CN114350584B - 高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用。本发明通过对野生型PSA菌株进行改良，无需转入外源SA合成途径基因，对底盘扰动少；通过转入neuABC基因，从而增加了CMP‑SA的积累，同时敲除了neuS、neuE基因，减少杂合多糖的干扰，继而提高唾液酸乳糖产量。本发明提供的高产唾液酸乳糖的重组大肠杆菌工程菌具有很好的应用前景，为生物法合成唾液乳糖提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
母乳被誉为营养的“黄金标准”，它可以促进婴幼儿的生长发育并满足健康所需。人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是一种非结合的复合多糖，是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分，包含多种由2～10个单糖分子组成的低聚糖，具有重要的生物学活性，人初乳中HMO含量为22-23g/L，成熟乳中为12-13g/L。人乳寡糖被认为是母乳中的双歧因子，能够起到调节肠道菌群环境，促进有益菌群的生长，调节免疫系统，同时对促进大脑发育也有重要的作用，在婴幼儿配方食品领域具有广阔的应用前景。
对于人乳寡糖的制备，主流手段为构建工程菌并发酵生产，以唾液酸乳糖为例，已公开的大部分方法中，主流路线均为从唾液酸合成进行构建，并通过各种优化代谢路径的手段提高唾液酸乳糖的产量，但是由于需要敲除或增加的基因过多，对原有底盘(出发菌株)的扰动较大，而对于底盘过多的扰动会增加底盘抗性，给后期发酵工艺的调控造成困难，同时还存在产量无法稳定的影响。
另外，由于生物学有着令人难以置信的不可预测性，目前无法确保有机体能够按初始设计的要求和预测结果进行输出。所以，如何构建能够大规模生产人乳低聚糖的菌株仍是当前需要攻克的难点，而其中构建一个良好的工程化底盘对于简化后续的构建步骤、提高构建效率、优化后期发酵工艺具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种高产唾液酸乳糖的工程菌，所述工程菌的构建方法包括以下步骤：
(1)通过弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；或者，
通过弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；
(2)增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC以及α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst，获得基因增强菌株；或者，
增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst以及β-半乳糖苷透性酶基因LacY，获得基因增强菌株；
其中，所述原始菌株(底盘菌株)为产聚唾液酸(PSA)的大肠杆菌；
前述的方法，步骤(1)中所述弱化包括敲除或降低基因的表达；
步骤(2)中所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
5)通过导入增强子而增强；
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
本发明中，所述原始菌株为经过诱变或随机突变后的菌株或基因工程菌。
优选地，所述原始菌株为大肠杆菌Escherichia coli SA-EC21-SA12Ⅰ。SA-EC21-SA12Ⅰ是通过人工诱变和筛选获得的高产聚唾液酸的大肠杆菌作为出发菌株，将其作为底盘菌株用于构建高产唾液酸乳糖的工程菌。菌株SA-EC21-SA12Ⅰ现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M20211274，保藏日期2021年10月14日。
本发明中，聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE、β-半乳糖苷酶基因LacZ、乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst、β-半乳糖苷透性酶基因LacY在NCBI上的参考序列编号分别如下：
NeuS：Sequence ID:CP054214.1，3959153-3960382bp。
neuE：Sequence ID:CP054353.1，4303539-4304687bp。
LacZ：Sequence ID:CP054353.1，1153979-1157047bp。
NeuB：Sequence ID:AF400048.1，6901-7941bp。
neuC：Sequence ID:AF400048.1，7998-9056bp。
neuA:Sequence ID:CP054214.1，3962685-3963941bp。
3ST：Sequence ID:U60662.2。
6ST:Sequence ID:AB293985.1。
LacY：Sequence ID:CP037857.2，358642-359895bp。
第二方面，本发明提供一种高产唾液酸乳糖的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)利用基因工程手段弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；或者，
利用基因工程手段弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；
(2)增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC以及α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst，获得基因增强菌株；或者，
增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst以及β-半乳糖苷透性酶基因LacY，获得基因增强菌株；
其中，所述原始菌株(底盘菌株)为产聚唾液酸的大肠杆菌；
前述的方法，步骤(1)中所述弱化包括敲除或降低基因的表达；
步骤(2)中所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
5)通过导入增强子而增强；
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
前述的方法，步骤(2)中用于构建基因增强菌株所用启动子可以是tac、lacUV5、trp中任一种，并不做出特殊限定。所用质粒可以是pCDFDuet，其他适合的表达载体同样可以应用于本发明。
前述的方法，步骤(1)中所述弱化的方法选自诱变、定点突变、同源重组等中的至少一种。
第三方面，本发明提供所述的工程菌或按照上述方法构建的工程菌在发酵生产唾液酸乳糖或提高唾液酸乳糖发酵产量中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明通过对野生型PSA菌株进行改良(包括诱变、基因工程改造)，无需转入外源SA合成途径基因，对底盘扰动少；
(二)通过转入neuABC基因，增强neuABC的拷贝，从而增加了CMP-SA的积累，同时敲除了neuS、neuE基因，减少杂合多糖的干扰，继而提高唾液酸乳糖产量；
(三)利用该菌株可同时可控生产3’SL和6’SL等多种唾液酸乳糖。
(四)采用甘油碳源，有助于细胞应对发酵压力环境，避免工艺控制中葡萄糖抑制发生概率，增加工艺调控容错率。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中ΔneuS-SA-EC21-SA12Ⅰ菌落形态，图中显示与未敲除菌相比，菌落形态发生改变，菌体表征已发生变化。
图2为本发明较佳实施例中大肠杆菌基因工程菌SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst菌体生长曲线。
具体实施方式
本发明旨在筛选并构建一种适用于生产人乳低聚糖(如唾液酸乳糖)的工程化底盘，其对于原有底盘的扰动尽可能的减少，并且有利于后续生产人乳低聚糖的工程菌的构建。
为了实现减少底盘扰动，并保证唾液酸乳糖的产量，本发明从底盘细胞入手，筛选出一株高产聚唾液酸的野生型大肠杆菌。以高产聚唾液酸野生型大肠杆为底盘细胞，敲除聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE以及β-半乳糖苷酶基因lacZ，并构建产唾液酸乳糖的工程菌株。
本发明采用如下技术方案：
1、高产PSA野生菌种筛选方法
(1)(1)以大肠埃希氏菌保藏编号CCTCC NO：M 2018103(参见CN108588152B)作为出发菌株，以活化培养基上生长的菌落为目标，用离子注入机注入剂量10×1014N+/cm2的离子束，注入结束后吸取2mL生理盐水洗脱。
(2)初筛
挑取变色光圈大且菌落也大的菌株作为初筛菌株并接种至复筛培养基保存。
(3)高通量筛选
将初筛得到的菌株接种于含种子培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，每株菌做3个平行，37℃、250r/min培养12h。种子液按4％转接到含发酵培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，37℃、150r/min培养48h。将产生的PSA(聚唾液酸)水解成SA(唾液酸)，通过测定SA含量确定PSA产量。
将产PSA最高的菌株大肠杆菌SA-EC21-SA12Ⅰ作为底盘菌株，保藏编号CCTCC NO：M20211274。
2、工程化大肠杆菌底盘菌株
敲除产PSA大肠杆菌的聚唾液酸转移酶基因neuS和β-半乳糖苷酶基因LacZ，或者敲除产PSA大肠杆菌的聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE，以及β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得ΔneuSΔ LacZ双缺陷型底盘菌株或Δ neuSΔneuEΔ LacZ缺陷型底盘菌株。
3、唾液酸乳糖高产菌株的构建
(1)双表达载体pCDFDuet-1-neuBCA-nst的构建
构建以更换启动子为tac的pCDFDuet质粒承载外源基因乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)，CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuA)，N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因(neuC)以及α-2,3/α-2,6唾液酸转移酶基因(nst)的重组双表达载体。
可选择地，将外源基因β-半乳糖苷透性酶基因(LacY)连接于以上载体。
(2)筛选阳性菌株
用上述重组表达载体转化底盘菌，在链霉素抗性平板上筛选出具有抗性的改造菌株，通过PCR、酶切以及发酵验证，筛选出SL(唾液酸乳糖)高产菌株。
4、发酵培养
分别在摇瓶、50L发酵罐检测SL的表达水平。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1高产PSA大肠杆菌的获得方法
一、诱变
1、悬浮液制备
(1)从-80℃冰箱中取出甘油管保藏的出发菌种，待融化后，用接种环蘸取一环划线于LB平板，37℃培养16h。
(2)挑取单菌落接种至LB培养基，37℃、250rpm培养6h。
(3)对步骤(2)培养液进行镜检(要求未染菌)，然后按1％接种量接种到50mL LB培养基/250mL三角瓶中，37℃、250rpm培养5～6h。
(4)准备4支10mL的无菌离心管，各加入上述步骤(3)的培养液5mL，6000rpm离心10min，弃去上清液。
(5)每管各加入5mL的无菌水，涡旋振荡混悬，4000rpm离心10min，弃去上清液。
(6)每管各加入5mL的无菌水，涡旋振荡混悬，制成菌悬液，备用。
二、诱变筛选
(1)将菌悬液涂布于无菌平皿，在超净台中以无菌空气风干备用。
(2)在中科院离子束生物工程学重点实验室氮离子注入装置上进行。N+离子源注入注入能量15keV，注入剂量10×1014ion/cm2，以5s脉冲式注入，间隔20s，合计注入15s，靶室真空度约10-3Pa。将涂布平皿放于注入机靶台上进行离子束注入。
(3)诱变结束后以2mL无菌水洗脱，梯度稀释后，涂布于含有初筛培养基的平板上，37℃培养24h。
(4)挑选变色圈大的单菌落经二级种子活化，5％接种于复筛发酵培养基保存。
(5)将初筛得到的菌株接种于含种子培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，每株菌做3个平行，37℃、250r/min培养12h。种子液按4％转接到含发酵培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，37℃、150r/min培养48h。将产生的PSA(聚唾液酸)水解成SA(唾液酸)，通过测定SA含量确定PSA产量。得到产PSA最高的菌株，大肠杆菌SA-EC21-SA12Ⅰ，保藏编号CCTCCNO：M 20211274。
实施例2产唾液酸乳糖工程菌的构建
1、聚唾液酸转移酶基因敲除菌株的构建
采用λred同源重组方法进行基因敲除。将pKD46质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)转入大肠杆菌SA-EC21-SA12Ⅰ菌株中，在L-阿拉伯糖的诱导下使其表达Exo、Beta、Gam三个重组蛋白，获得具有同源重组能力的菌株SA-EC21-SA12Ⅰ(pKD46)；以pKD3质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)为模板设计5‘端大约50bp的neuS基因同源臂，3‘端为两侧带有FRT位点的氯霉素基因，将此线性片段转入SA-EC21-SA12Ⅰ(pKD46)感受态细胞中，通过菌落形态、PCR验证筛选阳性转化子，用高温消除温敏质粒pKD46，再转入pCP20质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)，消除氯霉素抗性基因，同样通过温敏特性消除pCP20质粒，从而敲除大肠杆菌SA-EC21-SA12Ⅰ的聚唾液酸转移酶基因(neuS)。
Δ neuS-SA-EC21-SA12Ⅰ菌落形态见图1，图中显示与未敲除菌相比，菌落形态发生改变，菌体表征已发生变化。
具体步骤为：
①将pKD46质粒导入大肠杆菌SA-EC21-SA12Ⅰ，在20μg/mL浓度氨苄青霉素的SOB固体培养基平板上生长的菌落用PCR验证阳性转化子，即SA-EC21-SA12Ⅰ(pKD46)；
②将同源重组线性片段电转化至SA-EC21-SA12Ⅰ(pKD46)细胞中，菌落PCR鉴定阳性转化子；
③消除pKD46质粒，将前一步中阳性转化子接含50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中在37℃过夜培养，次日在LB固体平板上划出单菌落，分别挑取单菌落于含氯霉素或氨苄青霉素的LB固体平板上，在氯霉素平板生长在氨苄青霉素平板不生长的即为已消除pKD46的菌；
④消除氯霉素抗性基因，将前一步中细胞制备成感受态，转入pCP20质粒，涂平板30℃过夜培养，菌落PCR鉴定阳性转化子，消除pCP20质粒(方法同消除pKD46质粒)。最终获得Δ neuS-SA-EC21-SA12Ⅰ菌株。
2、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)和多唾液酸合成蛋白基因(neuE)的敲除
LacZ与neuE基因以同样方法敲除，最终分别获得Δ neuSΔ LacZ-SA-EC21-SA12Ⅰ底盘菌株、ΔneuSΔ LacZΔ neuE-SA-EC21-SA12Ⅰ两种底盘菌株。
lacZ敲除的表征：
得到的两种底盘菌株进行培养验证。大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化，敲除LacZ基因后将不能分解X-gal，即生长出来的为白色菌落。将两种菌株在含X-gal 100μg/mL、IPTG 50μg/mL的LB固体平板上均匀涂布，生长出来的菌落为白色即为敲除LacZ基因菌落。经过相同条件下培养验证，ΔneuSΔLacZ-SA-EC21-SA12Ⅰ，胞外发酵液中SA含量4.0g/L；ΔneuSΔ LacZΔ neuE-SA-EC21-SA12Ⅰ，胞外发酵液中唾液酸的含量为5.5g/L。
说明ΔneuSΔ LacZΔ neuE-SA-EC21-SA12Ⅰ底盘菌株没有单唾液酸溢出的途径，对于进一步构建SL菌株具有更优越的性质。
3、nanKETA基因簇的敲除
nanA：Sequence ID:CP037857.2，3365704-3366597bp。
nanE：Sequence ID:CP037857.2，3363368-3364057bp。
nanT：Sequence ID:CP037857.2，3364105-3365595bp。
nanK：Sequence ID:CP037857.2，3362496-3363371bp。
与以上敲除手段相同，最终获得ΔneuSΔLacZΔneuEΔnanKETA-SA-EC21-SA12Ⅰ底盘菌株，进行相同的培养验证，ΔneuSΔ LacZΔ nanKETA-SA-EC21-SA12Ⅰ底盘菌株发酵液中，唾液酸的含量为5.7g/L。唾液酸的含量相比ΔneuSΔ LacZΔ neuE-SA-EC21-SA12Ⅰ并无较大差异，却相比之下需要更多基因的敲除，对于底盘的扰动较大，后续增加质粒之后，可能会导致发酵工艺的调控难度。
最终确认ΔneuSΔ LacZΔ neuE-SA-EC21-SA12Ⅰ为最合适的底盘菌株。
所用引物见表1。
表1
实施例3重组表达载体的构建
1、获取唾液酸合成酶基因(neuBCA)及唾液酸转移酶基因(nst)
用设计的引物F7/R7，以菌株SA-EC21-SA12Ⅰ为模板进行PCR获neuBCA基因；经过密码子优化后合成3’st及6’st基因。
2、构建pCDFDuet-neuBCA-nst/pCDFDuet-neuBCA-nst表达载体
将pCDFDuet质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)通过引物F8/R8进行PCR扩增成线性片段，并将T7启动子为更换为tac启动子(tac启动子来自质粒pGEX-4T-1)。将neuBCA基因片段与合成基因nst(3’st)使用Gibson方法与载体pCDFDuet进行连接，目的基因片段与载体以摩尔比3:1比例混合，在50℃下连接15min，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于链霉素抗性平板，通过PCR验证阳性转化子，获得重组双表达载体pCDFDuet-neuBCA-nst。
并采用相同的方法构建重组载体pCDFDuet-neuBCA-nst-lacY。
需要说明的是，合成基因nst(3’st)可以更换成nst(6’st)以构建生产6’-SL的菌株。
所用引物见表2。
表2
实施例4产唾液酸乳糖菌株SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔ LacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst(3’-SL)的构建
1、将实施例2制备的底盘细胞SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔneuEΔLacZ制备成感受态细胞，转入双表达载体pCDFDuet-neuBCA-nst或pCDFDuet-neuBCA-nst-lacY重组质粒，在链霉素抗性平板(LB)上筛选出具有抗性的阳性转化子，通过PCR、酶切验证，得到含有完整唾液酸乳糖产生途径基因的菌株SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst。
并采用相同的方法构建SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst-lacY。
需要说明的是，当使用合成基因nst6’st时能够得到产6’-SL的工程菌。
实施例5工程菌的发酵验证
1、种子活化培养：取本发明所述大肠杆菌基因工程菌SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst接种到含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基中培养活化，培养温度37℃，摇床振摇转速为250r/min，培养时间24h，所述活化培养基为：酵母提取物23.8g/L，胰蛋白胨11.8g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，pH自然。
2、发酵培养：将上述步骤1培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到1L发酵罐中进行培养(装液量为1/4体积)，培养温度37℃，在OD达到0.6-1.0时加入50μg/mL的IPTG诱导，继续培养12h，转速为250r/min，所用发酵培养基为：链霉素50mg/L，酵母提取物23.8g/L，胰蛋白胨11.8g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，乳糖10g/L，pH6.8。
发酵完成后检测含量，得到11.3g/L的3’-唾液酸乳糖。大肠杆菌基因工程菌SA-EC21-SA12ⅠΔ neuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst菌体生长曲线见图2。
采用上述方法对工程菌SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst-lacY进行发酵，3’-唾液酸乳糖产量为12.3g/L。
采用上述方法转入nst(6’st)后得到生产6’-SL的菌株SA-EC21-SA12ⅠΔneuSΔLacZΔneuE/pCDFDuet-neuBCA-nst(6’st)，采用相同的方法发酵后，6’-唾液酸乳糖产量为12.5g/L。
对比例1：
1、种子活化培养：取本发明所述未改造的SA-EC21-SA12Ⅰ菌株接种到活化培养基中培养，培养温度37℃，摇床振摇转速为250r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：酵母提取物23.8g/L，胰蛋白胨11.8g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，pH自然。
2、发酵培养：将上述步骤1培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到1L发酵瓶(装液量1/4体积)中进行培养，培养温度37℃，在OD达到0.6-1.0时加入50μg/mL的IPTG诱导，继续培养48h，转速为250r/min，所用发酵培养基为：链霉素50mg/L，酵母提取物23.8g/L，胰蛋白胨11.8g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，乳糖10g/L，pH6.8。
发酵结束检测唾液酸乳糖含量为0.4g/L。
对比例2：
由出发菌株(大肠杆菌CCTCC No.M 2018103)作为底盘，构建重组菌Δ neuSΔLacZΔ neuE/pCDFDuet-neuBCA-nst，具体构建方法参见前述实施例。经过相同条件发酵得到唾液酸乳糖含量为5.5g/L。
实施例6ΔneuSΔ LacZΔ neuE/pCDFDuet-neuBCA-nst-lacY的生物反应器发酵稳定性考察
发酵培养：将实施例5中步骤1培养的活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到50L发酵罐(装液量30L)中进行培养，培养温度37℃，在OD达到0.6-1.0时加入100mg/L的IPTG诱导，继续培养48h，转速为250r/min，所用发酵培养基为：链霉素50mg/L，酵母提取物23.8g/L，胰蛋白胨11.8g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾9.4g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，乳糖20g/L，pH6.8，溶氧量30％，甘油耗完后发酵过程中以4.0g/L·h速度补充甘油持续70h。分别进行5次发酵，结果见表3。
表3
由表3可知，方差为1.923，可达到稳定结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.高产唾液酸乳糖的工程菌，其特征在于，所述工程菌的构建方法包括以下步骤：
(1)通过弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；
(2)增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC以及α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst，获得基因增强菌株；或者，
增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst以及β-半乳糖苷透性酶基因LacY，获得基因增强菌株；
所述原始菌株为产聚唾液酸的大肠杆菌，所述原始菌株为大肠杆菌EscherichiacoliSA-EC21-SA12Ⅰ，保藏编号为CCTCC NO：M 20211274。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，
步骤(1)中所述弱化包括敲除或降低基因的表达；
步骤(2)中所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
5)通过导入增强子而增强；
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
3.权利要求1或2所述的高产唾液酸乳糖的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用基因工程手段弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；或者，
利用基因工程手段弱化原始菌株中聚唾液酸转移酶基因neuS、多唾液酸合成蛋白基因neuE和β-半乳糖苷酶基因LacZ，获得的基因弱化菌株；
(2)增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC以及α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst，获得基因增强菌株；或者，
增强上述基因弱化菌株中乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、α-2,3唾液酸转移酶基因nst或α-2,6唾液酸转移酶基因nst以及β-半乳糖苷透性酶基因LacY，获得基因增强菌株；
所述原始菌株为产聚唾液酸的大肠杆菌；
其中，步骤(1)中所述弱化包括敲除或降低基因的表达；
步骤(2)中所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
5)通过导入增强子而增强；
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述原始菌株为环境中分离产聚唾液酸并经过诱变或随机突变后定向筛选的菌株或基因工程菌。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中用于构建基因增强菌株所用启动子为tac、lacUV5或trp。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述弱化的方法选自诱变、定点突变、同源重组中的至少一种。
7.权利要求1或2所述的工程菌或按照权利要求3-6任一项所述方法构建的工程菌在发酵生产唾液酸乳糖或提高唾液酸乳糖发酵产量中的应用。
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