝胶接收的压力不同，影响后续探索同一压力对细胞功能的影响，所得结果重复性欠佳。而本发明所述方法明显优于现有技术，所述方法先预先形成承载细胞的凝胶，凝胶的形成不受海绵环的影响，配胶液体不会外漏和渗透至海绵环，可形成体积相同的高质量凝胶，并且，相同体积的凝胶保证了细胞所受的压力相同，实验体系可重复性强。
在一些具体的实施方式中，预先形成多块形状相同的所述凝胶，分别转移至所述压力培养板的不同海绵环中。现有的成胶方法容易导致从不同海绵环中外漏不同体积的液体，不能保证不同海绵环形成相同体积的凝胶，不能确保每块凝胶接受相同的压力，同时，凝胶中所述含细胞的数量也容易受影响，从而导致研究的不准确。而本发明所述方法可以预先形成多块形状相同的凝胶，转移至海绵环后，凝胶的体积和所承载的细胞不会发生变化，可以确保每块凝胶接受的压力和承载的细胞不会出现大偏差，不影响研究的正确性。
在一些具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤：预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞在所述细胞培养板中经适应性培养后，连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，加压培养所述细胞。
在一些具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤，预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，添加培养基至所述压力培养板外槽，加压培养所述细胞。
在一些具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤：以细胞培养板，优选24孔板为容器，在其中预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞在所述细胞培养板中经适应性培养后，连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，添加培养基至所述压力培养板外槽，加压培养所述细胞。
本发明所述方法在加压培养前，先经过适应性培养，使细胞适应凝胶环境，可以避免凝胶对细胞的生长造成影响。由于本发明所述方法形成的凝胶质量好，pH值稳定，在外槽加入培养基不影响凝胶的稳定性。所述细胞在所述细胞培养板中经适应性培养后，连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，添加培养基至所述压力培养板外槽，此时添加的培养基不会改变胶块的结构和稳定性，然后加压培养所述细胞。
本发明所述方法在细胞培养板，特别是24孔板中形成凝胶，所述凝胶具有规则的圆柱形和一定的厚度，可以包含足够数量的细胞，用于后续实验，而且凝胶形成后可直接放置在细胞培养箱中进行培养，方便快捷。同时，借助24孔板可以一次性快速制备多个体积相同的所述凝胶，分别转移至所述压力培养板的不同海绵环中，操作简便，节约时间。透明的24孔板方便观察凝胶状态，并且可以随时通过光学显微镜观察细胞状态，可以避免凝胶对细胞的生长造成影响。
在一些具体的实施方式中，所述预先形成承载细胞的凝胶的步骤包括：在容器中依次加入缓冲液、NaOH溶液、胶原溶液和含细胞的培养基，混匀后静置，在所述容器中形成凝胶。
在一些具体的实施方式中，所述缓冲液为PBS缓冲液，优选为10×PBS缓冲液，体积优选为40～50μL，更优选为42μL。
在一些具体的实施方式中，所述NaOH溶液为0.1M NaOH，体积优选为15～20μL，更优选为18μL。
在一些具体的实施方式中，所述胶原为I型胶原，优选为鼠尾I型胶原，浓度优选为4.5～5.5mg/mL，更优选为5mg/mL，体积优选为250～350μL，更优选为300μL。
在一些具体的实施方式中，所述培养基为含10％FBS的F12/DMEM培养基，体积优选为0.8～1.2mL，更优选为1mL。
在一些具体的实施方式中，所述凝胶的pH为7～7.5，优选为7.3。
在一些具体的实施方式中，所述预先形成承载细胞的凝胶的步骤包括：在容器中依次加入缓冲液、NaOH溶液、鼠尾1型胶原溶液和含细胞的F12/DMEM培养基，混匀后静置，在所述容器中形成凝胶。
在一些具体的实施方式中，所述预先形成承载细胞的凝胶的步骤包括：在容器中依次加入42μL 10×PBS缓冲液，18μL 0.1M NaOH溶液，300μL 5mg/mL鼠尾1型胶原溶液和1mL含细胞的F12/DMEM+10％FBS的培养基，混匀后在细胞培养箱中静置10分钟，在所述容器中形成pH7.3的凝胶。
本发明经过多次压力培养实验论证后确定本发明体系的稳定性。鼠尾1型胶原3D培养凝胶浸泡在F12/DMEM培养基内仍可以保持稳定的结构，最长研究时间4天，细胞活性仍很好。
在一些具体的实施方式中，所述凝胶的体积为0.5～2mL，优选为1.5mL。
在一些具体的实施方式中，所述凝胶的厚度0.5～1.5cm，优选为1cm。
在一些具体的实施方式中，所述凝胶的体积为0.5～2mL，优选为1.5mL；所述凝胶的厚度0.5～1.5cm，优选为1cm。
本发明所述方法形成的凝胶能够确保胶内含有足够数量的细胞用于实验，而现有技术以海绵环成胶，海绵环的厚度只有3mm，向环内添加液体，最多只能保证3mm厚度的凝胶形成，导致大部分液体流失。
在一些具体的实施方式中，所述细胞的适应性培养时间为6-8小时。
在一些具体的实施方式中，利用移液器，使用剪去前端部分的枪头吸附转移所述凝胶至压力培养板的海绵环中，优选使用1mL枪头，优选转移后，在所述压力培养板外槽添加3mL培养基。
在一些具体的实施方式中，加压培养的时间为24h～96h，例如，36h，48h，72h或96h。
在一些具体的实施方式中，所述加压培养板为Flexcell加压培养板。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括在加压培养结束后，酶解所述凝胶和回收所述细胞的步骤。
在一些具体的实施方式中，酶解所述凝胶和回收所述细胞的步骤包括：转移所述凝胶至新容器中，加入胶原酶溶液至所述凝胶，摇床震荡消化，消化完后所得液体，经离心，获得细胞沉淀。由于凝胶结构稳定，本发明所述方法能够容易地将凝胶转移至新的容器中，获得足量的细胞用于后续实验。
在一些具体的实施方式中，酶解所述凝胶和回收所述细胞的步骤包括：加入1mL浓度为1mg/mL的1型胶原酶溶液至所述凝胶，37℃摇床震荡消化20分钟，消化完后所得液体，经0.1g离心力离心，获得细胞沉淀。本发明所述方法摸索出适合消化鼠尾1型胶原凝胶的消化方式、消化时间和胶原酶浓度，对细胞损伤较小。
附图说明
图1为实施例1的3D水凝胶配置模式图；
图2为添加培养基前后的水凝胶形态，其中图2A为加入培养基前的水凝胶形态，图2B为加入培养基后的水凝胶形态；
图3为用枪头将成型水凝胶转移至Flexcell压力培养板的过程；
图4为转移至Flexcell压力培养板后的水凝胶；
图5为装载凝胶的Flexcell生物力学加载系统；
图6为.30mmHg压力培养24小时后水凝胶的状态。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1.制备鼠尾I型胶原3D培养凝胶和加压培养
1)取24孔板，每孔作为1个培养单位，按照以下顺序添加：①42μl10*PBS；②18μulNaOH(0.1mol/L)；③300μl鼠尾1型胶原(杭州欣友生物科技公司，5mg/ml)；④1ml细胞悬液，该细胞悬液用含10％FBS的F12 DMEM重悬人真皮微血管内皮细胞(与海绵环细胞不同)。加样完毕后，可以吹打5次，迅速混匀。37℃，5％CO2培养箱静置10min即可成胶。
所得凝胶pH在7.3左右，呈半透明淡橙色，在光学显微镜下观察到细胞成舒展状态。所述凝胶借助24孔板每孔形状，预先铸型，可以保证每个胶块形成后高度一致。为验证凝胶的稳定性，预实验中在成型凝胶中添加培养基，培养基不影响已经成胶后的胶体的稳定性(图2B)。
2)细胞在凝胶内适应性生长6-8小时后转移至Flexcell压力培养板中。无菌刀片剪掉1ml枪头前1cm部分，利用1ml枪压力即可吸附凝胶并转移(参见图3和图4)。
3)凝胶转移至Flexcell压力培养板后，可以在外槽内加入3ml无血清培养基，随后进行压力培养(参见图5)，培养24小时后，水凝胶仍稳定。最长研究时间4天，凝胶结构仍然稳定，细胞活性仍很好。
2.消化鼠尾I型胶原3D培养凝胶，回收细胞
1)I型胶原酶(sigma)，加F12 DMEM配制成1mg/ml浓度；2)0.22μm滤膜过滤除菌；3)将凝胶从海绵环中转移至24孔板，每1块凝胶添加1ml I型胶原酶(1mg/mL)，37℃摇床震荡20min即使凝胶完全消化；4)0.1g离心3分钟即可得到细胞沉淀。
最后说明：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种在压力条件下培养细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，加压培养所述细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预先形成多块形状相同的所述凝胶，分别转移至所述压力培养板的不同海绵环中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以细胞培养板为容器，在其中预先形成承载细胞的凝胶，所述细胞在所述细胞培养板中经适应性培养后，连同所述凝胶转移至压力培养板的海绵环中，添加培养基至所述压力培养板外槽，加压培养所述细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预先形成承载细胞的凝胶的步骤包括：在容器中依次加入缓冲液、NaOH溶液、鼠尾I型胶原溶液和含细胞的F12/DMEM培养基，混匀后静置，在所述容器中形成凝胶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶的体积为0.5～2mL；所述凝胶的厚度0.5～1.5cm。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞的适应性培养时间为6-8小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用移液器，使用剪去前端部分的枪头吸附转移所述凝胶至压力培养板的海绵环中，转移后，在所述压力培养板外槽添加3mL培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在加压培养结束后，酶解所述凝胶和回收所述细胞的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，酶解所述凝胶和回收所述细胞的步骤包括：转移所述凝胶至新容器中，加入胶原酶溶液至所述凝胶，摇床震荡消化，消化完后所得液体，经离心，获得细胞沉淀。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，酶解所述凝胶和回收所述细胞的步骤包括：加入1mL浓度为1mg/mL的I型胶原酶溶液至所述凝胶，37℃摇床震荡消化20分钟，消化完后所得液体，经0.1g离心力离心，获得细胞沉淀。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220415 |