CN115895987B - 一种提高果糖软骨素产量的重组菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高果糖软骨素产量的重组菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌基因组上强化合成UDP‑乙酰氨基半乳糖胺路径的关键酶氨基转移酶glmS和磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的编码基因，在解决质粒不稳定等问题的同时，提高了果糖软骨素的产量，使摇瓶发酵条件下的果糖软骨素的产量从90mg/L提高至245mg/L，在7.5L发酵罐发酵的产量达到7.12g/L，为后续的工业化奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高果糖软骨素产量的重组菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
硫酸软骨素(sulfated chondroitin,CS)是一类硫酸化的糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)，由葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)通过β1→3或者β1→4糖苷键交替连接而成。CS存在于动物软骨组织中，具有良好的生物活性和药用价值，广泛用于医药行业，食品保健品行业和护肤化妆品行业。
当前硫酸软骨素的主要生产方法是通过动物组织进行提取，例如鱼、猪、牛、羊等动物软骨。然而这种方法原料来源匮乏且提取工艺复杂，因此动物提取法的生产成本制约了其工业化的生产。其次，化学合成法的工艺条件要求苛刻且污染严重，因此不利于绿色生产。然而，利用微生物合成的方法由于原料低廉，生产条件简便，生产周期短等优势，受到了国内外研究人员的青睐。
大肠杆菌K4菌株可以天然合成一种荚膜多糖，果糖软骨素。这是一种硫酸软骨素的类似物，通过脱除果糖基团可成为硫酸软骨素的前体软骨素，接着通过添加硫酸盐供体PAPS,在磺基转移酶的作用下可转化为硫酸软骨素。通过强化软骨素聚合酶kfoC的表达及进行突变，强化转录因子slyA的表达，平衡前体产物的代谢流等手段，目前果糖软骨素的产量达到8.4g/L。然而由于携带质粒会影响菌体的生长，质粒复制的不稳定性会造成产量的不稳定，添加抗生物会提高成本且抗生物难以去除等问题，因此构建一株不携带质粒，整合关键基因至基因组的重组菌株成为一种很有竞争力的方法。
发明内容
为了解决携带质粒所带来的生产不稳定与使用抗生素的问题，本发明提供了一株无质粒的产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法，在解决质粒不稳定等问题的同时提高了果糖软骨素的产量。
本发明提供了一种具有果糖软骨素合成能力的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌在基因组上强化了氨基转移酶glmS和磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的表达；所述氨基转移酶glmS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述氨基转移酶glmS基因整合在ldhA位点，所述磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的编码基因整合在poxB和/或pta位点，
在一种实施方式中，编码所述氨基转移酶glmS的基因具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中，编码所述磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的出发菌株包括但不限于大肠杆菌K4。
本发明还提供了所述重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括：
(1)构建含目的位点上游片段-glmS基因-目的位点下游片段的glmS基因表达框，构建含目的位点上游片段-glmM基因-目的位点下游片段的glmM基因表达框；
(2)将glmS基因表达框、glmM基因表达框整合至目的位点处；
所述glmS基因对应的目的位点为ldhA位点；所述glmM基因对应的目的位点为poxB和/或pta位点。
本发明还提供所述重组大肠杆菌在生产果糖软骨素中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述重组大肠杆菌在培养基中发酵，收集发酵液中的果糖软骨素。
在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：甘油、KH2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4、柠檬酸、维生素B1、金属离子液；所述金属离子液含有(NH4)Mo7O24、MnSO4、CuSO4、FeSO4、Na2B4O7、CaCl2、ZnSO4。
在一种实施方式中，所述应用是将所述重组大肠杆菌培养至OD≥5，添加终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG进行诱导。
在一种实施方式中，所述发酵过程中还补料甘油。
本发明还提供所述重组大肠杆菌或其发酵方法在生产含果糖软骨素的产品中的应用。
有益效果：本发明采用整合至基因组的方式强化表达磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶，实现了基因的高效表达，构建的重组菌株在大肠杆菌K4中过表达，可以有效提高果糖软骨素的产量，使摇瓶发酵条件下的果糖软骨素的产量从90mg/L提高至245mg/L。本发明还通过优化发酵条件，以DO-stat补料策略在7.5L发酵罐进行高密度发酵，使果糖软骨素的产量达到7.12g/L。
附图说明
图1为改造菌株在摇瓶中的果糖软骨素产量。
图2所示为最优改造菌株在7.5L发酵罐上发酵过程中果糖软骨素的产量。
图3为不同菌株在摇瓶中的果糖软骨素产量。
图4为不同菌株在摇瓶发酵过程中发酵液的OD值。
图5为不同菌株在摇瓶中的果糖软骨素产量。
具体实施方式
实施例1：重组质粒pEtac-glmM/pEtac-glmS的构建
本发明所用的磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因和氨基转移酶glmS基因来源于大肠杆菌K4(ATCC23502)。将大肠杆菌K4接种于30mL LB液体培养基中，在37℃，200rpm下培养8h，进行离心收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌菌株的基因组DNA。
根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物对KZ-glmM-S/KZ-glmM-A，以提取的大肠杆菌K4基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得在5’端和3’端分别添加酶切位点EcoRI和XhoI的片段glmM。
KZ-glmM-S：GAATTCATGAGTAATCGTAAATATTT；
KZ-glmM-A：CTCGAGTTAAACGGCTTTTACTGCAT；
采用琼脂糖凝胶核酸电泳切胶回收PCR扩增产物，并连接至pMD19T载体，体系10μL：5μL solution I连接液，4μL目的片段，1μL载体，16℃过夜连接，转化至JM109感受态，挑取单菌落进行PCR验证，挑取阳性转化子进行测序，序列比对正确证明片段构建成功。质粒命名为pT19-glmM。
使用EcoRI和XhoI双酶切载体pT19-glmM获得测序无误的片段glmM，并同时使用EcoRI和XhoI双酶切载体pEtac。使用T4连接酶进行过夜连接并筛选正确的转化子，命名为pEtac-glmM。
依据上述相同的策略构建连接有glmS基因的转化子，验证正确的命名为pEtac-glmS。
实施例2：将glmM、glmS基因片段编辑整合至基因组
(1)构建pTargetF-N20-poxB质粒
利用引物FP-S-poxB/FP-A-poxB扩增获得线性载体pTargetF片段，利用同源重组进行构建重组质粒。经过验证，获得重组质粒pTargetF-N20-poxB。
N20-poxB序列5’→3’：GATATCAACCCAGCCAGCAT；
FP-S-poxB：GATATCAACCCAGCCAGCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；
FP-A-poxB：ATGCTGGCTGGGTTGATATCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC；
(2)构建含poxB上下游同源臂的glmM整合框
利用引物KZ-poxB-1-S/KZ-poxB-1-A，KZ-poxB-2-S/KZ-poxB-2-A，KZ-glmM-1-S/KZ-glmM-1-A分别扩增poxB上、下游500bp片段及tac-glmM片段，并在扩增获得的片段上下游分别添加酶切位点HindIII和XhoI，通过融合PCR将三个片段进行融合获得UP500-glmM-down500，并连接于pMD19T载体，测序获得正确的转化子并进行抽提质粒，酶切获得待整合的片段poxB-UP500-glmM-down500。
KZ-poxB-1-S：AAGCTTGCGGCCCGGCTCCGTATATG；
KZ-poxB-1-A：CCGTGCAGTCGATAAGCTCCGGTTCTCCATCTCCTGAATG；
KZ-glmM-1-S：CATTCAGGAGATGGAGAACCGGAGCTTATCGACTGCACGG；
KZ-glmM-1-A：GACGGGAAATGCCACCCTTTTTAAACGGCTTTTACTGCAT；
KZ-poxB-2-S：ATGCAGTAAAAGCCGTTTAAAAAGGGTGGCATTTCCCGTC；
KZ-poxB-2-A：CTCGAGAATTCCCATGCTTCTTTCAG。
(3)片段整合
利用化转法将温敏型质粒pCas9转入大肠杆菌K4中。将上述含有质粒的菌株接于含Kan抗性的LB液体培养基中，30℃、200rpm培养12h。将培养好的菌体转接入无菌的含有Kan抗性的LB新鲜培养基中，于30℃、200rpm的摇床中培养至OD600测定值0.2时，加入终浓度为30mmol/L的阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达，继续培养。当菌体培养至OD600测定值0.6时，将含菌液的三角瓶置冰盒上30min，同时将配好的10％甘油预冷。将冷却好的菌液用枪吸至若干个冷的1.5mL EP管中，4℃、4000rpm离心5min，倒掉EP管中的培养基。向每个1.5mL EP管中加入适当预冷的甘油，反复吹吸在管底部的菌体，使其均匀悬浮在溶液中，在冰盒上放置15min，4℃、4000rpm离心5min弃掉上清，重复两次。将上述构建的pTargeF-N20-poxB质粒和片段poxB-UP500-glmM-down500加入到制备好的感受态细胞中，反复慢慢吹吸使其充分接触，于冰盒上放置3min。将感受态细胞加入到冷的2mm电转杯当中电击。快速向电转杯中加入适当无菌的LB培养基，反复吹吸在杯底部的菌体，使菌体充分悬浮于培养基中，然后用枪将杯中的菌液吸入新的1.5mL EP管中，30℃复苏1.5h。将孵育好的菌株7000rpm离心5min收集，弃掉一部分管中的培养基，反复吹打菌体使菌体悬于剩余的液体中，并涂布在含有Kan及Spe双抗性的LB平皿中，30℃恒温箱中培养至菌体长出。对平板中长出的菌落进行PCR验证，筛选出阳性转化子。将验证正确的菌株培养于含有Kan抗性的无菌LB中，30℃、200rpm条件下培养至OD600测定值0.4时,加入IPTG消除pTargetF-N20-poxB质粒，终浓度为0.5mmol/L，继续培养过夜。将培养好的菌液接于含有Kan的LB平皿中，于30℃、200rpm培养12h，若双抗液体培养基中未有菌生长，而含Kan抗性的液体培养基中菌体生长，则说明质粒消除成功。将验证pTargetF-N20-poxB消除成功的阳性转化子接种于LB培养基中，恒温42℃培养12h，挑取菌株分别培养于含Kan抗性及未含抗性的无菌LB培养基中进行培养，若含Kan抗性的LB培养基中未有菌长出，且LB培养基中有菌体生长，则表明pCas9质粒消除成功，将构建好的菌种保存，并且命名为GZ01。
以菌株GZ01为基础，按照上述相同策略将ldhA位点替换为glmS基因片段，获得的菌株命名为GZ02。
N20-ldhA(5’→3’):GATATCAACCCAGCCAGCAT；
KZ-ldhA-1-S(5’→3’):CAAGCTTCAAGCAGAATCAAGTTCTA；
KZ-ldhA-1-A(5’→3’):CCGTGCAGTCGATAAGCTCCAAGACTTTCTCCAGTGATGT；
KZ-glmS-1-S(5’→3’):ACATCACTGGAGAAAGTCTTGGAGCTTATCGACTGCACGG；
KZ-glmS-1-A(5’→3’):AATGCAGGGGAGCGGCAAGATTACTCAACCGTAACCGATT；
KZ-ldhA-2-S(5’→3’):AATCGGTTACGGTTGAGTAATCTTGCCGCTCCCCTGCATT；
KZ-ldhA-2-A(5’→3’):CTCGAGTGTCTGTTTTGCGGTCGCC。
以菌株GZ02为基础，上述相同的操作策略将pta位点替换为glmM基因片段，并命名为GZ03。
N20-pta(5’→3’):GCTTGCCTGGCAGCCATGAA；
KZ-pta-1-S(5’→3’):AAGCTTGGCATGAGCGTTGACGCAAT；
KZ-pta-1-A(5’→3’):CCGTGCAGTCGATAAGCTCCGGTTTATCCTCTTTCGTTAC；
KZ-glmM-1-S(5’→3’):GTAACGAAAGAGGATAAACCGGAGCTTATCGACTGCACGG；
KZ-glmM-1-A(5’→3’):AGCTGCGGATGATGACGAGATTAAACGGCTTTTACTGCAT；
KZ-pta-2-S(5’→3’):ATGCAGTAAAAGCCGTTTAATCTCGTCATCATCCGCAGCT；
KZ-pta-2-A(5’→3’):CTCGAGGATCCTGAGGTTAATCCTTC。
实施例3：重组菌株GZ01,GZ02,GZ03摇瓶发酵
接取重组菌株GZ01，GZ02，GZ03进行摇瓶发酵测试果糖软骨素的生产能力。
发酵培养基：甘油20g·L-1，KH2PO4 13.5g·L-1，(NH4)2HPO4 4g·L-1，MgSO 4·7H2O1.4g·L-1，柠檬酸1.7g·L-1，维生素B1 4.5mg·L-1，微量金属离子液10mL·L-1；
微量金属离子液：(NH4)Mo7O24 0.10g·L-1，MnSO4·4H2O 0.50g·L-1，CuSO4·5H2O1.00g·L-1，FeSO4·7H20 10.00g·L-1，Na2B4O7·10H2 O 0.20g·L-1，CaCl2 2.00g·L-1，ZnSO4·7H2O 2.30g·L-1。
从甘油管接种200μL菌液于50mL(250mL摇瓶)的LB培养基中，于37℃、转速200rpm条件下摇瓶活化12h，作为摇瓶发酵的种子液。摇瓶发酵的接种量为1％，发酵的条件为：转速200rpm，温度37℃，初始pH值控制在7.0-7.5。摇瓶培养5h时添加1mmol/L的IPTG进行诱导表达，其中诱导温度为37℃。每4h进行取样测定果糖软骨素的产量。
摇瓶培养后的发酵液10000rpm离心收集上清液。将上清液置于65℃加热2h变性沉淀蛋白，离心去除沉淀收集上清液。加入3倍体积无水乙醇混匀，置于4℃过夜沉淀，收集白色沉淀并进行烘干。接着加入适量的水复溶，利用硫酸咔唑法测量果糖软骨素的产量。
结果如图1所示，摇瓶发酵37h，原始菌株K4，重组菌株GZ01、GZ02、GZ03的果糖软骨素产量分别为90、189、220、245mg/L，重组菌株相较于原始菌株均有所提高，其中重组菌株GZ03的较原始菌株提高了172％。
实施例4：重组菌株GZ03在7.5L发酵罐进行发酵测试
发酵培养基：甘油20g·L-1，KH2PO4 13.5g·L-1，(NH4)2HPO4 4g·L-1，MgSO 4·7H2O1.4g·L-1，柠檬酸1.7g·L-1，维生素B1 4.5mg·L-1，微量金属离子液10mL·L-1；
微量金属离子液：(NH4)Mo7O24 0.10g·L-1，MnSO4·4H2O 0.50g·L-1，CuSO4·5H2O1.00g·L-1，FeSO4·7H20 10.00g·L-1，Na2B4O7·10H2 O 0.20g·L-1，CaCl2 2.00g·L-1，ZnSO4·7H2O 2.30g·L-1。
补料培养基：甘油500g·L-1。
将重组菌株GZ03在发酵罐水平测试果糖软骨素的生产能力。从甘油管接种200μL菌液于50mL(250mL摇瓶)的LB培养基中，于37℃、转速200rpm条件下摇瓶活化12h，获得OD600为5.0的菌液作为上罐发酵的种子液。发酵罐装液量为3L发酵培养基的初始pH控制在7.0-7.5。按10％的接种量将种子液接种至含发酵培养基的发酵罐中，培养5h时添加终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，发酵过程中，当溶氧陡然升高，开始进行补料，补料策略为DO-stat，每当溶氧高于30％时开始补料持续至发酵结束。每4h取样一次测定果糖软骨素的产量。
结果如图2所示，发酵36h，重组菌株GZ03和出发菌株大肠杆菌K4的果糖软骨素产量分别为7.12g/L和1.91g/L。
对比例1：
将实施例1构建的重组质粒pEtac-glmS和pEtac-glmM分别导入到野生型大肠杆菌K4菌株，获得重组菌分别命名为GZ04和GZ05，按照实施例4相同方法进行发酵，发酵36h，GZ04和GZ05的产量分别达到5.51g/L和6.33g/L。与整合至基因组的改造菌株GZ03相比，结果显示(图3)，使用基因组强化路径酶表达相比于通过质粒强化表达对产量的提升效果更为显著，这可能是因为使用质粒在发酵过程中存在质粒丢失的情况，导致路径酶的表达效果不如整合在基因组上的效果稳定。
对比例2：
具体实施方式同实施例2，区别在于，将poxB位点替换为ackA(菌株命名为△ackA)，将pta位点替换为kfoE(菌株命名为△kfoE)，设计的N20序列如下：
N20-ackA(5’→3’):TACAACCTGTACAAAGAGCA；
N20-kfoE(5’→3’):AAATGGTTTGAAACTATTCC；
结果显示(图4、图5)，将glmM整合在位点ackA对菌株的生长和产量的均有较大影响，菌株的生长变慢，且最终OD相较于GZ03降低了30％，产量相较于GZ03降低了20％；而将glmM整合在kfoE位点虽然对菌株OD的影响较小，但是菌株产量相较于GZ03下降了40％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种具有果糖软骨素合成能力的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌在基因组上强化了氨基转移酶glmS和磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的表达；所述氨基转移酶glmS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述氨基转移酶glmS基因整合在ldhA位点，所述磷酸葡萄糖胺变位酶glmM的编码基因整合在poxB或pta位点；所述重组大肠杆菌的出发菌株为大肠杆菌K4。
2.权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建含目的位点上游片段-glmS基因-目的位点下游片段的glmS基因表达框，构建含目的位点上游片段-glmM基因-目的位点下游片段的glmM基因表达框；
(2)将glmS基因表达框、glmM基因表达框整合至目的位点处；
所述glmS基因对应的目的位点为ldhA位点；所述glmM基因对应的目的位点为poxB或pta位点。
3.一种生产果糖软骨素的方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组大肠杆菌在培养基中发酵，收集发酵液中的果糖软骨素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基含有：甘油、KH2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4、柠檬酸、维生素B1和金属离子液；所述金属离子液含有(NH4)Mo7O24、MnSO4、CuSO4、FeSO4、Na2B4O7、CaCl2和ZnSO4。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵在30～37℃下进行。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养4～5h后，添加终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG进行诱导。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养4～5h后，添加终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG进行诱导。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵过程中还补料甘油。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵过程中还补料甘油。
10.权利要求1所述的重组大肠杆菌或权利要求3～9任一所述的方法在生产含果糖软骨素的产品中的应用。
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