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TWI495644B - 營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途 - Google Patents

營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途 Download PDF

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TWI495644B
TWI495644B TW101141373A TW101141373A TWI495644B TW I495644 B TWI495644 B TW I495644B TW 101141373 A TW101141373 A TW 101141373A TW 101141373 A TW101141373 A TW 101141373A TW I495644 B TWI495644 B TW I495644B
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seq
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trop
conjugate
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TW101141373A
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TW201333036A (zh
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Shu-Hui Liu
Wei-Hsien Ho
Pavel Strop
Magdalena Grazyna Dorywalska
Arvind Rajpal
David Louis Shelton
Thomas-Toan Tran
Original Assignee
Rinat Neuroscience Corp
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Publication date
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Description

營養層細胞表面抗原(Trop-2)之專一性抗體類及彼等之用途 相關申請案
本申請案主張美國臨時專利申請案號61/559,015(2011年11月11日提出申請)、美國臨時專利申請案61/640,641(2012年4月30日提出申請)及美國臨時專利申請案61/717,288(2012年10月23日提出申請)之權益，彼等以參照方式全部納入此處。
本發明關於抗體(例如全長抗體或彼之抗原結合片段)，其與營養層細胞表面抗原(Trop-2)專一性結合。本發明另關於包含該等Trop-2抗體之抗體共軛物(例如抗體-藥物-共軛物)、包含該等Trop-2抗體之組成物，及使用該等Trop-2抗體及彼等之共軛物以治療與Trop-2表現有關之症狀(例如癌)之方法。
營養層細胞表面抗原(Trop-2)又名M1S1、GA733-1(胃抗原733-1)、EGP-1(上皮糖蛋白-1)或TACSTD2(腫瘤相關性鈣信號傳導因子)，其最早係於人胎盤營養層發現之細胞表面糖蛋白，後來被發現高度表現於大部分人之癌細胞上，且僅受限或有限地表現於正常成人組織。見例如Varughese et al.,Gynecologic Oncology,122：171-177,2011。Trop-2在不同物種之間具有高度保守性。舉例來 說，人Trop-2蛋白與小鼠Trop-2蛋白之間具有79%一致性。見Cubas et al.,Molecular Cancer,9：253,2010。雖然Trop-2之生物功能尚不清楚，多項研究顯示Trop-2之過度表現與多種人癌症之腫瘤侵犯性、轉移及預後不良有關，像是結腸癌、卵巢癌及胰癌。見例如Fang et al.,Int.J.Colorectal Dis,24：875-884,2009；Bignotti et al.,Eur.J.Cancer,46：944-953,2010；及Fong et al.,Br J Cancer,99：1290-1295,2008。研究亦顯示Trop-2造成至少部分的腫瘤致病機轉，即藉由活化在癌細胞增生、移動、入侵及存活上有重要關聯性之ERK1/2 MAPK途徑。見Cubas et al.,2010，同上。
上皮腫瘤細胞過度表現Trop-2及彼之跨膜位置使Trop-2成為癌免疫治療中值得注意之標靶。因此，對Trop-2(特別是人Trop-2)具有高度親和性之抗體將是在人病患之癌治療中的優良治療劑。雖然多種Trop-2抗體已被揭示(見例如美國專利第7,420,041號(抗體AR47A6.4.2)、美國專利第5,850,854號(抗體BR110)、美國專利第6,653,104號(抗體RS7)、美國專利第7,517,964號(抗體RS7)、US2012/0237518)，但是要找到具有高度親和性、高度專一性及強效細胞毒性或腫瘤殺滅/抑制/緩解活性之單株抗體非常困難。仍然需要具有增進療效及安全性特性之針對Trop-2之抗體及其他免疫治療劑(如抗體-藥物共軛物)，且必須適用於人病患。
 摘要
本發明在此處揭示抗體及抗體共軛物(例如抗體-藥物共軛物)，其與Trop-2結合。在一態樣中，本發明提供抗體或抗體共軛物，其藉由表面電漿共振所測量之約6.5 nM或小於6.5 nM之單價抗體結合親和性(KD )與人Trop-2(SEQ ID NO：27)之結構域3(例如胺基酸殘基152至206)及結構域4(例如胺基酸殘基209至274)專一性結合。在另一態樣中，本發明提供經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包含a)重鏈可變區(VH)互補決定區及/或b)輕鏈可變區(VH)互補決定區，該重鏈可變區(VH)互補決定區包含(i)VH互補決定區1(CDR1)，其包含序列SYGVH(SEQ ID NO：30)、GGSISSY(SEQ ID NO：36)或GGSISSYGVH(SEQ ID NO：37)；(ii)VH CDR2，其包含序列VIWTX1 GX2 TDYNSALMX3 ，其中X1 係G或S、X2 係S或V、X3 係S或G(SEQ ID NO：49)；或WTX1 GX2 ，其中X1 係G或S、X2 係S或V(SEQ ID NO：50)；及(iii)VH CDR3，其包含序列DGDYDRYTMDY(SEQ ID NO：35)；DYDRYTX1 DY，其中X1 係E或M(SEQ ID NO：82)；或DYDRYTX1 DY，其中X1 係任何天然發生之胺基酸，例如A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V(SEQ ID NO：83)，該輕鏈可變區(VL)互補決定區包含(i)VL CDR1，其包含序列RASKSVSTSX1 YSYMH，其中X1 係 G、L或N(SEQ ID NO：63)；(ii)VL CDR2，其包含序列LASNLES(SEQ ID NO：55)；及(iii)VL CDR3，其包含序列VLQHSRELPYT(SEQ ID NO：56)。在一些實施態樣中，該抗體不包含序列QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGSTDYNSALMSRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：2)之重鏈可變區及序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)之輕鏈可變區。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包含：VH區及/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：5、84或85所示之VH序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，該VL區包含如SEQ ID NO：3或6所示之VL序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些實施態樣中，該VH區包含(i)VH CDR1，其包含序列SYGVH(SEQ ID NO：30)、GGSISSY(SEQ ID NO：36)或GGSISSYGVH(SEQ ID NO：37)；(ii)VH CDR2，其包含序列VIWTSGVTDYNSALMG(SEQ ID NO：38)或WTSGV(SEQ ID NO：39)；及(iii)VH CDR3，其包含序列DGDYDRYTMDY(SEQ ID NO：35)或DYDRYTX1 DY，其中X1 係E或M (SEQ ID NO：82)。在一些實施態樣中，該VL區包含(i)VL CDR1，其包含序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO：54)或RASKSVSTSLYSYMH(SEQ ID NO：57)；(ii)VL CDR2，其包含序列LASNLES(SEQ ID NO：55)；及(iii)VL CDR3，其包含序列QHSRELPYT(SEQ ID NO：56)。在一些實施態樣中，該抗體包含(a)重鏈CDR，其包含：(i)CDR1，其包含序列SYGVH(SEQ ID NO：30)、GGSISSY(SEQ ID NO：36)或GGSISSYGVH(SEQ ID NO：37)；(ii)CDR2，其包含序列VIWTSGVTDYNSALMG(SEQ ID NO：38)或WTSGV(SEQ ID NO：39)；及(iii)CDR3，其包含序列DGDYDRYTMDY(SEQ ID NO：35)、DYDRYTMDY(SEQ ID NO：99)或DYDRYTEDY(SEQ ID NO：100)；及(b)輕鏈CDR，其包含：(i)CDR1，其包含序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO：54)或RASKSVSTSLYSYMH(SEQ ID NO：57)；(ii)CDR2，其包含序列LASNLES(SEQ ID NO：55)；及(iii)CDR3，其包含序列QHSRELPYT(SEQ ID NO：56)。在一些實施態樣中，該VH區包含如SEQ ID NO：5、84或85或在非CDR內之殘基經一或多個保守性胺基酸取代之變異體所示之序列，及/或該VL區包含如SEQ ID NO：3、6或彼在非CDR內之胺基酸經一或多個胺基酸取代之變異體所示之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該抗體包含輕鏈及/或重鏈，該輕鏈包含如SEQ ID NO：66所示之序列，該重鏈包含如SEQ ID NO：65所示之序列。在一些實施態樣中，該抗體 包含由ATCC編號PTA-12872之表現載體所產製之VH區。在一些實施態樣中，該抗體包含由ATCC編號PTA-12871之表現載體所產製之VL區。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其藉由表面電漿共振所測量之約35 nM或小於35 nM之結合親和性(KD )與人Trop-2(SEQ ID NO：27)之結構域1(例如胺基酸殘基31至71)專一性結合。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包含：(a)重鏈可變區(VH)互補決定區，其包含(i)VH CDR1，其包含序列SYWIN(SEQ ID NO：40)、GYTFTSY(SEQ ID NO：41)或GYTFTSYWIN(SEQ ID NO：42)；(ii)VH CDR2，其包含序列NIX1 PSDSYSNYNX2 KFKD其中X1 係Y或F、X2 係Q或K(SEQ ID NO：51)，或X1 PSDSY其中X1 係Y或F(SEQ ID NO：52)；及(iii)VH CDR3，其包含序列GSX1 FDY其中X1 係S或G(SEQ ID NO：53)；及/或(b)VL區互補決定區，其包含(i)VL CDR1，其包含序列RASQTIGTSIH(SEQ ID NO：59)；(ii)VL CDR2，其包含序列YASESIS(SEQ ID NO：60)；及(iii)VL CDR3，其包含序列X1 QSX2 SWPFT其中X1 係Q或S、X2 係N或F(SEQ ID NO：64)。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包 含：VH區及/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：13所示之VH序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，該VL區包含如SEQ ID NO：12所示之VL序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些實施態樣中，該VH區包含(i)VH CDR1，其包含序列SYWIN(SEQ ID NO：40)、GYTFTSY(SEQ ID NO：41)或GYTFTSYWIN(SEQ ID NO：42)；(ii)VH CDR2，其包含序列NIFPSDSYSNYNKKFKD(SEQ ID NO：46)或FPSDSY(SEQ ID NO：47)；及(iii)VH CDR3，其包含序列GSGFDY(SEQ ID NO：48)。在一些實施態樣中，該VL區包含(i)VL CDR1，其包含序列RASQTIGTSIH(SEQ ID NO：59)；(ii)VL CDR2，其包含序列YASESIS(SEQ ID NO：60)；及(iii)VL CDR3，其包含序列SQSFSWPFT(SEQ ID NO：62)。在一些實施態樣中，該抗體包含(a)重鏈CDR，其包含：(i)CDR1，其包含序列SYWIN(SEQ ID NO：40)、GYTFTSY(SEQ ID NO：41)或GYTFTSYWIN(SEQ ID NO：42)；(ii)CDR2，其包含序列NIFPSDSYSNYNKKFKD(SEQ ID NO：46)或FPSDSY(SEQ ID NO：47)；及(iii)VH CDR3，其包含序列GSGFDY(SEQ ID NO：48)；及(b)輕鏈CDR，其包含：(i)CDR1，其包含序列RASQTIGTSIH(SEQ ID NO：59)；(ii)CDR2，其包含序列YASESIS(SEQ ID NO：60)；及(iii)CDR3，其包含序列SQSFSWPFT(SEQ ID NO：62)。在一些實施態樣中，該VH區包含如SEQ ID NO：13或在非CDR內之殘基經一或多個保守性胺基酸取代之變異體所示之序列，及/ 或該VL區包含如SEQ ID NO：12或彼在非CDR內之胺基酸經一或多個胺基酸取代之變異體所示之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含如SEQ ID NO：68所示之序列，該重鏈包含如SEQ ID NO：67所示之序列。
在一些實施態樣中，該抗體可為人抗體、人化抗體或嵌合性抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單株抗體。
在一些實施態樣中，該抗體包含恆定區。在一些實施態樣中，該抗體係屬於人IgG1、IgG2或IgG2△a、IgG3或IgG4亞型。在一些實施態樣中，該抗體包含經糖基化之恆定區。在一些實施態樣中，該抗體包含對一或多種人Fcγ受體具有增加之結合親和性之恆定區。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其與Trop-2專一性結合且與此處所述之抗體(例如m7E6、h7E6_SVG、h7E6_SVG4、h7E6_SVG19、h7E6_SVG6、h7E6_SVG20、h7E6_SVG22、h7E6_SVG28、h7E6_SVG30、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h7E6_SVGN、m6G11、h6G11或h6G11_FKG_SF)競爭。在一些實施態樣中，該抗體與h7E6_SVG競爭且具有藉由表面電漿共振所測量之約6.5 nM或小於6.5 nM之單價抗體結合親和性(KD )。
在另一態樣中，本發明提供如此處所述之抗體或抗原結合片段之共軛物，其中該抗體或抗原結合片段係與劑共 軛，其中該劑係選自細胞毒性劑、免疫調節劑、顯影劑、治療性蛋白質、生物聚合物或寡核苷酸。在一些實施態樣中，該劑係細胞毒性劑(例如一甲基耳抑素D(MMAD)或其他耳抑素)。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其包含在該抗體之特定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤。在一些實施態樣中，該標籤包含胺基酸麩胺醯胺(Q)或胺基酸序列GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ NO：79)、GGLLQGA(SEQ ID NO：81)、LLQ或LLQX1 X2 X3 X4 X5 ，其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係G、K或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88)。在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在特定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤，諸如Q、GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ ID NO：79)、GGLLQGA(SEQ ID NO：81)、LLQ或LLQX1 X2 X3 X4 X5 ，其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係G、K或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88)。
在一變異態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其包括含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及在該抗體之位置222、340或370(卡巴編號系統)之胺基酸修飾，其中該修飾係胺基酸刪除、插入、取代、突變或任何彼等之組合。 在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在該Trop-2抗體之特定位置(例如該重鏈或輕鏈之羧基端或另一位置)經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤(例如Q、GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ ID NO：79)、GGLLQGA(SEQ ID NO：81)、LLQ或LLQX1 X2 X3 X4 X5 ，其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係G、K或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88))及在該抗體之位置222、340或370(卡巴編號系統)之胺基酸修飾。在一些實施態樣中，該胺基酸修飾係將離胺酸取代成精胺酸。
在另一態樣中，本發明提供如此處所述之抗體或抗原結合片段之共軛物，其中該共軛物包含下式：抗體-(含有麩胺醯胺之醯基供體標籤)-(連接子)-(細胞毒性劑)，其中該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤係經工程化於該抗體或抗原結合片段之特定位置(例如該重鏈或輕鏈之羧基端或另一位置)，其中該標籤係與連接子共軛(例如含有一或多個反應性胺之連接子(例如一級胺NH2 ))且其中該連接子係與細胞毒性劑(例如MMAD或其他耳抑素)共軛。
在一些實施態樣中，該共軛物係選自1)抗體-LLQGA-(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基)-0101，其中乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基係AcLys-VC-PABC，且其中0101係2-甲基丙胺醯基-N -[(3R, 4S, 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R, 2R )-1-甲氧基- 2-甲基-3-羰基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-羰基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺；2)抗體-LLQGA-AcLys-VC-PABC-MMAD；3)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-AcLys-VC-PABC-0101；4)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-AcLys-VC-PABC-MMAD；5)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-AcLys-VC-PABC-0101；或6)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-AcLys-VC-PABC-MMAD。在一些實施態樣中，該共軛物包含位置222之離胺酸取代成精胺酸之胺基酸取代。在一些實施態樣中，該共軛物包含在該抗體重鏈之C端的胺基酸離胺酸(K)刪除。
在另一態樣中，本發明提供如此處所述之抗體或抗原結合片段之共軛物，該共軛物包含在位置N297Q及K222R之胺基酸取代、包含胺基-PEG6-丙醯基之連接子，及細胞毒性劑(例如MMAD或其他耳抑素)。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含治療有效量之如此處所述之Trop-2抗體或共軛物及醫藥上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之多核苷酸，其包含編碼如此處所述之Trop-2抗體之核苷酸序列。在一些實施態樣中，本發明提供一種載體，其包含該多核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之宿主細胞，其重組產製如此處所述之Trop-2抗體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之與Trop-2表現有關之症狀之方法，該方法包含對需要治療之個體投予有效量之如此處所述之醫藥組成物。在一些實施態樣中，該症狀係癌。在一些實施態樣中，該癌係選自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、腎癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰癌、前列腺癌或皮膚癌。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制患有Trop-2表現腫瘤之個體的腫瘤生長或惡化之方法，該方法包含對需要抑制之個體投予有效量之如此處所述之醫藥組成物。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制個體之Trop-2表現癌細胞之轉移之方法，該方法包含對需要抑制之個體投予有效量之如此處所述之醫藥組成物。
在另一態樣中，本發明提供一種誘導患有Trop-2表現腫瘤之個體的腫瘤緩解之方法，該方法包含對需要誘導之個體投予有效量之如此處所述之醫藥組成物。
在一些實施態樣中，如此處所述之抗體或共軛物可非經腸地投予至個體。在一些實施態樣中，該個體係人。
在一些實施態樣中，此處所述之抗體不包含序列QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGSTDYNSALMSRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：2)之重鏈可變區及序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQ QKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)之輕鏈可變區。
本發明之詳細說明
此處揭示之發明提供抗體及抗體共軛物(例如抗體-藥物共軛物)，其與Trop-2(例如人Trop-2)專一性結合。本發明亦提供編碼該等抗體之多核苷酸、包含該等抗體之組成物及製備及使用該等抗體之方法。本發明亦提供用於治療個體之與Trop-2表現有關之症狀諸如癌(例如結腸癌、胃癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌及胰癌)之方法。
一般技術
除非另外說明，本發明之實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，這些技術係該領域之習知技藝。該等技術係於文獻中充分解釋，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
「抗體」係免疫球蛋白分子，其可透過位於該免疫球蛋白分子之可變區的至少一個抗原辨認區特異性地與目標 結合，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此處所使用之該用語不僅包含完整多株或單株抗體，但亦包含彼之片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv)、單鏈抗體(ScFv)、結構域抗體(包括例如鯊魚及駱駝抗體)、包含抗體之融合蛋白，及任何其他包含抗原辨認區之免疫球蛋白分子之經修飾之構型。抗體包括任何類型之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或彼等之亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。根據彼之重鏈的恆定區之抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同類型。有五種主要的免疫球蛋白類型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些類型可進一步分成亞型(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定區分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型係廣為週知。
抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部位」用語在此處係指完整抗體之一或多個片段，該片段保留與給定抗原(例如Trop-2)專一性結合之能力。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段實現。抗體之「抗原結合片段」用語所涵蓋之結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 、由VH及CH1結構域組成之Fd片段、由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段、單一結構域抗體(dAb)片段(Ward et al.,Nature 341：544-546,1989)及經分離之互補決定區(CDR)。
與標靶(例如Trop-2蛋白)「優先結合」或「專一性結合 」(在此處可互換使用)之抗體、抗體共軛物或多肽係該領域理解清楚之用語，測定該等專一性或優先結合之方法亦為該領域所廣為周知。若分子與特定細胞或物質之交互反應或相連相較於與其他細胞或物質之交互反應或相連係更頻繁、更快速、更長時間及/或更高親和性，該分子被稱為展現「專一性結合」或「優先結合」。若抗體與標靶之結合相較於與其他物質之結合具有更高親和性、親合力(avidity)、更快速及/或更長時間，則該抗體與標靶「專一性結合」或「優先結合」。舉例來說，與Trop-2表位專一性或優先結合之抗體係指相較於與其他Trop-2表位或非Trop-2表位結合時，以更高之親和性、親合力、更快速及/或更長時間與此表位結合之抗體。藉由閱讀此定義亦可了解，舉例來說，與第一標靶專一性或優先結合之抗體(或基團或表位)可能與第二標靶或不與第二標靶專一性或優先結合。因此，「專一性結合」或「優先結合」不一定需要(雖然可包括)排他性結合。一般來說(但不必然)，所謂的結合係指優先結合。
抗體之「可變區」係指(不論單獨或經組合之)抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如該領域所知，重鏈及輕鏈之可變區各由四個架構區(FR)及連接該四個架構區之三個互補決定區(CDR)組成，CDR亦稱為超變異區。各鏈中之CDR藉由FR被拉近，且與另一鏈之CDR形成抗體之抗原結合部位。至少有兩種技術用於測定CDR：(1)根據跨種序列變異性之方法(即Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)根據抗原-抗體複合體之結晶學研究之方法(Al-lazikani et al.,1997,J.Molec.Biol.273：927-948)。此處所使用之CDR係指以任一方法或兩種方法之組合所定義之CDR。
可變結構域之「CDR」係位於可變區內之胺基酸殘基，該等胺基酸殘基係根據卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、卡巴及柯西亞之累積定義、AbM定義、接觸定義及/或構形定義，或該領域廣為周知之任何CDR測定方法加以識別。抗體CDR可能被識別為最先由卡巴等人所定義之超變異區。見例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.。CDR之位置亦可能被識別為最先由柯西亞等人所描述之結構性圈環結構。見例如Chothia et al.,Nature 342：877-883,1989。其他識別CDR之方法包括「AbM定義」，該法為卡巴法及柯西亞法之折衷，係源自利用牛津分子(Oxford Molecular)之AbM抗體模型軟體(現為Accelrys®)，或如MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262：732-745,1996所述之基於抗原接觸觀察之CDR的「接觸定義」。在此處稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可能被鑑別為對抗原結合造成焓貢獻之殘基。見例如Makabe et al.,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166,2008。其他CDR邊界定義可能仍不嚴格遵守上述方法中之一者，但將與至少部分之卡巴 CDR重疊，不過它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用之CDR可能指由該領域已知之任何方法(包括多種方法之組合)所定義之CDR。此處所使用之方法可利用根據這些方法中任一者所定義之CDR。以包含超過一種CDR之任何給定實施態樣而言，該等CDR可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
此處所使用之「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，即除了可能少量存在之可能天然發生之突變以外，組成該族群之個別抗體係相同的。單株抗體具高度專一性，其係以單一抗原部位為目標。另外，和通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體的多株抗體製劑不同的是，各單株抗體係以抗原上之單一決定簇為目標。修飾語「單株」表示抗體係自實質上同源之抗體族群獲得之特徵，不應被視為需要藉由任何特定之方法產製該抗體。舉例來說，本發明所使用之單株抗體可能藉由首先由Kohler and Milstein,Nature 256：495,1975所描述之雜交瘤方法製備，或可藉由重組DNA方法諸如美國專利第4,816,567號所述者製備。該等單株抗體亦可自利用例如McCafferty et al.,Nature 348：552-554,1990所述之技術而產製之噬菌體分子庫分離。
此處所使用之「人化」抗體係指非人(例如小鼠)抗體之形式，其為包含源自非人免疫球蛋白之最少序列之嵌合 性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或彼等之片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2 或抗體之其他抗原結合子序列)。較佳地，人化抗體係其中源自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被源自具有所欲之專一性、親和性及能力之非人物種(諸如小鼠、大鼠或兔)(捐贈者抗體)之CDR的殘基所取代之人免疫球蛋白(接受者抗體)。在一些情況中，人免疫球蛋白之Fv架構區(FR)殘基被對應之非人殘基取代。另外，該人化抗體可能包含不見於接受者抗體或不見於經導入之CDR或架構序列中之殘基，但該些殘基被包括以進一步改善及最佳化抗體之表現。整體而言，人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有之CDR區對應非人免疫球蛋白之CDR區且所有或實質上所有之FR區係人免疫球蛋白一致序列之FR區。該人化抗體亦將理想地包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之恆定區或恆定結構域。較佳地具有如WO 99/58572所述之經修飾之Fc區之抗體。其他形式之人化抗體具有一或多個相對於原始抗體經改變之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，該等CDR亦被稱為一或多個「源自」原始抗體之一或多個CDR之CDR。
此處所使用之「人抗體」係指具有對應由人所產生之抗體的胺基酸序列之胺基酸序列的抗體，及/或利用任何該領域之技藝人士所知或此處所揭示之製備人抗體之技術所製備之抗體。此定義之人抗體包括含有至少一個人重鏈 多肽或至少一個人輕鏈多肽之抗體。一個該等實例係包含小鼠輕鏈及人重鏈多肽之抗體。人抗體可利用該領域已知之多種技術製備。在一實施態樣中，該人抗體係選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人抗體(Vaughan et al.,Nature Biotechnology,14：309-314,1996；Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162,1998；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227：381,1991；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581,1991)。人抗體亦可藉由免疫接種動物加以製備，該動物體內之內源性基因座(loci)已被基因轉殖導入之人免疫球蛋白基因座所取代，例如其中內源性免疫球蛋白基因已被部份或完全不活化之小鼠。此方法係描述於美國專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016號。或者，該人抗體可藉由使產製針對標靶抗原之抗體的人B淋巴細胞永生化加以製備(該等B淋巴細胞可自個體收集或自該cDNA之單細胞選殖收集或可能在試管內經免疫)。見例如Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77,1985；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1)：86-95,1991及美國專利第5,750,373號。
用語「嵌合抗體」係用來指其中之可變區序列係源自一物種且恆定區序列係源自另一物種之抗體，諸如其中該可變區序列係源自小鼠抗體且該恆定區序列係源自人抗體之抗體。
用語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在此 處可交換使用以指稱任何長度之胺基酸鏈，較佳地相對短(例如10至100個胺基酸)之胺基酸鏈。該鏈可為線性或分支，其可能包含經修飾之胺基酸及/或可能被非胺基酸中斷。該等用語亦包含經天然或人為干預修飾之胺基酸鏈；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記成份共軛。該定義亦包括例如包含一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及該領域習知之其他修飾之多肽。應了解的是該多肽可以單鏈或相連之鏈存在。
「單價抗體」之每分子包含一個抗原結合部位(例如IgG或Fab)。在一些情況中，單價抗體可具有超過一個抗原結合部位，但該等結合部位係源自不同抗原。
「雙價抗體」之每分子包含二個抗原結合部位(例如IgG)。在一些情況中，該二個結合部位具有相同之抗原專一性。然而，雙價抗體可為雙專一性。
「雙專一性」、「雙重專一性」或「雙功能性」抗體係具有二個不同的抗原結合部位之雜交抗體。雙專一性抗體之二個抗原結合部位與二個不同的表位結合，該等表位可能位於相同或不同的蛋白質標靶上。
本發明之抗體可利用該領域廣為周知之技術製備，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術之組合、或該領域已知之其他技術(見例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50,1999及Fellouse,F.A.,et al,J.Mol.Biol.,373(4)：924-40,2007)。
如該領域所知之「多核苷酸」或「核酸」在此處可交換使用，其係指任何長度之核苷酸之鏈，包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被納入鏈中之底物。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及彼等之類似物。若存在的話，對核苷酸結構之修飾可在該鏈組合之前或之後進行。核苷酸之序列可被非核苷酸成份中斷。多核苷酸在聚合之後可進一步被修飾，諸如與標記成份共軛。其它類型之修飾包括例如「加蓋(caps)」、以類似物取代一或多個天然發生之核苷酸、核苷酸間修飾諸如舉例來說該些具有不帶電鍵結(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸醯胺化物、胺基甲酸酯等)及帶電鍵結(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、該些含有側基團者，諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚離胺酸等)、該些具有嵌入劑(intercalator)者(例如吖啶、補骨脂素等)、該些含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、該些含有烷化劑者、該些具有經修飾之鍵結者(例如α異位性核酸等)以及未經修飾之多核苷酸形式。另外，任何通常存在於糖類中之羥基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被標準保護基保護或被活化以製備與其他核苷酸之額外鍵結，或可能與固體支持物共軛。該5’及3’端OH可被磷酸化或被胺類或自1至20個碳原子之有機加蓋基團取代。其他羥基亦可被衍生成為標準保護基。多核苷酸亦可 包含該領域通常已知之核糖或去氧核糖糖類之類似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟代-核糖、2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α或β異位性糖類、差向異構體糖類諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖糖類、呋喃糖糖類、景天酮庚糖、非環類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵結可被替代性連接基團取代。該些替代性連接基團包括但不限於其中磷酸鹽被P(O)S(「硫代鹽」)、P(S)S(「二硫代鹽」)、(O)NR2 (「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2 (「甲縮醛」)取代之實施態樣，其中各R或R’係獨立地H或經取代或未經取代之烷基(1至20個碳)，該烷基可選擇地含有醚(-O-)鍵結、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。多核苷酸中之所有鍵結不需要完全相同。前面的敘述適用於此處提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
該技藝中所謂之抗體之「恆定區」係指單獨或經組合之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
此處所使用之「實質上純的」係指其為至少50%純的(也就是不含污染物)，更佳地至少90%純的，更佳地至少95%純的，甚至更佳地至少98%純的，且最佳地至少99%純的物質。
「宿主細胞」包括可以或已經接受載體以導入多核苷酸插入物之個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且該後代可能因為天然、意外或蓄意突變而不一定與原始親代細胞完全相同(在形態學或基因學 DNA互補性上)。宿主細胞包括經本發明之多核苷酸在體內轉染之細胞。
如該領域所知，用語「Fc區」係用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域。該「Fc區」可能為天然序列Fc區或變異體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能不同，人IgG重鏈Fc區通常被定義為從Cys226處之胺基酸殘基或從Pro230延伸至彼之羧基端。Fc區中之殘基編號係如卡巴(Kabat)所述之EU指數。Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991.免疫球蛋白之Fc區通常包含兩個恆定區CH2及CH3。
該領域所使用之「Fc受體」或「FcR」描述與抗體之Fc區結合之受體。較佳之FcR係天然序列人FcR。另外，較佳之FcR係與IgG抗體結合之受體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞型之受體，包括等位基因變異體及可選擇之該等受體之剪切形式。FCγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，彼等具有類似之胺基酸序列但主要差異在於細胞質結構域。FcR係於Ravetch and Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92,1991；Capel et al.,Immunomethods,4：25-34,1994及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41,1995中回顧。FcR亦包括新生兒受體FcRn，該受體負責轉運母體IgG至胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.,117：587,1976及 Kim et al.,J.Immunol.,24：249,1994)。
此處關於抗體所使用之用語「競爭」係指第一抗體或彼之抗原結合片段(或部份)與表位結合之方式充份類似於第二抗體或彼之抗原結合部份之結合，使得第一抗體與彼之同源表位在第二抗體存在時之結合結果呈可偵測地降低，相較於第二抗體不存在時該第一抗體與彼之同源表位之結合。或者，該情況可為但不一定是該第二抗體與彼之表位之結合亦因第一抗體之存在而可偵測地降低。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與彼之表位之結合，但第二抗體不抑制該第一抗體與彼之個別表位之結合。然而，當各種抗體不論以相同、較高或較低程度可偵測地抑制另一抗體與彼之同源表位或配體結合時，該等抗體被稱為彼此「交叉競爭」與彼等個別表位之結合。本發明包含競爭抗體及交叉競爭抗體。不論該競爭或交叉競爭所藉以發生之機轉為何(例如空間位阻、構形變化或與共同表位或彼之部分結合)，技藝人士將了解根據此處所提供之揭示，本發明包含競爭及/或交叉競爭抗體且彼等可被用於此處所揭示之方法。
「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之至少一種效應功能。示範性「效應功能」包括C1q結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性、吞噬作用、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)等。該等效應功能通常需要Fc區與結合結構域(例如抗體可變結構域)結合且可利用該領域已知之各種用於評估該等抗體效應功 能之測定檢測。
「天然序列Fc區」包含與在天然中發現之Fc區的胺基酸序列完全相同之胺基酸序列。「變異體Fc區」包含與天然序列Fc區有至少一個胺基酸修飾之差異的胺基酸序列，但仍保留該天然序列Fc區之至少一種效應功能。在一些實施態樣中，該變異體Fc區相較於天然序列Fc區或親代多肽之Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中自約1至約10個胺基酸取代，且較佳地自約1至約5個胺基酸取代。此處之變異體Fc區將較佳地具有與天然序列Fc區及/或與親代多肽之Fc區至少約80%之序列一致性，最佳地具有至少約90%之序列一致性，更佳地具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%之序列一致性。
用語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之生物活性。抗體效應功能之實例包括但不限於抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、Fc受體結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q結合及下調細胞表面受體(例如B細胞受體(BCR))。見例如美國專利第6,737,056號。該等效應功能通常需要Fc區與結合結構域(例如抗體可變結構域)結合且可利用該領域已知之各種用於評估該等抗體效應功能之測定檢測。示範性效應功能檢測係經由Fcγ3及/或C1q結合。
此處所使用之「抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性」或「 ADCC」係指細胞媒介性反應，其中表現Fc受體(FcR)之非專一性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、適中性球及巨噬細胞)辨識標靶細胞上之結合抗體，因此造成該標靶細胞溶解。感興趣分子之ADCC活性可利用試管內ADCC試驗檢測，諸如美國專利第5,500,362或5,821,337號中所述者。可用於該試驗之效應細胞包括週邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。選擇性地或另外地，感興趣分子之ADCC活性可於活體內例如動物模型中評估，諸如Clynes et al.,1998,PNAS(USA),95：652-656中所揭示者。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在時溶解標靶。該補體活化途徑係由補體系統之第一補體(C1q)與和同源抗原複合之分子(例如抗體)結合所啟動。為了評估補體活化，可進行例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述之CDC檢測。
此處所使用之「治療」係指得到有益或所欲臨床結果之方法。以本發明之目的而言，有益或所欲之臨床結果包括但不限於下列一或多項：減少(或摧毀)腫瘤或癌細胞之增生、抑制腫瘤細胞轉移、縮小或減少Trop-2表現腫瘤之體積、緩解Trop-2相關性疾病(例如癌)、減少Trop-2相關性疾病(例如癌)所導致之症狀、提高罹患Trop-2相關性疾病(例如癌)之病患的生活品質、減少治療Trop-2相關性疾病(例如癌)所需之其他藥物之劑量、延緩Trop-2相關性疾病(例如癌)之進展、治癒Trop-2相關性疾病(例如癌) 及/或延長罹患Trop-2相關性疾病(例如癌)之病患的存活。
「改善」係指相較於未投予Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物，減輕或改善一或多種症狀。「改善」亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
此處所使用之藥物、化合物或醫藥組成物之「有效劑量」或「有效量」係指足以影響任一或多種有益或所欲結果之量。就預防性用途而言，有益或所欲結果包括消除或減少風險、減輕嚴重性或延遲疾病之開始，包括疾病之生化學、組織學及/或行為學之症狀、彼之併發症及在疾病發展期間所表現之中間病理學表型。就治療性用途而言，有益或所欲結果包括諸如減少一或多種Trop-2相關性疾病或症狀(諸如胃癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌及胰癌)之發生率、改善一或多種Trop-2相關性疾病或症狀(諸如胃癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌及胰癌)、降低治療該疾病所需之其他藥物之劑量、提高其他藥物之效應及/或延緩病患之Trop-2相關性疾病進程之臨床結果。有效劑量可分一或多次投予。就本發明之目的而言，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量係足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如在臨床上所了解的，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量可能與或可能不與另一藥物、化合物或醫藥組成物組合達到。因此，「有效劑量」可在投予一或多種治療劑之情況中被考慮，且可考慮給予有效量之單一劑，若與一或多種其他劑組合時可能或係經達成所欲之結果。
「個體」或「對象」係哺乳動物，更佳者係人。哺乳動物亦包括但不限於農場動物、競賽動物、寵物、靈長動物、馬、犬、貓、小鼠及大鼠。
此處所使用之「載體」係指建構物，其能在宿主細胞中遞送及較佳地表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞諸如生產細胞。
此處使用之「表現控制序列」係引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子或增強子。表現控制序列係可操作地與所欲轉錄之核酸序列連接。
此處所使用之「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何當與活性成分組合時能使該成分保留生物活性且不與個體之免疫系統反應之任何物質。實例包括但不限於任何標準醫藥載劑諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液諸如油/水乳液及各種類型之潤濕劑。較佳之用於氣霧劑或非經腸投予之稀釋劑係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含該等載劑之組成物係由眾所周知之習知方法調製(見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990及Remington,The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.Mack Publishing,2005)。
此處所使用之用語「含有麩胺醯胺之醯基供體標籤」或「麩胺醯胺標籤」係指含有一或多個麩胺醯胺(Gln)殘基之多肽或蛋白質，其係作為轉麩醯胺酶胺受體。見例如WO2012059882。
此處所使用之用語「kon 」係指抗體與抗原結合之速率常數。特別地，該等速率常數(kon 及koff )及平衡解離常數係利用Fab抗體片段(即單價)與Trop-2蛋白(例如Trop-2-Fc融合蛋白)測量。
此處所使用之用語「Koff 」係指抗體自抗體/抗原複合物解離之速率常數。
此處所使用之用語「KD 」係指抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
在此處提及「約」某數值或參數時，包括(且描述)與該數值或參數本身相關之實施態樣。舉例來說，提及「約X」之用語包括「X」之用語。數值範圍包含界定該範圍之數值。
應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語「包含」描述，其亦提供其他以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。
本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西群組或其他選擇性形式之群組描述，本發明不僅包含被標示為整體之整個群組，但亦包含該群組之個別成員及該主要群組中所有可能之亞群，且亦包含不含其中一或多個群組成員之主要群 組。本發明亦設想明確排除該申請專利之發明中任何群組成員之一或多者。
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語和本發明所屬領域之一般技藝人士所通常瞭解之意義相同。若發生衝突，以本說明書(包括定義)為主。在本說明書及申請專利範圍中，用語「包含(comprise)」或變化諸如「包括(comprises)」或「含有(comprising)」將被理解為意指包括被敘述之整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群。除非上下文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。
示範性方法及材料係於此處敘述，不過與此處所述之方法及材料類似或相等者亦可被用於實施或檢測本發明。該等材料、方法及實施例僅用來示例而非意圖限制。
Trop-2抗體及製備彼之方法
本發明提供與Trop-2結合之抗體。在一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其藉由表面電漿共振所測量之6.5 nM或小於6.5 nM之單價抗體結合親和性(KD )與人Trop-2(例如SEQ ID NO：27)之結構域3(例如胺基酸殘基153至206)及結構域4(例如胺基酸殘基209至274)專一性結合。在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其藉由表面電漿共振所測量之約35 nM或小於35 nM之結合親和性(KD )與人Trop-2(例如SEQ ID NO：27)之結構域1(例如胺基酸殘 基27至70)專一性結合。
本發明之抗體及抗體共軛物具有下列任一項或多項之特徵：(a)與Trop-2結合；(b)減少或下調Trop-2蛋白之表現；(c)治療、預防、改善個體之一或多種與Trop-2表現有關之疾病(例如癌，像是胃癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌或胰癌)的症狀；(d)抑制個體(其患有Trop-2表現腫瘤之之腫瘤生長或惡化；(e)抑制個體(其患有一或多種Trop-2表現癌細胞)之Trop-2表現癌細胞之轉移；(f)誘導Trop-2表現腫瘤之緩解(例如長期緩解)；(g)展現對Trop-2表現細胞之細胞毒性活性；(h)去活或下調ERK1/2 MAPK途徑；及(i)阻斷Trop-2與其他尚未被識別之因子的交互作用。
本發明所使用之抗體可包含單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙專一性抗體、異源共軛抗體、單鏈抗體(ScFv)、彼等之突變物、包含抗體部位之融合蛋白(例如結構域抗體)、人化抗體及任何其他含有該所需專一性之抗原辨認區的免疫球蛋白分子之經修飾之構型，包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及經共價修飾之抗體。該抗體可為小鼠、大鼠、人或任何其他來源(包括嵌合或人化抗體)。
在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體係單株抗體。舉例來說，該Trop-2抗體係人化單株抗體或嵌合性單株抗體。
在一些實施態樣中，該抗體包含經修飾之恆定區，諸如但不限於具有增加之引發免疫反應潛力之恆定區。舉例來說，該恆定區可經修飾為對Fcγ受體(例如FcγRI、FcγRIIA或FcγIII)具有增加之親和性。
在一些實施態樣中，該抗體包含經修飾之恆定區，諸如免疫惰性即具有減少之引發免疫反應潛力之恆定區。在一些實施態樣中，該恆定區係經如Eur.J.Immunol.,29：2613-2624,1999；PCT申請案PCT/GB99/01441及/或英國專利申請案98099518所述之修飾。該Fc可為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。該Fc可為含有突變A330P331至S330S331(IgG2△a)之人IgG2，其中該胺基酸殘基係參考野生型IgG2序列編號。Eur.J.Immunol.,29：2613-2624,1999。在一些實施態樣中，該抗體包含IgG4 之恆定區，該恆定區包含下列突變(Armour et al.,Molecular Immunology 40 585-593,2003)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4△c)，其中的編號係參考野生型IgG4。在另一實施態樣中，該Fc係人IgG4 E233F234L235至P233V234A235並刪除G236(IgG4△b)。在另一實施態樣中，該Fc係包含絞鏈穩定突變S228至P228之任何人IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)(Aalberse et al.,Immunology 105,9-19,2002)。在另一實施態樣中，該Fc可為非糖基化Fc。
在一些實施態樣中，該恆定區係藉由使該寡醣連接殘基(諸如Asn297)及/或該恆定區中屬於糖基化辨認序列之 部份的側翼殘基突變而去糖基化。在一些實施態樣中，該恆定區之N-連接糖基化係經酵素去糖基化。該恆定區之N-連接糖基化可經酵素去糖基化或藉由在糖基化缺陷之宿主細胞中表現以去糖基化。
測定抗體與Trop-2之結合親和性的一個方法係藉由測量該抗體之單功能性Fab片段的結合親和性。為了得到單功能性Fab片段，抗體(例如IgG)可經木瓜酶剪切或經重組表現。抗體之Trop-2 Fab片段的親和性可藉由表面電漿共振(BiacoreTM 3000TM 表面電漿共振(SPR)系統，紐澤西州皮斯卡塔維BiacoreTM 公司)測定，該系統裝設預先固定之鏈黴抗生物素蛋白感測晶片(SA)或抗小鼠Fc或抗人Fc，使用HBS-EP流動緩衝液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 NaCl，3 mM EDTA，0.005%體積/體積界面活性劑P20)。經生物素基化或Fc融合之人Trop-2可經HBS-EP緩衝液稀釋至濃度低於0.5微克/毫升，並利用不同的接觸時間注射經過各別晶片通道以達到兩種抗原密度範圍，即用於詳細動力學試驗之50至200反應單位(RU)或用於篩選測定之800至-1,000 RU。再生試驗顯示含25毫莫耳NaOH之25體積%乙醇有效地移除經結合之Fab，同時保持晶片上之Trop-2之活性以供超過200次注射。通常，經純化之Fab樣本的連續稀釋液(濃度自0.1至10倍之預估KD 濃度)係以100 μL/分鐘注射1分鐘，並允許最高2小時之解離時間。該Fab蛋白之濃度係藉由ELISA及/或SDS-PAGE電泳測定，並使用已知濃度(以胺基酸分析測 定)之Fab作為標準物。動力學結合速率(kon )及解離速率(koff )係同時獲得，藉由將資料完整帶入1：1蘭繆爾(Langmuir)結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994),Methods Enzymology 6,99-110)並使用BIAevaluation軟體。平衡解離常數(KD )數值係以koff /kon 計算。此方法適合用於測定抗體與任何Trop-2之結合親和性，包括人Trop-2、另一哺乳動物之Trop-2(諸如小鼠Trop-2、大鼠Trop-2或靈長動物Trop-2)以及不同形式之Trop-2(例如糖基化Trop-2)。抗體之結合親和性通常在25℃測量，但亦可在37℃測量。
此處所述之Trop-2抗體可由該領域中習知之任何方法製備。就雜交瘤細胞系之產製而言，免疫接種宿主動物之途徑及時程通常與已建立及習知之抗體刺激及產製技術一致，如此處進一步描述。用於產製人及小鼠抗體之通用技術係該領域已知及/或係於此處描述。
應考慮任何哺乳動物個體包括人或源自該個體之抗體產製細胞可經操縱以作為產製哺乳動物(包括人)雜交瘤細胞系之基礎。通常，該宿主動物係經腹膜內、肌肉內、經口、皮下、腳掌內及/或皮內接種一定量之免疫原，包括如此處所述。
雜交瘤可自淋巴細胞及永生化之骨髓瘤細胞製備，其使用Kohler,B.and Milstein,C.,Nature 256：495-497,1975之常規體細胞雜交技術或由Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18：377-381,1982所改良之技術。可用之骨髓瘤細 胞系(包括但不限於X63-Ag8.653及該些來自美國加州聖地牙哥沙克研究所細胞分布中心(Salk Institute,Cell Distribution Center)之細胞)可被用於雜交。通常，該技術涉及使用促融劑諸如聚乙二醇或藉由該領域之技藝人士眾所周知之電裝置使骨髓瘤細胞與淋巴樣細胞融合。在融合後，使該等細胞自融合培養基中分離並於選擇性生長培養基諸如次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)培養基中生長以消除未雜交之親代細胞。任何此處所描述之培養基不論有無添加血清皆可被用於培養分泌單株抗體之雜交瘤。在細胞融合技術之另一替代技術中，EBV永生化B細胞可被用於產製本發明之Trop-2單株抗體。需要時該等雜交瘤係經擴增及次選殖，上清液之抗免疫原活性藉由習知之免疫測定方法(例如放射性免疫測定、酵素免疫測定或螢光免疫測定)檢測。
可被用來作為抗體來源之雜交瘤包含所有衍生物、該產製對Trop-2具專一性之單株抗體之親代雜交瘤的子細胞或彼等之部分。
產製該等抗體之雜交瘤可利用已知方法在試管內或體內生長。該等單株抗體可藉由習知之免疫球蛋白純化方法自培養基或體液中分離，諸如硫酸銨沉澱、膠體電泳、透析、色層分析及若需要之超過濾。非所欲之活性(若有的話)可被移除，例如藉由使該製劑通過由免疫原連接固相所製成之吸附物，然後自該免疫原洗脫或釋放該所欲之抗體。以和蛋白質共軛之人Trop-2或含有該標靶胺基酸序 列之片段免疫接種宿主動物可產生抗體族群(例如單株抗體)，該蛋白質對所欲免疫接種之物種具免疫原性，例如鑰孔狀帽貝血藍素、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，該共軛係利用雙功能劑或衍生劑進行，例如順丁烯二亞胺基苯甲醯基磺酸基琥珀醯亞胺基酯(經由半胱胺酸殘基共軛)、N-羥琥珀二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2 或R1 N=C=NR，其中R和R1 係不同的烷基)。
需要時可對該感興趣之Trop-2抗體(單株或多株)定序，接著該多核苷酸序列可被選殖至載體以供表現或增殖。編碼該感興趣之抗體的序列可被維持於宿主細胞中之載體，接著該宿主細胞可被擴增及冷凍以供將來使用。在細胞培養中產製重組單株抗體可透過該領域已知之方法自B細胞選殖抗體基因加以進行。見例如Tiller et al.,J.Immunol.Methods 329,112,2008及美國專利第7,314,622號。
在替代態樣中，該多核苷酸序列可能被用於基因操縱以「人化」該抗體或改善該抗體之親和性或其他特徵。舉例來說，該恆定區可經工程化(engineered)以更類似於人之恆定區，避免該抗體用於人之臨床試驗及治療時之免疫反應。基因操縱該抗體序列以獲得針對Trop-2之較高親和性及抑制Trop-2之較高療效係為所欲。
人化單株抗體有四個常規步驟，包括：(1)測定起始抗體之輕鏈及重鏈可變結構域之核苷酸序列及預測之胺基酸 序列，(2)設計該人化抗體，即決定在人化過程中將使用哪一個抗體架構區，(3)實際人化方法/技術，及(4)轉染及表現該人化抗體。見例如美國專利第4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089及6,180,370號。
一些包含源自非人免疫球蛋白之抗原結合部位的「人化」抗體分子已被描述，包括具有齧齒動物V區或經修飾之齧齒動物V區且彼等之相關CDR與人恆定區融合之嵌合抗體。見例如Winter et al.Nature 349：293-299,1991、Lobuglio et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224,1989、Shaw et al.J Immunol.138：4534-4538,1987及Brown et al.Cancer Res.47：3577-3583,1987。其它參考文獻描述將齧齒動物之CDR移植至人支持性架構區(FR)，然後再與適當之人抗體恆定區融合。見例如Riechmann et al.Nature 332：323-327,1988、Verhoeyen et al.Science 239：1534-1536,1988及Jones et al.Nature 321：522-525,1986。另一參考文獻描述齧齒動物之CDR係由經重組工程化之齧齒動物架構區所支持。見例如歐洲專利公開號0519596。該些「人化」分子係經設計以最小化非所欲之針對齧齒動物抗人抗體分子之免疫反應，以免限制該些分子在人接受者之治療應用的持續期及有效性。舉例來說，該抗體恆定區可經工程化以使其呈免疫惰性(例如不會誘發補體溶解)。見例如PCT公開號PCT/GB99/01441及英國專利申請號9809951.8。其他也可 能被用來人化抗體之方法係由下列文獻揭示：Daugherty et al.,Nucl.Acids Res.19：2471-2476,1991、美國專利第6,180,377、6,054,297、5,997,867、5,866,692、6,210,671及6,350,861號及PCT公開號WO 01/27160。
上述有關人化抗體之通用原則亦適用於客製化用於例如犬、貓、靈長動物、馬或牛之抗體。另外，此處所述之人化抗體之一或多個態樣可被組合，例如CDR移植、架構突變及CDR突變。
在一變異態樣中，全人抗體可藉由使用自商業途徑獲得之小鼠得到，該小鼠已經工程化處理以表現特定人免疫球蛋白。經設計以產生更為所欲(例如全人抗體)或更強烈之免疫反應的基因轉殖動物亦可被用於產製人化抗體或人抗體。該技術之實例係艾比基因(Abgenix)公司(加州費利蒙市(Fremont,CA))之XenomouseTM 及美德列斯(Medarex)公司(紐澤西州普林斯頓)之HuMAb-Mouse®及TC MouseTM 。
在選擇性態樣中，抗體可利用該領域已知之任何方法重組製備及表現。在另一選擇性態樣中，抗體可藉由噬菌體展示技術重組製備。見例如美國專利第5,565,332、5,580,717、5,733,743及6,265,150號及Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12：433-455,1994。或者，噬菌體展示技術(McCafferty et al.,Nature 348：552-553,1990)可被用於自未經免疫接種之捐贈者的免疫球蛋白可變(V)結構域基因庫試管內 產製人抗體及抗體片段。根據此項技術， 抗體V結構域基因被符合讀框地選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要外套蛋白基因中，且以功能性抗體片段被展示於該噬菌體顆粒之表面。由於該絲狀顆粒包含該噬菌體基因組之單股DNA拷貝，因此根據該抗體之功能特性所進行之篩選亦導致選擇展現該等特性之抗體的編碼基因。因此，該噬菌體模擬B細胞之若干特性。噬菌體展示可以各種形式進行；回顧文獻見例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571,1993。不同來源之V基因區段可被用於噬菌體展示。Clackson et al.,Nature 352：624-628,1991自V基因之小型隨機組合庫分離出多種抗噁唑啉酮抗體，該等V基因係源自經免疫接種之小鼠的脾臟。源自未經免疫接種之人捐贈者的V基因庫可被建構，並依照Mark et al.,J.Mol.Biol.222：581-597,1991或Griffith et al.,EMBO J.12：725-734,1993所述之技術實質上分離針對各類抗原(包括自體抗原)之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因高比例地累積突變(體細胞超突變)。若干被導入之改變將授予更高之親和性，且展示高親和性表面免疫球蛋白之B細胞在後續抗原攻擊時將被優先複製及分化。此天然過程可藉由採用被稱為「鏈洗牌(chain shuffling)」之技術模擬。(Marks et al.,Bio/Technol.10：779-783,1992)。在此方法中，藉由噬菌體展示獲得之「初級」人抗體的親和性，可藉由以得自未經免疫接種之捐贈者的天然發生之V區基因變異體庫依序取代該重鏈及 輕鏈之V區基因加以改善。此技術能產製親和性介於pM至nM之抗體及抗體片段。製備非常大型之噬菌體抗體庫(亦稱為「萬眾之母庫(the mother-of-all libraries)」)之策略已由Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.21：2265-2266,1993描述。基因替換亦可被用於自鼠抗體衍生人抗體，其中該人抗體具有與該起始鼠抗體類似之親和性及專一性。根據此方法(其又名「表位印記」)，藉由噬菌體展示技術得到之鼠抗體的重鏈或輕鏈V區基因被人V區基因庫取代，因此產生鼠-人嵌合抗體。利用抗原篩選導致分離出能恢復功能性抗原結合部位即負責(印記)選擇結合伴之表位之人可變區。重複該方法以取代剩餘之鼠V區可得到人抗體(見PCT公開號WO 93/06213)。和慣用之藉由CDR移植以人化鼠抗體不同的是，此技術提供全人抗體，其不具鼠來源之架構殘基或CDR殘基。
抗體可被重組製備，首先自宿主動物分離抗體及抗體產製細胞，接著取得基因序列，然後使用該基因序列以於宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表現該抗體。另一可被採用之方法係於植物(例如菸草)或基因轉殖乳中表現該抗體序列。於植物或乳中重組表現抗體之方法已被揭示。見例如Peeters,et al.Vaccine 19：2756,2001；Lonberg,N.and D.Huszar,Int.Rev.Immunol 13：65,1995及Pollock,et al.,J Immunol Methods 231：147,1999。用於製備抗體衍生物之方法例如人化、單鏈等係為該領域所知。
免疫測定及流式細胞分選技術諸如螢光激活細胞分選 (FACS)亦可被用來分離對Trop-2具專一性之抗體。
此處描述之抗體可與許多不同之載劑結合。載劑可為活性及/或惰性。廣為週知之載劑實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉酶、玻璃、天然纖維素、經改質之纖維素、聚丙醯胺、洋菜糖及磁鐵礦。該載劑之性質就本發明之目的而言可為可溶性或不可溶性。該領域之技藝人士知道其他用於結合抗體之適當載劑，或可利用例行實驗加以確認。在一些實施態樣中，該載劑包含針對心肌之基團。
編碼單株抗體之DNA可利用習知方法輕易地分離及定序(例如藉由使用能與編碼該等單株抗體之重鏈及輕鏈之基因專一性結合之寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞係該等DNA之較佳來源。一經分離後，該等DNA可被置入表現載體中(諸如PCT公開號WO 87/04462所揭示之表現載體)，該等表現載體接著被轉染至原本不產製免疫球蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在該等重組宿主細胞中獲得經合成之單株抗體。見例如PCT公開號WO 87/04462。該等DNA亦可經修飾，例如藉由以人重鏈及輕鏈恆定區之編碼序列取代同源鼠序列(Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)，或藉由共價連接免疫球蛋白編碼序列與所有或部分之非免疫球蛋白多肽之編碼序列。如此，可製備具有此處所述之Trop-2單株抗體之結合專一性之「嵌合」或「雜交」抗體。
此處所述之Trop-2抗體可利用該領域已知之方法識別或特徵化，藉此可檢測及/或測量Trop-2表現量之減少。在一些實施態樣中，Trop-2抗體係藉由培養候選劑與Trop-2並監測結合狀況及/或隨之而來之Trop-2表現量減少加以識別。該結合測定可利用經純化之Trop-2多肽進行，或利用天然表現或經轉染以表現Trop-2多肽之細胞進行。在一實施態樣中，該結合測定係競爭性結合測定，其中候選抗體與已知之Trop-2抗體競爭與Trop-2結合之能力係經評估。該測定可以不同形式進行，包括ELISA形式。
在初步識別之後，候選Trop-2抗體之活性可藉由生物測定進一步證實及定義，該等生物測定已知可用於測試標靶生物活性。或者，生物測定可被用來直接篩選候選物。若干用於識別及特徵化Trop-2抗體之方法係於實施例中詳細描述。
Trop-2抗體可利用該領域眾所周知之方法加以特徵化。舉例來說，一種方法係識別其所結合之表位，或稱「表位定位」。該領域有許多已知之用於定位及特徵化蛋白質上表位的位置之方法，包括拆開抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭測定、基因片段表現測定及合成性肽基底測定，例如於Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章所述。在另一實例中，表位定位可被用於測定Trop-2抗體所結合之 序列。表位定位可自不同之商業來源獲得，例如Pepscan系統(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。該表位可為線性表位(即包含於單一胺基酸片段中)，或藉由不一定包含在單一片段中之胺基酸的三維交互作用所形成之構型表位。各種長度之肽(例如至少4至6個胺基酸長)可經分離或合成(例如重組合成)，以用於Trop-2抗體之結合測定。在另一實例中，Trop-2抗體所結合之表位可利用系統化篩選測定，使用源自Trop-2序列之重疊肽並測定Trop-2抗體之結合。根據基因片段表現測定，編碼Trop-2之開放閱讀框係經隨機分段或按特定基因建構體分段，且Trop-2之該表現片段與所欲測試之抗體之反應性係經測定。該基因片段可能舉例來說藉由PCR產製，接著於試管內在放射性胺基酸存在時被轉錄及轉譯成蛋白質。該抗體與該經放射性標記之Trop-2片段之結合接著藉由免疫沉澱及膠體電泳測定。某些表位亦可藉由使用噬菌體顆粒表面所展示之隨機肽序列的大型庫(噬菌體庫)加以識別。或者，可於簡單結合測定中測試經定義之重疊肽片段庫與該檢測抗體之結合。在另一實施例中，可進行抗原結合結構域之突變形成、結構域交換實驗及丙胺酸篩選突變形成以識別表位結合所需、足夠及/或必要之殘基。舉例來說，結構域交換實驗可利用突變Trop-2進行，其中該Trop-2蛋白之各種片段已被來自其他物種(例如小鼠)之Trop-2的序列或密切相關但抗原性不同之蛋白(例如Trop-1)取代(交換)。藉由檢測該抗體與該突變Trop-2之結合 力，可評估特定Trop-2片段對抗體結合之重要性。
另一可用於特徵化Trop-2抗體之方法係使用已知和相同抗原(即Trop-2之各種片段)結合之其他抗體的競爭試驗，以測定該Trop-2抗體是否和其他抗體一樣與相同之表位結合。競爭試驗為該領域之技藝人士所廣為週知。
表現載體可被用於直接表現Trop-2抗體。該領域之技藝人士通曉投予表現載體以於體內獲得外源性蛋白之表現。見例如美國專利第6,436,908、6,413,942及6,376,471號。表現載體之投予包括局部或系統性投予，包括注射、經口投予、粒子槍或經導管投予及局部投予。在另一實施態樣中，該表現載體係直接投予至交感神經幹或神經節，或投予至冠狀動脈、心房、心室或心包膜中。
靶向性遞送含有表現載體或次基因組多核苷酸之治療性組成物亦可被使用。受體媒介性DNA遞送技術係描述於例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.,1993,11：202、Chiou et al.,Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994、Wu et al.,J.Biol.Chem.,263：621,1988、Wu et al.,J.Biol.Chem.,269：542,1994、Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：3655,1990及Wu et al.,J.Biol.Chem.,266：338,1991。含有多核苷酸之治療性組成物係以約100奈克至約200毫克之DNA範圍投予以供基因治療計畫中之局部投予。約500 ng至約50 mg、約1 μg至約2 mg、約5 μg至約500 μg及約20 μg至約100 μg之DNA 濃度範圍亦可被用於基因治療計畫。治療性多核苷酸及多肽可利用基因遞送載具遞送。該基因遞送載具可為病毒性或非病毒性來源(通常參考Jolly,Cancer Gene Therapy 1：51,1994；Kimura,Human Gene Therapy 5：845,1994；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185及Kaplitt,Nature Genetics 6：148,1994)。該等編碼序列之表現可利用內源性哺乳動物或異源性啟動子誘導。編碼序列之表現可為組成性或經調節的。
供遞送所欲之多核苷酸及在所欲細胞中表現之病毒基底載體係該領域所熟知。示範性病毒基底載具包括但不限於重組反轉錄病毒(見例如PCT公開號WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美國專利第5,219,740及4,777,127號、GB專利第2,200,651號及EP專利第0 345 242號)、阿爾法病毒基底載體(例如辛德比(Sindbis)病毒載體、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR 1249、ATCC VR-532))及腺病毒相關病毒(AAV)載體(見例如PCT公開號WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)。投予如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147所述之與死腺病毒連接之DNA亦可被 採用。
非病毒性遞送載具及方法亦可被採用，包括但不限於不論有無與單獨死腺病毒連接之經聚陽離子縮合之DNA(見例如Curiel,Hum.Gene Ther.,3：147,1992)、與配體連接之DNA(見例如Wu,J.Biol.Chem.,264：16985,1989)、真核細胞遞送載具細胞(見例如美國專利第5,814,482號、PCT公開號WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763及WO 97/42338)及核電荷中和或與細胞膜融合。裸DNA亦可被採用。示範性裸DNA導入方法係於PCT公開號WO 90/11092及美國專利第5,580,859號中描述。可被用來作為基因遞送載具之脂質體係描述於美國專利第5,422,120號、PCT公開號WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445及EP 0524968。其他方式係描述於Philip,Mol.Cell Biol.,14：2411,1994及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,91：1581,1994。
在一些實施態樣中，本發明包含組成物(包括醫藥組成物)，該組成物包含此處所述之抗體或藉由此處所述之方法產製且具有此處所述之特徵之抗體。此處所使用之組成物包含一或多種與Trop-2結合之抗體，及/或一或多種包含編碼一或多種該等抗體之序列的多核苷酸。該等組成物可能進一步包含適當之賦形劑，諸如醫藥上可接受之賦形劑，包括該領域眾所周知之緩衝劑。
因此，本發明提供下列任一者或包含下列任一者之組成物(包括醫藥組成物)：(a)具有下列之部分輕鏈序列之抗 體：a)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：3)、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSLYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKLEI K(SEQ ID NO：6)、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSNYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：7)、DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQTIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：8)、GVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTIGTSIHWYQQKPGQAPRLLIYYASESISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：10)或EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTIGTSIHWYQQKPGQAPRLLIYYASESISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSFSWPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：12)及/或(b)具有下列之部分重鏈序列之抗體： QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGSTDYNSALMSRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：2)、QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIWTGGSTDYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)、QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIWTSGVTDYNSALMGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)、QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGHGLEWIGNIYPSDSYSNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQVSSPTSEDSAVYYCTYGSSFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：9)、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPSDSYSNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：11)或QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIFPSDSYSNYNKKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：13)。
在表1中，劃底線之序列係根據卡巴之CDR序列，粗體之序列係根據柯西亞之序列。
本發明亦提供針對Trop-2之抗體的CDR部分(包括柯西亞CDR、卡巴CDR及CDR接觸區)。CDR區之測定係屬該領域所熟知之技藝。應了解在一些實施態樣中，CDR可為卡巴及柯西亞CDR之組合(亦稱為「組合CDR」或「延伸CDR」)。在一些實施態樣中，該CDR係卡巴CDR。在其他實施態樣中，該CDR係柯西亞CDR。換句話說，在具有超過一個CDR之實施態樣中，該CDR可為卡巴CDR、柯西亞CDR、組合CDR或彼等之組合中之任一者。表2提供此處所提供之CDR序列之實例。
在一些實施態樣中，本發明提供與Trop-2結合且與此處所述之抗體(諸如m7E6、h7E6、h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h7E6_SVGN、m6G11、h6G11或h6G11_FKG_SF)競爭之抗體。在一些實施態樣中，該抗體與抗體h7E6_SVG、h7E6_SVG4、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG22、h7E6_SVG28、h7E6_SVG30、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h7E6_SVGN或h6G11_FKG_SF競爭與Trop-2之結合。在一些實施態樣中，該抗體與抗體h7E6_SVG競爭與Trop2之結合，且具有藉由表面電漿 共振所測量之約下列任一者或小於約下列任一者之單價抗體結合親和性(KD )：6.5 nM、6.0 nM、5.5 nM、5.0 nM、4.5 nM、4.0 nM、3.5 nM、3.0 nM、2.5 nM、2.0 nM、1.5 nM、1.0 nM、0.5 nM或0.25 nM。在一些實施態樣中，該抗體與抗體h7E6競爭與Trop-2之結合，且具有約下列任一者或小於約下列任一者之單價抗體結合親和性(KD )：30 nM、25 nM、22 nM、20 nM、15 nM或10 nM。在一些實施態樣中，該競爭抗體不包含序列QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGSTDYNSALMSRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：2)之重鏈可變區及序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該競爭抗體不是抗體AR47A6.4.2、AR52A301.5、AR36A36.11.1、BR110或RS7。
在一些實施態樣中，本發明提供一種與Trop-2專一性結合之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含VH區及/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：5、84或85所示之序列，該VL區包含如SEQ ID NO：3所示之序列。在一些實施態樣中，該抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含序列DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQA EDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：66)，該重鏈包含序列QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIWTSGVTDYNSALMGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGDYDRYTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：65)。在一些實施態樣中，該抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含序列SEQ ID NO：66，該重鏈包含序列SEQ ID NO：101或102。
在一些實施態樣中，本發明提供一種與Trop-2專一性結合之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含VH區及/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：13所示之序列，該VL區包含如SEQ ID NO：12所示之序列。在一些實施態樣中，該抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTIGTSIHWYQQKPGQ APRLLIYYASESISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSFSWPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：68)，該重鏈包含序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIFPSDSYSNYNKKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：67)。
在一些實施態樣中，本發明亦提供根據CDR接觸區之針對Trop-2之抗體之CDR部分。CDR接觸區係給予該抗體對抗原之專一性的抗體之區。通常，CDR接觸區包括CDR中之殘基位置及游標區，該游標區係經限制以維持該抗體之適當圈環結構以與特定抗原結合。見例如Makabe et al.,J.Biol.Chem.,283：1156-1166,2007。CDR接觸區之測定係屬該領域所熟知之技藝。
此處所述之Trop-2抗體與Trop-2(諸如人Trop-2)之結合親和性(KD )可為約0.002至約200 nM。在一些實施態樣中，該結合親和性係約200 nM、約100 nM、約50 nM、約45 nM、約40 nM、約35 nM、約30 nM、約25 nM、約20 nM、約15 nM、約10 nM、約8 nM、約7.5 nM、約7 nM、約6.5 nM、約6 nM、約5.5 nM、約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM、約1 nM、約500 pM、約100 pM、約60 pM、約50 pM、約20 pM、約15 pM、約10 pM、約5 pM或約2 pM。在一些實施態樣中，該結合親和性係小於約250 nM、約200 nM、約100 nM、約50 nM、約30 nM、約20 nM、約10 nM、約7.5 nM、約7 nM、約6.5 nM、約6 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、約500 pM、約100 pM、約50 pM、約20 pM、約10 pM、約5 pM或約2 pM。
在一些實施態樣中，此處所述之抗體之結合親和性(例如單價抗體結合)係藉由表面電漿共振測量之約35 nM或小於35 nM。在一些實施態樣中，此處所述之抗體之結合親和性(例如單價抗體結合)係藉由表面電漿共振測量之約6.5 nM或小於6.5 nM。
本發明亦提供製備任何該等抗體之方法。本發明之抗體可利用該領域已知之方法製備。多肽可藉由抗體之蛋白水解或其他降解方式、藉由如上所述之重組方法(即單一或融合多肽)或藉由化學合成加以製備。該等抗體之多肽 特別是最多約50個胺基酸之較短多肽係方便地藉由化學合成製備。化學合成之方法係該領域所知且可自商業途徑獲得。舉例來說，抗體可藉由採用固相方法之自動多肽合成儀產製。亦見美國專利第5,807,715、4,816,567及6,331,415號。
在另一替代態樣中，該等抗體可利用該領域廣為週知之重組方法製備。在一實施態樣中，多核苷酸包含編碼下列抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之序列：m7E6、h7E6、h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h7E6_SVGN、m6G11、h6G11或h6G11_FKG_SF。編碼該感興趣之抗體的序列可被維持於宿主細胞之載體中，接著該宿主細胞可被擴增及冷凍以供將來使用。載體(包括表現載體)及宿主細胞另於此處說明。
本發明亦包含本發明之抗體的scFv。單鏈可變區片段 係藉由使用短連接肽連接輕鏈及/或重鏈可變區加以製備(Bird et al.,Science 242：423-426,1988)。一種連接肽之實例係(GGGGS)3 (SEQ ID NO：80)，其橋接一可變區之羧基端與另一可變區之胺基端之間約3.5 nm之距離。其它序列之連接子已被設計及使用(Bird et al.,1988，同上)。連接子應為短且可彎折之多肽，較佳地包含少於約20個胺基酸殘基。連接子亦可經修飾以得到額外功能，諸如與藥物連接或與固態支持物連接。該單鏈變異體可經重組或合成產製。就scFv之合成產製而言，可使用自動化合成儀。就scFv之重組產製而言，包含編碼該scFv之多核苷酸之適當質體可被導入適當之宿主細胞中，不論是真核細胞諸如酵母菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，抑或是原核細胞諸如大腸桿菌。編碼感興趣之scFv之多核苷酸可藉由例行操作加以製備，諸如接合多核苷酸。該形成之scFv可利用該領域已知之標準蛋白質純化技術分離。
其他形式之單鏈抗體諸如雙價抗體(diabodies)或迷你抗體(minibodies)亦包含於本發明中。雙價抗體係雙價、雙專一性之抗體，其中重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)係表現於單一多肽鏈上，但使用過短而使該同一鏈上之兩個結構域無法配對之連接子，藉此強迫該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合部位(見例如Holliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448,1993；Poljak,R.J.,et al.,Structure 2：1121-1123,1994)。迷你抗體包括與該免疫球蛋白分子之絞鏈區及 CH3區融合之天然抗體之VL及VH。見例如美國專利第5,837,821號。
舉例來說，雙專一性抗體(對至少兩種不同之抗原具有結合專一性之單株抗體)可利用此處所揭示之抗體製備。製備雙專一性抗體之方法係該領域所知(見例如Suresh et al.,Methods in Enzymology 121：210,1986)。傳統上，雙專一性抗體之重組產製係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該兩個重鏈具有不同之專一性(Millstein and Cuello,Nature 305,537-539,1983)。
根據一種製備雙專一性抗體之方法，具有所欲結合專一性之抗體可變區(抗體-抗原結合部位)係與免疫球蛋白恆定區序列融合。該融合較佳地係包含免疫球蛋白重鏈恆定區，包含至少部份之絞鏈區、CH2區及CH3區。較佳地是使第一重鏈恆定區(CH1)(其包含輕鏈結合所需之部位)存在於該等融合之至少一者。編碼免疫球蛋白重鏈融合及(若需要的話)免疫球蛋白輕鏈之DNA被插入分開之表現載體，並被共轉染至適當之宿主有機體。在使用不等比例之三個多肽鏈建構以提供最佳產量之實施態樣中，此提供調整三個多肽片段之相互比例的高度靈活性。然而，當以相等比例表現至少兩個多肽鏈導致高產量，或該比例不具特別顯著性時，有可能在一個表現載體中插入兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列。
在一態樣中，該雙專一性抗體係由一臂為具有第一結合專一性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂為雜交免疫球蛋 白重鏈-輕鏈對(提供第二結合專一性)所組成。此種免疫球蛋白輕鏈僅位於該雙專一性分子之一半的不對稱結構有利於自非所欲之免疫球蛋白鏈組合中分離該所欲之雙專一性化合物。此方法係描述於PCT公開號WO 94/04690。
在另一態樣中，該雙專一性抗體在一臂之第一絞鏈區中包含胺基酸修飾，且該第一絞鏈區中經取代/替代之胺基酸與另一臂之第二絞鏈區中之對應胺基酸帶有相反電荷。此方法係描述於國際專利申請案PCT/US2011/036419(WO2011/143545)。
在另一態樣中，該等雙專一性抗體可利用含有麩胺醯胺之肽標籤及另一肽標籤在轉麩醯胺酶存在時產製，該含有麩胺醯胺之肽標籤係經工程化至針對表位(例如Trop-2)之抗體的一臂，該另一肽標籤(例如含有Lys之肽標籤或反應性內源性Lys)係經工程化至針對第二表位之第二抗體的另一臂。此方法係描述於國際專利申請案PCT/IB2011/054899(WO2011/059882)。
包含兩個共價連接抗體之異源共軛抗體亦屬於本發明之範圍內。該等抗體被用於靶向免疫系統細胞至非所欲之細胞(美國專利第4,676,980號)及用於治療HIV感染(PCT公開號WO 91/00360及WO 92/200373及EP 03089)。異源共軛抗體可利用任何方便之交聯方法製備。適當之交聯劑及技術係該領域所廣為週知且描述於美國專利第4,676,980號。
嵌合或雜交抗體亦可利用已知之合成蛋白質化學方法 於試管內 製備，包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說，免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵加以建構。為達此目的之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
在重組人化抗體中，該Fcγ部分可經修飾以避免與Fcγ受體及與補體和免疫系統之交互作用。用於製備該等抗體之技術係於WO 99/58572中描述。舉例來說，該恆定區可經工程化以更類似於人之恆定區，避免該抗體用於人之臨床試驗及治療時之免疫反應。見例如美國專利第5,997,867及5,866,692號。
本發明包含對如表1所示之本發明之變異抗體及多肽之修飾，包括不會顯著影響彼等之性質之功能相等性抗體及具有增進或降低活性及/或親和性之變異體。舉例來說，該胺基酸序列可能經突變以獲得對Trop-2具有所欲結合親和性之抗體。多肽之修飾係該領域之例行操作，不須在此詳細說明。經修飾之多肽實例包括具有保守性取代之胺基酸殘基、具有一或多個不顯著有害地改變該功能活性之胺基酸刪除或添加、具有一或多個使該多肽對彼之配體之親和性成熟(增進)之胺基酸刪除或添加或使用化學類似物之多肽。
胺基酸序列插入包括長度介於一個殘基至包含一百或更多個殘基之多肽的胺基端及/或羧基端融合，也包括在序列內插入單一或多個胺基酸殘基。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與表位標籤融合之抗 體。抗體分子之其它插入變異體包括在抗體之N端或C端融合酵素或多肽以增加該抗體於血液循環中之半衰期。
取代變異體是使該抗體分子中之至少一個胺基酸殘基被移除且在該位置插入不同之殘基。最受到關注之取代性突變形成之位置包括超變異區，但亦可考慮FR之改變。保守性取代係顯示於表3中標題「保守性取代」之欄。若該等取代導致生物活性改變，則更顯著之改變(表3稱為「示範性取代」)或如下參照胺基酸分類進一步描述者可被導入，然後篩選該產物。
抗體之生物特性的顯著修飾係藉由選擇在維持下列特性之效果上有顯著差異之取代加以完成：(a)取代區之多肽骨架結構，例如摺板狀或螺旋構型，(b)目標部位之分子的帶電或疏水性，或(c)側鏈之主體。天然發生之胺基酸殘基根據常見之側鏈性質分成下列群組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)極性不帶電：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；(5)影響鏈方向性之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
非保守性取代係指以上述分類中之一個分類的成員交換另一分類之成員。
任何與維持抗體之適當構型無關之半胱胺酸殘基亦可被取代(通常以絲胺酸取代)，以增進該分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反地，半胱胺酸鍵可被加入抗體以增進抗體之穩定性，特別是當該抗體係抗體片段諸如Fv片段時。
胺基酸修飾可從改變或修飾一或多個胺基酸至完全重新設計一區諸如可變區。可變區之改變可改變結合親和性及/或專一性。在一些實施態樣中，在一個CDR內不具有超過一至五個保守性胺基酸取代。在其他實施態樣中，在一個CDR內不具有超過一至三個保守性胺基酸取代。在其他實施態樣中，該CDR區係CDR H3及/或CDR L3。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽，也包括具有其他轉譯後修飾之多肽，諸如舉例來說以不同之糖進行糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體係於彼等之恆定區中的保守位置經糖基化(Jefferis and Lund,Chem.Immunol.65：111-128,1997；Wright and Morrison,TibTECH 15：26-32,1997)。免疫球蛋白之寡糖側鏈影響該蛋白質之功能(Boyd et al.,Mol.Immunol.32：1311-1318,1996；Wittwe and Howard,Biochem.29：4175-4180,1990)及該糖蛋白之不同部分之間的分子內交互作用，其可影響該糖蛋白之構形及所呈現之三維表面(Jefferis and Lund,supra；Wyss and Wagner,Current Opin.Biotech.7：409-416,1996)。根據特定辨認結構，寡糖亦可被用來使給定糖蛋白瞄準某些分子。也有報告指出抗體之糖基化會影響抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。特別是，經四環素調節表現β(1,4)-N-乙醯葡萄胺基轉移酶III(GnTIII，一種催化形成平分型GlcNAc之糖基轉移酶)之CHO細胞被報告具有增強之ADCC活性(Umana et al.,Nature Biotech.17：176-180,1999)。
抗體之糖基化通常不是N-連接就是O-連接。N-連接係指碳水化合物基團連接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸、天冬醯胺酸-X-蘇胺酸及天冬醯胺酸-X-半胱胺酸係供碳水化合物基團與天冬醯胺酸側鏈酵素性連接之辨識序列，其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸。因此，多肽中有任何該等三肽序列之存在即產生 可能的糖基化位置。O-連接糖基化係指連接糖類N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一者與羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，不過5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸亦可被使用。
在抗體中加入糖基化位置可藉由改變胺基酸序列以使該序列包含一或多個上述之三肽序列(供N-連接糖基化位置)而方便地完成。該改變亦可藉由在原始抗體之序列加入或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基加以完成(供O-連接糖基化位置)。
抗體之糖基化模式亦可在不改變基礎核苷酸序列下加以改變。糖基化大多取決於用來表現該抗體之宿主細胞。由於用來表現重組糖蛋白(例如抗體)以作為潛在治療劑之細胞種類鮮少為天然細胞，因此抗體之糖基化模式的變化可被預期(見例如Hse et al.,J.Biol.Chem.272：9062-9070,1997)。
除了宿主細胞之選擇以外，在重組產製抗體期間可影響糖基化之因素包括生長模式、培養基配方、培養密度、氧化、pH、純化程序及該類似因素。多種方法已被提出以改變在特定宿主生物體中達成之糖基化模式，包括導入或過度表現與寡糖產製有關之某些酵素(美國專利第5,047,335、5,510,261及5,278,299號)。糖基化(或某些類型之糖基化)可藉由酵素自糖蛋白移除，舉例來說利用內切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3。此外，該重組宿主細胞可經 基因工程化以不處理某些種類之多醣。這些及類似之技術係該領域所廣為週知。
其他修飾之方法包括使用該領域已知之偶合技術，包括但不限於酵素方法、氧化性取代及螯合。修飾可被用於例如連接用於免疫測定之標記。經修飾之多肽係利用該領域已建立之方法製備，且可利用該領域已知之標準測定篩選，這些方法中有些係於下面及實施例中描述。
在本發明之一些實施態樣中，該抗體包含經修飾之恆定區，諸如增加對人Fcγ受體之親和性、呈免疫惰性或部分惰性之恆定區(例如不引發補體媒介性溶解、不刺激抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)或不活化巨噬細胞)或在下列任一或多項具有減少之活性(相較於未經修飾之抗體)：引發補體媒介性溶解、刺激抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、或活化小神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可被用於達到效應功能之最佳量及/或組合。見例如Morgan et al.,Immunology 86：319-324,1995、Lund et al.,J.Immunology 157：4963-4969,1996、Idusogie et al.,J.Immunology 164：4178-4184,2000、Tao et al.,J.Immunology 143：2595-2601,1989及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施態樣中，該恆定區係經如Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624、PCT申請案PCT/GB99/01441及/或英國專利申請案9809951.8所述之修飾。在其他實施態樣中，該抗體包括含有下列突變之人重鏈IgG2恆定區：A330P331至 S330S331(胺基酸編號參照野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624。在其他實施態樣中，該恆定區係無N-連接糖基化。在一些實施態樣中，該恆定區係藉由使該糖基化胺基酸殘基或該恆定區中屬於N-糖基化辨認序列之部份的側翼殘基突變而無N-連接糖基化。舉例來說，N糖基化位置N297可經突變成A、Q、K或H。見Tao et al.,J.Immunology 143：2595-2601,1989及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施態樣中，該恆定區係無N-連接糖基化。該恆定區可經酵素處理(諸如藉由酵素PNGase移除碳水化合物)，或藉由在糖基化缺陷之宿主細胞中表現以無N-連接糖基化。
其他抗體修飾包括如PCT公開號WO 99/58572所述經修飾之抗體。該等抗體除了包含針對標靶分子之結合結構域，還包含具有實質上與人免疫球蛋白重鏈之所有或部分恆定區同源之胺基酸序列的效應結構域。該等抗體能與標靶分子結合但不引發顯著之補體依賴性溶解或細胞媒介性標靶破壞。在一些實施態樣中，該效應結構域能與FcRn及/或FcγRIIb專一性結合。彼等通常是根據衍生自二或多種人免疫球蛋白重鏈CH 2區之嵌合性結構域。以此方式修飾之抗體特別適用於慢性抗體治療，以避免傳統抗體治療所引發之發炎及其他不良反應。
本發明包括親和性成熟之實施態樣。舉例來說，親和性成熟抗體可藉由該領域已知之方法產製(Marks et al., Bio/Technology,10：779-783,1992、Barbas et al.,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813,1994、Schier et al.,Gene,169：147-155,1995、Yelton et al.,J.Immunol.,155：1994-2004,1995、Jackson et al.,J.Immunol.,154(7)：3310-9,1995、Hawkins et al.,J.Mol.Biol.,226：889-896,1992及PCT公開號WO2004/058184)。
下列方法可被用於調整抗體之親和性及特徵化CDR。一種特徵化抗體之CDR及/或改變(諸如改善)多肽諸如抗體之結合親和性之方法被稱為「庫掃描突變形成」。通常，庫掃描突變形成係如下述。CDR中之一或多個胺基酸位置係利用該領域已建立之方法經兩或多個(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸取代。如此產生小型克隆庫(在一些實施態樣中，每個經分析之胺基酸位置皆有一個克隆)，每個克隆皆有兩或多個成員之複雜性(若各位置被兩或多個胺基酸取代)。通常，該克隆庫亦包括包含天然(未經取代之)胺基酸之克隆。各庫中之少量克隆(例如約20至80個克隆，依該庫之複雜性而定)係經篩選其與該標靶多肽(或其他結合標靶)之結合親和性，結合性增加、相同、降低或不具結合性之候選克隆被識別。測定結合親和性之方法係該領域所廣為週知。結合親和性可利用BiacoreTM 表面電漿共振分析測定，該分析檢測約2倍或更高之結合親和性差異。BiacoreTM 特別適用於當起始抗體已經以相當高之親和性結合時，例如約10 nM或小於10 nM之 KD 。利用BiacoreTM 表面電漿共振篩選係描述於此處之實施例。
結合親和性可利用金耐科薩(Kinexa)生物感測器、鄰近閃爍檢測、ELISA、ORIGEN免疫測定(IGEN)、螢光淬熄、螢光轉移及/或酵母菌展示測定。結合親和性亦可利用適當之生物測定篩選。
在一些實施態樣中，CDR中之每個胺基酸位置(在一些實施態樣中一次一個位置)皆利用該領域已知之突變形成方法(某些方法於此處描述)以所有20個天然胺基酸取代。如此產生小型克隆庫(在一些實施態樣中，每個經分析之胺基酸位置有一個克隆)，各克隆具有20個成員之複雜性(若每個位置被所有20個胺基酸取代)。
在一些實施態樣中，該經篩選之庫包含兩或多個位置之取代，該兩或多個位置可能在相同CDR內或在兩或多個CDR內中。因此，該庫可能包含在一個CDR中取代兩或多個位置。該庫可能包含在二或多個CDR中取代兩或多個位置。該庫可能包含取代3、4、5或多個位置，該等位置見於二、三、四、五或六個CDR中。該取代可利用低多餘性密碼子製備。見例如Balint et al.,Gene 137(1)：109-18,1993之表2。
該CDR可為CDRH3及/或CDRL3。該CDR可為CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3之一或多者。該CDR可為卡巴CDR、柯西亞CDR或延伸CDR。
具有改善結合性之候選物可被定序，藉此識別導致改善親和性之CDR取代突變(亦稱為「改善」取代)。可結合之候選物亦被定序，藉此識別保留結合性之CDR取代。
可進行多次篩選。舉例來說，具有改善結合性之候選物(各候選物在一或多個CDR之一或多個位置包含胺基酸取代)亦可被用於設計第二庫，該庫在各經改善之CDR位置(即在CDR中取代突變顯示改善結合性之胺基酸位置)包含至少該原始及經取代之胺基酸。此庫之製備、篩選及選擇另於下討論。
庫掃描突變形成亦提供特徵化CDR之方法，因為具有改善結合力、相同結合力、降低結合力或無結合力之克隆的頻率亦提供有關各胺基酸位置對抗體-抗原複合物之穩定性的重要性之資訊。舉例來說，如果CDR之一個位置被改變成所有20個胺基酸仍保留結合力，該位置被認為不可能是抗原結合所必需之位置。相反地，如果CDR之一個位置只有在低比例之取代中保留結合力，該位置被認為是對CDR之功能具重要性之位置。因此，庫掃描突變形成方法產生有關CDR中之位置的資訊，有些位置可被改變成許多不同之胺基酸(包括所有20個胺基酸)，有些位置無法被改變或僅能被改變成少數幾種胺基酸。
具有改善親和性之候選物可利用所希望之篩選或選擇方法被組合於第二庫中，該庫包括在該位置經改善之胺基酸及原始胺基酸，且可能另外包括該位置之額外取代，視所希望或所允許之該庫之複雜性而定。此外若有需要的 話，鄰近之胺基酸位置可被隨機化成至少兩或多種胺基酸。鄰近胺基酸之隨機化可能允許該突變CDR之額外構型可塑性，此可能進而允許或促進導入更多之改善突變。該庫亦可能包含在第一次篩選時不顯示改善親和性之取代位置。
該第二庫係利用該領域已知之任何方法篩選或選擇具有改善及/或改變之結合親和性之庫成員，包括利用BiacoreTM 表面電漿共振分析篩選，及利用該領域已知之任何用於選擇之方法選擇，包括噬菌體展示、酵母菌展示及核糖體展示。
本發明亦包含融合蛋白質，該融合蛋白質包含一或多個源自本發明之抗體的片段或區域。在一實施態樣中，本發明提供一種融合多肽，該融合多肽包含如SEQ ID NO：1、3、6、7、8、10或12所示之輕鏈可變區之至少10個連續胺基酸，及/或如SEQ ID NO：2、4、5、9、11或13所示之重鏈可變區之至少10個連續胺基酸。在其他實施態樣中，本發明提供包含該輕鏈可變區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續胺基酸及/或該重鏈可變區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續胺基酸之融合多肽。在另一實施態樣中，該融合多肽包含輕鏈可變區及/或重鏈可變區，如選自SEQ ID NO：1及2、3及4、3及5、6及5、7及5、8及9、10及11或12及13之任一序列對所示。在另一實施態樣中，該融合多肽包含 一或多個CDR。在仍其他實施態樣中，該融合多肽包含CDR H3(VH CDR3)及/或CDR L3(VL CDR3)。就本發明之目的而言，融合蛋白包含一或多種抗體及在天然分子中未與其連接之另一胺基酸序列，例如異源性序列或來自另一區之同源性序列。示範性異源序列包括但不限於「標籤」諸如FLAG標籤或6His標籤。標籤係該領域所廣為周知。
融合多肽可藉由該領域已知之方法產製，例如合成或重組。通常，本發明之融合蛋白係藉由使用此處所描述之重組方法使編碼彼等之多核苷酸表現加以製備，不過亦可藉由該領域所知之其他方法製備，包括例如化學合成。
本發明亦提供組成物，該等組成物包含與劑共軛(例如連接)以利與固相支持物(諸如生物素或抗生物素蛋白)偶合之抗體。為了簡單起見大致將以抗體為例，但應了解該等方法適用於此處所述之任何Trop-2抗體實施態樣。共軛一般係指如此處所述之連接該等成分。該連接(通常以近距離相連固定該等成分以至少供投予)可以數種方式達成。舉例來說，當劑與抗體各自具有能與彼此反應之取代基時，兩者間之直接反應係可能的。舉例來說，一者之親核基團(諸如胺基或氫硫基)可能能與另一者之含有羰基之基團(諸如酐或酸性鹵化物)或含有好的離去基團(例如鹵化物)之烷基反應。
本發明亦提供編碼本發明之抗體之經分離之多核苷酸，及包含該多核苷酸之載體及宿主細胞。
因此，本發明提供多核苷酸(或組成物，包括醫藥組成物)，該等多核苷酸包含編碼下列任一者之多核苷酸：m7E6、h7E6、h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h7E6_SVGN、m6G11、h6G11、h6G11_FKG_SF或彼等之能與Trop-2結合之任何片段或部分。
在另一態樣中，本發明提供編碼此處所述之任何抗體(包括抗體片段)及多肽之多核苷酸，諸如具有受損效應功能之抗體及多肽。多核苷酸可利用該領域已知之方法製備及表現。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之任何多核苷酸之組成物(諸如醫藥組成物)。在一些實施態樣中，該組成物包含表現載體，該表現載體包含編碼此處所述之任何抗體之多核苷酸。在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：14所示之多核苷酸之任 一或兩者：
m7E6重鏈可變區
(SEQ ID NO：15)
m7E6輕鏈可變區
(SEQ ID NO：14)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：16所示之多核苷酸之任一或兩者：
h7E6重鏈可變區
(SEQ ID NO：17)
h7E6輕鏈可變區
(SEQ ID NO：16)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：16所示之多核苷酸之任一或兩者：
h7E6_SVG重鏈可變區
(SEQ ID NO：18)
h7E6_SVG輕鏈可變區
(SEQ ID NO：16)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19所示之多核苷酸之任一或兩者：
h7E6_SVGL重鏈可變區
(SEQ ID NO：18)
h7E6_SVGL輕鏈可變區
(SEQ ID NO：19)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20所示之多核苷酸之任一或兩者：
h7E6_SVGN重鏈可變區
(SEQ ID NO：18)
h7E6_SVGN輕鏈可變區
(SEQ ID NO：20)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26所示之多核苷酸之任一或兩者：
h6G11_FKG_SF重鏈可變區
(SEQ ID NO：25)
h6G11_FKG_SF輕鏈可變區
(SEQ ID NO：26)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：21所示之多核苷酸之任一或兩者：
m6G11重鏈可變區
(SEQ ID NO：22)
m6G11輕鏈可變區
(SEQ ID NO：21)
在其他實施態樣中，該組成物包含如下列SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：23所示之多核苷酸之任一或兩者：
h6G11重鏈可變區
(SEQ ID NO：24)
h6G11輕鏈可變區
(SEQ ID NO：23)
表現載體及投予多核苷酸組成物另於此處描述。
在另一態樣中，本發明提供製備此處所述之任何多核苷酸之方法。
與任何該等序列互補之多核苷酸亦包含於本發明中。多核苷酸可能為單股(編碼或反義)或雙股，且可能為DNA(基因組、cDNA或合成性)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子及mRNA分子，該HnRNA分子包含內含子且以一對一之方式對應DNA分子，該mRNA分子不包含內含子。額外之編碼或非編碼序列可能(但不一定)存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可能(但不一定)與其他分子及/或支持物質連接。
多核苷酸可能包含天然序列(即編碼抗體或彼之部分 之內源性序列)或可能包含該序列之變異體。多核苷酸變異體包含一或多個取代、添加、刪除及/或插入以使該經編碼之多肽的免疫反應性相對於天然免疫反應性分子而言不被減少。對該經編碼之多肽的免疫反應性之影響通常係如此處所述檢測。變異體較佳地展現與編碼天然抗體或彼之部分之多核苷酸序列具有至少約70%之一致性，更佳地至少約80%之一致性，甚至更佳地至少約90%之一致性及最佳地至少約95%之一致性。
若二個多核苷酸或多肽序列如下所述排比以得到最高對應性且該二個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則該二個序列被稱為「一致」。兩序列之間的比較通常藉由在比較窗中比較序列加以進行，以識別及比較具有序列相似性之局部區域。此處所使用之「比較窗」係指至少約20個、通常30個至約75個、或40個至約50個連續位置之區段，在該窗中一序列可與具有相同連續位置數量之參考序列在該二序列經最佳排比後比較。
供比較之序列的最佳排比可利用雷斯基(Lasergene)生物資訊套裝軟體中之邁佳來(Megalign)程式(威斯康辛州麥迪遜市DNASTAR公司)以內建參數進行。此程式具體化下列文獻中描述之數種排比法：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5, Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
較佳地，「序列一致性之百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗中比較二個經最佳排比之序列加以決定，其中在比較窗中多核苷酸或多肽序列之部分相較於供二序列最佳排比之參考序列(其不包含添加或刪除)可能包含20%或低於20%、通常5%至15%、或10%至12%之添加或刪除(即缺口)。百分比之計算係藉由測定二個序列中出現相同之核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目，以得到匹配位置之數目，將該匹配位置之數目除以參考序列之位置總數(即窗之大小)，並將該結果乘以100以得到序列一致性百分比。
變異體亦可能或選擇性地與天然基因或彼之部分或互補部分實質上同源。該等多核苷酸變異體能在中度嚴謹度條件下與編碼天然抗體之天然發生之DNA序列(或互補序 列)雜交。
適當之「中度嚴謹度條件」包括在5倍SSC、0.5% SDS、1.0毫莫耳EDTA(pH 8.0)之溶液中預先清洗；於50℃至60℃之5倍SSC中隔夜雜交；接著於65℃中各以含有0.1% SDS之2倍、0.5倍及0.2倍SSC清洗20分鐘兩次。
此處所使用之「高度嚴謹度條件」或「高嚴謹條件」係該些：(1)採用低離子張力及高溫清洗，例如於50℃之0.015莫耳氯化鈉/0.0015莫耳檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉；(2)在42℃之雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/含有750毫莫耳氯化鈉、75毫莫耳檸檬酸鈉之pH 6.5之50毫莫耳磷酸鈉緩衝液之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)於42℃採用50%甲醯胺、5倍SSC(0.75莫耳NaCl、0.075莫耳檸檬酸鈉)、50毫莫耳磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5倍丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50微克/毫升)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，並於42℃以0.2倍SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)清洗及於55℃以50%甲醯胺清洗，之後於55℃以含有EDTA之0.1倍SSC進行高嚴謹度清洗。該領域之技藝人士將知道如何視需要調整溫度、離子強度等條件以配合像是探針長度等類似之因子。
該領域之一般技藝人士將瞭解的是，由於基因密碼簡併之結果，有許多核苷酸序列編碼此處所描述之多肽。這 些多核苷酸中有些與任何天然基因之核苷酸序列具有極低之同源性。然而，本發明特別考慮因為使用不同的密碼子而有所差異之多核苷酸。另外，包含此處所提供之多核苷酸序列之基因的等位基因係屬於本發明之範圍內。等位基因係因為一或多個突變，諸如核苷酸之刪除、添加及/或取代而被改變之內源性基因。該形成之mRNA及蛋白質可能但不一定具有經改變之結構或功能。等位基因可利用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)加以識別。
本發明之多核苷酸可利用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成之方法係該領域所廣為週知，不須在此詳細說明。該領域之技藝人士可利用此處所提供之序列及商用DNA合成儀產製所欲之DNA序列。
在利用重組方法製備多核苷酸時，包含所欲序列之多核苷酸可被插入適當之載體中，該載體接著可被導入適當之宿主細胞以供複製及擴增，在下面進一步討論。多核苷酸可藉由該領域所知之任何方法被插入宿主細胞中。細胞之轉形係藉由直接攝取、胞飲作用、轉染、F交配(F-mating)或電穿孔導入外源性多核苷酸。一旦導入後，該外源性多核苷酸可以非整合性載體(諸如質體)或整合至該宿主細胞之基因組中而被維持於該細胞內。經此放大之多核苷酸可利用該領域所熟習之方法自該宿主細胞分離。見例如Sambrook et al.,1989。
另外，PCR能複製DNA序列。PCR技術係該領域所廣為周知，於美國專利第4,683,195、4,800,159、 4,754,065及4,683,202號及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中描述。
RNA可藉由使用適當載體中經分離之DNA且將其插入適當之宿主細胞中獲得。當細胞複製且該DNA被轉錄成為RNA時，該RNA即可利用該領域之技藝人士所廣為週知之方法分離，例如於Sambrook et al.,1989(同上)所述。
適當之選殖載體可根據標準技術建構，或可選自該領域為數眾多之可用選殖載體。雖然該經選擇之選殖載體可能因所意圖使用之宿主細胞而異，適用之選殖載體通常具有自我複製之能力、可能具有特定限制內切酶之單一目標及/或可能帶有可用於選擇含有該載體之克隆的標誌基因。適當實例包括質體及細菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體諸如pSA3及pAT28。這些及許多其他選殖載體可購自商業賣方諸如伯樂(BioRad)公司、斯壯特基(Stratagene)公司及英維特基(Invitrogen)公司。
表現載體通常是可複製之多核苷酸建構物，其包含本發明之多核苷酸。這暗示表現載體必需能在宿主細胞中以附加體或染色體DNA之組成部分被複製。適當之表現載體包括但不限於質體、病毒載體(包括腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開號WO 87/04462中所揭示之表現載體。載體成份通常包括但不限於下列一或多項：信號序列、複製起點、一或多種標誌基因、適當之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。就表現(即轉譯)而言，通常也需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位置、轉譯起始位置及終止密碼子。
含有感興趣之多核苷酸之載體可藉由任何適當之方法導入宿主細胞，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染、微彈撞擊、脂質體轉染及感染(例如該載體為感染性劑諸如牛痘病毒)。導入載體或多核苷酸之選擇通常將視該宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含此處所述之任何多核苷酸之宿主細胞。任何能過度表現異源性DNA之宿主細胞可被使用以分離編碼該感興趣之抗體、多肽或蛋白質之基因。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括但不限於COS、HeLa及CHO細胞。亦見PCT公開號WO 87/04462。適當之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草桿菌)及酵母菌(諸如啤酒釀母菌、分裂酵母(S.pombe)或乳酸克魯維酵母菌(K.lactis))。較佳地，該宿主細胞以相較於該對應之感興趣之內源性抗體或蛋白質若存在於宿主細胞中高出約5倍、更佳為高出10倍、甚至更佳為高出20倍之量表現cDNA。篩選與Trop-2或Trop-2結構域(例如結構域1至4)專一性結合之宿主細胞係利用免疫測定或FACS進行。過度表現感興趣之抗體或蛋白之細胞可被識別。
Trop-2抗體共軛物
本發明亦提供一種如此處所述之Trop-2抗體或彼之抗原結合片段之共軛物(或免疫共軛物)，其中該抗體或抗原結合片段係直接或間接經由連接子與劑(例如細胞毒性劑)共軛以用於靶向性免疫療法(例如抗體-藥物共軛物)。舉例來說，細胞毒性劑可如此處所述與該Trop-2抗體或彼之抗原結合片段連接或共軛以用於靶向性局部遞送該細胞毒性劑至腫瘤(例如Trop-2表現腫瘤)。
用於共軛細胞毒性劑或其他治療劑與抗體之方法已於許多文獻中說明。舉例來說，抗體之化學修飾可經由離胺酸側鏈胺或藉由還原鏈間雙硫鍵而被活化之半胱胺酸氫硫基進行，以使共軛反應得以發生。見例如Tanaka et al.,FEBS Letters 579：2092-2096,2005及Gentle et al.,Bioconjugate Chem.15：658-663,2004。經工程化於抗體之特定位置之反應性半胱胺酸殘基以利用經定義之化學計量供特定藥物共軛亦已被描述。見例如Junutula et al.,Nature Biotechnology,26：925-932,2008。在轉麩醯胺酶及胺存在時，使用含有麩胺醯胺之醯基供體標籤或藉由多肽工程化使成反應性之內源性麩胺醯胺(即形成共價鍵以作為醯基供體之能力)之共軛(例如包含或連接至反應性胺之細胞毒性劑)亦描述於國際專利申請序號PCT/IB2011/054899(WO2012/059882)。
在一些實施態樣中，此處描述之Trop-2抗體或共軛 物包含在該抗體之特定位置(例如該Trop-2抗體之羧基端、胺基端或其他位置)經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤。在一些實施態樣中，該標籤包含胺基酸麩胺醯胺(Q)或胺基酸序列GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ ID NO：79)、GGLLQGA(SEQ ID NO：81)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO：90)、LLQGPG(SEQ ID NO：91)、LLQGPA(SEQ ID NO：92)、LLQGP(SEQ ID NO：93)、LLQP(SEQ ID NO：94)、LLQPGK(SEQ ID NO：95)、LLQGAPGK(SEQ ID NO：96)、LLQGAPG(SEQ ID NO：97)、LLQGAP(SEQ ID NO：98)、LLQX1 X2 X3 X4 X5 其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係K、G或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88)，或LLQX1 X2 X3 X4 X5 其中X1 係任何天然發生之胺基酸且其中X2、 X3、 X4 及X5 係任何天然發生之胺基酸或不存在(SEQ ID NO：89)。在一些實施態樣中，此處描述之Trop-2抗體或共軛物包含在該抗體之特定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤，其中該標籤包含在該Trop-2抗體之輕鏈羧基端經工程化之胺基酸序列GGLLQGG(SEQ ID NO：78)。在一些實施態樣中，此處描述之Trop-2抗體或共軛物包含在該抗體之特定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤，其中該標籤包含在該Trop-2抗體之輕鏈羧基端經工程化之胺基酸序列GGLLQGA(SEQ ID NO：81)。在其他實施態樣中，此處描述之Trop-2抗體或共軛物包含在該抗體之特 定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤，其中該標籤包含在該Trop-2抗體之重鏈羧基端經工程化之胺基酸序列LLQGA(SEQ ID NO：79)且其中該重鏈羧基端之離胺酸殘基係經刪除。在其他實施態樣中，此處描述之Trop-2抗體或共軛物包含在該抗體之特定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤，其中該標籤包含在該Trop-2抗體之重鏈羧基端經工程化之胺基酸序列LLQ且其中該重鏈羧基端之離胺酸殘基係經刪除。在一些實施態樣中，此處描述之Trop-2抗體或共軛物包含該Trop-2抗體之位置297的胺基酸自天冬醯胺酸(N)取代成麩胺醯胺(Q)。
本發明亦提供一種經分離之抗體，其包括含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及在該抗體之位置222、340或370(卡巴編號系統)之胺基酸修飾，其中該修飾係胺基酸刪除、插入、取代、突變或任何彼等之組合。因此，在一些實施態樣中，本發明提供如此處所述之Trop-2抗體或共軛物，其包含與該Trop-2抗體之特定位置(例如該重鏈或輕鏈之羧基端或其他位置)共軛之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤(例如Q、GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ ID NO：79)、GGLLQGA(SEQ ID NO：81)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO：90)、LLQGPG(SEQ ID NO：91)、LLQGPA(SEQ ID NO：92)、LLQGP(SEQ ID NO：93)、LLQP(SEQ ID NO：94)、LLQPGK(SEQ ID NO：95)、LLQGAPGK(SEQ ID NO：96)、LLQGAPG(SEQ ID NO：97)、LLQGAP (SEQ ID NO：98)、LLQX1 X2 X3 X4 X5 其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係K、G或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88)，或LLQX1 X2 X3 X4 X5 其中X1 係任何天然發生之胺基酸且其中X2 、X3 、X4 及X5 係任何天然發生之胺基酸或不存在(SEQ ID NO：89))及在該抗體之位置222、340或370(卡巴編號)之胺基酸修飾。在一些實施態樣中，該胺基酸修飾係將離胺酸取代成精胺酸(例如K222R、K340R或K370R)。在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在該Trop-2抗體輕鏈之C端經工程化之包含序列GGLLQGG(SEQ ID NO：78)之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及在該抗體之位置222(卡巴編號)之胺基酸自離胺酸取代成精胺酸。在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在該Trop-2抗體輕鏈之C端經工程化之包含序列GGLLQGA(SEQ ID NO：81)之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及在該抗體之位置222(卡巴編號)之胺基酸自離胺酸取代成精胺酸。在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在該Trop-2抗體重鏈之C端經工程化之包含序列LLQGA(SEQ ID NO：79)之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及在該抗體之位置222(卡巴編號)之胺基酸自離胺酸取代成精胺酸，其中該重鏈羧基端之離胺酸殘基係經刪除。在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在該Trop-2抗體重鏈之C端經工程化之包含序列LLQ之含有麩胺醯胺之醯 基供體標籤及在該抗體之位置222(卡巴編號)之胺基酸自離胺酸取代成精胺酸，其中該重鏈羧基端之離胺酸殘基係經刪除。在一些實施態樣中，此處所述之Trop-2抗體或共軛物包含在該Trop-2抗體之位置297經工程化之包含麩胺醯胺之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及在該抗體之位置222(卡巴編號)之胺基酸自離胺酸取代成精胺酸。
可與本發明之Trop-2抗體或抗原結合片段共軛之劑包括但不限於細胞毒性劑、免疫調節劑、顯影劑、治療性蛋白質、生物聚合物或寡核苷酸。
細胞毒性劑之實例包括但不限於蒽環類(anthracycline)、耳抑素、海兔毒素(dolastatin)、CC-1065、雙聯黴素(duocarmycin)、烯二炔、膠達納黴素(geldanamycin)、美坦素(maytansine)、嘌呤黴素(puromycin)、紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、SN-38、微管溶素(tubulysin)、半星芒體(hemiasterlin)及彼等之立體異構物、同電子排列體、類似物或衍生物。
蒽環係源自鏈黴菌屬之細菌，已被用於治療多種癌，諸如白血病、淋巴瘤、乳癌、子宮癌、卵巢癌及肺癌。示範性蒽環包括但不限於正定黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(即甲烯土黴素(adriamycin))、表阿黴素(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。
海兔毒素(dolastatin)及彼等之肽類似物及衍生物耳抑 素係高度有效之抗有絲分裂劑，已被顯示具有抗癌及抗真菌活性。見例如美國專利第5,663,149號及Pettit et al.,Antimicrob.Agents Chemother .42：2961-2965,1998。示範性海兔毒素及耳抑素包括但不限於海兔毒素10、耳抑素E、耳抑素EB(AEB)、耳抑素EFP(AEFP)、MMAD(一甲基耳抑素D或一甲基海兔毒素10)、MMAF(一甲基耳抑素F或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙胺酸)，MMAE(一甲基耳抑素E或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-dolaisoleuine-dolaproine-降麻黃鹼)、5-苯甲醯基戊酸-AE酯(AEVB)及其他新穎之耳抑素(諸如美國專利申請案61/561,255及61/676,423中所述者)。在一些實施態樣中，該耳抑素係0101(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R, 4S, 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R, 2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)，其具有下列結構：
雙聯黴素(duocarmycin)及CC-1065係具有細胞毒性效力之DNA烷化劑。見Boger and Johnson,PNAS 92：3642-3649,1995。示範性海兔毒素及耳抑素包括但不限於(+)-雙聯黴素A及(+)-雙聯黴素SA及(+)-CC-1065。
烯二炔(Enediyne)係一類抗腫瘤細菌產物，其特徵為具有九元及十元環或有經共軛之三鍵-雙鍵-三鍵之環狀系統存在。示範性烯二炔包括但不限於卡利奇黴素(calicheamicin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)及達內黴素(dynemicin)。
膠達納黴素(geldanamycin)係與Hsp90(熱休克蛋白90)結合之苯醌安莎黴素(ansamycin)抗生素，其已被用來作為抗腫瘤藥。示範性膠達納黴素包括但不限於17-AAG(17-N-烯丙基胺基-17-去甲氧基膠達納黴素)及17-DMAG(17-二甲基胺基乙基胺基-17-去甲氧基膠達納黴素)。
美坦素(Maytansine)或彼等之衍生物類美坦素(maytansinoid)抑制細胞增生，其藉由在有絲分裂時經由抑制微管蛋白之聚合而抑制微管形成。見Remillard et al.,Science 189：1002-1005,1975。示範性美坦素及類美坦素包括但不限於美登素(mertansine)(DM1)、美登素之衍生物及安絲菌素(ansamitocin)。
紫杉烷(taxane)係作為抗微管蛋白劑或有絲分裂抑制劑之二萜。示範性紫杉烷包括但不限於太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如TAXOL® )及多西紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE® )。
長春花生物鹼亦為抗微管蛋白劑。示範性長春花生物鹼包括但不限於長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine)。
在一些實施態樣中，該劑係免疫調節劑。免疫調節劑之實例包括但不限於更昔洛韋(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、伏環孢素(voclosporin)、環孢靈(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolgate mofetil)、甲胺喋呤(methotrexate)、糖皮質素、糖皮質素類似物、細胞介素、幹細胞生長因子、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子、介白素(例如介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、集落刺激因子(例如顆粒球集落刺激因子(G-CSF)及顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)、命名為「S1因子」之幹細胞生長因子、紅血球生成素、血小板生成素或彼等之組合。
在一些實施態樣中，該劑係顯影劑(例如螢光團標記、正電子發射斷層攝影(PET)標記、單光子發射電腦斷層攝影(SPECT)標記)或磁共振攝影(MRI)標記。
螢光團之實例包括但不限於螢光素異硫氰酸酯(FITC)(例如5-FITC)、螢光素胺基磷酸酯(fluorescein amidite)(FAM)(例如5-FAM)、伊紅素、羧基螢光素、紅螢素(erythrosine)、Alexa Fluor® (例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明 (TAMRA)(例如5,-TAMRA)、四甲基若丹明(TMR)及磺基若丹明(SR)(例如SR101)。
在一些實施態樣中，治療性或診斷性放射性同位素或其他標記(例如PET或SPECT標記)可被納入與此處所述之Trop-2抗體或抗原結合片段共軛之劑中。放射性同位素或其他標記之實例包括但不限於3 H、11 C、13 N、14 C、15 N、15 O、35 S、18 F、32 P、33 P、47 Sc、51 Cr、57 Co、58 Co、59 Fe、62 Cu、64 Cu、67 Cu、67 Ga、68 Ga、75 Se、76 Br、77 Br、86 Y、89 Zr、90 Y、94 Tc、95 Ru、97 Ru、99 Tc、103 Ru、105 Rh、105 Ru、107 Hg、109 Pd、111 Ag、111 In、113 In、121 Te、122 Te、123 I、124 I、125 I、125 Te、126 I、131 I、131 In、133 I、142 Pr、143 Pr、153 Pb、153 Sm、161 Tb、165 Tm、166 Dy、166 H、167 Tm、168 Tm、169 Yb、177 Lu、186 Re、188 Re、189 Re、197 Pt、198 Au、199 Au、201 Tl、203 Hg、211 At、212 Bi、212 Pb、213 Bi、223 Ra、224 Ac及225 Ac。
在一些實施態樣中，該劑係治療性蛋白質，包括但不限於毒素、荷爾蒙、酶及生長因子。
毒素蛋白質(或多肽)之實例包括但不限於白喉毒素(例如白喉毒素A鏈)、假單胞菌外毒素及內毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)(例如蓖麻毒蛋白A鏈)、相思豆毒素(abrin)(例如相思豆毒素A鏈)、莫迪素(modeccin)(例如莫迪素A鏈)、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素(dianthin)蛋白質、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、 葡萄球菌腸毒素A、商陸(pokeweed)抗病毒蛋白、白樹毒素(gelonin)、白喉毒素、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(Saponaria officianalis)抑制劑、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、新月毒素(tricothecene)、抑制劑胱胺酸結(ICK)肽(例如角毒素(ceratotoxin))及芋螺毒素(conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
在一些實施態樣中，該劑係生物相容性聚合物。此處所述之Trop-2抗體或抗原結合片段可與生物相容性聚合物共軛以增加血清半衰期及生物活性及/或延長體內半衰期。生物相容性聚合物之實例包括水溶性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或彼之衍生物及含有兩性離子之生物相容性聚合物(例如含有磷醯膽鹼之聚合物)。
在一些實施態樣中，該劑係寡核苷酸，諸如反義寡核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供如此處所述之抗體或抗原結合片段之共軛物，其中該共軛物包含下式：抗體-(含有麩胺醯胺之醯基供體標籤)-(連接子)-(細胞毒性劑)，其中該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤係經工程化於該抗體或抗原結合片段之特定位置(例如該重鏈或輕鏈之羧基端或另一位置)，其中該標籤係與連接子共軛(例如含有一或多個 反應性胺之連接子(例如一級胺NH2 ))且其中該連接子係與細胞毒性劑(例如MMAD或其他耳抑素諸如0101)共軛。
含有一或多個反應性胺之連接子之實例包括但不限於乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC)或胺基PEG6-丙醯基。見例如WO2012/059882。
在一些實施態樣中，該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤包含GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ ID NO：79)、GGLLQGA(SEQ ID NO：81)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO：90)、LLQGPG(SEQ ID NO：91)、LLQGPA(SEQ ID NO：92)、LLQGP(SEQ ID NO：93)、LLQP(SEQ ID NO：94)、LLQPGK(SEQ ID NO：95)、LLQGAPGK(SEQ ID NO：96)、LLQGAPG(SEQ ID NO：97)、LLQGAP(SEQ ID NO：98)、LLQX1 X2 X3 X4 X5 其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係K、G或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88)，或LLQX1 X2 X3 X4 X5 其中X1 係任何天然發生之胺基酸且其中X2、 X3、 X4 及X5 係任何天然發生之胺基酸或不存在(SEQ ID NO：89)。
在一些實施態樣中，該共軛物係1)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-AcLys-VC-PABC-0101、2)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-AcLys-VC-PABC-MMAD、3)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-AcLys-VC-PABC-0101、4)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-AcLys-VC-PABC-MMAD 、5)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-AcLys-VC-PABC-0101或6)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-AcLys-VC-PABC-MMAD。在一些實施態樣中，該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤包含例如LLQ、SEQ ID NO：79、90、91、92、93、94、95、96、97或98，其係經工程化於該抗體之重鏈之C端，其中在該C端之離胺酸殘基係經刪除。在其他實施態樣中，該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤(例如GGLLQGG(SEQ ID NO：78))係經工程化於該抗體之輕鏈之C端。該抗體之實例包括但不限於h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h7E6SVGN、h6G11或h6G11_FKG_SF。
在一變異實施態樣中，該共軛物另包含位置222之離胺酸取代成精胺酸之胺基酸取代。因此，舉例來說，該共軛物係1)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-AcLys-VC-PABC-MMAD且包含K222R、2)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-AcLys-VC-PABC-0101且包含K222R、3)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-AcLys-VC-PABC-0101且包含K222R、4)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-AcLys-VC-PABC-MMAD且包含K222R或5)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-AcLys-VC-PABC-MMAD且包含K222R。在一些實施態樣中，該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤包含例如LLQ、SEQ ID NO：79、90、91、92、93、94、95、96、97或98，其係經工程化於該抗體之重鏈之C端，其中在該C端之離胺酸殘基係經刪除。在其他實施態樣中，該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤(例如GGLLQGG(SEQ ID NO：78))係經工程化於該抗體之輕鏈之C端。該抗體之實例包括但不限於h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h6G11或h6G11_FKG_SF。
在另一態樣中，本發明提供如此處所述之抗體或抗原 結合片段之共軛物，該共軛物包含在位置N297Q及K222R之胺基酸取代、包含胺基-PEG6-丙醯基之連接子，及細胞毒性劑(例如MMAD或其他耳抑素)。舉例來說，該共軛物係與胺基-PEG6-丙醯基及MMAD共軛之h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h6G11或h6G11_FKG_SF，或是與胺基-PEG6-丙醯基及0101共軛之h7E6_SVG、h7E6_SVG1、h7E6_SVG2、h7E6_SVG3、h7E6_SVG4、h7E6_SVG5、h7E6_SVG6、h7E6_SVG7、h7E6_SVG8、h7E6_SVG9、h7E6_SVG10、h7E6_SVG11、h7E6_SVG12、h7E6_SVG13、h7E6_SVG14、h7E6_SVG15、h7E6_SVG16、h7E6_SVG17、h7E6_SVG18、h7E6_SVG19、h7E6_SVG20、h7E6_SVG21、h7E6_SVG22、h7E6_SVG23、h7E6_SVG24、h7E6_SVG25、h7E6_SVG26、h7E6_SVG27、h7E6_SVG28、h7E6_SVG29、h7E6_SVG30、 h7E6_SVG31、h7E6_SVG32、h7E6_SVGL、h7E6_SVGL1、h7E6_SVGL2、h7E6_SVGL3、h7E6_SVGL4、h7E6_SVGL5、h6G11或h6G11_FKG_SF。
使用Trop-2抗體及彼之抗體共軛物之方法
本發明之抗體及抗體共軛物可用於許多應用，包括但不限於治療性處理方法及診斷性處理方法。
在一態樣中，本發明提供一種供治療與個體之Trop-2表現有關之症狀之方法。在一些實施態樣中，該治療與個體之Trop-2表現有關之症狀之方法包含對需要治療之個體投予有效量之組成物(例如醫藥組成物)，該組成物包含如此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。該等與Trop-2表現有關之症狀包括但不限於不正常之Trop-2表現、經改變或異常之Trop-2表現、Trop-2過度表現及增生性疾病(例如癌)。
因此，在一些實施態樣中，本發明提供一種治療個體之癌之方法，該方法包含對需要治療之個體投予有效量之組成物，該組成物包含如此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。如此處所使用，癌包括但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、腎癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰癌、前列腺癌及皮膚癌。在一些實施態樣中，本發明提供一種抑制患有Trop-2表現性腫瘤之個體的腫瘤生長或惡化之方法，該方法包含對需要抑制之個體投予有效量之 組成物，該組成物包含如此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。在其他實施態樣中，本發明提供一種抑制個體之Trop-2表現性癌細胞轉移之方法，該方法包含對需要抑制之個體投予有效量之組成物，該組成物包含如此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。在其他實施態樣中，本發明提供一種誘導個體之Trop-2表現性腫瘤緩解之方法，該方法包含對需要誘導之個體投予有效量之組成物，該組成物包含如此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。
在另一態樣中，本發明提供一種檢測、診斷及/或監測與Trop-2表現有關之症狀之方法。舉例來說，此處所述之Trop-2抗體可經可檢測之基團標記，諸如顯影劑及酶-受質標記。此處所述之抗體亦可被用於體內診斷性試驗(例如體內顯影(例如PET或SPECT))或染色試劑。
在一些實施態樣中，此處描述之方法另包含以其他形式之療法治療個體之步驟。在一些實施態樣中，該其他形式之療法係其他抗癌療法，包括但不限於化學療法、放射療法、手術、荷爾蒙療法及/或其他免疫療法。
在一些實施態樣中，該其他形式之療法包含投予一或多種除了此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物以外之治療劑。該等治療劑包括但不限於第二抗體(例如抗VEGF抗體、抗HER2抗體、抗CD25抗體及/或抗CD20抗體)、血管生成抑制劑、細胞毒性劑、抗發炎劑(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、順鉑 (cisplatin)、多柔比星(doxorubicin)、強體松(prednisone)、絲裂黴素(mitomycin)、助孕素、它莫西芬(tamoxifen)或氟尿嘧啶)。
該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物可經由任何適當之途徑對個體投予。該領域之技藝人士應了解的是，此處所描述之實例不應意圖限制而是可用技術之示例。因此在一些實施態樣中，該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物係根據已知方法對個體投予，諸如靜脈內投予例如快速濃注或在一段時間內連續輸注、肌肉內、腹腔內、腦脊髓腔內、顱內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內、經噴入、脊椎鞘內、經口、吸入或局部途徑。投予可為系統性例如靜脈內投予或局部投予。自商業途徑獲得之液體調製劑噴霧器包括噴射噴霧器及超音波噴霧器可用於投予。液體調製劑可經直接噴霧，冷凍乾燥之粉末可在重構後經噴霧投予。或者，該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物可利用氟碳調製劑及定量吸入器加以氣霧化或以經冷凍乾燥及磨細粉末之形式吸入。
在一實施態樣中，該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物係經定點或靶向性局部遞送技術投予。定點或靶向性局部遞送技術之實例包括各種Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之植入式貯劑來源或局部遞送導管，諸如輸注導管、留置導管、或針頭導管、合成性移植物、外膜層包覆、分流器及支架或其他植入式裝置、定點載劑、直接注射或直接施用。見例如PCT公開號WO 00/53211及美國專利第 5,981,568號。
該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之多種調製劑可被用於投予。在一些實施態樣中，該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之多種調製劑可被用於單獨投予。在一些實施態樣中，該Trop-2抗體(或Trop-2抗體共軛物)及醫藥上可接受之賦形劑可能呈多種調製劑。醫藥上可接受之賦形劑係為該領域所知，且係有助於投予藥理有效物質之相對惰性物質。舉例來說，賦形劑可提供外形或稠度，或作為稀釋劑。適當之賦形劑包括但不限於穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於改變滲透性之鹽類、包封劑、緩衝劑及皮膚穿透增進劑。用於非經腸及經腸藥物遞送之賦形劑以及調製劑係闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.Mack Publishing,2000。
在一些實施態樣中，該等劑係經調製為供注射投予(例如腹膜內、靜脈、皮下、肌肉內等)。因此，該等劑可與醫藥上可接受之載劑(諸如鹽水、林格(Ringer)氏液、葡萄糖溶液及該類似物)組合。特定給藥方案(即劑量、時間及重複性)將依特定個體及該個體之醫學病史而定。
此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物可利用任何適當之方法投予，包括注射(例如腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射等)。此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物亦可經吸入投予。通常在投予Trop-2抗體及Trop-2抗體共軛物時，初始候選劑量可為約2毫克/公斤。就本發明之目的而言，典型之每日劑量可根據 上述因子介於自約3微克/公斤至30微克/公斤、至300微克/公斤、至3毫克/公斤、至30毫克/公斤、至100毫克/公斤或至100毫克/公斤以上之任何範圍內。舉例來說，可使用約1毫克/公斤、約2.5毫克/公斤、約5毫克/公斤、約10毫克/公斤及約25毫克/公斤之劑量。視狀況而在數天或更久期間內重複投予時，該治療係持續進行直到發生所欲之症狀抑制或達成足夠之治療量，例如抑制或延緩腫瘤生長/惡化或癌細胞轉移。示範性給藥方案包含投予初始劑量約2毫克/公斤之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物，隨後投予每週約1毫克/公斤之維持劑量或隔週約1毫克/公斤之維持劑量。其他示範性給藥方案包含投予漸增之劑量(例如初始劑量1 mg/kg，逐漸增加至每周或更長期間給予一或多個更高之劑量)。其他給藥方案亦可根據醫師所希望達成之藥物動力學衰減模式使用。舉例來說，在一些實施態樣中，每週投藥一至四次係經考慮。在其他實施態樣中，每月投藥一次或隔月或每三個月投藥一次係經考慮。此治療之進展可藉由習知技術及檢測加以輕易地監測。該給藥方案(包括所使用之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物)可隨時間而異。
就本發明之目的而言，該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之適當劑量將依所採用之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物(或彼等之組成物)、所欲治療之症狀的類型及嚴重性、該劑是否以治療性目的投予、先前治療、該病患之臨床病史及對該劑之反應、該病患清除該經投予之劑之速 率及主治醫師之考量而定。通常醫師將投予Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物直到達到可完成所欲結果之劑量。劑量及/或頻率可依治療療程而異。經驗性考量諸如半衰期通常將影響該劑量之決定。舉例來說，可相容於人免疫系統之抗體諸如人化抗體或全人抗體可被用以延長該抗體之半衰期及防止該抗體被宿主之免疫系統攻擊。投予頻率可在療程當中決定及調整，通常但不一定根據症狀之治療及/或抑制及/或改善及/或延緩，例如腫瘤生長之抑制或延緩等。或者，Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之持續性連續釋放調製劑可為適當。各種用於達成持續釋放之調製劑及裝置係該領域所知。
在一實施態樣中，在已經接受過一或多次Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物投予之個體中，該Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之劑量可能憑經驗決定。個體係經給予漸增劑量之Trop-2抗體或Trop-2抗體拮抗劑。為了評估療效可追蹤疾病之指標。
根據本發明之方法投予Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物可為連續性或間歇性，依例如接受者之生理狀況、該投藥之目的係治療性或預防性及該領域之技藝人士所知之其他因素而定。Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之投予可為實質上連續一段預先決定之時間，或可為一系列間隔劑量。
在一些實施態樣中，可能存在超過一種Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。可能存在至少一種、至少兩種、 至少三種、至少四種、至少五種不同或更多種Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。通常，該等Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物可能具有不會互相不良影響之互補活性。舉例來說，一或多種下列Trop-2抗體可被使用：針對Trop-2上之一種表位之第一Trop-2抗體及針對Trop-2上之不同表位之第二Trop-2抗體。
本發明所使用之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之治療性調製劑係藉由混合具有所欲純度之抗體與可任意選擇之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或安定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed.Mack Publishing,2005)，以製備成供儲存之冷凍乾燥調製劑或水性溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者不具毒性，可能包括例如緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基芐基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨 醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
含有Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之脂質體係藉由該領域已知之方法製備，諸如Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688,1985、Hwang,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030,1980及美國專利第4,485,045及4,544,545號所述。循環時間延長之脂質體係揭露於美國專利第5,013,556號。特別有用之脂質體可利用逆相蒸發方法以包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物產製。脂質體被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。
該活性成分亦可被包封於藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化所製備之微膠囊中例如分別於羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊中、於膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於巨乳化液中。該等技術係揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Mack Publishing,2005。
可能製備持續釋放性製劑。持續釋放製劑之適當實例包括含有該抗體之固相疏水性聚合物之半透性基體，該基體係呈形狀物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基體之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸 酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
欲用於活體內投予之調製劑必須為無菌。此可輕易地藉由例如無菌過濾膜之過濾達成。治療性Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物組成物通常被置放於具有無菌接口之容器中，例如具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
本發明之組成物可呈單位劑量形式，諸如錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、溶液、懸浮液或栓劑，以供口服、非經腸或經直腸投予，或藉由吸入或噴入投予。
為了製備固體組成物諸如錠劑，主要活性成份係與醫藥載劑(例如習用之製錠成分諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠)及其他醫藥稀釋劑(例如水)混合，以形成含有本發明之化合物或彼之非毒性醫藥上可接受之鹽的均質混合物之固體預調製組成物。當提到這些均質之預調製組成物，表示該活性成分係均勻分散於該組成物內，以使該組成物可被輕易地細分為同樣有效之單位劑量形式諸如錠劑、丸劑及膠囊。此固體預調製組成物接著被細分為上述類型之單位劑量形式，其含有自0.1至約500 mg之本發明之活性成 份。該新穎組成物之錠劑或丸劑可經包覆或經其他方式複合以提供具有長效優點之劑型。舉例來說，該錠劑或丸劑可包含內部劑量及外部劑量成分，後者係呈包封前者之形式。該兩種成分可以腸溶層分開，該腸溶層用來抵抗胃中之崩解，以使該內部成分完整通過到達十二指腸或被延遲釋放。多種物質可被用於該腸溶層或包覆層，該等物質包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨臘醇及醋酸纖維素之物質之混合物。
適當之表面活性劑包括特別是非離子性劑，諸如聚氧乙烯去水山梨醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他去水山梨醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。含有表面活性劑之組成物將方便地方包含自0.05至5%之表面活性劑，且可介於0.1至2.5%。將了解若需要的話其他成分可被添加，例如甘露醇或其他醫藥上可接受之載具。
適當之乳液可利用自商業途徑獲得之脂質乳液製備，諸如IntralipidTM 、LiposynTM 、InfonutrolTM 、LipofundinTM 及LipiphysanTM 。該活性成分可被溶解於預先混合之乳液組成物中，或者可被溶解於油中(例如大豆油、紅花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。將瞭解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以調整該乳液之張力。適當之乳液通常將含有最高20%例如介於5至20%之油。該脂肪乳液可包含介於0.1至1.0微米特別是0.1至0.5微米之脂肪液滴，且具有介於5.5 至8.0之pH。
該乳液組成物可為該些藉由混合Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物與IntralipidTM 或彼之成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備者。
用於吸入或噴入之組成物包括在醫藥上可接受之水性或有機溶劑或彼等之混合物中之溶液及懸浮液和粉末。該液體或固體組成物可能包含如前述之適當之醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施態樣中，該組成物係以經口或經鼻呼吸途徑投予以提供局部或系統性效應。在醫藥上可接受之較佳無菌溶劑中之組成物可藉由使用氣體加以噴霧化。經噴霧化之溶液可從噴霧裝置直接吸入，或該霧化裝置可與面罩、帷幕或間歇性正壓呼吸器連接。溶液、懸浮液或粉末組成物可自裝置較佳地經口或經鼻投予，該裝置以適當方式遞送調製劑。
組成物
用於本發明之方法中之組成物包含有效量之此處所討論之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。該等組成物之實例以及如何調製也被描述於較早章節及以下。在一些實施態樣中，該組成物包含一或多種Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物。舉例來說，Trop-2抗體辨識人Trop-2。在一些實施態樣中，該Trop-2抗體係人抗體、人化抗體或嵌合性抗體。在一些實施態樣中，該Trop-2抗體包含能引發所欲之免疫反應(諸如抗體媒介性溶解或ADCC)之恆定 區。在其他實施態樣中，該Trop-2抗體包含不引發非所需或非所欲之免疫反應(諸如抗體媒介性溶解或ADCC)之恆定區。在其他實施態樣中，該Trop-2抗體包含抗體之一或多個CDR(諸如一、二、三、四、五或在一些實施態樣中所有六個CDR)。
應了解該等組成物可包含超過一種Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物(例如辨識Trop-2之不同表位之Trop-2抗體之混合物)。其他示範性組成物包含超過一種辨識相同表位之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物，或與Trop-2之不同表位結合之不同物種的Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物(例如人Trop-2)。
本發明所使用之組成物可另包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑或安定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy 21st Ed.,2005,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)以呈冷凍乾燥調製劑或水性溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者不具毒性，且可能包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基芐基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基 吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。醫藥上可接受之賦形劑另於此處說明。
套組
本發明亦提供用於本方法之套組。本發明之套組包括一或多個含有此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之容器及根據此處所述之本發明之方法中之任一者所使用之說明。通常，該等說明包含投予Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之說明以用於上述之治療性處理。
有關使用如此處所述之Trop-2抗體或Trop-2抗體共軛物之說明通常包括用於該意圖處理之劑量、投藥計畫及投予途徑之資訊。該等容器可為單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組所提供之說明通常為在標籤或包裝仿單上之書面說明(例如包含在套組中之紙)，但機器讀取之說明(例如磁性或光學儲存磁碟上攜帶之說明)亦可被接受。
本發明之套組係經適當包裝。適當之包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、可彎折之包裝(例如密封之美拉(Mylar)或塑膠袋)及該類似物。亦考慮的是與特殊裝置組 合使用之包裝，諸如吸入器、經鼻投予裝置(例如霧化器)或輸注裝置諸如小型泵。套組可能具有無菌接口(例如該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜注溶液袋或小瓶)。該容器也可能具有無菌接口(例如該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜注溶液袋或小瓶)。該組成物中之至少一種活性劑係Trop-2抗體。該容器可能另包含第二醫藥活性劑。
套組可能可任意選擇地提供額外成份諸如緩衝劑及解說資訊。通常，該套組包含容器及在該容器上或與該容器相關之標籤或包裝仿單。
突變及修飾
為了表現本發明之Trop-2抗體，編碼VH及VL區之DNA片段可先利用上述之任何方法獲得。各種修飾例如突變、取代、刪除及/或添加亦可利用該領域之技藝人士所知之標準方法被導入該DNA序列。舉例來說，可利用標準方法誘發突變形成，諸如PCR媒介性突變形成，其中該突變之核苷酸被納入PCR引子以使該PCR產物包含所欲之突變或定點突變形成。
可能被實施之一種取代舉例來說係改變抗體中一或多個半胱胺酸，該等半胱胺酸可能對另一殘基諸如但不限於丙胺酸或絲胺酸具化學反應性。舉例來說，可發生非典型半胱胺酸之取代。該取代可發生於抗體之可變結構域之CDR或架構區或恆定區中。在一些實施態樣中，該半胱胺 酸係典型半胱胺酸。
亦可在抗體之例如重鏈及/或輕鏈之可變結構域進行修飾，以例如改變該抗體之結合特性。舉例來說，可在一或多個CDR區製造突變以增加或降低該抗體對Trop-2之KD 、增加或降低koff 或改變該抗體之結合專一性。定點突變形成之技術係該領域所廣為週知。見例如Sambrook et al.及Ausubel et al.(同上)。
修飾或突變亦可於架構區或恆定區發生以增加Trop-2抗體之半衰期。見例如PCT公開號WO 00/09560。在架構區或恆定區之突變亦可被創造以改變該抗體之免疫原性、提供與另一分子共價或非共價結合之位點或改變像是補體固定、FcR結合及抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性等之特性。根據本發明，單一抗體可能在可變區之任一或多個CDR或架構區或恆定區中具有突變。
在稱為「種系化」之過程中，在VH及VL序列中之某些胺基酸可經突變以符合在種系VH及VL 序列中天然發現之胺基酸。特別是在VH及VL序列之架構區中之胺基酸序列可經突變成種系序列以降低該抗體在投予時之免疫原性風險。人VH及VL基因之種系DNA序列係該領域所知(見例如Vbase人種系序列資料庫；亦見Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publ.No.91-3242；Tomlinson et al.,J.Mol.Biol.227：776-798,1992及Cox et al.,Eur.J. Immunol.24：827-836,1994)。
另一種可能產生之胺基酸取代係移除抗體中潛在之蛋白水解位置。該位置可能出現在抗體可變區之CDR或架構區中或在抗體恆定區中。取代半胱胺酸殘基及移除蛋白水解位置可能降低抗體產物之異質性之風險，因此增加彼之均質性。另一類型之胺基酸取代係消除天冬醯胺酸-甘胺酸對，其藉由改變該等殘基之一或兩者以形成潛在之脫醯胺位置。在另一實例中，本發明之Trop-2抗體之重鏈的C端離胺酸可被切掉。在本發明之各種實施態樣中，Trop-2抗體之重鏈及輕鏈可任意選擇地包括信號序列。
當獲得編碼本發明之VH及VL區段之DNA片段後，可進一步利用標準重組DNA技術操縱該等DNA片段，例如轉換該可變區基因成為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段係可操作地與編碼另一蛋白之另一DNA片段連接，諸如抗體恆定區或可彎折之連接子。在此上下文所使用之用語「可操作地連接」係意圖指涉兩個DNA片段係經連接以使由該兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列維持讀框順序。
編碼VH區之經分離之DNA可藉由可操作地連接編碼該VH之DNA與另一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子以轉換成全長重鏈基因。人重鏈恆定區基因之序列係該領域所知(見例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publ.No.91-3242)且包含該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳的是IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為任何已知發生在不同個體之各種等位基因或同種異型，諸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。該些同種異型代表在IgG1恆定區中天然發生之胺基酸取代。就Fab片段重鏈基因而言，該編碼VH之DNA可與另一僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子可操作地連接。該CH1重鏈恆定區可源自任何重鏈基因。
編碼VL區之經分離之DNA可藉由可操作地連接該編碼VL之DNA與另一編碼輕鏈恆定區(CL)之DNA分子以轉換成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恆定區基因之序列係該領域所知(見例如Kabat,E.A.,et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publ.No.91-3242)且包含該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區序列可為任何已知發生在不同個體之各種等位基因，諸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。該λ恆定區可源自三個λ基因中之任一基因。
為了產製scFv基因，編碼VH及VL之DNA片段係可操作性與另一編碼可彎折連接子之片段連接，例如編碼 胺基酸序列(Gly4 -Ser)3 (SEQ ID NO：80)之片段，以使得該VH及VL序列可被表現為連續單鏈蛋白質，且該VL及VH區藉由可彎折之連接子連接(見例如Bird et al.,1988,Science 242：423-426；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.,1990,Nature 348：552-554)。該單鏈抗體可為單價(若僅使用單一VH及VL)、雙價(若使用二個VH及VL)或多價(若使用超過二個VH及VL)。雙專一性或多價抗體可被產製以與Trop-2及另一分子專一性結合。
在另一實施態樣中，融合抗體或免疫黏附素可被製造，其包含與另一多肽連接之所有或部分之本發明之Trop-2抗體。在另一實施態樣中，僅Trop-2抗體之可變區係與多肽連接。在另一實施態樣中，Trop-2抗體之VH結構域係與第一多肽連接，同時Trop-2抗體之VL結構域係與第二多肽連接，該第二多肽與第一多肽係以使該VH及VL結構域得以彼此交互作用以形成抗原結合部位之方式相連。在另一較佳之實施態樣中，該VH結構域與VL結構域被連接子分開，以使該VH及VL結構域可彼此交互作用。該VH-連接子-VL抗體接著與感興趣之多肽連接。此外，融合抗體可被產製，其中兩個(或多個)單鏈抗體係彼此相連。這可被用於若想在單一多肽鏈上產製雙價或多價抗體或想產製雙專一性抗體。
在其他實施態樣中，其他經修飾之抗體可利用編碼Trop-2抗體之核酸分子產製。舉例來說，「κ抗體」(Ill et al.,Protein Eng.10：949-57,1997)、「迷你抗體」(Martin et al.,EMBO J.,13：5303-9,1994)、「雙價抗體」(Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448,1993)或「傑魯斯抗體」(Traunecker et al.,EMBO J.10：3655-3659,1991 and Traunecker et al.,Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52,1992)可依照本申請案之揭示內容利用標準分子生物技術製備。
雙專一性抗體或抗原結合片段可藉由各種方法產製，包括雜交瘤之融合或連接Fab’片段。見例如Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321,1990及Kostelny et al.,J.Immunol.148：1547-1553,1992。此外，雙專一性抗體可能被形成為「雙價抗體」或「傑魯斯抗體」。在一些實施態樣中，該雙專一性抗體與Trop-2之兩種不同的表位結合。在一些實施態樣中，上述經修飾之抗體係利用源自此處所提供之Trop-2抗體的一或多個可變區或CDR製備。
本發明之代表性材料係於2012年4月26日寄存於美國菌種保存中心(ATCC)。ATCC編號PTA-12872之載體係編碼人化Trop-2抗體重鏈可變區之多核苷酸，ATCC編號PTA-12871之載體係編碼人化Trop-2抗體輕鏈可變區之多核苷酸。該等寄存係根據國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(布達佩斯條約)之規定進行。此確保自寄存日開始30年內維持該寄存物為活的培養物。該寄存物將依照布達佩斯條約之規定由ATCC提供，且將受限於 輝瑞(Pfizer,Inc.)與ATCC之合約，該合約確保當簽發相關美國專利或公開任何美國或外國專利申請案時(以先到者為主)，該寄存物之培養子代可永久且不受限制地供公眾使用，且確保由美國專利商標局局長依據35 U.S.C.122及該局長所依據之法則(包括37 C.F.R.1.14，特別參照886 OG 638)判定有權獲得該子代者之可得性。
本申請案之代理人同意，若該寄存中之材料的培養物在適當條件培養下死亡或遺失或毀損，一經通知應立即以另一相同材料取代該材料。不得將該寄存材料之可得性視為可藉以實施本發明而侵犯由任何政府機關依據該國專利法所授予之權利之許可。
下列實施例僅作為示範之用，無意在任何方面限制本發明之範圍。事實上，除了在此處顯示及說明之修飾之外，本發明之許多修飾將為該領域之技藝人士自前述說明所顯而易見且屬於隨附之權利要求之範圍內。
 實施例1：測定重組抗Trop-2小鼠抗體之抗體結合親和性
產自雜交瘤之抗Trop-2小鼠抗體之親和性係經表面電漿共振測量，使用裝設研究級CM5感測晶片之BiacoreTM 2000或3000生物感測器(BiacoreTM AB,Uppsala,Sweden-現為GE Healthcare)。抗小鼠IgG係偶合於CM5晶片表面之一級胺。多種抗Trop-2小鼠抗體接著藉由抗小鼠IgG捕捉。單體Trop-2胞外域係由木瓜酶消 化Trop-2-Fc融合蛋白製備，然後經3倍連續稀釋以作為注射之分析物。抗Trop-2小鼠抗體之親和性係自7.5至31.8 nM。見表4。
實施例2：重組抗Trop-2小鼠抗體之結構域定位
結構域定位係藉由以Trop-1(EpCAM)或小鼠Trop-2相等區交換Trop-2胞外域進行。見圖4及5。抗Trop-2抗體3E9、6G11、7E6及18B1(經表現為重組小鼠IgG2a)不與人Trop-1或小鼠Trop-2結合，然而15E2與小鼠Trop-2結合但不與人Trop-1結合。該等雜交蛋白質係於293F細胞中表現為人Fc融合蛋白。抗Trop-2抗體與該等結構域雜交物之結合係藉由Biacore測定。當結構域交換導致結合喪失或減少，即定義抗Trop-2抗體辨識某些人Trop-2結構域。抗Trop-2抗體3E9、7E6及15E2與結構域3及4結合，然而抗體6G11及18B1與結構域1結合。見表5。Trop-2之不同結構域之定義可見例如Chong et al.,J.Biol.Chem.276(8)：5804-13,2001。
+ 表示結構域取代導致結合喪失
+/- 表示結構域取代導致結合減少
- 表示結構域取代不影響結合
實施例3：Colo205異種移植模型之體內療效試驗
抗Trop-2小鼠IgG之體內療效試驗係於標靶表現性colo205異種移植模型中進行。一百萬個colo205結腸癌細胞係經皮下植入至5至8週齡之nu/nu小鼠(第0天)。隔天(第1天)依據小鼠體重將其隨機分配至不同治療組(對照IgG、7E6、15E2或18B1組；n=10/組)。20mg/kg之各治療組之抗Trop-2抗體及對照mIgG係經尾靜脈快速濃注投予，每周三次共投予12次。每天測量所有實驗動物之體重變化。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量兩次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。TGI(%腫瘤生長抑制)係由[1-腫瘤體積(治療組)/腫瘤體積(對照組)]x 100決定。表6及圖1顯示抗Trop-2抗體7E6、15E2及18B1抑制Colo205異種移植腫瘤之體內生長。
實施例4：A431異種移植模型之體內療效試驗 a)抗Trop-2抗體7E6、15E2及18B1抑制A431異種移植腫瘤生長
抗Trop-2小鼠IgG之體內療效試驗係於標靶表現性A431異種移植模型中進行。二百萬個A431表皮樣癌細胞係經皮下植入5至8週齡之nu/nu小鼠，直到腫瘤體積到達約100 mm3 。根據腫瘤體積將小鼠隨機分組，經由尾靜脈快速濃注投藥。抗Trop-2抗體係源自293F暫時表現之重組小鼠IgG2a抗體。20mg/kg之抗Trop-2抗體(18B1、15E2及7E6重組mIgG2a)或對照mIgG係經尾靜脈快速濃注投予，每周二次共投予6次。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量兩次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。TGI(%腫瘤生長抑制)係由[1-腫瘤體積(治療組)/腫瘤體積(對照組)]x 100決定。表7A及圖2A顯示抗Trop-2抗體7E6、15E2及18B1抑制A431異種移植腫瘤之體內生長。
b)抗Trop-2抗體7E6於劑量反應試驗中抑制A431異種移植腫瘤生長
使用和實施例4a相同之異種移植模型，不同劑量之抗Trop-2 7E6抗體(5、10及20 mg/kg)或20 mg/kg之對照IgG係經由尾靜脈快速濃注投予，每周兩次共投予6次。表7B及圖2B顯示不同劑量之7E6抑制A431異種移植腫瘤體內生長。
c)抗Trop-2抗體6G11、7E6及18B1抑制A431異種移植腫瘤生長
類似地，20 mg/kg之抗Trop-2抗體(6G11、7E6、 18B1及對照IgG)(皆經重組表現為mIgG2)係經由尾靜脈快速濃注投予，每周一次共投予3次至如實施例4a)所述之A431異種移植模型。表7C及圖2C顯示抗Trop-2抗體6G11、7E6及18B1抑制A431異種移植腫瘤之體內生長。
實施例5：測定人化抗Trop-2抗體7E6之抗體結合親和性
嵌合性及人化抗Trop-2 7E6抗體之親和性係經表面電漿共振測量，使用裝設研究級CM4感測晶片之BiacoreTM T200生物感測器(BiacoreTM AB,Uppsala,Sweden-現為GE Healthcare)。人Trop-2-hFc或長尾獼猴Trop-2-hFc蛋白質被捕捉於經抗人Fc偶合之CM5 EDA晶片37感測表面上。嵌合性及人化7E6重組Fab片段之3倍連續稀釋液係經注射。表8A及8B分別顯示人化抗Trop-2 7E6抗體對人及長尾獼猴Trop-2蛋白質之親和性測量值。
實施例6：測定人化抗Trop-2抗體6G11之抗體結合親和性
人化6G11抗體之親和性係經表面電漿共振測量，使用裝設研究級CM5感測晶片之BiacoreTM 2000生物感測器(BiacoreTM AB,Uppsala,Sweden-現為GE Healthcare)。人Trop-2-mFc蛋白質被捕捉於經抗小鼠Fc偶合之CM5晶片上。人6G11_WT或人6G11_FKG_SF嵌合性Fab片段之3倍連續稀釋液係經注射。表9顯示人化抗Trop-2 6G11抗體對人Trop-2蛋白質之親和性測量值。
實施例7：小鼠及人化抗Trop-2抗體於Trop-2陽性及陰性腫瘤細胞上之流式細胞分析 a)7E6
小鼠嵌合性及人化抗Trop-2 7E6抗體(表現為人IgG1亞型)之結合係藉由流式細胞分析於Trop-2表現性(A431及Colo205)和非表現性(SW620)細胞上測定。以A431細胞染色而言，200,000個細胞係與0.5 ug抗體於100uL結合緩衝液(PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)+0.5% BSA(牛血清白蛋白))中培養，然後與經Dylight488共軛之購自Jackson免疫研究實驗室(West Grove,PA)之山羊抗人(Fab’)2-專一性二級抗體一起培養。以Colo205及SW620細胞而言，300,000個細胞係與1 ug之一級抗體一起培養，然後與經AlexaFluor 647共軛之購自Jackson免疫研究實驗室(West Grove,PA)之抗人(Fab’)2-專一性二級抗體一起培養。表10顯示小鼠7E6及人化7E6抗體與至少約93%之Trop-2陽性腫瘤細胞結合。
b)6G11
與實施例7a)類似，嵌合性小鼠及人化抗Trop-2 6G11抗體(表現為人IgG1亞型)之結合係藉由流式細胞分析於Trop-2表現性(A431及Colo205)和非表現性(SW620)細胞上測定。300,000個細胞係與1 ug之一級抗體一起培養，然後與AlexaFluor 647抗人(Fab’)2-專一性二級抗體培養。表11顯示小鼠6G11及人化6G11抗體與至少約99%之Trop-2陽性腫瘤細胞結合。
實施例8：嵌合性及人化抗Trop-2 7E6 hIgG1抗體對A431細胞之ADCC活性
嵌合性小鼠(h7E6-WT)及人化抗Trop-2 7E6人IgG1抗體(h7E6_SVG(VH區)、h7E6_L(VL區)及h7E6-SVGL(VH及VL區兩者))之ADCC(抗體依賴性細胞毒性)活性係利用cytoTox 96非放射性細胞毒性測試套組(Promega,Madison WI)測定。標靶表現性A431細胞在測試前一天以10,000細胞/孔槽接種。捐贈者PBMC(經冷凍保存之週邊血液單核細胞)係利用Ficoll梯度分離，於37℃、X-VIVO培養基(Lonza,Wakersville,MO)中隔夜培養。該等抗體隔天以圖3所示之濃度被添加至孔槽中，然後添加500,000 PBMC細胞(E：T=50：1)於RPMI+5% FBS(胎牛血清)中。抗EGFR(表皮生長因子受體)抗體(ERBITUX® ,Imclone,Bridgewater,NJ)被用來作為該試驗之陽性對照。孔盤接著於37℃培養4小時。在3.5小時之時間點，添加20 uL之溶胞液至僅含標靶細胞之孔槽。以8000 rpm離心孔盤3分鐘後，取50uL之上清液至另一孔盤。然後添加50ul之受質至各孔槽，於室溫黑暗中培養該孔盤30分鐘。藉由添加50 uL之購自Promega(Madison,WI)之停止溶液至各孔以停止該反應。接著利用分光光度計(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)於490 nm讀取孔盤。專一性溶胞之百分比(%)係利用下式計算：%專一性溶胞=(治療LDH(乳酸去氫酶)釋放-標靶細胞自發性LDH釋放-效應細胞自發性LDH釋放)/(標靶細胞最大LDH釋放-標靶細胞自發性LDH釋放)x 100
圖3顯示嵌合性小鼠及人化抗Trop-2 7E6 IgG1抗體 皆誘導ADCC殺滅A431細胞。
實施例9：抗Trop-2-ADC於Trop-2陽性細胞之細胞毒性
嵌合性小鼠(6G11及7E6)及人化抗Trop-2(h7E6-SVG、h7E6-SVGL及h7E6-SVGN)抗體係如表12所示經表現為經含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶(“Q”)標籤(例如TG1、LCQ03及TG6，彼等分別對應SEQ ID NO：75(LLQGG)、SEQ ID NO：78(GGLLQGA)及SEQ ID NO：79(LLQGA))工程化之人IgG1亞型，且與AcLys-vcMMAD(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-MMAD)、胺基己醯基-vc-PABC-MMAD(胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基-MMAD)或AcLys-vc-PABC-MMAD(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基-MMAD)共軛。在一例中，該轉麩醯胺酶標籤可經工程化於該抗體之輕鏈或重鏈之C端；在另一例中，該轉麩醯胺酶標籤(例如Q)係經工程化於該抗體之另一位置，諸如該人IgG之位置297(卡巴編號法)。舉例來說，在Trop-2抗體位置297之野生型胺基酸天冬醯胺酸(N)係經麩胺醯胺取代(N297Q)。抗Trop-2抗體與MMAD之間接著經由微生物轉麩醯胺酶催化之轉醯胺作用，使得在特定位置攜帶含有麩胺醯胺標籤之抗Trop-2抗體(例如該抗體之重鏈或輕鏈之羧基端或胺基端、位置297或另一位置)與該載荷藥物(例如MMAD)之含胺衍生基達成共軛。在一些態樣中，在羧基端之野生型胺基酸離胺酸(根據卡巴編號之位置447)係經刪除並由Q-標籤取代。 在其他態樣中，在位置222、340或370(根據卡巴編號)之野生型胺基酸離胺酸係經胺基酸精胺酸取代(“K222R”、“K340R”或“K370R”)。舉例來說，我們發現K222R取代具有令人意外之效果，像是導致更同質之抗體與載荷藥物共軛物、較佳之該抗體與載荷藥物間之分子間交聯，及/或顯著減少該抗體輕鏈C端之麩胺醯胺標籤之鏈間交聯。在轉醯胺作用中，該抗體上之麩胺醯胺作為醯基供體，該含胺化合物作為醯基受體(胺供體)。濃度1.67至4.04 μM之經純化之抗Trop-2抗體與20至100 M過量之醯基受體(濃度範圍167至404 μM)在0.225-0.545%(w/v)茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense )轉麩醯胺酶(ACTIVATM ,Ajinomoto,Japan)存在下，一起培養於150至900 mM NaCl之25 mM MES、HEPES[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸]或Tris HCl緩衝液pH 6.2-8.8中。反應條件係根據各種醯基受體衍生基調整，最佳效率及特異性通常見於2.87 μM抗體、287 μM衍生基及0.378%(w/v)轉麩醯胺酶於150 mM NaCl、25 mM Tris HCl pH 8.8中。在室溫中培養2.5小時後，該抗體係利用該領域之技藝人士已知之標準親和性層析法於MabSelect樹脂(GE Healthcare,Waukesha,WI)上純化，諸如GE Healthcare之商用親和性層析。
標靶表現性(A431、BxPC3、CAPAN-2及Colo205)或非表現性(SW620)細胞在治療前24小時以2000細胞/孔槽接種於白壁透明底之孔盤。三份細胞以經4倍連續稀釋之 抗體-藥物共軛物治療。細胞存活性於治療後96小時藉由CellTiter-Glo® 發光細胞存活測試96(Promega,Madison WI)測定。相對細胞存活性係以未治療對照之百分比表示。IC50係藉由Prism軟體計算。表12顯示經由轉麩醯胺酶標籤與MMAD共軛之嵌合性小鼠及人化抗Trop-2 7E6抗體於Trop-2表現性細胞中展現有效之細胞殺滅活性。
實施例10：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於BxPC3異種移植模型中誘導長期腫瘤緩解
對照抗體hIgG1-TG1-vcMMAD(“NNCTG1-vcMMAD”) 及經由轉麩醯胺酶與1)LCQ03-AcLys-vc-PABC-MMAD K222R變異體或2)TG6-AcLys-vc-PABC-MMAD共軛之嵌合性抗Trop-2抗體7E6的體內療效試驗係於標靶表現性BxPC3異種移植模型中進行。以h7E6-K222R-LCQ03-AcLys-vc-PABC-MMAD變異體共軛物而言，該抗Trop-2抗體中根據卡巴編號之位置222的野生型胺基酸離胺酸係經胺基酸精胺酸取代(即K222R)。LCQ03對應SEQ ID NO：78(GGLLQGG)，TG6對應SEQ ID NO：79(LLQGA)。利用轉麩醯胺酶標籤LCQ03及TG6共軛Trop-2抗體之一般方法係於實施例9描述。二百萬個BxPC3癌細胞係經皮下植入5至8週齡CB17 SCID小鼠，直到腫瘤體積到達約250 mm3 。根據腫瘤體積將小鼠隨機分組，經由尾靜脈快速濃注投藥。3 mg/kg之對照hIgG1、嵌合性h7E6-K222R-LCQ03-AcLys-vc-PABC-MMAD變異體或嵌合性7E6-TG6-AcLys-vc-PABC-MMAD係經由尾靜脈快速濃注共投予一次。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2)/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。單一劑量之與AcLys-vc-PABC-MMAD共軛之嵌合性抗Trop-2抗體7E6導致長期腫瘤緩解。見圖8。
實施例11：抗Trop-2-ADC於Trop-2陽性細胞之細胞毒性
陰性對照(NNC)及人化抗Trop-2(h7E6SVG)抗體係如所示之經表現為在該重鏈C端(TG6(SEQ ID NO：79))、該 輕鏈C端(LCQ03(SEQ ID NO：78)及LCQ04(SEQ ID NO：79))或在重鏈之CH2/絞鏈區具有N297Q/K222R突變之經含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤工程化之人IgG1亞型，且與AcLys-vc-PABC-0101(“vc0101”或乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基-(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R, 4S, 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R, 2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-羰基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺))或胺基己醯基-PEG6(丙二醇)6 -丙醯基)-MMAD共軛。2-甲基丙胺醯基-N -[(3R, 4S, 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R, 2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-羰基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺係新穎之耳抑素，如美國專利申請案61/561,255及61/676,423中所述。利用轉麩醯胺酶標籤共軛Trop-2抗體之方法係於實施例9描述。標靶表現性或非表現性(SW620)細胞在治療前24小時以每孔2000個(A431、BxPC3、NCI-H292、NCI-H1650、MDA-MB-468及SW620)、2500個(Calu-3)或3000個(OVCAR3及SKBR3)細胞接種於白壁透明底之孔盤。三份細胞以經4倍連續稀釋之抗體-藥物共軛物治療。細胞存活性於治療後96小時藉由CellTiter-Glo® 發光細胞存活測試96(Promega,Madison,WI)測定。相對細胞存活性係以未治療對照之百分比表示。IC50係藉由GraphPad Prism 5軟體計算，並以總Ab之濃度(nM)表示。表13顯示經由轉麩 醯胺酶標籤與vc0101或PEG6-MMAD共軛之人化抗Trop-2 7E6抗體於Trop-2表現性細胞中展現有效之細胞殺滅活性。
實施例12：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於胰腫瘤BxPC3異種移植模型中誘導腫瘤緩解
Trop-2 ADC之體內療效試驗係於標靶表現性BxPC3異種移植模型中進行。二百萬個BxPC3胰癌細胞係經皮下植入5至8週齡CB17/SCID小鼠，直到腫瘤體積到達介於300至400 mm3 。小鼠根據腫瘤體積隨機分組，單一劑量之與1)TG6-AcLys-vc-PABC-0101(等於圖9A中之TG6-AcLys-vc-0101)、2)N297Q/K222R-PEG6-MMAD((丙二醇)6 - 丙醯基-MMAD)及3)LCQ04-K222R-vc-PABC0101(等於圖9C中之LCQ04/K222R-vc0101；LCQ04對應SEQ ID NO：79(LLQGA))共軛之人化抗Trop-2抗體及對照共軛物係經尾靜脈快速濃注投予。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。圖9A至9C顯示單一劑量之與1)TG6-AcLys-vc-PABC-0101、2)N297Q/K222R-PEG6-MMAD及3)LCQ04-K222R-vc-PABC0101共軛之人化抗Trop2抗體導致胰腫瘤BxPC3異種移植模型中之腫瘤緩解。
實施例13：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於結直腸腫瘤Colo205異種移植模型中誘導腫瘤緩解
Trop-2 ADC之體內療效試驗係於標靶表現性colo205異種移植模型中進行。三百萬個colo205結腸癌細胞係經皮下植入5至8週齡之nu/nu小鼠，直到腫瘤體積到達約300 mm3 。小鼠根據腫瘤體積隨機分組，單一劑量6mg/kg之與1)TG6-AcLys-vc-PABC-0101(等於圖10中之TG6-vc-0101)及2)在重鏈之絞鏈/CH2區具有K222R取代之LCQ03-vc-PABC-0101(等於圖10中之LCQ03/K222R-vc0101；LCQ03對應SEQ ID NO：78(GGLLQGG))共軛之人化抗Trop-2抗體及對照共軛物(IgG-vc-PABC-0101)係經尾靜脈快速濃注投予。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。 試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。圖10顯示單一劑量之與1)TG6-AcLys-vc-PABC-0101及2)在重鏈之絞鏈/CH2區具有K222R取代之LCQ03-vc-PABC-0101共軛之人化抗Trop-2抗體於結直腸腫瘤Colo205異種移植模型中導致腫瘤緩解。
實施例14：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於卵巢PDX Ova196756異種移植模型中誘導腫瘤緩解
使用與TG6-vc-0101共軛之人化抗Trop2抗體(h7E6SVG)之Trop-2 ADC之體內療效試驗係於標靶表現性卵巢癌病患衍生性異種移植模型(PDX Ova196756)中進行。此腫瘤樣本係源自手術檢體並於NSG小鼠體內增殖(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)。在療效試驗中，大約1-2 mm3 之腫瘤碎片係經皮下植入CB17/SCID小鼠之側腹。當腫瘤體積達到約400 mm3 時將小鼠隨機分組，單劑之h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101(0.75 mg/kg及1.5 mg/kg；相當於圖11所示之TG6-vc0101)及對照共軛物(1.5 mg/kg；如圖11所示之IgG-vc-PABC-0101或IgG-vc0101)係經尾靜脈快速濃注投予。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。圖11顯示單次劑量之與TG6-AcLys-vc-PABC-0101共軛之人化抗Trop2抗體於卵巢PDX Ova196756異種移植模型中誘導腫瘤緩解。
實施例15：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於Pan0146胰PDX模型中相較於吉西他濱(Gemcitabine)顯示優異之誘導腫瘤緩解之療效
使用與TG6-vc0101共軛之人化抗Trop-2抗體(h7E6SVG)之Trop-2 ADC之體內療效試驗係於購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine)之標靶表現性胰癌病患衍生性異種移植模型(PDX Pan0146)中進行。在療效試驗中，1-2 mm3 之腫瘤碎片係經皮下植入小鼠之側腹。當腫瘤體積達到約300 mm3 時將小鼠隨機分組，h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101及對照共軛物係經尾靜脈快速濃注投予。圖12A：單劑之h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101(在圖中顯示為h7E6SVG-TG6-vc0101)及對照共軛物係按所示劑量投予。吉西他濱係以75 mg/kg每週投予二次，共投予6次。圖12B：h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101係以每周一次0.75 mg/kg共投予4次，每二周一次1.5 mg/kg共投予二次，或單次投予3.0 mg/kg。吉西他濱係以75 mg/kg每周投予一次共投4次。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。該等資料顯示與TG6-AcLys-vc-PABC-0101共軛之人化抗Trop-2抗體於Pan0146胰PDX模型中相較於吉西他濱具有優異之誘導腫瘤緩解之療效，且繼續投予h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101導致胰 PDX Pan0146異種移植模型中之持續腫瘤緩解。
實施例16：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於胰Pan144607 PDX模型中誘導腫瘤緩解
使用與vc0101或PEG6MMAD共軛之人化抗Trop-2抗體(h7E6SVG)之Trop-2 ADC之體內療效試驗係於標靶表現性胰癌病患衍生性異種移植模型(PDX Pan144607)中進行。此腫瘤樣本係源自手術檢體並於NSG小鼠體內增殖(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)。在療效試驗中，大約1-2 mm3 之腫瘤碎片係經皮下植入CB17/SCID小鼠之側腹。當腫瘤體積達到約300 mm3 時將小鼠隨機分組，單劑1.5、3.0及6.0 mg/kg之h7E6SVG-N297Q/K222R-PEG6MMAD及對照共軛物係經尾靜脈快速濃注投予。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。圖13顯示單次劑量之與PEG6-MMAD共軛之人化抗Trop2抗體於胰Pan144607 PDX模型中導致腫瘤緩解。
實施例17：抗Trop-2 7E6耳抑素共軛物於胰Pan0135 PDX模型中誘導腫瘤緩解
使用與PEG6MMAD共軛之人化抗Trop-2抗體(h7E6SVG)之Trop-2 ADC之體內療效試驗係於購自Jackson Laboratories之標靶表現性胰癌病患衍生性異種移 植模型(PDX Pan0135)中進行。在療效試驗中，大約1-2 mm3 之腫瘤碎片係經皮下植入小鼠之側腹。當腫瘤體積達到約300 mm3 時將小鼠隨機分組，6mg/kg之h7E6SVG-N297Q/K222R-PEG6MMAD及對照共軛物係以單次劑量經尾靜脈快速濃注投予。腫瘤體積係藉由卡尺每周測量一次，並利用下式計算：腫瘤體積=(長度x寬度2 )/2。試驗在腫瘤體積到達2000 mm3 之前終止。圖14顯示單次劑量之與PEG6-MMAD共軛之人化抗Trop2抗體於胰Pan0135 PDX模型中導致腫瘤緩解。
實施例18：測定人化抗Trop-2抗體之抗體結合親和性
Fab/人Trop2-ECD(胞外域)之交互反應分析係利用裝設有GLC感測晶片之Bio-Rad Proteon XPR36表面電漿共振(SPR)生物感測器(Bio-Rad,Hercules,CA)進行。測試溫度係25℃，測試緩衝液係10 mM磷酸鈉、150 mM NaCl、0.05% Tween-20 pH 7.4。一系列與胺偶合之Fab係利用Abdiche et al.(Anal.Biochem.,411：139-151(2011))所述之方法製備。在每個分析週期中，單價人Trop2-ECD抗原係以30 μL/min之流速流過經固定之Fab達3分鐘，然後以緩衝液清洗15分鐘以監測該Fab/Trop2複合體之解離。感測晶片表面在分析週期之間係經再生，利用三次18秒注射Pierce IgG洗脫液：4 M NaCl(Pierce,Rockford,IL)之2：1(體積)混合物。結合及再生週期係重複於6、30及150 nM之人Trop2-ECD濃度。該得到之資料使用蛋白 質評估軟體被導入1：1蘭繆爾(Langmuir)結合模型。結果顯示於下表。
雖然本發明之揭示內容已藉由各種應用、方法、套組及組成物加以說明，應了解可進行各種改變及修飾而不背離此處之揭示內容及以下之申請專利範圍。前述之實施例係為了更清楚地說明本發明之揭示內容而提供，並無意限制本發明之範圍。雖然本發明已藉由該等示範性實施態樣說明，該領域之技藝人士將輕易了解可能針對該等示範性實施態樣進行許多變異及修飾而無須過度實驗。所有該等變異及修飾皆包含在本揭示發明之範圍內。
此處之引證文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及該類似文獻)以及該等文獻中所引證之文獻若未經本發明參照，則以參照方式整體納入此處。若一或多篇該等納入文獻及類似材料與本申請案有不同或衝突之處，包 括但不限於經定義之用語、用語之使用、經描述之技術或該類似物，以本申請案為主。
前述之詳細說明及實施方式詳細描述本發明之某些特定實施態樣，並說明發明人所考慮之最佳模式。然而應了解的是，不論前述內容說明得多詳細，本發明可以許多方式實施，且應根據該隨附之申請專利範圍及彼等之任何相等範圍被解讀。
圖1說明各種Trop-2小鼠抗體(7E6、15E2及18B1)於標靶表現性Colo205異種移植模型之體內療效試驗。
圖2A說明各種Trop-2小鼠抗體(7E6、15E2及18B1)於標靶表現性A431異種移植模型之體內療效試驗。
圖2B說明Trop-2抗體7E6於劑量反應試驗中抑制A431異種移植腫瘤生長。
圖2C說明Trop-2抗體6G11、7E6及18B1於A431異種移植模型中抑制A431異種移植腫瘤生長。
圖3說明嵌合性及人化Trop-2 7E6抗體於A431細胞之ADCC活性。7E6對應嵌合性Trop-2 7E6抗體(例如包含SEQ ID NO：2及3之抗體)，h7E6-WT對應包含SEQ ID NO：4及3之抗體，h7E6-SVG對應包含SEQ ID NO：5及3之抗體，h7E6-L對應包含SEQ ID NO：4及6之抗體，h7E6-SVGL對應包含SEQ ID NO：5及6之抗體及抗EGFR(表皮生長因子受體)對應陽性對照抗體。
圖4說明人Trop-1(SEQ ID NO：29)、人Trop-2(SEQ ID NO：27)及一致序列(SEQ ID NO：69)之胺基酸序列排比。
圖5說明人Trop-2(SEQ ID NO：27)、小鼠Trop-2(SEQ ID NO：28)及一致序列(SEQ ID NO：70)之胺基酸序列排比。
圖6A說明Trop-2抗體h7E6之重鏈可變區(SEQ ID NO：4)、h7E6_SVG之重鏈可變區(SEQ ID NO：5)、m7E6之重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及彼等之一致序列(SEQ ID NO：71)的胺基酸序列排比。
圖6B說明Trop-2抗體h7E6_VL之輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)、h7E6_VL_L之輕鏈可變區(SEQ ID NO：6)、h7E6_VL_N之輕鏈可變區(SEQ ID NO：7)、m7E6_VL之輕鏈可變區(SEQ ID NO：1)及彼等之一致序列(SEQ ID NO：72)的胺基酸序列排比。
圖7A說明Trop-2抗體h6G11之重鏈可變區(SEQ ID NO：11)、h6G11_FKG_SF之重鏈可變區(SEQ ID NO：13)、m6G11之重鏈可變區(SEQ ID NO：9)及彼等之一致序列(SEQ ID NO：73)的胺基酸序列排比。
圖7B說明Trop-2抗體h6G11之輕鏈可變區(SEQ ID NO：10)、h6G11_FKG_SF之輕鏈可變區(SEQ ID NO：12)、m6G11之輕鏈可變區(SEQ ID NO：8)及彼等之一致序列(SEQ ID NO：74)的胺基酸序列排比。
圖8說明與AcLys-vc-PABC-MMAD共軛之嵌合性 (7E6)Trop-2抗體於BxPC3異種移植模型中誘導長期腫瘤緩解。AcLys-vc-PABC-MMAD對應乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基-一甲基耳抑素D。LCQ03及TG6分別對應含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤SEQ ID NO：78及79。NNC-TG1-vcMMAD代表與含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤(SEQ ID NO：75)及vcMMAD共軛之對照抗體。
圖9A說明與vc0101共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於胰腫瘤BxPC3異種移植模型中誘導腫瘤緩解。Vc0101對應AcLys-vc-PABC-0101(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基-(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R, 4S, 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R, 2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-羰基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)。TG6對應含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤SEQ ID NO：79。
圖9B說明在位置297及222具有胺基酸取代且與PEG6-MMAD共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於胰腫瘤BxPC3異種移植模型中誘導腫瘤緩解。PEG6-MMAD對應(丙二醇)6 -丙醯基-MMAD。
圖9C說明在位置222具有胺基酸取代且與vc0101共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於胰腫瘤BxPC3異種移植模型中誘導腫瘤緩解。LCQ04對應含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤SEQ ID NO：79。vc0101對應AcLys-vc-PABC- 0101。
圖10說明與vc0101共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於結直腸腫瘤Colo205異種移植模型中誘導腫瘤緩解。TG6及LCQ03分別對應含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤SEQ ID NO：79及78。
圖11說明與vc0101共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於卵巢PDX Ova196756異種移植模型中誘導腫瘤緩解。TG6對應含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤SEQ ID NO：79。
圖12A顯示與vc0101共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於Pan0146胰PDX模型中相較於吉西他濱(gemcitabine)具有較佳之誘導腫瘤緩解之療效。TG6對應含有麩胺醯胺之轉麩醯胺酶標籤SEQ ID NO：79(與圖12B相同)。
圖12B顯示連續投予與vc0101共軛之人化(h7E6SVG)Trop-2抗體於胰PDX Pan0146異種移植模型中導致持續腫瘤緩解。
圖13顯示單一劑量之與PEG6-MMAD共軛之人化抗Trop2抗體於胰Pan144607 PDX模型中誘導腫瘤緩解。
圖14顯示單一劑量之與PEG6-MMAD共軛之人化抗Trop2抗體於胰Pan0135 PDX模型中誘導腫瘤緩解。
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為Y或F
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
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<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成性建構體
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成性建構體
<400> 60
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<220>
<223> 合成性建構體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
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<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
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<223> Xaa可為G、L或N
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為Q或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為N或F
<400> 64
<210> 65
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 65
<210> 66
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 66
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<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
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<210> 68
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為A或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<223> Xaa可為T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為Q或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> Xaa可為N或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為K或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為S或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為R或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> Xaa可為A或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa可為K或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa可為R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa可為S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa可為G或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(89)
<223> Xaa可為Q或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(90)
<223> Xaa可為N或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (101)..(101)
<223> Xaa可為E或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (102)..(102)
<223> Xaa可為S或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (104)..(104)
<223> Xaa可為L或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為G或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為T或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為T或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為R或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為E或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為P或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (159)..(159)
<223> Xaa可為D或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (161)..(161)
<223> Xaa可為K或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為S或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa可為R或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (165)..(165)
<223> Xaa可為T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (166)..(166)
<223> Xaa可為A或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (168)..(168)
<223> Xaa可為Q或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (170)..(170)
<223> Xaa可為E或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(171)
<223> Xaa可為I或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (172)..(172)
<223> Xaa可為T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (173)..(173)
<223> Xaa可為T或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (176)..(176)
<223> Xaa可為Q或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (178)..(178)
<223> Xaa可為D或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (183)..(183)
<223> Xaa可為T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (186)..(186)
<223> Xaa可為L或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (190)..(190)
<223> Xaa可為N或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (191)..(191)
<223> Xaa可為V或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (193)..(193)
<223> Xaa可為T或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (197)..(197)
<223> Xaa可為V或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (204)..(204)
<223> Xaa可為T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (205)..(205)
<223> Xaa可為Q或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (206)..(206)
<223> Xaa可為N或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (213)..(213)
<223> Xaa可為V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (228)..(228)
<223> Xaa可為H或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (229)..(229)
<223> Xaa可為S或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (231)..(231)
<223> Xaa可為K或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (232)..(232)
<223> Xaa可為G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (236)..(236)
<223> Xaa可為T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (238)..(238)
<223> Xaa可為N或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(241)
<223> Xaa可為Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (242)..(242)
<223> Xaa可為L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (243)..(243)
<223> Xaa可為D或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (245)..(245)
<223> Xaa可為D或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (246)..(246)
<223> Xaa可為P或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (247)..(247)
<223> Xaa可為G或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(248)
<223> Xaa可為Q或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (257)..(257)
<223> Xaa可為K或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (258)..(258)
<223> Xaa可為A或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (260)..(260)
<223> Xaa可為E或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (264)..(264)
<223> Xaa可為Q或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (265)..(265)
<223> Xaa可為G或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (267)..(267)
<223> Xaa可為K或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (286)..(267)
<223> Xaa可為K或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (286)..(286)
<223> Xaa可為V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (292)..(292)
<223> Xaa可為R或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> Xaa可為M或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (300)..(300)
<223> Xaa可為E或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (302)..(302)
<223> Xaa可為A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (311)..(311)
<223> Xaa可為H或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (314)..(314)
<223> Xaa可為L或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (315)..(315)
<223> Xaa可為N或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (316)..(316)
<223> Xaa可為A或L
<400> 69
<210> 70
<211> 323
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為P或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為G或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可為P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可為P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可為L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa可為R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa可為L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可為P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Xaa可為A或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa可為V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> Xaa可為G或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可為H或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa可為T或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可為A或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可為D或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa可為S或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa可為P或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa可為D或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可為R或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> Xaa可為G或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> Xaa可為A或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa可為P或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> Xaa可為N或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa可為R或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(110)
<223> Xaa可為P或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (111)..(111)
<223> Xaa可為E或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (141)..(141)
<223> Xaa可為L或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (164)..(164)
<223> Xaa可為A或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (165)..(165)
<223> Xaa可為G或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (181)..(181)
<223> Xaa可為R或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (189)..(189)
<223> Xaa可為K或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (198)..(198)
<223> Xaa可為Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (209)..(209)
<223> Xaa可為T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (214)..(214)
<223> Xaa可為A或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (214)..(214)
<223> Xaa可為A或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (215)..(215)
<223> Xaa可為G或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (237)..(237)
<223> Xaa可為Q或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (240)..(240)
<223> Xaa可為G或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (245)..(245)
<223> Xaa可為R或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (252)..(252)
<223> Xaa可為Q或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (264)..(264)
<223> Xaa可為I或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (267)..(267)
<223> Xaa可為K或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (282)..(282)
<223> Xaa可為V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (285)..(285)
<223> Xaa可為V或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (293)..(293)
<223> Xaa可為A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (299)..(299)
<223> Xaa可為N或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (319)..(319)
<223> Xaa可為K或S
<400> 70
<210> 71
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 71
<210> 72
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 72
<210> 73
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 73
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 74
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 75
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為F或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為T或S
<400> 76
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為T或S
<400> 77
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 78
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 79
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 80
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 81
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> Xaa
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為M或E
<220>
<221> Xaa
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為E或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為M或E
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<400> 83
<210> 84
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(99)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<400> 84
<210> 85
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(99)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> Xaa可為M或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> Xaa可為E或M
<400> 85
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<400> 86
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可為E或M
<400> 87
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為A、G、P或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為A、G、K、P或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為G、K或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為K或不存在
<400> 88
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸或不存在
<400> 89
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 90
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 91
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 92
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 93
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 94
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 95
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 96
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 97
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 98
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 99
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 100
<210> 101
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(99)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
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<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
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<210> 102
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<213> 人工序列
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (99)..(99)
<223> Xaa可為任何天然發生之胺基酸
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<222> (106)..(106)
<223> Xaa可為E或M
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<223> 合成性建構體
<400> 130

Claims (38)

  1. 一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與營養層細胞表面抗原2(Trop-2)專一性結合，其中該抗體包含(a)重鏈可變區(VH)，其包含(i)VH互補決定區1(CDR1)，其包含序列SYGVH(SEQ ID NO：30)、GGSISSY(SEQ ID NO：36)或GGSISSYGVH(SEQ ID NO：37)；(ii)VH CDR2，其包含序列VIWTX1 GX2 TDYNSALMX3 ，其中X1 係G或S；X2 係S或V；X3 係S或G(SEQID NO：49)，或WTX1 GX2 ，其中X1 係G或S，X2 係S或V(SEQ ID NO：50)；及(iii)VH CDR3，其包含序列DGDYDRYTMDY(SEQ ID NO：35)；及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含(i)VL CDR1，其包含序列RASKSVSTSX1 YSYMH，其中X1 係G、L或N(SEQ ID NO：63)；(ii)VL CDR2，其包含序列LASNLES(SEQ ID NO：55)；及(iii)VL CDR3，其包含序列QHSRELPYT(SEQ ID NO：56)。
  2. 一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包含：VH區，其包含如SEQ ID NO：4或5所示之VH序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及VL區，其包含如SEQ ID NO：3、6或7所示之VL序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
  3. 如申請專利範圍第2項之抗體或抗原結合片段，其中該VH區包含(i)VH CDR1，其包含序列SYGVH(SEQ ID NO：30)、GGSISSY(SEQ ID NO：36)或GGSISSYGVH(SEQ ID NO：37)；(ii)VH CDR2，其包含序列VIWTSGVTDYNSALMG(SEQ ID NO：38)或WTSGV(SEQ ID NO：39)；及(iii)VH CDR3，其包含序列DGDYDRYTMDY(SEQ ID NO：35)，且其中該VL區包含(i)VL CDR1，其包含序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO：54)；(ii)VL CDR2，其包含序列LASNLES(SEQ ID NO：55)；及(iii)VL CDR3，其包含序列QHSRELPYT(SEQ ID NO：56)。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗體或抗原結合片段，其中該VH區包含如SEQ ID NO：5或在非CDR內之殘基經一或多個保守性胺基酸取代之變異體所示之序列，且該VL區包含如SEQ ID NO：3或彼在非CDR內之胺基酸經一或多個胺基酸取代之變異體所示之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第4項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含如SEQ ID NO：66所示之序列，且該重鏈包含如SEQ ID NO：65所示之序列。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其藉由表面電漿共振所測量之約0.25nM或小於0.25nM之單價抗體結合親和性(KD )與人Trop-2(SEQ ID NO：27)之結構域3及結構域4專一性結合。
  7. 一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包含： (a)重鏈可變區(VH)，其包含(i)VH互補決定區1(CDR1)，其包含序列SYWIN(SEQ ID NO：40)、GYTFTSY(SEQ ID NO：41)或GYTFTSYWIN(SEQ ID NO：42)；(ii)VH CDR2，其包含序列NIX1 PSDSYSNYNX2 KFKD，其中X1 係Y或F；X2 係Q或K(SEQ ID NO：51)，或X1 PSDSY，其中X1 係Y或F(SEQ ID NO：52)；及(iii)VH CDR3，其包含序列GSX1 FDY，其中X1 係S或G(SEQ ID NO：53)；及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含(i)VL CDR1，其包含序列RASQTIGTSIH(SEQ ID NO：59)；(ii)VL CDR2，其包含序列YASESIS(SEQ ID NO：60)；及(iii)VL CDR3，其包含序列X1 QSX2 SWPFT，其中X1 係Q或S；X2 係N或F(SEQ ID NO：64)。
  8. 一種經分離之抗體或彼之抗原結合片段，其與Trop-2專一性結合，其中該抗體包含：VH區，其包含如SEQ ID NO：13所示之VH序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及VL區，其包含如SEQ ID NO：12所示之VL序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
  9. 如申請專利範圍第8項之抗體或抗原結合片段，其中該VH區包含(i)VH CDR1，其包含序列SYWIN(SEQ ID NO：40)、GYTFTSY(SEQ ID NO：41)或GYTFTSYWIN(SEQ ID NO：42)；(ii)VH CDR2，其包含序列NIFPSDSYSNYNKKFKD(SEQ ID NO：46)或FPSDSY(SEQ ID NO：47)；及(iii)VH CDR3，其包含序列GSGFDY (SEQ ID NO：48)，且其中該VL區包含(i)VL CDR1，其包含序列RASQTIGTSIH(SEQ ID NO：59)；(ii)VL CDR2，其包含序列YASESIS(SEQ ID NO：60)；及(iii)VL CDR3，其包含序列SQSFSWPFT(SEQ ID NO：62)。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗體或抗原結合片段，其中該VH區包含如SEQ ID NO：13或在非CDR內之殘基經一或多個保守性胺基酸取代之變異體所示之序列，且該VL區包含如SEQ ID NO：12或彼在非CDR內之胺基酸經一或多個胺基酸取代之變異體所示之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第10項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈包含如SEQ ID NO：68所示之序列，且該重鏈包含如SEQ ID NO：67所示之序列。
  12. 如申請專利範圍第7項之抗體，其中該抗體具有藉由表面電漿共振所測量之約0.6nM或小於0.6nM之單價抗體結合親和性(KD )。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體，其中該抗體包含在特定位置經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤。
  14. 如申請專利範圍第13項之抗體，其中該標籤包含胺基酸序列GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ ID NO：79)或LLQ。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體，其中該抗體另包含在位置K222、K340或K370之胺基酸修飾。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗體，其中該胺基酸修飾係將離胺酸取代成精胺酸。
  17. 一種如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體或抗原結合片段之共軛物，其中該抗體或抗原結合片段係與劑共軛，其中該劑係選自細胞毒性劑、免疫調節劑、顯影劑、治療性蛋白質、生物聚合物或寡核苷酸。
  18. 如申請專利範圍第17項之共軛物，其中該劑係細胞毒性劑。
  19. 如申請專利範圍第18項之共軛物，其中該細胞毒性劑係MMAD(一甲基耳抑素D)或0101(2-甲基丙胺醯基-N -[(3R, 4S, 5S )-3-甲氧基-1-{(2S )-2-[(1R, 2R )-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S )-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N -甲基-L-纈胺醯胺)。
  20. 如申請專利範圍第19項之共軛物，其中該共軛物包含下式：抗體-(含有麩胺醯胺之醯基供體標籤)-(連接子)-(細胞毒性劑)。
  21. 如申請專利範圍第20項之共軛物，其中該含有麩胺醯胺之醯基供體標籤包含胺基酸序列GGLLQGG(SEQ ID NO：78)、LLQGA(SEQ NO：79)、LLQ或LLQX1 X2 X3 X4 X5 ，其中X1 係G或P，其中X2 係A、G、P或不存在，其中X3 係A、G、K、P或不存在，其中X4 係G、K或不存在且其中X5 係K或不存在(SEQ ID NO：88)，且其中該連接子包含乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸- 對胺基苯甲氧基羰基或胺基-PEG6-丙醯基。
  22. 如申請專利範圍第21項之共軛物，其中該共軛物係選自1)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；2)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；3)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-(AcLys-VC-PABC)-0101；4)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；5)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-(AcLys-VC-PABC)-0101；或6)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
  23. 如申請專利範圍第22項之共軛物，其中該共軛物1)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-(AcLys-VC-PABC)-0101；2)抗體-GGLLQGG(SEQ ID NO：78)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；3)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-(AcLys-VC-PABC)-0101；4)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；5)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-(AcLys-VC-PABC)-0101；或6)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-AcLys-VC-PABC-MMAD包含位置222之離胺酸取代成精胺酸之胺基酸取代。
  24. 如申請專利範圍第22項之共軛物，其中該共軛物係1)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-(AcLys-VC-PABC)-0101；2)抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-AcLys-VC-PABC-MMAD；3)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-(AcLys-VC-PABC)-0101；或4)抗體-LLQX1 X2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO：88)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD，其中在該抗體重鏈之C端的胺基酸離胺酸係經刪除。
  25. 如申請專利範圍第19項之共軛物，其中該共軛物包含在位置N297Q及K222R之胺基酸取代、包含胺基-PEG6-丙醯基之連接子、及包含MMAD之細胞毒性劑。
  26. 一種醫藥組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體或如申請專利範圍第17至25項中任一項之共軛物及醫藥上可接受之載劑。
  27. 一種經分離之多核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體的核苷酸序列。
  28. 一種載體，其包含如申請專利範圍第27項之多核苷酸。
  29. 一種經分離之宿主細胞，其重組產製如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體。
  30. 一種產製抗體之方法，其包含在導致產製該抗體之條件下培養如申請專利範圍第29項之宿主細胞，及自該宿主細胞或培養物分離該抗體。
  31. 一種如申請專利範圍第26項之醫藥組成物於製備供治療個體之與Trop-2表現有關之症狀的藥物之用途。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該症狀係癌。
  33. 如申請專利範圍第32項之用途，其中該癌係選自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、腎癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰癌、前列腺癌或皮膚癌。
  34. 一種如申請專利範圍第26項之醫藥組成物於製備供抑制患有Trop-2表現腫瘤之個體的腫瘤生長或惡化之藥物之用途。
  35. 一種如申請專利範圍第26項之醫藥組成物於製備供抑制個體之Trop-2表現癌細胞之轉移的藥物之用途。
  36. 一種如申請專利範圍第26項之醫藥組成物於製備供誘導患有Trop-2表現腫瘤之個體的腫瘤緩解之藥物之用途。
  37. 如申請專利範圍第19項之共軛物，其中該共軛物係抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-(AcLys-VC-PABC)-0101，其中該共軛物包含該抗體之位置222之離胺酸取代成精胺酸之胺基酸取代，且其中在該抗體重鏈之C端的胺基酸離胺酸係經刪除。
  38. 一種抗體-藥物共軛物，其與營養層細胞表面抗原2(Trop-2)專一性結合，其中該共軛物係抗體-LLQGA(SEQ ID NO：79)-(AcLys-VC-PABC)-0101，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH區包含(i)VH互補決定區1(CDR1)，其包含序列SYGVH(SEQ ID NO：30)、GGSISSY(SEQ ID NO：36)或GGSISSYGVH(SEQ ID NO：37)；(ii)VH CDR2，其包含序列VIWTSGVTDYNSALMG(SEQ ID NO：38)或WTSGV(SEQ ID NO：39)；及(iii)VH CDR3，其包含序列DGDYDRYTMDY(SEQ ID NO：35)，且其中該VL區包含(i)VL CDR1，其包含序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO：54)；(ii)VL CDR2，其包含序列LASNLES(SEQ ID NO：55)；及(iii)VL CDR3，其包含序列QHSRELPYT(SEQ ID NO：56)，其中該共軛物包含該抗體之位置222之離胺酸取代成精胺酸之胺基酸取代，且其中在該抗體重鏈之C端的胺基酸離胺酸係經刪除。
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