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CN106434522A - 一种自体软骨细胞的三维培养方法 - Google Patents

一种自体软骨细胞的三维培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种自体软骨细胞的三维培养方法，所述三维培养方法能有效的促进软骨细胞的增殖。本发明提供的一种自体软骨细胞的三维培养方法，取自体软骨细胞和脐带间充质干细胞混合，接种到三维胶原支架上进行培养。本发明提供的技术方案中，采用了具有生物修复功能的三维胶原支架代替三维水凝胶支架，降低了成本，还采用脐带间充质干细胞与软骨细胞按照一定比例进行共培养。经实验测定可得，通过本发明的技术方案建立的三维培养方法能够促进自体软骨细胞的增殖。

Description

一种自体软骨细胞的三维培养方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种自体软骨细胞的三维培养方法。
背景技术
关节软骨是一种负重结缔组织，是关节运动过程中不可或缺的一部分，虽然仅几毫米厚，却具有非常高的抗压硬度和弹性，并且能在关节运动过程中分散压力。关节软骨没有神经支配，也没有血管，其营养成分必须从关节液中取得。由于缺乏血液供应，细胞代谢缓慢，关节软骨一旦损伤后便难以自行修复，因而在临床上由于外伤或者疾病造成的关节软骨缺损或变性坏死很常见。
近几年来，组织工程和分子生物学的发展开辟了修复软骨关节的新途径，临床上关节软骨修复的方式有软骨或软骨细胞移植、骨膜移植、自体软骨细胞移植等。自体软骨细胞移植(ACI)是当前反映较好的一种方式，将自体软骨细胞在三维支架环境中培养，等到形成新的软骨组织后再移植到缺损处修复软骨。
脐带间充质干细胞(umbilical cord Mesnchymal Stem Cells，UC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。目前有文献报道，可将UC-MSCs移植到关节软骨缺损处，治疗关节软骨损伤。
然而，不管是软骨细胞移植还是间充质干细胞移植，为获得大量的细胞来源，需要在三维支架上分离培养软骨细胞，而三维支架均采用各种来源的水凝胶作为支架材料，其价格昂贵，且支架本身对自体软骨细胞的增殖无明显作用。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种自体软骨细胞的三维培养方法，以促进软骨细胞的增殖，具体技术方案如下：
一种自体软骨细胞的三维培养方法，取自体软骨细胞和脐带间充质干细胞混合，接种到无菌三维胶原支架上进行培养。
优选的，所述自体软骨细胞和所述脐带间充质干细胞的细胞个数比为4:1。
优选的，所述自体软骨细胞的三维培养方法中所述自体软骨细胞接种数为2×107个，脐带间充质干细胞接种数为0.5×107个。
优选的，所述自体软骨细胞的三维培养方法中所述培养的时间为30-40天。
本发明所述自体软骨细胞的三维培养方法中所述自体软骨细胞优选为原代自体软骨细胞。
在一些实施方案中，所述原代自体软骨细胞的制备方法具体包括以下步骤：1)取约3～4cm3的软骨组织置于无菌木板上，用无菌手术刀将其切碎至1mm3大小；
2)将上述软骨组织碎片转移到50mL离心管中，用含10％胎牛血清的无Ca2+、Mg2+磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)洗涤两遍；
3)加入软骨组织碎片2～5倍体积的Ⅱ型胶原酶溶液，在37℃摇床上消化4～5小时，转速为100～150rpm；
4)加入含10％的胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
5)采用200目筛网进行过滤；
6)滤液离心，离心后试管底部的沉淀即为软骨细胞；
7)将软骨细胞用含10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，按照1×105～2×105/mL的密度接种在T25培养瓶中，在37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养36h。
优选的，所述脐带间充质干细胞为第三代至第五代脐带间充质干细胞。如第三代脐带间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述第三代脐带间充质干细胞的制备方法具体包括以下步骤：1)取出保存的第二代hUC-MSC，去掉旧的培养基，加入PBS溶液进行洗涤；
2)加入0.25％的胰蛋白酶消化1～2min；
3)加入10％的胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
4)离心后得到第二代hUC-MSCs沉淀；
5)用含10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，按照1×105～2×105/mL的密度接种在T25培养瓶中，在37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养36h。
进一步的，本发明所述自体软骨细胞的三维培养方法中所述无菌三维胶原支架优选平铺于培养容器的底部。
其中，所述培养容器优选为培养皿，更优选为35mm培养皿。
本发明所述无菌三维胶原支架的形态可以为球形、圆柱型、长方块和正方块。
优选的，所述无菌三维胶原支架的形态为正方块。
更优选的，所述正方块大小为1mm3。
优选的，所述无菌三维胶原支架的数量为3块。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)采用胶原支架代替水凝胶或琼脂糖支架，成本低廉且具有生物修复作用，促进自体软骨细胞增殖；
(2)采用脐带间充质干细胞(hUC-MSC)与软骨干细胞按一定比例进行共培养，hUC-MSC能分泌一些生长因子，如转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)等，这些生长因子可促进软骨细胞的增殖；
(3)自体软骨细胞可分泌细胞外基质，这些基质可促进hUC-MSC向软骨细胞分化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为光学显微镜(50×)下的原代自体软骨细胞的形态图；
图2为光学显微镜(50×)下的第三代脐带间充质干细胞的形态图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊说明，本发明所涉及的实验材料及试剂均可以通过商业渠道购买获得。如ELISA试剂盒购自上海双赢生物科技有限公司。35mm的培养皿(购自康宁公司。
实施例1
1、原代自体软骨细胞的制备
1)在超净台内，取约3～4cm3的软骨组织(来源于华侨医院骨科)置于无菌木板上，用无菌手术刀将其切碎至1mm3大小；
2)将上述软骨组织碎片转移到50mL离心管(CORNING公司)中，用含10％胎牛血清的无Ca2+、Mg2+磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)洗涤两遍；
3)加入软骨组织碎片2～5倍体积的Ⅱ型胶原酶溶液，在37℃摇床上消化4～5小时，转速为100～150rpm；
4)加入含10％的胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
5)采用200目筛网进行过滤；
6)滤液离心，离心后试管底部的沉淀即为软骨细胞；
7)将软骨细胞用含10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，按照1×105～2×105/mL的密度接种在T25培养瓶(CORNING公司)中，在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行培养；培养36h后，在光学显微镜下观察原代自体软骨细胞。结果如图1。
图1显示在光学显微镜(50×)下的原代自体软骨细胞的形态呈铺路石状。
2、脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的制备
1)取出保存的第二代hUC-MSC，去掉旧的培养基，加入PBS溶液进行洗涤；
2)加入0.25％的胰蛋白酶消化1～2min；
3)加入10％的胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
4)离心后得到第二代hUC-MSCs沉淀；
5)用含10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，按照1×105～2×105/mL的密度接种在T25培养瓶(CORNING公司)中，在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行培养；培养36h后，在光学显微镜下观察脐带间充质干细胞的形态，结果如图2所示。
图2结果显示在光学显微镜(50×)下的第三代脐带间充质干细胞的形态呈旋涡状。
3、无菌胶原支架材料的制备
在无菌条件下，将约10cm×10cm×3cm(长×宽×高)的无菌胶原材料(购自华南理工大学)用无菌手术剪剪至1cm×1cm×0.2cm(长×宽×高)的大小。
4、三维共培养体系的建立
1)取三块上述制备的无菌胶原支架材料平铺在35mm的培养皿的底部；
2)将上述制备的原代自体软骨细胞和hUC-MSC按4：1的细胞个数比混合，接种到胶原支架上进行培养，其中自体软骨细胞接种数为2×107个，脐带间充质干细胞接种数为0.5×107个。
对比例1自体软骨细胞在三维水凝胶支架上进行单独培养的方法
1、原代自体软骨细胞的分离培养
同实施例1中原代自体软骨细胞的制备。
2、海藻酸钠水凝胶支架的三维培养
1)购买海藻酸钠水凝胶支架；
2)将1×107～3×107个原代自体软骨细胞放到海藻酸钠水凝胶上培养30～50天。
实施例2检测软骨细胞外基质的Ⅱ型胶原的含量
1、分别收集实施例1和对比例1中在三维支架上培养30天后细胞培养液，采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中软骨细胞外基质Ⅱ型胶原的含量，具体检测步骤按照Ⅱ型胶原含量检测试剂盒说明书进行：
1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原；
2)加稀释的细胞培养液，在37℃条件下反应30min，细胞培养液中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗-体复合物；
3)加酶标抗抗体；
4)加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比，30min后，在562nm波长处用酶标仪检测吸光度值。
2、记录并分析实验数据，得到实验结果如下：
Ⅱ型胶原标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其线性曲线为：Y＝0.132X+1.8。实施例1中细胞培养液所测Ⅱ型胶原的OD450值为2.56，对比例1中细胞培养液所测Ⅱ型胶原的OD450值为1.98。根据线性曲线计算得到，实施例1中细胞培养液的Ⅱ型胶原的含量为5.76μg/mL，对比例1中细胞培养液的Ⅱ型胶原的含量为1.36μg/mL。表明实施例1中建立的三维共培养方法能够促进Ⅱ型胶原的产生，说明本发明建立的三维共培养方法能够促进软骨细胞的增殖。
实施例3检测软骨细胞外基质的糖胺聚糖的含量
步骤一、分别收集实施例1和对比例1中在三维支架上培养30天后细胞培养液，采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中软骨细胞外基质糖胺聚糖的含量，具体检测步骤按照糖胺聚糖含量检测试剂盒说明书进行：
1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原；
2)加稀释的细胞培养液，在37℃条件下反应30min，条件培养基中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗-体复合物；
3)加酶标抗抗体；
4)加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比，30min后，在562nm波长处用酶标仪检测吸光度值。
步骤二、记录并分析实验数据，得到实验结果如下：
糖胺聚糖标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其线性曲线为：Y＝0.21X+0.8。实施例1中细胞培养液所测糖胺聚糖的OD450值为1.64，对比例1中细胞培养液所测糖胺聚糖的OD450值为1.32。根据线性曲线计算得到，实施例1中细胞培养液的糖胺聚糖的含量为4μg/mL，对比例1中细胞培养液的糖胺聚糖的含量为2.48μg/mL。表明实施例1中建立的三维共培养方法能够促进糖胺聚糖的产生，说明本发明建立的三维共培养方法能够促进软骨细胞的增殖。
综合以上实验结果，发现同等条件下，在胶原支架上进行共培养后的软骨细胞外基质中的Ⅱ型胶原和糖胺聚糖的含量均比对比例1中采用水凝胶支架单独培养后的高，说明采用三维胶原支架代替三维水凝胶支架，并结合软骨细胞和hUC-MSC进行共培养，能够有效的促进软骨细胞的增殖。

Claims (10)

1.一种自体软骨细胞的三维培养方法，其特征在于，取自体软骨细胞和脐带间充质干细胞混合，接种到无菌三维胶原支架上进行培养。
2.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述自体软骨细胞和所述脐带间充质干细胞的细胞个数比为4:1。
3.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述自体软骨细胞接种数为2×107个，脐带间充质干细胞接种数为0.5×107个。
4.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述培养的时间为30-40天。
5.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述自体软骨细胞为原代自体软骨细胞。
6.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为第三代至第五代脐带间充质干细胞。
7.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述无菌三维胶原支架平铺于培养容器的底部。
8.根据权利要求7所述的三维培养方法，其特征在于，所述培养容器为35mm的培养皿。
9.根据权利要求1所述的三维培养方法，其特征在于，所述无菌三维胶原支架的形态为正方块。
10.根据权利要求9所述的三维培养方法，其特征在于，所述无菌三维胶原支架正方块大小为1mm3。
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