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CN114269903A - 多链嵌合多肽和其用途 - Google Patents

多链嵌合多肽和其用途 Download PDF

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CN114269903A
CN114269903A CN202080058125.3A CN202080058125A CN114269903A CN 114269903 A CN114269903 A CN 114269903A CN 202080058125 A CN202080058125 A CN 202080058125A CN 114269903 A CN114269903 A CN 114269903A
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HCW Biologics Inc
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Abstract

本公开涉及的方法包含使用第一多链嵌合多肽和第二多链嵌合多肽用于刺激NK细胞、诱导或增加NK细胞的增殖、诱导NK细胞的分化和使用活化的NK细胞治疗有需要的受试者。

Description

多链嵌合多肽和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月21日提交的美国临时专利申请序列号62/864,996的优先权；所述专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，并且更具体地说，涉及两种多链嵌合多肽的组合的用途，每种多链嵌合多肽具有定位在两个靶结合结构域之间的接头结构域。
背景技术
过继性免疫疗法或细胞疗法需要在体内培养从受试者获得的免疫细胞(以及任选地对免疫细胞进行基因操作以表达T细胞或嵌合抗原受体)，之后再施用回受试者体内。需要足够数目的免疫细胞以便在受试者中提供治疗作用。在许多实例中，需要持续三周或三周以上培养从受试者获得的免疫细胞才可获得治疗有效数目的免疫细胞。另外，许多体外培养从受试者获得的免疫细胞的方法需要一层饲养细胞，所述方法需要随后纯化或分离免疫细胞，之后再施用回受试者体内。
发明内容
本发明基于以下发现：使NK细胞接触的特定两步法导致NK细胞在体外显著扩增，并且扩增的NK细胞高度活化，对受体宿主中的患病细胞具有长期持久性和高度细胞毒性。
在一方面，本文提供了一种促进自然杀伤细胞活化和增殖的方法，所述方法包含：(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的第一多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第一时间段；以及(b)在允许所述自然杀伤细胞的活化和增殖的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的(i)第二多链嵌合多肽和(ii)IgG1抗体构建体的液体培养基中接触，持续第二时间段，其中所述第一多链嵌合多肽包含：第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含第一靶结合结构域、可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18受体或IL-12受体；并且其中所述第二多链嵌合多肽包含：第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含第一靶结合结构域、接头结构域、一对亲和结构域的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7受体或IL-21受体，并且所述IgG1抗体构建体包含特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域。
在一些实施例中，所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包含所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包含所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包含所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含SEQ ID NO:9。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含SEQ ID NO:10。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包含在其N端处的信号序列。在一些实施例中，所述信号序列包含SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述信号序列是SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。在一些实施例中，所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含SEQ ID NO:26。在一些实施例中，所述IL15Rα的sushi结构域包含来自人IL15Rα的sushi结构域。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含与SEQ IDNO:24具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含与SEQ ID NO:24具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含与SEQ ID NO:24具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含SEQ ID NO:24。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。
在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-15或可溶性IL-18。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-12受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-18受体。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-18受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-12受体。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包含可溶性IL-18。在一些实施例中，所述可溶性IL-18是可溶性人IL-18。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包含与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包含与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包含与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包含SEQ ID NO:20的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域包含可溶性IL-12。在一些实施例中，所述可溶性IL-12是可溶性人IL-12。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12包含可溶性人IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-15进一步包含可溶性IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列之间的接头序列。在一些实施例中，所述接头序列包含SEQ ID NO:11。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包含与SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包含与SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包含与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包含SEQ ID NO:14。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包含与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包含SEQ ID NO:16。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNEDSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:63)具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与SEQ ID NO:63具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与SEQ ID NO:63具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含
MKWVTFISLLFLFSSAYSYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNEDSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:64)。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包含与
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:65)具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包含与SEQ ID NO:65具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包含与SEQ ID NO:65具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包含
MKWVTFISLLFLFSSAYSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:66)。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包含所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包含所述第一嵌合多肽中的所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包含所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述接头结构域是可溶性组织因子结构域。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含SEQ ID NO:9。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包含SEQ ID NO:10。
在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包含在其N端处的信号序列。在一些实施例中，所述信号序列包含SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述信号序列是SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。在一些实施例中，所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包含SEQ ID NO:26。在一些实施例中，所述IL15Rα的sushi结构域包含来自人IL15Rα的sushi结构域。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含与SEQ ID NO:24具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含与SEQ ID NO:24具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含与SEQ ID NO:24具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包含SEQ ID NO:24。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-7或可溶性IL-21。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-21受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-7受体。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-7受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-21受体。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包含可溶性IL-21。在一些实施例中，所述可溶性IL-21是可溶性人IL-21。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包含与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包含与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包含与SEQ ID NO:22具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包含SEQ ID NO:22的序列。在一些实施例中，所述第二靶结合结构域包含可溶性IL-7。在一些实施例中，所述可溶性IL-7是可溶性人IL-7。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包含与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包含与SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包含与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包含SEQ ID NO:23的序列。
在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:67)具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与SEQ ID NO:67具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与SEQ ID NO:67具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含SEQ ID NO:67。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含
MKWVTFISLLFLFSSAYSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:68)。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含与
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:69)具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含与SEQ ID NO:69具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含与SEQ ID NO:69具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含SEQ ID NO:69。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含
MKWVTFISLLFLFSSAYSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQID NO:70)。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:71)具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含与SEQ ID NO:71具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包含
MGVKVLFALICIAVAEAQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:72)。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含与
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQID NO:73)具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含与SEQ ID NO:73具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含SEQ ID NO:73。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包含
MGVKVLFALICIAVAEADCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中所述单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到所述接头结构域。在一些实施例中，所述IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中所述双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到所述接头结构域。在一些实施例中，所述第一时间段为约15分钟到约4小时。在一些实施例中，所述第一时间段为约30分钟到约3.5小时。在一些实施例中，所述第一时间段为约1小时到约3.5小时。在一些实施例中，所述第一时间段为约2小时到约3.5小时。在一些实施例中，步骤(a)和/或步骤(b)中的所述液体培养基是含血清的液体培养基。
在一些实施例中，所述NK细胞以约4.0x107个细胞/毫升到约1.5x108个细胞/毫升的密度存在于步骤(a)中的所述液体培养基中。在一些实施例中，所述NK细胞以约5.0x107个细胞/毫升到约2.0x108个细胞/毫升的密度存在于步骤(a)中的所述液体培养基中。在一些实施例中，所述第二时间段为约1天到约30天。在一些实施例中，所述第二时间段为约7天到约30天。在一些实施例中，所述第二时间段为约14天到约21天。在一些实施例中，步骤(b)中的所述液体培养基包含摩尔比为约0.5:1到约2:1的所述第二多链嵌合多肽和所述IgG1抗体构建体。在一些实施例中，步骤(b)中的所述液体培养基包含摩尔比为约0.8:1到约1.2:1的所述第二多链嵌合多肽和所述IgG1抗体构建体。在一些实施例中，所述NK细胞在步骤(b)中的所述液体培养基中维持在约0.5x106个细胞/毫升到约2.0x106个细胞/毫升的密度。在一些实施例中，所述NK细胞在步骤(b)中的所述液体培养基中维持在约1.0x106个细胞/毫升到约2.0x106个细胞/毫升的密度。在一些实施例中，所述NK细胞先前从受试者获得。在一些实施例中，所述NK细胞先前从脐带血或诱导多能干细胞中获得。在一些实施例中，所述方法进一步包含在步骤(a)之前从所述受试者获得所述NK细胞。在一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实施例中，所述方法进一步包含，在步骤(a)和步骤(b)之间，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。在一些实施例中，所述方法进一步包含，在步骤(a)之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。在一些实施例中，所述方法进一步包含，在步骤(b)期间，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。在一些实施例中，所述方法进一步包含在步骤(b)之后分离所述NK细胞。在一些实施例中，与步骤(a)之前一种或多种蛋白质的表达或分泌水平相比，在步骤(b)之后，所述NK细胞的一种或多种蛋白质的表达或分泌水平增加，所述一种或多种蛋白质选自由以下组成的组：TNF-α、IFN-γ、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、2B4、CD8、CD11a、CD16、CD25、CD27、CD48、CD49d、CD54、CD56、CD58、CD62L、CD69、CD70、CD94、CD137、CD158a、CD158b、CD158e、CD178、CD226、CD253、NKG2C、NKG2D、LIR-1、LILR-B1、KIR2DL1、KIR3DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、CXCR3、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、TRAIL、FasL、CXCR3、CXCR4、LTB、MX1、BAX、TNF-α和IFN-γ。在一些实施例中，所述方法进一步包含，在所述接触步骤之后，向有需要的受试者施用所述NK细胞。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在一些实施例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自由以下组成的组：阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin'slymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在一些实施例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了一种通过任何上述实施例所述的方法产生的活化的NK细胞。还提供了一种包括上述实施例所述的活化的NK细胞的药物组合物。还提供了一种包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含任何上述实施例所述的活化的NK细胞。在另一方面，本文提供了一种在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的任何上述实施例所述的活化的NK细胞或任何上述实施例所述的药物组合物。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在一些实施例中，所述与老化相关的疾病或病况选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。在一些实施例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在一些实施例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
在一些实施例中，本文提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何上述实施例所述的活化的NK细胞或活化的T细胞或任何上述实施例所述的药物组合物。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在一些实施例中，所述与老化相关的疾病或病况选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。在一些实施例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在一些实施例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
在另一方面，本文中提供了一种试剂盒，其包括：(a)第一多链嵌合多肽，所述第一多链嵌合多肽包括：第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括第一靶结合结构域、可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18受体或IL-12受体；第二多链嵌合多肽，所述第二多链嵌合多肽包括：第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括第一靶结合结构域、接头结构域、一对亲和结构域的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7受体或IL-21受体；以及(c)IgG1抗体，所述IgG1抗体包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域。在一些实施例中，所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包括所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:5。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:9。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:10。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包括在其N端处的信号序列。在一些实施例中，所述信号序列包括SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述信号序列是SEQ IDNO:28。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。在一些实施例中，所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括SEQ ID NO:26。在一些实施例中，所述IL15Rα的sushi结构域包括来自人IL15Rα的sushi结构域。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括SEQ ID NO:24。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-15或可溶性IL-18。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-12受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-18受体。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-18受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-12受体。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包括可溶性IL-18。在一些实施例中，所述可溶性IL-18是可溶性人IL-18。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包括与SEQID NO:20具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包括与SEQ IDNO:20具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包括与SEQ IDNO:20具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-18包括SEQ ID NO:20的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域包括可溶性IL-12。在一些实施例中，所述可溶性IL-12是可溶性人IL-12。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12包括可溶性人IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-15进一步包括可溶性IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列之间的接头序列。在一些实施例中，所述接头序列包括SEQ ID NO:11。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括SEQ ID NO:14。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括SEQ ID NO:16。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:63。在一些实施例中，所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:64。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:65。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:66。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包括所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述接头结构域是可溶性组织因子结构域。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:5具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:5。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:9具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:9。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:10具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:10。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。在一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包括在其N端处的信号序列。在一些实施例中，所述信号序列包括SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述信号序列是SEQ ID NO:28。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。在一些实施例中，所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性IL-15包括SEQ ID NO:26。在一些实施例中，所述IL15Rα的sushi结构域包括来自人IL15Rα的sushi结构域。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有80％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ IDNO:24具有90％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有95％同一性的序列。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括SEQ ID NO:24。在一些实施例中，所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-7或可溶性IL-21。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-21受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-7受体。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-7受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-21受体。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包括可溶性IL-21。在一些实施例中，所述可溶性IL-21是可溶性人IL-21。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-21包括SEQ ID NO:22的序列。在一些实施例中，所述第二靶结合结构域包括可溶性IL-7。323.在一些实施例中，所述可溶性IL-7是可溶性人IL-7。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述可溶性人IL-7包括SEQ ID NO:23的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:67。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:68。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:69。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:70。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQID NO:71具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:71。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少80％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQID NO:73具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:73。在一些实施例中，所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:74。在一些实施例中，所述IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中所述单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到所述接头结构域。在一些实施例中，所述IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中所述双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到所述接头结构域。
如本文所使用的，术语“嵌合”是指多肽包含最初来源于两个不同来源(例如，两种天然存在的不同蛋白质，例如来自相同或不同物种)的氨基酸序列(例如，结构域)。例如，嵌合多肽可以包含来自至少两种天然存在的不同人蛋白质的结构域。在一些实例中，嵌合多肽可以包含作为合成序列(例如，scFv)的结构域和来源于天然存在的蛋白质(例如，天然存在的人蛋白质)的结构域。在一些实施例中，嵌合多肽可以包含至少两个不同的作为合成序列(例如，两个不同scFv)的结构域。
“多链嵌合多肽”是指两种或更多种嵌合多肽的复合物。
“抗原结合结构域”是能够特异性结合到一种或多种不同抗原的一个或多个蛋白质结构域(例如，由来自单个多肽的氨基酸形成或由来自两个或多于两个多肽(例如，相同或不同的多肽)的氨基酸形成)。在一些实例中，抗原结合结构域可能以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和力结合到抗原或表位。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是抗体或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域可以包含替代支架。本文描述了抗原结合结构域的非限制性实例。抗原结合结构域的额外的实例是本领域已知的。
“可溶性组织因子结构域”是指与缺少跨膜结构域和细胞内结构域的野生型哺乳动物组织因子蛋白(例如，野生型人组织因子蛋白)的段具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的多肽。本文描述了可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
术语“可溶性白介素蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的白介素蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性白介素蛋白可以包含与野生型成熟并且分泌的哺乳动物白介素蛋白(例如，野生型人白介素蛋白)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列，并且保留其生物活性。本文描述了可溶性白介素蛋白的非限制性实例。
术语“可溶性细胞因子蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的细胞因子蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性细胞因子蛋白可以包含与野生型成熟并且分泌的哺乳动物白介素蛋白(例如，野生型人白介素蛋白)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列，并且保留其生物活性。本文描述了可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例。
术语“可溶性白介素受体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，所述多肽缺少能够结合其天然配体中的一个或多个(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜结构域(和任选的细胞内结构域)。例如，可溶性白介素受体可以包含与野生型白介素受体的细胞外结构域具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列，并且保留其特异性结合到其天然配体中的一个或多个的能力，但缺少其跨膜结构域(并且任选地，还缺少其细胞内结构域)。本文描述了可溶性白介素受体的非限制性实例。
术语“可溶性细胞因子受体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，其缺少能够结合一个或多个其天然配体(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜结构域(和任选的细胞内结构域)。例如，可溶性细胞因子受体可以包含与野生型细胞因子受体的细胞外结构域具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列，并且保留其特异性结合到其天然受体中的一个或多个的能力，但缺少其跨膜结构域(并且任选地，还缺少其细胞内结构域)。本文描述了可溶性细胞因子受体的非限制性实例。
术语“共刺激分子的配体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，所述多肽能够结合并活化免疫细胞上的共刺激受体分子(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)。例如，共刺激分子的配体可以包含与共刺激分子的配体具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列，所述共刺激分子的配体保留其特异性结合到其天然受体中的一个或多个的能力。本文描述了共刺激分子的配体的非限制性实例。
术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且包含某些类型的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含特异性结合到抗原或表位的一个或多个抗原结合结构域。抗体具体包含例如完整抗体(例如，完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。抗原结合结构域的一个实例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。本文描述了抗体的额外的实例。抗体的额外的实例是本领域已知的。
“亲和力”是指抗原结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所使用的，“亲和力”是指固有结合亲和力，其反映抗原结合结构域与抗原或表位的成员之间的1:1相互作用。分子X与其配偶体Y的亲和力可以由解离平衡常数(KD)表示。在下文中更详细地描述了贡献于解离平衡常数的动力学组分。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包含本文描述的方法。亲和力可以例如使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如，
Figure BDA0003508369120000231
)或生物层干涉测量术(例如，
Figure BDA0003508369120000232
)来确定。用于确定对抗原结合结构域及其对应的抗原或表位的亲和力的额外的方法是本领域已知的。
术语“一对亲和结构域”是以小于1x10-7M(例如，小于1x10-8M、小于1x10-9M、小于1x10-10M或小于1x10-11M)的KD彼此特异性结合的两个不同的蛋白质结构域。在一些实例中，一对亲和结构域可以是一对天然存在的蛋白质。在一些实施例中，一对亲和结构域可以是一对合成蛋白质。本文描述了亲和结构域对的非限制性实例。
术语“表位”是指特异性结合到抗原结合结构域的抗原的一部分。表位可以例如由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象表位和非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合而非与后者的结合可能会丢失。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。用于鉴别与抗原结合结构域结合的表位的方法是本领域已知的。
“免疫效应细胞”是指哺乳动物的免疫系统的细胞，其能够直接或间接地识别哺乳动物中的病原性细胞(例如，癌细胞)和/或引起所述细胞的细胞停滞或细胞死亡。免疫效应细胞的非限制性实例包含巨噬细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞)、嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。免疫效应细胞的额外的实例是本领域已知的。
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实例中，所治疗的病症是癌症，并且改善癌症的至少一种症状包含减少异常增殖、基因表达、信号传导、翻译和/或因子的分泌。一般来说，治疗方法包含将治疗有效量的组合物施用给有需要或已被确定为需要这种治疗的受试者，所述组合物减少病症的至少一种症状。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。
本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求变得显而易见。
附图说明
图1示出了示例性IL-12/IL-15RαSu DNA构建体的示意图。
图2示出了示例性IL-18/TF/IL-15DNA构建体的示意图。
图3示出了示例性IL-12/IL-15RαSu和IL-18/TF/IL-15DNA构建体之间的相互作用的示意图。
图4示出了示例性IL-12/IL-15RαSu和IL-18/TF/IL-15融合蛋白之间的相互作用产生IL-18/TF/IL-15:IL-12/IL-15RαSu复合物(18t15-12s)的示意图。
图5示出了示例性IL-7/IL-15RαSu DNA构建体的示意图。
图6示出了示例性IL-21/TF/IL-15DNA构建体的示意图。
图7示出了示例性IL-7/IL-15RαSu和IL-21/TF/IL-15DNA构建体之间的相互作用的示意图。
图8示出了示例性IL-7/IL-15RαSu和IL-21/TF/IL-15融合蛋白之间的相互作用产生IL-21/TF/IL-15:IL-7/IL-15RαSu复合物(21t15-7s)的示意图。
图9示出了示例性IL-21/IL-15RαSu DNA构建体的示意图。
图10示出了示例性IL-7/TF/IL-15DNA构建体的示意图。
图11示出了示例性IL-21/IL-15RαSu和IL-7/TF/IL-15DNA构建体之间的相互作用的示意图。
图12示出了示例性IL-21/IL-15RαSu和IL-7/TF/IL-15融合蛋白之间的相互作用产生IL-7/TF/IL-15:IL-21/IL-15RαSU复合物(7t15-21s)的示意图。
图13示出了显示在未受刺激的NK细胞(US)或与示例性第二多链嵌合多肽和示例性IgG1抗体构建体的组合(7t15-21s:抗-TF Ab)、示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)、重组IL-12和IL-18的组合(单一细胞因子)、重组IL-12(IL-12)或重组IL-18(IL-18)接触5分钟、15分钟、30分钟、60分钟或过夜的NK细胞中，STAT4和STAT5表达的增加倍数的图。
图14是示出在未受刺激的NK细胞和与10nM或100nM的示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)或与重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL18)的组合接触0到4小时的NK细胞中，细胞外酸化速率(ECAR)的图。NK细胞获自三个不同的供体。
图15是示出在未受刺激的NK细胞和与示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)或与重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL18)的组合接触0到3小时的NK细胞中，细胞外酸化速率(ECAR)的图。NK细胞获自三个不同的供体。NK细胞进一步与表明的葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖添加接触。
图16是未受刺激的NK细胞或与重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的组合、示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)或对照多链嵌合多肽(7t15-21s)接触1小时或3小时的NK细胞中，mTORC1、MYC和SREBP的基因表达的变化倍数图。
图17是示出在未受刺激或与重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的组合或100nM示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)接触30分钟到3小时的NK细胞中，示例性活化标志物mTORC1、MYC和SREBP的表达的图。
图18示出了在没有刺激或用重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的混合物或示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)刺激3小时或过夜的NK细胞之后，CD69阳性和干扰素-γ阳性NK细胞的百分比。
图19示出了在没有刺激或用重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的混合物或示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)刺激3小时或过夜的NK细胞之后，41BB阳性和IL-21受体α阳性NK细胞的百分比。
图20是示出接受以下处理的NK细胞随时间的扩增倍数的图：(i)未接受初始刺激，并随后与示例性第二多链嵌合多肽(7t15-21s)和示例性IgG1抗体构建体(18t15-12s)接触；(ii)用重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的组合进行初始刺激，并随后与示例性第二多链嵌合多肽(7t15-21s)和示例性IgG1抗体构建体(18t15-12s)的组合接触；或(iii)用示例性第一多链嵌合多肽进行初始刺激，并随后与示例性第二多链嵌合多肽(7t15-21s)和示例性IgG1抗体构建体(18t15-12s)的组合接触。
图21是示出接受以下处理的CD107a阳性细胞的百分比的图：(i)无初始刺激，并随后用示例性第二多链嵌合多肽(7t15-21s)和示例性IgG1抗体构建体(αTF Ab)的组合进行处理；(ii)用细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的组合进行初始刺激，并随后用示例性第二多链嵌合多肽(7t15-21s)和示例性IgG1抗体构建体(αTF Ab)的组合进行处理；(iii)用示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)进行初始刺激，并随后用示例性第二多链嵌合多肽(7t15-21s)和示例性IgG1抗体构建体(αTF Ab)的组合进行处理；(iv)无初始刺激，并随后重组用IL-15进行处理；(v)用细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的组合进行初始刺激，并随后用重组IL-15进行处理；或(vi)用示例性第一多链嵌合多肽进行初始刺激。
图22是示出受刺激的人NK细胞的耗氧速率(OCR)分析的图，其中OCR分析由四个阶段组成：基础呼吸(无药物)、ATP相关呼吸/质子泄漏(1.5μM寡霉素)、最大呼吸(2μMFCCP)和备用呼吸(0.5μM鱼藤酮)。OCR图是三个供体获得的NK细胞的组合表示。如相应实例中所示和所述刺激NK细胞。
图23是示出用18t15-12s或单个细胞因子组合刺激后IFN-γmRNA和NKG2D mRNA水平的图，其中细胞分为短期活化(180分钟)或长期活化(过夜刺激12-16小时)组，或未受刺激。
图24是示出在NSG小鼠模型中用7t15-21s-αTF Ab扩增的过继转移的NK细胞(CD56+细胞)的持久性的图，其中在扩增之前，细胞未受培养基刺激作为对照，或用100nM的18t15-12s刺激(唤醒(Kick))180分钟或12-16小时(过夜)。
图25是示出对IFNγCNS-1CpG区域的DNA甲基化进行的“唤醒和扩增(Kick andExpansion)”表观遗传分析的图，其中细胞被转移到24孔平底板中，并经受：无处理，或用单一细胞因子的混合物或18t15-12s短期暴露180分钟或12-16小时(过夜)进行刺激。然后，将NK细胞洗涤并重新悬浮在补充有7t15-21s加上抗组织因子抗体(αTF Ab)的完全RPMI1640培养基中，并孵育14天(长期)。使从细胞中分离的DNA经受对位于IFNγCNS-1区域内的CpG位点的DNA甲基化进行的焦磷酸测序分析。
图26是示出体内记忆样NK细胞的表观遗传分析的图，其中细胞经受：用单一细胞因子的混合物或18t15-12s刺激12-16小时。然后，将NK细胞洗涤并重新悬浮在补充有7t15-21s+抗组织因子抗体(αTF Ab)的完全RPMI 1640培养基中，并孵育14天。扩增14天后，活化的NK细胞被加工用于焦磷酸测序分析(输注前样品)或注入NSG小鼠中(五组，每组五只小鼠)。输注后第9天，采集每只小鼠的脾脏，针对每组(五组，每组五只小鼠)进行纯化并合并NK细胞。使样品(输注后)经受对位于IFNγCNS-1区域内的CpG位点的DNA甲基化进行的焦磷酸测序分析。
图27是示出NK细胞在扩增第5天的扩增倍数的图，其中数据显示NK细胞需要IgG1信号进行扩增。
图28是当前要求保护的方法的示例性实施例。
图29是一组图，其示出了使用本文所述的方法扩增原代NK细胞。
图30是示出可用于本文所述方法中的多链嵌合多肽的示例性图示。
图31是当前要求保护的方法的示例性实施例的示意图。
图32是当前要求保护的方法的示例性实施例的示意图。
图33是一组图，其示出了第10天后，表面标志物CD25(上图)和CD26(下图)的百分比。
图34是一组图，其示出了第10天后，表面标志物NKp44(上图)和NKp30(下图)的百分比。
图35是一组图，其示出了第10天后，表面标志物CD62L(上图)和CD16(下图)的百分比。数据显示，用18t15-12s活化和用7t15-21s和抗组织因子IgG1抗体扩增会导致CD62L表达增加。
图36是示出未受刺激或用重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的混合物或示例性第一多链嵌合多肽(18t15-12s)刺激后的细胞中的细胞毒性的百分比。
图37A是一组直方图，其示出了未经处理或在用18t15-12s(250nM)刺激180分钟或12-16小时然后使用7t15-21s(200nM)和抗组织因子抗体(αTF Ab，100nM)扩增7天后的脐带血来源的NK细胞的扩增。
图37B是示出未经处理或在用18t15-12s(250nM)刺激180分钟或12-16小时然后使用7t15-21s(200nM)和抗组织因子抗体(αTF Ab，100nM)扩增7天后的脐带血来源的NK细胞的细胞增殖百分比的图。
具体实施方式
本文提供了两种多链嵌合多肽的特定组合、所述两种多链嵌合多肽的用途以及包含所述两种多链嵌合多肽的试剂盒。多链嵌合多肽包含定位在两个靶结合结构域之间的接头结构域。在一些实施例中，所述接头结构域是或包含可溶性组织因子结构域。在一些实施例中，所述接头结构域可以被同源IgG1抗体(例如，单克隆抗体)识别。在一些实施例中，本文所述的多链嵌合多肽中的两种多链嵌合多肽的组合可用于刺激NK细胞、诱导或增加NK细胞的增殖和/或诱导NK细胞的分化，并且所述NK细胞此后可以用于治疗受试者。
本文提供了促进自然杀伤细胞活化和增殖的方法，所述方法包含：(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触，持续第一时间段；以及(b)在允许所述自然杀伤细胞的活化和增殖的条件下使所述NK细胞在包括有效量的(i)第二多链嵌合多肽和(ii)包含特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，本文所述的任何示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。还提供了通过任何这些方法产生的NK细胞，以及使用这些NK细胞治疗受试者的方法。本文还提供了包含使用这些方法生成的任何NK细胞的组合物。还提供了试剂盒，所述试剂盒包含：(a)包含第一和第二嵌合多肽的第一多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何示例性第一多链嵌合多肽)；(b)包含第一和第二嵌合多肽的第二多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何示例性第二多链嵌合多肽)；以及(c)包含特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，本文所述的任何IgG1抗体构建体)。在图30-32中描绘了本文提供的方法的示例性实施例。
目前的离体NK扩增方法可能包含基于饲养细胞的扩增方法和基于细胞因子的扩增方法。基于饲养细胞的扩增方法的示例性缺点包含：GMP级饲养细胞的开发和维护以及显示饲养细胞有效照射的方法；最终产品在施用于患者之前必须耗竭所有饲养细胞污染物，包含DNA；以及制造过程可能既乏味又昂贵。基于细胞因子的扩增方法的示例性缺点包含：最终NK细胞产品的纯度欠佳、与饲养细胞扩增相比最终NK细胞数量低、重组细胞因子的费用以及缺乏市售的GMP级细胞因子(除了IL-2)。本文所述的方法提供了如从患者产生高度活化的NK细胞、与饲养细胞方法相当或类似的大规模扩增、加工要求有限的具有成本效益的扩增和活化等优点，并且可以将细胞注射到受试者中，从而允许体内细胞扩增。
在一些实施例中，本文描述的方法可以诱导NK细胞的生成和增殖，所述NK细胞高度活化，对受体宿主中的患病细胞(具有本文所述的记忆样自然杀伤细胞的任何示例性方面的细胞)具有长期持久性和高度细胞毒性。在本文所述的任何方法的一些实施例中，包含使NK细胞与第一多链嵌合多肽接触的接触步骤导致少于50％的细胞死亡(例如，细胞凋亡)(例如，少于48％的细胞死亡、少于46％的细胞死亡、少于44％的细胞死亡、少于42％的细胞死亡、少于40％的细胞死亡、少于38％的细胞死亡、少于36％的细胞死亡、少于34％的细胞死亡、少于32％的细胞死亡、少于30％的细胞死亡、少于28％的细胞死亡、少于26％的细胞死亡、少于24％的细胞死亡、少于22％的细胞死亡、少于20％的细胞死亡、少于18％的细胞死亡、少于16％的细胞死亡、少于14％的细胞死亡、少于12％的细胞死亡、少于10％的细胞死亡、少于8％的细胞死亡、少于6％的细胞死亡、少于4％的细胞死亡或少于2％的细胞死亡)。
在一些实施例中，与实施本文所述的任何方法之前(例如，在使NK细胞与本文所述的任何示例性第一多链嵌合多肽接触之前)的NK细胞相比，本文所述的任何方法可导致糖酵解、有氧代谢、氧化磷酸化、葡萄糖消耗和细胞外酸化速率(ECAR)中的一项或多项增加(例如，约1％到约5,000％的增加、约1％到约4,000％的增加、约1％到约3,000％的增加、约1％到约2,000％的增加、约1％到约1,000％的增加、约1％到约800％的增加、约1％到约600％的增加、约1％到约500％的增加、约1％到约400％的增加、约1％到约300％的增加、约1％到约200％的增加、约1％到约180％的增加、约1％到约160％的增加、约1％到约140％的增加、约1％到约120％的增加、约1％到约100％的增加、约1％到约80％的增加、约1％到约60％的增加、约1％到约40％的增加、约1％到约30％的增加、约1％到约20％的增加、约1％到约15％的增加、约1％到约10％的增加、约1％到约5％的增加、约5％到约5,000％的增加、约5％到约4,000％的增加、约5％到约3,000％的增加、约5％到约2,000％的增加、约5％到约1,000％的增加、约5％到约800％的增加、约5％到约600％的增加、约5％到约500％的增加、约5％到约400％的增加、约5％到约300％的增加、约5％到约200％的增加、约5％到约180％的增加、约5％到约160％的增加、约5％到约140％的增加、约5％到约120％的增加、约5％到约100％的增加、约5％到约80％的增加、约5％到约60％的增加、约5％到约40％的增加、约5％到约30％的增加、约5％到约20％的增加、约5％到约15％的增加、约5％到约10％的增加、约10％到约5,000％的增加、约10％到约4,000％的增加、约10％到约3,000％的增加、约10％到约2,000％的增加、约10％到约1,000％的增加、约10％到约800％的增加、约10％到约600％的增加、约10％到约500％的增加、约10％到约400％的增加、约10％到约300％的增加、约10％到约200％的增加、约10％到约180％的增加、约10％到约160％的增加、约10％到约140％的增加、约10％到约120％的增加、约10％到约100％的增加、约10％到约80％的增加、约10％到约60％的增加、约10％到约40％的增加、约10％到约30％的增加、约10％到约20％的增加、约10％到约15％的增加、约15％到约5,000％的增加、约15％到约4,000％的增加、约15％到约3,000％的增加、约15％到约2,000％的增加、约15％到约1,000％的增加、约15％到约800％的增加、约15％到约600％的增加、约15％到约500％的增加、约15％到约400％的增加、约15％到约300％的增加、约15％到约200％的增加、约15％到约180％的增加、约15％到约160％的增加、约15％到约140％的增加、约15％到约120％的增加、约15％到约100％的增加、约15％到约80％的增加、约15％到约60％的增加、约15％到约40％的增加、约15％到约30％的增加、约15％到约20％的增加、约20％到约5,000％的增加、约20％到约4,000％的增加、约20％到约3,000％的增加、约20％到约2,000％的增加、约20％到约1,000％的增加、约20％到约800％的增加、约20％到约600％的增加、约20％到约500％的增加、约20％到约400％的增加、约20％到约300％的增加、约20％到约200％的增加、约20％到约180％的增加、约20％到约160％的增加、约20％到约140％的增加、约20％到约120％的增加、约20％到约100％的增加、约20％到约80％的增加、约20％到约60％的增加、约20％到约40％的增加、约20％到约30％的增加、约30％到约5,000％的增加、约30％到约4,000％的增加、约30％到约3,000％的增加、约30％到约2,000％的增加、约30％到约1,000％的增加、约30％到约800％的增加、约30％到约600％的增加、约30％到约500％的增加、约30％到约400％的增加、约30％到约300％的增加、约30％到约200％的增加、约30％到约180％的增加、约30％到约160％的增加、约30％到约140％的增加、约30％到约120％的增加、约30％到约100％的增加、约30％到约80％的增加、约30％到约60％的增加、约30％到约40％的增加、约40％到约5,000％的增加、约40％到约4,000％的增加、约40％到约3,000％的增加、约40％到约2,000％的增加、约40％到约1,000％的增加、约40％到约800％的增加、约40％到约600％的增加、约40％到约500％的增加、约40％到约400％的增加、约40％到约300％的增加、约40％到约200％的增加、约40％到约180％的增加、约40％到约160％的增加、约40％到约140％的增加、约40％到约120％的增加、约40％到约100％的增加、约40％到约80％的增加、约40％到约60％的增加、约60％到约5,000％的增加、约60％到约4,000％的增加、约60％到约3,000％的增加、约60％到约2,000％的增加、约60％到约1,000％的增加、约60％到约800％的增加、约60％到约600％的增加、约60％到约500％的增加、约60％到约400％的增加、约60％到约300％的增加、约60％到约200％的增加、约60％到约180％的增加、约60％到约160％的增加、约60％到约140％的增加、约60％到约120％的增加、约60％到约100％的增加、约60％到约80％的增加、约80％到约5,000％的增加、约80％到约4,000％的增加、约80％到约3,000％的增加、约80％到约2,000％的增加、约80％到约1,000％的增加、约80％到约800％的增加、约80％到约600％的增加、约80％到约500％的增加、约80％到约400％的增加、约80％到约300％的增加、约80％到约200％的增加、约80％到约180％的增加、约80％到约160％的增加、约80％到约140％的增加、约80％到约120％的增加、约80％到约100％的增加、约100％到约5,000％的增加、约100％到约4,000％的增加、约100％到约3,000％的增加、约100％到约2,000％的增加、约100％到约1,000％的增加、约100％到约800％的增加、约100％到约600％的增加、约100％到约500％的增加、约100％到约400％的增加、约100％到约300％的增加、约100％到约200％的增加、约100％到约180％的增加、约100％到约160％的增加、约100％到约140％的增加、约100％到约120％的增加、约120％到约5,000％的增加、约120％到约4,000％的增加、约120％到约3,000％的增加、约120％到约2,000％的增加、约120％到约1,000％的增加、约120％到约800％的增加、约120％到约600％的增加、约120％到约500％的增加、约120％到约400％的增加、约120％到约300％的增加、约120％到约200％的增加、约120％到约180％的增加、约120％到约160％的增加、约120％到约140％的增加、约140％到约5,000％的增加、约140％到约4,000％的增加、约140％到约3,000％的增加、约140％到约2,000％的增加、约140％到约1,000％的增加、约140％到约800％的增加、约140％到约600％的增加、约140％到约500％的增加、约140％到约400％的增加、约140％到约300％的增加、约140％到约200％的增加、约140％到约180％的增加、约140％到约160％的增加、约160％到约5,000％的增加、约160％到约4,000％的增加、约160％到约3,000％的增加、约160％到约2,000％的增加、约160％到约1,000％的增加、约160％到约800％的增加、约160％到约600％的增加、约160％到约500％的增加、约160％到约400％的增加、约160％到约300％的增加、约160％到约200％的增加、约160％到约180％的增加、约180％到约5,000％的增加、约180％到约4,000％的增加、约180％到约3,000％的增加、约180％到约2,000％的增加、约180％到约1,000％的增加、约180％到约800％的增加、约180％到约600％的增加、约180％到约500％的增加、约180％到约400％的增加、约180％到约300％的增加、约180％到约200％的增加、约200％到约5,000％的增加、约200％到约4,000％的增加、约200％到约3,000％的增加、约200％到约2,000％的增加、约200％到约1,000％的增加、约200％到约800％的增加、约200％到约600％的增加、约200％到约500％的增加、约200％到约400％的增加、约200％到约300％的增加、约300％到约5,000％的增加、约300％到约4,000％的增加、约300％到约3,000％的增加、约300％到约2,000％的增加、约300％到约1,000％的增加、约300％到约800％的增加、约300％到约600％的增加、约300％到约500％的增加、约300％到约400％的增加、约400％到约5,000％的增加、约400％到约4,000％的增加、约400％到约3,000％的增加、约400％到约2,000％的增加、约400％到约1,000％的增加、约400％到约800％的增加、约400％到约600％的增加、约400％到约500％的增加、约500％到约5,000％的增加、约500％到约4,000％的增加、约500％到约3,000％的增加、约500％到约2,000％的增加、约500％到约1,000％的增加、约500％到约800％的增加、约500％到约600％的增加、约600％到约5,000％的增加、约600％到约4,000％的增加、约600％到约3,000％的增加、约600％到约2,000％的增加、约600％到约1,000％的增加、约600％到约800％的增加、约800％到约5,000％的增加、约800％到约4,000％的增加、约800％到约3,000％的增加、约800％到约2,000％的增加、约800％到约1,000％的增加、约1,000％到约5,000％的增加、约1,000％到约4,000％的增加、约1,000％到约3,000％的增加、约1,000％到约2,000％的增加、约2,000％到约5,000％的增加、约2,000％到约4,000％的增加、约2,000％到约3,000％的增加、约3,000％到约5,000％的增加、约3,000％到约4,000％的增加或约4,000％到约5,000％的增加。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，与在使NK细胞与本文所述的任何示例性第一多链嵌合多肽接触的步骤之前的NK细胞的数量相比，所述方法导致活NK细胞的数量扩增例如约5倍到约5,000倍、约5倍到约4,500倍、约5倍到约4,000倍、约5倍到约3,500倍、约5倍到约3,000倍、约5倍到约2,500倍、约5倍到约2,000倍、约5倍到约1,500倍、约5倍到约1,000倍、约5倍到约800倍、约5倍到约600倍、约5倍到约500倍、约5倍到约450倍、约5倍到约400倍、约5倍到约350倍、约5倍到约300倍、约5倍到约250倍、约5倍到约200倍、约5倍到约150倍、约5倍到约100倍、约5倍到约80倍、约5倍到约60倍、约5倍到约40倍、约5倍到约20倍、约5倍到约10倍、约10倍到约5,000倍、约10倍到约4,500倍、约10倍到约4,000倍、约10倍到约3,500倍、约10倍到约3,000倍、约10倍到约2,500倍、约10倍到约2,000倍、约10倍到约1,500倍、约10倍到约1,000倍、约10倍到约800倍、约10倍到约600倍、约10倍到约500倍、约10倍到约450倍、约10倍到约400倍、约10倍到约350倍、约10倍到约300倍、约10倍到约250倍、约10倍到约200倍、约10倍到约150倍、约10倍到约100倍、约10倍到约80倍、约10倍到约60倍、约10倍到约40倍、约10倍到约20倍、约20倍到约5,000倍、约20倍到约4,500倍、约20倍到约4,000倍、约20倍到约3,500倍、约20倍到约3,000倍、约20倍到约2,500倍、约20倍到约2,000倍、约20倍到约1,500倍、约20倍到约1,000倍、约20倍到约800倍、约20倍到约600倍、约20倍到约500倍、约20倍到约450倍、约20倍到约400倍、约20倍到约350倍、约20倍到约300倍、约20倍到约250倍、约20倍到约200倍、约20倍到约150倍、约20倍到约100倍、约20倍到约80倍、约20倍到约60倍、约20倍到约40倍、约40倍到约5,000倍、约40倍到约4,500倍、约40倍到约4,000倍、约40倍到约3,500倍、约40倍到约3,000倍、约40倍到约2,500倍、约40倍到约2,000倍、约40倍到约1,500倍、约40倍到约1,000倍、约40倍到约800倍、约40倍到约600倍、约40倍到约500倍、约40倍到约450倍、约40倍到约400倍、约40倍到约350倍、约40倍到约300倍、约40倍到约250倍、约40倍到约200倍、约40倍到约150倍、约40倍到约100倍、约40倍到约80倍、约40倍到约60倍、约60倍到约5,000倍、约60倍到约4,500倍、约60倍到约4,000倍、约60倍到约3,500倍、约60倍到约3,000倍、约60倍到约2,500倍、约60倍到约2,000倍、约60倍到约1,500倍、约60倍到约1,000倍、约60倍到约800倍、约60倍到约600倍、约60倍到约500倍、约60倍到约450倍、约60倍到约400倍、约60倍到约350倍、约60倍到约300倍、约60倍到约250倍、约60倍到约200倍、约60倍到约150倍、约60倍到约100倍、约60倍到约80倍、约80倍到约5,000倍、约80倍到约4,500倍、约80倍到约4,000倍、约80倍到约3,500倍、约80倍到约3,000倍、约80倍到约2,500倍、约80倍到约2,000倍、约80倍到约1,500倍、约80倍到约1,000倍、约80倍到约800倍、约80倍到约600倍、约80倍到约500倍、约80倍到约450倍、约80倍到约400倍、约80倍到约350倍、约80倍到约300倍、约80倍到约250倍、约80倍到约200倍、约80倍到约150倍、约80倍到约100倍、约100倍到约5,000倍、约100倍到约4,500倍、约100倍到约4,000倍、约100倍到约3,500倍、约100倍到约3,000倍、约100倍到约2,500倍、约100倍到约2,000倍、约100倍到约1,500倍、约100倍到约1,000倍、约100倍到约800倍、约100倍到约600倍、约100倍到约500倍、约100倍到约450倍、约100倍到约400倍、约100倍到约350倍、约100倍到约300倍、约100倍到约250倍、约100倍到约200倍、约100倍到约150倍、约150倍到约5,000倍、约150倍到约4,500倍、约150倍到约4,000倍、约150倍到约3,500倍、约150倍到约3,000倍、约150倍到约2,500倍、约150倍到约2,000倍、约150倍到约1,500倍、约150倍到约1,000倍、约150倍到约800倍、约150倍到约600倍、约150倍到约500倍、约150倍到约450倍、约150倍到约400倍、约150倍到约350倍、约150倍到约300倍、约150倍到约250倍、约150倍到约200倍、约200倍到约5,000倍、约200倍到约4,500倍、约200倍到约4,000倍、约200倍到约3,500倍、约200倍到约3,000倍、约200倍到约2,500倍、约200倍到约2,000倍、约200倍到约1,500倍、约200倍到约1,000倍、约200倍到约800倍、约200倍到约600倍、约200倍到约500倍、约200倍到约450倍、约200倍到约400倍、约200倍到约350倍、约200倍到约300倍、约200倍到约250倍、约250倍到约5,000倍、约250倍到约4,500倍、约250倍到约4,000倍、约250倍到约3,500倍、约250倍到约3,000倍、约250倍到约2,500倍、约250倍到约2,000倍、约250倍到约1,500倍、约250倍到约1,000倍、约250倍到约800倍、约250倍到约600倍、约250倍到约500倍、约250倍到约450倍、约250倍到约400倍、约250倍到约350倍、约250倍到约300倍、约300倍到约5,000倍、约300倍到约4,500倍、约300倍到约4,000倍、约300倍到约3,500倍、约300倍到约3,000倍、约300倍到约2,500倍、约300倍到约2,000倍、约300倍到约1,500倍、约300倍到约1,000倍、约300倍到约800倍、约300倍到约600倍、约300倍到约500倍、约300倍到约450倍、约300倍到约400倍、约300倍到约350倍、约350倍到约5,000倍、约350倍到约4,500倍、约350倍到约4,000倍、约350倍到约3,500倍、约350倍到约3,000倍、约350倍到约2,500倍、约350倍到约2,000倍、约350倍到约1,500倍、约350倍到约1,000倍、约350倍到约800倍、约350倍到约600倍、约350倍到约500倍、约350倍到约450倍、约350倍到约400倍、约400倍到约5,000倍、约400倍到约4,500倍、约400倍到约4,000倍、约400倍到约3,500倍、约400倍到约3,000倍、约400倍到约2,500倍、约400倍到约2,000倍、约400倍到约1,500倍、约400倍到约1,000倍、约400倍到约800倍、约400倍到约600倍、约400倍到约500倍、约400倍到约450倍、约450倍到约5,000倍、约450倍到约4,500倍、约450倍到约4,000倍、约450倍到约3,500倍、约450倍到约3,000倍、约450倍到约2,500倍、约450倍到约2,000倍、约450倍到约1,500倍、约450倍到约1,000倍、约450倍到约800倍、约450倍到约600倍、约450倍到约500倍、约500倍到约5,000倍、约500倍到约4,500倍、约500倍到约4,000倍、约500倍到约3,500倍、约500倍到约3,000倍、约500倍到约2,500倍、约500倍到约2,000倍、约500倍到约1,500倍、约500倍到约1,000倍、约500倍到约800倍、约500倍到约600倍、约600倍到约5,000倍、约600倍到约4,500倍、约600倍到约4,000倍、约600倍到约3,500倍、约600倍到约3,000倍、约600倍到约2,500倍、约600倍到约2,000倍、约600倍到约1,500倍、约600倍到约1,000倍、约600倍到约800倍、约800倍到约5,000倍、约800倍到约4,500倍、约800倍到约4,000倍、约800倍到约3,500倍、约800倍到约3,000倍、约800倍到约2,500倍、约800倍到约2,000倍、约800倍到约1,500倍、约800倍到约1,000倍、约1,000倍到约5,000倍、约1,000倍到约4,500倍、约1,000倍到约4,000倍、约1,000倍到约3,500倍、约1,000倍到约3,000倍、约1,000倍到约2,500倍、约1,000倍到约2,000倍、约1,000倍到约1,500倍、约1,500倍到约5,000倍、约1,500倍到约4,500倍、约1,500倍到约4,000倍、约1,500倍到约3,500倍、约1,500倍到约3,000倍、约1,500倍到约2,500倍、约1,500倍到约2,000倍、约2,000倍到约5,000倍、约2,000倍到约4,500倍、约2,000倍到约4,000倍、约2,000倍到约3,500倍、约2,000倍到约3,000倍、约2,000倍到约2,500倍、约2,500倍到约5,000倍、约2,500倍到约4,500倍、约2,500倍到约4,000倍、约2,500倍到约3,500倍、约2,500倍到约3,000倍、约3,000倍到约5,000倍、约3,000倍到约4,500倍、约3,000倍到约4,000倍、约3,000倍到约3,500倍、约3,500倍到约5,000倍、约3,500倍到约4,500倍、约3,500倍到约4,000倍、约4,000倍到约5,000倍、约4,000倍到约4,500倍或约4,500倍到约5,000倍。
在一些实施例中，所述方法提供与未经处理的对照NK细胞相比具有改善的针对受试者的患病细胞的持久性和细胞毒性的NK细胞。
多链嵌合多肽
本文所述的方法包含使用两种不同的多链嵌合多肽。
本文提供的第一多链嵌合多肽包含：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含：第一靶结合结构域；可溶性组织因子结构域；和一对亲和结构域的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含：一对亲和结构域的第二结构域；和第二靶结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合，并且所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18受体或IL-12受体。
本文提供的第二多链嵌合多肽包含：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含：第一靶结合结构域、接头结构域、一对亲和结构域的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合，并且所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7受体或IL-21受体。
在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的总长度可以各自独立地为约50个氨基酸到约3000个氨基酸、约50个氨基酸到约2500个氨基酸、约50个氨基酸到约2000个氨基酸、约50个氨基酸到约1500个氨基酸、约50个氨基酸到约1000个氨基酸、约50个氨基酸到约950个氨基酸、约50个氨基酸到约900个氨基酸、约50个氨基酸到约850个氨基酸、约50个氨基酸到约800个氨基酸、约50个氨基酸到约750个氨基酸、约50个氨基酸到约700个氨基酸、约50个氨基酸到约650个氨基酸、约50个氨基酸到约600个氨基酸、约50个氨基酸到约550个氨基酸、约50个氨基酸到约500个氨基酸、约50个氨基酸到约480个氨基酸、约50个氨基酸到约460个氨基酸、约50个氨基酸到约440个氨基酸、约50个氨基酸到约420个氨基酸、约50个氨基酸到约400个氨基酸、约50个氨基酸到约380个氨基酸、约50个氨基酸到约360个氨基酸、约50个氨基酸到约340个氨基酸、约50个氨基酸到约320个氨基酸、约50个氨基酸到约300个氨基酸、约50个氨基酸到约280个氨基酸、约50个氨基酸到约260个氨基酸、约50个氨基酸到约240个氨基酸、约50个氨基酸到约220个氨基酸、约50个氨基酸到约200个氨基酸、约50个氨基酸到约150个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约100个氨基酸到约3000个氨基酸、约100个氨基酸到约2500个氨基酸、约100个氨基酸到约2000个氨基酸、约100个氨基酸到约1500个氨基酸、约100个氨基酸到约1000个氨基酸、约100个氨基酸到约950个氨基酸、约100个氨基酸到约900个氨基酸、约100个氨基酸到约850个氨基酸、约100个氨基酸到约800个氨基酸、约100个氨基酸到约750个氨基酸、约100个氨基酸到约700个氨基酸、约100个氨基酸到约650个氨基酸、约100个氨基酸到约600个氨基酸、约100个氨基酸到约550个氨基酸、约100个氨基酸到约500个氨基酸、约100个氨基酸到约480个氨基酸、约100个氨基酸到约460个氨基酸、约100个氨基酸到约440个氨基酸、约100个氨基酸到约420个氨基酸、约100个氨基酸到约400个氨基酸、约100个氨基酸到约380个氨基酸、约100个氨基酸到约360个氨基酸、约100个氨基酸到约340个氨基酸、约100个氨基酸到约320个氨基酸、约100个氨基酸到约300个氨基酸、约100个氨基酸到约280个氨基酸、约100个氨基酸到约260个氨基酸、约100个氨基酸到约240个氨基酸、约100个氨基酸到约220个氨基酸、约100个氨基酸到约200个氨基酸、约100个氨基酸到约150个氨基酸、约150个氨基酸到约3000个氨基酸、约150个氨基酸到约2500个氨基酸、约150个氨基酸到约2000个氨基酸、约150个氨基酸到约1500个氨基酸、约150个氨基酸到约1000个氨基酸、约150个氨基酸到约950个氨基酸、约150个氨基酸到约900个氨基酸、约150个氨基酸到约850个氨基酸、约150个氨基酸到约800个氨基酸、约150个氨基酸到约750个氨基酸、约150个氨基酸到约700个氨基酸、约150个氨基酸到约650个氨基酸、约150个氨基酸到约600个氨基酸、约150个氨基酸到约550个氨基酸、约150个氨基酸到约500个氨基酸、约150个氨基酸到约480个氨基酸、约150个氨基酸到约460个氨基酸、约150个氨基酸到约440个氨基酸、约150个氨基酸到约420个氨基酸、约150个氨基酸到约400个氨基酸、约150个氨基酸到约380个氨基酸、约150个氨基酸到约360个氨基酸、约150个氨基酸到约340个氨基酸、约150个氨基酸到约320个氨基酸、约150个氨基酸到约300个氨基酸、约150个氨基酸到约280个氨基酸、约150个氨基酸到约260个氨基酸、约150个氨基酸到约240个氨基酸、约150个氨基酸到约220个氨基酸、约150个氨基酸到约200个氨基酸、约200个氨基酸到约3000个氨基酸、约200个氨基酸到约2500个氨基酸、约200个氨基酸到约2000个氨基酸、约200个氨基酸到约1500个氨基酸、约200个氨基酸到约1000个氨基酸、约200个氨基酸到约950个氨基酸、约200个氨基酸到约900个氨基酸、约200个氨基酸到约850个氨基酸、约200个氨基酸到约800个氨基酸、约200个氨基酸到约750个氨基酸、约200个氨基酸到约700个氨基酸、约200个氨基酸到约650个氨基酸、约200个氨基酸到约600个氨基酸、约200个氨基酸到约550个氨基酸、约200个氨基酸到约500个氨基酸、约200个氨基酸到约480个氨基酸、约200个氨基酸到约460个氨基酸、约200个氨基酸到约440个氨基酸、约200个氨基酸到约420个氨基酸、约200个氨基酸到约400个氨基酸、约200个氨基酸到约380个氨基酸、约200个氨基酸到约360个氨基酸、约200个氨基酸到约340个氨基酸、约200个氨基酸到约320个氨基酸、约200个氨基酸到约300个氨基酸、约200个氨基酸到约280个氨基酸、约200个氨基酸到约260个氨基酸、约200个氨基酸到约240个氨基酸、约200个氨基酸到约220个氨基酸、约220个氨基酸到约3000个氨基酸、约220个氨基酸到约2500个氨基酸、约220个氨基酸到约2000个氨基酸、约220个氨基酸到约1500个氨基酸、约220个氨基酸到约1000个氨基酸、约220个氨基酸到约950个氨基酸、约220个氨基酸到约900个氨基酸、约220个氨基酸到约850个氨基酸、约220个氨基酸到约800个氨基酸、约220个氨基酸到约750个氨基酸、约220个氨基酸到约700个氨基酸、约220个氨基酸到约650个氨基酸、约220个氨基酸到约600个氨基酸、约220个氨基酸到约550个氨基酸、约220个氨基酸到约500个氨基酸、约220个氨基酸到约480个氨基酸、约220个氨基酸到约460个氨基酸、约220个氨基酸到约440个氨基酸、约220个氨基酸到约420个氨基酸、约220个氨基酸到约400个氨基酸、约220个氨基酸到约380个氨基酸、约220个氨基酸到约360个氨基酸、约220个氨基酸到约340个氨基酸、约220个氨基酸到约320个氨基酸、约220个氨基酸到约300个氨基酸、约220个氨基酸到约280个氨基酸、约220个氨基酸到约260个氨基酸、约220个氨基酸到约240个氨基酸、约240个氨基酸到约3000个氨基酸、约240个氨基酸到约2500个氨基酸、约240个氨基酸到约2000个氨基酸、约240个氨基酸到约1500个氨基酸、约240个氨基酸到约1000个氨基酸、约240个氨基酸到约950个氨基酸、约240个氨基酸到约900个氨基酸、约240个氨基酸到约850个氨基酸、约240个氨基酸到约800个氨基酸、约240个氨基酸到约750个氨基酸、约240个氨基酸到约700个氨基酸、约240个氨基酸到约650个氨基酸、约240个氨基酸到约600个氨基酸、约240个氨基酸到约550个氨基酸、约240个氨基酸到约500个氨基酸、约240个氨基酸到约480个氨基酸、约240个氨基酸到约460个氨基酸、约240个氨基酸到约440个氨基酸、约240个氨基酸到约420个氨基酸、约240个氨基酸到约400个氨基酸、约240个氨基酸到约380个氨基酸、约240个氨基酸到约360个氨基酸、约240个氨基酸到约340个氨基酸、约240个氨基酸到约320个氨基酸、约240个氨基酸到约300个氨基酸、约240个氨基酸到约280个氨基酸、约240个氨基酸到约260个氨基酸、约260个氨基酸到约3000个氨基酸、约260个氨基酸到约2500个氨基酸、约260个氨基酸到约2000个氨基酸、约260个氨基酸到约1500个氨基酸、约260个氨基酸到约1000个氨基酸、约260个氨基酸到约950个氨基酸、约260个氨基酸到约900个氨基酸、约260个氨基酸到约850个氨基酸、约260个氨基酸到约800个氨基酸、约260个氨基酸到约750个氨基酸、约260个氨基酸到约700个氨基酸、约260个氨基酸到约650个氨基酸、约260个氨基酸到约600个氨基酸、约260个氨基酸到约550个氨基酸、约260个氨基酸到约500个氨基酸、约260个氨基酸到约480个氨基酸、约260个氨基酸到约460个氨基酸、约260个氨基酸到约440个氨基酸、约260个氨基酸到约420个氨基酸、约260个氨基酸到约400个氨基酸、约260个氨基酸到约380个氨基酸、约260个氨基酸到约360个氨基酸、约260个氨基酸到约340个氨基酸、约260个氨基酸到约320个氨基酸、约260个氨基酸到约300个氨基酸、约260个氨基酸到约280个氨基酸、约280个氨基酸到约3000个氨基酸、约280个氨基酸到约2500个氨基酸、约280个氨基酸到约2000个氨基酸、约280个氨基酸到约1500个氨基酸、约280个氨基酸到约1000个氨基酸、约280个氨基酸到约950个氨基酸、约280个氨基酸到约900个氨基酸、约280个氨基酸到约850个氨基酸、约280个氨基酸到约800个氨基酸、约280个氨基酸到约750个氨基酸、约280个氨基酸到约700个氨基酸、约280个氨基酸到约650个氨基酸、约280个氨基酸到约600个氨基酸、约280个氨基酸到约550个氨基酸、约280个氨基酸到约500个氨基酸、约280个氨基酸到约480个氨基酸、约280个氨基酸到约460个氨基酸、约280个氨基酸到约440个氨基酸、约280个氨基酸到约420个氨基酸、约280个氨基酸到约400个氨基酸、约280个氨基酸到约380个氨基酸、约280个氨基酸到约360个氨基酸、约280个氨基酸到约340个氨基酸、约280个氨基酸到约320个氨基酸、约280个氨基酸到约300个氨基酸、约300个氨基酸到约3000个氨基酸、约300个氨基酸到约2500个氨基酸、约300个氨基酸到约2000个氨基酸、约300个氨基酸到约1500个氨基酸、约300个氨基酸到约1000个氨基酸、约300个氨基酸到约950个氨基酸、约300个氨基酸到约900个氨基酸、约300个氨基酸到约850个氨基酸、约300个氨基酸到约800个氨基酸、约300个氨基酸到约750个氨基酸、约300个氨基酸到约700个氨基酸、约300个氨基酸到约650个氨基酸、约300个氨基酸到约600个氨基酸、约300个氨基酸到约550个氨基酸、约300个氨基酸到约500个氨基酸、约300个氨基酸到约480个氨基酸、约300个氨基酸到约460个氨基酸、约300个氨基酸到约440个氨基酸、约300个氨基酸到约420个氨基酸、约300个氨基酸到约400个氨基酸、约300个氨基酸到约380个氨基酸、约300个氨基酸到约360个氨基酸、约300个氨基酸到约340个氨基酸、约300个氨基酸到约320个氨基酸、约320个氨基酸到约3000个氨基酸、约320个氨基酸到约2500个氨基酸、约320个氨基酸到约2000个氨基酸、约320个氨基酸到约1500个氨基酸、约320个氨基酸到约1000个氨基酸、约320个氨基酸到约950个氨基酸、约320个氨基酸到约900个氨基酸、约320个氨基酸到约850个氨基酸、约320个氨基酸到约800个氨基酸、约320个氨基酸到约750个氨基酸、约320个氨基酸到约700个氨基酸、约320个氨基酸到约650个氨基酸、约320个氨基酸到约600个氨基酸、约320个氨基酸到约550个氨基酸、约320个氨基酸到约500个氨基酸、约320个氨基酸到约480个氨基酸、约320个氨基酸到约460个氨基酸、约320个氨基酸到约440个氨基酸、约320个氨基酸到约420个氨基酸、约320个氨基酸到约400个氨基酸、约320个氨基酸到约380个氨基酸、约320个氨基酸到约360个氨基酸、约320个氨基酸到约340个氨基酸、约340个氨基酸到约3000个氨基酸、约340个氨基酸到约2500个氨基酸、约340个氨基酸到约2000个氨基酸、约340个氨基酸到约1500个氨基酸、约340个氨基酸到约1000个氨基酸、约340个氨基酸到约950个氨基酸、约340个氨基酸到约900个氨基酸、约340个氨基酸到约850个氨基酸、约340个氨基酸到约800个氨基酸、约340个氨基酸到约750个氨基酸、约340个氨基酸到约700个氨基酸、约340个氨基酸到约650个氨基酸、约340个氨基酸到约600个氨基酸、约340个氨基酸到约550个氨基酸、约340个氨基酸到约500个氨基酸、约340个氨基酸到约480个氨基酸、约340个氨基酸到约460个氨基酸、约340个氨基酸到约440个氨基酸、约340个氨基酸到约420个氨基酸、约340个氨基酸到约400个氨基酸、约340个氨基酸到约380个氨基酸、约340个氨基酸到约360个氨基酸、约360个氨基酸到约3000个氨基酸、约360个氨基酸到约2500个氨基酸、约360个氨基酸到约2000个氨基酸、约360个氨基酸到约1500个氨基酸、约360个氨基酸到约1000个氨基酸、约360个氨基酸到约950个氨基酸、约360个氨基酸到约900个氨基酸、约360个氨基酸到约850个氨基酸、约360个氨基酸到约800个氨基酸、约360个氨基酸到约750个氨基酸、约360个氨基酸到约700个氨基酸、约360个氨基酸到约650个氨基酸、约360个氨基酸到约600个氨基酸、约360个氨基酸到约550个氨基酸、约360个氨基酸到约500个氨基酸、约360个氨基酸到约480个氨基酸、约360个氨基酸到约460个氨基酸、约360个氨基酸到约440个氨基酸、约360个氨基酸到约420个氨基酸、约360个氨基酸到约400个氨基酸、约360个氨基酸到约380个氨基酸、约380个氨基酸到约3000个氨基酸、约380个氨基酸到约2500个氨基酸、约380个氨基酸到约2000个氨基酸、约380个氨基酸到约1500个氨基酸、约380个氨基酸到约1000个氨基酸、约380个氨基酸到约950个氨基酸、约380个氨基酸到约900个氨基酸、约380个氨基酸到约850个氨基酸、约380个氨基酸到约800个氨基酸、约380个氨基酸到约750个氨基酸、约380个氨基酸到约700个氨基酸、约380个氨基酸到约650个氨基酸、约380个氨基酸到约600个氨基酸、约380个氨基酸到约550个氨基酸、约380个氨基酸到约500个氨基酸、约380个氨基酸到约480个氨基酸、约380个氨基酸到约460个氨基酸、约380个氨基酸到约440个氨基酸、约380个氨基酸到约420个氨基酸、约380个氨基酸到约400个氨基酸、约400个氨基酸到约3000个氨基酸、约400个氨基酸到约2500个氨基酸、约400个氨基酸到约2000个氨基酸、约400个氨基酸到约1500个氨基酸、约400个氨基酸到约1000个氨基酸、约400个氨基酸到约950个氨基酸、约400个氨基酸到约900个氨基酸、约400个氨基酸到约850个氨基酸、约400个氨基酸到约800个氨基酸、约400个氨基酸到约750个氨基酸、约400个氨基酸到约700个氨基酸、约400个氨基酸到约650个氨基酸、约400个氨基酸到约600个氨基酸、约400个氨基酸到约550个氨基酸、约400个氨基酸到约500个氨基酸、约400个氨基酸到约480个氨基酸、约400个氨基酸到约460个氨基酸、约400个氨基酸到约440个氨基酸、约400个氨基酸到约420个氨基酸、约420个氨基酸到约3000个氨基酸、约420个氨基酸到约2500个氨基酸、约420个氨基酸到约2000个氨基酸、约420个氨基酸到约1500个氨基酸、约420个氨基酸到约1000个氨基酸、约420个氨基酸到约950个氨基酸、约420个氨基酸到约900个氨基酸、约420个氨基酸到约850个氨基酸、约420个氨基酸到约800个氨基酸、约420个氨基酸到约750个氨基酸、约420个氨基酸到约700个氨基酸、约420个氨基酸到约650个氨基酸、约420个氨基酸到约600个氨基酸、约420个氨基酸到约550个氨基酸、约420个氨基酸到约500个氨基酸、约420个氨基酸到约480个氨基酸、约420个氨基酸到约460个氨基酸、约420个氨基酸到约440个氨基酸、约440个氨基酸到约3000个氨基酸、约440个氨基酸到约2500个氨基酸、约440个氨基酸到约2000个氨基酸、约440个氨基酸到约1500个氨基酸、约440个氨基酸到约1000个氨基酸、约440个氨基酸到约950个氨基酸、约440个氨基酸到约900个氨基酸、约440个氨基酸到约850个氨基酸、约440个氨基酸到约800个氨基酸、约440个氨基酸到约750个氨基酸、约440个氨基酸到约700个氨基酸、约440个氨基酸到约650个氨基酸、约440个氨基酸到约600个氨基酸、约440个氨基酸到约550个氨基酸、约440个氨基酸到约500个氨基酸、约440个氨基酸到约480个氨基酸、约440个氨基酸到约460个氨基酸、约460个氨基酸到约3000个氨基酸、约460个氨基酸到约2500个氨基酸、约460个氨基酸到约2000个氨基酸、约460个氨基酸到约1500个氨基酸、约460个氨基酸到约1000个氨基酸、约460个氨基酸到约950个氨基酸、约460个氨基酸到约900个氨基酸、约460个氨基酸到约850个氨基酸、约460个氨基酸到约800个氨基酸、约460个氨基酸到约750个氨基酸、约460个氨基酸到约700个氨基酸、约460个氨基酸到约650个氨基酸、约460个氨基酸到约600个氨基酸、约460个氨基酸到约550个氨基酸、约460个氨基酸到约500个氨基酸、约460个氨基酸到约480个氨基酸、约480个氨基酸到约3000个氨基酸、约480个氨基酸到约2500个氨基酸、约480个氨基酸到约2000个氨基酸、约480个氨基酸到约1500个氨基酸、约480个氨基酸到约1000个氨基酸、约480个氨基酸到约950个氨基酸、约480个氨基酸到约900个氨基酸、约480个氨基酸到约850个氨基酸、约480个氨基酸到约800个氨基酸、约480个氨基酸到约750个氨基酸、约480个氨基酸到约700个氨基酸、约480个氨基酸到约650个氨基酸、约480个氨基酸到约600个氨基酸、约480个氨基酸到约550个氨基酸、约480个氨基酸到约500个氨基酸、约500个氨基酸到约3000个氨基酸、约500个氨基酸到约2500个氨基酸、约500个氨基酸到约2000个氨基酸、约500个氨基酸到约1500个氨基酸、约500个氨基酸到约1000个氨基酸、约500个氨基酸到约950个氨基酸、约500个氨基酸到约900个氨基酸、约500个氨基酸到约850个氨基酸、约500个氨基酸到约800个氨基酸、约500个氨基酸到约750个氨基酸、约500个氨基酸到约700个氨基酸、约500个氨基酸到约650个氨基酸、约500个氨基酸到约600个氨基酸、约500个氨基酸到约550个氨基酸、约550个氨基酸到约3000个氨基酸、约550个氨基酸到约2500个氨基酸、约550个氨基酸到约2000个氨基酸、约550个氨基酸到约1500个氨基酸、约550个氨基酸到约1000个氨基酸、约550个氨基酸到约950个氨基酸、约550个氨基酸到约900个氨基酸、约550个氨基酸到约850个氨基酸、约550个氨基酸到约800个氨基酸、约550个氨基酸到约750个氨基酸、约550个氨基酸到约700个氨基酸、约550个氨基酸到约650个氨基酸、约550个氨基酸到约600个氨基酸、约600个氨基酸到约3000个氨基酸、约600个氨基酸到约2500个氨基酸、约600个氨基酸到约2000个氨基酸、约600个氨基酸到约1500个氨基酸、约600个氨基酸到约1000个氨基酸、约600个氨基酸到约950个氨基酸、约600个氨基酸到约900个氨基酸、约600个氨基酸到约850个氨基酸、约600个氨基酸到约800个氨基酸、约600个氨基酸到约750个氨基酸、约600个氨基酸到约700个氨基酸、约600个氨基酸到约650个氨基酸、约650个氨基酸到约3000个氨基酸、约650个氨基酸到约2500个氨基酸、约650个氨基酸到约2000个氨基酸、约650个氨基酸到约1500个氨基酸、约650个氨基酸到约1000个氨基酸、约650个氨基酸到约950个氨基酸、约650个氨基酸到约900个氨基酸、约650个氨基酸到约850个氨基酸、约650个氨基酸到约800个氨基酸、约650个氨基酸到约750个氨基酸、约650个氨基酸到约700个氨基酸、约700个氨基酸到约3000个氨基酸、约700个氨基酸到约2500个氨基酸、约700个氨基酸到约2000个氨基酸、约700个氨基酸到约1500个氨基酸、约700个氨基酸到约1000个氨基酸、约700个氨基酸到约950个氨基酸、约700个氨基酸到约900个氨基酸、约700个氨基酸到约850个氨基酸、约700个氨基酸到约800个氨基酸、约700个氨基酸到约750个氨基酸、约750个氨基酸到约3000个氨基酸、约750个氨基酸到约2500个氨基酸、约750个氨基酸到约2000个氨基酸、约750个氨基酸到约1500个氨基酸、约750个氨基酸到约1000个氨基酸、约750个氨基酸到约950个氨基酸、约750个氨基酸到约900个氨基酸、约750个氨基酸到约850个氨基酸、约750个氨基酸到约800个氨基酸、约800个氨基酸到约3000个氨基酸、约800个氨基酸到约2500个氨基酸、约800个氨基酸到约2000个氨基酸、约800个氨基酸到约1500个氨基酸、约800个氨基酸到约1000个氨基酸、约800个氨基酸到约950个氨基酸、约800个氨基酸到约900个氨基酸、约800个氨基酸到约850个氨基酸、约850个氨基酸到约3000个氨基酸、约850个氨基酸到约2500个氨基酸、约850个氨基酸到约2000个氨基酸、约850个氨基酸到约1500个氨基酸、约850个氨基酸到约1000个氨基酸、约850个氨基酸到约950个氨基酸、约850个氨基酸到约900个氨基酸、约900个氨基酸到约3000个氨基酸、约900个氨基酸到约2500个氨基酸、约900个氨基酸到约2000个氨基酸、约900个氨基酸到约1500个氨基酸、约900个氨基酸到约1000个氨基酸、约900个氨基酸到约950个氨基酸、约950个氨基酸到约3000个氨基酸、约950个氨基酸到约2500个氨基酸、约950个氨基酸到约2000个氨基酸、约950个氨基酸到约1500个氨基酸、约950个氨基酸到约1000个氨基酸、约1000个氨基酸到约3000个氨基酸、约1000个氨基酸到约2500个氨基酸、约1000个氨基酸到约2000个氨基酸、约1000个氨基酸到约1500个氨基酸、约1500个氨基酸到约3000个氨基酸、约1500个氨基酸到约2500个氨基酸、约1500个氨基酸到约2000个氨基酸、约2000个氨基酸到约3000个氨基酸、约2000个氨基酸到约2500个氨基酸或约2500个氨基酸到约3000个氨基酸。本文提供的示例性第一多链嵌合多肽的图解描绘于图1-4中。示例性第二多链嵌合多肽的图解描绘于图5-12中。
在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域(例如，本文所述的任何第一靶结合结构域)和接头结构域(例如，本文所述的任何示例性接头结构域)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中的第一靶结合结构域(例如，本文所述的任何示例性第一靶结合结构域)和接头结构域(例如，本文所述的任何示例性接头结构域)之间的接头序列(本文所述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。
在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实施例中，接头结构域(例如，本文所述的任何示例性接头结构域)和亲和结构域对的第一结构域(例如，本文所述的任何示例性亲和结构域对的任何示例性第一结构域)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中的接头结构域(例如，本文所述的任何示例性接头结构域)和亲和结构域对的第一结构域(例如，本文所述的任何示例性亲和结构域对的任何示例性第一结构域)之间的接头序列(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。
在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实施例中，亲和结构域对的第二结构域(例如，本文所述的任何示例性亲和结构域对的任何示例性第二结构域)和第二靶结合结构域(例如，本文所述的任何示例性第二靶结合结构域)在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中的亲和结构域对的第二结构域(例如，本文所述的任何示例性亲和结构域对的任何示例性第二结构域)和第二靶结合结构域(例如，本文所述的任何示例性第二靶结合结构域)之间的接头序列(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。
组织因子
人组织因子是263个氨基酸的跨膜蛋白，其含有三个结构域：(1)219个氨基酸的N端细胞外结构域(残基1-219)；(2)22个氨基酸的跨膜结构域(残基220-242)；和(3)21个氨基酸的胞质C端尾(残基242-263)((UniProtKB标识号：P13726)。胞质尾在Ser253和Ser258处含有两个磷酸化位点，并且在Cys245处含有一个S-棕榈酰化位点。没有发现胞质结构域的缺失或突变影响组织因子凝血活性。组织因子在蛋白质的细胞内结构域中在Cys245处具有一个S-棕榈酰化位点。Cys245位于细胞内结构域的氨基酸端，并且靠近膜表面。组织因子跨膜结构域由单跨度的α-螺旋构成。
由两个纤连蛋白III型结构域构成的组织因子的细胞外结构域通过六氨基酸接头与跨膜结构域连接。该接头提供构象灵活性以将组织细胞外结构域与其跨膜结构域和细胞质结构域分离。每个组织因子纤连蛋白III型模块均由两个重叠的β折叠构成，其中顶层折叠结构域含有三个反平行的β链，而底层折叠含有四个β链。β链通过β环在链βA和βB、βC和βD以及βE和βF之间连接，它们在两个模块中均构象保守。存在连接β链的三个短的α螺旋段。组织的一个独特特征是β10链和β11链之间的17个氨基酸的β-发夹，其不是纤连蛋白超家族的常见元素。N端结构域还在β6F与β7G之间含有一个12个氨基酸的环，所述环不存在于C端结构域，并且是组织因子特有的。这种纤连蛋白III型结构域结构是免疫球蛋白样家族蛋白质折叠的特征，并且在广泛多种细胞外蛋白中是保守的。
一旦酶原FVII与组织结合形成活性组织因子-FVIIa复合物，就可通过有限的蛋白水解将其迅速转化成FVIIa。以大约0.1nM(血浆FVII的1％)的浓度作为酶循环的FVIIa也可以直接结合到组织因子。组织和FVIIa在组织因子-FVIIa复合物上的变构相互作用大大增加了FVIIa的酶活性：小的显色肽基底物的水解速率增加了大约20到100倍，而天然大分子底物FIX和FX的活化速率增加了近一百万倍。与结合到组织因子时FVIIa活性位点的变构活化一致，磷脂双层上组织-FVIIa复合物的形成(即，在膜表面上暴露磷脂酰-L-丝氨酸时)将FIX或FX活化的速率，以Ca2+依赖的方式，额外增加了1,000倍。相对于游离FVIIa，组织-FVIIa-磷脂复合物对FX活化的大约百万倍的总体增加是凝血级联的关键调节点。
FVII是约50kDa的单链多肽，由406个氨基酸残基组成，具有N端富含γ-羧基谷氨酸(GLA)的结构域、两个表皮生长因子样结构域(EGF1和EFG2)和C端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII通过Ile-154-Arg152键在EGF2与蛋白酶结构域之间的短接头区中的特异性蛋白水解切割而被活化为FVIIa。这种切割引起轻链和重链通过Cys135和Cys262的单个二硫键固定在一起。FVIIa通过其N端GLA结构域以Ca2+依赖性方式结合磷脂膜。GLA结构域的C端紧邻芳香族堆叠和两个EGF结构域。芳香族堆叠将GLA连接到结合单个Ca2+离子的EGF1结构域。占用这一Ca2+结合位点会增加FVIIa酰胺分解活性和组织因子缔合。催化三联体由His193、Asp242和Ser344组成，并且FVIIa蛋白酶结构域内单个Ca2+离子的结合对其催化活性至关重要。FVII对FVIIa的蛋白水解活化释放了Ile153处新形成的氨基端，使其向后折叠并且插入活化袋中，从而与Asp343的羧酸盐形成盐桥，以生成氧阴离子孔。这一盐桥的形成对于FVIIa活性至关重要。然而，在蛋白水解活化后，游离的FVIIa中不会发生氧阴离子孔的形成。结果，FVIIa以酶原样状态循环，血浆蛋白酶抑制剂不能很好识别所述状态，从而使其以大约90分钟的半衰期循环。
FVIIa活性位点在膜表面上方的组织因子介导的定位对于FVIIa朝向同源底物很重要。游离FVIIa在结合到膜上时采用稳定扩展结构，其活性位点定位在膜表面上方约
Figure BDA0003508369120000451
FVIIa结合到组织因子时，FVa活性位点重新定位于更接近膜的约
Figure BDA0003508369120000452
处。这种调节可帮助FVIIa催化三联体与靶标底物切割位点适当对齐。使用无GLA结构域的FVIIa，已显示活性位点仍位于膜上方相似的距离，这证明即使在没有FVIIa-膜相互作用的情况下，组织因子也能够完全支持FVIIa活性位点定位。额外的数据显示，只要组织因子细胞外结构域以某种方式系栓到膜表面，组织因子就支持完全FVIIa蛋白水解活性。然而，将FVIIa的活性位点提高到膜表面上方大于
Figure BDA0003508369120000453
会大大降低组织因子-FVIIa复合物活化FX的能力，但不会降低组织因子-FVIIa的酰胺分解活性。
丙氨酸扫描诱变已被用于评定组织因子细胞外结构域中特定氨基酸侧链对与FVIIa相互作用的作用(Gibbs等人,《生物化学(Biochemistry)》33(47):14003-14010,1994；Schullek等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》269(30):19399-19403,1994)。丙氨酸取代鉴别出有限数量的残基位置，在这些位置处，丙氨酸置换引起对FVIIa结合的亲和力降低5到10倍。发现这些残基侧链中的大多数在晶体结构中充分暴露于溶剂，与大分子配体相互作用一致。FVIIa配体结合位点位于两个模块之间边界处的宽广区上。在C模块中，位于突出的B-C环上的残基Arg135和Phe140提供与FVIIa的独立接触。Leu133位于手指状结构的基底部，并且挤入两个模块之间的裂缝中。这提供由Lys20、Thr60、Asp58和Ile22组成的重要结合残基的主要簇的连续性。Thr60仅部分暴露于溶剂，并且可能起局部结构作用，而不是与配体显著接触。结合位点延伸到模块间角的凹面，其涉及Glu24和Gln110，并且可能涉及更远的残基Val207。结合区从Asp58延伸到由Lys48、Lys46、Gln37、Asp44和Trp45形成的凸表面区。Trp45和Asp44不会独立地与FVIIa相互作用，这表明Trp45位置处的突变效应可能反映这一侧链对邻近Asp44和Gln37侧链的局部堆积的结构重要性。相互作用区进一步包含两个表面暴露的芳香族残基Phe76和Tyr78，其在N模块中形成疏水簇的一部分。
组织因子-FVIIa的已知生理底物是FVII、FIX和FX以及某些蛋白酶活化的受体。突变分析已鉴别出许多残基，当突变时，所述残基支持对小肽基底物的完全FVIIa酰胺分解活性，但缺少支持大分子底物(即，FVII、FIX和FX)活化的能力(Ruf等人,《生物化学杂志》267(31):22206-22210,1992；Ruf等人,《生物化学杂志》267(9):6375-6381,1992；Huang等人,《生物化学杂志》271(36):21752-21757,1996；Kirchhofer等人,《生物化学》39(25):7380-7387,2000)。已显示在残基159-165处的组织因子环区和在这一柔性环中或附近的残基对于组织因子-FVIIa复合物的蛋白水解活性至关重要。这定义了提出的组织因子的底物结合位点外区，所述区与FVIIa活性位点相距甚远。甘氨酸残基被稍大的残基丙氨酸取代会大大损害组织因子-FVIIa的蛋白水解活性。这表明甘氨酸提供的柔性对于用于组织因子大分子底物识别的残基159-165的环至关重要。
还证明了残基Lys165和Lys166对于底物识别和结合很重要。这些残基中的任何一个突变为丙氨酸均会引起组织因子辅助因子功能的显著降低。在大多数组织因子-FVIIa结构中，Lys165和Lys166彼此背对，Lys165指向FVIIa，而Lys166指向晶体结构中的底物结合位点外区。FVIIa的Lys165和Gla35之间的推定盐桥形成将支持组织因子与FVIIa的GLA结构域相互作用调节底物识别的观点。这些结果表明，组织因子胞外结构域的C端部分直接与FIX和FX的GLA结构域、可能的邻近EGF1结构域相互作用，并且FVIIa GLA结构域的存在可以直接或间接调节这些相互作用。
示例性接头结构域和IgG1抗体构建体
在本文所述的任何方法、组合物或试剂盒的一些实例中，第二多链嵌合多肽中的接头结构域可以是或包含由同源IgG1抗体(例如，单克隆抗体)识别的任何抗原。IgG1抗体与抗体的其它IgG类别的区别在于其恒定区，具体地说，铰链区和上部CH2结构域(参见例如Vadarsson等人,“IgG子类和同种异型：从结构到效应功能(IgG Subclasses andAllotypes:From Structure to Effector Functions)”,《免疫学前沿(FrontImmunol.)》,5,章节520,2014)。人IgG1是唯一已知结合到人CD16a并活化人CD16a的信号传导的IgG子类。
在本文提供的第二多链嵌合多肽中可以使用多种接头结构域中的任一种。在某些实施例中，接头结构域由抗体(例如，IgG1抗体)或抗体片段识别。在一些实施例中，接头结构域是由同源抗κ轻链IgG1抗体识别的抗体κ轻链。在一些实施例中，接头结构域是由同源抗λ轻链人IgG1抗体识别的抗体λ轻链。多个κ轻链和λ轻链是本领域已知的(参见例如Smith等人,“抗原性质和复杂度影响人抗体轻链使用和特异性(Antigen Nature andComplexity Influence Human Antibody Light Chain Usage and Specificity)”,《疫苗(Vaccine)》,34(25):2813-2820,2016)。在一些实施例中，接头结构域是或包括由同源人IgG1抗体(例如，单克隆抗体)识别的人多肽(例如，抗体的人κ轻链或抗体的人λ轻链)。在一些实施例中，同源人IgG1抗体包含至少两个抗原结合结构域，并且每个抗原结合结构域特异性结合到接头结构域。在一些实施例中，同源人IgG1抗体包含至少两个抗原结合结构域，并且只有抗原结合结构域的一个子集(例如，一个抗原结合结构域)特异性结合到第二多链嵌合多肽中的接头结构域。在一些实施例中，接头结构域可以是本文所述的任何可溶性组织因子结构域。
在本文所述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是IgG1抗体(例如，特异性结合到接头结构域的单克隆或多克隆IgG1抗体)。在本文所述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是包含IgG1 Fc区(例如，人IgG1Fc区)并且特异性结合到第二多链嵌合多肽中的接头结构域的抗体或抗体片段。如本领域已知，IgG1 Fc区结合到CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)并且诱导其细胞内信号传导。在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是单链或多链多肽，其包含能够特异性结合到CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)并且能够诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导的Fc区，并且特异性结合到接头结构域。在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是包含Fc区的单链或多链多肽，并且特异性结合到接头结构域，所述Fc区包含与野生型IgG1 Fc结构域(例如，野生型人IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO:1)具有至少80％同一性(例如，至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)的序列并且能够特异性结合到CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)，并且能够诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导。在本文所述的任何方法、组合物或试剂盒的一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是抗体或抗体片段，其特异性结合到接头结构域并且包含非IgG1 Fc区(例如，IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述非IgG1Fc区已经过改变(例如，通过取代野生型非IgG1 Fc区中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸)，使得非IgG1 Fc区能够结合到CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)并诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导。在本文所述的任何方法、组合物或试剂盒的一些实施例中，IgG1抗体构建体特异性结合到第二多链嵌合多肽中的接头结构域并且包含非人Fc区(例如，来自非人抗体的Fc区)，所述非人Fc区已经过改变(例如，通过取代野生型非人Fc区中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸)，使得非人Fc区能够结合到人CD16a(人FcRγIII)并诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导。
野生型人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:1)
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
野生型人IgG2 Fc区(SEQ ID NO:2)
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
野生型人IgG3 Fc区(SEQ ID NO:3)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
野生型人IgG4 Fc区(SEQ ID NO:4)
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
在一些实施例中，接头结构域的总长度可以为约20个氨基酸到约220个氨基酸、约20个氨基酸到约215个氨基酸、约20个氨基酸到约210个氨基酸、约20个氨基酸到约205个氨基酸、约20个氨基酸到约200个氨基酸、约20个氨基酸到约195个氨基酸、约20个氨基酸到约190个氨基酸、约20个氨基酸到约185个氨基酸、约20个氨基酸到约180个氨基酸、约20个氨基酸到约175个氨基酸、约20个氨基酸到约170个氨基酸、约20个氨基酸到约165个氨基酸、约20个氨基酸到约160个氨基酸、约20个氨基酸到约155个氨基酸、约20个氨基酸到约150个氨基酸、约20个氨基酸到约145个氨基酸、约20个氨基酸到约140个氨基酸、约20个氨基酸到约135个氨基酸、约20个氨基酸到约130个氨基酸、约20个氨基酸到约125个氨基酸、约20个氨基酸到约120个氨基酸、约20个氨基酸到约115个氨基酸、约20个氨基酸到约110个氨基酸、约20个氨基酸到约105个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约95个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约85个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约75个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约220个氨基酸、约30个氨基酸到约215个氨基酸、约30个氨基酸到约210个氨基酸、约30个氨基酸到约205个氨基酸、约30个氨基酸到约200个氨基酸、约30个氨基酸到约195个氨基酸、约30个氨基酸到约190个氨基酸、约30个氨基酸到约185个氨基酸、约30个氨基酸到约180个氨基酸、约30个氨基酸到约175个氨基酸、约30个氨基酸到约170个氨基酸、约30个氨基酸到约165个氨基酸、约30个氨基酸到约160个氨基酸、约30个氨基酸到约155个氨基酸、约30个氨基酸到约150个氨基酸、约30个氨基酸到约145个氨基酸、约30个氨基酸到约140个氨基酸、约30个氨基酸到约135个氨基酸、约30个氨基酸到约130个氨基酸、约30个氨基酸到约125个氨基酸、约30个氨基酸到约120个氨基酸、约30个氨基酸到约115个氨基酸、约30个氨基酸到约110个氨基酸、约30个氨基酸到约105个氨基酸、约30个氨基酸到约100个氨基酸、约30个氨基酸到约95个氨基酸、约30个氨基酸到约90个氨基酸、约30个氨基酸到约85个氨基酸、约30个氨基酸到约80个氨基酸、约30个氨基酸到约75个氨基酸、约30个氨基酸到约70个氨基酸、约30个氨基酸到约60个氨基酸、约30个氨基酸到约50个氨基酸、约30个氨基酸到约40个氨基酸、约40个氨基酸到约220个氨基酸、约40个氨基酸到约215个氨基酸、约40个氨基酸到约210个氨基酸、约40个氨基酸到约205个氨基酸、约40个氨基酸到约200个氨基酸、约40个氨基酸到约195个氨基酸、约40个氨基酸到约190个氨基酸、约40个氨基酸到约185个氨基酸、约40个氨基酸到约180个氨基酸、约40个氨基酸到约175个氨基酸、约40个氨基酸到约170个氨基酸、约40个氨基酸到约165个氨基酸、约40个氨基酸到约160个氨基酸、约40个氨基酸到约155个氨基酸、约40个氨基酸到约150个氨基酸、约40个氨基酸到约145个氨基酸、约40个氨基酸到约140个氨基酸、约40个氨基酸到约135个氨基酸、约40个氨基酸到约130个氨基酸、约40个氨基酸到约125个氨基酸、约40个氨基酸到约120个氨基酸、约40个氨基酸到约115个氨基酸、约40个氨基酸到约110个氨基酸、约40个氨基酸到约105个氨基酸、约40个氨基酸到约100个氨基酸、约40个氨基酸到约95个氨基酸、约40个氨基酸到约90个氨基酸、约40个氨基酸到约85个氨基酸、约40个氨基酸到约80个氨基酸、约40个氨基酸到约75个氨基酸、约40个氨基酸到约70个氨基酸、约40个氨基酸到约60个氨基酸、约40个氨基酸到约50个氨基酸、约50个氨基酸到约220个氨基酸、约50个氨基酸到约215个氨基酸、约50个氨基酸到约210个氨基酸、约50个氨基酸到约205个氨基酸、约50个氨基酸到约200个氨基酸、约50个氨基酸到约195个氨基酸、约50个氨基酸到约190个氨基酸、约50个氨基酸到约185个氨基酸、约50个氨基酸到约180个氨基酸、约50个氨基酸到约175个氨基酸、约50个氨基酸到约170个氨基酸、约50个氨基酸到约165个氨基酸、约50个氨基酸到约160个氨基酸、约50个氨基酸到约155个氨基酸、约50个氨基酸到约150个氨基酸、约50个氨基酸到约145个氨基酸、约50个氨基酸到约140个氨基酸、约50个氨基酸到约135个氨基酸、约50个氨基酸到约130个氨基酸、约50个氨基酸到约125个氨基酸、约50个氨基酸到约120个氨基酸、约50个氨基酸到约115个氨基酸、约50个氨基酸到约110个氨基酸、约50个氨基酸到约105个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约50个氨基酸到约95个氨基酸、约50个氨基酸到约90个氨基酸、约50个氨基酸到约85个氨基酸、约50个氨基酸到约80个氨基酸、约50个氨基酸到约75个氨基酸、约50个氨基酸到约70个氨基酸、约50个氨基酸到约60个氨基酸、约60个氨基酸到约220个氨基酸、约60个氨基酸到约215个氨基酸、约60个氨基酸到约210个氨基酸、约60个氨基酸到约205个氨基酸、约60个氨基酸到约200个氨基酸、约60个氨基酸到约195个氨基酸、约60个氨基酸到约190个氨基酸、约60个氨基酸到约185个氨基酸、约60个氨基酸到约180个氨基酸、约60个氨基酸到约175个氨基酸、约60个氨基酸到约170个氨基酸、约60个氨基酸到约165个氨基酸、约60个氨基酸到约160个氨基酸、约60个氨基酸到约155个氨基酸、约60个氨基酸到约150个氨基酸、约60个氨基酸到约145个氨基酸、约60个氨基酸到约140个氨基酸、约60个氨基酸到约135个氨基酸、约60个氨基酸到约130个氨基酸、约60个氨基酸到约125个氨基酸、约60个氨基酸到约120个氨基酸、约60个氨基酸到约115个氨基酸、约60个氨基酸到约110个氨基酸、约60个氨基酸到约105个氨基酸、约60个氨基酸到约100个氨基酸、约60个氨基酸到约95个氨基酸、约60个氨基酸到约90个氨基酸、约60个氨基酸到约85个氨基酸、约60个氨基酸到约80个氨基酸、约60个氨基酸到约75个氨基酸、约60个氨基酸到约70个氨基酸、约70个氨基酸到约220个氨基酸、约70个氨基酸到约215个氨基酸、约70个氨基酸到约210个氨基酸、约70个氨基酸到约205个氨基酸、约70个氨基酸到约200个氨基酸、约70个氨基酸到约195个氨基酸、约70个氨基酸到约190个氨基酸、约70个氨基酸到约185个氨基酸、约70个氨基酸到约180个氨基酸、约70个氨基酸到约175个氨基酸、约70个氨基酸到约170个氨基酸、约70个氨基酸到约165个氨基酸、约70个氨基酸到约160个氨基酸、约70个氨基酸到约155个氨基酸、约70个氨基酸到约150个氨基酸、约70个氨基酸到约145个氨基酸、约70个氨基酸到约140个氨基酸、约70个氨基酸到约135个氨基酸、约70个氨基酸到约130个氨基酸、约70个氨基酸到约125个氨基酸、约70个氨基酸到约120个氨基酸、约70个氨基酸到约115个氨基酸、约70个氨基酸到约110个氨基酸、约70个氨基酸到约105个氨基酸、约70个氨基酸到约100个氨基酸、约70个氨基酸到约95个氨基酸、约70个氨基酸到约90个氨基酸、约70个氨基酸到约85个氨基酸、约70个氨基酸到约80个氨基酸、约80个氨基酸到约220个氨基酸、约80个氨基酸到约215个氨基酸、约80个氨基酸到约210个氨基酸、约80个氨基酸到约205个氨基酸、约80个氨基酸到约200个氨基酸、约80个氨基酸到约195个氨基酸、约80个氨基酸到约190个氨基酸、约80个氨基酸到约185个氨基酸、约80个氨基酸到约180个氨基酸、约80个氨基酸到约175个氨基酸、约80个氨基酸到约170个氨基酸、约80个氨基酸到约165个氨基酸、约80个氨基酸到约160个氨基酸、约80个氨基酸到约155个氨基酸、约80个氨基酸到约150个氨基酸、约80个氨基酸到约145个氨基酸、约80个氨基酸到约140个氨基酸、约80个氨基酸到约135个氨基酸、约80个氨基酸到约130个氨基酸、约80个氨基酸到约125个氨基酸、约80个氨基酸到约120个氨基酸、约80个氨基酸到约115个氨基酸、约80个氨基酸到约110个氨基酸、约80个氨基酸到约105个氨基酸、约80个氨基酸到约100个氨基酸、约80个氨基酸到约95个氨基酸、约80个氨基酸到约90个氨基酸、约90个氨基酸到约220个氨基酸、约90个氨基酸到约215个氨基酸、约90个氨基酸到约210个氨基酸、约90个氨基酸到约205个氨基酸、约90个氨基酸到约200个氨基酸、约90个氨基酸到约195个氨基酸、约90个氨基酸到约190个氨基酸、约90个氨基酸到约185个氨基酸、约90个氨基酸到约180个氨基酸、约90个氨基酸到约175个氨基酸、约90个氨基酸到约170个氨基酸、约90个氨基酸到约165个氨基酸、约90个氨基酸到约160个氨基酸、约90个氨基酸到约155个氨基酸、约90个氨基酸到约150个氨基酸、约90个氨基酸到约145个氨基酸、约90个氨基酸到约140个氨基酸、约90个氨基酸到约135个氨基酸、约90个氨基酸到约130个氨基酸、约90个氨基酸到约125个氨基酸、约90个氨基酸到约120个氨基酸、约90个氨基酸到约115个氨基酸、约90个氨基酸到约110个氨基酸、约90个氨基酸到约105个氨基酸、约90个氨基酸到约100个氨基酸、约100个氨基酸到约220个氨基酸、约100个氨基酸到约215个氨基酸、约100个氨基酸到约210个氨基酸、约100个氨基酸到约205个氨基酸、约100个氨基酸到约200个氨基酸、约100个氨基酸到约195个氨基酸、约100个氨基酸到约190个氨基酸、约100个氨基酸到约185个氨基酸、约100个氨基酸到约180个氨基酸、约100个氨基酸到约175个氨基酸、约100个氨基酸到约170个氨基酸、约100个氨基酸到约165个氨基酸、约100个氨基酸到约160个氨基酸、约100个氨基酸到约155个氨基酸、约100个氨基酸到约150个氨基酸、约100个氨基酸到约145个氨基酸、约100个氨基酸到约140个氨基酸、约100个氨基酸到约135个氨基酸、约100个氨基酸到约130个氨基酸、约100个氨基酸到约125个氨基酸、约100个氨基酸到约120个氨基酸、约100个氨基酸到约115个氨基酸、约100个氨基酸到约110个氨基酸、约110个氨基酸到约220个氨基酸、约110个氨基酸到约215个氨基酸、约110个氨基酸到约210个氨基酸、约110个氨基酸到约205个氨基酸、约110个氨基酸到约200个氨基酸、约110个氨基酸到约195个氨基酸、约110个氨基酸到约190个氨基酸、约110个氨基酸到约185个氨基酸、约110个氨基酸到约180个氨基酸、约110个氨基酸到约175个氨基酸、约110个氨基酸到约170个氨基酸、约110个氨基酸到约165个氨基酸、约110个氨基酸到约160个氨基酸、约110个氨基酸到约155个氨基酸、约110个氨基酸到约150个氨基酸、约110个氨基酸到约145个氨基酸、约110个氨基酸到约140个氨基酸、约110个氨基酸到约135个氨基酸、约110个氨基酸到约130个氨基酸、约110个氨基酸到约125个氨基酸、约110个氨基酸到约120个氨基酸、约110个氨基酸到约115个氨基酸、约115个氨基酸到约220个氨基酸、约115个氨基酸到约215个氨基酸、约115个氨基酸到约210个氨基酸、约115个氨基酸到约205个氨基酸、约115个氨基酸到约200个氨基酸、约115个氨基酸到约195个氨基酸、约115个氨基酸到约190个氨基酸、约115个氨基酸到约185个氨基酸、约115个氨基酸到约180个氨基酸、约115个氨基酸到约175个氨基酸、约115个氨基酸到约170个氨基酸、约115个氨基酸到约165个氨基酸、约115个氨基酸到约160个氨基酸、约115个氨基酸到约155个氨基酸、约115个氨基酸到约150个氨基酸、约115个氨基酸到约145个氨基酸、约115个氨基酸到约140个氨基酸、约115个氨基酸到约135个氨基酸、约115个氨基酸到约130个氨基酸、约115个氨基酸到约125个氨基酸、约115个氨基酸到约120个氨基酸、约120个氨基酸到约220个氨基酸、约120个氨基酸到约215个氨基酸、约120个氨基酸到约210个氨基酸、约120个氨基酸到约205个氨基酸、约120个氨基酸到约200个氨基酸、约120个氨基酸到约195个氨基酸、约120个氨基酸到约190个氨基酸、约120个氨基酸到约185个氨基酸、约120个氨基酸到约180个氨基酸、约120个氨基酸到约175个氨基酸、约120个氨基酸到约170个氨基酸、约120个氨基酸到约165个氨基酸、约120个氨基酸到约160个氨基酸、约120个氨基酸到约155个氨基酸、约120个氨基酸到约150个氨基酸、约120个氨基酸到约145个氨基酸、约120个氨基酸到约140个氨基酸、约120个氨基酸到约135个氨基酸、约120个氨基酸到约130个氨基酸、约120个氨基酸到约125个氨基酸、约125个氨基酸到约220个氨基酸、约125个氨基酸到约215个氨基酸、约125个氨基酸到约210个氨基酸、约125个氨基酸到约205个氨基酸、约125个氨基酸到约200个氨基酸、约125个氨基酸到约195个氨基酸、约125个氨基酸到约190个氨基酸、约125个氨基酸到约185个氨基酸、约125个氨基酸到约180个氨基酸、约125个氨基酸到约175个氨基酸、约125个氨基酸到约170个氨基酸、约125个氨基酸到约165个氨基酸、约125个氨基酸到约160个氨基酸、约125个氨基酸到约155个氨基酸、约125个氨基酸到约150个氨基酸、约125个氨基酸到约145个氨基酸、约125个氨基酸到约140个氨基酸、约125个氨基酸到约135个氨基酸、约125个氨基酸到约130个氨基酸、约130个氨基酸到约220个氨基酸、约130个氨基酸到约215个氨基酸、约130个氨基酸到约210个氨基酸、约130个氨基酸到约205个氨基酸、约130个氨基酸到约200个氨基酸、约130个氨基酸到约195个氨基酸、约130个氨基酸到约190个氨基酸、约130个氨基酸到约185个氨基酸、约130个氨基酸到约180个氨基酸、约130个氨基酸到约175个氨基酸、约130个氨基酸到约170个氨基酸、约130个氨基酸到约165个氨基酸、约130个氨基酸到约160个氨基酸、约130个氨基酸到约155个氨基酸、约130个氨基酸到约150个氨基酸、约130个氨基酸到约145个氨基酸、约130个氨基酸到约140个氨基酸、约130个氨基酸到约135个氨基酸、约135个氨基酸到约220个氨基酸、约135个氨基酸到约215个氨基酸、约135个氨基酸到约210个氨基酸、约135个氨基酸到约205个氨基酸、约135个氨基酸到约200个氨基酸、约135个氨基酸到约195个氨基酸、约135个氨基酸到约190个氨基酸、约135个氨基酸到约185个氨基酸、约135个氨基酸到约180个氨基酸、约135个氨基酸到约175个氨基酸、约135个氨基酸到约170个氨基酸、约135个氨基酸到约165个氨基酸、约135个氨基酸到约160个氨基酸、约135个氨基酸到约155个氨基酸、约135个氨基酸到约150个氨基酸、约135个氨基酸到约145个氨基酸、约135个氨基酸到约140个氨基酸、约140个氨基酸到约220个氨基酸、约140个氨基酸到约215个氨基酸、约140个氨基酸到约210个氨基酸、约140个氨基酸到约205个氨基酸、约140个氨基酸到约200个氨基酸、约140个氨基酸到约195个氨基酸、约140个氨基酸到约190个氨基酸、约140个氨基酸到约185个氨基酸、约140个氨基酸到约180个氨基酸、约140个氨基酸到约175个氨基酸、约140个氨基酸到约170个氨基酸、约140个氨基酸到约165个氨基酸、约140个氨基酸到约160个氨基酸、约140个氨基酸到约155个氨基酸、约140个氨基酸到约150个氨基酸、约140个氨基酸到约145个氨基酸、约145个氨基酸到约220个氨基酸、约145个氨基酸到约215个氨基酸、约145个氨基酸到约210个氨基酸、约145个氨基酸到约205个氨基酸、约145个氨基酸到约200个氨基酸、约145个氨基酸到约195个氨基酸、约145个氨基酸到约190个氨基酸、约145个氨基酸到约185个氨基酸、约145个氨基酸到约180个氨基酸、约145个氨基酸到约175个氨基酸、约145个氨基酸到约170个氨基酸、约145个氨基酸到约165个氨基酸、约145个氨基酸到约160个氨基酸、约145个氨基酸到约155个氨基酸、约145个氨基酸到约150个氨基酸、约150个氨基酸到约220个氨基酸、约150个氨基酸到约215个氨基酸、约150个氨基酸到约210个氨基酸、约150个氨基酸到约205个氨基酸、约150个氨基酸到约200个氨基酸、约150个氨基酸到约195个氨基酸、约150个氨基酸到约190个氨基酸、约150个氨基酸到约185个氨基酸、约150个氨基酸到约180个氨基酸、约150个氨基酸到约175个氨基酸、约150个氨基酸到约170个氨基酸、约150个氨基酸到约165个氨基酸、约150个氨基酸到约160个氨基酸、约150个氨基酸到约155个氨基酸、约155个氨基酸到约220个氨基酸、约155个氨基酸到约215个氨基酸、约155个氨基酸到约210个氨基酸、约155个氨基酸到约205个氨基酸、约155个氨基酸到约200个氨基酸、约155个氨基酸到约195个氨基酸、约155个氨基酸到约190个氨基酸、约155个氨基酸到约185个氨基酸、约155个氨基酸到约180个氨基酸、约155个氨基酸到约175个氨基酸、约155个氨基酸到约170个氨基酸、约155个氨基酸到约165个氨基酸、约155个氨基酸到约160个氨基酸、约160个氨基酸到约220个氨基酸、约160个氨基酸到约215个氨基酸、约160个氨基酸到约210个氨基酸、约160个氨基酸到约205个氨基酸、约160个氨基酸到约200个氨基酸、约160个氨基酸到约195个氨基酸、约160个氨基酸到约190个氨基酸、约160个氨基酸到约185个氨基酸、约160个氨基酸到约180个氨基酸、约160个氨基酸到约175个氨基酸、约160个氨基酸到约170个氨基酸、约160个氨基酸到约165个氨基酸、约165个氨基酸到约220个氨基酸、约165个氨基酸到约215个氨基酸、约165个氨基酸到约210个氨基酸、约165个氨基酸到约205个氨基酸、约165个氨基酸到约200个氨基酸、约165个氨基酸到约195个氨基酸、约165个氨基酸到约190个氨基酸、约165个氨基酸到约185个氨基酸、约165个氨基酸到约180个氨基酸、约165个氨基酸到约175个氨基酸、约165个氨基酸到约170个氨基酸、约170个氨基酸到约220个氨基酸、约170个氨基酸到约215个氨基酸、约170个氨基酸到约210个氨基酸、约170个氨基酸到约205个氨基酸、约170个氨基酸到约200个氨基酸、约170个氨基酸到约195个氨基酸、约170个氨基酸到约190个氨基酸、约170个氨基酸到约185个氨基酸、约170个氨基酸到约180个氨基酸、约170个氨基酸到约175个氨基酸、约175个氨基酸到约220个氨基酸、约175个氨基酸到约215个氨基酸、约175个氨基酸到约210个氨基酸、约175个氨基酸到约205个氨基酸、约175个氨基酸到约200个氨基酸、约175个氨基酸到约195个氨基酸、约175个氨基酸到约190个氨基酸、约175个氨基酸到约185个氨基酸、约175个氨基酸到约180个氨基酸、约180个氨基酸到约220个氨基酸、约180个氨基酸到约215个氨基酸、约180个氨基酸到约210个氨基酸、约180个氨基酸到约205个氨基酸、约180个氨基酸到约200个氨基酸、约180个氨基酸到约195个氨基酸、约180个氨基酸到约190个氨基酸、约180个氨基酸到约185个氨基酸、约185个氨基酸到约220个氨基酸、约185个氨基酸到约215个氨基酸、约185个氨基酸到约210个氨基酸、约185个氨基酸到约205个氨基酸、约185个氨基酸到约200个氨基酸、约185个氨基酸到约195个氨基酸、约185个氨基酸到约190个氨基酸、约190个氨基酸到约220个氨基酸、约190个氨基酸到约215个氨基酸、约190个氨基酸到约210个氨基酸、约190个氨基酸到约205个氨基酸、约190个氨基酸到约200个氨基酸、约190个氨基酸到约195个氨基酸、约195个氨基酸到约220个氨基酸、约195个氨基酸到约215个氨基酸、约195个氨基酸到约210个氨基酸、约195个氨基酸到约205个氨基酸、约195个氨基酸到约200个氨基酸、约200个氨基酸到约220个氨基酸、约200个氨基酸到约215个氨基酸、约200个氨基酸到约210个氨基酸、约200个氨基酸到约205个氨基酸、约205个氨基酸到约220个氨基酸、约205个氨基酸到约215个氨基酸、约205个氨基酸到约210个氨基酸、约210个氨基酸到约220个氨基酸、约210个氨基酸到约215个氨基酸或约215个氨基酸到约220个氨基酸。
可溶性组织因子结构域
在本文所述的任何方法、组合物或试剂盒的一些实例中，接头结构域可以是可溶性组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域的野生型组织因子多肽。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是组织因子突变体，其中野生型组织因子多肽缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域，并且已在所选氨基酸处经过进一步修饰。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性人组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性大鼠组织因子结构域。下文示出了可溶性人组织因子结构域、小鼠可溶性组织因子结构域、大鼠可溶性组织因子结构域和突变体可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
示例性可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:5)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
编码可溶性人组织因子结构域的示例性核酸(SEQ ID NO:6)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
示例性可溶性小鼠组织因子结构域(SEQ ID NO:7)
agipekafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwknkcfsttdtecdltdeivkdvtwayeakvlsvprrnsvhgdgdqlvihgeeppftnapkflpyrdtnlgqpviqqfeqdgrklnvvvkdsltlvrkngtfltlrqvfgkdlgyiityrkgsstgkktnitntnefsidveegvsycffvqamifsrktnqnspgsstvcteqwksflge
示例性可溶性大鼠组织因子结构域(SEQ ID NO:8)
Agtppgkafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwkykctgttdtecdltdeivkdvnwtyearvlsvpwrnsthgketlfgthgeeppftnarkflpyrdtkigqpviqkyeqggtklkvtvkdsftlvrkngtfltlrqvfgndlgyiltyrkdsstgrktntthtneflidvekgvsycffaqavifsrktnhkspesitkcteqwksvlge
示例性突变体可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:9)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
示例性突变体可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:10)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDAKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLAENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以包含与SEQ ID NO:5、7、8、9或10具有至少70％同一性、至少72％同一性、至少74％同一性、至少76％同一性、至少78％同一性、至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以包含SEQID NO:5、7、8、9或10的序列，其中从其N端去除了一到二十个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个)氨基酸和/或从其C端去除了一到二十个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个)氨基酸。
如本领域技术人员将理解的，不同哺乳动物物种之间保守的氨基酸的突变更有可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性，而不同哺乳动物物种之间不保守的氨基酸的突变不太可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性。
在一些实例中，所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。在一些实例中，所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。在一些实施例中，单链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的血液凝血。
在一些实例中，可溶性组织结构域可以是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性大鼠组织因子结构域。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或七个)：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，突变体可溶性组织因子具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以由包含与SEQ ID NO:6具有至少70％同一性、至少72％同一性、至少74％同一性、至少76％同一性、至少78％同一性、至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域的总长度可以为约20个氨基酸到约220个氨基酸、约20个氨基酸到约215个氨基酸、约20个氨基酸到约210个氨基酸、约20个氨基酸到约205个氨基酸、约20个氨基酸到约200个氨基酸、约20个氨基酸到约195个氨基酸、约20个氨基酸到约190个氨基酸、约20个氨基酸到约185个氨基酸、约20个氨基酸到约180个氨基酸、约20个氨基酸到约175个氨基酸、约20个氨基酸到约170个氨基酸、约20个氨基酸到约165个氨基酸、约20个氨基酸到约160个氨基酸、约20个氨基酸到约155个氨基酸、约20个氨基酸到约150个氨基酸、约20个氨基酸到约145个氨基酸、约20个氨基酸到约140个氨基酸、约20个氨基酸到约135个氨基酸、约20个氨基酸到约130个氨基酸、约20个氨基酸到约125个氨基酸、约20个氨基酸到约120个氨基酸、约20个氨基酸到约115个氨基酸、约20个氨基酸到约110个氨基酸、约20个氨基酸到约105个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约95个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约85个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约75个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约220个氨基酸、约30个氨基酸到约215个氨基酸、约30个氨基酸到约210个氨基酸、约30个氨基酸到约205个氨基酸、约30个氨基酸到约200个氨基酸、约30个氨基酸到约195个氨基酸、约30个氨基酸到约190个氨基酸、约30个氨基酸到约185个氨基酸、约30个氨基酸到约180个氨基酸、约30个氨基酸到约175个氨基酸、约30个氨基酸到约170个氨基酸、约30个氨基酸到约165个氨基酸、约30个氨基酸到约160个氨基酸、约30个氨基酸到约155个氨基酸、约30个氨基酸到约150个氨基酸、约30个氨基酸到约145个氨基酸、约30个氨基酸到约140个氨基酸、约30个氨基酸到约135个氨基酸、约30个氨基酸到约130个氨基酸、约30个氨基酸到约125个氨基酸、约30个氨基酸到约120个氨基酸、约30个氨基酸到约115个氨基酸、约30个氨基酸到约110个氨基酸、约30个氨基酸到约105个氨基酸、约30个氨基酸到约100个氨基酸、约30个氨基酸到约95个氨基酸、约30个氨基酸到约90个氨基酸、约30个氨基酸到约85个氨基酸、约30个氨基酸到约80个氨基酸、约30个氨基酸到约75个氨基酸、约30个氨基酸到约70个氨基酸、约30个氨基酸到约60个氨基酸、约30个氨基酸到约50个氨基酸、约30个氨基酸到约40个氨基酸、约40个氨基酸到约220个氨基酸、约40个氨基酸到约215个氨基酸、约40个氨基酸到约210个氨基酸、约40个氨基酸到约205个氨基酸、约40个氨基酸到约200个氨基酸、约40个氨基酸到约195个氨基酸、约40个氨基酸到约190个氨基酸、约40个氨基酸到约185个氨基酸、约40个氨基酸到约180个氨基酸、约40个氨基酸到约175个氨基酸、约40个氨基酸到约170个氨基酸、约40个氨基酸到约165个氨基酸、约40个氨基酸到约160个氨基酸、约40个氨基酸到约155个氨基酸、约40个氨基酸到约150个氨基酸、约40个氨基酸到约145个氨基酸、约40个氨基酸到约140个氨基酸、约40个氨基酸到约135个氨基酸、约40个氨基酸到约130个氨基酸、约40个氨基酸到约125个氨基酸、约40个氨基酸到约120个氨基酸、约40个氨基酸到约115个氨基酸、约40个氨基酸到约110个氨基酸、约40个氨基酸到约105个氨基酸、约40个氨基酸到约100个氨基酸、约40个氨基酸到约95个氨基酸、约40个氨基酸到约90个氨基酸、约40个氨基酸到约85个氨基酸、约40个氨基酸到约80个氨基酸、约40个氨基酸到约75个氨基酸、约40个氨基酸到约70个氨基酸、约40个氨基酸到约60个氨基酸、约40个氨基酸到约50个氨基酸、约50个氨基酸到约220个氨基酸、约50个氨基酸到约215个氨基酸、约50个氨基酸到约210个氨基酸、约50个氨基酸到约205个氨基酸、约50个氨基酸到约200个氨基酸、约50个氨基酸到约195个氨基酸、约50个氨基酸到约190个氨基酸、约50个氨基酸到约185个氨基酸、约50个氨基酸到约180个氨基酸、约50个氨基酸到约175个氨基酸、约50个氨基酸到约170个氨基酸、约50个氨基酸到约165个氨基酸、约50个氨基酸到约160个氨基酸、约50个氨基酸到约155个氨基酸、约50个氨基酸到约150个氨基酸、约50个氨基酸到约145个氨基酸、约50个氨基酸到约140个氨基酸、约50个氨基酸到约135个氨基酸、约50个氨基酸到约130个氨基酸、约50个氨基酸到约125个氨基酸、约50个氨基酸到约120个氨基酸、约50个氨基酸到约115个氨基酸、约50个氨基酸到约110个氨基酸、约50个氨基酸到约105个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约50个氨基酸到约95个氨基酸、约50个氨基酸到约90个氨基酸、约50个氨基酸到约85个氨基酸、约50个氨基酸到约80个氨基酸、约50个氨基酸到约75个氨基酸、约50个氨基酸到约70个氨基酸、约50个氨基酸到约60个氨基酸、约60个氨基酸到约220个氨基酸、约60个氨基酸到约215个氨基酸、约60个氨基酸到约210个氨基酸、约60个氨基酸到约205个氨基酸、约60个氨基酸到约200个氨基酸、约60个氨基酸到约195个氨基酸、约60个氨基酸到约190个氨基酸、约60个氨基酸到约185个氨基酸、约60个氨基酸到约180个氨基酸、约60个氨基酸到约175个氨基酸、约60个氨基酸到约170个氨基酸、约60个氨基酸到约165个氨基酸、约60个氨基酸到约160个氨基酸、约60个氨基酸到约155个氨基酸、约60个氨基酸到约150个氨基酸、约60个氨基酸到约145个氨基酸、约60个氨基酸到约140个氨基酸、约60个氨基酸到约135个氨基酸、约60个氨基酸到约130个氨基酸、约60个氨基酸到约125个氨基酸、约60个氨基酸到约120个氨基酸、约60个氨基酸到约115个氨基酸、约60个氨基酸到约110个氨基酸、约60个氨基酸到约105个氨基酸、约60个氨基酸到约100个氨基酸、约60个氨基酸到约95个氨基酸、约60个氨基酸到约90个氨基酸、约60个氨基酸到约85个氨基酸、约60个氨基酸到约80个氨基酸、约60个氨基酸到约75个氨基酸、约60个氨基酸到约70个氨基酸、约70个氨基酸到约220个氨基酸、约70个氨基酸到约215个氨基酸、约70个氨基酸到约210个氨基酸、约70个氨基酸到约205个氨基酸、约70个氨基酸到约200个氨基酸、约70个氨基酸到约195个氨基酸、约70个氨基酸到约190个氨基酸、约70个氨基酸到约185个氨基酸、约70个氨基酸到约180个氨基酸、约70个氨基酸到约175个氨基酸、约70个氨基酸到约170个氨基酸、约70个氨基酸到约165个氨基酸、约70个氨基酸到约160个氨基酸、约70个氨基酸到约155个氨基酸、约70个氨基酸到约150个氨基酸、约70个氨基酸到约145个氨基酸、约70个氨基酸到约140个氨基酸、约70个氨基酸到约135个氨基酸、约70个氨基酸到约130个氨基酸、约70个氨基酸到约125个氨基酸、约70个氨基酸到约120个氨基酸、约70个氨基酸到约115个氨基酸、约70个氨基酸到约110个氨基酸、约70个氨基酸到约105个氨基酸、约70个氨基酸到约100个氨基酸、约70个氨基酸到约95个氨基酸、约70个氨基酸到约90个氨基酸、约70个氨基酸到约85个氨基酸、约70个氨基酸到约80个氨基酸、约80个氨基酸到约220个氨基酸、约80个氨基酸到约215个氨基酸、约80个氨基酸到约210个氨基酸、约80个氨基酸到约205个氨基酸、约80个氨基酸到约200个氨基酸、约80个氨基酸到约195个氨基酸、约80个氨基酸到约190个氨基酸、约80个氨基酸到约185个氨基酸、约80个氨基酸到约180个氨基酸、约80个氨基酸到约175个氨基酸、约80个氨基酸到约170个氨基酸、约80个氨基酸到约165个氨基酸、约80个氨基酸到约160个氨基酸、约80个氨基酸到约155个氨基酸、约80个氨基酸到约150个氨基酸、约80个氨基酸到约145个氨基酸、约80个氨基酸到约140个氨基酸、约80个氨基酸到约135个氨基酸、约80个氨基酸到约130个氨基酸、约80个氨基酸到约125个氨基酸、约80个氨基酸到约120个氨基酸、约80个氨基酸到约115个氨基酸、约80个氨基酸到约110个氨基酸、约80个氨基酸到约105个氨基酸、约80个氨基酸到约100个氨基酸、约80个氨基酸到约95个氨基酸、约80个氨基酸到约90个氨基酸、约90个氨基酸到约220个氨基酸、约90个氨基酸到约215个氨基酸、约90个氨基酸到约210个氨基酸、约90个氨基酸到约205个氨基酸、约90个氨基酸到约200个氨基酸、约90个氨基酸到约195个氨基酸、约90个氨基酸到约190个氨基酸、约90个氨基酸到约185个氨基酸、约90个氨基酸到约180个氨基酸、约90个氨基酸到约175个氨基酸、约90个氨基酸到约170个氨基酸、约90个氨基酸到约165个氨基酸、约90个氨基酸到约160个氨基酸、约90个氨基酸到约155个氨基酸、约90个氨基酸到约150个氨基酸、约90个氨基酸到约145个氨基酸、约90个氨基酸到约140个氨基酸、约90个氨基酸到约135个氨基酸、约90个氨基酸到约130个氨基酸、约90个氨基酸到约125个氨基酸、约90个氨基酸到约120个氨基酸、约90个氨基酸到约115个氨基酸、约90个氨基酸到约110个氨基酸、约90个氨基酸到约105个氨基酸、约90个氨基酸到约100个氨基酸、约100个氨基酸到约220个氨基酸、约100个氨基酸到约215个氨基酸、约100个氨基酸到约210个氨基酸、约100个氨基酸到约205个氨基酸、约100个氨基酸到约200个氨基酸、约100个氨基酸到约195个氨基酸、约100个氨基酸到约190个氨基酸、约100个氨基酸到约185个氨基酸、约100个氨基酸到约180个氨基酸、约100个氨基酸到约175个氨基酸、约100个氨基酸到约170个氨基酸、约100个氨基酸到约165个氨基酸、约100个氨基酸到约160个氨基酸、约100个氨基酸到约155个氨基酸、约100个氨基酸到约150个氨基酸、约100个氨基酸到约145个氨基酸、约100个氨基酸到约140个氨基酸、约100个氨基酸到约135个氨基酸、约100个氨基酸到约130个氨基酸、约100个氨基酸到约125个氨基酸、约100个氨基酸到约120个氨基酸、约100个氨基酸到约115个氨基酸、约100个氨基酸到约110个氨基酸、约110个氨基酸到约220个氨基酸、约110个氨基酸到约215个氨基酸、约110个氨基酸到约210个氨基酸、约110个氨基酸到约205个氨基酸、约110个氨基酸到约200个氨基酸、约110个氨基酸到约195个氨基酸、约110个氨基酸到约190个氨基酸、约110个氨基酸到约185个氨基酸、约110个氨基酸到约180个氨基酸、约110个氨基酸到约175个氨基酸、约110个氨基酸到约170个氨基酸、约110个氨基酸到约165个氨基酸、约110个氨基酸到约160个氨基酸、约110个氨基酸到约155个氨基酸、约110个氨基酸到约150个氨基酸、约110个氨基酸到约145个氨基酸、约110个氨基酸到约140个氨基酸、约110个氨基酸到约135个氨基酸、约110个氨基酸到约130个氨基酸、约110个氨基酸到约125个氨基酸、约110个氨基酸到约120个氨基酸、约110个氨基酸到约115个氨基酸、约115个氨基酸到约220个氨基酸、约115个氨基酸到约215个氨基酸、约115个氨基酸到约210个氨基酸、约115个氨基酸到约205个氨基酸、约115个氨基酸到约200个氨基酸、约115个氨基酸到约195个氨基酸、约115个氨基酸到约190个氨基酸、约115个氨基酸到约185个氨基酸、约115个氨基酸到约180个氨基酸、约115个氨基酸到约175个氨基酸、约115个氨基酸到约170个氨基酸、约115个氨基酸到约165个氨基酸、约115个氨基酸到约160个氨基酸、约115个氨基酸到约155个氨基酸、约115个氨基酸到约150个氨基酸、约115个氨基酸到约145个氨基酸、约115个氨基酸到约140个氨基酸、约115个氨基酸到约135个氨基酸、约115个氨基酸到约130个氨基酸、约115个氨基酸到约125个氨基酸、约115个氨基酸到约120个氨基酸、约120个氨基酸到约220个氨基酸、约120个氨基酸到约215个氨基酸、约120个氨基酸到约210个氨基酸、约120个氨基酸到约205个氨基酸、约120个氨基酸到约200个氨基酸、约120个氨基酸到约195个氨基酸、约120个氨基酸到约190个氨基酸、约120个氨基酸到约185个氨基酸、约120个氨基酸到约180个氨基酸、约120个氨基酸到约175个氨基酸、约120个氨基酸到约170个氨基酸、约120个氨基酸到约165个氨基酸、约120个氨基酸到约160个氨基酸、约120个氨基酸到约155个氨基酸、约120个氨基酸到约150个氨基酸、约120个氨基酸到约145个氨基酸、约120个氨基酸到约140个氨基酸、约120个氨基酸到约135个氨基酸、约120个氨基酸到约130个氨基酸、约120个氨基酸到约125个氨基酸、约125个氨基酸到约220个氨基酸、约125个氨基酸到约215个氨基酸、约125个氨基酸到约210个氨基酸、约125个氨基酸到约205个氨基酸、约125个氨基酸到约200个氨基酸、约125个氨基酸到约195个氨基酸、约125个氨基酸到约190个氨基酸、约125个氨基酸到约185个氨基酸、约125个氨基酸到约180个氨基酸、约125个氨基酸到约175个氨基酸、约125个氨基酸到约170个氨基酸、约125个氨基酸到约165个氨基酸、约125个氨基酸到约160个氨基酸、约125个氨基酸到约155个氨基酸、约125个氨基酸到约150个氨基酸、约125个氨基酸到约145个氨基酸、约125个氨基酸到约140个氨基酸、约125个氨基酸到约135个氨基酸、约125个氨基酸到约130个氨基酸、约130个氨基酸到约220个氨基酸、约130个氨基酸到约215个氨基酸、约130个氨基酸到约210个氨基酸、约130个氨基酸到约205个氨基酸、约130个氨基酸到约200个氨基酸、约130个氨基酸到约195个氨基酸、约130个氨基酸到约190个氨基酸、约130个氨基酸到约185个氨基酸、约130个氨基酸到约180个氨基酸、约130个氨基酸到约175个氨基酸、约130个氨基酸到约170个氨基酸、约130个氨基酸到约165个氨基酸、约130个氨基酸到约160个氨基酸、约130个氨基酸到约155个氨基酸、约130个氨基酸到约150个氨基酸、约130个氨基酸到约145个氨基酸、约130个氨基酸到约140个氨基酸、约130个氨基酸到约135个氨基酸、约135个氨基酸到约220个氨基酸、约135个氨基酸到约215个氨基酸、约135个氨基酸到约210个氨基酸、约135个氨基酸到约205个氨基酸、约135个氨基酸到约200个氨基酸、约135个氨基酸到约195个氨基酸、约135个氨基酸到约190个氨基酸、约135个氨基酸到约185个氨基酸、约135个氨基酸到约180个氨基酸、约135个氨基酸到约175个氨基酸、约135个氨基酸到约170个氨基酸、约135个氨基酸到约165个氨基酸、约135个氨基酸到约160个氨基酸、约135个氨基酸到约155个氨基酸、约135个氨基酸到约150个氨基酸、约135个氨基酸到约145个氨基酸、约135个氨基酸到约140个氨基酸、约140个氨基酸到约220个氨基酸、约140个氨基酸到约215个氨基酸、约140个氨基酸到约210个氨基酸、约140个氨基酸到约205个氨基酸、约140个氨基酸到约200个氨基酸、约140个氨基酸到约195个氨基酸、约140个氨基酸到约190个氨基酸、约140个氨基酸到约185个氨基酸、约140个氨基酸到约180个氨基酸、约140个氨基酸到约175个氨基酸、约140个氨基酸到约170个氨基酸、约140个氨基酸到约165个氨基酸、约140个氨基酸到约160个氨基酸、约140个氨基酸到约155个氨基酸、约140个氨基酸到约150个氨基酸、约140个氨基酸到约145个氨基酸、约145个氨基酸到约220个氨基酸、约145个氨基酸到约215个氨基酸、约145个氨基酸到约210个氨基酸、约145个氨基酸到约205个氨基酸、约145个氨基酸到约200个氨基酸、约145个氨基酸到约195个氨基酸、约145个氨基酸到约190个氨基酸、约145个氨基酸到约185个氨基酸、约145个氨基酸到约180个氨基酸、约145个氨基酸到约175个氨基酸、约145个氨基酸到约170个氨基酸、约145个氨基酸到约165个氨基酸、约145个氨基酸到约160个氨基酸、约145个氨基酸到约155个氨基酸、约145个氨基酸到约150个氨基酸、约150个氨基酸到约220个氨基酸、约150个氨基酸到约215个氨基酸、约150个氨基酸到约210个氨基酸、约150个氨基酸到约205个氨基酸、约150个氨基酸到约200个氨基酸、约150个氨基酸到约195个氨基酸、约150个氨基酸到约190个氨基酸、约150个氨基酸到约185个氨基酸、约150个氨基酸到约180个氨基酸、约150个氨基酸到约175个氨基酸、约150个氨基酸到约170个氨基酸、约150个氨基酸到约165个氨基酸、约150个氨基酸到约160个氨基酸、约150个氨基酸到约155个氨基酸、约155个氨基酸到约220个氨基酸、约155个氨基酸到约215个氨基酸、约155个氨基酸到约210个氨基酸、约155个氨基酸到约205个氨基酸、约155个氨基酸到约200个氨基酸、约155个氨基酸到约195个氨基酸、约155个氨基酸到约190个氨基酸、约155个氨基酸到约185个氨基酸、约155个氨基酸到约180个氨基酸、约155个氨基酸到约175个氨基酸、约155个氨基酸到约170个氨基酸、约155个氨基酸到约165个氨基酸、约155个氨基酸到约160个氨基酸、约160个氨基酸到约220个氨基酸、约160个氨基酸到约215个氨基酸、约160个氨基酸到约210个氨基酸、约160个氨基酸到约205个氨基酸、约160个氨基酸到约200个氨基酸、约160个氨基酸到约195个氨基酸、约160个氨基酸到约190个氨基酸、约160个氨基酸到约185个氨基酸、约160个氨基酸到约180个氨基酸、约160个氨基酸到约175个氨基酸、约160个氨基酸到约170个氨基酸、约160个氨基酸到约165个氨基酸、约165个氨基酸到约220个氨基酸、约165个氨基酸到约215个氨基酸、约165个氨基酸到约210个氨基酸、约165个氨基酸到约205个氨基酸、约165个氨基酸到约200个氨基酸、约165个氨基酸到约195个氨基酸、约165个氨基酸到约190个氨基酸、约165个氨基酸到约185个氨基酸、约165个氨基酸到约180个氨基酸、约165个氨基酸到约175个氨基酸、约165个氨基酸到约170个氨基酸、约170个氨基酸到约220个氨基酸、约170个氨基酸到约215个氨基酸、约170个氨基酸到约210个氨基酸、约170个氨基酸到约205个氨基酸、约170个氨基酸到约200个氨基酸、约170个氨基酸到约195个氨基酸、约170个氨基酸到约190个氨基酸、约170个氨基酸到约185个氨基酸、约170个氨基酸到约180个氨基酸、约170个氨基酸到约175个氨基酸、约175个氨基酸到约220个氨基酸、约175个氨基酸到约215个氨基酸、约175个氨基酸到约210个氨基酸、约175个氨基酸到约205个氨基酸、约175个氨基酸到约200个氨基酸、约175个氨基酸到约195个氨基酸、约175个氨基酸到约190个氨基酸、约175个氨基酸到约185个氨基酸、约175个氨基酸到约180个氨基酸、约180个氨基酸到约220个氨基酸、约180个氨基酸到约215个氨基酸、约180个氨基酸到约210个氨基酸、约180个氨基酸到约205个氨基酸、约180个氨基酸到约200个氨基酸、约180个氨基酸到约195个氨基酸、约180个氨基酸到约190个氨基酸、约180个氨基酸到约185个氨基酸、约185个氨基酸到约220个氨基酸、约185个氨基酸到约215个氨基酸、约185个氨基酸到约210个氨基酸、约185个氨基酸到约205个氨基酸、约185个氨基酸到约200个氨基酸、约185个氨基酸到约195个氨基酸、约185个氨基酸到约190个氨基酸、约190个氨基酸到约220个氨基酸、约190个氨基酸到约215个氨基酸、约190个氨基酸到约210个氨基酸、约190个氨基酸到约205个氨基酸、约190个氨基酸到约200个氨基酸、约190个氨基酸到约195个氨基酸、约195个氨基酸到约220个氨基酸、约195个氨基酸到约215个氨基酸、约195个氨基酸到约210个氨基酸、约195个氨基酸到约205个氨基酸、约195个氨基酸到约200个氨基酸、约200个氨基酸到约220个氨基酸、约200个氨基酸到约215个氨基酸、约200个氨基酸到约210个氨基酸、约200个氨基酸到约205个氨基酸、约205个氨基酸到约220个氨基酸、约205个氨基酸到约215个氨基酸、约205个氨基酸到约210个氨基酸、约210个氨基酸到约220个氨基酸、约210个氨基酸到约215个氨基酸或约215个氨基酸到约220个氨基酸。
接头序列
在一些实施例中，接头序列可以是柔性接头序列。可以使用的接头序列的非限制性实例描述于以下文献中：Klein等人,《蛋白质工程、设计和选择(Protein Engineering,Design&Selection)》第27卷,第10期,第325-330页,2014；Priyanka等人,《蛋白质科学(Protein Sci.)》,2013年2月；22(2):153–167。在一些实例中，接头序列是合成接头序列。
在本文所述的任何多链嵌合多肽的一些实施例中，第一和/或第二多肽可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，相同或不同的接头序列，例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。
在一些实施例中，接头序列的总长度可以为1个氨基酸到约100个氨基酸、1个氨基酸到约90个氨基酸、1个氨基酸到约80个氨基酸、1个氨基酸到约70个氨基酸、1个氨基酸到约60个氨基酸、1个氨基酸到约50个氨基酸、1个氨基酸到约45个氨基酸、1个氨基酸到约40个氨基酸、1个氨基酸到约35个氨基酸、1个氨基酸到约30个氨基酸、1个氨基酸到约25个氨基酸、1个氨基酸到约24个氨基酸、1个氨基酸到约22个氨基酸、1个氨基酸到约20个氨基酸、1个氨基酸到约18个氨基酸、1个氨基酸到约16个氨基酸、1个氨基酸到约14个氨基酸、1个氨基酸到约12个氨基酸、1个氨基酸到约10个氨基酸、1个氨基酸到约8个氨基酸、1个氨基酸到约6个氨基酸、1个氨基酸到约4个氨基酸、约2个氨基酸到约100个氨基酸、约2个氨基酸到约90个氨基酸、约2个氨基酸到约80个氨基酸、约2个氨基酸到约70个氨基酸、约2个氨基酸到约60个氨基酸、约2个氨基酸到约50个氨基酸、约2个氨基酸到约45个氨基酸、约2个氨基酸到约40个氨基酸、约2个氨基酸到约35个氨基酸、约2个氨基酸到约30个氨基酸、约2个氨基酸到约25个氨基酸、约2个氨基酸到约24个氨基酸、约2个氨基酸到约22个氨基酸、约2个氨基酸到约20个氨基酸、约2个氨基酸到约18个氨基酸、约2个氨基酸到约16个氨基酸、约2个氨基酸到约14个氨基酸、约2个氨基酸到约12个氨基酸、约2个氨基酸到约10个氨基酸、约2个氨基酸到约8个氨基酸、约2个氨基酸到约6个氨基酸、约2个氨基酸到约4个氨基酸、约4个氨基酸到约100个氨基酸、约4个氨基酸到约90个氨基酸、约4个氨基酸到约80个氨基酸、约4个氨基酸到约70个氨基酸、约4个氨基酸到约60个氨基酸、约4个氨基酸到约50个氨基酸、约4个氨基酸到约45个氨基酸、约4个氨基酸到约40个氨基酸、约4个氨基酸到约35个氨基酸、约4个氨基酸到约30个氨基酸、约4个氨基酸到约25个氨基酸、约4个氨基酸到约24个氨基酸、约4个氨基酸到约22个氨基酸、约4个氨基酸到约20个氨基酸、约4个氨基酸到约18个氨基酸、约4个氨基酸到约16个氨基酸、约4个氨基酸到约14个氨基酸、约4个氨基酸到约12个氨基酸、约4个氨基酸到约10个氨基酸、约4个氨基酸到约8个氨基酸、约4个氨基酸到约6个氨基酸、约6个氨基酸到约100个氨基酸、约6个氨基酸到约90个氨基酸、约6个氨基酸到约80个氨基酸、约6个氨基酸到约70个氨基酸、约6个氨基酸到约60个氨基酸、约6个氨基酸到约50个氨基酸、约6个氨基酸到约45个氨基酸、约6个氨基酸到约40个氨基酸、约6个氨基酸到约35个氨基酸、约6个氨基酸到约30个氨基酸、约6个氨基酸到约25个氨基酸、约6个氨基酸到约24个氨基酸、约6个氨基酸到约22个氨基酸、约6个氨基酸到约20个氨基酸、约6个氨基酸到约18个氨基酸、约6个氨基酸到约16个氨基酸、约6个氨基酸到约14个氨基酸、约6个氨基酸到约12个氨基酸、约6个氨基酸到约10个氨基酸、约6个氨基酸到约8个氨基酸、约8个氨基酸到约100个氨基酸、约8个氨基酸到约90个氨基酸、约8个氨基酸到约80个氨基酸、约8个氨基酸到约70个氨基酸、约8个氨基酸到约60个氨基酸、约8个氨基酸到约50个氨基酸、约8个氨基酸到约45个氨基酸、约8个氨基酸到约40个氨基酸、约8个氨基酸到约35个氨基酸、约8个氨基酸到约30个氨基酸、约8个氨基酸到约25个氨基酸、约8个氨基酸到约24个氨基酸、约8个氨基酸到约22个氨基酸、约8个氨基酸到约20个氨基酸、约8个氨基酸到约18个氨基酸、约8个氨基酸到约16个氨基酸、约8个氨基酸到约14个氨基酸、约8个氨基酸到约12个氨基酸、约8个氨基酸到约10个氨基酸、约10个氨基酸到约100个氨基酸、约10个氨基酸到约90个氨基酸、约10个氨基酸到约80个氨基酸、约10个氨基酸到约70个氨基酸、约10个氨基酸到约60个氨基酸、约10个氨基酸到约50个氨基酸、约10个氨基酸到约45个氨基酸、约10个氨基酸到约40个氨基酸、约10个氨基酸到约35个氨基酸、约10个氨基酸到约30个氨基酸、约10个氨基酸到约25个氨基酸、约10个氨基酸到约24个氨基酸、约10个氨基酸到约22个氨基酸、约10个氨基酸到约20个氨基酸、约10个氨基酸到约18个氨基酸、约10个氨基酸到约16个氨基酸、约10个氨基酸到约14个氨基酸、约10个氨基酸到约12个氨基酸、约12个氨基酸到约100个氨基酸、约12个氨基酸到约90个氨基酸、约12个氨基酸到约80个氨基酸、约12个氨基酸到约70个氨基酸、约12个氨基酸到约60个氨基酸、约12个氨基酸到约50个氨基酸、约12个氨基酸到约45个氨基酸、约12个氨基酸到约40个氨基酸、约12个氨基酸到约35个氨基酸、约12个氨基酸到约30个氨基酸、约12个氨基酸到约25个氨基酸、约12个氨基酸到约24个氨基酸、约12个氨基酸到约22个氨基酸、约12个氨基酸到约20个氨基酸、约12个氨基酸到约18个氨基酸、约12个氨基酸到约16个氨基酸、约12个氨基酸到约14个氨基酸、约14个氨基酸到约100个氨基酸、约14个氨基酸到约90个氨基酸、约14个氨基酸到约80个氨基酸、约14个氨基酸到约70个氨基酸、约14个氨基酸到约60个氨基酸、约14个氨基酸到约50个氨基酸、约14个氨基酸到约45个氨基酸、约14个氨基酸到约40个氨基酸、约14个氨基酸到约35个氨基酸、约14个氨基酸到约30个氨基酸、约14个氨基酸到约25个氨基酸、约14个氨基酸到约24个氨基酸、约14个氨基酸到约22个氨基酸、约14个氨基酸到约20个氨基酸、约14个氨基酸到约18个氨基酸、约14个氨基酸到约16个氨基酸、约16个氨基酸到约100个氨基酸、约16个氨基酸到约90个氨基酸、约16个氨基酸到约80个氨基酸、约16个氨基酸到约70个氨基酸、约16个氨基酸到约60个氨基酸、约16个氨基酸到约50个氨基酸、约16个氨基酸到约45个氨基酸、约16个氨基酸到约40个氨基酸、约16个氨基酸到约35个氨基酸、约16个氨基酸到约30个氨基酸、约16个氨基酸到约25个氨基酸、约16个氨基酸到约24个氨基酸、约16个氨基酸到约22个氨基酸、约16个氨基酸到约20个氨基酸、约16个氨基酸到约18个氨基酸、约18个氨基酸到约100个氨基酸、约18个氨基酸到约90个氨基酸、约18个氨基酸到约80个氨基酸、约18个氨基酸到约70个氨基酸、约18个氨基酸到约60个氨基酸、约18个氨基酸到约50个氨基酸、约18个氨基酸到约45个氨基酸、约18个氨基酸到约40个氨基酸、约18个氨基酸到约35个氨基酸、约18个氨基酸到约30个氨基酸、约18个氨基酸到约25个氨基酸、约18个氨基酸到约24个氨基酸、约18个氨基酸到约22个氨基酸、约18个氨基酸到约20个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约45个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约35个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约20个氨基酸到约25个氨基酸、约20个氨基酸到约24个氨基酸、约20个氨基酸到约22个氨基酸、约22个氨基酸到约100个氨基酸、约22个氨基酸到约90个氨基酸、约22个氨基酸到约80个氨基酸、约22个氨基酸到约70个氨基酸、约22个氨基酸到约60个氨基酸、约22个氨基酸到约50个氨基酸、约22个氨基酸到约45个氨基酸、约22个氨基酸到约40个氨基酸、约22个氨基酸到约35个氨基酸、约22个氨基酸到约30个氨基酸、约22个氨基酸到约25个氨基酸、约22个氨基酸到约24个氨基酸、约25个氨基酸到约100个氨基酸、约25个氨基酸到约90个氨基酸、约25个氨基酸到约80个氨基酸、约25个氨基酸到约70个氨基酸、约25个氨基酸到约60个氨基酸、约25个氨基酸到约50个氨基酸、约25个氨基酸到约45个氨基酸、约25个氨基酸到约40个氨基酸、约25个氨基酸到约35个氨基酸、约25个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约100个氨基酸、约30个氨基酸到约90个氨基酸、约30个氨基酸到约80个氨基酸、约30个氨基酸到约70个氨基酸、约30个氨基酸到约60个氨基酸、约30个氨基酸到约50个氨基酸、约30个氨基酸到约45个氨基酸、约30个氨基酸到约40个氨基酸、约30个氨基酸到约35个氨基酸、约35个氨基酸到约100个氨基酸、约35个氨基酸到约90个氨基酸、约35个氨基酸到约80个氨基酸、约35个氨基酸到约70个氨基酸、约35个氨基酸到约60个氨基酸、约35个氨基酸到约50个氨基酸、约35个氨基酸到约45个氨基酸、约35个氨基酸到约40个氨基酸、约40个氨基酸到约100个氨基酸、约40个氨基酸到约90个氨基酸、约40个氨基酸到约80个氨基酸、约40个氨基酸到约70个氨基酸、约40个氨基酸到约60个氨基酸、约40个氨基酸到约50个氨基酸、约40个氨基酸到约45个氨基酸、约45个氨基酸到约100个氨基酸、约45个氨基酸到约90个氨基酸、约45个氨基酸到约80个氨基酸、约45个氨基酸到约70个氨基酸、约45个氨基酸到约60个氨基酸、约45个氨基酸到约50个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约50个氨基酸到约90个氨基酸、约50个氨基酸到约80个氨基酸、约50个氨基酸到约70个氨基酸、约50个氨基酸到约60个氨基酸、约60个氨基酸到约100个氨基酸、约60个氨基酸到约90个氨基酸、约60个氨基酸到约80个氨基酸、约60个氨基酸到约70个氨基酸、约70个氨基酸到约100个氨基酸、约70个氨基酸到约90个氨基酸、约70个氨基酸到约80个氨基酸、约80个氨基酸到约100个氨基酸、约80个氨基酸到约90个氨基酸或约90个氨基酸到约100个氨基酸。
在一些实施例中，接头序列富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施例中，接头序列富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施例中，接头序列富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，接头序列具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(GS)，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个GS对。在一些实施例中，接头序列具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)序列，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个GGGS序列。在一些实施例中，接头序列具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)序列，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个GGGGS序列。在一些实施例中，接头序列具有一个或多个Gly-Gly-Ser-Gly(GGSG)序列，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个GGSG序列。
在一些实施例中，接头序列可以包括GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:11)或由其组成。在一些实施例中，接头序列可以由包括以下或由以下组成的核酸编码：GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT(SEQ ID NO:12)。在一些实施例中，接头序列可以包括以下或由以下组成：GGGSGGGS(SEQ ID NO:13)。
靶结合结构域
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一和第二靶结合结构域可以是抗原结合结构域(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性抗原结合结构域，例如，激动性抗原结合结构域)，或可溶性白介素或细胞因子蛋白(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性可溶性白介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白)。
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18受体和IL-12受体。
在本文所述的任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7受体和IL-21受体。
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域可以是可溶性白细胞介素或可溶性细胞因子蛋白。在一些实例中，可溶性白细胞介素或可溶性细胞因子蛋白选自以下的组：IL-7、IL-12、IL-18和IL-21。
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一和第二靶结合结构域可以各自独立地具有约5个氨基酸到约1000个氨基酸、约5个氨基酸到约950个氨基酸、约5个氨基酸到约900个氨基酸、约5个氨基酸到约850个氨基酸、约5个氨基酸到约800个氨基酸、约5个氨基酸到约750个氨基酸、约5个氨基酸到约700个氨基酸、约5个氨基酸到约650个氨基酸、约5个氨基酸到约600个氨基酸、约5个氨基酸到约550个氨基酸、约5个氨基酸到约500个氨基酸、约5个氨基酸到约450个氨基酸、约5个氨基酸到约400个氨基酸、约5个氨基酸到约350个氨基酸、约5个氨基酸到约300个氨基酸、约5个氨基酸到约280个氨基酸、约5个氨基酸到约260个氨基酸、约5个氨基酸到约240个氨基酸、约5个氨基酸到约220个氨基酸、约5个氨基酸到约200个氨基酸、约5个氨基酸到约195个氨基酸、约5个氨基酸到约190个氨基酸、约5个氨基酸到约185个氨基酸、约5个氨基酸到约180个氨基酸、约5个氨基酸到约175个氨基酸、约5个氨基酸到约170个氨基酸、约5个氨基酸到约165个氨基酸、约5个氨基酸到约160个氨基酸、约5个氨基酸到约155个氨基酸、约5个氨基酸到约150个氨基酸、约5个氨基酸到约145个氨基酸、约5个氨基酸到约140个氨基酸、约5个氨基酸到约135个氨基酸、约5个氨基酸到约130个氨基酸、约5个氨基酸到约125个氨基酸、约5个氨基酸到约120个氨基酸、约5个氨基酸到约115个氨基酸、约5个氨基酸到约110个氨基酸、约5个氨基酸到约105个氨基酸、约5个氨基酸到约100个氨基酸、约5个氨基酸到约95个氨基酸、约5个氨基酸到约90个氨基酸、约5个氨基酸到约85个氨基酸、约5个氨基酸到约80个氨基酸、约5个氨基酸到约75个氨基酸、约5个氨基酸到约70个氨基酸、约5个氨基酸到约65个氨基酸、约5个氨基酸到约60个氨基酸、约5个氨基酸到约55个氨基酸、约5个氨基酸到约50个氨基酸、约5个氨基酸到约45个氨基酸、约5个氨基酸到约40个氨基酸、约5个氨基酸到约35个氨基酸、约5个氨基酸到约30个氨基酸、约5个氨基酸到约25个氨基酸、约5个氨基酸到约20个氨基酸、约5个氨基酸到约15个氨基酸、约5个氨基酸到约10个氨基酸、约10个氨基酸到约1000个氨基酸、约10个氨基酸到约950个氨基酸、约10个氨基酸到约900个氨基酸、约10个氨基酸到约850个氨基酸、约10个氨基酸到约800个氨基酸、约10个氨基酸到约750个氨基酸、约10个氨基酸到约700个氨基酸、约10个氨基酸到约650个氨基酸、约10个氨基酸到约600个氨基酸、约10个氨基酸到约550个氨基酸、约10个氨基酸到约500个氨基酸、约10个氨基酸到约450个氨基酸、约10个氨基酸到约400个氨基酸、约10个氨基酸到约350个氨基酸、约10个氨基酸到约300个氨基酸、约10个氨基酸到约280个氨基酸、约10个氨基酸到约260个氨基酸、约10个氨基酸到约240个氨基酸、约10个氨基酸到约220个氨基酸、约10个氨基酸到约200个氨基酸、约10个氨基酸到约195个氨基酸、约10个氨基酸到约190个氨基酸、约10个氨基酸到约185个氨基酸、约10个氨基酸到约180个氨基酸、约10个氨基酸到约175个氨基酸、约10个氨基酸到约170个氨基酸、约10个氨基酸到约165个氨基酸、约10个氨基酸到约160个氨基酸、约10个氨基酸到约155个氨基酸、约10个氨基酸到约150个氨基酸、约10个氨基酸到约145个氨基酸、约10个氨基酸到约140个氨基酸、约10个氨基酸到约135个氨基酸、约10个氨基酸到约130个氨基酸、约10个氨基酸到约125个氨基酸、约10个氨基酸到约120个氨基酸、约10个氨基酸到约115个氨基酸、约10个氨基酸到约110个氨基酸、约10个氨基酸到约105个氨基酸、约10个氨基酸到约100个氨基酸、约10个氨基酸到约95个氨基酸、约10个氨基酸到约90个氨基酸、约10个氨基酸到约85个氨基酸、约10个氨基酸到约80个氨基酸、约10个氨基酸到约75个氨基酸、约10个氨基酸到约70个氨基酸、约10个氨基酸到约65个氨基酸、约10个氨基酸到约60个氨基酸、约10个氨基酸到约55个氨基酸、约10个氨基酸到约50个氨基酸、约10个氨基酸到约45个氨基酸、约10个氨基酸到约40个氨基酸、约10个氨基酸到约35个氨基酸、约10个氨基酸到约30个氨基酸、约10个氨基酸到约25个氨基酸、约10个氨基酸到约20个氨基酸、约10个氨基酸到约15个氨基酸、约15个氨基酸到约1000个氨基酸、约15个氨基酸到约950个氨基酸、约15个氨基酸到约900个氨基酸、约15个氨基酸到约850个氨基酸、约15个氨基酸到约800个氨基酸、约15个氨基酸到约750个氨基酸、约15个氨基酸到约700个氨基酸、约15个氨基酸到约650个氨基酸、约15个氨基酸到约600个氨基酸、约15个氨基酸到约550个氨基酸、约15个氨基酸到约500个氨基酸、约15个氨基酸到约450个氨基酸、约15个氨基酸到约400个氨基酸、约15个氨基酸到约350个氨基酸、约15个氨基酸到约300个氨基酸、约15个氨基酸到约280个氨基酸、约15个氨基酸到约260个氨基酸、约15个氨基酸到约240个氨基酸、约15个氨基酸到约220个氨基酸、约15个氨基酸到约200个氨基酸、约15个氨基酸到约195个氨基酸、约15个氨基酸到约190个氨基酸、约15个氨基酸到约185个氨基酸、约15个氨基酸到约180个氨基酸、约15个氨基酸到约175个氨基酸、约15个氨基酸到约170个氨基酸、约15个氨基酸到约165个氨基酸、约15个氨基酸到约160个氨基酸、约15个氨基酸到约155个氨基酸、约15个氨基酸到约150个氨基酸、约15个氨基酸到约145个氨基酸、约15个氨基酸到约140个氨基酸、约15个氨基酸到约135个氨基酸、约15个氨基酸到约130个氨基酸、约15个氨基酸到约125个氨基酸、约15个氨基酸到约120个氨基酸、约15个氨基酸到约115个氨基酸、约15个氨基酸到约110个氨基酸、约15个氨基酸到约105个氨基酸、约15个氨基酸到约100个氨基酸、约15个氨基酸到约95个氨基酸、约15个氨基酸到约90个氨基酸、约15个氨基酸到约85个氨基酸、约15个氨基酸到约80个氨基酸、约15个氨基酸到约75个氨基酸、约15个氨基酸到约70个氨基酸、约15个氨基酸到约65个氨基酸、约15个氨基酸到约60个氨基酸、约15个氨基酸到约55个氨基酸、约15个氨基酸到约50个氨基酸、约15个氨基酸到约45个氨基酸、约15个氨基酸到约40个氨基酸、约15个氨基酸到约35个氨基酸、约15个氨基酸到约30个氨基酸、约15个氨基酸到约25个氨基酸、约15个氨基酸到约20个氨基酸、约20个氨基酸到约1000个氨基酸、约20个氨基酸到约950个氨基酸、约20个氨基酸到约900个氨基酸、约20个氨基酸到约850个氨基酸、约20个氨基酸到约800个氨基酸、约20个氨基酸到约750个氨基酸、约20个氨基酸到约700个氨基酸、约20个氨基酸到约650个氨基酸、约20个氨基酸到约600个氨基酸、约20个氨基酸到约550个氨基酸、约20个氨基酸到约500个氨基酸、约20个氨基酸到约450个氨基酸、约20个氨基酸到约400个氨基酸、约20个氨基酸到约350个氨基酸、约20个氨基酸到约300个氨基酸、约20个氨基酸到约280个氨基酸、约20个氨基酸到约260个氨基酸、约20个氨基酸到约240个氨基酸、约20个氨基酸到约220个氨基酸、约20个氨基酸到约200个氨基酸、约20个氨基酸到约195个氨基酸、约20个氨基酸到约190个氨基酸、约20个氨基酸到约185个氨基酸、约20个氨基酸到约180个氨基酸、约20个氨基酸到约175个氨基酸、约20个氨基酸到约170个氨基酸、约20个氨基酸到约165个氨基酸、约20个氨基酸到约160个氨基酸、约20个氨基酸到约155个氨基酸、约20个氨基酸到约150个氨基酸、约20个氨基酸到约145个氨基酸、约20个氨基酸到约140个氨基酸、约20个氨基酸到约135个氨基酸、约20个氨基酸到约130个氨基酸、约20个氨基酸到约125个氨基酸、约20个氨基酸到约120个氨基酸、约20个氨基酸到约115个氨基酸、约20个氨基酸到约110个氨基酸、约20个氨基酸到约105个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约95个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约85个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约75个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约65个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约55个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约45个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约35个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约20个氨基酸到约25个氨基酸、约25个氨基酸到约1000个氨基酸、约25个氨基酸到约950个氨基酸、约25个氨基酸到约900个氨基酸、约25个氨基酸到约850个氨基酸、约25个氨基酸到约800个氨基酸、约25个氨基酸到约750个氨基酸、约25个氨基酸到约700个氨基酸、约25个氨基酸到约650个氨基酸、约25个氨基酸到约600个氨基酸、约25个氨基酸到约550个氨基酸、约25个氨基酸到约500个氨基酸、约25个氨基酸到约450个氨基酸、约25个氨基酸到约400个氨基酸、约25个氨基酸到约350个氨基酸、约25个氨基酸到约300个氨基酸、约25个氨基酸到约280个氨基酸、约25个氨基酸到约260个氨基酸、约25个氨基酸到约240个氨基酸、约25个氨基酸到约220个氨基酸、约25个氨基酸到约200个氨基酸、约25个氨基酸到约195个氨基酸、约25个氨基酸到约190个氨基酸、约25个氨基酸到约185个氨基酸、约25个氨基酸到约180个氨基酸、约25个氨基酸到约175个氨基酸、约25个氨基酸到约170个氨基酸、约25个氨基酸到约165个氨基酸、约25个氨基酸到约160个氨基酸、约25个氨基酸到约155个氨基酸、约25个氨基酸到约150个氨基酸、约25个氨基酸到约145个氨基酸、约25个氨基酸到约140个氨基酸、约25个氨基酸到约135个氨基酸、约25个氨基酸到约130个氨基酸、约25个氨基酸到约125个氨基酸、约25个氨基酸到约120个氨基酸、约25个氨基酸到约115个氨基酸、约25个氨基酸到约110个氨基酸、约25个氨基酸到约105个氨基酸、约25个氨基酸到约100个氨基酸、约25个氨基酸到约95个氨基酸、约25个氨基酸到约90个氨基酸、约25个氨基酸到约85个氨基酸、约25个氨基酸到约80个氨基酸、约25个氨基酸到约75个氨基酸、约25个氨基酸到约70个氨基酸、约25个氨基酸到约65个氨基酸、约25个氨基酸到约60个氨基酸、约25个氨基酸到约55个氨基酸、约25个氨基酸到约50个氨基酸、约25个氨基酸到约45个氨基酸、约25个氨基酸到约40个氨基酸、约25个氨基酸到约35个氨基酸、约25个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约1000个氨基酸、约30个氨基酸到约950个氨基酸、约30个氨基酸到约900个氨基酸、约30个氨基酸到约850个氨基酸、约30个氨基酸到约800个氨基酸、约30个氨基酸到约750个氨基酸、约30个氨基酸到约700个氨基酸、约30个氨基酸到约650个氨基酸、约30个氨基酸到约600个氨基酸、约30个氨基酸到约550个氨基酸、约30个氨基酸到约500个氨基酸、约30个氨基酸到约450个氨基酸、约30个氨基酸到约400个氨基酸、约30个氨基酸到约350个氨基酸、约30个氨基酸到约300个氨基酸、约30个氨基酸到约280个氨基酸、约30个氨基酸到约260个氨基酸、约30个氨基酸到约240个氨基酸、约30个氨基酸到约22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0个氨基酸到约350个氨基酸、约60个氨基酸到约300个氨基酸、约60个氨基酸到约280个氨基酸、约60个氨基酸到约260个氨基酸、约60个氨基酸到约240个氨基酸、约60个氨基酸到约220个氨基酸、约60个氨基酸到约200个氨基酸、约60个氨基酸到约195个氨基酸、约60个氨基酸到约190个氨基酸、约60个氨基酸到约185个氨基酸、约60个氨基酸到约180个氨基酸、约60个氨基酸到约175个氨基酸、约60个氨基酸到约170个氨基酸、约60个氨基酸到约165个氨基酸、约60个氨基酸到约160个氨基酸、约60个氨基酸到约155个氨基酸、约60个氨基酸到约150个氨基酸、约60个氨基酸到约145个氨基酸、约60个氨基酸到约140个氨基酸、约60个氨基酸到约135个氨基酸、约60个氨基酸到约130个氨基酸、约60个氨基酸到约125个氨基酸、约60个氨基酸到约120个氨基酸、约60个氨基酸到约115个氨基酸、约60个氨基酸到约110个氨基酸、约60个氨基酸到约105个氨基酸、约60个氨基酸到约100个氨基酸、约60个氨基酸到约95个氨基酸、约60个氨基酸到约90个氨基酸、约60个氨基酸到约85个氨基酸、约60个氨基酸到约80个氨基酸、约60个氨基酸到约75个氨基酸、约60个氨基酸到约70个氨基酸、约60个氨基酸到约65个氨基酸、约65个氨基酸到约1000个氨基酸、约65个氨基酸到约950个氨基酸、约65个氨基酸到约900个氨基酸、约65个氨基酸到约850个氨基酸、约65个氨基酸到约800个氨基酸、约65个氨基酸到约750个氨基酸、约65个氨基酸到约700个氨基酸、约65个氨基酸到约650个氨基酸、约65个氨基酸到约600个氨基酸、约65个氨基酸到约550个氨基酸、约65个氨基酸到约500个氨基酸、约65个氨基酸到约450个氨基酸、约65个氨基酸到约400个氨基酸、约65个氨基酸到约350个氨基酸、约65个氨基酸到约300个氨基酸、约65个氨基酸到约280个氨基酸、约65个氨基酸到约260个氨基酸、约65个氨基酸到约240个氨基酸、约65个氨基酸到约220个氨基酸、约65个氨基酸到约200个氨基酸、约65个氨基酸到约195个氨基酸、约65个氨基酸到约190个氨基酸、约65个氨基酸到约185个氨基酸、约65个氨基酸到约180个氨基酸、约65个氨基酸到约175个氨基酸、约65个氨基酸到约170个氨基酸、约65个氨基酸到约165个氨基酸、约65个氨基酸到约160个氨基酸、约65个氨基酸到约155个氨基酸、约65个氨基酸到约150个氨基酸、约65个氨基酸到约145个氨基酸、约65个氨基酸到约140个氨基酸、约65个氨基酸到约135个氨基酸、约65个氨基酸到约130个氨基酸、约65个氨基酸到约125个氨基酸、约65个氨基酸到约120个氨基酸、约65个氨基酸到约115个氨基酸、约65个氨基酸到约110个氨基酸、约65个氨基酸到约105个氨基酸、约65个氨基酸到约100个氨基酸、约65个氨基酸到约95个氨基酸、约65个氨基酸到约90个氨基酸、约65个氨基酸到约85个氨基酸、约65个氨基酸到约80个氨基酸、约65个氨基酸到约75个氨基酸、约65个氨基酸到约70个氨基酸、约70个氨基酸到约1000个氨基酸、约70个氨基酸到约950个氨基酸、约70个氨基酸到约900个氨基酸、约70个氨基酸到约850个氨基酸、约70个氨基酸到约800个氨基酸、约70个氨基酸到约750个氨基酸、约70个氨基酸到约700个氨基酸、约70个氨基酸到约650个氨基酸、约70个氨基酸到约600个氨基酸、约70个氨基酸到约550个氨基酸、约70个氨基酸到约500个氨基酸、约70个氨基酸到约450个氨基酸、约70个氨基酸到约400个氨基酸、约70个氨基酸到约350个氨基酸、约70个氨基酸到约300个氨基酸、约70个氨基酸到约280个氨基酸、约70个氨基酸到约260个氨基酸、约70个氨基酸到约240个氨基酸、约70个氨基酸到约220个氨基酸、约70个氨基酸到约200个氨基酸、约70个氨基酸到约195个氨基酸、约70个氨基酸到约190个氨基酸、约70个氨基酸到约185个氨基酸、约70个氨基酸到约180个氨基酸、约70个氨基酸到约175个氨基酸、约70个氨基酸到约170个氨基酸、约70个氨基酸到约165个氨基酸、约70个氨基酸到约160个氨基酸、约70个氨基酸到约155个氨基酸、约70个氨基酸到约150个氨基酸、约70个氨基酸到约145个氨基酸、约70个氨基酸到约140个氨基酸、约70个氨基酸到约135个氨基酸、约70个氨基酸到约130个氨基酸、约70个氨基酸到约125个氨基酸、约70个氨基酸到约120个氨基酸、约70个氨基酸到约115个氨基酸、约70个氨基酸到约110个氨基酸、约70个氨基酸到约105个氨基酸、约70个氨基酸到约100个氨基酸、约70个氨基酸到约95个氨基酸、约70个氨基酸到约90个氨基酸、约70个氨基酸到约85个氨基酸、约70个氨基酸到约80个氨基酸、约70个氨基酸到约75个氨基酸、约75个氨基酸到约1000个氨基酸、约75个氨基酸到约950个氨基酸、约75个氨基酸到约900个氨基酸、约75个氨基酸到约850个氨基酸、约75个氨基酸到约800个氨基酸、约75个氨基酸到约750个氨基酸、约75个氨基酸到约700个氨基酸、约75个氨基酸到约650个氨基酸、约75个氨基酸到约600个氨基酸、约75个氨基酸到约550个氨基酸、约75个氨基酸到约500个氨基酸、约75个氨基酸到约450个氨基酸、约75个氨基酸到约400个氨基酸、约75个氨基酸到约350个氨基酸、约75个氨基酸到约300个氨基酸、约75个氨基酸到约280个氨基酸、约75个氨基酸到约260个氨基酸、约75个氨基酸到约240个氨基酸、约75个氨基酸到约220个氨基酸、约75个氨基酸到约200个氨基酸、约75个氨基酸到约195个氨基酸、约75个氨基酸到约190个氨基酸、约75个氨基酸到约185个氨基酸、约75个氨基酸到约180个氨基酸、约75个氨基酸到约175个氨基酸、约75个氨基酸到约170个氨基酸、约75个氨基酸到约165个氨基酸、约75个氨基酸到约160个氨基酸、约75个氨基酸到约155个氨基酸、约75个氨基酸到约150个氨基酸、约75个氨基酸到约145个氨基酸、约75个氨基酸到约140个氨基酸、约75个氨基酸到约135个氨基酸、约75个氨基酸到约130个氨基酸、约75个氨基酸到约125个氨基酸、约75个氨基酸到约120个氨基酸、约75个氨基酸到约115个氨基酸、约75个氨基酸到约110个氨基酸、约75个氨基酸到约105个氨基酸、约75个氨基酸到约100个氨基酸、约75个氨基酸到约95个氨基酸、约75个氨基酸到约90个氨基酸、约75个氨基酸到约85个氨基酸、约75个氨基酸到约80个氨基酸、约80个氨基酸到约1000个氨基酸、约80个氨基酸到约950个氨基酸、约80个氨基酸到约900个氨基酸、约80个氨基酸到约850个氨基酸、约80个氨基酸到约800个氨基酸、约80个氨基酸到约750个氨基酸、约80个氨基酸到约700个氨基酸、约80个氨基酸到约650个氨基酸、约80个氨基酸到约600个氨基酸、约80个氨基酸到约550个氨基酸、约80个氨基酸到约500个氨基酸、约80个氨基酸到约450个氨基酸、约80个氨基酸到约400个氨基酸、约80个氨基酸到约350个氨基酸、约80个氨基酸到约300个氨基酸、约80个氨基酸到约280个氨基酸、约80个氨基酸到约260个氨基酸、约80个氨基酸到约240个氨基酸、约80个氨基酸到约220个氨基酸、约80个氨基酸到约200个氨基酸、约80个氨基酸到约195个氨基酸、约80个氨基酸到约190个氨基酸、约80个氨基酸到约185个氨基酸、约80个氨基酸到约180个氨基酸、约80个氨基酸到约175个氨基酸、约80个氨基酸到约170个氨基酸、约80个氨基酸到约165个氨基酸、约80个氨基酸到约160个氨基酸、约80个氨基酸到约155个氨基酸、约80个氨基酸到约150个氨基酸、约80个氨基酸到约145个氨基酸、约80个氨基酸到约140个氨基酸、约80个氨基酸到约135个氨基酸、约80个氨基酸到约130个氨基酸、约80个氨基酸到约125个氨基酸、约80个氨基酸到约120个氨基酸、约80个氨基酸到约115个氨基酸、约80个氨基酸到约110个氨基酸、约80个氨基酸到约105个氨基酸、约80个氨基酸到约100个氨基酸、约80个氨基酸到约95个氨基酸、约80个氨基酸到约90个氨基酸、约80个氨基酸到约85个氨基酸、约85个氨基酸到约1000个氨基酸、约85个氨基酸到约950个氨基酸、约85个氨基酸到约900个氨基酸、约85个氨基酸到约850个氨基酸、约85个氨基酸到约800个氨基酸、约85个氨基酸到约750个氨基酸、约85个氨基酸到约700个氨基酸、约85个氨基酸到约650个氨基酸、约85个氨基酸到约600个氨基酸、约85个氨基酸到约550个氨基酸、约85个氨基酸到约500个氨基酸、约85个氨基酸到约450个氨基酸、约85个氨基酸到约400个氨基酸、约85个氨基酸到约350个氨基酸、约85个氨基酸到约300个氨基酸、约85个氨基酸到约280个氨基酸、约85个氨基酸到约260个氨基酸、约85个氨基酸到约240个氨基酸、约85个氨基酸到约220个氨基酸、约85个氨基酸到约200个氨基酸、约85个氨基酸到约195个氨基酸、约85个氨基酸到约190个氨基酸、约85个氨基酸到约185个氨基酸、约85个氨基酸到约180个氨基酸、约85个氨基酸到约175个氨基酸、约85个氨基酸到约170个氨基酸、约85个氨基酸到约165个氨基酸、约85个氨基酸到约160个氨基酸、约85个氨基酸到约155个氨基酸、约85个氨基酸到约150个氨基酸、约85个氨基酸到约145个氨基酸、约85个氨基酸到约140个氨基酸、约85个氨基酸到约135个氨基酸、约85个氨基酸到约130个氨基酸、约85个氨基酸到约125个氨基酸、约85个氨基酸到约120个氨基酸、约85个氨基酸到约115个氨基酸、约85个氨基酸到约110个氨基酸、约85个氨基酸到约105个氨基酸、约85个氨基酸到约100个氨基酸、约85个氨基酸到约95个氨基酸、约85个氨基酸到约90个氨基酸、约90个氨基酸到约1000个氨基酸、约90个氨基酸到约950个氨基酸、约90个氨基酸到约900个氨基酸、约90个氨基酸到约850个氨基酸、约90个氨基酸到约800个氨基酸、约90个氨基酸到约750个氨基酸、约90个氨基酸到约700个氨基酸、约90个氨基酸到约650个氨基酸、约90个氨基酸到约600个氨基酸、约90个氨基酸到约550个氨基酸、约90个氨基酸到约500个氨基酸、约90个氨基酸到约450个氨基酸、约90个氨基酸到约400个氨基酸、约90个氨基酸到约350个氨基酸、约90个氨基酸到约300个氨基酸、约90个氨基酸到约280个氨基酸、约90个氨基酸到约260个氨基酸、约90个氨基酸到约240个氨基酸、约90个氨基酸到约220个氨基酸、约90个氨基酸到约200个氨基酸、约90个氨基酸到约195个氨基酸、约90个氨基酸到约190个氨基酸、约90个氨基酸到约185个氨基酸、约90个氨基酸到约180个氨基酸、约90个氨基酸到约175个氨基酸、约90个氨基酸到约170个氨基酸、约90个氨基酸到约165个氨基酸、约90个氨基酸到约160个氨基酸、约90个氨基酸到约155个氨基酸、约90个氨基酸到约150个氨基酸、约90个氨基酸到约145个氨基酸、约90个氨基酸到约140个氨基酸、约90个氨基酸到约135个氨基酸、约90个氨基酸到约130个氨基酸、约90个氨基酸到约125个氨基酸、约90个氨基酸到约120个氨基酸、约90个氨基酸到约115个氨基酸、约90个氨基酸到约110个氨基酸、约90个氨基酸到约105个氨基酸、约90个氨基酸到约100个氨基酸、约90个氨基酸到约95个氨基酸、约95个氨基酸到约1000个氨基酸、约95个氨基酸到约950个氨基酸、约95个氨基酸到约900个氨基酸、约95个氨基酸到约850个氨基酸、约95个氨基酸到约800个氨基酸、约95个氨基酸到约750个氨基酸、约95个氨基酸到约700个氨基酸、约95个氨基酸到约650个氨基酸、约95个氨基酸到约600个氨基酸、约95个氨基酸到约550个氨基酸、约95个氨基酸到约500个氨基酸、约95个氨基酸到约450个氨基酸、约95个氨基酸到约400个氨基酸、约95个氨基酸到约350个氨基酸、约95个氨基酸到约300个氨基酸、约95个氨基酸到约280个氨基酸、约95个氨基酸到约260个氨基酸、约95个氨基酸到约240个氨基酸、约95个氨基酸到约220个氨基酸、约95个氨基酸到约200个氨基酸、约95个氨基酸到约195个氨基酸、约95个氨基酸到约190个氨基酸、约95个氨基酸到约185个氨基酸、约95个氨基酸到约180个氨基酸、约95个氨基酸到约175个氨基酸、约95个氨基酸到约170个氨基酸、约95个氨基酸到约165个氨基酸、约95个氨基酸到约160个氨基酸、约95个氨基酸到约155个氨基酸、约95个氨基酸到约150个氨基酸、约95个氨基酸到约145个氨基酸、约95个氨基酸到约140个氨基酸、约95个氨基酸到约135个氨基酸、约95个氨基酸到约130个氨基酸、约95个氨基酸到约125个氨基酸、约95个氨基酸到约120个氨基酸、约95个氨基酸到约115个氨基酸、约95个氨基酸到约110个氨基酸、约95个氨基酸到约105个氨基酸、约95个氨基酸到约100个氨基酸、约100个氨基酸到约1000个氨基酸、约100个氨基酸到约950个氨基酸、约100个氨基酸到约900个氨基酸、约100个氨基酸到约850个氨基酸、约100个氨基酸到约800个氨基酸、约100个氨基酸到约750个氨基酸、约100个氨基酸到约700个氨基酸、约100个氨基酸到约650个氨基酸、约100个氨基酸到约600个氨基酸、约100个氨基酸到约550个氨基酸、约100个氨基酸到约500个氨基酸、约100个氨基酸到约450个氨基酸、约100个氨基酸到约400个氨基酸、约100个氨基酸到约350个氨基酸、约100个氨基酸到约300个氨基酸、约100个氨基酸到约280个氨基酸、约100个氨基酸到约260个氨基酸、约100个氨基酸到约240个氨基酸、约100个氨基酸到约220个氨基酸、约100个氨基酸到约200个氨基酸、约100个氨基酸到约195个氨基酸、约100个氨基酸到约190个氨基酸、约100个氨基酸到约185个氨基酸、约100个氨基酸到约180个氨基酸、约100个氨基酸到约175个氨基酸、约100个氨基酸到约170个氨基酸、约100个氨基酸到约165个氨基酸、约100个氨基酸到约160个氨基酸、约100个氨基酸到约155个氨基酸、约100个氨基酸到约150个氨基酸、约100个氨基酸到约145个氨基酸、约100个氨基酸到约140个氨基酸、约100个氨基酸到约135个氨基酸、约100个氨基酸到约130个氨基酸、约100个氨基酸到约125个氨基酸、约100个氨基酸到约120个氨基酸、约100个氨基酸到约115个氨基酸、约100个氨基酸到约110个氨基酸、约100个氨基酸到约105个氨基酸、约105个氨基酸到约1000个氨基酸、约105个氨基酸到约950个氨基酸、约105个氨基酸到约900个氨基酸、约105个氨基酸到约850个氨基酸、约105个氨基酸到约800个氨基酸、约105个氨基酸到约750个氨基酸、约105个氨基酸到约700个氨基酸、约105个氨基酸到约650个氨基酸、约105个氨基酸到约600个氨基酸、约105个氨基酸到约550个氨基酸、约105个氨基酸到约500个氨基酸、约105个氨基酸到约450个氨基酸、约105个氨基酸到约400个氨基酸、约105个氨基酸到约350个氨基酸、约105个氨基酸到约300个氨基酸、约105个氨基酸到约280个氨基酸、约105个氨基酸到约260个氨基酸、约105个氨基酸到约240个氨基酸、约105个氨基酸到约220个氨基酸、约105个氨基酸到约200个氨基酸、约105个氨基酸到约195个氨基酸、约105个氨基酸到约190个氨基酸、约105个氨基酸到约185个氨基酸、约105个氨基酸到约180个氨基酸、约105个氨基酸到约175个氨基酸、约105个氨基酸到约170个氨基酸、约105个氨基酸到约165个氨基酸、约105个氨基酸到约160个氨基酸、约105个氨基酸到约155个氨基酸、约105个氨基酸到约150个氨基酸、约105个氨基酸到约145个氨基酸、约105个氨基酸到约140个氨基酸、约105个氨基酸到约135个氨基酸、约105个氨基酸到约130个氨基酸、约105个氨基酸到约125个氨基酸、约105个氨基酸到约120个氨基酸、约105个氨基酸到约115个氨基酸、约105个氨基酸到约110个氨基酸、约110个氨基酸到约1000个氨基酸、约110个氨基酸到约950个氨基酸、约110个氨基酸到约900个氨基酸、约110个氨基酸到约850个氨基酸、约110个氨基酸到约800个氨基酸、约110个氨基酸到约750个氨基酸、约110个氨基酸到约700个氨基酸、约110个氨基酸到约650个氨基酸、约110个氨基酸到约600个氨基酸、约110个氨基酸到约550个氨基酸、约110个氨基酸到约500个氨基酸、约110个氨基酸到约450个氨基酸、约110个氨基酸到约400个氨基酸、约110个氨基酸到约350个氨基酸、约110个氨基酸到约300个氨基酸、约110个氨基酸到约280个氨基酸、约110个氨基酸到约260个氨基酸、约110个氨基酸到约240个氨基酸、约110个氨基酸到约220个氨基酸、约110个氨基酸到约200个氨基酸、约110个氨基酸到约195个氨基酸、约110个氨基酸到约190个氨基酸、约110个氨基酸到约185个氨基酸、约110个氨基酸到约180个氨基酸、约110个氨基酸到约175个氨基酸、约110个氨基酸到约170个氨基酸、约110个氨基酸到约165个氨基酸、约110个氨基酸到约160个氨基酸、约110个氨基酸到约155个氨基酸、约110个氨基酸到约150个氨基酸、约110个氨基酸到约145个氨基酸、约110个氨基酸到约140个氨基酸、约110个氨基酸到约135个氨基酸、约110个氨基酸到约130个氨基酸、约110个氨基酸到约125个氨基酸、约110个氨基酸到约120个氨基酸、约110个氨基酸到约115个氨基酸、约115个氨基酸到约1000个氨基酸、约115个氨基酸到约950个氨基酸、约115个氨基酸到约900个氨基酸、约115个氨基酸到约850个氨基酸、约115个氨基酸到约800个氨基酸、约115个氨基酸到约750个氨基酸、约115个氨基酸到约700个氨基酸、约115个氨基酸到约650个氨基酸、约115个氨基酸到约600个氨基酸、约115个氨基酸到约550个氨基酸、约115个氨基酸到约500个氨基酸、约115个氨基酸到约450个氨基酸、约115个氨基酸到约400个氨基酸、约115个氨基酸到约350个氨基酸、约115个氨基酸到约300个氨基酸、约115个氨基酸到约280个氨基酸、约115个氨基酸到约260个氨基酸、约115个氨基酸到约240个氨基酸、约115个氨基酸到约220个氨基酸、约115个氨基酸到约200个氨基酸、约115个氨基酸到约195个氨基酸、约115个氨基酸到约190个氨基酸、约115个氨基酸到约185个氨基酸、约115个氨基酸到约180个氨基酸、约115个氨基酸到约175个氨基酸、约115个氨基酸到约170个氨基酸、约115个氨基酸到约165个氨基酸、约115个氨基酸到约160个氨基酸、约115个氨基酸到约155个氨基酸、约115个氨基酸到约150个氨基酸、约115个氨基酸到约145个氨基酸、约115个氨基酸到约140个氨基酸、约115个氨基酸到约135个氨基酸、约115个氨基酸到约130个氨基酸、约115个氨基酸到约125个氨基酸、约115个氨基酸到约120个氨基酸、约120个氨基酸到约1000个氨基酸、约120个氨基酸到约950个氨基酸、约120个氨基酸到约900个氨基酸、约120个氨基酸到约850个氨基酸、约120个氨基酸到约800个氨基酸、约120个氨基酸到约750个氨基酸、约120个氨基酸到约700个氨基酸、约120个氨基酸到约650个氨基酸、约120个氨基酸到约600个氨基酸、约120个氨基酸到约550个氨基酸、约120个氨基酸到约500个氨基酸、约120个氨基酸到约450个氨基酸、约120个氨基酸到约400个氨基酸、约120个氨基酸到约350个氨基酸、约120个氨基酸到约300个氨基酸、约120个氨基酸到约280个氨基酸、约120个氨基酸到约260个氨基酸、约120个氨基酸到约240个氨基酸、约120个氨基酸到约220个氨基酸、约120个氨基酸到约200个氨基酸、约120个氨基酸到约195个氨基酸、约120个氨基酸到约190个氨基酸、约120个氨基酸到约185个氨基酸、约120个氨基酸到约180个氨基酸、约120个氨基酸到约175个氨基酸、约120个氨基酸到约170个氨基酸、约120个氨基酸到约165个氨基酸、约120个氨基酸到约160个氨基酸、约120个氨基酸到约155个氨基酸、约120个氨基酸到约150个氨基酸、约120个氨基酸到约145个氨基酸、约120个氨基酸到约140个氨基酸、约120个氨基酸到约135个氨基酸、约120个氨基酸到约130个氨基酸、约120个氨基酸到约125个氨基酸、约125个氨基酸到约1000个氨基酸、约125个氨基酸到约950个氨基酸、约125个氨基酸到约900个氨基酸、约125个氨基酸到约850个氨基酸、约125个氨基酸到约800个氨基酸、约125个氨基酸到约750个氨基酸、约125个氨基酸到约700个氨基酸、约125个氨基酸到约650个氨基酸、约125个氨基酸到约600个氨基酸、约125个氨基酸到约550个氨基酸、约125个氨基酸到约500个氨基酸、约125个氨基酸到约450个氨基酸、约125个氨基酸到约400个氨基酸、约125个氨基酸到约350个氨基酸、约125个氨基酸到约300个氨基酸、约125个氨基酸到约280个氨基酸、约125个氨基酸到约260个氨基酸、约125个氨基酸到约240个氨基酸、约125个氨基酸到约220个氨基酸、约125个氨基酸到约200个氨基酸、约125个氨基酸到约195个氨基酸、约125个氨基酸到约190个氨基酸、约125个氨基酸到约185个氨基酸、约125个氨基酸到约180个氨基酸、约125个氨基酸到约175个氨基酸、约125个氨基酸到约170个氨基酸、约125个氨基酸到约165个氨基酸、约125个氨基酸到约160个氨基酸、约125个氨基酸到约155个氨基酸、约125个氨基酸到约150个氨基酸、约125个氨基酸到约145个氨基酸、约125个氨基酸到约140个氨基酸、约125个氨基酸到约135个氨基酸、约125个氨基酸到约130个氨基酸、约130个氨基酸到约1000个氨基酸、约130个氨基酸到约950个氨基酸、约130个氨基酸到约900个氨基酸、约130个氨基酸到约850个氨基酸、约130个氨基酸到约800个氨基酸、约130个氨基酸到约750个氨基酸、约130个氨基酸到约700个氨基酸、约130个氨基酸到约650个氨基酸、约130个氨基酸到约600个氨基酸、约130个氨基酸到约550个氨基酸、约130个氨基酸到约500个氨基酸、约130个氨基酸到约450个氨基酸、约130个氨基酸到约400个氨基酸、约130个氨基酸到约350个氨基酸、约130个氨基酸到约300个氨基酸、约130个氨基酸到约280个氨基酸、约130个氨基酸到约260个氨基酸、约130个氨基酸到约240个氨基酸、约130个氨基酸到约220个氨基酸、约130个氨基酸到约200个氨基酸、约130个氨基酸到约195个氨基酸、约130个氨基酸到约190个氨基酸、约130个氨基酸到约185个氨基酸、约130个氨基酸到约180个氨基酸、约130个氨基酸到约175个氨基酸、约130个氨基酸到约170个氨基酸、约130个氨基酸到约165个氨基酸、约130个氨基酸到约160个氨基酸、约130个氨基酸到约155个氨基酸、约130个氨基酸到约150个氨基酸、约130个氨基酸到约145个氨基酸、约130个氨基酸到约140个氨基酸、约130个氨基酸到约135个氨基酸、约135个氨基酸到约1000个氨基酸、约135个氨基酸到约950个氨基酸、约135个氨基酸到约900个氨基酸、约135个氨基酸到约850个氨基酸、约135个氨基酸到约800个氨基酸、约135个氨基酸到约750个氨基酸、约135个氨基酸到约700个氨基酸、约135个氨基酸到约650个氨基酸、约135个氨基酸到约600个氨基酸、约135个氨基酸到约550个氨基酸、约135个氨基酸到约500个氨基酸、约135个氨基酸到约450个氨基酸、约135个氨基酸到约400个氨基酸、约135个氨基酸到约350个氨基酸、约135个氨基酸到约300个氨基酸、约135个氨基酸到约280个氨基酸、约135个氨基酸到约260个氨基酸、约135个氨基酸到约240个氨基酸、约135个氨基酸到约220个氨基酸、约135个氨基酸到约200个氨基酸、约135个氨基酸到约195个氨基酸、约135个氨基酸到约190个氨基酸、约135个氨基酸到约185个氨基酸、约135个氨基酸到约180个氨基酸、约135个氨基酸到约175个氨基酸、约135个氨基酸到约170个氨基酸、约135个氨基酸到约165个氨基酸、约135个氨基酸到约160个氨基酸、约135个氨基酸到约155个氨基酸、约135个氨基酸到约150个氨基酸、约135个氨基酸到约145个氨基酸、约135个氨基酸到约140个氨基酸、约140个氨基酸到约1000个氨基酸、约140个氨基酸到约950个氨基酸、约140个氨基酸到约900个氨基酸、约140个氨基酸到约850个氨基酸、约140个氨基酸到约800个氨基酸、约140个氨基酸到约750个氨基酸、约140个氨基酸到约700个氨基酸、约140个氨基酸到约650个氨基酸、约140个氨基酸到约600个氨基酸、约140个氨基酸到约550个氨基酸、约140个氨基酸到约500个氨基酸、约140个氨基酸到约450个氨基酸、约140个氨基酸到约400个氨基酸、约140个氨基酸到约350个氨基酸、约140个氨基酸到约300个氨基酸、约140个氨基酸到约280个氨基酸、约140个氨基酸到约260个氨基酸、约140个氨基酸到约240个氨基酸、约140个氨基酸到约220个氨基酸、约140个氨基酸到约200个氨基酸、约140个氨基酸到约195个氨基酸、约140个氨基酸到约190个氨基酸、约140个氨基酸到约185个氨基酸、约140个氨基酸到约180个氨基酸、约140个氨基酸到约175个氨基酸、约140个氨基酸到约170个氨基酸、约140个氨基酸到约165个氨基酸、约140个氨基酸到约160个氨基酸、约140个氨基酸到约155个氨基酸、约140个氨基酸到约150个氨基酸、约140个氨基酸到约145个氨基酸、约145个氨基酸到约1000个氨基酸、约145个氨基酸到约950个氨基酸、约145个氨基酸到约900个氨基酸、约145个氨基酸到约850个氨基酸、约145个氨基酸到约800个氨基酸、约145个氨基酸到约750个氨基酸、约145个氨基酸到约700个氨基酸、约145个氨基酸到约650个氨基酸、约145个氨基酸到约600个氨基酸、约145个氨基酸到约550个氨基酸、约145个氨基酸到约500个氨基酸、约145个氨基酸到约450个氨基酸、约145个氨基酸到约400个氨基酸、约145个氨基酸到约350个氨基酸、约145个氨基酸到约300个氨基酸、约145个氨基酸到约280个氨基酸、约145个氨基酸到约260个氨基酸、约145个氨基酸到约240个氨基酸、约145个氨基酸到约220个氨基酸、约145个氨基酸到约200个氨基酸、约145个氨基酸到约195个氨基酸、约145个氨基酸到约190个氨基酸、约145个氨基酸到约185个氨基酸、约145个氨基酸到约180个氨基酸、约145个氨基酸到约175个氨基酸、约145个氨基酸到约170个氨基酸、约145个氨基酸到约165个氨基酸、约145个氨基酸到约160个氨基酸、约145个氨基酸到约155个氨基酸、约145个氨基酸到约150个氨基酸、约150个氨基酸到约1000个氨基酸、约150个氨基酸到约950个氨基酸、约150个氨基酸到约900个氨基酸、约150个氨基酸到约850个氨基酸、约150个氨基酸到约800个氨基酸、约150个氨基酸到约750个氨基酸、约150个氨基酸到约700个氨基酸、约150个氨基酸到约650个氨基酸、约150个氨基酸到约600个氨基酸、约150个氨基酸到约550个氨基酸、约150个氨基酸到约500个氨基酸、约150个氨基酸到约450个氨基酸、约150个氨基酸到约400个氨基酸、约150个氨基酸到约350个氨基酸、约150个氨基酸到约300个氨基酸、约150个氨基酸到约280个氨基酸、约150个氨基酸到约260个氨基酸、约150个氨基酸到约240个氨基酸、约150个氨基酸到约220个氨基酸、约150个氨基酸到约200个氨基酸、约150个氨基酸到约195个氨基酸、约150个氨基酸到约190个氨基酸、约150个氨基酸到约185个氨基酸、约150个氨基酸到约180个氨基酸、约150个氨基酸到约175个氨基酸、约150个氨基酸到约170个氨基酸、约150个氨基酸到约165个氨基酸、约150个氨基酸到约160个氨基酸、约150个氨基酸到约155个氨基酸、约155个氨基酸到约1000个氨基酸、约155个氨基酸到约950个氨基酸、约155个氨基酸到约900个氨基酸、约155个氨基酸到约850个氨基酸、约155个氨基酸到约800个氨基酸、约155个氨基酸到约750个氨基酸、约155个氨基酸到约700个氨基酸、约155个氨基酸到约650个氨基酸、约155个氨基酸到约600个氨基酸、约155个氨基酸到约550个氨基酸、约155个氨基酸到约500个氨基酸、约155个氨基酸到约450个氨基酸、约155个氨基酸到约400个氨基酸、约155个氨基酸到约350个氨基酸、约155个氨基酸到约300个氨基酸、约155个氨基酸到约280个氨基酸、约155个氨基酸到约260个氨基酸、约155个氨基酸到约240个氨基酸、约155个氨基酸到约220个氨基酸、约155个氨基酸到约200个氨基酸、约155个氨基酸到约195个氨基酸、约155个氨基酸到约190个氨基酸、约155个氨基酸到约185个氨基酸、约155个氨基酸到约180个氨基酸、约155个氨基酸到约175个氨基酸、约155个氨基酸到约170个氨基酸、约155个氨基酸到约165个氨基酸、约155个氨基酸到约160个氨基酸、约160个氨基酸到约1000个氨基酸、约160个氨基酸到约950个氨基酸、约160个氨基酸到约900个氨基酸、约160个氨基酸到约850个氨基酸、约160个氨基酸到约800个氨基酸、约160个氨基酸到约750个氨基酸、约160个氨基酸到约700个氨基酸、约160个氨基酸到约650个氨基酸、约160个氨基酸到约600个氨基酸、约160个氨基酸到约550个氨基酸、约160个氨基酸到约500个氨基酸、约160个氨基酸到约450个氨基酸、约160个氨基酸到约400个氨基酸、约160个氨基酸到约350个氨基酸、约160个氨基酸到约300个氨基酸、约160个氨基酸到约280个氨基酸、约160个氨基酸到约260个氨基酸、约160个氨基酸到约240个氨基酸、约160个氨基酸到约220个氨基酸、约160个氨基酸到约200个氨基酸、约160个氨基酸到约195个氨基酸、约160个氨基酸到约190个氨基酸、约160个氨基酸到约185个氨基酸、约160个氨基酸到约180个氨基酸、约160个氨基酸到约175个氨基酸、约160个氨基酸到约170个氨基酸、约160个氨基酸到约165个氨基酸、约165个氨基酸到约1000个氨基酸、约165个氨基酸到约950个氨基酸、约165个氨基酸到约900个氨基酸、约165个氨基酸到约850个氨基酸、约165个氨基酸到约800个氨基酸、约165个氨基酸到约750个氨基酸、约165个氨基酸到约700个氨基酸、约165个氨基酸到约650个氨基酸、约165个氨基酸到约600个氨基酸、约165个氨基酸到约550个氨基酸、约165个氨基酸到约500个氨基酸、约165个氨基酸到约450个氨基酸、约165个氨基酸到约400个氨基酸、约165个氨基酸到约350个氨基酸、约165个氨基酸到约300个氨基酸、约165个氨基酸到约280个氨基酸、约165个氨基酸到约260个氨基酸、约165个氨基酸到约240个氨基酸、约165个氨基酸到约220个氨基酸、约165个氨基酸到约200个氨基酸、约165个氨基酸到约195个氨基酸、约165个氨基酸到约190个氨基酸、约165个氨基酸到约185个氨基酸、约165个氨基酸到约180个氨基酸、约165个氨基酸到约175个氨基酸、约165个氨基酸到约170个氨基酸、约170个氨基酸到约1000个氨基酸、约170个氨基酸到约950个氨基酸、约170个氨基酸到约900个氨基酸、约170个氨基酸到约850个氨基酸、约170个氨基酸到约800个氨基酸、约170个氨基酸到约750个氨基酸、约170个氨基酸到约700个氨基酸、约170个氨基酸到约650个氨基酸、约170个氨基酸到约600个氨基酸、约170个氨基酸到约550个氨基酸、约170个氨基酸到约500个氨基酸、约170个氨基酸到约450个氨基酸、约170个氨基酸到约400个氨基酸、约170个氨基酸到约350个氨基酸、约170个氨基酸到约300个氨基酸、约170个氨基酸到约280个氨基酸、约170个氨基酸到约260个氨基酸、约170个氨基酸到约240个氨基酸、约170个氨基酸到约220个氨基酸、约170个氨基酸到约200个氨基酸、约170个氨基酸到约195个氨基酸、约170个氨基酸到约190个氨基酸、约170个氨基酸到约185个氨基酸、约170个氨基酸到约180个氨基酸、约170个氨基酸到约175个氨基酸、约175个氨基酸到约1000个氨基酸、约175个氨基酸到约950个氨基酸、约175个氨基酸到约900个氨基酸、约175个氨基酸到约850个氨基酸、约175个氨基酸到约800个氨基酸、约175个氨基酸到约750个氨基酸、约175个氨基酸到约700个氨基酸、约175个氨基酸到约650个氨基酸、约175个氨基酸到约600个氨基酸、约175个氨基酸到约550个氨基酸、约175个氨基酸到约500个氨基酸、约175个氨基酸到约450个氨基酸、约175个氨基酸到约400个氨基酸、约175个氨基酸到约350个氨基酸、约175个氨基酸到约300个氨基酸、约175个氨基酸到约280个氨基酸、约175个氨基酸到约260个氨基酸、约175个氨基酸到约240个氨基酸、约175个氨基酸到约220个氨基酸、约175个氨基酸到约200个氨基酸、约175个氨基酸到约195个氨基酸、约175个氨基酸到约190个氨基酸、约175个氨基酸到约185个氨基酸、约175个氨基酸到约180个氨基酸、约180个氨基酸到约1000个氨基酸、约180个氨基酸到约950个氨基酸、约180个氨基酸到约900个氨基酸、约180个氨基酸到约850个氨基酸、约180个氨基酸到约800个氨基酸、约180个氨基酸到约750个氨基酸、约180个氨基酸到约700个氨基酸、约180个氨基酸到约650个氨基酸、约180个氨基酸到约600个氨基酸、约180个氨基酸到约550个氨基酸、约180个氨基酸到约500个氨基酸、约180个氨基酸到约450个氨基酸、约180个氨基酸到约400个氨基酸、约180个氨基酸到约350个氨基酸、约180个氨基酸到约300个氨基酸、约180个氨基酸到约280个氨基酸、约180个氨基酸到约260个氨基酸、约180个氨基酸到约240个氨基酸、约180个氨基酸到约220个氨基酸、约180个氨基酸到约200个氨基酸、约180个氨基酸到约195个氨基酸、约180个氨基酸到约190个氨基酸、约180个氨基酸到约185个氨基酸、约185个氨基酸到约1000个氨基酸、约185个氨基酸到约950个氨基酸、约185个氨基酸到约900个氨基酸、约185个氨基酸到约850个氨基酸、约185个氨基酸到约800个氨基酸、约185个氨基酸到约750个氨基酸、约185个氨基酸到约700个氨基酸、约185个氨基酸到约650个氨基酸、约185个氨基酸到约600个氨基酸、约185个氨基酸到约550个氨基酸、约185个氨基酸到约500个氨基酸、约185个氨基酸到约450个氨基酸、约185个氨基酸到约400个氨基酸、约185个氨基酸到约350个氨基酸、约185个氨基酸到约300个氨基酸、约185个氨基酸到约280个氨基酸、约185个氨基酸到约260个氨基酸、约185个氨基酸到约240个氨基酸、约185个氨基酸到约220个氨基酸、约185个氨基酸到约200个氨基酸、约185个氨基酸到约195个氨基酸、约185个氨基酸到约190个氨基酸、约190个氨基酸到约1000个氨基酸、约190个氨基酸到约950个氨基酸、约190个氨基酸到约900个氨基酸、约190个氨基酸到约850个氨基酸、约190个氨基酸到约800个氨基酸、约190个氨基酸到约750个氨基酸、约190个氨基酸到约700个氨基酸、约190个氨基酸到约650个氨基酸、约190个氨基酸到约600个氨基酸、约190个氨基酸到约550个氨基酸、约190个氨基酸到约500个氨基酸、约190个氨基酸到约450个氨基酸、约190个氨基酸到约400个氨基酸、约190个氨基酸到约350个氨基酸、约190个氨基酸到约300个氨基酸、约190个氨基酸到约280个氨基酸、约190个氨基酸到约260个氨基酸、约190个氨基酸到约240个氨基酸、约190个氨基酸到约220个氨基酸、约190个氨基酸到约200个氨基酸、约190个氨基酸到约195个氨基酸、约195个氨基酸到约1000个氨基酸、约195个氨基酸到约950个氨基酸、约195个氨基酸到约900个氨基酸、约195个氨基酸到约850个氨基酸、约195个氨基酸到约800个氨基酸、约195个氨基酸到约750个氨基酸、约195个氨基酸到约700个氨基酸、约195个氨基酸到约650个氨基酸、约195个氨基酸到约600个氨基酸、约195个氨基酸到约550个氨基酸、约195个氨基酸到约500个氨基酸、约195个氨基酸到约450个氨基酸、约195个氨基酸到约400个氨基酸、约195个氨基酸到约350个氨基酸、约195个氨基酸到约300个氨基酸、约195个氨基酸到约280个氨基酸、约195个氨基酸到约260个氨基酸、约195个氨基酸到约240个氨基酸、约195个氨基酸到约220个氨基酸、约195个氨基酸到约200个氨基酸、约200个氨基酸到约1000个氨基酸、约200个氨基酸到约950个氨基酸、约200个氨基酸到约900个氨基酸、约200个氨基酸到约850个氨基酸、约200个氨基酸到约800个氨基酸、约200个氨基酸到约750个氨基酸、约200个氨基酸到约700个氨基酸、约200个氨基酸到约650个氨基酸、约200个氨基酸到约600个氨基酸、约200个氨基酸到约550个氨基酸、约200个氨基酸到约500个氨基酸、约200个氨基酸到约450个氨基酸、约200个氨基酸到约400个氨基酸、约200个氨基酸到约350个氨基酸、约200个氨基酸到约300个氨基酸、约200个氨基酸到约280个氨基酸、约200个氨基酸到约260个氨基酸、约200个氨基酸到约240个氨基酸、约200个氨基酸到约220个氨基酸、约220个氨基酸到约1000个氨基酸、约220个氨基酸到约950个氨基酸、约220个氨基酸到约900个氨基酸、约220个氨基酸到约850个氨基酸、约220个氨基酸到约800个氨基酸、约220个氨基酸到约750个氨基酸、约220个氨基酸到约700个氨基酸、约220个氨基酸到约650个氨基酸、约220个氨基酸到约600个氨基酸、约220个氨基酸到约550个氨基酸、约220个氨基酸到约500个氨基酸、约220个氨基酸到约450个氨基酸、约220个氨基酸到约400个氨基酸、约220个氨基酸到约350个氨基酸、约220个氨基酸到约300个氨基酸、约220个氨基酸到约280个氨基酸、约220个氨基酸到约260个氨基酸、约220个氨基酸到约240个氨基酸、约240个氨基酸到约1000个氨基酸、约240个氨基酸到约950个氨基酸、约240个氨基酸到约900个氨基酸、约240个氨基酸到约850个氨基酸、约240个氨基酸到约800个氨基酸、约240个氨基酸到约750个氨基酸、约240个氨基酸到约700个氨基酸、约240个氨基酸到约650个氨基酸、约240个氨基酸到约600个氨基酸、约240个氨基酸到约550个氨基酸、约240个氨基酸到约500个氨基酸、约240个氨基酸到约450个氨基酸、约240个氨基酸到约400个氨基酸、约240个氨基酸到约350个氨基酸、约240个氨基酸到约300个氨基酸、约240个氨基酸到约280个氨基酸、约240个氨基酸到约260个氨基酸、约260个氨基酸到约1000个氨基酸、约260个氨基酸到约950个氨基酸、约260个氨基酸到约900个氨基酸、约260个氨基酸到约850个氨基酸、约260个氨基酸到约800个氨基酸、约260个氨基酸到约750个氨基酸、约260个氨基酸到约700个氨基酸、约260个氨基酸到约650个氨基酸、约260个氨基酸到约600个氨基酸、约260个氨基酸到约550个氨基酸、约260个氨基酸到约500个氨基酸、约260个氨基酸到约450个氨基酸、约260个氨基酸到约400个氨基酸、约260个氨基酸到约350个氨基酸、约260个氨基酸到约300个氨基酸、约260个氨基酸到约280个氨基酸、约280个氨基酸到约1000个氨基酸、约280个氨基酸到约950个氨基酸、约280个氨基酸到约900个氨基酸、约280个氨基酸到约850个氨基酸、约280个氨基酸到约800个氨基酸、约280个氨基酸到约750个氨基酸、约280个氨基酸到约700个氨基酸、约280个氨基酸到约650个氨基酸、约280个氨基酸到约600个氨基酸、约280个氨基酸到约550个氨基酸、约280个氨基酸到约500个氨基酸、约280个氨基酸到约450个氨基酸、约280个氨基酸到约400个氨基酸、约280个氨基酸到约350个氨基酸、约280个氨基酸到约300个氨基酸、约300个氨基酸到约1000个氨基酸、约300个氨基酸到约950个氨基酸、约300个氨基酸到约900个氨基酸、约300个氨基酸到约850个氨基酸、约300个氨基酸到约800个氨基酸、约300个氨基酸到约750个氨基酸、约300个氨基酸到约700个氨基酸、约300个氨基酸到约650个氨基酸、约300个氨基酸到约600个氨基酸、约300个氨基酸到约550个氨基酸、约300个氨基酸到约500个氨基酸、约300个氨基酸到约450个氨基酸、约300个氨基酸到约400个氨基酸、约300个氨基酸到约350个氨基酸、约350个氨基酸到约1000个氨基酸、约350个氨基酸到约950个氨基酸、约350个氨基酸到约900个氨基酸、约350个氨基酸到约850个氨基酸、约350个氨基酸到约800个氨基酸、约350个氨基酸到约750个氨基酸、约350个氨基酸到约700个氨基酸、约350个氨基酸到约650个氨基酸、约350个氨基酸到约600个氨基酸、约350个氨基酸到约550个氨基酸、约350个氨基酸到约500个氨基酸、约350个氨基酸到约450个氨基酸、约350个氨基酸到约400个氨基酸、约400个氨基酸到约1000个氨基酸、约400个氨基酸到约950个氨基酸、约400个氨基酸到约900个氨基酸、约400个氨基酸到约850个氨基酸、约400个氨基酸到约800个氨基酸、约400个氨基酸到约750个氨基酸、约400个氨基酸到约700个氨基酸、约400个氨基酸到约650个氨基酸、约400个氨基酸到约600个氨基酸、约400个氨基酸到约550个氨基酸、约400个氨基酸到约500个氨基酸、约400个氨基酸到约450个氨基酸、约450个氨基酸到约1000个氨基酸、约450个氨基酸到约950个氨基酸、约450个氨基酸到约900个氨基酸、约450个氨基酸到约850个氨基酸、约450个氨基酸到约800个氨基酸、约450个氨基酸到约750个氨基酸、约450个氨基酸到约700个氨基酸、约450个氨基酸到约650个氨基酸、约450个氨基酸到约600个氨基酸、约450个氨基酸到约550个氨基酸、约450个氨基酸到约500个氨基酸、约500个氨基酸到约1000个氨基酸、约500个氨基酸到约950个氨基酸、约500个氨基酸到约900个氨基酸、约500个氨基酸到约850个氨基酸、约500个氨基酸到约800个氨基酸、约500个氨基酸到约750个氨基酸、约500个氨基酸到约700个氨基酸、约500个氨基酸到约650个氨基酸、约500个氨基酸到约600个氨基酸、约500个氨基酸到约550个氨基酸、约550个氨基酸到约1000个氨基酸、约550个氨基酸到约950个氨基酸、约550个氨基酸到约900个氨基酸、约550个氨基酸到约850个氨基酸、约550个氨基酸到约800个氨基酸、约550个氨基酸到约750个氨基酸、约550个氨基酸到约700个氨基酸、约550个氨基酸到约650个氨基酸、约550个氨基酸到约600个氨基酸、约600个氨基酸到约1000个氨基酸、约600个氨基酸到约950个氨基酸、约600个氨基酸到约900个氨基酸、约600个氨基酸到约850个氨基酸、约600个氨基酸到约800个氨基酸、约600个氨基酸到约750个氨基酸、约600个氨基酸到约700个氨基酸、约600个氨基酸到约650个氨基酸、约650个氨基酸到约1000个氨基酸、约650个氨基酸到约950个氨基酸、约650个氨基酸到约900个氨基酸、约650个氨基酸到约850个氨基酸、约650个氨基酸到约800个氨基酸、约650个氨基酸到约750个氨基酸、约650个氨基酸到约700个氨基酸、约700个氨基酸到约1000个氨基酸、约700个氨基酸到约950个氨基酸、约700个氨基酸到约900个氨基酸、约700个氨基酸到约850个氨基酸、约700个氨基酸到约800个氨基酸、约700个氨基酸到约750个氨基酸、约750个氨基酸到约1000个氨基酸、约750个氨基酸到约950个氨基酸、约750个氨基酸到约900个氨基酸、约750个氨基酸到约850个氨基酸、约750个氨基酸到约800个氨基酸、约800个氨基酸到约1000个氨基酸、约800个氨基酸到约950个氨基酸、约800个氨基酸到约900个氨基酸、约800个氨基酸到约850个氨基酸、约850个氨基酸到约1000个氨基酸、约850个氨基酸到约950个氨基酸、约850个氨基酸到约900个氨基酸、约900个氨基酸到约1000个氨基酸、约900个氨基酸到约950个氨基酸或约950个氨基酸到约1000个氨基酸的氨基酸总数。
本文所述的任何靶结合结构域可以以小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10-9M、小于1x10-10M、小于1x10-11M、小于1x10-12M或小于1x10-13M的解离平衡常数(KD)结合到其靶标。在一些实施例中，本文提供的抗原结合蛋白构建体可以以约1x10-3M到约1x10-5M、约1x10-4M到约1x10-6M、约1x10-5M到约1x10-7M、约1x10-6M到约1x10-8M、约1x10-7M到约1x10-9M、约1x10-8M到约1x10-10M或约1x10-9M到约1x10-11M(含端值)的KD结合到识别抗原。
本文所述的任何靶结合结构域可以以约1pM到约30nM之间(例如，约1pM到约25nM、约1pM到约20nM、约1pM到约15nM、约1pM到约10nM、约1pM到约5nM、约1pM到约2nM、约1pM到约1nM、约1pM到约950pM、约1pM到约900pM、约1pM到约850pM、约1pM到约800pM、约1pM到约750pM、约1pM到约700pM、约1pM到约650pM、约1pM到约600pM、约1pM到约550pM、约1pM到约500pM、约1pM到约450pM、约1pM到约400pM、约1pM到约350pM、约1pM到约300pM、约1pM到约250pM、约1pM到约200pM、约1pM到约150pM、约1pM到约100pM、约1pM到约90pM、约1pM到约80pM、约1pM到约70pM、约1pM到约60pM、约1pM到约50pM、约1pM到约40pM、约1pM到约30pM、约1pM到约20pM、约1pM到约10pM、约1pM到约5pM、约1pM到约4pM、约1pM到约3pM、约1pM到约2pM、约2pM到约30nM、约2pM到约25nM、约2pM到约20nM、约2pM到约15nM、约2pM到约10nM、约2pM到约5nM、约2pM到约2nM、约2pM到约1nM、约2pM到约950pM、约2pM到约900pM、约2pM到约850pM、约2pM到约800pM、约2pM到约750pM、约2pM到约700pM、约2pM到约650pM、约2pM到约600pM、约2pM到约550pM、约2pM到约500pM、约2pM到约450pM、约2pM到约400pM、约2pM到约350pM、约2pM到约300pM、约2pM到约250pM、约2pM到约200pM、约2pM到约150pM、约2pM到约100pM、约2pM到约90pM、约2pM到约80pM、约2pM到约70pM、约2pM到约60pM、约2pM到约50pM、约2pM到约40pM、约2pM到约30pM、约2pM到约20pM、约2pM到约10pM、约2pM到约5pM、约2pM到约4pM、约2pM到约3pM、约5pM到约30nM、约5pM到约25nM、约5pM到约20nM、约5pM到约15nM、约5pM到约10nM、约5pM到约5nM、约5pM到约2nM、约5pM到约1nM、约5pM到约950pM、约5pM到约900pM、约5pM到约850pM、约5pM到约800pM、约5pM到约750pM、约5pM到约700pM、约5pM到约650pM、约5pM到约600pM、约5pM到约550pM、约5pM到约500pM、约5pM到约450pM、约5pM到约400pM、约5pM到约350pM、约5pM到约300pM、约5pM到约250pM、约5pM到约200pM、约5pM到约150pM、约5pM到约100pM、约5pM到约90pM、约5pM到约80pM、约5pM到约70pM、约5pM到约60pM、约5pM到约50pM、约5pM到约40pM、约5pM到约30pM、约5pM到约20pM、约5pM到约10pM、约10pM到约30nM、约10pM到约25nM、约10pM到约20nM、约10pM到约15nM、约10pM到约10nM、约10pM到约5nM、约10pM到约2nM、约10pM到约1nM、约10pM到约950pM、约10pM到约900pM、约10pM到约850pM、约10pM到约800pM、约10pM到约750pM、约10pM到约700pM、约10pM到约650pM、约10pM到约600pM、约10pM到约550pM、约10pM到约500pM、约10pM到约450pM、约10pM到约400pM、约10pM到约350pM、约10pM到约300pM、约10pM到约250pM、约10pM到约200pM、约10pM到约150pM、约10pM到约100pM、约10pM到约90pM、约10pM到约80pM、约10pM到约70pM、约10pM到约60pM、约10pM到约50pM、约10pM到约40pM、约10pM到约30pM、约10pM到约20pM、约15pM到约30nM、约15pM到约25nM、约15pM到约20nM、约15pM到约15nM、约15pM到约10nM、约15pM到约5nM、约15pM到约2nM、约15pM到约1nM、约15pM到约950pM、约15pM到约900pM、约15pM到约850pM、约15pM到约800pM、约15pM到约750pM、约15pM到约700pM、约15pM到约650pM、约15pM到约600pM、约15pM到约550pM、约15pM到约500pM、约15pM到约450pM、约15pM到约400pM、约15pM到约350pM、约15pM到约300pM、约15pM到约250pM、约15pM到约200pM、约15pM到约150pM、约15pM到约100pM、约15pM到约90pM、约15pM到约80pM、约15pM到约70pM、约15pM到约60pM、约15pM到约50pM、约15pM到约40pM、约15pM到约30pM、约15pM到约20pM、约20pM到约30nM、约20pM到约25nM、约20pM到约20nM、约20pM到约15nM、约20pM到约10nM、约20pM到约5nM、约20pM到约2nM、约20pM到约1nM、约20pM到约950pM、约20pM到约900pM、约20pM到约850pM、约20pM到约800pM、约20pM到约750pM、约20pM到约700pM、约20pM到约650pM、约20pM到约600pM、约20pM到约550pM、约20pM到约500pM、约20pM到约450pM、约20pM到约400pM、约20pM到约350pM、约20pM到约300pM、约20pM到约250pM、约20pM到约20pM、约200pM到约150pM、约20pM到约100pM、约20pM到约90pM、约20pM到约80pM、约20pM到约70pM、约20pM到约60pM、约20pM到约50pM、约20pM到约40pM、约20pM到约30pM、约30pM到约30nM、约30pM到约25nM、约30pM到约30nM、约30pM到约15nM、约30pM到约10nM、约30pM到约5nM、约30pM到约2nM、约30pM到约1nM、约30pM到约950pM、约30pM到约900pM、约30pM到约850pM、约30pM到约800pM、约30pM到约750pM、约30pM到约700pM、约30pM到约650pM、约30pM到约600pM、约30pM到约550pM、约30pM到约500pM、约30pM到约450pM、约30pM到约400pM、约30pM到约350pM、约30pM到约300pM、约30pM到约250pM、约30pM到约200pM、约30pM到约150pM、约30pM到约100pM、约30pM到约90pM、约30pM到约80pM、约30pM到约70pM、约30pM到约60pM、约30pM到约50pM、约30pM到约40pM、约40pM到约30nM、约40pM到约25nM、约40pM到约30nM、约40pM到约15nM、约40pM到约10nM、约40pM到约5nM、约40pM到约2nM、约40pM到约1nM、约40pM到约950pM、约40pM到约900pM、约40pM到约850pM、约40pM到约800pM、约40pM到约750pM、约40pM到约700pM、约40pM到约650pM、约40pM到约600pM、约40pM到约550pM、约40pM到约500pM、约40pM到约450pM、约40pM到约400pM、约40pM到约350pM、约40pM到约300pM、约40pM到约250pM、约40pM到约200pM、约40pM到约150pM、约40pM到约100pM、约40pM到约90pM、约40pM到约80pM、约40pM到约70pM、约40pM到约60pM、约40pM到约50pM、约50pM到约30nM、约50pM到约25nM、约50pM到约30nM、约50pM到约15nM、约50pM到约10nM、约50pM到约5nM、约50pM到约2nM、约50pM到约1nM、约50pM到约950pM、约50pM到约900pM、约50pM到约850pM、约50pM到约800pM、约50pM到约750pM、约50pM到约700pM、约50pM到约650pM、约50pM到约600pM、约50pM到约550pM、约50pM到约500pM、约50pM到约450pM、约50pM到约400pM、约50pM到约350pM、约50pM到约300pM、约50pM到约250pM、约50pM到约200pM、约50pM到约150pM、约50pM到约100pM、约50pM到约90pM、约50pM到约80pM、约50pM到约70pM、约50pM到约60pM、约60pM到约30nM、约60pM到约25nM、约60pM到约30nM、约60pM到约15nM、约60pM到约10nM、约60pM到约5nM、约60pM到约2nM、约60pM到约1nM、约60pM到约950pM、约60pM到约900pM、约60pM到约850pM、约60pM到约800pM、约60pM到约750pM、约60pM到约700pM、约60pM到约650pM、约60pM到约600pM、约60pM到约550pM、约60pM到约500pM、约60pM到约450pM、约60pM到约400pM、约60pM到约350pM、约60pM到约300pM、约60pM到约250pM、约60pM到约200pM、约60pM到约150pM、约60pM到约100pM、约60pM到约90pM、约60pM到约80pM、约60pM到约70pM、约70pM到约30nM、约70pM到约25nM、约70pM到约30nM、约70pM到约15nM、约70pM到约10nM、约70pM到约5nM、约70pM到约2nM、约70pM到约1nM、约70pM到约950pM、约70pM到约900pM、约70pM到约850pM、约70pM到约800pM、约70pM到约750pM、约70pM到约700pM、约70pM到约650pM、约70pM到约600pM、约70pM到约550pM、约70pM到约500pM、约70pM到约450pM、约70pM到约400pM、约70pM到约350pM、约70pM到约300pM、约70pM到约250pM、约70pM到约200pM、约70pM到约150pM、约70pM到约100pM、约70pM到约90pM、约70pM到约80pM、约80pM到约30nM、约80pM到约25nM、约80pM到约30nM、约80pM到约15nM、约80pM到约10nM、约80pM到约5nM、约80pM到约2nM、约80pM到约1nM、约80pM到约950pM、约80pM到约900pM、约80pM到约850pM、约80pM到约800pM、约80pM到约750pM、约80pM到约700pM、约80pM到约650pM、约80pM到约600pM、约80pM到约550pM、约80pM到约500pM、约80pM到约450pM、约80pM到约400pM、约80pM到约350pM、约80pM到约300pM、约80pM到约250pM、约80pM到约200pM、约80pM到约150pM、约80pM到约100pM、约80pM到约90pM、约90pM到约30nM、约90pM到约25nM、约90pM到约30nM、约90pM到约15nM、约90pM到约10nM、约90pM到约5nM、约90pM到约2nM、约90pM到约1nM、约90pM到约950pM、约90pM到约900pM、约90pM到约850pM、约90pM到约800pM、约90pM到约750pM、约90pM到约700pM、约90pM到约650pM、约90pM到约600pM、约90pM到约550pM、约90pM到约500pM、约90pM到约450pM、约90pM到约400pM、约90pM到约350pM、约90pM到约300pM、约90pM到约250pM、约90pM到约200pM、约90pM到约150pM、约90pM到约100pM、约100pM到约30nM、约100pM到约25nM、约100pM到约30nM、约100pM到约15nM、约100pM到约10nM、约100pM到约5nM、约100pM到约2nM、约100pM到约1nM、约100pM到约950pM、约100pM到约900pM、约100pM到约850pM、约100pM到约800pM、约100pM到约750pM、约100pM到约700pM、约100pM到约650pM、约100pM到约600pM、约100pM到约550pM、约100pM到约500pM、约100pM到约450pM、约100pM到约400pM、约100pM到约350pM、约100pM到约300pM、约100pM到约250pM、约100pM到约200pM、约100pM到约150pM、约150pM到约30nM、约150pM到约25nM、约150pM到约30nM、约150pM到约15nM、约150pM到约10nM、约150pM到约5nM、约150pM到约2nM、约150pM到约1nM、约150pM到约950pM、约150pM到约900pM、约150pM到约850pM、约150pM到约800pM、约150pM到约750pM、约150pM到约700pM、约150pM到约650pM、约150pM到约600pM、约150pM到约550pM、约150pM到约500pM、约150pM到约450pM、约150pM到约400pM、约150pM到约350pM、约150pM到约300pM、约150pM到约250pM、约150pM到约200pM、约200pM到约30nM、约200pM到约25nM、约200pM到约30nM、约200pM到约15nM、约200pM到约10nM、约200pM到约5nM、约200pM到约2nM、约200pM到约1nM、约200pM到约950pM、约200pM到约900pM、约200pM到约850pM、约200pM到约800pM、约200pM到约750pM、约200pM到约700pM、约200pM到约650pM、约200pM到约600pM、约200pM到约550pM、约200pM到约500pM、约200pM到约450pM、约200pM到约400pM、约200pM到约350pM、约200pM到约300pM、约200pM到约250pM、约300pM到约30nM、约300pM到约25nM、约300pM到约30nM、约300pM到约15nM、约300pM到约10nM、约300pM到约5nM、约300pM到约2nM、约300pM到约1nM、约300pM到约950pM、约300pM到约900pM、约300pM到约850pM、约300pM到约800pM、约300pM到约750pM、约300pM到约700pM、约300pM到约650pM、约300pM到约600pM、约300pM到约550pM、约300pM到约500pM、约300pM到约450pM、约300pM到约400pM、约300pM到约350pM、约400pM到约30nM、约400pM到约25nM、约400pM到约30nM、约400pM到约15nM、约400pM到约10nM、约400pM到约5nM、约400pM到约2nM、约400pM到约1nM、约400pM到约950pM、约400pM到约900pM、约400pM到约850pM、约400pM到约800pM、约400pM到约750pM、约400pM到约700pM、约400pM到约650pM、约400pM到约600pM、约400pM到约550pM、约400pM到约500pM、约500pM到约30nM、约500pM到约25nM、约500pM到约30nM、约500pM到约15nM、约500pM到约10nM、约500pM到约5nM、约500pM到约2nM、约500pM到约1nM、约500pM到约950pM、约500pM到约900pM、约500pM到约850pM、约500pM到约800pM、约500pM到约750pM、约500pM到约700pM、约500pM到约650pM、约500pM到约600pM、约500pM到约550pM、约600pM到约30nM、约600pM到约25nM、约600pM到约30nM、约600pM到约15nM、约600pM到约10nM、约600pM到约5nM、约600pM到约2nM、约600pM到约1nM、约600pM到约950pM、约600pM到约900pM、约600pM到约850pM、约600pM到约800pM、约600pM到约750pM、约600pM到约700pM、约600pM到约650pM、约700pM到约30nM、约700pM到约25nM、约700pM到约30nM、约700pM到约15nM、约700pM到约10nM、约700pM到约5nM、约700pM到约2nM、约700pM到约1nM、约700pM到约950pM、约700pM到约900pM、约700pM到约850pM、约700pM到约800pM、约700pM到约750pM、约800pM到约30nM、约800pM到约25nM、约800pM到约30nM、约800pM到约15nM、约800pM到约10nM、约800pM到约5nM、约800pM到约2nM、约800pM到约1nM、约800pM到约950pM、约800pM到约900pM、约800pM到约850pM、约900pM到约30nM、约900pM到约25nM、约900pM到约30nM、约900pM到约15nM、约900pM到约10nM、约900pM到约5nM、约900pM到约2nM、约900pM到约1nM、约900pM到约950pM、约1nM到约30nM、约1nM到约25nM、约1nM到约20nM、约1nM到约15nM、约1nM到约10nM、约1nM到约5nM、约2nM到约30nM、约2nM到约25nM、约2nM到约20nM、约2nM到约15nM、约2nM到约10nM、约2nM到约5nM、约4nM到约30nM、约4nM到约25nM、约4nM到约20nM、约4nM到约15nM、约4nM到约10nM、约4nM到约5nM、约5nM到约30nM、约5nM到约25nM、约5nM到约20nM、约5nM到约15nM、约5nM到约10nM、约10nM到约30nM、约10nM到约25nM、约10nM到约20nM、约10nM到约15nM、约15nM到约30nM、约15nM到约25nM、约15nM到约20nM、约20nM到约30nM和约20nM到约25nM)的KD结合到其靶标。
本文所述的任何靶结合结构域可以以约1nM到约10nM之间(例如，约1nM到约9nM、约1nM到约8nM、约1nM到约7nM、约1nM到约6nM、约1nM到约5nM、约1nM到约4nM、约1nM到约3nM、约1nM到约2nM、约2nM到约10nM、约2nM到约9nM、约2nM到约8nM、约2nM到约7nM、约2nM到约6nM、约2nM到约5nM、约2nM到约4nM、约2nM到约3nM、约3nM到约10nM、约3nM到约9nM、约3nM到约8nM、约3nM到约7nM、约3nM到约6nM、约3nM到约5nM、约3nM到约4nM、约4nM到约10nM、约4nM到约9nM、约4nM到约8nM、约4nM到约7nM、约4nM到约6nM、约4nM到约5nM、约5nM到约10nM、约5nM到约9nM、约5nM到约8nM、约5nM到约7nM、约5nM到约6nM、约6nM到约10nM、约6nM到约9nM、约6nM到约8nM、约6nM到约7nM、约7nM到约10nM、约7nM到约9nM、约7nM到约8nM、约8nM到约10nM、约8nM到约9nM和约9nM到约10nM)的KD结合到其靶标。
可以使用本领域已知的多种不同方法来确定本文所述的任何靶结合蛋白构建体的KD值(例如，电泳迁移率变化测定法、过滤器结合测定法、表面等离子体共振和生物分子结合动力学测定法等)。
抗原结合结构域
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽和/或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以是抗原结合结构域。在本文所述的任何第一多链嵌合多肽或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域可以各自为抗原结合结构域。在本文所述的任何第一多链嵌合多肽和/或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域可以特异性结合到不同的抗原。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域可以是激动性抗原结合结构域。
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽或任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，抗原结合结构域可以包含或者是scFv或单结构域抗体(例如，VHH或VNAR结构域)。存在于本文所述的任何多链多肽中的抗原结合结构域各自独立地选自以下的组：VHH结构域、VNAR结构域和scFv。在一些实例中，抗原结合结构域(例如，本文所述的任何抗原结合结构域)可以特异性结合到IL-7受体、IL-12受体、IL-18受体或IL-21受体。
在一些实施例中，本文所述的任何抗原结合结构域是BiTe、(scFv)2、纳米抗体(nanobody)、纳米抗体-HSA、DART、TandAb、单链双功能抗体(scDiabody)、单链双功能抗体-CH3、scFv-CH-CL-scFv、HSAbody、单链双功能抗体-HAS或串联scFv。可用于本文所述的任何多链嵌合多肽(例如，第一多链嵌合多肽和第二多链嵌合多肽)的抗原结合结构域的额外的实例是本领域已知的。
VHH结构域是可在骆驼科动物中发现的单个单体可变抗体结构域。VNAR结构域是可在软骨鱼中发现的单个单体可变抗体结构域。VHH结构域和VNAR结构域的非限制性方面描述于以下文献中：例如Cromie等人,《医药化学当前论题(Curr.Top.Med.Chem.)》15:2543-2557,2016；De Genst等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》30:187-198,2006；De Meyer等人,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》32:263-270,2014；Kijanka等人,《纳米医学(Nanomedicine)》10:161-174,2015；Kovaleva等人,《生物疗法专家观点(Expert.Opin.Biol.Ther.)》14:1527-1539,2014；Krah等人,《免疫药理学和免疫毒理学(Immunopharmacol.Immunotoxicol.)》38:21-28,2016；Mujic-Delic等人,《药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.)》35:247-255,2014；Muyldermans,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》74:277-302,2001；Muyldermans等人,《生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.)》26:230-235,2001；Muyldermans,《生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)》82:775-797,2013；Rahbarizadeh等人,《免疫学研究(Immunol.Invest.)》40:299-338,2011；Van Audenhove等人,《E生物医学(EBioMedicine)》8:40-48,2016；Van Bockstaele等人,《研究药物当前观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)》10:1212-1224,2009；Vincke等人,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》911:15-26,2012；和Wesolowski等人,《医学微生物学和免疫学(Med.Microbiol.Immunol.)》198:157-174,2009。
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域都是VHH结构域，或至少一个抗原结合结构域是VHH结构域。在本文所述的任何第一多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域都是VNAR结构域，或至少一个抗原结合结构域是VNAR结构域。在本文所述的任何第一多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域都是scFv结构域，或至少一个抗原结合结构域是scFv结构域。
在本文所述的任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域都是VHH结构域，或至少一个抗原结合结构域是VHH结构域。在本文所述的任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域都是VNAR结构域，或至少一个抗原结合结构域是VNAR结构域。在本文所述的任何第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域都是scFv结构域，或至少一个抗原结合结构域是scFv结构域。DART描述于以下文献中：例如Garber,《自然综述：药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》13:799-801,2014。
在本文所述的任何抗原结合结构域的一些实施例中，抗原结合结构域可以结合到选自由以下组成的组的抗原：蛋白质、碳水化合物、脂质和其组合。
抗原结合结构域的额外的实例和方面是本领域已知的。
可溶性白介素或细胞因子蛋白
在本文所述的任何第一多链嵌合多肽和/或第二多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以是可溶性白细胞介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白。在一些实施例中，可溶性白细胞介素或可溶性细胞因子蛋白选自以下的组：IL-7、IL-12、IL-18和IL-21。以下提供了可溶性IL-7、IL-12、IL-18和IL-21的非限制性实例。
人可溶性IL-12β(p40)(SEQ ID NO:14)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
编码人可溶性IL-12β(p40)的核酸(SEQ ID NO:15)
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCC
人可溶性IL-12α(p35)(SEQ ID NO:16)
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
编码人可溶性IL-12α(p35)的核酸(SEQ ID NO:17)
CGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
示例性人可溶性IL-12(SEQ ID NO:18)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
编码示例性人可溶性IL-12的核酸(SEQ ID NO:19)
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCCGGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCTCGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
人可溶性IL-18(SEQ ID NO:20)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
编码人可溶性IL-18的核酸(SEQ ID NO:21)
TACTTCGGCAAACTGGAATCCAAGCTGAGCGTGATCCGGAATTTAAACGACCAAGTTCTGTTTATCGATCAAGGTAACCGGCCTCTGTTCGAGGACATGACCGACTCCGATTGCCGGGACAATGCCCCCCGGACCATCTTCATTATCTCCATGTACAAGGACAGCCAGCCCCGGGGCATGGCTGTGACAATTAGCGTGAAGTGTGAGAAAATCAGCACTTTATCTTGTGAGAACAAGATCATCTCCTTTAAGGAAATGAACCCCCCCGATAACATCAAGGACACCAAGTCCGATATCATCTTCTTCCAGCGGTCCGTGCCCGGTCACGATAACAAGATGCAGTTCGAATCCTCCTCCTACGAGGGCTACTTTTTAGCTTGTGAAAAGGAGAGGGATTTATTCAAGCTGATCCTCAAGAAGGAGGACGAGCTGGGCGATCGTTCCATCATGTTCACCGTCCAAAACGAGGAT
在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白可以包含与SEQ ID NO:14具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的第一序列和与SEQ ID NO:16具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的第二序列。在一些实施例中，可溶性IL-12可以进一步包含第一序列与第二序列之间的接头序列(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。
在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白由编码与SEQ ID NO:15具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的第一序列的第一核酸和编码与SEQ ID NO:17具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的第二序列的第二核酸序列编码。在一些实施例中，编码可溶性IL-12蛋白的核酸进一步包含编码第一核酸与第二核酸之间的接头序列(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性接头序列)的核酸序列。
在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列。在一些实施例中，可溶性IL-12蛋白由包含与SEQ ID NO:19具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性IL-18蛋白可以包含与SEQ ID NO:20具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列。在一些实施例中，可溶性IL-18蛋白由包含与SEQ ID NO:21具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的序列的核酸编码。
在本文所述的任何多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以是可溶性IL-21(例如，可溶性人IL-21)。例如，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以是人可溶性IL-21，其包含以下氨基酸序列：
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的任何多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以是可溶性IL-7(可溶性人IL-7)。例如，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以是人IL-7，其包含氨基酸序列DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH(SEQ ID NO:23)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域中的一个或两者可以包含与SEQ IDNO:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的额外的实例是本领域已知的。
亲和结构域对
第一和第二多链嵌合多肽包含：1)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含一对亲和结构域的第一结构域；以及2)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含一对亲和结构域的第二结构域，使得所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合。在一些实施例中，所述亲和结构域对是来自IL-15受体的α链(IL15Rα)(例如，人IL-15受体(IL15Rα))的sushi结构域和可溶性IL-15(例如，人可溶性IL-15)。sushi结构域，也被称为短共有重复序列或1型糖蛋白基序，是蛋白质-蛋白质相互作用中的常见基序。已在许多蛋白质结合分子，包含补体组分C1r、C1s、因子H和C2m以及非免疫分子因子XIII和β2-糖蛋白上鉴别了sushi结构域。典型的sushi结构域具有大约60个氨基酸残基，并且含有四个半胱氨酸(Ranganathan,《太平洋生物计算专题讨论会(Pac.Symp Biocomput.)》2000:155-67)。第一半胱氨酸可与第三半胱氨酸形成二硫键，并且第二半胱氨酸可与第四半胱氨酸形成二硫桥键。在所述亲和结构域对的一个成员是可溶性IL-15的一些实施例中，可溶性IL15具有D8N或D8A氨基酸取代。在所述亲和结构域对的一个成员是人IL-15受体的α链(IL15Rα)的一些实施例中，人IL15Rα是成熟的全长IL15Rα。在一些实施例中，所述亲和结构域对是barnase和barnstar。在一些实施例中，所述亲和结构域对是PKA和AKAP。在一些实施例中，所述亲和结构域对是基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块(Rossi,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)》103:6841-6846,2006；Sharkey等人,《癌症研究(Cancer Res.)》68:5282-5290,2008；Rossi等人,《药物科学趋势(Trends Pharmacol Sci.)》33:474-481,2012)或基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块(Deyev等人,《自然·生物技术(Nat Biotechnol.)》1486-1492,2003)。
在一些实施例中，第一和第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包含一对亲和结构域的第一结构域，并且第一和第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包含一对亲和结构域的第二结构域，其中所述亲和结构域对的第一结构域和所述亲和结构域对的第二结构域以小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10-9M、小于1x10-10M、小于1x10-11M、小于1x10-12M或小于1x10- 13M的解离平衡常数(KD)彼此结合。在一些实施例中，所述亲和结构域对的第一结构域和所述亲和结构域对的第二结构域以约1x10-4M到约1x10-6M、约1x10-5M到约1x10-7M、约1x10-6M到约1x10-8M、约1x10-7M到约1x10-9M、约1x10-8M到约1x10-10M、约1x10-9M到约1x10-11M、约1x10-10M到约1x10-12M、约1x10-11M到约1x10-13M、约1x10-4M到约1x10-5M、约1x10-5M到约1x10- 6M、约1x10-6M到约1x10-7M、约1x10-7M到约1x10-8M、约1x10-8M到约1x10-9M、约1x10-9M到约1x10-10M、约1x10-10M到约1x10-11M、约1x10-11M到约1x10-12M或约1x10-12M到约1x10-13M的KD彼此结合。可以使用本领域已知的多种不同方法中的任一种来确定所述亲和结构域对的第一结构域和所述亲和结构域对的第二结构域的结合的KD值(例如，电泳迁移率变化测定法、过滤器结合测定法、表面等离子体共振和生物分子结合动力学测定法等)。
在一些实施例中，第一和第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包含一对亲和结构域的第一结构域，并且第一和第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包含一对亲和结构域的第二结构域，其中所述亲和结构域对的第一结构域、所述亲和结构域对的第二结构域或两者的长度为约10到100个氨基酸。例如，一对亲和结构域的第一结构域、一对亲和结构域的第二个结构域或两者的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，一对亲和结构域的第一结构域、一对亲和结构域的第二结构域或两者的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的一对亲和结构域的第一和/或第二结构域中的任一个可以在其N端和/或C端包含一个或多个额外的氨基酸(例如，1个、2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸)，只要一对亲和结构域的第一和/或第二结构域的功能保留完整即可。例如，来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域可以在N端和/或C端包含一个或多个额外的氨基酸，同时仍保留与可溶性IL-15结合的能力。另外或可替代地，可溶性IL-15可以在N端和/或C端包含一个或多个额外的氨基酸，同时仍保留与来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域结合的能力。
来自IL-15受体α(IL15Rα)的α链的sushi结构域的非限制性实例可以包含与ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:24)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。在一些实施例中，来自IL15Rα的α链的sushi结构域可以由包含
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG(SEQ ID NO:25)的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性IL-15可以包含与
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:26)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。在一些实施例中，可溶性IL-15可以由包含序列
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC(SEQ ID NO:27)的核酸编码。
信号序列
在一些实施例中，本文所述的第一和第二多肽中的任一个在其N端包含信号序列。如本领域普通技术人员将理解，信号序列是存在于许多内源产生的蛋白质的N端的氨基酸序列，其将蛋白质引导到分泌路径(例如，蛋白质被引导以存在于某些细胞内细胞器中、存在于细胞膜中或从细胞中分泌)。信号序列是异质的，并且其一级氨基酸序列差异很大。然而，信号序列的长度典型地为16到30个氨基酸，并且包含亲水的通常带正电荷的N端区域、中央疏水结构域和含有信号肽酶切割位点的C端区域。
在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:28)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包含由核酸序列ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:29)、ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC(SEQ ID NO:30)或ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:31)编码的信号序列。
在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含具有氨基酸序列MKCLLYLAFLFLGVNC(SEQ ID NO:32)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含具有氨基酸序列MGQIVTMFEALPHIIDEVINIVIIVLIIITSIKAVYNFATCGILALVSFLFLAGRSCG(SEQ ID NO:33)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含具有氨基酸序列MPNHQSGSPTGSSDLLLSGKKQRPHLALRRKRRREMRKINRKVRRMNLAPIKEKTAWQHLQALISEAEEVLKTSQTPQNSLTLFLALLSVLGPPVTG(SEQ ID NO:34)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含具有氨基酸序列MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS(SEQ ID NO:35)的信号序列。本领域普通技术人员将了解用于单链嵌合多肽的其它适当的信号序列。
在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含长度为约10到100个氨基酸的信号序列。例如，信号序列的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，信号序列的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的任何信号序列可以在其N端和/或C端包含一个或多个额外的氨基酸(例如，1个、2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸)，只要信号序列的功能保留完整即可。例如，具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:28)的信号序列可以在N端或C端包含一个或多个额外的氨基酸，同时仍然保留将单链嵌合多肽引导到分泌路径的能力。
在一些实施例中，第一和/或第二多肽包含将单链嵌合多肽引导到细胞外空间中的信号序列。此类实施例可用于产生相对容易分离和/或纯化的第一和/或第二多肽。
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽包含在其N端包含信号序列的第一嵌合多肽。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽包含在其N端包含信号序列的第二嵌合多肽。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽和第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽均包含信号序列。如本领域普通技术人员将理解，信号序列是存在于许多内源产生的蛋白质的N端的氨基酸序列，其将蛋白质引导到分泌路径(例如，蛋白质被引导以存在于某些细胞内细胞器中、存在于细胞膜中或从细胞中分泌)。信号序列是异质的，并且其一级氨基酸序列差异很大。然而，信号序列的长度典型地为16到30个氨基酸，并且包含亲水的通常带正电荷的N端区域、中央疏水结构域和含有信号肽酶切割位点的C端区域。
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ IDNO:28)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含由核酸序列
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:29)、ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC(SEQ ID NO:30)或
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:31)编码的信号序列。
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含具有氨基酸序列MKCLLYLAFLFLGVNC(SEQ ID NO:32)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含具有氨基酸序列MGQIVTMFEALPHIIDEVINIVIIVLIIITSIKAVYNFATCGILALVSFLFLAGRSCG(SEQ ID NO:36)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含具有氨基酸序列MPNHQSGSPTGSSDLLLSGKKQRPHLALRRKRRREMRKINRKVRRMNLAPIKEKTAWQHLQALISEAEEVLKTSQTPQNSLTLFLALLSVLGPPVTG(SEQ ID NO:37)的信号序列。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含具有氨基酸序列MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS(SEQID NO:38)的信号序列。本领域普通技术人员将了解用于本文描述的第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的其它合适的信号序列。
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含长度为约10到100个氨基酸的信号序列。例如，信号序列的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，信号序列的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的任何信号序列可以在其N端和/或C端包含一个或多个额外的氨基酸(例如，1个、2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸)，只要信号序列的功能保留完整即可。例如，具有氨基酸序列MKCLLYLAFLFLGVNC(SEQ ID NO:32)的信号序列可以在N端或C端包含一个或多个额外的氨基酸，同时仍然保留将第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者引导到分泌路径的能力。
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含将多链嵌合多肽引导到细胞外空间中的信号序列。此类实施例可用于产生相对容易分离和/或纯化的第一和/或第二多链嵌合多肽。
肽标签
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽包含第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含肽标签(例如，在第一嵌合多肽的N端或C端)。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽包含第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含肽标签(例如，在第二嵌合多肽的N端或C端)。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽和第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽均包含肽标签。在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含两个或更多个肽标签。
可以包含在第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者中的示例性肽标签包含但不限于AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:75)、钙调素标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL；SEQ ID NO:76)、聚谷氨酸标签(EEEEEE；SEQ ID NO:77)、E-标签(GAPVPYPDPLEPR；SEQ ID NO:78)、FLAG-标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:79)、HA-标签、来自血凝素的肽(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:80)、his-标签(HHHHH(SEQ ID NO:39)；HHHHHH(SEQ ID NO:40)；HHHHHHH(SEQ ID NO:41)；HHHHHHHH(SEQ ID NO:42)；HHHHHHHHH(SEQ ID NO:43)；或HHHHHHHHHH(SEQ ID NO:44))、myc-标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:45)、NE-标签(TKENPRSNQEESYDDNES；SEQ ID NO:46)、S-标签(KETAAAKFERQHMDS；SEQ ID NO:47)、SBP-标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP；SEQ ID NO:48)、Softag 1(SLAELLNAGLGGS；SEQ ID NO:49)、Softag 3(TQDPSRVG；SEQID NO:50)、Spot-标签(PDRVRAVSHWSS；SEQ ID NO:51)、Strep-标签(WSHPQFEK；SEQ ID NO:52)、TC标签(CCPGCC；SEQ ID NO:53)、Ty标签(EVHTNQDPLD；SEQ ID NO:54)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST；SEQ ID NO:55)、VSV-标签(YTDIEMNRLGK；SEQ ID NO:56)和Xpress标签(DLYDDDDK；SEQ ID NO:57)。在一些实施例中，组织因子蛋白是肽标签。
可以包含在第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者中的肽标签可用于任何与多链嵌合多肽相关的各种应用。例如，肽标签可用于纯化第一和/或第二多链嵌合多肽。作为一个非限制性实例，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽(例如，重组表达的第一嵌合多肽)、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽(例如，重组表达的第二嵌合多肽)或两者可以包含myc标签；可以使用识别myc标签的抗体纯化包含myc标记的第一嵌合多肽、myc标记的第二嵌合多肽或两者的第一和/或第二多链嵌合多肽。识别myc标签的抗体的一个非限制性实例是9E10，其可以从非商业发展研究杂交瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank)获得。作为另一个非限制性实例，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽(例如，重组表达的第一嵌合多肽)、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽(例如，重组表达的第二嵌合多肽)或两者可以包含组氨酸标签；可以使用镍或钴螯合物纯化包含组氨酸标记的第一嵌合多肽、组氨酸标记的第二嵌合多肽或两者的第一和/或第二多链嵌合多肽。本领域普通技术人员将了解其它合适的标签和结合那些标签的用于纯化第一和/或第二多链嵌合多肽的试剂。在一些实施例中，在纯化后从第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽中去除肽标签。在一些实施例中，在纯化后不从第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽中不去除肽标签。
可包含在第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者中的肽标签可用于例如第一和/或第二多链嵌合多肽的免疫沉淀中，第一和/或第二多链嵌合多肽的成像(例如，通过蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术和/或免疫细胞化学)和/或第一和/或第二多链嵌合多肽的增溶。
在一些实施例中，第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者包含长度为约10到100个氨基酸的肽标签。例如，肽标签的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，肽标签的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
包含在第一和/或第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽、第一和/或第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽或两者中的肽标签可以具有任何合适的长度。例如，肽标签的长度可以为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸。在其中第一和/或第二多链嵌合多肽包含两个或更多个肽标签的实施例中，两个或更多个肽标签可以具有相同或不同的长度。在一些实施例中，本文公开的任何肽标签可以在N端和/或C端包含一个或多个额外的氨基酸(例如，1个、2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸)，只要肽标签的功能保留完整即可。例如，具有氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:58)的myc标签可以包含一个或多个额外的氨基酸(例如，在肽标签的N端和/或C端)，同时仍然保留被抗体(例如，9E10)结合的能力。
组合物/试剂盒
本文还提供了组合物(例如，药物组合物)，其包含本文所述的任何单链嵌合多肽、多链嵌合多肽、IgG1抗体构建体、任何细胞或任何核酸中的至少一种。在一些实施例中，组合物包含本文所述的任何单链嵌合多肽中的至少一种。在一些实施例中，组合物包含本文所述的任何多链嵌合多肽(例如，第一多链嵌合多肽和/或第二多链嵌合多肽)中的至少一种。在一些实施例中，组合物包含本文所述的任何多链嵌合多肽和任何IgG1抗体中的至少一种。在一些实施例中，组合物包含任何NK细胞(例如，本文所述的任何NK细胞，例如，使用本文所述的任何方法产生的任何NK细胞)。
在一些实施例中，药物组合物被配制成用于不同的施用途径(例如，静脉内、皮下)。在一些实施例中，药物组合物可以包含药学上可接受的载剂(例如，磷酸盐缓冲盐水)。
可将药物组合物的单次或多次施用给予有需要的受试者，其取决于例如：受试者所需和耐受的剂量和频率。调配物应提供足够量的活性剂以有效治疗、预防或改善病况、疾病或症状。
本文还提供了试剂盒，其包含本文所述的任何多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何第一多链嵌合多肽和第二多链多肽)、IgG1抗体构建体(例如，本文所述的任何IgG1抗体构建体)、组合物、核酸和/或细胞(例如，NK细胞)。在一些实施例中，试剂盒可以包含用于进行本文所述的任何方法的说明书。在一些实施例中，试剂盒可以包含至少一个剂量的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的NK细胞(例如，活化的NK细胞)。本文还提供了药物组合物，其包含通过本文所述的任何方法产生的任何活化的NK细胞。本文还提供了包含本文所述的任何药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含通过本文所述的任何方法产生的任何活化的NK细胞(例如，活化的NK细胞)。
本文还提供了试剂盒，其包含本文所述的任何IgG1抗体构建体和本文所述的任何多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何示例性第一多链嵌合多肽和/或本文所述的任何示例性第二多链嵌合多肽)。在本文所述的任何试剂盒的一些实施例中，试剂盒进一步包含用于进行本文所述的任何方法的说明书。
核酸/载体
本文还提供了编码本文所述的任何第一多链嵌合多肽的任何第一和/或第二多肽的核酸。本文还提供了包含编码本文所述的任何第二多链嵌合多肽的任何第一和/或第二多肽的任何核酸的载体。
本文还提供了包含编码本文所述的任何多链嵌合多肽的任何核酸的载体。在一些实施例中，第一载体可以包含编码第一多链嵌合多肽的第一嵌合多肽的核酸，并且第二载体可以包含编码第一多链嵌合多肽的第二嵌合多肽的核酸。在一些实施例中，单个载体可以包含编码第一多链嵌合多肽的第一嵌合多肽的第一核酸和编码第一多链嵌合多肽的第二嵌合多肽的第二核酸。
在一些实施例中，第一载体可以包含编码第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽的核酸，并且第二载体可以包含编码第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽的核酸。在一些实施例中，单个载体可以包含编码第二多链嵌合多肽的第一嵌合多肽的核酸和编码第二多链嵌合多肽的第二嵌合多肽的第二核酸。
本文还提供了编码第一和第二多链嵌合多肽的单个核酸序列。在一些实施例中，单个核酸可以编码第一多链嵌合多肽的第一和第二嵌合多肽两者，以及第二多链嵌合多肽的第一和第二嵌合多肽两者。
本文还提供了包含编码第一和第二多链嵌合多肽(例如，第一和第二多链嵌合多肽各自的第一和第二嵌合多肽)两者的单个核酸序列的载体。
本文还提供了编码本文所述的任何IgG1抗体构建体的核酸。
本文所述的任何载体可以是表达载体。例如，表达载体可以包含启动子序列，所述启动子序列可操作地连接到编码单链嵌合多肽或编码多链嵌合多肽的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的序列。在另一个实例中，表达载体可以包含与编码本文所述的任何第一多肽和/或第二多肽的序列可操作地连接的启动子序列。
载体的非限制性实例包含质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如，任何腺病毒载体(例如pSV或pCMV载体)、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)和任何
Figure BDA0003508369120001161
载体。载体可以例如包含足够的用于表达的顺式作用元件；其它表达元件可以由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中供应。熟练从业人员将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞以制备本文所述的任何单链嵌合多肽或多链嵌合多肽。
细胞
本文还提供了包括本文所述的任何核酸的细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，所述核酸编码本文所述的任何第一多链嵌合多肽的任何示例性第一多肽和/或第二多肽。
本文还提供了包含本文所述的任何载体的细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，所述载体编码本文所述的任何第一多链嵌合多肽的任何第一多肽和/或第二多肽。
本文还提供了包括本文所述的任何核酸的细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，所述核酸编码本文所述的任何第二多链嵌合多肽的任何第一多肽和/或第二多肽。
本文还提供了包含本文所述的任何载体的细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，所述载体编码本文所述的任何第二多链嵌合多肽的任何第一多肽和/或第二多肽。
本文还提供了包括本文所述的任何核酸的细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，所述核酸编码本文所述的任何多链嵌合多肽(例如，编码第一多链嵌合多肽和/或第二多链嵌合多肽的第一和第二嵌合多肽两者)。本文还提供了包含本文所述的任何载体的细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，所述载体编码本文所述的任何多链嵌合多肽(例如，编码第一多链嵌合多肽和/或第二多链嵌合多肽的第一和第二嵌合多肽两者)。
本文还提供了细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，其包含(i)本文描述的编码第一多链嵌合多肽的任何核酸、(ii)本文所述的编码第二多链嵌合多肽的任何核酸和(iii)本文所述的编码IgG1抗体构建体的任何核酸。
本文还提供了细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性细胞)，其包含(i)本文描述的编码第一多链嵌合多肽的任何载体、(ii)编码第二多链嵌合多肽的任何载体和(iii)编码IgG1抗体构建体的任何载体。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，细胞可以是真核细胞。如本文所使用的，术语“真核细胞”是指具有明显的膜结合核的细胞。这类细胞可以包含例如哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物或人)、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施例中，真核细胞是酵母细胞，如啤酒酵母。在一些实施例中，真核细胞是高级真核生物，如哺乳动物、禽类、植物或昆虫细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包含中国仓鼠卵巢细胞和人胚胎肾细胞(例如，HEK293细胞)。
将核酸和表达载体引入到细胞(例如，真核细胞)中的方法是本领域已知的。可用于将核酸引入到细胞中的方法的非限制性实例包含脂质转染、转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙转染、基于树状大分子的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、声致穿孔、光学转染、刺穿感染、流体动力学递送、磁转染、病毒转导(例如，腺病毒和慢病毒转导)和纳米颗粒转染。
产生单链和多链嵌合多肽的方法
本文还提供了产生本文所述的任何单链嵌合多肽的方法，所述方法包含在足以引起产生单链嵌合多肽的条件下在培养基中培养本文所述的任何细胞；以及从细胞和/或培养基回收单链嵌合多肽。
可以使用本领域众所周知的技术(例如硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、离子交换色谱(阴离子或阳离子)、基于疏水相互作用的色谱、金属亲和色谱、配体亲和色谱和尺寸排阻色谱)从培养基或细胞(例如真核细胞)回收单链嵌合多肽。
本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的单链嵌合多肽(例如，本文所述的任何单链嵌合多肽)。
本文还提供了产生本文所述的任何多链嵌合多肽的方法，所述方法包含在足以引起产生多链嵌合多肽的条件下在培养基中培养本文所述的任何细胞；以及从细胞和/或培养基回收多链嵌合多肽。
本文还提供了产生本文所述的任何多链嵌合多肽的方法，所述方法包含：在足以引起产生第一嵌合多肽的条件下，在第一培养基中培养本文所述的任何细胞；从细胞和/或第一培养基中回收第一嵌合多肽；在足以引起产生第二嵌合多肽的条件下，在第二培养基中培养本文所述的任何细胞；从细胞和/或第二培养基中回收第二嵌合多肽；以及组合(例如，混合)回收的第一嵌合多肽和回收的第二嵌合多肽以形成多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何多链嵌合多肽)。
可以使用本领域众所周知的技术(例如硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、离子交换色谱(阴离子或阳离子)、基于疏水相互作用的色谱、金属亲和色谱、配体亲和色谱和尺寸排阻色谱)从细胞(例如真核细胞)回收多链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽。
本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何多链嵌合多肽)、第一嵌合多肽(例如，任何第一嵌合多肽)或第二嵌合多肽(例如，本文所述的任何第二嵌合多肽)。
培养细胞的方法是本领域众所周知的。可以将细胞体外维持在有利于增殖、分化和生长的条件下。简单来说，可以通过使细胞(例如，任何细胞)与细胞培养基接触来培养细胞，所述细胞培养基包含必需的生长因子和补充剂以支持细胞活力和生长。
促进免疫细胞活化和增殖的方法
本文还提供了促进NK细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性NK细胞)活化和增殖的方法，所述方法包含：在允许NK细胞的分化的条件下使所述NK细胞在包含有效量的本文所述的第一多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第一时间段；以及在允许所述NK细胞的活化和增殖的条件下使所述NK细胞在包含有效量的(i)本文所述的第二多链嵌合多肽和(ii)包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，特异性结合到接头结构域的单克隆或多克隆人、小鼠、兔或山羊IgG1抗体，或本文所述的任何其它示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在这些方法的一些实施例中，IgG1抗体构建体包含特异性结合到第二多链嵌合多肽中的接头结构域的至少一个抗原结合结构域。在这些方法的一些实施例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实施例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，第一时间段为约15分钟到约4小时(例如，约15分钟到约3.75小时、约15分钟到约3.5小时、约15分钟到约3.25小时、约15分钟到约3小时、约15分钟到约2.75小时、约15分钟到约2.5小时、约15分钟到约2.25小时、约15分钟到约2小时、约15分钟到约1.75小时、约15分钟到约1.5小时、约15分钟到约1.25小时、约15分钟到约1小时、约15分钟到约45分钟、约15分钟到约30分钟、约30分钟到约3.75小时、约30分钟到约3.5小时、约30分钟到约3.25小时、约30分钟到约3小时、约30分钟到约2.75小时、约30分钟到约2.5小时、约30分钟到约2.25小时、约30分钟到约2小时、约30分钟到约1.75小时、约30分钟到约1.5小时、约30分钟到约1.25小时、约30分钟到约1小时、约30分钟到约45分钟、约45分钟到约3.75小时、约45分钟到约3.5小时、约45分钟到约3.25小时、约45分钟到约3小时、约45分钟到约2.75小时、约45分钟到约2.5小时、约45分钟到约2.25小时、约45分钟到约2小时、约45分钟到约1.75小时、约45分钟到约1.5小时、约45分钟到约1.25小时、约45分钟到1小时、约1小时到约3.75小时、约1小时到约3.5小时、约1小时到约3.25小时、约1小时到约3小时、约1小时到约2.75小时、约1小时到约2.5小时、约1小时到约2.5小时、约1小时到约2.25小时、约1小时到约2小时、约1小时到约1.75小时、约1小时到约1.5小时、约1小时到约1.25小时、约1.25小时到约3.75小时、约1.25小时到约3.5小时、约1.25小时到约3.25小时、约1.25小时到约3小时、约1.25小时到约2.75小时、约1.25小时到约2.75小时、约1.25小时到约2.5小时、约1.25小时到约2.25小时、约1.25小时到约2小时、约1.25小时到约1.75小时、约1.25小时到约1.5小时、约1.5小时到约3.75小时、约1.5小时到约3.5小时、约1.5小时到约3.25小时、约1.5小时到约3小时、约1.5小时到约2.75小时、约1.5小时到约2.5小时、约1.5小时到约2.25小时、约1.5小时到约2小时、约1.5小时到约1.75小时、约1.75小时到约3.75小时、约1.75小时到约3.5小时、约1.75小时到约3.25小时、约1.75小时到约3小时、约1.75小时到约2.75小时、约1.75小时到约2.5小时、约1.75小时到约2.25小时或约1.75小时到2小时)。
在这些方法的一些实施例中，第二时间段为约1天到约30天(例如，约1天到约28天、约1天到约26天、约1天到约24天、约1天到约22天、约1天到约20天、约1天到约18天、约1天到约16天、约1天到约14天、约1天到约12天、约1天到约10天、约1天到约8天、约1天到约7天、约1天到约6天、约1天到约5天、约1天到约4天、约1天到约3天、约1天到约2天、约2天到约28天、约2天到约26天、约2天到约24天、约2天到约22天、约2天到约20天、约2天到约18天、约2天到约16天、约2天到约14天、约2天到约12天、约2天到约10天、约2天到约8天、约2天到约7天、约2天到约6天、约2天到约5天、约2天到约4天、约2天到约3天、约3天到约28天、约3天到约26天、约3天到约24天、约3天到约22天、约3天到约20天、约3天到约18天、约3天到约16天、约3天到约14天、约3天到约12天、约3天到约10天、约3天到约8天、约3天到约7天、约3天到约6天、约3天到约5天、约3天到约4天、约4天到约28天、约4天到约26天、约4天到约24天、约4天到约22天、约4天到约20天、约4天到约18天、约4天到约16天、约4天到约14天、约4天到约12天、约4天到约10天、约4天到约8天、约4天到约7天、约4天到约6天、约4天到约5天、约5天到约28天、约5天到约26天、约5天到约24天、约5天到约22天、约5天到约20天、约5天到约18天、约5天到约16天、约5天到约14天、约5天到约12天、约5天到约10天、约5天到约8天、约5天到约7天、约5天到约6天、约6天到约28天、约6天到约26天、约6天到约24天、约6天到约22天、约6天到约20天、约6天到约18天、约6天到约16天、约6天到约14天、约6天到约12天、约6天到约10天、约6天到约8天、约6天到约7天、约7天到约28天、约7天到约26天、约7天到约24天、约7天到约22天、约7天到约20天、约7天到约18天、约7天到约16天、约7天到约14天、约7天到约12天、约7天到约10天、约7天到约8天、约8天到约28天、约8天到约26天、约8天到约24天、约8天到约22天、约8天到约20天、约8天到约18天、约8天到约16天、约8天到约14天、约8天到约12天、约8天到约10天、约8天到约9天、约9天到约28天、约9天到约26天、约9天到约24天、约9天到约22天、约9天到约20天、约9天到约18天、约9天到约16天、约9天到约14天、约9天到约12天、约9天到约10天、约10天到约28天、约10天到约26天、约10天到约24天、约10天到约22天、约10天到约20天、约10天到约18天、约10天到约16天、约10天到约14天、约10天到约12天、约12天到约28天、约12天到约26天、约12天到约24天、约12天到约22天、约12天到约20天、约12天到约18天、约12天到约16天、约12天到约14天、约14天到约28天、约14天到约26天、约14天到约24天、约14天到约22天、约14天到约20天、约14天到约18天、约14天到约16天、约16天到约28天、约16天到约26天、约16天到约24小时、约16天到约22天、约16天到约20天、约16天到约18天、约18天到约28天、约18天到约26天、约18天到约24天、约18天到约22天、约18天到约20天、约20天到约28天、约20天到约26天、约20天到约24天、约20天到约22天、22天到约28天、约22天到约26天、约22天到约24天、约24天到约28天、约24天到约26天或约26到约28天。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，液体培养基是无血清液体培养基。在本文所述的任何方法的一些实施例中，液体培养基是化学成分确定的液体培养基。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，NK细胞先前是从受试者获得的。本文所述的任何方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。
在一些实施例中，所述NK细胞先前从脐带血或诱导多能干细胞中获得。本文所述的任何方法的一些实施例进一步包含从脐带血获得NK细胞。一些实施例进一步包含从诱导多能干细胞产生NK细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
本文所述的任何方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。
本文所述的任何方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。
本文所述的任何方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，在第一和/或第二时间段之后，NK细胞是趋化因子诱导的记忆NK细胞。在一些实例中，与第一时间段之前一种或多种蛋白质的表达或分泌水平相比，在第一和/或第二时间段之后，NK细胞的一种或多种蛋白质的表达、分泌和/或活性水平增加，所述一种或多种蛋白质选自由以下组成的组：2B4、CD8、CD11a、CD16、CD25、CD27、CD48、CD49d、CD54、CD56、CD58、CD62L、CD69、CD70、CD94、CD137、CD158a、CD158b、CD158e、CD178、CD226、CD253、NKG2C、NKG2D、LIR-1、LILR-B1、KIR2DL1、KIR3DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、CXCR3、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、TRAIL、FasL、CXCR3、CXCR4、LTB、MX1、BAX、TNF-α、STAT5和IFN-γ。
本文所述的任何方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在本文所述的任何方法的一些实施例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的活化的NK。本文还提供了药物组合物，其包含通过本文所述的任何方法产生的任何NK细胞。本文还提供了包含任何药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含通过本文所述的任何方法产生的任何活化的NK细胞。
刺激NK细胞的方法
本文还提供了刺激NK细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性NK细胞)的方法，所述方法包含：在允许NK细胞的分化的条件下使所述NK细胞在包含有效量的本文所述的第一多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第一时间段；以及在允许所述NK细胞的刺激的条件下使所述NK细胞在包含有效量的(i)本文所述的第二多链嵌合多肽和(ii)包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，特异性结合到接头结构域的单克隆或多克隆人、小鼠、兔或山羊IgG1抗体，或本文所述的任何其它示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。在一些实例中，使NK细胞在体外接触(例如，在足以导致NK细胞刺激的条件下在合适的液体培养基中)。在一些实例中，所述接触进一步包含使NK细胞与有效量的本文所述的任何IgG1抗体构建体接触。
在一些实例中，NK细胞先前已从受试者(例如哺乳动物，例如人)获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。
在一些实例中，使NK细胞在体内接触。在此类实施例中，以足以刺激受试者免疫细胞的量将第一多链嵌合多肽、第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体施用于受试者(例如哺乳动物，例如人)。在本文所述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，将IgG1抗体构建体(例如，本文所述的任何示例性IgG1抗体构建体)与第一和第二多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽)组合(例如，同时或按顺序)施用于受试者。
在一些实例中，NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
这些方法的一些实施例可以进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入NK细胞(例如，本文所述的任何NK细胞)中。这些方法的一些实施例可以进一步包含向有需要的受试者(例如，本文所述的任何示例性受试者)施用治疗有效量的NK细胞。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况的受试者。与年龄相关的疾病或病症的非限制性实例包含：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴定或诊断为患有癌症的受试者。癌症的非限制性实例包含：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在一些实例中，受试者可以是已被诊断或鉴定为患有感染性疾病的受试者。感染性疾病的非限制性实例包含人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒或流感病毒的感染。
可以使用本领域已知的方法确定NK细胞的活化。例如，免疫细胞的活化可以通过检测在免疫细胞活化时分泌或上调的细胞因子、趋化因子和活化受体的水平来确定。在免疫细胞活化时分泌或上调的细胞因子、趋化因子和活化受体的非限制性实例包含：IL-2、干扰素-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-33、白三烯B4、CCL5、TNFα、穿孔素、TGFβ、STAT3、RORγT、FOXP3、STAT6、GATA3、颗粒酶A、颗粒酶B、2B4、CD8、CD11a、CD16、CD25、CD27、CD48、CD49d、CD54、CD56、CD58、CD62L、CD69、CD70、CD94、CD137、CD158a、CD158b、CD158e、CD178、CD226、CD253、NKG2C、NKG2D、LIR-1、LILR-B1、KIR2DL1、KIR3DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、CXCR3、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、TRAIL、FasL、CXCR3、CXCR4、LTB、MX1、BAX、TNF-α和IFN-γ。这些细胞因子和趋化因子的检测可以使用免疫测定法(例如，酶联免疫吸附测定法)进行。例如，免疫细胞的活化可导致本文所述的任何细胞因子或趋化因子中的一种或多种(例如，IL-2、干扰素-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-33、白三烯B4、CCL5、TNFα、颗粒酶、穿孔素、TGFβ、STAT3、RORγT、FOXP3、STAT6和GATA3)增加约1％到约800％(例如，约1％到约750％、约1％到约700％、约1％到约650％、约1％到约600％、约1％到约550％、约1％到约500％、约1％到约450％、约1％到约400％、约1％到约350％、约1％到约300％、约1％到约280％、约1％到约260％、约1％到约240％、约1％到约220％、约1％到约200％、约1％到约180％、约1％到约160％、约1％到约140％、约1％到约120％、约1％到约100％、约1％到约90％、约1％到约80％、约1％到约70％、约1％到约60％、约1％到约50％、约1％到约45％、约1％到约40％、约1％到约35％、约1％到约30％、约1％到约25％、约1％到约20％、约1％到约15％、约1％到约10％、约1％到约5％、约5％到约800％、约5％到约750％、约5％到约700％、约5％到约650％、约5％到约600％、约5％到约550％、约5％到约500％、约5％到约450％、约5％到约400％、约5％到约350％、约5％到约300％、约5％到约280％、约5％到约260％、约5％到约240％、约5％到约220％、约5％到约200％、约5％到约180％、约5％到约160％、约5％到约140％、约5％到约120％、约5％到约100％、约5％到约90％、约5％到约80％、约5％到约70％、约5％到约60％、约5％到约50％、约5％到约45％、约5％到约40％、约5％到约35％、约5％到约30％、约5％到约25％、约5％到约20％、约5％到约15％、约5％到约10％、约10％到约800％、约10％到约750％、约10％到约700％、约10％到约650％、约10％到约600％、约10％到约550％、约10％到约500％、约10％到约450％、约10％到约400％、约10％到约350％、约10％到约300％、约10％到约280％、约10％到约260％、约10％到约240％、约10％到约220％、约10％到约200％、约10％到约180％、约10％到约160％、约10％到约140％、约10％到约120％、约10％到约100％、约10％到约90％、约10％到约80％、约10％到约70％、约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约45％、约10％到约40％、约10％到约35％、约10％到约30％、约10％到约25％、约10％到约20％、约10％到约15％、约15％到约800％、约15％到约750％、约15％到约700％、约15％到约650％、约15％到约600％、约15％到约550％、约15％到约500％、约15％到约450％、约15％到约400％、约15％到约350％、约15％到约300％、约15％到约280％、约15％到约260％、约15％到约240％、约15％到约220％、约15％到约200％、约15％到约180％、约15％到约160％、约15％到约140％、约15％到约120％、约15％到约100％、约15％到约90％、约15％到约80％、约15％到约70％、约15％到约60％、约15％到约50％、约15％到约45％、约15％到约40％、约15％到约35％、约15％到约30％、约15％到约25％、约15％到约20％、约20％到约800％、约20％到约750％、约20％到约700％、约20％到约650％、约20％到约600％、约20％到约550％、约20％到约500％、约20％到约450％、约20％到约400％、约20％到约350％、约20％到约300％、约20％到约280％、约20％到约260％、约20％到约240％、约20％到约220％、约20％到约200％、约20％到约180％、约20％到约160％、约20％到约140％、约20％到约120％、约20％到约100％、约20％到约90％、约20％到约80％、约20％到约70％、约20％到约60％、约20％到约50％、约20％到约45％、约20％到约40％、约20％到约35％、约20％到约30％、约20％到约25％、约25％到约800％、约25％到约750％、约25％到约700％、约25％到约650％、约25％到约600％、约25％到约550％、约25％到约500％、约25％到约450％、约25％到约400％、约25％到约350％、约25％到约300％、约25％到约280％、约25％到约260％、约25％到约240％、约25％到约220％、约25％到约200％、约25％到约180％、约25％到约160％、约25％到约140％、约25％到约120％、约25％到约100％、约25％到约90％、约25％到约80％、约25％到约70％、约25％到约60％、约25％到约50％、约25％到约45％、约25％到约40％、约25％到约35％、约35％到约800％、约35％到约750％、约35％到约700％、约35％到约650％、约35％到约600％、约35％到约550％、约35％到约500％、约35％到约450％、约35％到约400％、约35％到约350％、约35％到约300％、约35％到约280％、约35％到约260％、约35％到约240％、约35％到约220％、约35％到约200％、约35％到约180％、约35％到约160％、约35％到约140％、约35％到约120％、约35％到约100％、约35％到约90％、约35％到约80％、约35％到约70％、约35％到约60％、约35％到约50％、约35％到约45％、约35％到约40％、约40％到约800％、约40％到约750％、约40％到约700％、约40％到约650％、约40％到约600％、约40％到约550％、约40％到约500％、约40％到约450％、约40％到约400％、约40％到约350％、约40％到约300％、约40％到约280％、约40％到约260％、约40％到约240％、约40％到约220％、约40％到约200％、约40％到约180％、约40％到约160％、约40％到约140％、约40％到约120％、约40％到约100％、约40％到约90％、约40％到约80％、约40％到约70％、约40％到约60％、约40％到约50％、约40％到约45％、约45％到约800％、约45％到约750％、约45％到约700％、约45％到约650％、约45％到约600％、约45％到约550％、约45％到约500％、约45％到约450％、约45％到约400％、约45％到约350％、约45％到约300％、约45％到约280％、约45％到约260％、约45％到约240％、约45％到约220％、约45％到约200％、约45％到约180％、约45％到约160％、约45％到约140％、约45％到约120％、约45％到约100％、约45％到约90％、约45％到约80％、约45％到约70％、约45％到约60％、约45％到约50％、约50％到约800％、约50％到约750％、约50％到约700％、约50％到约650％、约50％到约600％、约50％到约550％、约50％到约500％、约50％到约450％、约50％到约400％、约50％到约350％、约50％到约300％、约50％到约280％、约50％到约260％、约50％到约240％、约50％到约220％、约50％到约200％、约50％到约180％、约50％到约160％、约50％到约140％、约50％到约120％、约50％到约100％、约50％到约90％、约50％到约80％、约50％到约70％、约50％到约60％、约60％到约800％、约60％到约750％、约60％到约700％、约60％到约650％、约60％到约600％、约60％到约550％、约60％到约500％、约60％到约450％、约60％到约400％、约60％到约350％、约60％到约300％、约60％到约280％、约60％到约260％、约60％到约240％、约60％到约220％、约60％到约200％、约60％到约180％、约60％到约160％、约60％到约140％、约60％到约120％、约60％到约100％、约60％到约90％、约60％到约80％、约60％到约70％、约70％到约800％、约70％到约750％、约70％到约700％、约70％到约650％、约70％到约600％、约70％到约550％、约70％到约500％、约70％到约450％、约70％到约400％、约70％到约350％、约70％到约300％、约70％到约280％、约70％到约260％、约70％到约240％、约70％到约220％、约70％到约200％、约70％到约180％、约70％到约160％、约70％到约140％、约70％到约120％、约70％到约100％、约70％到约90％、约70％到约80％、约80％到约800％、约80％到约750％、约80％到约700％、约80％到约650％、约80％到约600％、约80％到约550％、约80％到约500％、约80％到约450％、约80％到约400％、约80％到约350％、约80％到约300％、约80％到约280％、约80％到约260％、约80％到约240％、约80％到约220％、约80％到约200％、约80％到约180％、约80％到约160％、约80％到约140％、约80％到约120％、约80％到约100％、约80％到约90％、约90％到约800％、约90％到约750％、约90％到约700％、约90％到约650％、约90％到约600％、约90％到约550％、约90％到约500％、约90％到约450％、约90％到约400％、约90％到约350％、约90％到约300％、约90％到约280％、约90％到约260％、约90％到约240％、约90％到约220％、约90％到约200％、约90％到约180％、约90％到约160％、约90％到约140％、约90％到约120％、约90％到约100％、约100％到约800％、约100％到约750％、约100％到约700％、约100％到约650％、约100％到约600％、约100％到约550％、约100％到约500％、约100％到约450％、约100％到约400％、约100％到约350％、约100％到约300％、约100％到约280％、约100％到约260％、约100％到约240％、约100％到约220％、约100％到约200％、约100％到约180％、约100％到约160％、约100％到约140％、约100％到约120％、约120％到约800％、约120％到约750％、约120％到约700％、约120％到约650％、约120％到约600％、约120％到约550％、约120％到约500％、约120％到约450％、约120％到约400％、约120％到约350％、约120％到约300％、约120％到约280％、约120％到约260％、约120％到约240％、约120％到约220％、约120％到约200％、约120％到约180％、约120％到约160％、约120％到约140％、约140％到约800％、约140％到约750％、约140％到约700％、约140％到约650％、约140％到约600％、约140％到约550％、约140％到约500％、约140％到约450％、约140％到约400％、约140％到约350％、约140％到约300％、约140％到约280％、约140％到约260％、约140％到约240％、约140％到约220％、约140％到约200％、约140％到约180％、约140％到约160％、约160％到约800％、约160％到约750％、约160％到约700％、约160％到约650％、约160％到约600％、约160％到约550％、约160％到约500％、约160％到约450％、约160％到约400％、约160％到约350％、约160％到约300％、约160％到约280％、约160％到约260％、约160％到约240％、约160％到约220％、约160％到约200％、约160％到约180％、约180％到约800％、约180％到约750％、约180％到约700％、约180％到约650％、约180％到约600％、约180％到约550％、约180％到约500％、约180％到约450％、约180％到约400％、约180％到约350％、约180％到约300％、约180％到约280％、约180％到约260％、约180％到约240％、约180％到约220％、约180％到约200％、约200％到约800％、约200％到约750％、约200％到约700％、约200％到约650％、约200％到约600％、约200％到约550％、约200％到约500％、约200％到约450％、约200％到约400％、约200％到约350％、约200％到约300％、约200％到约280％、约200％到约260％、约200％到约240％、约200％到约220％、约220％到约800％、约220％到约750％、约220％到约700％、约220％到约650％、约220％到约600％、约220％到约550％、约220％到约500％、约220％到约450％、约220％到约400％、约220％到约350％、约220％到约300％、约220％到约280％、约220％到约260％、约220％到约240％、约240％到约800％、约240％到约750％、约240％到约700％、约240％到约650％、约240％到约600％、约240％到约550％、约240％到约500％、约240％到约450％、约240％到约400％、约240％到约350％、约240％到约300％、约240％到约280％、约240％到约260％、约260％到约800％、约260％到约750％、约260％到约700％、约260％到约650％、约260％到约600％、约260％到约550％、约260％到约500％、约260％到约450％、约260％到约400％、约260％到约350％、约260％到约300％、约260％到约280％、约280％到约800％、约280％到约750％、约280％到约700％、约280％到约650％、约280％到约600％、约280％到约550％、约280％到约500％、约280％到约450％、约280％到约400％、约280％到约350％、约280％到约300％、约300％到约800％、约300％到约750％、约300％到约700％、约300％到约650％、约300％到约600％、约300％到约550％、约300％到约500％、约300％到约450％、约300％到约400％、约300％到约350％、约350％到约800％、约350％到约750％、约350％到约700％、约350％到约650％、约350％到约600％、约350％到约550％、约350％到约500％、约350％到约450％、约350％到约400％、约400％到约800％、约400％到约750％、约400％到约700％、约400％到约650％、约400％到约600％、约400％到约550％、约400％到约500％、约400％到约450％、约450％到约800％、约450％到约750％、约450％到约700％、约450％到约650％、约450％到约600％、约450％到约550％、约450％到约500％、约500％到约800％、约500％到约750％、约500％到约700％、约500％到约650％、约500％到约600％、约500％到约550％、约550％到约800％、约550％到约750％、约550％到约700％、约550％到约650％、约550％到约600％、约600％到约800％、约600％到约750％、约600％到约700％、约600％到约650％、约650％到约800％、约650％到约750％、约650％到约700％、约700％到约800％、约700％到约750％或约750％到约800％)(例如，与未与本文所述的任何单链嵌合多肽或任何多链嵌合多肽接触的对照中的一种或多种细胞因子和趋化因子的水平相比)。
诱导或增加NK细胞增殖的方法
本文还提供了诱导或增加NK细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性NK细胞)增殖的方法，所述方法包含：在允许NK细胞的分化的条件下使所述NK细胞在包含有效量的本文所述的第一多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第一时间段；以及在允许诱导或增加所述NK细胞的增殖的条件下使所述NK细胞在包含有效量的(i)本文所述的第二多链嵌合多肽和(ii)包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，特异性结合到接头结构域的单克隆或多克隆人、小鼠、兔或山羊IgG1抗体，或本文所述的任何其它示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在一些实例中，使NK细胞在体外接触(例如，在足以导致免疫细胞刺激的条件下在合适的液体培养基中)。在一些实例中，使NK细胞进一步与本文所述的任何IgG1抗体构建体在体外接触，与使免疫细胞在体外接触多链嵌合多肽(例如，本文所述的第一和/或第二多链嵌合多肽中的任一种)组合(例如，同时或按顺序)。
在一些实例中，NK细胞先前已从受试者(例如哺乳动物，例如人)获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。
在一些实例中，使NK细胞在体内接触。在此类实施例中，将任何第一多链嵌合多肽、任何第二多链嵌合多肽和任何IgG1抗体构建体以足以刺激受试者NK细胞的量施用于受试者(例如哺乳动物，例如人)。
在一些实例中，NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
这些方法的一些实施例可以进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入NK细胞(例如，本文所述的任何NK细胞)中。
这些方法的一些实施例可以进一步包含向有需要的受试者(例如，本文所述的任何示例性受试者)施用治疗有效量的NK细胞。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况的受试者。与年龄相关的疾病或病症的非限制性实例包含：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴定或诊断为患有癌症的受试者。癌症的非限制性实例包含：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在一些实例中，受试者可以是已被诊断或鉴定为患有感染性疾病的受试者。感染性疾病的非限制性实例包含人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒或流感病毒的感染。
免疫细胞增殖的检测可以使用本领域已知的方法进行，例如细胞术(例如，荧光辅助流式细胞术)、显微术和免疫荧光显微术，例如通过将未与单链嵌合多肽或多链嵌合多肽接触的样品中免疫细胞浓度的增加速率与本文所述的任何单链嵌合多肽或本文所述的任何多链嵌合多肽接触的类似样品中免疫细胞浓度的增加速率进行比较。
在其它实例中，通过检测增殖性免疫细胞在表面分泌或上调的一种或多种细胞因子、趋化因子和增殖生物标志物(例如，IL-2、干扰素-γ、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-33、白三烯B4、CCL5、TNFα、TGFβ、TNF-α、IFN-γ和Ki67中的一种或多种)的水平升高(例如，与未与本文所述的任何单链嵌合多肽接触的对照中的一种或多种细胞因子和趋化因子的水平相比)，可以间接检测NK细胞的增殖。
在一些实施例中，与第一时间段之前类似对照样品中的增加速率相比，本文提供的方法可导致与本文所述的任何第一和第二多链嵌合多肽以及本文所述的IgG1抗体构建体接触(如本文所述方法中所述)的样品中NK浓度增加速率的增加(例如，约1％到约800％的增加，或本文所述的该范围的任何子范围)。
诱导NK细胞分化的方法
本文还提供了诱导NK细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性免疫细胞)分化的方法，所述方法包含：在允许NK细胞的分化的条件下使所述NK细胞在包含有效量的本文所述的第一多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第一时间段；以及在允许所述NK细胞的活化和增殖的条件下使所述NK细胞在包含有效量的(i)本文所述的第二多链嵌合多肽和(ii)包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，特异性结合到接头结构域的单克隆或多克隆人、小鼠、兔或山羊IgG1抗体，或本文所述的任何其它示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。在一些实例中，使NK细胞在体外接触(例如，在足以导致NK细胞刺激的条件下在合适的液体培养基中)。
在一些实例中，NK细胞先前已从受试者(例如哺乳动物，例如人)获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。
在一些实例中，使免疫细胞在体内接触。在此类实施例中，可以将本文所述的任何第一多链嵌合多肽、任何第二多链嵌合多肽和任何IgG1抗体构建体以足以刺激受试者NK细胞的量施用于受试者(例如哺乳动物，例如人)。
在一些实例中，NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例可以进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入NK细胞(例如，本文所述的任何免疫细胞)中。
这些方法的一些实施例可以进一步包含向有需要的受试者(例如，本文所述的任何示例性受试者)施用治疗有效量的NK细胞。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况的受试者。与年龄相关的疾病或病症的非限制性实例包含：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在一些实例中，受试者可以是已被鉴定或诊断为患有癌症的受试者。癌症的非限制性实例包含：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在一些实例中，受试者可以是已被诊断或鉴定为患有感染性疾病的受试者。感染性疾病的非限制性实例包含人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒或流感病毒的感染。
在一些实例中，免疫细胞是NK细胞，并且对高度活化且对受体宿主中的患病细胞(例如，记忆NK细胞)具有长期持续性和高度细胞毒性的NK细胞的检测可以包含，例如，检测IL-12、IL-18、IL-33、STAT4、Zbtb32、DNAM-1、BIM、Noxa、SOCS1、BNIP3、BNIP3L、干扰素-γ、TNFα、CXCL16、CXCR6、NKG2D、TRAIL、CD49、Ly49D、CD49b和Ly79H中的一种或多种的水平。以下文献中描述了对NK记忆细胞和其检测方法的描述：O'Sullivan等人,《免疫学(Immunity)》43:634-645,2015。
治疗方法
本文还提供了治疗有需要的受试者(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性受试者)的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的任何NK细胞或本文所述的任何组合物(例如，药物组合物)。
在这些方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。癌症的非限制性实例包含：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施例中，这些方法可引起受试者中癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，与治疗前受试者中癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率相比)。在一些实施例中，这些方法可导致受试者中一种或多种实体瘤的体积减少(例如，约1％减少到约99％减少、约1％减少到约95％减少、约1％减少到约90％减少、约1％减少到约85％减少、约1％减少到约80％减少、约1％减少到约75％减少、约1％减少到约70％减少、约1％减少到约65％减少、约1％减少到约60％减少、约1％减少到约55％减少、约1％减少到约50％减少、约1％减少到约45％减少、约1％减少到约40％减少、约1％减少到约35％减少、约1％减少到约30％减少、约1％减少到约25％减少、约1％减少到约20％减少、约1％减少到约15％减少、约1％减少到约10％减少、约1％减少到约5％减少、约5％减少到约99％减少、约5％减少到约95％减少、约5％减少到约90％减少、约5％减少到约85％减少、约5％减少到约80％减少、约5％减少到约75％减少、约5％减少到约70％减少、约5％减少到约65％减少、约5％减少到约60％减少、约5％减少到约55％减少、约5％减少到约50％减少、约5％减少到约45％减少、约5％减少到约40％减少、约5％减少到约35％减少、约5％减少到约30％减少、约5％减少到约25％减少、约5％减少到约20％减少、约5％减少到约15％减少、约5％减少到约10％减少、约10％减少到约99％减少、约10％减少到约95％减少、约10％减少到约90％减少、约10％减少到约85％减少、约10％减少到约80％减少、约10％减少到约75％减少、约10％减少到约70％减少、约10％减少到约65％减少、约10％减少到约60％减少、约10％减少到约55％减少、约10％减少到约50％减少、约10％减少到约45％减少、约10％减少到约40％减少、约10％减少到约35％减少、约10％减少到约30％减少、约10％减少到约25％减少、约10％减少到约20％减少、约10％减少到约15％减少、约15％减少到约99％减少、约15％减少到约95％减少、约15％减少到约90％减少、约15％减少到约85％减少、约15％减少到约80％减少、约15％减少到约75％减少、约15％减少到约70％减少、约15％减少到约65％减少、约15％减少到约60％减少、约15％减少到约55％减少、约15％减少到约50％减少、约15％减少到约45％减少、约15％减少到约40％减少、约15％减少到约35％减少、约15％减少到约30％减少、约15％减少到约25％减少、约15％减少到约20％减少、约20％减少到约99％减少、约20％减少到约95％减少、约20％减少到约90％减少、约20％减少到约85％减少、约20％减少到约80％减少、约20％减少到约75％减少、约20％减少到约70％减少、约20％减少到约65％减少、约20％减少到约60％减少、约20％减少到约55％减少、约20％减少到约50％减少、约20％减少到约45％减少、约20％减少到约40％减少、约20％减少到约35％减少、约20％减少到约30％减少、约20％减少到约25％减少、约25％减少到约99％减少、约25％减少到约95％减少、约25％减少到约90％减少、约25％减少到约85％减少、约25％减少到约80％减少、约25％减少到约75％减少、约25％减少到约70％减少、约25％减少到约65％减少、约25％减少到约60％减少、约25％减少到约55％减少、约25％减少到约50％减少、约25％减少到约45％减少、约25％减少到约40％减少、约25％减少到约35％减少、约25％减少到约30％减少、约30％减少到约99％减少、约30％减少到约95％减少、约30％减少到约90％减少、约30％减少到约85％减少、约30％减少到约80％减少、约30％减少到约75％减少、约30％减少到约70％减少、约30％减少到约65％减少、约30％减少到约60％减少、约30％减少到约55％减少、约30％减少到约50％减少、约30％减少到约45％减少、约30％减少到约40％减少、约30％减少到约35％减少、约35％减少到约99％减少、约35％减少到约95％减少、约35％减少到约90％减少、约35％减少到约85％减少、约35％减少到约80％减少、约35％减少到约75％减少、约35％减少到约70％减少、约35％减少到约65％减少、约35％减少到约60％减少、约35％减少到约55％减少、约35％减少到约50％减少、约35％减少到约45％减少、约35％减少到约40％减少、约40％减少到约99％减少、约40％减少到约95％减少、约40％减少到约90％减少、约40％减少到约85％减少、约40％减少到约80％减少、约40％减少到约75％减少、约40％减少到约70％减少、约40％减少到约65％减少、约40％减少到约60％减少、约40％减少到约55％减少、约40％减少到约50％减少、约40％减少到约45％减少、约45％减少到约99％减少、约45％减少到约95％减少、约45％减少到约90％减少、约45％减少到约85％减少、约45％减少到约80％减少、约45％减少到约75％减少、约45％减少到约70％减少、约45％减少到约65％减少、约45％减少到约60％减少、约45％减少到约55％减少、约45％减少到约50％减少、约50％减少到约99％减少、约50％减少到约95％减少、约50％减少到约90％减少、约50％减少到约85％减少、约50％减少到约80％减少、约50％减少到约75％减少、约50％减少到约70％减少、约50％减少到约65％减少、约50％减少到约60％减少、约50％减少到约55％减少、约55％减少到约99％减少、约55％减少到约95％减少、约55％减少到约90％减少、约55％减少到约85％减少、约55％减少到约80％减少、约55％减少到约75％减少、约55％减少到约70％减少、约55％减少到约65％减少、约55％减少到约60％减少、约60％减少到约99％减少、约60％减少到约95％减少、约60％减少到约90％减少、约60％减少到约85％减少、约60％减少到约80％减少、约60％减少到约75％减少、约60％减少到约70％减少、约60％减少到约65％减少、约65％减少到约99％减少、约65％减少到约95％减少、约65％减少到约90％减少、约65％减少到约85％减少、约65％减少到约80％减少、约65％减少到约75％减少、约65％减少到约70％减少、约70％减少到约99％减少、约70％减少到约95％减少、约70％减少到约90％减少、约70％减少到约85％减少、约70％减少到约80％减少、约70％减少到约75％减少、约75％减少到约99％减少、约75％减少到约95％减少、约75％减少到约90％减少、约75％减少到约85％减少、约75％减少到约80％减少、约80％减少到约99％减少、约80％减少到约95％减少、约80％减少到约90％减少、约80％减少到约85％减少、约85％减少到约99％减少、约85％减少到约95％减少、约85％减少到约90％减少、约90％减少到约99％减少、约90％减少到约95％减少或约95％减少到约99％减少)(例如，与治疗前或治疗开始时一种或多种实体瘤的体积相比)。在一些实施例中，这些方法可以降低(例如，降低约1％到约99％，或本文所述的该范围的任何子范围)在受试者中发生转移或发生一种或多种额外转移的风险(例如，与治疗前受试者或类似受试者或被施用不同治疗的受试者群体发生转移或发生一种或多种额外转移的风险相比)。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。与老化相关的疾病或病况的非限制性实例包含阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。在一些实例中，这些方法可引起受试者中与老化相关的疾病或病况的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，与治疗前受试者中与老化相关的疾病或病况的一种或多种症状的数目、严重性或频率相比)。在一些实例中，例如，与治疗前受试者中衰老细胞的数量相比，所述方法可导致受试者中衰老细胞数量的减少(例如，约1％减少到约99％减少、约1％减少到约95％减少、约1％减少到约90％减少、约1％减少到约85％减少、约1％减少到约80％减少、约1％减少到约75％减少、约1％到约70％减少、约1％减少到约65％减少、约1％减少到约60％减少、约1％减少到约55％减少、约1％减少到约50％减少、约1％减少到约45％减少、约1％减少到约40％减少、约1％减少到约35％减少、约1％减少到约30％减少、约1％减少到约25％减少、约1％减少到约20％减少、约1％减少到约15％减少、约1％减少到约10％减少、约1％减少到约5％减少、约5％减少到约99％减少、约5％减少到约95％减少、约5％减少到约90％减少、约5％减少到约85％减少、约5％减少到约80％减少、约5％减少到约75％减少、约5％到约70％减少、约5％减少到约65％减少、约5％减少到约60％减少、约5％减少到约55％减少、约5％减少到约50％减少、约5％减少到约45％减少、约5％减少到约40％减少、约5％减少到约35％减少、约5％减少到约30％减少、约5％减少到约25％减少、约5％减少到约20％减少、约5％减少到约15％减少、约5％减少到约10％减少、约10％减少到约99％减少、约10％减少到约95％减少、约10％减少到约90％减少、约10％减少到约85％减少、约10％减少到约80％减少、约10％减少到约75％减少、约10％到约70％减少、约10％减少到约65％减少、约10％减少到约60％减少、约10％减少到约55％减少、约10％减少到约50％减少、约10％减少到约45％减少、约10％减少到约40％减少、约10％减少到约35％减少、约10％减少到约30％减少、约10％减少到约25％减少、约10％减少到约20％减少、约10％减少到约15％减少、约15％减少到约99％减少、约15％减少到约95％减少、约15％减少到约90％减少、约15％减少到约85％减少、约15％减少到约80％减少、约15％减少到约75％减少、约15％到约70％减少、约15％减少到约65％减少、约15％减少到约60％减少、约15％减少到约55％减少、约15％减少到约50％减少、约15％减少到约45％减少、约15％减少到约40％减少、约15％减少到约35％减少、约15％减少到约30％减少、约15％减少到约25％减少、约15％减少到约20％减少、约20％减少到约99％减少、约20％减少到约95％减少、约20％减少到约90％减少、约20％减少到约85％减少、约20％减少到约80％减少、约20％减少到约75％减少、约20％到约70％减少、约20％减少到约65％减少、约20％减少到约60％减少、约20％减少到约55％减少、约20％减少到约50％减少、约20％减少到约45％减少、约20％减少到约40％减少、约20％减少到约35％减少、约20％减少到约30％减少、约20％减少到约25％减少、约25％减少到约99％减少、约25％减少到约95％减少、约25％减少到约90％减少、约25％减少到约85％减少、约25％减少到约80％减少、约25％减少到约75％减少、约25％到约70％减少、约25％减少到约65％减少、约25％减少到约60％减少、约25％减少到约55％减少、约25％减少到约50％减少、约25％减少到约45％减少、约25％减少到约40％减少、约25％减少到约35％减少、约25％减少到约30％减少、约30％减少到约99％减少、约30％减少到约95％减少、约30％减少到约90％减少、约30％减少到约85％减少、约30％减少到约80％减少、约30％减少到约75％减少、约30％到约70％减少、约30％减少到约65％减少、约30％减少到约60％减少、约30％减少到约55％减少、约30％减少到约50％减少、约30％减少到约45％减少、约30％减少到约40％减少、约30％减少到约35％减少、约35％减少到约99％减少、约35％减少到约95％减少、约35％减少到约90％减少、约35％减少到约85％减少、约35％减少到约80％减少、约35％减少到约75％减少、约35％到约70％减少、约35％减少到约65％减少、约35％减少到约60％减少、约35％减少到约55％减少、约35％减少到约50％减少、约35％减少到约45％减少、约35％减少到约40％减少、约40％减少到约99％减少、约40％减少到约95％减少、约40％减少到约90％减少、约40％减少到约85％减少、约40％减少到约80％减少、约40％减少到约75％减少、约40％到约70％减少、约40％减少到约65％减少、约40％减少到约60％减少、约40％减少到约55％减少、约40％减少到约50％减少、约40％减少到约45％减少、约45％减少到约99％减少、约45％减少到约95％减少、约45％减少到约90％减少、约45％减少到约85％减少、约45％减少到约80％减少、约45％减少到约75％减少、约45％到约70％减少、约45％减少到约65％减少、约45％减少到约60％减少、约45％减少到约55％减少、约45％减少到约50％减少、约50％减少到约99％减少、约50％减少到约95％减少、约50％减少到约90％减少、约50％减少到约85％减少、约50％减少到约80％减少、约50％减少到约75％减少、约50％到约70％减少、约50％减少到约65％减少、约50％减少到约60％减少、约50％减少到约55％减少、约55％减少到约99％减少、约55％减少到约95％减少、约55％减少到约90％减少、约55％减少到约85％减少、约55％减少到约80％减少、约55％减少到约75％减少、约55％到约70％减少、约55％减少到约65％减少、约55％减少到约60％减少、约60％减少到约99％减少、约60％减少到约95％减少、约60％减少到约90％减少、约60％减少到约85％减少、约60％减少到约80％减少、约60％减少到约75％减少、约60％到约70％减少、约60％减少到约65％减少、约65％减少到约99％减少、约65％减少到约95％减少、约65％减少到约90％减少、约65％减少到约85％减少、约65％减少到约80％减少、约65％减少到约75％减少、约65％到约70％减少、约70％减少到约99％减少、约70％减少到约95％减少、约70％减少到约90％减少、约70％减少到约85％减少、约70％减少到约80％减少、约70％减少到约75％减少、约75％减少到约99％减少、约75％减少到约95％减少、约75％减少到约90％减少、约75％减少到约85％减少、约75％减少到约80％减少、约80％减少到约99％减少、约80％减少到约95％减少、约80％减少到约90％减少、约80％减少到约85％减少、约85％减少到约99％减少、约85％减少到约95％减少、约85％减少到约90％减少、约90％减少到约99％减少、约90％减少到约95％减少或约95％减少到约99％减少)(例如，受试者的与老化相关的疾病或病症中涉及和/或牵连的一种或多种特定组织中衰老细胞的数量减少)。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。感染性疾病的非限制性实例包含人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。在一些实施例中，这些方法可引起受试者中感染滴度(例如病毒滴度)的降低(例如，与治疗前受试者中的感染滴度相比)。在一些实施例中，这些方法可引起受试者中感染性疾病(例如病毒感染)的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，与治疗前受试者中感染性疾病的一种或多种症状的数目、严重性或频率相比)。
术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施例中，受试者或“需要治疗的受试者”可以是犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、绵羊、牛、猪、山羊、灵长类动物，例如猿猴(例如，猴(例如狨猴、狒狒)或猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿)或人；或啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)。在一些实施例中，受试者或“需要治疗的受试者”可以是非人哺乳动物，尤其可以采用常规用作证明在人中的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，鼠、兔、猪、犬或灵长类动物)。
杀死癌细胞、受感染细胞或衰老细胞的方法
本文还提供了杀死有需要的受试者(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性受试者)中的癌细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性癌症类型)、受感染的细胞(例如，被本文所述的或本领域已知的示例性病毒中的任一种感染的细胞)或衰老细胞(例如，衰老的癌细胞、衰老的成纤维细胞或衰老的内皮细胞)的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的任何NK细胞或本文所述的任何组合物(例如，药物组合物)。
在这些方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。癌症的非限制性实例包含：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。与老化相关的疾病或病况的非限制性实例包含阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。感染性疾病的非限制性实例包含人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
衰老细胞
衰老是不可逆的生长停滞的一种形式，伴随着表型变化、对细胞凋亡的抗性和损伤感知信号传导路径的活化。细胞衰老最初是在经培养的人类成纤维细胞中描述的，这些细胞失去了增殖能力，在大约50次种群倍增后达到永久停滞(被称为海弗利克极限(Hayflick limit))。衰老被认为是可由广泛范围的内在和外在伤害，包含氧化和遗传毒性应激、DNA损伤、端粒损耗、致癌活化、线粒体功能障碍或化疗剂诱导的应激反应。
衰老细胞保留代谢活性，并且可以通过其分泌表型影响组织止血、疾病和老化。衰老被认为是生理过程，并且对促进伤口愈合、组织稳态、再生和纤维化调节很重要。例如，在伤口愈合过程中观察到衰老细胞的瞬时诱导，并且其有助于伤口愈合。衰老的最重要作用之一可能是其在肿瘤抑制中的作用。然而，衰老细胞的积累也驱动老化和与老化相关的疾病和病况。衰老表型还可以触发慢性炎性反应，并且因此增强慢性炎性病况以促进肿瘤生长。衰老与老化之间的联系最初是基于衰老细胞在老化组织中积累的观察结果。转基因模型的使用已使得能够在许多年龄相关的病理中系统地检测衰老细胞。选择性消除衰老细胞的策略已证实，衰老细胞确实可以在老化和相关病理中起因果作用。
衰老细胞显示重要且独特的特性，包含形态、染色质组织、基因表达和代谢的变化。存在几个与细胞衰老相关的生化和功能性质，如(i)细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂p16INK4a和p21CIP1的表达增加；(ii)溶酶体活性的标志物–与衰老相关的β-半乳糖苷酶的存在；(iii)与衰老相关的异染色质病灶的出现和核纤层蛋白B1水平的下调；(iv)抗凋亡BCL家族蛋白表达增加引起的细胞凋亡抗性；以及(v)CD26(DPP4)、CD36(清道夫受体)、叉头框4(FOXO4)和分泌性载体膜蛋白4(SCAMP4)的上调。衰老细胞还表达炎性特征，即所谓的衰老相关分泌表型(SASP)。通过SASP，衰老细胞产生广泛范围的炎性细胞因子(IL-6、IL-8)、生长因子(TGF-β)、趋化因子(CCL-2)和基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9)，其以细胞自主方式运作以增强衰老(自分泌作用)，并且与微环境通信并改变微环境(旁分泌作用)。SASP因子可以通过触发衰老监视，即免疫介导的衰老细胞清除来促进肿瘤抑制。然而，慢性炎症也是肿瘤发生的已知驱动因素，并且越来越多的证据表明，慢性SASP也可以促进癌症和与老化相关的疾病。
衰老细胞的分泌特征是上下文相关的。例如，人成纤维细胞中不同的线粒体功能障碍诱导的线粒体功能障碍相关衰老(MiDAS)引起缺乏IL-1依赖性炎性因子的SASP出现。NAD+/NADH比率的降低活化AMPK信号传导，其通过活化p53诱导MiDAS。结果，p53抑制NF-κB信号传导，其为促炎性SASP的关键诱导因素。相反，由人细胞中持续性DNA损伤引起的细胞衰老诱导炎性SASP，其依赖于共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶的活化，而不依赖于p53的活化。具体地说，IL-6和IL-8的表达和分泌水平提高。还证明了由异位表达p16INK4a和p21CIP1引起的细胞衰老在没有炎性SASP的情况下诱导人成纤维细胞的衰老表型，这表明生长停滞本身并不刺激SASP。
衰老的最主要特性之一是稳定生长停滞。这是通过两个重要路径实现的，p16INK4a/Rb和p53/p21CIP1，这两者都是肿瘤抑制的核心。DNA损伤导致：(1)γH2Ax(组蛋白编码基因)和53BP1(参与DNA损伤反应)在染色质中的高沉积：这导致激酶级联的活化，从而最终导致p53活化；以及(2)p16INK4a和ARF(均由CDKN2A编码)和P15INK4b(由CDKN2B编码)的活化：p53诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(p21CIP1)的转录，并与p16INK4a和p15INK4b两者一起阻断用于细胞周期进程的基因(CDK4和CDK6)。这最终引起成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化不足，并且使细胞周期停滞在G1期。
在正常老化的情况下，选择性杀死衰老细胞已显示可显著改善小鼠的健康寿命，并且改善与年龄相关的疾病或癌症疗法的结果(Ovadya,《临床研究杂志(J ClinInvest.)》128(4):1247-1254,2018)。在自然界中，衰老细胞通常被先天免疫细胞去除。衰老的诱导不仅阻止了受损/改变的细胞的潜在增殖和转化，而且还通过产生SASP因子(主要充当自然杀伤(NK)细胞的化学引诱物(如IL-15和CCL2)和巨噬细胞的化学引诱物(如CFS-1和CCL2))促进组织修复。这些先天免疫细胞介导消除应激细胞的免疫监视机制。衰老细胞通常上调NK细胞活化受体NKG2D和DNAM1配体，其属于应激诱导性配体家族：防御感染性疾病和恶性肿瘤的一线免疫的重要组分。受体活化后，NK细胞可以接着通过其溶细胞机构特异性诱导衰老细胞的死亡。已在肝纤维化(Sagiv,《致癌基因(Oncogene)》32(15):1971-1977,2013)、肝细胞癌(Iannello,《实验医学杂志(J Exp Med)》210(10):2057-2069,2013)、多发性骨髓瘤(Soriani,《血液学(Blood)》113(15):3503-3511,2009)和由甲羟戊酸路径功能异常应激的神经胶质瘤细胞(Ciaglia,《国际癌症杂志(Int J Cancer)》142(1):176-190,2018)中指出了NK细胞在衰老细胞的免疫监视中的作用。子宫内膜细胞经历急性细胞衰老，并且不会分化成蜕膜细胞。分化的蜕膜细胞分泌IL-15，从而募集子宫NK细胞以靶向并消除未分化的衰老细胞，因此有助于重塑和年轻化子宫内膜(Brighton，《E生命(Elife)》6:e31274,2017)。以相似机制，在肝纤维化过程中，表达p53的衰老肝卫星细胞使驻留库普弗(Kupfer)巨噬细胞和新浸润的巨噬细胞的极化偏向促炎性M1表型，其显示衰老活性。已显示F4/80+巨噬细胞在清除小鼠子宫衰老细胞以维持产后子宫功能中起关键作用。
衰老细胞主要通过上调NKG2D(在NK细胞上表达)的配体、趋化因子和其它SASP因子来募集NK细胞。肝纤维化的体内模型已显示活化的NK细胞有效清除衰老细胞(Krizhanovsky,《细胞(Cell)》134(4):657-667,2008)。研究已描述多种模型来研究衰老，包含肝纤维化(Krizhanovsky，《细胞》134(4):657-667,2008)、骨关节炎(Xu,《老年学杂志：A系列，生物科学与医学(J Gerontol A Biol Sci Med Sci)》72(6):780-785,2017)和帕金森氏病(Chinta,《细胞报告(Cell Rep)》22(4):930-940,2018)。用于研究衰老细胞的动物模型描述于以下文献中：Krizhanovsky,《细胞》134(4):657-667,2008；Baker,《自然》479(7372):232-236,2011；Farr,《自然·医学(Nat Med)》23(9):1072-1079,2017；Bourgeois,《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett)》592(12):2083-2097,2018；Xu,《自然·医学》24(8):1246-1256,2018)。
增加NK细胞的葡萄糖消耗的方法
本文还提供了增加NK细胞的葡萄糖消耗的方法，所述方法包含：(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的包括第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触，持续第一时间段；以及(b)在允许NK细胞的葡萄糖消耗的条件下使自然杀伤细胞在包括有效量的(i)包括第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的第二多链嵌合多肽和(ii)包含特异性结合到接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，本文所述的任何示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，将葡萄糖消耗的增加与未与本文所述的任何多链嵌合多肽接触的类似NK细胞中的葡萄糖消耗水平进行比较。
可以用于检测葡萄糖消耗的非限制性测定法包含：例如包含使用放射性标记的3-O-甲基葡萄糖或放射性标记的2-脱氧-葡萄糖的测定法，或用于检测2-脱氧葡萄糖的酶促荧光测定法。可以用于检测葡萄糖消耗的测定法的额外的实例描述于以下文献中：例如Yamamoto等人,《药理学现行方案(Curr.Protoc.Pharmacol.)》,第12章,第12.14.1-22节,2011年12月；Zou等人,《生物化学与生物物理方法杂志(J.Biochem.Biophys.Methods)》64(3):207-215,2005年9月；以及MacKrell等人,《糖尿病(Diabetes)》第1-9页，于2012年3月13日在线发布。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:1到约2:1(例如，约0.8:1到约1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的活化的NK细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的NK细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的NK细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
增加NK细胞的氧化磷酸化的方法
本文还提供了增加NK细胞的氧化磷酸化的方法，所述方法包含：(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的本文所述的任何第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触，持续第一时间段；以及(b)在允许自然杀伤细胞的氧化磷酸化的条件下使自然杀伤细胞在包括有效量的(i)本文所述的任何第二多链嵌合多肽和(ii)包含特异性结合到接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体(例如，本文所述的任何示例性IgG1抗体构建体)的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，将氧化磷酸化的增加与未与本文所述的任何多链嵌合多肽接触的类似NK细胞中的氧化磷酸化水平进行比较。
可以用于检测氧化磷酸化的非限制性测定法包含例如免疫荧光测定法和比色测定法。可以用于确定氧化磷酸化水平的非限制性商业测定法为MitoToxTM Complete OXPHOS活性测定法(Abcam)。可以用于检测氧化磷酸化的测定法的额外的实例描述于以下文献中：例如Chance等人,《自然》175:1120-1121,1955；Pullman等人,《科学》123(3208):1105-1107,1956；Van Bergen等人,《线粒体(Mitochondrion)》15:24-33,2014；以及Rocha等人,《科学报告》5:15037,2015。
在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过任何这些方法产生的活化的NK细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的NK细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的NK细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的NK细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
增加免疫细胞的有氧糖酵解的方法
本文还提供了增加免疫细胞的有氧糖酵解的方法，所述方法包含：(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的本文所述的任何第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触，持续第一时间段；以及(b)在允许自然杀伤细胞中的有氧糖酵解的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的(i)本文所述的任何第二多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，将有氧糖酵解的增加与未与本文所述的任何多链嵌合多肽接触的类似NK细胞中的有氧糖酵解水平进行比较。
可以用于检测有氧糖酵解的非限制性测定法包含例如检测ATP和/或CO2产生(例如使用气相色谱/质谱法)或细胞外酸化速率。可以用于检测有氧糖酵解的测定法的额外的实例描述于以下文献中：例如Zhang等人,《骨骼(Bone)》114:150-160,2018；Zhao等人,《乳腺癌杂志(J.Breast Cancer)》21(2):112-123,2018；Li等人,《细胞通信与信号传导杂志(Cell Comm.Signal.)》16(1):26,2018；Cai等人,《实验与临床癌症研究(J.Exp.Clin.Cancer Res.)》37(1):104,2018；以及Zhang等人,《肿瘤学报告(Oncol.Rep.)》40(2):1156-1164,2018。
在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过任何这些方法产生的活化的免疫细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的免疫细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的NK细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
增加免疫细胞的细胞外酸化速率(ECAR)的方法
本文还提供了增加NK细胞的细胞外酸化速率(ECAR)的方法，所述方法包含：(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包含有效量的本文所述的任何第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触，持续第一时间段；以及(b)在允许自然杀伤细胞的细胞外酸化的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的本文所述的任何第二多链嵌合多肽和本文所述的任何IgG1抗体构建体的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，将细胞外酸化速率(ECAR)的增加与未与任何多链嵌合多肽和/或包含特异性结合到接头结构域的至少一个抗原结合结构域的IgG1抗体构建体接触的类似NK细胞中的细胞外酸化速率(ECAR)的水平进行比较。
可以用于检测细胞外酸化速率(ECAR)的非限制性商业测定法包含例如糖酵解测定法(细胞外酸化试剂盒)(ab197244或ab197245)(Abcam)、
Figure BDA0003508369120001521
细胞外pH传感器试剂盒(ENZ-51048)(恩佐生命科学公司(Enzo Life Sciences))和pH-XtraTM-糖酵解测定法(细胞外酸化)。可以用于检测细胞外酸化速率(ECAR)的测定法的额外的实例描述于以下文献中：例如Owicki等人,《生物传感器与生物电子学(Biosens.Bioelectron.)》7(4):255-272,1992；Hynes等人,《分析生物化学(Analytical Biochem.)》390(1):21-28,2009；Trevani等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》162(8):4849-4857,1999；以及Mookerjee等人,《可视化实验杂志(J.Vis.Exp.)》106:53464,2015。
在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过任何这些方法产生的活化的免疫细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的免疫细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的NK细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的NK细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
增加免疫细胞的线粒体耗氧速率的方法
本文还提供了增加自然杀伤细胞的线粒体耗氧速率的方法，所述方法包含：(a)使自然杀伤细胞在包含有效量的本文所述的任何第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触；以及(b)在允许自然杀伤细胞的线粒体耗氧速率的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的本文所述的任何第二多链嵌合多肽和本文所述的任何IgG1抗体构建体的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，将线粒体耗氧速率的增加与未与本文所述的任何多链嵌合多肽接触的类似NK细胞中的线粒体耗氧速率水平进行比较。
可以用于检测线粒体耗氧速率的非限制性商业测定法包含例如包含使用电极或市售试剂盒(例如耗氧速率测定试剂盒(Cayman Chemical))的测定法、Seahorse测定法(如Sakamuri等人,《老年科学(Geroscience)》40(3):347-356,2018中所描述)。可以用于检测线粒体耗氧速率的测定法的额外的实例描述于以下文献中：例如Li等人,《线粒体异常(Mitochondrial Disorders)》第63-72页,2011年12月；Kumagi等人,《突触(Synapse)》e22067,2018年8月；Takahashi等人,《生理科学杂志(J.Physiol.Sci.)》67(6):731-737,2017；以及Iihoshi等人,《毒理学快报(Toxicol.Lett.)》277:109-114,2017。
在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过任何这些方法产生的活化的免疫细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的免疫细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
增加NK细胞中活化受体的表达的方法
本文还提供了增加自然杀伤细胞中活化受体(例如，本文所述的自然杀伤细胞的任何示例性活化受体)的表达的方法，所述方法包含：(a)使自然杀伤细胞在包含有效量的本文所述的任何第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触；以及(b)在允许自然杀伤细胞的线粒体耗氧速率的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的本文所述的任何第二多链嵌合多肽和本文所述的任何IgG1抗体构建体的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过任何这些方法产生的活化的免疫细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的免疫细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
在向受试者施用时增加NK细胞的持久性的方法
本文还提供了在向受试者施用时增加自然杀伤细胞(例如，本文所述的自然杀伤细胞的任何示例性活化受体)的持久性的方法，所述方法包含在向受试者施用NK细胞之前：(a)使所述自然杀伤细胞在包含有效量的本文所述的任何第一多链嵌合多肽的液体培养基(例如，本文所述的任何液体培养基)中接触；以及(b)在允许自然杀伤细胞的线粒体耗氧速率的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的本文所述的任何第二多链嵌合多肽和本文所述的任何IgG1抗体构建体的液体培养基中接触，持续第二时间段。
在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到接头结构域。在这些方法的一些实例中，IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是无血清液体培养基。在这些方法的一些实施例中，液体培养基可以是化学成分确定的液体培养基。在这些方法的其它实例中，液体培养基包含血清。
在这些方法的一些实例中，液体培养基包含摩尔比为约0.5:0.5:1到约2:2:1(例如，约0.8:0.8:1到约1.2:1.2:1)的第二多链嵌合多肽和IgG1抗体构建体。
在这些方法的一些实例中，所述NK细胞先前从受试者获得。这些方法的一些实施例进一步包含在接触步骤之前从受试者获得NK细胞。在这些方法的一些实施例中，所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，分离NK细胞。这些方法的一些实施例进一步包含，在接触步骤之后，将NK细胞施用于有需要的受试者。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与年龄相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
本文还提供了通过任何这些方法产生的活化的免疫细胞。本文还提供了药物组合物，其包含通过任何这些方法产生的任何活化的免疫细胞。本文还提供了试剂盒，其包含通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的通过本文所述的任何方法产生的本文所述的任何活化的免疫细胞或本文所述的任何药物组合物。在这些方法的一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。在这些方法的一些实施例中，所述癌症选自以下的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
在这些方法一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。在这些方法的一些实例中，所述与老化相关的疾病或病况选自以下的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
在这些方法的一些实例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。在这些方法的一些实例中，所述感染性疾病是人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
额外的治疗剂
本文所述的任何方法的一些实施例可以进一步包含向受试者(例如，本文所述的任何受试者)施用治疗有效量的一种或多种额外的治疗剂。可以将一种或多种额外的治疗剂与单链嵌合多肽(例如，本文所述的任何单链嵌合多肽)、多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何多链嵌合多肽)或活化的免疫细胞(例如，活化的NK细胞或活化的T细胞)基本上同时施用给受试者(例如，作为单一调配物或两种或更多种调配物施用给受试者)。在一些实施例中，可以在施用单链嵌合多肽(例如，本文所述的任何单链嵌合多肽)、多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何多链嵌合多肽)或活化的免疫细胞(例如，活化的NK细胞或活化的T细胞)之前将一种或多种额外的治疗剂施用给受试者。在一些实施例中，可以在将单链嵌合多肽(例如，本文所述的任何单链嵌合多肽)、多链嵌合多肽(例如，本文所述的任何多链嵌合多肽)或活化的免疫细胞(例如，活化的NK细胞或活化的T细胞)施用给受试者之后将一种或多种额外的治疗剂施用给受试者。
额外的治疗剂的非限制性实例包含：抗癌药物、活化受体激动剂、免疫检查点抑制剂、用于阻断HLA特异性抑制受体的试剂、糖原合酶激酶(GSK)3抑制剂和抗体。
抗癌药物的非限制性实例包含抗代谢药物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基尿素、甲胺喋呤、6-硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)、奈拉滨(nelarabine)、喷司他汀(pentostatin)或培美曲塞(pemetrexed))、植物碱(例如，长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、喜树碱(camptothecin)、9-甲氧基喜树碱、冠狗牙花定碱(coronaridine)、紫杉醇、乌檀根碱(naucleaoral)、二异戊二烯基化吲哚生物碱(diprenylated indole alkaloid)、山矢车菊碱(montamine)、希什金矢车菊碱(schischkiniin)、原小蘖碱(protoberberine)、小蘖碱(berberine)、血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、白屈菜碱(chelidonine)、鹅掌楸碱(liriodenine)、山岗蠹吾碱(clivorine)、β-咔啉、脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)、娃儿藤碱(tylophorine)、白叶藤碱(cryptolepine)、新白叶藤碱(neocryptolepine)、紫堇诺灵碱(corynoline)、依兰碱(sampangine)、咔唑、文珠兰碱(crinamine)、高山网球花碱(montanine)、玫瑰树碱(ellipticine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenisopide)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)或吖啶酮生物碱)、蛋白酶体抑制剂(例如，乳胞素(lactacystin)、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(marizomib)(盐孢菌素(salinosporamide)A)、奥普佐米(oprozomib)(ONX-0912)、地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)、环氧霉素(epoxomicin)、MG132、β-羟基β-甲基丁酸盐、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)或埃沙佐米(ixazomib))、抗肿瘤抗生素(例如，阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、放线菌素(actinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)或博来霉素(bleomycin))、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat)、帕比诺他(panobinostat)、贝林司他(belinostat)、吉韦诺他(givinostat)、阿贝辛他(abexinostat)、缩肽(depsipeptide)、恩替诺特(entinostat)、苯基丁酸盐、丙戊酸、曲古抑菌素(trichostatin)A、达西司他(dacinostat)、莫西司他(mocetinostat)、普瑞司他(pracinostat)、烟酰胺(nicotinamide)、坎比诺尔(cambinol)、替诺文(tenovin)1、替诺文6、斯汀诺(sirtinol)、利可司他(ricolinostat)、替非司他(tefinostat)、凯维林(kevetrin)、奎西司他(quisinostat)、雷米诺他(resminostat)、泰克地那林(tacedinaline)、西达本胺(chidamide)或赛利司他(selisistat))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿昔替尼(axitinib)、达沙替尼(dasatinib)、恩可非尼(encorafinib)、厄洛替尼(erlotinib)、伊马替尼(imatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕唑帕尼(pazopanib)和舒尼替尼(sunitinib))和化疗剂(例如，全反式维甲酸、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、去氧氟尿苷、埃博霉素(epothilone)、羟脲、伊马替尼、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星(valrubicin)、维罗非尼(vemurafenib)和来那度胺(lenalidomide))。化疗剂的额外的实例包含烷化剂，例如，二氯甲二乙胺、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、噻替派(thiotepa)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、白消安(busulfan)、六甲蜜胺(altretamine)、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、卡莫司汀(carmustine)、罗莫司汀(lumustine)、链脲霉素(streptozocin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。
活化受体激动剂的非限制性实例包含活化和增强NK细胞的细胞毒性的活化受体的任何激动剂，包含抗CD16抗体(例如，抗CD16/CD30双特异性单克隆抗体(BiMAb))和基于Fc的融合蛋白。检查点抑制剂的非限制性实例包含抗PD-1抗体(例如，MEDI0680)、抗PD-L1抗体(例如，BCD-135、BGB-A333、CBT-502、CK-301、CS1001、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、抗PD-L1/CTLA-4双特异性抗体KN046、抗PD-L1/TGFβRII融合蛋白M7824、抗PD-L1/TIM-3双特异性抗体LY3415244、阿特珠单抗(atezolizumab)或阿维鲁单抗(avelumab))、抗TIM3抗体(例如，TSR-022、Sym023或MBG453)和抗CTLA-4抗体(例如，AGEN1884、MK-1308或抗CTLA-4/OX40双特异性抗体ATOR-1015)。用于阻断HLA特异性抑制受体的试剂的非限制性实例包含莫那力单抗(monalizumab)(例如，抗HLA-ENKG2A抑制受体单克隆抗体)。GSK3抑制剂的非限制性实例包含替格鲁西布(tideglusib)或CHIR99021。可以用作额外的治疗剂的抗体的非限制性实例包含抗CD26抗体(例如，YS110)、抗CD36抗体和可结合到NK细胞上的Fc受体(例如，CD16)并活化所述受体的任何其它抗体或抗体构建体。在一些实施例中，额外的治疗剂可以是胰岛素或二甲双胍(metformin)。
实例
在以下实例中进一步描述了本发明，所述实例不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
实例1：IL-12/IL-15RαSu DNA构建体的创建
在非限制性实例中，创建了IL-12/IL-15RαSu DNA构建体(见图1)。人IL-12亚基序列、人IL-15RαSu序列、人IL-15序列、人组织因子219序列和人IL-18序列从UniProt网站获得，并且这些序列的DNA由金唯智(Genewiz)合成。制备DNA构建体，用GS(3)接头将IL-12亚基β(p40)连接到IL-12亚基α(p35)以产生IL-12的单链形式，并且然后直接将IL-12序列连接到IL-15RαSu序列。最终的IL-12/IL-15RαSu DNA构建体序列由金唯智合成。
IL12/IL-15RαSu构建体的核酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:59)：
(信号肽)
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC
(人IL-12亚基β(p40))
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCC
(接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人IL-12亚基α(p35))
CGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
(人IL-15Rαsushi结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
实例2：IL-18/TF/IL-15DNA构建体的创建
在非限制性实例中，制备IL-18/TF/IL-15构建体(见图2)，将IL-18序列连接到组织因子219的N端编码区，并进一步将IL-18/TF构建体与IL-15的N端编码区连接。金唯智合成的IL-18/TF/IL-15构建体的核酸序列(包含前导序列)如下(SEQ ID NO:60)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC
(人IL-18)
TACTTCGGCAAACTGGAATCCAAGCTGAGCGTGATCCGGAATTTAAACGACCAAGTTCTGTTTATCGATCAAGGTAACCGGCCTCTGTTCGAGGACATGACCGACTCCGATTGCCGGGACAATGCCCCCCGGACCATCTTCATTATCTCCATGTACAAGGACAGCCAGCCCCGGGGCATGGCTGTGACAATTAGCGTGAAGTGTGAGAAAATCAGCACTTTATCTTGTGAGAACAAGATCATCTCCTTTAAGGAAATGAACCCCCCCGATAACATCAAGGACACCAAGTCCGATATCATCTTCTTCCAGCGGTCCGTGCCCGGTCACGATAACAAGATGCAGTTCGAATCCTCCTCCTACGAGGGCTACTTTTTAGCTTGTGAAAAGGAGAGGGATTTATTCAAGCTGATCCTCAAGAAGGAGGACGAGCTGGGCGATCGTTCCATCATGTTCACCGTCCAAAACGAGGAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
实例3：IL-12/IL-15RαSu和IL-18/TF/IL-15融合蛋白的分泌
将IL-12/IL-15RαSu和IL-18/TF/IL-15DNA构建体克隆到pMSGV-1修饰的逆转录病毒表达载体(如通过引用并入本文的Hughes,《人基因疗法(Hum Gene Ther)》16:457-72,2005所描述)中，并且将表达载体转染到CHO-K1细胞中。这两种构建体在CHO-K1细胞中的共表达允许形成和分泌可溶性IL-18/TF/IL-15:IL-12/IL-15RαSu蛋白复合物(被称为18t15-12s；见图3和4)。使用抗TF抗体(hOAT)亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从CHO-K1细胞培养上清液中纯化18t15-12s蛋白，从而产生由IL-12/IL-15RαSu和IL-18/TF/IL-15融合蛋白组成的可溶性(非聚集)蛋白质复合物。
IL12/IL-15RαSu融合蛋白的氨基酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:61)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-12亚基β(p40))
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人IL-12亚基α(p35))
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
(人IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
IL-18/TF/IL-15融合蛋白的氨基酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:62)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-18)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
在一些情况下，将前导(信号序列)肽从完整多肽上切割下来，以产生可能可溶或可分泌的成熟形式。
实例3：IL-7/IL-15RαSu DNA构建体的创建
在非限制性实例中，创建了IL-7/IL-15RαSu DNA构建体(见图5)。人IL-7序列、人IL-15RαSu序列、人IL-15序列和人组织因子219序列从UniProt网站获得，并且这些序列的DNA由金唯智合成。制备DNA构建体，将IL-7序列连接到IL-15RαSu序列。最终的IL-7/IL-15RαSu DNA构建体序列由金唯智合成。
实例4：IL-21/TF/IL-15DNA构建体的创建
在非限制性实例中，通过将IL-21序列连接到组织因子219的N端编码区，并进一步将IL-21/TF构建体与IL-15的N端编码区连接来制备IL-21/TF/IL-15构建体(见图6)。
实例5：IL-7/IL-15RαSu和IL-21/TF/IL-15融合蛋白的分泌
将IL-7/IL-15RαSu和IL-21/TF/IL-15DNA构建体克隆到pMSGV-1修饰的逆转录病毒表达载体(如通过引用并入本文的Hughes,《人基因疗法(Hum Gene Ther)》16:457-72,2005所描述)中，并且将表达载体转染到CHO-K1细胞中。这两种构建体在CHO-K1细胞中的共表达允许形成和分泌可溶性IL-21/TF/IL-15:IL-7/IL-15RαSu蛋白复合物(被称为21t15-7s；见图7和8)。使用抗TF抗体亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从CHO-K1细胞培养上清液中纯化21t15-7s蛋白，从而产生由IL-7/IL-15RαSu和IL-21/TF/IL-15融合蛋白组成的可溶性(非聚集)蛋白质复合物。
在一些情况下，将前导(信号序列)肽从完整多肽上切割下来，以产生可能可溶或可分泌的成熟形式。
实例6：IL-21/IL-15RαSu DNA构建体的创建
在非限制性实例中，创建了IL-21/IL-15RαSu DNA构建体。人IL-21序列和人IL-15RαSu序列从UniProt网站获得，并且这些序列的DNA由金唯智合成。制备DNA构建体，将IL-21序列连接到IL-15RαSu序列。最终的IL-21/IL-15RαSu DNA构建体序列由金唯智合成。见图9。
实例7：IL-7/TF/IL-15DNA构建体的创建
在非限制性实例中，通过将IL-7序列连接到组织因子219的N端编码区，并进一步将IL-7/TF构建体与IL-15的N端编码区连接来制备IL-7/TF/IL-15构建体。见图10。
实例8：IL-21/IL-15RαSu和IL-7/TF/IL-15融合蛋白的分泌
将IL-21/IL-15RαSu和IL-7/TF/IL-15DNA构建体克隆到pMSGV-1修饰的逆转录病毒表达载体(如通过引用并入本文的Hughes,《人基因疗法(Hum Gene Ther)》16:457-72,2005所描述)中，并且将表达载体转染到CHO-K1细胞中。这两种构建体在CHO-K1细胞中的共表达允许形成和分泌可溶性IL-7/TF/IL-15:IL-21/IL-15RαSu蛋白复合物(被称为7t15-21s)(图11和12)。使用抗TF抗体(IgG1)亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从CHO-K1细胞培养上清液中纯化7t15-21s蛋白，从而产生由IL-21/IL-15RαSu和IL-7/TF/IL-15融合蛋白组成的可溶性(非聚集)蛋白质复合物。
实例9：通过STAT4和STAT5的下游蛋白磷酸化测量细胞因子信号传导
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15：18t15-12s)对纯化的NK细胞的细胞因子信号传导的影响(图13)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies))分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以0.5x106/mL重新悬浮在96孔平底板中的0.1mL完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo Life Technologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo Life Technologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。在37℃、5％CO2下将细胞用hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)或hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽(100nM)刺激15分钟、45分钟、90分钟、180分钟或过夜。在不同点收获细胞并在多聚甲醛(Sigma)中固定至终浓度为1.6％。将板在黑暗中在室温下孵育10分钟。将100mL的FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD Millipore)和0.001％叠氮化钠(Sigma)的1X PBS(Hyclone))添加到细胞中并转移至96孔“V”形底板。在室温下将细胞以1500RPM洗涤5分钟。将细胞沉淀在100mL冷冻甲醇中混合并轻轻上下移液，并在4℃下孵育30分钟。将细胞与100mL FACS缓冲液混合，并洗涤，并在室温下以1500RPM离心5分钟。将细胞沉淀物与含有4mL pSTAT4(BD Bioscience)和pSTAT5(BDBioscience)的50mL FACS缓冲液混合，并在室温下避光孵育30分钟。将细胞与100mL FACS缓冲液混合，洗涤，并在室温下以1500RPM离心5分钟。将细胞沉淀物与50mL FACS缓冲液混合，并通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)进行分析。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽接触后，细胞因子信号传导(STAT4和STAT5)升高(图13)。
实例10：对免疫细胞进行急性刺激以测量细胞外酸化速率(ECAR)，这是细胞代谢 和健康的替代指标
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15：18t15-12s)对纯化的NK细胞的ECAR的影响(图14)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以4x106/mL重新悬浮在96孔中(50μL/孔)，接种在Cell-Tak包被的Seahorse BioanalyzerXFe96培养板中，所述培养板在Seahorse XF RPMI培养基中，pH 7.4，补充有2mM L-谷氨酰胺。使细胞在37℃下附着在板上，持续30分钟。将额外的130μL测定培养基添加到板的每个孔中(也是背景孔)。将板在37℃的非CO2孵育箱中孵育1小时。对于校准板，在Seahorse测定培养基中制备葡萄糖/寡霉素/2DG的10x溶液。将20μL体积的葡萄糖/寡霉素/2DG添加到经过整夜校准的细胞外通量板的端口B、C和D。对于急性实验，将hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)或hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或100nM的IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽直接添加到校准板的端口A。使用XFe96细胞外通量分析仪测量细胞外酸化速率(ECAR)。完整的ECAR分析由四个阶段组成：基础(无药物)、糖酵解诱导(10mM葡萄糖)、最大糖酵解诱导(2μM寡霉素)和糖酵解抑制(100mM 2-DG)。(9个供体中的一个供体的实验代表)。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽接触后，ECAR升高(图14)。
实例11：在存在葡萄糖的情况下对免疫细胞进行急性刺激以测量细胞外酸化速率 (ECAR)
在存在葡萄糖的情况下进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15：18t15-12s)对纯化的NK细胞的ECAR的影响(图15)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以4x106/mL重新悬浮在96孔中(50μL/孔)，接种在Cell-Tak包被的Seahorse BioanalyzerXFe96培养板中，所述培养板在Seahorse XF RPMI培养基中，pH 7.4，补充有2mM L-谷氨酰胺。使细胞在37℃下附着在板上，持续30分钟。将额外的130μL测定培养基添加到板的每个孔中(也是背景孔)。将板在37℃的非CO2孵育箱中孵育1小时。对于校准板：在Seahorse测定培养基中制备寡霉素/2DG的10x溶液。将20μL体积的寡霉素/2DG添加到经过整夜校准的细胞外通量板的端口B和C。用与单一细胞因子或(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)多链多肽混合的葡萄糖(10mM)刺激细胞，或将单独的培养基直接添加到校准板的端口A。使用XFe96细胞外通量分析仪测量细胞外酸化速率(ECAR)。完整的ECAR分析由四个阶段组成：基础(无药物)、糖酵解诱导(10mM葡萄糖)、最大糖酵解诱导(2μM寡霉素)和糖酵解抑制(100mM 2-DG)。(4个供体中的一个供体的实验代表)。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15：18t15-12s多链嵌合多肽接触后和在存在葡萄糖的情况下，ECAR升高(图15)。
实例12：对免疫细胞进行急性刺激以测量细胞外酸化速率(ECAR)并添加(掺入)葡 萄糖以显示增加的糖酵解和糖酵解能力
当在添加融合蛋白后掺入葡萄糖时，进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15：18t15-12s)对NK细胞上的ECAR的影响(图16)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以4x106/mL重新悬浮在96孔中(50μL/孔)，接种在Cell-Tak包被的Seahorse BioanalyzerXFe96培养板中，所述培养板在Seahorse XF RPMI培养基中，pH 7.4，补充有2mM L-谷氨酰胺。使细胞在37℃下附着在板上，持续30分钟。将额外的130μL测定培养基添加到板的每个孔中(也是背景孔)。将板在37℃的非CO2孵育箱中孵育1小时。对于校准板：在Seahorse测定培养基中制备葡萄糖/寡霉素/2DG的10x溶液。将20μL体积的葡萄糖/寡霉素/2DG添加到经过整夜校准的细胞外通量板的端口B、C和D。对于急性实验，将hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)或hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或100nM的IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15直接添加到端口A。在用单一细胞因子的混合物或IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽或单独培养基对急性刺激进行3次读数后，用葡萄糖(10mM)刺激细胞。使用XFe96细胞外通量分析仪测量细胞外酸化速率(ECAR)。完整的ECAR分析由四个阶段组成：基础(无药物)、糖酵解诱导(10mM葡萄糖)、最大糖酵解诱导(2μM寡霉素)和糖酵解抑制(100mM 2-DG)。(4个供体中的一个供体的实验代表)。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15：18t15-12s多链嵌合多肽接触后和当在添加融合蛋白后掺入葡萄糖时，ECAR升高(图16)。
实例13：用IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激后mTOR、MYC和 SREBP的基因表达分析显示对细胞基因编程的药物影响速度
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)对NK细胞中基因表达的影响(图17)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以2x106/mL重新悬浮在24孔平底板中的1mL完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(ThermoLife Technologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。在37℃、5％CO2下将细胞用hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)或hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽复合物(100nM)刺激60分钟和180分钟。在不同点收获细胞并进行基因表达分析。RNA提取、cDNA合成和实时PCR：根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen#74106)提取总RNA。1μg总RNA用于使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)合成cDNA。使用CFX96检测系统(Bio-Rad)，使用FAM标记的针对人类特定基因的预设计引物mTORC、Myc、SREBP和18S进行实时PCR，所述引物购自赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)。反应在三个独立实验中一式三份进行。将管家基因18S核糖体RNA用作内部对照，以将表达水平的变异性归一化。每个靶标mRNA相对于18S rRNA的表达基于Ct被计算为2–Δ(ΔCt)，其中ΔCt＝Ct靶标–Ct18S。数据表示为与无处理对照相比的变化倍数。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽接触后，基因表达升高(图17)。
实例14：用IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激后活化和细胞内标 志物的增加
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)对NK细胞活化的影响(图18)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以0.2x106/mL重新悬浮在96孔平底板中的0.2mL完全培养基中(将细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo Life Technologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(ThermoLife Technologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco)中培养)。在37□，5％CO2下将细胞用hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或100nM的IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激30分钟、60分钟、90分钟和180分钟。第二天，将细胞用10μg/mL的Brefeldin A(Sigma)和1x的莫能菌素(Monensin)(eBioscience)处理4小时。收获细胞并针对CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-APC、CD69-APCFire750、CD62L-PeCy7进行表面染色，持续30分钟。表面染色后，将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD Millipore)和0.001％叠氮化钠(Sigma)的1X PBS(Hyclone))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)，并在室温下固定10分钟。固定步骤后，将细胞在1x透化缓冲液(eBioscience)中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)，并在室温下染色以进行IFN-γ-PE(Biolegend)的细胞内染色，持续30分钟。将细胞再次用1x透化缓冲液洗涤，然后用FACS缓冲液洗涤。将细胞沉淀物重新悬浮在300μLFACS缓冲液中，用于通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)进行分析。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽接触后，NK活化升高(图18)。
实例15：比较短期与过夜，用IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激 后41BB和IL21R标志物的增加显示细胞已准备好对活化刺激作出反应
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)对NK细胞活化的影响(图19)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以0.2x106/mL重新悬浮在96孔平底板中的0.2mL完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(ThermoLife Technologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。在37℃，5％CO2下将细胞用hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或100nM的IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激180分钟或过夜。收获细胞，并针对CD56-BV421、CD16-BV510、IL21r-PE、41BB-APC.Cy7(BioLegend)进行表面染色，持续30分钟。表面染色后，将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD Millipore)和0.001％叠氮化钠(Sigma)的1x PBS(Hyclone))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)。两次洗涤后，通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)分析细胞。
数据显示，与对照相比，在与IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽接触后，NK活化升高(图19)。
实例16：在用IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽或单独培养基进行短 时间刺激(180分钟)后，通过IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15多链嵌合多肽和IgG1抗体构建 体扩增NK细胞
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)、第二多链嵌合多肽(IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15)、IgG1抗体构建体对NK细胞扩增的影响(图20)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以1x108/mL重新悬浮在96孔平底板中的完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo LifeTechnologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。将细胞用hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或100nM的IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激180分钟。在37°，5％CO2下用100nM的IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15和50nM的IgG1抗体构建体在24孔板中将细胞从1x108/mL稀释到2x106/mL。用含有100nM的IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15和50nM的IgG1抗体构建体的新鲜完全将细胞保持在2x106/mL。以扩增倍数测量细胞扩增(3个供体)。
数据显示，在用第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)、第二嵌合多肽(IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15)和IgG1抗体构建体处理后，NK扩增。
实例17：在用示例性第一多链嵌合多肽刺激和用示例性第二多链嵌合多肽扩增后 脱粒标志物的增加
进行了一组实验以确定第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15)、第二多链嵌合多肽(IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15)和IgG1抗体构建体对NK细胞脱粒的影响(图11)。
在这些实验中，从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE、CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以1x108/mL重新悬浮在96孔平底板中的完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo LifeTechnologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。将细胞用hIL-12(10ng/mL)(Biolegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)的混合细胞因子或100nM的IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15多链嵌合多肽刺激180分钟。在37℃和5％CO2下用100nM的IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15多链嵌合多肽和50nM的IgG1抗体构建体在24孔板中将细胞从1x108/mL稀释到2x106/mL。用含有100nM的IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15和50nM的IgG1抗体构建体或1ng/mL rhIL-15的新鲜完全将细胞保持在2x106/mL，直至第11天。在37°，5％CO2下收获细胞，并用K562细胞系(靶标)与4μls CD107-FITC(Biolegend)以2:1(效应子:靶标)的比率重新悬浮细胞。孵育四小时后，收获细胞并针对CD56-BV421、CD16-BV510进行表面染色，持续30分钟。表面染色后，将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD Millipore)和0.001％叠氮化钠(Sigma)的1X PBS(Hyclone))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)。将细胞沉淀物重新悬浮在50μL FACS缓冲液中，用于进行流式细胞术分析(Celesta-BD Bioscience)。
数据显示，在用第一多链嵌合多肽(IL-12/IL-15RαSu和IL-18/IL-15(D8N))、第二多链嵌合多肽(IL-7/IL-15RαSu和IL-21/IL-15(D8N))和IgG1抗体构建体处理后，NK细胞对靶细胞表现出增强的细胞毒性(图21)。
实例18：耗氧速率(OCR)
从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)和CD69-APCFire750(BioLegend)分离CD56+NK细胞。对细胞进行计数并以1x108/mL重新悬浮在96孔平底板中的完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo LifeTechnologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。将细胞用细胞因子混合物(SCKs)[hIL-12(10ng/mL)(BioLegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)]或100nM的18t15-12s刺激180分钟(唤醒)，或仅使用(未刺激的)培养基进行刺激。在37℃，5％CO2下在24孔板中将细胞从1x108/mL稀释到2x106/mL，并用100nM的7t15-21s和50nM的抗组织因子抗体(IgG1)(αTF Ab)扩增。用含有100nM的7t15-21s和50nM的αTF Ab或50ng/mL重组人IL-15的新鲜完全培养基将细胞保持在2x106/mL，持续14天。在第14天收获细胞，对细胞进行计数并以4x106/mL重新悬浮在96孔板中(50μL/孔)，并接种在Cell-Tak包被的Seahorse Bioanalyzer XFe96培养板中，所述培养板在Seahorse XF RPMI培养基中，pH 7.4，补充有10mM葡萄糖和2mM L-谷氨酰胺。使细胞在37℃下附着在板上，持续30分钟。此外，将130μL测定培养基添加到板的每个孔中(也是背景孔)。将板在37℃的非CO2孵育箱中孵育1小时。对于校准板：在Seahorse测定培养基中制备寡霉素/FCCP/鱼藤酮的10x溶液。将20μL的寡霉素、FCCP和鱼藤酮添加到经过整夜校准的细胞外通量板的每个端口。使用XFe96细胞外通量分析仪测量耗氧速率(OCR)。完整的OCR分析由四个阶段组成：基础呼吸(无药物)、ATP相关呼吸/质子泄漏(1.5μM寡霉素)、最大呼吸(2μM FCCP)和备用呼吸(0.5μM鱼藤酮)。OCR图是三个供体的组合表示。
数据显示，用细胞因子混合物(SCKs)或用18t15-12s刺激然后用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)支持扩增的NK细胞会导致耗氧速率(OCR)增加。添加羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)进一步提高了耗氧速率(OCR)能力。数据还显示，未受刺激的细胞、用细胞因子混合物(SCKs)或用18t15-12s刺激并用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)支持扩增的细胞也会导致OCR增加。然而，用细胞因子混合物(SCKs)或用18t15-12s处理过夜然后用低剂量的IL-15支持的NK细胞的OCR没有显示出太大的增加。总体而言，与用18t15-12s刺激(唤醒)然后用低剂量的IL-15扩增的NK细胞相比，用18t15-12s刺激然后用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)扩增的NK细胞更适合代谢(图22)。
实例19：用18t15-12s刺激后IFN-γ和NKG2D的基因表达分析
从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE和CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以1x108/mL重新悬浮在96孔平底板中的完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo LifeTechnologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。将细胞分为短期活化组(180分钟)或长期活化组(过夜刺激12-16小时)，或不刺激细胞。将细胞用细胞因子混合物(SCKs)[hIL-12(10ng/mL)(BioLegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)]或100nM的18t15-12s刺激(唤醒)180分钟或12-16小时。在37℃，5％CO2下在24孔板中将细胞从1x108/mL稀释到2x106/mL，并用100nM的7t15-21s和50nM的抗组织因子抗体(αTF Ab)扩增。用含有100nM的7t15-21s和50nM的αTF Ab的新鲜完全培养基将细胞保持在2x106/mL，持续14天。每隔一天用新鲜培养基和100nM的7t15-21s和50nM的αTF Ab刺激细胞，至多14天。在第14天的不同点收获细胞，然后评估基因表达分析。执行RNA提取、cDNA合成和实时PCR。根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen#74106)提取总RNA。一μg总RNA用于使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)合成cDNA。使用CFX96检测系统(Bio-Rad)，使用FAM标记的预设计引物进行实时PCR，所述引物购自赛默飞世尔科技公司用于IFNγ和NKG2D。反应在三个独立实验中一式三份进行。将管家基因18S核糖体RNA用作内部对照，以将表达水平的变异性归一化。每个靶标mRNA相对于18S rRNA的表达基于Ct被计算为2–Δ(ΔCt)，其中ΔCt＝Ct靶标–Ct18S。数据表示为与无处理对照相比的变化倍数。
数据显示，与用细胞因子混合物(SCKs)刺激然后用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)扩增的NK细胞相比，用18t15-12s刺激180分钟然后用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)扩增的NK细胞能够增加IFN-γ和NKG2D基因表达。在用细胞因子混合物(SCKs)或18t15-12s刺激过夜然后用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)扩增的NK细胞中，IFN-γ和NKG2D基因表达没有差异。这意味着，用18t15-12s进行短期刺激，然后用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)进行扩增足以上调NK细胞上的记忆样标志物(图23)。
实例20：用18t15-12s活化并用7t15-21s和αTF IgG1扩增的过继转移的NK细胞在 NSG小鼠模型中的持久性
从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE和CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以1x108/mL重新悬浮在96孔平底板中的完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo LifeTechnologies)、青霉素(Thermo Life Technologies)、链霉素(Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640(Gibco))中。细胞要么用培养基未刺激作为对照，要么用100nM的18t15-12s刺激(唤醒)180分钟或12-16小时(过夜)。在37℃，5％CO2下用100nM的7t15-21s和50nM的抗组织因子抗体(αTF Ab)在24孔板中将细胞从1x108/mL稀释到2x106/mL。用含有100nM的7t15-21s和50nM的αTF Ab的新鲜完全培养基将细胞保持在2x106/mL，持续21天。用含有100nM的7t15-21s和50nM的αTF Ab的新鲜完全培养基将细胞保持在2x106/mL，并且随着体积的增加，细胞被转移到更大容量的烧瓶中。在第21天收获细胞并使用台盼蓝进行计数以获取扩增倍数。将扩增的细胞在温热的HBSS缓冲液(Hyclone)中以1000RPM在室温下洗涤三次，持续10分钟。将细胞重新悬浮在10x106/0.2mL HBSS缓冲液中，并静脉注射到NSG小鼠(NOD scid gamma小鼠)(Jackson Laboratories)的尾静脉中。通过每48小时皮下注射一次，直至第12天，用Proleukin(rhIL2)(5000IU)支持细胞。每周通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)在针对hCD45、mCD45、hCD56、hCD3和hCD16染色的血液中测量细胞的植入。(数据代表每组5只小鼠)。
数据显示，与没有用18t15-12s刺激的NK细胞相比，用18t15-12s刺激180分钟或过夜并用7t15-21s和抗组织因子抗体(αTF Ab)支持扩增的NK细胞在NSG小鼠中输注后能够在体内持续长达12天(图24)。
实例21：对IFNγ-CNS-1CpG区的DNA甲基化的表观遗传分析
从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>85％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE和CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以2x106个细胞/毫升的密度重新悬浮在RPMI 1640培养基(Gibco)中，所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo Life Technologies)、抗生素(青霉素，10,000单位/毫升；链霉素，10,000μg/mL；Thermo Life Technologies)和10％FBS(Hyclone)。将细胞(1mL)转移到24孔平底板中，并经受：无处理，或用单一细胞因子混合物(SCKs)[hIL-12(10ng/mL)(BioLegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)]或18t15-12s(100nM)在37℃和5％CO2的气氛下短期暴露180分钟或12-16小时(过夜)进行刺激。然后，将NK细胞洗涤并重新悬浮在补充有7t15-21s加上抗组织因子抗体(αTF Ab，50nM)的完全RPMI 1640培养基中，并孵育14天(长期)。用7t15-21s加αTF Ab(50nM)补充细胞，以将细胞密度保持在大约1x106个细胞/毫升。
已证明，用单一细胞因子处理NK细胞然后用低剂量的IL-15处理可促进记忆样NK细胞分化，并用作记忆样NK细胞表观遗传学的比较对照。将来自供体至治疗组的未暴露/未处理的NK细胞用作全DNA甲基化水平的阳性对照。使用QIAamp UCP DNA微型试剂盒(Qiagen)从NK细胞(0.2-1.0x106)中提取基因组DNA(nDNA)。根据制造商的方案，使用EZDNA甲基化-直接试剂盒(Zymo Research)对纯化的nDNA(500ng)进行亚硫酸氢钠处理。亚硫酸氢盐处理在DNA中引入甲基化依赖性变化，其中脱甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。将经过亚硫酸氢盐处理的nDNA(10-50ng)用作模板，以对IFNγ远端启动子保守非编码序列1(CNS-1)增强子区域的247-bp区域进行PCR扩增，所述区域含有六个特征化CpG位点(位于相对于转录起始位点的-4399、-4377、-4360、-4325、-4293和-4278位置)。该CNS-1区域已被发现在T细胞和NK细胞分化中很重要，并且受DNA甲基化的表观遗传调控(Dong等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》43:793-804,2013)。使用具有正向引物IFNG-CNS1F(5'-AGAAAAGGGGGGATTTA-3')(SEQ ID NO:81)和生物素化反向引物IFNG-CNS1R-bio(5'-TAACACTCACAACCAAATTATC-3')(SEQ ID NO:82)(金智唯)的Pyromark PCR试剂盒(Qiagen)进行PCR。PCR条件为95℃下15分钟，95℃下35秒、55℃下35秒、72℃下40秒然后72℃下5分钟的50个循环。使247-bp PCR扩增产物的完整性和质量在1.2％TAE琼脂糖凝胶上可视化。通过焦磷酸测序确定六个CpG位点的DNA甲基化状态，所述焦磷酸测序是定量测量单个CpG位点处DNA甲基化的金标准技术。在约翰霍普金斯大学遗传资源核心设施中使用DNA测序引物C4399-CNS1F(5'-GGGGATTTAGAAAAAT-3'(SEQ ID NO:83)，特异于CpG位点-4399、-4377、-4360和-4325)和C4293-CNS1F(5'-TGTATGATGTTAGGAGTTT-3'(SEQ ID NO:84)，特异于CpG位点-4293、-4278和-4227)进行焦磷酸测序反应。对于DNA甲基化对照，使用人类非甲基化和甲基化基因组DNA(Zymo Research)。对于每个处理，对六个IFNγCNS-1CpG位点的甲基化百分比取平均。
对这六个IFNγCNS-1CpG位点的DNA甲基化状态的分析显示，与未暴露的(对照)或用单一细胞因子混合物(IL12+IL18+IL15)或18t15-12s刺激(唤醒)180分钟或过夜(短期)的NK细胞相比，用单一细胞因子混合物(SCKs)或18t15-12s刺激(唤醒)180分钟或12-16小时(过夜)并通过7t15-21s(50nM)加αTF Ab(50nM)在培养中支持14天(长期)的NK细胞的DNA去甲基化水平更高。实际上，与未暴露的NK细胞(对照)(79.50％±14.21)、180分钟刺激(唤醒)的NK细胞(79.25％±13.14到79.97％±14.13)和过夜刺激(唤醒)的NK细胞(73.51％±14.08到73.66％±14.01)相比，7t15-21s+αTF Ab支持的NK细胞表现出33.80％±13.20到40.72％±15.96的DNA甲基化。综上所述，这些结果表明，NK细胞长期暴露于7t15-21s+αTFAb会诱导CNS-1区域内CpG位点的显著DNA去甲基化，从而导致IFNγ基因表达的表观遗传重塑和NK细胞相互转化为先天免疫记忆NK细胞(图25)。
实例22：体内记忆样NK细胞的表观遗传分析
从血库中获取新鲜的人类白细胞，并使用RosetteSep/人NK细胞试剂(干细胞技术有限公司)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>70％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD25-PE和CD69-APCFire750(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以2x106个细胞/毫升的密度重新悬浮在RPMI 1640培养基(Gibco)中，所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo Life Technologies)、抗生素(青霉素，10,000单位/毫升；链霉素，10,000μg/mL；Thermo Life Technologies)和10％FBS(Hyclone)。将细胞(1mL)转移到24孔平底板中，并经受：用单一细胞因子混合物(标记的SCKs)[hIL-12(10ng/mL)(BioLegend)、hIL-18(50ng/mL)(R&D Systems)和hIL-15(50ng/mL)(NCI)]或18t15-12s(100nM)在37℃和5％CO2的气氛下刺激12-16小时。然后，将NK细胞洗涤并重新悬浮在补充有7t15-21s+抗组织因子抗体(αTF Ab)的完全RPMI 1640培养基中，并孵育14天，其中向培养基经常补充新鲜的7t15-21s+αTF Ab以将细胞密度保持在大约1x106个细胞/毫升。扩增14天后，活化的NK细胞被加工用于焦磷酸测序分析(输注前样品)或注入NSG小鼠中(五组，每组五只小鼠)。输注后第9天，采集每只小鼠的脾脏，针对每组(五组，每组五只小鼠)进行纯化并合并NK细胞。使样品(输注后)经受对位于IFNγCNS-1区域内的CpG位点的DNA甲基化进行的焦磷酸测序分析，如下文所述。
使用QIAamp UCP DNA微型试剂盒(Qiagen)从NK细胞(0.2-1.0x106)中提取基因组DNA(nDNA)。根据制造商的方案，使用EZ DNA甲基化-直接试剂盒(Zymo Research)对纯化的nDNA(500ng)进行亚硫酸氢钠处理。亚硫酸氢盐处理在DNA中引入甲基化依赖性变化，其中脱甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。将经过亚硫酸氢盐处理的nDNA(10-50ng)用作模板，以对IFNγ远端启动子保守非编码序列1(CNS-1)增强子区域的247-bp区域进行PCR扩增，所述区域含有六个特征化CpG位点(位于相对于转录起始位点的-4399、-4377、-4360、-4325、-4293和-4278位置)。该CNS-1区域已被发现在T细胞和NK细胞分化中很重要，并且受DNA甲基化的表观遗传调控(Dong等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》43:793-804,2013)。使用具有正向引物IFNG-CNS1F(5'-AGAAAAGGGGGGATTTA-3'；SEQ IDNO:81)和生物素化反向引物IFNG-CNS1R-bio(5'-TAACACTCACAACCAAATTATC-3'；SEQ IDNO:82)(金智唯)的Pyromark PCR试剂盒(Qiagen)进行PCR。PCR条件为95℃下15分钟，95℃下35秒、55℃下35秒、72℃下40秒然后72℃下5分钟的50个循环。使247-bp PCR扩增产物的完整性和质量在1.2％TAE琼脂糖凝胶上可视化。通过焦磷酸测序确定六个CpG位点的DNA甲基化状态，所述焦磷酸测序是定量测量单个CpG位点处DNA甲基化的金标准技术。在约翰霍普金斯大学遗传资源核心设施中使用DNA测序引物C4399-CNS1F(5'-GGGGATTTAGAAAAAT-3'(SEQ ID NO:83)，特异于CpG位点-4399、-4377、-4360和-4325)和C4293-CNS1F(5'-TGTATGATGTTAGGAGTTT-3'(SEQ ID NO:84)，特异于CpG位点-4293、-4278和-4227)进行焦磷酸测序反应。对于DNA甲基化对照，使用人类非甲基化和甲基化基因组DNA(ZymoResearch)。对于每个处理，对六个IFNγCNS-1CpG位点的甲基化百分比取平均。
对这六个IFNγCNS-1CpG位点的DNA甲基化状态的分析显示，与甲基化DNA对照相比，用单一细胞因子的混合物(IL12+IL18+IL15)或18t15-12s刺激过夜并通过7t15-21s(50nM)加αTF Ab(50nM)在培养中支持14天的预输注活化的NK细胞的DNA去甲基化水平更高。实际上，对比甲基化DNA对照的87.09％±10.65，单一细胞因子和18t15-12s刺激的NK细胞分别表现出26.99％±12.85和24.58％±13.22的DNA甲基化。更重要的是，在第9天从NSG小鼠中分离的输注后NK细胞也表现出非常低的DNA甲基化水平，其中单个细胞因子和18t15-12s处理的NK细胞的DNA甲基化水平分别为18.97％±11.17和19.57％±10.22。综上所述，这些结果表明，活化的NK细胞的记忆样表型在体内维持长达9天，并且一旦表观遗传重塑机制建立，其就会在随后的NK细胞后代中固定并在体内持续存在(图26)。
实例23：IL-7/IL-21/IL-15和抗TF IgG1对NK细胞的扩增
在非限制性实例中，进行了一组实验以确定单独的7t15-21s或7t15-21s与抗TFIgG1或抗TF IgG4的组合对NK细胞扩增的影响(在第5天评估扩增)。数据显示，NK细胞需要IgG1信号才能扩增(图27)。图28示出了描绘NK细胞扩增和活化的示意图。
实例24：用7t15-21s+αTF Ab扩增原代NK细胞
在非限制性实例中，进行了一组实验以确定7t15-21s和抗TF IgG1在15天的时间段内对原代NK细胞扩增的影响。数据显示，NK细胞在15天时段内扩增，并且表面标志物CD25和CD69的表达增加，而CD62L和CD57的表达降低(图29)。
实例25：短期活化后的扩增策略
在非限制性实例中，用18t15-12s在1-3小时的短期内活化NK细胞以诱导记忆样NK细胞。短期唤醒后，将NK细胞用7t15-21s和抗TF IgG1扩增14-21天。通过测量被唤醒和扩增的NK细胞中表面标志物(例如，CD25、CD69、NKp44、NKp30、CD62L和CD16)表达的百分比来表征记忆样NK细胞的扩增(图33-35)。数据还显示了在没有刺激或用重组细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)的混合物或18t15-12s刺激后的NK细胞的细胞毒性(图36)。
实例26.脐带血来源的NK细胞的唤醒和扩增
获得新鲜的人CD34-脐带血(OrganaBio)，并使用CD56+CD16+NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离CD56+NK细胞。NK细胞的纯度>50％，并通过用CD56-BV421、CD16-BV510、CD4-BV488、CD14-APC、CD8 PerCP Cy5.5、CD3 APC CY7(BioLegend)染色进行确认。对细胞进行计数并以1x106个细胞/毫升的密度重新悬浮在PBS中。将2μM终浓度的细胞追踪紫罗兰染料(CTV)(Life Technologies)添加到细胞中，并在37℃和5％CO2的气氛下孵育20分钟。在室温下将细胞以五倍体积重新悬浮在新鲜预热的RPMI 1640培养基(Gibco)中，所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo Life Technologies)、抗生素(青霉素，10,000单位/毫升；链霉素，10,000μg/mL；Thermo Life Technologies)和10％FBS(Hyclone)，持续5分钟。将细胞在计数时以1000rpm洗涤2次，持续10分钟，并以2x106个细胞/毫升的密度重新悬浮在RPMI 1640培养基(Gibco)中，所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(Thermo LifeTechnologies)、抗生素(青霉素，10,000单位/毫升；链霉素，10,000μg/mL；Thermo LifeTechnologies)和10％FBS(Hyclone)。将细胞(0.1mL)转移到96孔平底板中，并经受：无处理(培养基)，或用18t15-12s(250nM)在37℃和5％CO2的气氛下短期暴露180分钟(唤醒)或12-16小时(过夜唤醒)进行刺激。然后，将所有条件的NK细胞洗涤并重新悬浮在补充有7t15-21s(200nM)加上抗组织因子抗体(αTF Ab，100nM)的完全RPMI 1640培养基中，并孵育7天(长期)。每48到72小时用7t15-21s(200nM)加αTF Ab(100nM)补充细胞，以将细胞密度保持在大约2x106个细胞/毫升。为了评估细胞增殖，收获NK细胞并针对CD56进行表面染色，持续30分钟。表面染色后，将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD Millipore)和0.001％叠氮化钠(Sigma)的1X PBS(Hyclone))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)。两次洗涤后，通过流式细胞术(Celesta-BD Bioscience)分析细胞。
与由7t15-21s(200nM)加αTF Ab(100nM)支持的未刺激的细胞相比，用18t15-12s刺激(唤醒)180分钟或12-16小时(过夜)并通过7t15-21s(200nM)加αTF Ab(100nM)在培养中支持7天的NK细胞的细胞增殖分析增加了增殖能力。如图37A所示，与对照(由7t15-21s(200nM)加αTF Ab(100nM)支持的未刺激的细胞)相比，用细胞因子刺激的治疗组(唤醒和过夜唤醒)显示出增加的NK细胞增殖(分裂数)。与用18t15-12s刺激180分钟(唤醒)或12-16小时(过夜唤醒)并通过7t15-21s(200nM)加αTF Ab(100nM)在培养中支持7天的NK细胞中的少数终末分裂相比，对照组显示出处于不同分裂阶段的分裂细胞。图37B代表细胞增殖的百分比。
综上所述，该结果表明，源自脐带血、用18t15-12s刺激并由7t15-21s和αTF Ab支持的NK细胞具有增加的增殖能力。
其它实施例
应理解，虽然已经结合其具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都处于以下权利要求的范围内。
序列表
<110> HCW生物制剂公司（HCW Biologics, Inc.）
<120> 多链多肽和其用途
<130> 47039-0017WO1
<150> US 62/864,996
<151> 2019-06-21
<160> 84
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 2
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
1 5 10 15
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
35 40 45
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
50 55 60
Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
115 120 125
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
130 135
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 4
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 5
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
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Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 6
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
agcggcacaa ccaacacagt cgctgcctat aacctcactt ggaagagcac caacttcaaa 60
accatcctcg aatgggaacc caaacccgtt aaccaagttt acaccgtgca gatcagcacc 120
aagtccggcg actggaagtc caaatgtttc tataccaccg acaccgagtg cgatctcacc 180
gatgagatcg tgaaagatgt gaaacagacc tacctcgccc gggtgtttag ctaccccgcc 240
ggcaatgtgg agagcactgg ttccgctggc gagcctttat acgagaacag ccccgaattt 300
accccttacc tcgagaccaa tttaggacag cccaccatcc aaagctttga gcaagttggc 360
acaaaggtga atgtgacagt ggaggacgag cggactttag tgcggcggaa caacaccttt 420
ctcagcctcc gggatgtgtt cggcaaagat ttaatctaca cactgtatta ctggaagtcc 480
tcttcctccg gcaagaagac agctaaaacc aacacaaacg agtttttaat cgacgtggat 540
aaaggcgaaa actactgttt cagcgtgcaa gctgtgatcc cctcccggac cgtgaatagg 600
aaaagcaccg atagccccgt tgagtgcatg ggccaagaaa agggcgagtt ccgggag 657
<210> 7
<211> 223
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 7
Ala Gly Ile Pro Glu Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr Asp
1 5 10 15
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Asn Lys Cys Phe
35 40 45
Ser Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp
50 55 60
Val Thr Trp Ala Tyr Glu Ala Lys Val Leu Ser Val Pro Arg Arg Asn
65 70 75 80
Ser Val His Gly Asp Gly Asp Gln Leu Val Ile His Gly Glu Glu Pro
85 90 95
Pro Phe Thr Asn Ala Pro Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Asn Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Val Ile Gln Gln Phe Glu Gln Asp Gly Arg Lys Leu Asn
115 120 125
Val Val Val Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr Phe
130 135 140
Leu Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Lys Asp Leu Gly Tyr Ile Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Thr Gly Lys Lys Thr Asn Ile Thr Asn Thr
165 170 175
Asn Glu Phe Ser Ile Asp Val Glu Glu Gly Val Ser Tyr Cys Phe Phe
180 185 190
Val Gln Ala Met Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn Gln Asn Ser Pro Gly
195 200 205
Ser Ser Thr Val Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Phe Leu Gly Glu
210 215 220
<210> 8
<211> 224
<212> PRT
<213> 大鼠（Rat rattus）
<400> 8
Ala Gly Thr Pro Pro Gly Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr
1 5 10 15
Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr
20 25 30
Tyr Thr Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Tyr Lys Cys
35 40 45
Thr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys
50 55 60
Asp Val Asn Trp Thr Tyr Glu Ala Arg Val Leu Ser Val Pro Trp Arg
65 70 75 80
Asn Ser Thr His Gly Lys Glu Thr Leu Phe Gly Thr His Gly Glu Glu
85 90 95
Pro Pro Phe Thr Asn Ala Arg Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Lys
100 105 110
Ile Gly Gln Pro Val Ile Gln Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Lys Val Thr Val Lys Asp Ser Phe Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr
130 135 140
Phe Leu Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Gly Tyr Ile Leu
145 150 155 160
Thr Tyr Arg Lys Asp Ser Ser Thr Gly Arg Lys Thr Asn Thr Thr His
165 170 175
Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Glu Lys Gly Val Ser Tyr Cys Phe
180 185 190
Phe Ala Gln Ala Val Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn His Lys Ser Pro
195 200 205
Glu Ser Ile Thr Lys Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Val Leu Gly Glu
210 215 220
<210> 9
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Ala Thr Ala Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Ala Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Ala Arg Asn Asn Thr Ala Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Ala Thr Ala Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Ala Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Ala Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Ala Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Ala Arg Asn Asn Thr Ala Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 接头
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 接头
<400> 12
ggcggtggag gatccggagg aggtggctcc ggcggcggag gatct 45
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 接头
<400> 13
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 15
<211> 918
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
atttgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtcgaactgg actggtatcc cgatgctccc 60
ggcgaaatgg tggtgctcac ttgtgacacc cccgaagaag acggcatcac ttggaccctc 120
gatcagagca gcgaggtgct gggctccgga aagaccctca caatccaagt taaggagttc 180
ggagacgctg gccaatacac atgccacaag ggaggcgagg tgctcagcca ttccttatta 240
ttattacaca agaaggaaga cggaatctgg tccaccgaca ttttaaaaga tcagaaggag 300
cccaagaata agaccttttt aaggtgtgag gccaaaaact acagcggtcg tttcacttgt 360
tggtggctga ccaccatttc caccgattta accttctccg tgaaaagcag ccggggaagc 420
tccgaccctc aaggtgtgac atgtggagcc gctaccctca gcgctgagag ggttcgtggc 480
gataacaagg aatacgagta cagcgtggag tgccaagaag atagcgcttg tcccgctgcc 540
gaagaatctt tacccattga ggtgatggtg gacgccgtgc acaaactcaa gtacgagaac 600
tacacctcct ccttctttat ccgggacatc attaagcccg atcctcctaa gaatttacag 660
ctgaagcctc tcaaaaatag ccggcaagtt gaggtctctt gggaatatcc cgacacttgg 720
agcacacccc acagctactt ctctttaacc ttttgtgtgc aagttcaagg taaaagcaag 780
cgggagaaga aagaccgggt gtttaccgac aaaaccagcg ccaccgtcat ctgtcggaag 840
aacgcctcca tcagcgtgag ggctcaagat cgttattact ccagcagctg gtccgagtgg 900
gccagcgtgc cttgttcc 918
<210> 16
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 17
<211> 591
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
cgtaacctcc ccgtggctac ccccgatccc ggaatgttcc cttgtttaca ccacagccag 60
aatttactga gggccgtgag caacatgctg cagaaagcta ggcagacttt agaattttac 120
ccttgcacca gcgaggagat cgaccatgaa gatatcacca aggacaagac atccaccgtg 180
gaggcttgtt tacctctgga gctgacaaag aacgagtctt gtctcaactc tcgtgaaacc 240
agcttcatca caaatggctc ttgtttagct tcccggaaga cctcctttat gatggcttta 300
tgcctcagct ccatctacga ggatttaaag atgtaccaag tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tcatggaccc taaacggcag atctttttag accagaacat gctggctgtg 420
attgatgagc tgatgcaagc tttaaacttc aactccgaga ccgtccctca gaagtcctcc 480
ctcgaggagc ccgattttta caagacaaag atcaaactgt gcattttact ccacgccttt 540
aggatccggg ccgtgaccat tgaccgggtc atgagctatt taaacgccag c 591
<210> 18
<211> 518
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys
325 330 335
Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln
340 345 350
Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile
355 360 365
Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys
370 375 380
Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu
385 390 395 400
Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser
405 410 415
Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met
420 425 430
Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro
435 440 445
Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu
450 455 460
Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser
465 470 475 480
Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile
485 490 495
Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met
500 505 510
Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
515
<210> 19
<211> 1554
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
atttgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtcgaactgg actggtatcc cgatgctccc 60
ggcgaaatgg tggtgctcac ttgtgacacc cccgaagaag acggcatcac ttggaccctc 120
gatcagagca gcgaggtgct gggctccgga aagaccctca caatccaagt taaggagttc 180
ggagacgctg gccaatacac atgccacaag ggaggcgagg tgctcagcca ttccttatta 240
ttattacaca agaaggaaga cggaatctgg tccaccgaca ttttaaaaga tcagaaggag 300
cccaagaata agaccttttt aaggtgtgag gccaaaaact acagcggtcg tttcacttgt 360
tggtggctga ccaccatttc caccgattta accttctccg tgaaaagcag ccggggaagc 420
tccgaccctc aaggtgtgac atgtggagcc gctaccctca gcgctgagag ggttcgtggc 480
gataacaagg aatacgagta cagcgtggag tgccaagaag atagcgcttg tcccgctgcc 540
gaagaatctt tacccattga ggtgatggtg gacgccgtgc acaaactcaa gtacgagaac 600
tacacctcct ccttctttat ccgggacatc attaagcccg atcctcctaa gaatttacag 660
ctgaagcctc tcaaaaatag ccggcaagtt gaggtctctt gggaatatcc cgacacttgg 720
agcacacccc acagctactt ctctttaacc ttttgtgtgc aagttcaagg taaaagcaag 780
cgggagaaga aagaccgggt gtttaccgac aaaaccagcg ccaccgtcat ctgtcggaag 840
aacgcctcca tcagcgtgag ggctcaagat cgttattact ccagcagctg gtccgagtgg 900
gccagcgtgc cttgttccgg cggtggagga tccggaggag gtggctccgg cggcggagga 960
tctcgtaacc tccccgtggc tacccccgat cccggaatgt tcccttgttt acaccacagc 1020
cagaatttac tgagggccgt gagcaacatg ctgcagaaag ctaggcagac tttagaattt 1080
tacccttgca ccagcgagga gatcgaccat gaagatatca ccaaggacaa gacatccacc 1140
gtggaggctt gtttacctct ggagctgaca aagaacgagt cttgtctcaa ctctcgtgaa 1200
accagcttca tcacaaatgg ctcttgttta gcttcccgga agacctcctt tatgatggct 1260
ttatgcctca gctccatcta cgaggattta aagatgtacc aagtggagtt caagaccatg 1320
aacgccaagc tgctcatgga ccctaaacgg cagatctttt tagaccagaa catgctggct 1380
gtgattgatg agctgatgca agctttaaac ttcaactccg agaccgtccc tcagaagtcc 1440
tccctcgagg agcccgattt ttacaagaca aagatcaaac tgtgcatttt actccacgcc 1500
tttaggatcc gggccgtgac cattgaccgg gtcatgagct atttaaacgc cagc 1554
<210> 20
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 21
<211> 471
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
tacttcggca aactggaatc caagctgagc gtgatccgga atttaaacga ccaagttctg 60
tttatcgatc aaggtaaccg gcctctgttc gaggacatga ccgactccga ttgccgggac 120
aatgcccccc ggaccatctt cattatctcc atgtacaagg acagccagcc ccggggcatg 180
gctgtgacaa ttagcgtgaa gtgtgagaaa atcagcactt tatcttgtga gaacaagatc 240
atctccttta aggaaatgaa cccccccgat aacatcaagg acaccaagtc cgatatcatc 300
ttcttccagc ggtccgtgcc cggtcacgat aacaagatgc agttcgaatc ctcctcctac 360
gagggctact ttttagcttg tgaaaaggag agggatttat tcaagctgat cctcaagaag 420
gaggacgagc tgggcgatcg ttccatcatg ttcaccgtcc aaaacgagga t 471
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 23
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 24
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 25
<211> 195
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
attacatgcc cccctcccat gagcgtggag cacgccgaca tctgggtgaa gagctatagc 60
ctctacagcc gggagaggta tatctgtaac agcggcttca agaggaaggc cggcaccagc 120
agcctcaccg agtgcgtgct gaataaggct accaacgtgg ctcactggac aacaccctct 180
ttaaagtgca tccgg 195
<210> 26
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 27
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
aactgggtga acgtcatcag cgatttaaag aagatcgaag atttaattca gtccatgcat 60
atcgacgcca ctttatacac agaatccgac gtgcacccct cttgtaaggt gaccgccatg 120
aaatgttttt tactggagct gcaagttatc tctttagaga gcggagacgc tagcatccac 180
gacaccgtgg agaatttaat cattttagcc aataactctt tatccagcaa cggcaacgtg 240
acagagtccg gctgcaagga gtgcgaagag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
caatcctttg tgcacattgt ccagatgttc atcaatacct cc 342
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 信号序列
<400> 29
atgaaatggg tgacctttat ttctttactg ttcctcttta gcagcgccta ctcc 54
<210> 30
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 信号序列
<400> 30
atgaagtggg tcacatttat ctctttactg ttcctcttct ccagcgccta cagc 54
<210> 31
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 信号序列
<400> 31
atgaaatggg tgacctttat ttctttactg ttcctcttta gcagcgccta ctcc 54
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
<210> 33
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile
20 25 30
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Val Ser
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly
50 55
<210> 34
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Met Pro Asn His Gln Ser Gly Ser Pro Thr Gly Ser Ser Asp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Gly Lys Lys Gln Arg Pro His Leu Ala Leu Arg Arg Lys Arg
20 25 30
Arg Arg Glu Met Arg Lys Ile Asn Arg Lys Val Arg Arg Met Asn Leu
35 40 45
Ala Pro Ile Lys Glu Lys Thr Ala Trp Gln His Leu Gln Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Glu Ala Glu Glu Val Leu Lys Thr Ser Gln Thr Pro Gln Asn Ser
65 70 75 80
Leu Thr Leu Phe Leu Ala Leu Leu Ser Val Leu Gly Pro Pro Val Thr
85 90 95
Gly
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser
20 25 30
<210> 36
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile
20 25 30
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Val Ser
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly
50 55
<210> 37
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Met Pro Asn His Gln Ser Gly Ser Pro Thr Gly Ser Ser Asp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Gly Lys Lys Gln Arg Pro His Leu Ala Leu Arg Arg Lys Arg
20 25 30
Arg Arg Glu Met Arg Lys Ile Asn Arg Lys Val Arg Arg Met Asn Leu
35 40 45
Ala Pro Ile Lys Glu Lys Thr Ala Trp Gln His Leu Gln Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Glu Ala Glu Glu Val Leu Lys Thr Ser Gln Thr Pro Gln Asn Ser
65 70 75 80
Leu Thr Leu Phe Leu Ala Leu Leu Ser Val Leu Gly Pro Pro Val Thr
85 90 95
Gly
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser
20 25 30
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 39
His His His His His
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 40
His His His His His His
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 41
His His His His His His His
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 42
His His His His His His His His
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 43
His His His His His His His His His
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 44
His His His His His His His His His His
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 45
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 46
Thr Lys Glu Asn Pro Arg Ser Asn Gln Glu Glu Ser Tyr Asp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 47
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 48
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 48
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 49
Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 50
Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly
1 5
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 51
Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 52
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 53
Cys Cys Pro Gly Cys Cys
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 54
Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro Leu Asp
1 5 10
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 55
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 56
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 57
Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 58
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 59
<211> 1803
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-12/IL-15RαSu
<400> 59
atgaaatggg tgacctttat ttctttactg ttcctcttta gcagcgccta ctccatttgg 60
gaactgaaga aggacgtcta cgtggtcgaa ctggactggt atcccgatgc tcccggcgaa 120
atggtggtgc tcacttgtga cacccccgaa gaagacggca tcacttggac cctcgatcag 180
agcagcgagg tgctgggctc cggaaagacc ctcacaatcc aagttaagga gttcggagac 240
gctggccaat acacatgcca caagggaggc gaggtgctca gccattcctt attattatta 300
cacaagaagg aagacggaat ctggtccacc gacattttaa aagatcagaa ggagcccaag 360
aataagacct ttttaaggtg tgaggccaaa aactacagcg gtcgtttcac ttgttggtgg 420
ctgaccacca tttccaccga tttaaccttc tccgtgaaaa gcagccgggg aagctccgac 480
cctcaaggtg tgacatgtgg agccgctacc ctcagcgctg agagggttcg tggcgataac 540
aaggaatacg agtacagcgt ggagtgccaa gaagatagcg cttgtcccgc tgccgaagaa 600
tctttaccca ttgaggtgat ggtggacgcc gtgcacaaac tcaagtacga gaactacacc 660
tcctccttct ttatccggga catcattaag cccgatcctc ctaagaattt acagctgaag 720
cctctcaaaa atagccggca agttgaggtc tcttgggaat atcccgacac ttggagcaca 780
ccccacagct acttctcttt aaccttttgt gtgcaagttc aaggtaaaag caagcgggag 840
aagaaagacc gggtgtttac cgacaaaacc agcgccaccg tcatctgtcg gaagaacgcc 900
tccatcagcg tgagggctca agatcgttat tactccagca gctggtccga gtgggccagc 960
gtgccttgtt ccggcggtgg aggatccgga ggaggtggct ccggcggcgg aggatctcgt 1020
aacctccccg tggctacccc cgatcccgga atgttccctt gtttacacca cagccagaat 1080
ttactgaggg ccgtgagcaa catgctgcag aaagctaggc agactttaga attttaccct 1140
tgcaccagcg aggagatcga ccatgaagat atcaccaagg acaagacatc caccgtggag 1200
gcttgtttac ctctggagct gacaaagaac gagtcttgtc tcaactctcg tgaaaccagc 1260
ttcatcacaa atggctcttg tttagcttcc cggaagacct cctttatgat ggctttatgc 1320
ctcagctcca tctacgagga tttaaagatg taccaagtgg agttcaagac catgaacgcc 1380
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gatgagctga tgcaagcttt aaacttcaac tccgagaccg tccctcagaa gtcctccctc 1500
gaggagcccg atttttacaa gacaaagatc aaactgtgca ttttactcca cgcctttagg 1560
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cctcccatga gcgtggagca cgccgacatc tgggtgaaga gctatagcct ctacagccgg 1680
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tgcgtgctga ataaggctac caacgtggct cactggacaa caccctcttt aaagtgcatc 1800
cgg 1803
<210> 60
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-18/TF/IL-15
<400> 60
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gatcaaggta accggcctct gttcgaggac atgaccgact ccgattgccg ggacaatgcc 180
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accaatttag gacagcccac catccaaagc tttgagcaag ttggcacaaa ggtgaatgtg 900
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gtccagatgt tcatcaatac ctcc 1524
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-12/IL-15RαSu
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1 5 10 15
Tyr Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp
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Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr
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Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val
50 55 60
Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp
65 70 75 80
Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser
85 90 95
Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile
100 105 110
Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu
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130 135 140
Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val
165 170 175
Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp
180 185 190
Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val
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210 215 220
Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys
225 230 235 240
Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp
245 250 255
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260 265 270
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Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-18/TF/IL-15
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Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
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Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe
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Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
65 70 75 80
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Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp
115 120 125
Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala
130 135 140
Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp
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210 215 220
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Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly
245 250 255
Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser
260 265 270
Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile
275 280 285
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305 310 315 320
Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser
325 330 335
Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile
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Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp
405 410 415
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420 425 430
Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser
435 440 445
Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala
450 455 460
Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys
465 470 475 480
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485 490 495
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第一嵌合多肽
<400> 63
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Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
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Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
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Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp Ser Gly Thr
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165 170 175
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195 200 205
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Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val
225 230 235 240
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260 265 270
Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg
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Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser
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Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val
325 330 335
Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser
340 345 350
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Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
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Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
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Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
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Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn
435 440 445
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
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His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
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<210> 64
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第一嵌合多肽
<400> 64
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn
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Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
50 55 60
Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
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Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala
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Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp
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Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp Ser
165 170 175
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Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val
195 200 205
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Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly
245 250 255
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Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第二嵌合多肽
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435 440 445
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580
<210> 66
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第二嵌合多肽
<400> 66
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355 360 365
Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu
370 375 380
Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu
385 390 395 400
Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser
405 410 415
Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys
420 425 430
Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu
435 440 445
Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met
450 455 460
Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile
465 470 475 480
Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln
485 490 495
Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu
500 505 510
Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg
515 520 525
Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser
530 535 540
Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg
545 550 555 560
Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser
565 570 575
Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp
580 585 590
Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
595 600
<210> 67
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第一嵌合多肽
<400> 67
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu
165 170 175
Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr
180 185 190
Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu
195 200 205
Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu
210 215 220
Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser
225 230 235 240
Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu
245 250 255
Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly
260 265 270
Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg
275 280 285
Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile
290 295 300
Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala
305 310 315 320
Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn
325 330 335
Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg
340 345 350
Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu
355 360 365
Phe Arg Glu Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
370 375 380
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
385 390 395 400
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
405 410 415
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
420 425 430
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
435 440 445
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
450 455 460
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
465 470 475 480
Phe Ile Asn Thr Ser
485
<210> 68
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第一嵌合多肽
<400> 68
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser
20 25 30
Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile
35 40 45
Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile
50 55 60
Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys
65 70 75 80
Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His
85 90 95
Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly
100 105 110
Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr
115 120 125
Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn
130 135 140
Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp
145 150 155 160
Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ser Gly Thr Thr Asn Thr
165 170 175
Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile
180 185 190
Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile
195 200 205
Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp
210 215 220
Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr
225 230 235 240
Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr
245 250 255
Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro
260 265 270
Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln
275 280 285
Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val
290 295 300
Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp
305 310 315 320
Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys
325 330 335
Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly
340 345 350
Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val
355 360 365
Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys
370 375 380
Gly Glu Phe Arg Glu Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
385 390 395 400
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
405 410 415
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
420 425 430
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
435 440 445
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
450 455 460
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
465 470 475 480
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
485 490 495
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
500
<210> 69
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第二嵌合多肽
<400> 69
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
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Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His
130 135 140
Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr
145 150 155 160
Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr
165 170 175
Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro
180 185 190
Ser Leu Lys Cys Ile Arg
195
<210> 70
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第二嵌合多肽
<400> 70
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile
20 25 30
Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu
35 40 45
Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala
50 55 60
Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn
65 70 75 80
Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro
85 90 95
Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro
100 105 110
Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg
115 120 125
Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg
130 135 140
Thr His Gly Ser Glu Asp Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val
145 150 155 160
Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu
165 170 175
Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser
180 185 190
Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr
195 200 205
Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
210 215
<210> 71
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第一嵌合多肽
<400> 71
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn
130 135 140
Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro
145 150 155 160
Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly
165 170 175
Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu
180 185 190
Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val
195 200 205
Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu
210 215 220
Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn
225 230 235 240
Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val
245 250 255
Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr
260 265 270
Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu
275 280 285
Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn
290 295 300
Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe
305 310 315 320
Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr
325 330 335
Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
340 345 350
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
355 360 365
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
370 375 380
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
385 390 395 400
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
405 410 415
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
420 425 430
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
435 440 445
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
450 455 460
Thr Ser
465
<210> 72
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第一嵌合多肽
<400> 72
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp
20 25 30
Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe
35 40 45
Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe
50 55 60
Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn
65 70 75 80
Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro
85 90 95
Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser
100 105 110
Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe
115 120 125
Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr
130 135 140
His Gly Ser Glu Asp Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr
145 150 155 160
Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu
165 170 175
Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser
180 185 190
Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp
195 200 205
Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg
210 215 220
Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly
225 230 235 240
Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr
245 250 255
Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys
260 265 270
Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn
275 280 285
Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr
290 295 300
Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr
305 310 315 320
Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys
325 330 335
Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser
340 345 350
Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg
355 360 365
Glu Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
370 375 380
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
385 390 395 400
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
405 410 415
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
420 425 430
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
435 440 445
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
450 455 460
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
465 470 475 480
Asn Thr Ser
<210> 73
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第二嵌合多肽
<400> 73
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser
180 185 190
Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp
195 200 205
Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
210 215
<210> 74
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第二嵌合多肽
<400> 74
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
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Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
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Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
50 55 60
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
115 120 125
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
130 135 140
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
145 150 155 160
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met
165 170 175
Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser
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Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr
195 200 205
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Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
225 230
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 75
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 76
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 76
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 77
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 77
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> 标签
<400> 78
Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg
1 5 10
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 79
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Tag
<400> 80
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 正向引物
<400> 81
agaaaagggg ggattta 17
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 反向引物
<400> 82
taacactcac aaccaaatta tc 22
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 测序引物
<400> 83
ggggatttag aaaaat 16
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 测序引物
<400> 84
tgtatgatgt taggagttt 19

Claims (350)

1.一种促进自然杀伤细胞活化和增殖的方法，所述方法包括：
(a)在允许自然杀伤细胞的分化的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的第一多链嵌合多肽的液体培养基中接触，持续第一时间段；以及
(b)在允许所述自然杀伤细胞的活化和增殖的条件下使所述自然杀伤细胞在包括有效量的(i)第二多链嵌合多肽和(ii)IgG1抗体构建体的液体培养基中接触，持续第二时间段，
其中所述第一多链嵌合多肽包括：
第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括第一靶结合结构域、可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域的第一结构域；以及
第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，
其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18受体或IL-12受体；并且
其中所述第二多链嵌合多肽包括：
第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括第一靶结合结构域、接头结构域、一对亲和结构域的第一结构域；以及
第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，
其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7受体或IL-21受体，并且所述IgG1抗体构建体包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。
7.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包括所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:5具有至少95％同一性的序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:5。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:9具有至少90％同一性的序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:9具有至少95％同一性的序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:9。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:10具有至少90％同一性的序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:10具有至少95％同一性的序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:10。
21.根据权利要求8到11、13到15和17到19中任一项所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包括在其N端处的信号序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述信号序列包括SEQ ID NO:28。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述信号序列是SEQ ID NO:28。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括SEQ ID NO:26。
35.根据权利要求29到34中任一项所述的方法，其中所述IL15Rα的sushi结构域包括来自人IL15Rα的sushi结构域。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ IDNO:24具有80％同一性的序列。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ IDNO:24具有90％同一性的序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ IDNO:24具有95％同一性的序列。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括SEQ IDNO:24。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。
41.根据权利要求1到28中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-15或可溶性IL-18。
43.根据权利要求1到42中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-12受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-18受体。
44.根据权利要求1到42中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-18受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-12受体。
45.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包括可溶性IL-18。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述可溶性IL-18是可溶性人IL-18。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述可溶性人IL-18包括与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述可溶性人IL-18包括与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述可溶性人IL-18包括与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的序列。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述可溶性人IL-18包括SEQ ID NO:20的序列。
51.根据权利要求44到50中任一项所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域包括可溶性IL-12。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述可溶性IL-12是可溶性人IL-12。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述可溶性人IL-12包括可溶性人IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述可溶性人IL-15进一步包括可溶性IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列之间的接头序列。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述接头序列包括SEQ ID NO:11。
56.根据权利要求53到55中任一项所述的方法，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的序列。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ IDNO:14具有至少90％同一性的序列。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ IDNO:14具有至少95％同一性的序列。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括SEQ ID NO:14。
60.根据权利要求53到59中任一项所述的方法，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ IDNO:16具有至少90％同一性的序列。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ IDNO:16具有至少95％同一性的序列。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括SEQ ID NO:16。
64.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNEDSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:63)具有至少80％同一性的序列。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少90％同一性的序列。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少95％同一性的序列。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:63。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括
MKWVTFISLLFLFSSAYSYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNEDSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:64)。
69.根据权利要求1和64到68中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:65)具有至少80％同一性的序列。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少90％同一性的序列。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少95％同一性的序列。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:65。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括
MKWVTFISLLFLFSSAYSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQID NO:66)。
74.根据权利要求1到73中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
75.根据权利要求1到73中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域之间的接头序列。
76.根据权利要求1到75中任一项所述的方法，其中所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
77.根据权利要求1到75中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。
78.根据权利要求1到77中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。
79.根据权利要求1到77中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包括所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。
80.根据权利要求1到79中任一项所述的方法，其中所述接头结构域是可溶性组织因子结构域。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:5具有至少80％同一性的序列。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:5具有至少90％同一性的序列。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:5具有至少95％同一性的序列。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:5。
86.根据权利要求81所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:9具有至少80％同一性的序列。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:9具有至少90％同一性的序列。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:9具有至少95％同一性的序列。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:9。
90.根据权利要求81所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:10具有至少80％同一性的序列。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:10具有至少90％同一性的序列。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:10具有至少95％同一性的序列。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:10。
94.根据权利要求82到84、86到88和90到92中任一项所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
96.根据权利要求81到95中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。
97.根据权利要求81到96中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。
98.根据权利要求81到97中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。
99.根据权利要求1到98中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包括在其N端处的信号序列。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述信号序列包括SEQ ID NO:28。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述信号序列是SEQ ID NO:28。
102.根据权利要求1到101中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述可溶性IL-15包括SEQ ID NO:26。
108.根据权利要求102到107中任一项所述的方法，其中所述IL15Rα的sushi结构域包括来自人IL15Rα的sushi结构域。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQID NO:24具有80％同一性的序列。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQID NO:24具有90％同一性的序列。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQID NO:24具有95％同一性的序列。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括SEQ IDNO:24。
113.根据权利要求108所述的方法，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。
114.根据权利要求1到101中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。
115.根据权利要求1到114中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-7或可溶性IL-21。
116.根据权利要求1到115中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-21受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-7受体。
117.根据权利要求1到115中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-7受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-21受体。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包括可溶性IL-21。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述可溶性IL-21是可溶性人IL-21。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的序列。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少95％同一性的序列。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述可溶性人IL-21包括SEQ ID NO:22的序列。
124.根据权利要求117到123中任一项所述的方法，其中所述第二靶结合结构域包括可溶性IL-7。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述可溶性IL-7是可溶性人IL-7。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的序列。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的序列。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的序列。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述可溶性人IL-7包括SEQ ID NO:23的序列。
130.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:67)具有至少80％同一性的序列。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少90％同一性的序列。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少95％同一性的序列。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:67。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括
MKWVTFISLLFLFSSAYSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:68)。
135.根据权利要求1和130到134中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:69)具有至少80％同一性的序列。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少90％同一性的序列。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少95％同一性的序列。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:69。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括
MKWVTFISLLFLFSSAYSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ IDNO:70)。
140.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:71)具有至少80％同一性的序列。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的序列。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少95％同一性的序列。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:71。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括
MGVKVLFALICIAVAEAQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:72)。
145.根据权利要求1和140到144中任一项所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ IDNO:73)具有至少80％同一性的序列。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少90％同一性的序列。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的序列。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:73。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括
MGVKVLFALICIAVAEADCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:74)。
150.根据权利要求1到149中任一项所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中所述单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到所述接头结构域。
151.根据权利要求1到149中任一项所述的方法，其中IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
152.根据权利要求1到151中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约15分钟到约4小时。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述第一时间段为约30分钟到约3.5小时。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述第一时间段为约1小时到约3.5小时。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述第一时间段为约2小时到约3.5小时。
156.根据权利要求1到155中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)中的所述液体培养基是含血清的液体培养基。
157.根据权利要求1到156中任一项所述的方法，其中所述NK细胞以约4.0x107个细胞/毫升到约1.5x108个细胞/毫升的密度存在于步骤(a)中的所述液体培养基中。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所述NK细胞以约5.0x107个细胞/毫升到约2.0x108个细胞/毫升的密度存在于步骤(a)中的所述液体培养基中。
159.根据权利要求1到158中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约1天到约30天。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述第二时间段为约7天到约30天。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述第二时间段为约14天到约21天。
162.根据权利要求1到161中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述液体培养基包括摩尔比为约0.5:1到约2:1的所述第二多链嵌合多肽和所述IgG1抗体构建体。
163.根据权利要求162所述的方法，其中步骤(b)中的所述液体培养基包括摩尔比为约0.8:1到约1.2:1的所述第二多链嵌合多肽和所述IgG1抗体构建体。
164.根据权利要求1到163中任一项所述的方法，其中所述NK细胞在步骤(b)中的所述液体培养基中维持在约0.5x106个细胞/毫升到约2.0x106个细胞/毫升的密度。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述NK细胞在步骤(b)中的所述液体培养基中维持在约1.0x106个细胞/毫升到约2.0x106个细胞/毫升的密度。
166.根据权利要求1到165中任一项所述的方法，其中所述NK细胞先前从受试者获得。
167.根据权利要求1到165中任一项所述的方法，其中所述NK细胞先前从脐带血中获得。
168.根据权利要求1到165中任一项所述的方法，其中所述NK细胞先前从诱导多能干细胞中获得。
169.根据权利要求166或167所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(a)之前从所述受试者获得所述NK细胞。
170.根据权利要求1到169中任一项所述的方法，其中所述NK细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。
171.根据权利要求1到169中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(a)和步骤(b)之间，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。
172.根据权利要求1到169中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(a)之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。
173.根据权利要求1到169中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(b)期间，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述NK细胞中。
174.根据权利要求1到173中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之后分离所述NK细胞。
175.根据权利要求1到174中任一项所述的方法，其中与步骤(a)之前一种或多种蛋白质的表达或分泌水平相比，在步骤(b)之后，所述NK细胞的一种或多种蛋白质的表达或分泌水平增加，所述一种或多种蛋白质选自由以下组成的组：TNF-α、IFN-γ、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、2B4、CD8、CD11a、CD16、CD25、CD27、CD48、CD49d、CD54、CD56、CD58、CD62L、CD69、CD70、CD94、CD137、CD158a、CD158b、CD158e、CD178、CD226、CD253、NKG2C、NKG2D、LIR-1、LILR-B1、KIR2DL1、KIR3DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、CXCR3、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、TRAIL、FasL、CXCR3、CXCR4、LTB、MX1、BAX、TNF-α和IFN-γ。
176.根据权利要求1到177中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在所述接触步骤之后，向有需要的受试者施用所述NK细胞。
177.根据权利要求176所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与年龄相关的疾病或病况。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病况选自由以下组成的组：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
179.根据权利要求176所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
181.根据权利要求176所述的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。
182.根据权利要求181所述的方法，其中所述感染性疾病是人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
183.一种活化的NK细胞，其通过根据权利要求1到182中任一项所述的方法产生。
184.一种药物组合物，其包括根据权利要求183所述的活化的NK细胞。
185.一种包括药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包括根据权利要求183所述的活化的NK细胞。
186.一种在有需要的受试者中杀死癌细胞、感染细胞或衰老细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求183所述的活化的NK细胞或根据权利要求184所述的药物组合物。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
188.根据权利要求187所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
189.根据权利要求186所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述与老化相关的疾病或病况选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
191.根据权利要求186所述的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。
192.根据权利要求191所述的方法，其中所述感染性疾病是人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
193.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求183所述的活化的NK细胞或活化的T细胞或根据权利要求184所述的药物组合物。
194.根据权利要求193所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
195.根据权利要求194所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、B细胞赘瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿道上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。
196.根据权利要求193所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或病况。
197.根据权利要求196所述的方法，其中所述与老化相关的疾病或病况选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症和肾功能障碍。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定为患有感染性疾病。
199.根据权利要求198所述的方法，其中所述感染性疾病是人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、轮状病毒、天花、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和流感病毒的感染。
200.一种试剂盒，其包括：
(a)第一多链嵌合多肽，所述第一多链嵌合多肽包括：
第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括第一靶结合结构域、可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域的第一结构域；以及
第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，
其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18受体或IL-12受体；
(b)第二多链嵌合多肽，所述第二多链嵌合多肽包括：
第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括第一靶结合结构域、接头结构域、一对亲和结构域的第一结构域；以及
第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括一对亲和结构域的第二结构域和第二靶结合结构域，
其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7受体或IL-21受体；以及
(c)IgG1抗体，所述IgG1抗体包括特异性结合到所述接头结构域的至少一个抗原结合结构域。
201.根据权利要求200所述的试剂盒，其中所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
202.根据权利要求200所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
203.根据权利要求200到202中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
204.根据权利要求200到202中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。
205.根据权利要求200到204中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。
206.根据权利要求200到204中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包括所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。
207.根据权利要求200到206中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
208.根据权利要求207所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:5具有至少80％同一性的序列。
209.根据权利要求208所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:5具有至少90％同一性的序列。
210.根据权利要求209所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:5具有至少95％同一性的序列。
211.根据权利要求210所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:5。
212.根据权利要求207所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:9具有至少80％同一性的序列。
213.根据权利要求212所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:9具有至少90％同一性的序列。
214.根据权利要求213所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:9具有至少95％同一性的序列。
215.根据权利要求214所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:9。
216.根据权利要求207所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:10具有至少80％同一性的序列。
217.根据权利要求216所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:10具有至少90％同一性的序列。
218.根据权利要求217所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:10具有至少95％同一性的序列。
219.根据权利要求218所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:10。
220.根据权利要求207到210、212到214和216到218中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
221.根据权利要求220所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
222.根据权利要求200到221中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。
223.根据权利要求200到222中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。
224.根据权利要求200到223中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。
225.根据权利要求200到224中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包括在其N端处的信号序列。
226.根据权利要求225所述的试剂盒，其中所述信号序列包括SEQ ID NO:28。
227.根据权利要求226所述的试剂盒，其中所述信号序列是SEQ ID NO:28。
228.根据权利要求200到227中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。
229.根据权利要求228所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。
230.根据权利要求228所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。
231.根据权利要求230所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。
232.根据权利要求231所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。
233.根据权利要求232所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括SEQ ID NO:26。
234.根据权利要求228到233中任一项所述的试剂盒，其中所述IL15Rα的sushi结构域包括来自人IL15Rα的sushi结构域。
235.根据权利要求234所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有80％同一性的序列。
236.根据权利要求235所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有90％同一性的序列。
237.根据权利要求236所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有95％同一性的序列。
238.根据权利要求237所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括SEQID NO:24。
239.根据权利要求234所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。
240.根据权利要求200到227中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。
241.根据权利要求200到240中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-15或可溶性IL-18。
242.根据权利要求200到241中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-12受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-18受体。
243.根据权利要求200到241中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-18受体，并且所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-12受体。
244.根据权利要求252所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包括可溶性IL-18。
245.根据权利要求244所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-18是可溶性人IL-18。
246.根据权利要求245所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-18包括与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列。
247.根据权利要求246所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-18包括与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的序列。
248.根据权利要求247所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-18包括与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的序列。
249.根据权利要求248所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-18包括SEQ ID NO:20的序列。
250.根据权利要求243到249中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域包括可溶性IL-12。
251.根据权利要求250所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-12是可溶性人IL-12。
252.根据权利要求251所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12包括可溶性人IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列。
253.根据权利要求252所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-15进一步包括可溶性IL-12β(p40)序列和可溶性人IL-12α(p35)序列之间的接头序列。
254.根据权利要求253所述的试剂盒，其中所述接头序列包括SEQ ID NO:11。
255.根据权利要求252到254中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的序列。
256.根据权利要求255所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQID NO:14具有至少90％同一性的序列。
257.根据权利要求256所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括与SEQID NO:14具有至少95％同一性的序列。
258.根据权利要求257所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12β(p40)序列包括SEQ IDNO:14。
259.根据权利要求252到258中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列。
260.根据权利要求259所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQID NO:16具有至少90％同一性的序列。
261.根据权利要求260所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括与SEQID NO:16具有至少95％同一性的序列。
262.根据权利要求261所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-12α(p35)序列包括SEQ IDNO:16。
263.根据权利要求200所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少80％同一性的序列。
264.根据权利要求263所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少90％同一性的序列。
265.根据权利要求264所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:63具有至少95％同一性的序列。
266.根据权利要求265所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:63。
267.根据权利要求266所述的试剂盒，其中所述第一多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:64。
268.根据权利要求200和263到267中任一项所述的试剂盒，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少80％同一性的序列。
269.根据权利要求268所述的试剂盒，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少90％同一性的序列。
270.根据权利要求269所述的试剂盒，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:65具有至少95％同一性的序列。
271.根据权利要求270所述的试剂盒，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:65。
272.根据权利要求271所述的试剂盒，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:66。
273.根据权利要求200到272中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
274.根据权利要求200到272中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述接头结构域之间的接头序列。
275.根据权利要求200到274中任一项所述的试剂盒，其中所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域在所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
276.根据权利要求200到274中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽进一步包括所述第一嵌合多肽中的所述接头结构域和所述亲和结构域对的所述第一结构域之间的接头序列。
277.根据权利要求200到276中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。
278.根据权利要求200到276中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽进一步包括所述第二嵌合多肽中的所述亲和结构域对的所述第二结构域和所述第二靶结合结构域之间的接头序列。
279.根据权利要求200到278中任一项所述的试剂盒，其中所述接头结构域是可溶性组织因子结构域。
280.根据权利要求279所述的试剂盒，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
281.根据权利要求280所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:5具有至少80％同一性的序列。
282.根据权利要求281所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:5具有至少90％同一性的序列。
283.根据权利要求282所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:5具有至少95％同一性的序列。
284.根据权利要求283所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:5。
285.根据权利要求280所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:9具有至少80％同一性的序列。
286.根据权利要求285所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:9具有至少90％同一性的序列。
287.根据权利要求284所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:9具有至少95％同一性的序列。
288.根据权利要求285所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:9。
289.根据权利要求278所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:10具有至少80％同一性的序列。
290.根据权利要求289所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:10具有至少90％同一性的序列。
291.根据权利要求290所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQID NO:3具有至少95％同一性的序列。
292.根据权利要求291所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:10。
293.根据权利要求279到281、283到285和289到291中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的一个或多个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
294.根据权利要求293所述的试剂盒，其中所述可溶性人组织因子结构域不包括以下中的任一个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
295.根据权利要求278到294中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性组织因子结构域不能结合因子VIIa。
296.根据权利要求278到295中任一项所述的试剂盒，其中所述可溶性组织因子结构域不将无活性的因子X转化为因子Xa。
297.根据权利要求278到296中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽不刺激哺乳动物中的凝血。
298.根据权利要求198到297中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽和/或所述第二嵌合多肽进一步包括在其N端处的信号序列。
299.根据权利要求298所述的试剂盒，其中所述信号序列包括SEQ ID NO:28。
300.根据权利要求299所述的试剂盒，其中所述信号序列是SEQ ID NO:28。
301.根据权利要求198到298中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。
302.根据权利要求301所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。
303.根据权利要求301所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有80％同一性的序列。
304.根据权利要求303所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有90％同一性的序列。
305.根据权利要求304所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括与SEQ ID NO:26具有95％同一性的序列。
306.根据权利要求305所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-15包括SEQ ID NO:26。
307.根据权利要求301到306中任一项所述的试剂盒，其中所述IL15Rα的sushi结构域包括来自人IL15Rα的sushi结构域。
308.根据权利要求307所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有80％同一性的序列。
309.根据权利要求308所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有90％同一性的序列。
310.根据权利要求309所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括与SEQ ID NO:24具有95％同一性的序列。
311.根据权利要求310所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域包括SEQID NO:24。
312.根据权利要求307所述的试剂盒，其中所述来自人IL15Rα的sushi结构域是成熟的全长IL15Rα。
313.根据权利要求200到300中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述亲和结构域对选自由以下组成的组：barnase和barnstar、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块，以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触小泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块。
314.根据权利要求200到313中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自独立地为可溶性IL-7或可溶性IL-21。
315.根据权利要求200到314中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-21受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-7受体。
316.根据权利要求200到314中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域特异性结合到IL-7受体，并且所述第二多链嵌合多肽中的所述第二靶结合结构域特异性结合到IL-21受体。
317.根据权利要求316所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一靶结合结构域包括可溶性IL-21。
318.根据权利要求317所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-21是可溶性人IL-21。
319.根据权利要求318所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。
320.根据权利要求319所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的序列。
321.根据权利要求320所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-21包括与SEQ ID NO:22具有至少95％同一性的序列。
322.根据权利要求321所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-21包括SEQ ID NO:22的序列。
323.根据权利要求316到322中任一项所述的试剂盒，其中所述第二靶结合结构域包括可溶性IL-7。
324.根据权利要求323所述的试剂盒，其中所述可溶性IL-7是可溶性人IL-7。
325.根据权利要求324所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的序列。
326.根据权利要求325所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的序列。
327.根据权利要求326所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-7包括与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的序列。
328.根据权利要求327所述的试剂盒，其中所述可溶性人IL-7包括SEQ ID NO:23的序列。
329.根据权利要求200所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少80％同一性的序列。
330.根据权利要求329所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少90％同一性的序列。
331.根据权利要求330所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:67具有至少95％同一性的序列。
332.根据权利要求331所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:67。
333.根据权利要求332所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:68。
334.根据权利要求200和329到333中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少80％同一性的序列。
335.根据权利要求334所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少90％同一性的序列。
336.根据权利要求335所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:69具有至少95％同一性的序列。
337.根据权利要求336所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:69。
338.根据权利要求337所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:70。
339.根据权利要求200所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少80％同一性的序列。
340.根据权利要求339所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性的序列。
341.根据权利要求340所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少95％同一性的序列。
342.根据权利要求341所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:71。
343.根据权利要求342所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:72。
344.根据权利要求200和339到343中任一项所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少80％同一性的序列。
345.根据权利要求344所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少90％同一性的序列。
346.根据权利要求345所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:73具有至少95％同一性的序列。
347.根据权利要求346所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:73。
348.根据权利要求347所述的试剂盒，其中所述第二多链嵌合多肽中的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:74。
349.根据权利要求200到348中任一项所述的试剂盒，其中所述IgG1抗体构建体是单克隆IgG1抗体，其中所述单克隆IgG1抗体中的两个抗原结合结构域都特异性结合到所述接头结构域。
350.根据权利要求200到348中任一项所述的试剂盒，其中IgG1抗体构建体是双特异性IgG1抗体，其中双特异性IgG1抗体中的两个抗原结合结构域中的一个特异性结合到接头结构域。
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