MXPA04005717A

MXPA04005717A - Sistema de expresion.

Info

Publication number: MXPA04005717A
Application number: MXPA04005717A
Authority: MX
Inventors: Carl Frye Christopher
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2005-06-03
Also published as: JP2006502691A; US20050009029A1; CA2467505A1; BR0214542A; EP1456349A2; WO2003050240A3; WO2003050240A2; CN1604960A; AU2002348205A1; EP1456349A4

Abstract

La presente invencion proporciona un sistema de expresion para producir una proteina objetivo en una celula huesped, que comprende un gen homologamente integrado que codifica polimerasa de ARN T7, y un gen no integrado que codifica una proteina objetivo.

Description

SISTEMA DE EXPRESION La presente invención se refiere a una novedosa célula huésped útil en un sistema de expresión para producir proteínas objetivo. Muchos sistemas de expresión están disponibles para el propósito de producir proteínas objetivo en células huésped bacterianas. Muchos de estos sistemas son derivados de sistemas reguladores endógenos que ocurren de manera natural como los operones de lactosa (/ac) y triptófano (trp) de E. coli. También existen varios sistemas que utilizan componentes de redes reguladoras de expresión de fagos como el sistema promotor Lambda (PL) del fago Lambda. Sin embargo, entre los sistemas más amplia y rutinariamente usados para la expresión de proteínas objetivo recombinantes en E. coli al nivel de laboratorio se encuentra el sistema de expresión T7 de bacteriófago. El sistema de expresión está comercialmente disponible de Novagen, Inc. (Madison, Wl) y es descrito en la patente estadounidense no. 4,952,496. El sistema de expresión comprende una célula huésped que comprende un lisógeno de fago integrado. La célula huésped es transformada entonces con un gene no integrado bajo control de un promotor de fago, en donde el gene no integrado codifica una proteína objetivo de elección. El lisógeno Lambda DE3 es un fago recombiante que porta un clon de T7 RNA polimerasa bajo control de promotor lacUV5. Los lisógenos Lambda DE3 son preparados al co-infectar una célula huésped con un lisado de fago Lambda DE3, un lisado de fago auxiliar y un lisado de fago de selección. El resultado de la co-infección es una célula huésped que tiene el fago Lambda DE3 incorporado en el cromosoma de las células huéspedes. Aunque el fago Lambda DE3 es integrado en el cromosoma huésped en el sitio de integración Lambda, el fago Lambda DE3 es defectuoso en su capacidad para ser lítico. De esta manera, el lisógeno DE3 debería ser estable y no debería lisar subsecuentemente las células para producir fago infeccioso. Sobre la inducción del sistema de expresión, las células huéspedes hacen T7 RNA polimerasa a partir del lisógeno DE3. La T7 RNA polimerasa une entonces el promotor de fago del gene objetivo no integrado e inicia la síntesis de la proteína objetivo. Un sistema de expresión T7 proporciona muchos beneficios que hacen bastante adecuado expresar las proteínas objetivo. Por ejemplo, el promotor T7 o T7/ac del gene objetivo es un promotor de fago que es único para el fago y no es reconocido por RNA polimerasas de la célula huésped. Así, la expresión de la proteína objetivo es iniciada solamente cuando está presente la T7 RNA polimerasa. Esto ayuda a reducir el potencial de expresión de la proteína objetivo antes de la inducción. La expresión de la proteína objetivo antes de la inducción no es deseable debido a que algunas proteínas objetivo tienen efectos perjudiciales en el crecimiento de la célula huésped reduciendo, así, la producción de proteína objetivo máximo. Otro ejemplo que hace el sistema de expresión T7 adecuado para expresar proteínas objetivo es que el promotor T7 ha sido alterado para Incluir el operador de lactosa (lacO). El lacO es un sitio de unión para el represor de operón de lactosa. El represor de lactosa se une al /acO, lo cual evita que la T7 RNA polimerasa se una al promotor lilac, reprimiendo así de manera efectiva ia expresión de la proteína objetivo. La represión es reversible sobre la adición de un agente inductor a la célula huésped. El agente inductor golpea el represor de lactosa fuera del lacO y permite que la T7 RNA polimerasa se una al promotor lilac e inicia la expresión de la proteína objetivo. La inclusión de lacO aprieta la iniciación de la expresión de la proteína objetivo por casi 10 veces. Esto también ayuda a reducir el potencial para la expresión de la proteína objetivo antes de la inducción, lo cual para algunas proteínas objetivo, tiene efectos perjudiciales en el crecimiento de la célula huésped, reduciendo así la producción de proteína objetivo máxima. El represor de lactosa es producido a partir de un gene de célula huésped endógeno llamado lacl. Sin embargo, las cepas huéspedes con gene lacl no pueden producir suficiente represor de lactosa para reprimir de manera efectiva la expresión de la proteína objetivo. Así, para obtener la regulación apropiada de proteína objetivo, la cepa huésped también debería contener un gene lacl extra o usar una célula huésped de sobre-expresión comprendiendo un promotor lacl01. Probablemente, la característica más ventajosa única del sistema de expresión es el hecho de que la 11 RNA polimerasa es casi 12 veces más procesiva que la RNA polimerasa de célula huésped. La alta procesividad de la T7 RNA polimerasa puede generar más de 60% de la proteína total de la célula como la proteína objetivo, haciéndola entre los sistemas de expresión más eficientes. Sin embargo, la base para la presente invención es el descubrimiento de que en casos donde la proteína objetiva es producida en grandes cantidades, el fago infeccioso es detectable en el caldo de fermentación. Esto sugiere que el fago DE3 ha vuelto a ganar su capacidad para ser lítico. Las altas densidades celulares logradas durante la fermentación pueden ser tales, que el fago infeccioso es generado a través de bajos niveles de recombinación o recombinación ilegítima (reversión), resultando en la excisión del lisógeno. No obstante, las agencias reguladoras prohiben procesamiento adelantado de un caldo de fermentación que contenga proteínas objetivo a ser usadas como farmacéuticos que tienen niveles detectables de partículas de fagos. A la luz de este problema, la presente invención proporciona un sistema de expresión T7 mejorado. En la presente invención, el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el cromosoma de la célula huésped usando un mecanismo de integración diferente. La presente invención integra una copia del gene de 17 RNA polimerasa en un sitio no esencial en el cromosoma de la célula huésped mediante recombinación homologa, en lugar de infectar la célula huésped con fago defectuoso. La célula huésped comprende además un gene no integrado que codifica una proteína objetivo de elección. El gene integrado que codifica la T7 RNA polimerasa está bajo control de un sistema regulador endógeno de la célula huésped, mientras que el gene no integrado que codifica la proteína objetivo está bajo control de un sistema regulador de fago. Cuando la célula huésped es inducida, una RNA polimerasa de célula huésped es capaz de unirse a un promotor de célula huésped e iniciar la síntesis de la T7 RNA polimerasa. La T7 RNA polimerasa recién sintetizada está disponible para unirse a un promotor T7 o lilac e iniciar la síntesis de la proteína objetivo. El resultado es un caldo de fermentación libre de fagos que comprende la proteína objetivo. La presente invención proporciona una célula huésped que comprende un gene de T7 RNA polimerasa recombinado de manera homologa, bajo control de un promotor lac integrado en el cromosoma huésped. La T7 RNA polimerasa es integrada en el cromosoma de célula huésped sin el uso de un lisógeno de fago, resultando en la no incorporación de DNA de fago adicional. La recombinación hoóloga puede ocurrir en cualquier gene no esencial de elección, mientras que el lisógeno de fago se integra solo en sitios impulsados por el proceso de infección. El promotor puede ser un promotor lac tipo natural o un promotor lac modificado como lacUV5. La célula huésped puede comprender además un gene no integrado que codifica una proteína objetivo, en donde el gene no integrado está bajo el control de un promotor T7 o Jllac. De preferencia, el promotor T7 es T7/ac. De preferencia, la proteína objetivo es una hormona paratiroidea (PTH) (1-84) o fragmentos activos de la misma, incluyendo el fragmento N-terminal 1-34, 1-31, 1-28, o análogos o derivados de los mismos. En otra modalidad, la proteína objetivo es péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) o análogos o derivados del mismo. La presente invención proporciona además un sistema de expresión para producir caldo de fermentación libre de fago comprendiendo una proteína objetivo, en donde el sistema de expresión comprende una célula huésped con un gene de T7 RNA polimerasa integrado de manera homologa en un gene no esencial en un cromosoma de una célula huésped y un gene no integrado que codifica la proteína objetivo. La presente invención proporciona además un proceso para preparar una célula huésped que comprende un gene de T7 RNA polimerasa integrado de manera homologa. El gene de T7 RNA polimerasa es integrado en cualquier gene no esencial del cromosoma huésped, de preferencia, el operón de galactosa del cromosoma huésped. El gene de T7 RNA polimerasa puede ser integrado en el operón de galactosa a partir de un plásmido seleccionado del grupo que consiste de pHMM209, pHMM220, pHMM223 y pHMM228. La presente invención proporciona además un proceso para preparar una proteína objetivo, la cual comprende expresar la proteína objetivo en una célula huésped que comprende un gene de T7 RNA polimerasa integrado de manera homologa, y en donde la proteína objetivo está libre de fago. De preferencia, la proteína objetivo es hormona paratiroidea (PTH) (1-84) o fragmentos de la misma, incluyendo fragmento N-terminal 1-34, 1-31, 1-28 o análogos o derivados de los mismos. En otra modalidad, la proteína objetivo es péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) o análogos o derivados del mismo. La FIG. 1 muestra una representación esquemática de recombinación homologa de la T7 RNA polimerasa del plásmido de integración pHMM228 en el cromosoma huésped. Para fines de la presente invención, como se describe y reclama en la presente, se definen a continuación los siguientes términos y abreviaturas de biología molcular general. Los términos y abreviaturas usados en este documento tienen sus significados normales a menos que se designe de otra manera. Las abreviaturas de aminoácidos son como se expone en 37 C.F.R. § 1.822(b)(2)(1994). "Par de bases" o "bp", como se usa en la presente se refiere a DNA. Las abreviaturas A,C,G y T corresponden a las formas de 5'-monofosfato de los desoxiribonucleósidos ((desoxi)adenosina, (desoxi)citidina, (desoxi)guanosina y timidina, respectivamente, cuando ocurren en moléculas de DNA. En el DNA de doble filamento, el par de bases puede referirse a una asociación de A con T o C con G. "Kilo-base" o "kb" se refiere a mil (1000) pares de bases. "Plásmido" se refiere a un elemento genético extracromosómico que comprende ácido nucleico. Los plásmidos generalmente son designados por una "p" minúscula, seguida por letras y/o números. Los plásmidos de inicio en la presente están ya sea comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a aquéllos descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes para el técnico ordinariamente experto. Los plásmidos comprenden moléculas de DNA a las cuales pueden o se han adicionado uno o más segmentos de DNA adicionales. Algunos plásmidos son sensibles a temperatura, mientras que otros no lo son. Esto significa que a temperaturas permisivas, algunos plásmidos son auto-replicantes, y a temperaturas no permisivas, algunos plásmidos no son auto-replicantes. "Plásmido de expresión", como se usa en la presente, se refiere a cualquier plásmido no sensible a temperatura, en el cual ha sido incorporado un promotor para controlar la transcripción del DNA insertado. Un plásmido de expresión T7 comprende un promotor T7 o lilac que controla la expresión de un gene objetivo que codifica una proteína objetivo. Los plásmidos de expresión T7 son bien conocidos para el técnico ordinariamente experto. Los plásmidos de expresión T7 están comercialmente disponibles de Novagen, Inc. (Madison Wl) e incluyen, pero no están limitados a, la serie pET de plásmidos de expresión. "Plásmido de integración", como se usa en la presente, se refiere a cualquier plásmido sensible a la temperatura en el cual se ha insertado un promotor para controlar la transcripción del DNA insertado. Adicionalmente, el plásmido de integración inserta un segmento especificado de DNA en el cromosoma de una célula. Los plásmidos de integración son derivados de pMAK700 y pMAK705. Los p AK700 y pMAK705 son generados como se describe por Hamilton, et al., J. Bacteriol. 171:4617-4622, (1989), el cual es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Los plásmidos de integración de la presente invención, pHMM228, pHMM209, pHMM220 y pHMM223 son descritos con detalle más adelante. Estos plásmidos de integración comprenden un promotor lac que controla la expresión del gene de T7 RNA polimerasa que codifica la 17 RNA polimerasa. "Transformación" se refiere a la introducción de un plásmido en un organismo, de manera que el plásmido es replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Los métodos para transformar huéspedes bacterianos y eucarióticos son bien conocidos en la técnica, muchos de dichos métodos son resumidos en J.

Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) (1989). La transformación exitosa es reconocida generlamente cuando cualquier indicación de la operación de este plásmido ocurre dentro de la célula huésped. Por ejemplo, una célula huésped sensible se volverá resistente a un agente de selección cuando la célula huésped es transfectada con un plásmido que permite la resistencia.

"Temperatura permisiva" es la temperatura a la cual el plásmido puede auto-replicarse desués de la transformación en la célula huésped, independiente a la duplicación de la célula. La temperatura permisiva como se define en esta invención, es una temperatura normalmente menor que 44°C, generalmente entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C, de preferencia entre aproximadamente 25°C y 40°C, más preferiblemente entre aproximadamente 25°C y 35°C, muy preferiblemente aproximadamente 30°C. "Temperatura no permisiva" es la temperatura a la cual un plásmido después de la transformación en la célula huésped, no puede auto-replicarse independiente de la duplicación celular. La temperatura no permisiva como se define en esta invención es una temperatura normalmente mayor que 40°C, generalmente entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C, de preferncia aproximadamente 44°C. "Transcripción" se refiere al proceso por el cual la información contenida en una secuencia de nucleótidos de DNA es transferida a una secuencia de RNA complementaria mediante RNA polimerasa. Por ejemplo, la RNA polimerasa de E. col¡ transfiere el gene de T7 RNA polimerasa a la secuencia de RNA complementaria, la cual es trasladada entonces en T7 RNA polimerasa. De igual manera, por ejemplo, la T7 RNA polimerasa transfiere el gene objetivo a la secuencia de RNA complementaria, la cual es trasladada entonces en la proteína objetivo. "Traslación", como se ussa en la presente, se refiere al proceso mediante el cual la información genética de RNA mensajero (mRNA) es usada para especificar y dirigir la síntesis de una cadena de polipéptido. "Secuencia de aminoácidos aislada" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos, sin embargo, construida o sintetizada, la cual es locacionalmente distinta de la secuencia que ocurre naturalmente. "Compuesto de DNA aislado" se refiere a cualquier secuencia de DNA, sin embargo, construida o sintetizada, la cual es locacionalmente distinta de su ubicación natural en el DNA genómico. "Promotor" se refiere a una secuencia de DNA, el cual se une a una RNA polimerasa y dirige la transcripción de DNA a RNA. Ejemplo de promotores usados en la presente son lac, lac UV5, 17, lilac, laclQ1. "PCR" se refiere a la reacción de cadena de polimerasa ampliamente conocida que emplea una DNA polimerasa térmicamente estable. "Iniciador" se refiere a un fragmento de ácido nucleico, el cual funciona como un substrato iniciador para alargamiento enzimático o sintético en PCR. "Célula madre" se refiere a una célula que está desprovista de un lisógeno y es capaz de auto-replicarse ¡n vivo. La célula madre también debería tener secuencias de DNA que son determinables y deberían ser de aproximadamente 2 kb de longitud del cromosoma de célula huésped. Estas secuencias deberían estar además en un área no esencial de la célula. De preferencia, la célula madre es bacteriana. De preferencia, la célula madre comprende secuencias de DNA del operón de galactosa o un segmento del mismo. De preferencia, la célula madre es E. coli. Las células madre de E. coli preferidas están comercialmente disponibles de varios proveedores, tales como Novagen, Inc. (Madison Wl) e incluyen, pero no están limitadas a BL21, AD494, BLR, HMS174, Origami y Tuner. "Célula huésped" en la presente invención se refiere a una célula madre que comprende un gene de T7 RNA polimerasa integrado de manera homologa bajo el control de un promotor lac. El promotor puede ser el promotor lac tipo natural o un promotor lac modificado como lacUV5. La célula huésped puede comprender además un gene no integrado bajo control de un promotor T7. El promotor puede ser el promotor T7 tipo natural o un promotor T7 modificado como JJIac. El gene no integrado codifica una proteína objetivo de elección. Sobre la inducción de la célula huésped, se produce T7 RNA polimerasa. La T7 RNA polimerasa está disponible entonces para producir la proteína objetivo en el caldo de fermentación libre de fagos. "Libre de fago" se refiere a ninguna placa observable en un campo de bacterias cuando se incuba con caldo de fermentación. Ensayos usados para probar la contaminación de fagos son bien conocidos en la técnica. "Gene homólogamente integrado" se refiere a un gene que es integrado en el cromosoma de una célula huésped mediante un método de recombinación homologa. El método de recombinación homologa procede entre una secuencia de DNA en el cromosoma de la célula huésped y secuencias complementarias portadas en un plásmido de integración que está presente dentro de la célula después de la transformación. De preferencia, el método de recombinación homologa es realizado como es enseñado por Hamilton, et al. en New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli (Nuevo método para generar supresiones y reemplazos de genes en Escherichia coli), J. Bacteriol. 171:4617-4622, 1989, el cual es incorporado en la presente por referencia.

"Complementario", como se usa en la presente, se refiere a pares de bases (purinas y pirimidinas) que se asocian a través del enlace de hidrógeno en un ácido nucleico de doble filamento. Los siguientes pares de bases son complementarios: guanina y citosina; adenina y timina; y adenina y uracilo. El gene que está integrado mediante recombinación homologa de acuerdo con la presente invención es un gene de T7 RNA polimerasa. El gene de T7 RNA polimerasa es obtenido de bacteriófago T7 y está bajo control de un promotor lacUV5 inducible de isopropiltio-p-galactósido (IPTG). El gene puede ser obtenido de plásmido pAR1219, American Type Culture Collection (ATCC) 39563, patente estadounidense no. 4,952,496. Un fragmento BamHI en pAR1219 contiene un cartucho de expresión de T7 comprendiendo un gene de T7 RNA polimerasa bajo control del promotor lacUV5 IPTG-inducible y un gene lacl bajo control de su promotor natural.

El gene de T7 RNA polimerasa codifica una T7 RNA polimerasa que es bien conocida en la técnica y se describe en detalle en la patente estadounidense no. 4,952,496, el cual es incorporado en la presente por referencia. Cuando la célula huésped es inducida, una RNA polimerasa de célula huésped es capaz de unirse al promotor lacUV5 e iniciar la síntesis de la T7 RNA polimerasa. "Gene no integrado" se refiere a un gene que no es integrado en el cromosoma de una célula huésped, pero es portado en un plásmido de expresión. El plásmido de expresión es introducido en la célula huésped mediante métodos de transformación de rutina y convencionales, y replica de manera autónoma dentro de la célula huésped a temperaturas permisivas. De esta manera, el plásmido puede replicar por sí mismo en la célula huésped en la ausencia de duplicación de célula huésped. El gene no integrado que es portado en el plásmido de expresión codifica una proteína objetivo de interés. El gene no integrado está bajo control de un promotor T7 o T7/ac inducible de isopropiltio- -galactósido (IPTG). La T7 RNA polimerasa recién sintetizada del gene integrado es capaz de unirse al promotor T7 o lilac e iniciar la síntesis de la proteína objetivo. "Proteína objetivo" se refiere a una proteína que puede ser sintetizada en una célula huésped. De preferencia, la proteína objetivo es heteróloga para las proteínas de células huésped. Ejemplos de proteínas incluyen, pero no están limitadas a, calcitonina, eritropoyetina (EPO), factor IX, factor VIII, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos ( -CSF), quimiocinas, factor liberador de hormona de crecimiento (GRF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1), hormona de crecimiento, insulina, leptina, interferón, interleucinas, hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), hormona estimulante de folículos (FSH), somatostatina, vasopresina, amilina, pépt¡do-1- similar a glucagón (GLP-1), hormona paratioroidea (PTH), exendina-3, exendina-4 y alfa-1 anti-tripsina. La proteína. La proteína objetivo de la presente invención puede ser opcionalmente una proteína precursora o pro-proteína. Ejemplos de proteínas precursoras o pro-proteínas incluyen, pero no están limitadas a proinsulina y GLP-1(1-37).

Constructo de integración: Los plásmidos útiles son construidos para permitir la integración del gene objetivo recombinante en el cromosoma de una célula huésped deseada mediante recombinación homologa. Esta integración puede lograrse usando constructos pMAK modificados. De preferencia, los constructos pMAK de inicio son pMAK700 y pMAK705. Más preferiblemente, el constructo pMAK de inicio es pMAK705. Los constructos pMAK comprenden un origen de replicación sensible a la temperatura. Esto permite que el constructo replique a temperaturas permisivas como 30°C, pero el constructo no replicará a temperaturas no permisivas como 44°C. Los constructos pMAK también comprenden un gene de resistencia a cloranfenicol (Cmr). Así, una célula huésped que contiene un plásmido que comprende un gene Cmr será resistente a cloranfenicol y a una temperatura permisiva replicará en la presencia de cloranfenicol. Los constructos pMAK son modificados mediante la inserción de secuencias de ácidos nucleicos en el constructo pMAK que son homólogos a una secuencia de ácido nucleico encontrada en el cromosoma de una célula huésped. Los constructos pMAK, los cuales son insertados con secuencias de ácidos nucleicos homologas encontradas en el cromosoma de una célula huésped, son referidos en la presente invención como constructos pHMM. Las secuencias homologas de los constructos pHMM comprenden diferentes fragmentos del operón de galactosa (galETK). El operón de galactosa es bien conocido en la técnica. Las secuencias homologas del constructo pHMM y la célula huésped tienen suficiente longitud para hibridar unos a otros y experimentar recombinación. La hibridación generalmente depende de la capacidad de DNA cromosómico desnaturalizado para re-templar cuando están presentes filamentos complementarios del constructo de integración en un ambiente como una célula huésped. De preferencia, la secuencia homologa es mayor que aproximadamente 1 kb. Más preferiblemente, la secuencia homologa está entre aproximadamente 1 kb y aproximadamente 10kb. Aún más preferiblemente, la secuencia homologa está entre aproximadamente 1 kb y aproximadamente 4 kb. Muy preferiblemente, la secuencia homologa es aproximadamente 2kb. Las secuencias homologas de la célula huésped pueden ser cualquier secuencia que no sea esencial para la célula huésped porque el caso de recombinación puede romper la secuencia, de manera que la secuencia puede volverse no útil. Por ejemplo, si la secuencia homologa está en el gene responsable para la síntesis de la pared celular, la recombinación en esta secuencia de la célula huésped con el plásmido de integración podría romper la síntesis de las proteínas comprenden la pared celular y resultar en una célula huésped no viable. Los constructos pHMM pueden ser modificados adicionalmente por la inserción de un gene de T7 RNA polimerasa y un promotor lacUV5 en el constructo pHMM. Un gene de T7 RNA polimerasa bajo control del promotor lacUV5 puede ser obtenido de plásmido pAR1219, American Type Culture Collection (ATCC) 39563, patente estadounidense no.4,952,496. De preferencia, el promotor lac original del plásmido pMAK es eliminado por la clonación del gene de T7 RNA polimerasa y el promotor lacUV5 en el constructo pHMM. Una duplicación de los promotores lac podría resultar en el potencial para la formación de estructura secundaria, la cual podría presentar problemas para determinación de secuencia y la posibilidad para interferir con la recombinación homologa. De manera opcional, un constructo pHMM puede ser modificado adicionalmente mediante la inserción de un gene ¡acl en el constructo pHMM. Además del gene de T7 RNA polimerasa y el promotor lacUV5, el plásmido pAR1219 comprende además un fragmento de DNA conteniendo el gene lacl bajo control de su promotor natural. Una copia del gene lacl en el sistema de expresión puede proporcionar expresión adicional del represor de lactosa, lo cual ayuda a controlar tanto la expresión de T7 RNA polimerasa como de proteína objetivo. Opcionalmente, el gene lacl del cartucho de expresión T7 impulsado por un promotor lacl01. El promotor laclQ1 es bien conocido en la técnica. El promotor lacl01 es modificado para sobre-expresar el gene lacl. El resultado es producción de aproximadamente 10 ? del represor lacl que el gene lacl impulsado por su promotor natural. De manera adicional, un constructo pHMM comprende además un segundo gene de resistencia. De preferencia, el segundo gene de resistencia es kanamicina (Km'). Así, una célula huésped que contiene un plásmido que comprende un gene Kmr será resistente a la kanamicina y replicará en la presencia de kanamicina. De preferencia, el segundo gene de resistencia es orientado en la dirección opuesta que la T7 RNA polimerasa. El gene de resistencia a kanamicina proporciona un medio adicional para identificar de manera única la célula huésped. El gene de resistencia de kanamicina puede ser obtenido a partir del plásmido pACYC177. El pACYC177 está disponible del catálogo "Stratagene Cloning Systems" (1993) (Stratagene, La Jolla, Calif ). El gene de resistencia a kanamicina de pACYC177 incluye repeticiones invertidas de transposición Tn903 (IR). Debido a la inestabilidad potencial a través de la transposición que resulta de la presencia de estas repeticiones invertidas, se prefiere un cartucho que abarca el gene de resistencia a kanamicina, pero no las secuencias de repeticiones invertidas.

Integración: Un constructo de integración puede ser transformado en una cepa huésped deseada de acuerdo con métodos convencionales y colonias individuales son cultivadas durante la noche en medios de crecimiento líquidos a temperatura permisiva en la presencia de un agente de selección, por ejemplo, Cm o Km. El cultivo nocturno resultante es diluido en medios de crecimiento líquidos en la presencia de un agente de selección e incubado a una temperatura no permisiva, por ejemplo, 44°C, hasta la fase logarítmica. El cultivo es platinado entonces en placas de agar conteniendo un agente de selección y es incubado durante la noche a temperatura no permisiva para seleccionar la formación cointegrada. La formación cointegrada es el paso inicial en la recombinación homologa y ocurre cuando el constructo de integración se integra en el cromosoma huésped. Debido a que el plásmido de integración no puede replicarse a sí mismo a una temperatura no permisiva y el cultivo contiene un agente de selección, las únicas células huésped que sobreviven bajo estas condiciones serán aquéllas que integran el constructo de integración en el cromosoma de célula huésped. El cultivo resultante es platinado en placas de agar comprendiendo un agente de selección y es incubado a temperatura no permisiva durante la noche para seleccionar cointegrados.

Una combinación de colonias cointegradas son escogidas, transferidas a medios de crecimiento líquidos y son incubadas durante la noche a temperatura permisiva para resolución del cointegrado. La resolución proporciona un medio para que ocurra un segundo caso de recombinación, por lo cual el plásmido de integración es cortado del cromosoma y reformado dentro de la célula huésped. El plásmido de integración que es cortado y reformado en la célula huésped es ya sea el plásmido de integración original completo o es el plásmido de integración original menos la T7 RNA polimerasa, la cual permanece integrada en el cromosoma de la célula huésped. El objetivo del segundo caso de recombinación es cortar la porción del plásmido de integración que comprenden el origen de replicación del cromosoma de célula huésped, pero dejar la T7 RNA polimerasa integrada en el cromosoma de la célula huésped. Un esquema de este proceso es mostrado en la figura 1. En los casos donde el plásmido de integración comprende además otros genes, por ejemplo, lacl o Km, el objetivo del segundo caso de recombinación es cortar la porción del plásmido de integración que comprende el origen de replicación del cromosoma de célula huésped, pero dejar la T7 RNA polimerasa, y otros genes, por ejemplo, lacl o Km, integrados en el cromosoma de la célula huésped. La remoción del origen de replicación del plásmido de integración es deseado debido a que un origen de replicación integrado podría ser perjudicial para la célula huésped. El proceso de excisión puede ser continuado opcionalmente durante días al subcultivar con un agente de selección y mantener a temperatura permisiva. De preferencia, el subcultivado y mantenimento es menor a tres días, más preferiblemente el subcultivado y mantenimiento es continuado durante dos días. El cultivo es diluido entonces en un matraz pre-calentado conteniendo medios de crecimiento líquidos sin un agente de selección a temperatura no permisiva para iniciar el curado del integrado al cortar la secuencia de plásmido indeseable del cromosoma de la célula huésped. El cultivo es platinado en placas de agar conteniendo un agente de selección y cultivado a temperatura permisiva. Las colonias son clasificadas por la presencia de un caso de integración usando medios conocidos para un técnico experto, por ejemplo, PCR y Southern Blotting. Las colonias conteniendo un integrado son usadas para inocular un cultivo de medio líquido y subsecuentemente cultivadas durante días consecutivos a temperatura no permisiva para promover el curado. Los cultivos puede ser platinados entonces sobre placas de agar e incubados durante la noche a temperatura permisiva. Colonias individuales pueden ser parchadas subsecuentemente en placas de agar conteniendo opcionalmente ambos agentes de selección, por ejemplo, Cm y Km. Las colonias individuales pueden ser parchadas adicionalmente sobre placas de agar conteniendo solo el segundo agente de selección, por ejemplo, Km. Los clones deseados, los cuales tienen secuencias integradas son sensibles a Cm y resistentes a Km. En otra modalidad, el plásmido de integración es integrado preferiblemente en el operón de galactosa de la célula huésped. Más preferiblemente, el plásmido de integración es integrado en el sitio galE de la célula huésped. Varios intentos se hicieron para integrar en el sitio galK, sin embargo, la integración ideal no fue exitosa.

Proteína objetivo: El gene no integrado que codifica una proteína objetivo recombinante usada en el sistema de expresión de la presente invención es obtenida por medios disponibles para técnicos ordinariamente expertos en el campo de biología molecular. Los pasos básicos son: a) aislar una secuencia de DNA natural o construir una secuencia de DNA sintética o semi-sintética, en donde cualquier secuencia de DNA comprende un gene objetivo que codifica una proteína objetivo de interés, b) clonar la secuencia de DNA en un plásmido de expresión T7 disponible en una manera adecuada para expresar la proteína objetivo, c) transformar el huésped de expresión previamente descrito de la presente invención con el plásmido de expresión T7 comprendiendo el gene objetivo de interés, d) cultivar el huésped de expresión transformado durante un periodo de tiempo en un estado no inducido y entonces durante un periodo de tiempo en un estado inducido, y e) recuperar y purificar la proteína objetivo. De preferencia, la proteína objetivo es hormona paratiroidea (PTH).

Más preferiblemente, la PTH es PTH humana. La PTH es conocida en la técnica como una proteína de 84 aminoácidos y es descrita en la patente estadounidense no. 5,496,801. Los fragmentos N-terminales de PTH también son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, 1-34, 1-31 y 1-28. También se contemplan análogos y derivados de PTH y fragmentos de PTH. Ejemplos de fragmentos, análogos y derivados de PTH son descritos en W099/29337, US20020132973, patentes estadounidenses nos. 5,556,940; 6,472,505; y 6,417,333. En otra modalidad, la proteína objetivo es péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) o análogos o derivados del mismo. Ejemplos de análogos y derivados de GLP-1 son bien conocidos en la técnica y son descritos en WO01/98331 y patentes estadounidenses nos. 6,268,343; 5,977,071; 5,545,618; 5,705,483; y 6,133,235. Los análogos de GLP-1 también incluyen agonistas de Exendína-3 y Exendina-4 como se describe en WO99/07404, W099/25727, W099/25728, WO99/43708, WOOO/66629 y US2001/0047084A1.

Modificación: La proteína objetivo aislada es útil como una proteína terapéutica.

Opcionalmente, la proteína objetivo puede ser modificada adicionalmente fuera de la célula huésped para dar las características físicas adicionales de proteína objetivo útiles para una proteína terapéutica. Las modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, cortes enzimáticos o químicos, acilación, cristalización, adiciones de sal y similares.

Preparaciones: El medio de crecimiento liquido es Caldo T Caldo T = (por litro) 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCI, pH 7.5. Placas de agar T = adicionar 15 g/l de agar a caldo T. Amortiguador Sm = (por 100 mi de solución 10X) 20 mi 1 Tris-HCI (pH 7.4), 20 mi 5M NaCI, 10 mi 1M MgS04 Cloranfenicol (Cm) (25 ug/ml) en etanol Kanamicina (Km) (15-50 ug/ml) en agua Acido nalidíxico (20 ug/ml) en NaOH Streptomicina (50 ug/ml) en agua Plásmido de integración pHMM209: El plásmido de integración pHMM209 es un derivado de p AK705.

El paso inicial en la construcción de pHMM209 es clonar un adaptador de oligonucleótido, fíamHI a C/al, en el esqueleto de pMAK705. Este adaptador contiene un sitio Stu\, el cual es único en el constructo resultante. Un flanco galK es clonado en el esqueleto de pMAK705 como una inserción Sa/I a Xba\ resultando en un esqueleto de pHMM. El esqueleto de pHMM comprende sitios SamHI y C/al únicos en el flanco galK. El cartucho de expresión T7 de pAR1219, comprendiendo el gene lacl bajo la expresión de su secuencia promotora natural y el gene de T7 RNA polimerasa bajo la regulación del promotor lacUV5 es clonado como un fragmento SamHI en el esqueleto de pHMM. La orientación del cartucho de expresión T7 es opuesta a aquélla del operón galETK para prevenir la lectura a través de transcripción de las secuencias corriente arriba de galE. A continuación, el gene de resistencia para kanamicina es clonado como un fragmento Stu\ de pACYC177 en el sitio Stu\ del adaptador que fue clonado previamente en el esqueleto de pMAK705. La orientación del gene de kanamicina es opuesto a aquél del cartucho de expresión T7. El plásmido de Integración resultante es pHMM209.

Plásmido de integración pHMM220: El plásmido de Integración pHMM220 es un derivado de pMAK705.

El paso inicial en la construcción de pHMM220 es clonar un adaptador de oligonucleótido, Bam \ a C/al, en el esqueleto de p AK705. Este adaptador contiene un sitio Sful, el cual es único en el constructo resultante. Un flanco galK es clonado en el esqueleto pMAK705 como una inserción Sa/I a Xba\ en el flanco galK. El cartucho de expresión T7, comprendiendo el gene lacl bajo la expresión de su secuencia de promotor natural y el gene de T7 RNA polimerasa bajo la regulación del promotor lacUV5, es clonado entonces como un fragmento SamHI de pAR1219 en el esqueleto de pHMM. La orientación del cartucho de expresión T7 es opuesto a aquél del operón galETK para prevenir la lectura a través de transcripción de las secuencias corriente arriba de galE. A continuación, un gene de resistencia a kanamicina como un fragmento Stu\ es obtenido mediante PCR. Los iniciadores de PCR que son usados para amplificar el gene de resistencia son diseñados dentro de las secuencias de repeticiones invertidas presentes en el gene de kanamicina de plantilla pACYC177. Los iniciadores de PCR contienen sitios de restricción Stu\ en sus colas y se usan en una reacción de amplificación. El producto de PCR de aproximadamente 1 kb resultante es clonado directamente en un plásmido de clonación de PCR y clones putativos son seleccionados al platinar directamente en placas de agar T conteniendo kanamicina. El gene de resistencia de kanamicina resultante es subclonado como un fragmento Stu\ en el sitio Stu\ del adaptador que se clonó previamente en el esqueleto de pMAK705. La orientación del gene de kanamicina es opuesto a aquél del cartucho de expresión T7. El plásmido de integración resultante es pHMM220.

Plásmido de integración pHMM223: El plásmido de integración pHMM223 es construido igual que pH M220. A continuación, el gene lacl del cartucho de expresión T7 en pHMM220 es removido debido a que el gene lacl tuvo el potencial para integrar en el sitio lacl del cromosoma huésped. El gene lacl es suprimido del pH M220 mediante digestión del plásmido usando Bgl\. Un adaptador de DNA sintético es clonado en el sitio Bgl\ para reconstituir el promotor lacilV5 que es suprimido en el proceso de digestión Bgl\. El clon resultante es secuenciado y se encuentra que contiene la secuencia lacUV5 deseada con la excepción de dos cambios de nucleótidos. Estos cambios son en la región sin trasladar 5' del cartucho de expresión T7 y no son críticos para la expresión de la T7 RNA polimerasa. A continuación, el promotor lacl presente en el pHMM220 es eliminado. Esto se logra mediante la inserción de un adaptador Pst\ a Ase\ que reemplaza completamente la secuencia de promotor lacl. La supresión Bgl\ del pHMM220 también remueve el flanco galK corriente abajo. Con el fin de reconstituir esta región e incorporar el gene de resistencia a kanamicina sin las repeticiones invertidas, un fragmento fia/nHI a X£>al es subclonado en los sitios BglW a Xba\ del plásmido de integración. Esto resulta en un plásmido de integración designado pHMM223, el cual contiene el cartucho de expresión T7 sin una copia del gene lac\ y el promotor lacl, gene de resistencia de kanamicina sin repeticiones invertidas y un flanco galK completo. El pH M223 es usado para intentos de integrar en el sitio galK del cromosoma.

Plásmido de integración pHMM228: El plásmido de integración pH M228 es un derivado de pMAK705. El paso inicial en la construcción de pHMM228 es clonar un adaptador de oligonucleótido, Pst\ a agl, en el esqueleto de pMAK705. Este adaptador contiene sitios Sa/I y X£>al únicos. Aproximadamente 2kb del gene galE es clonado en el esqueleto p AK705 como una inserción Sa/I a X¿»al resultando en un esqueleto de pHMM. El esqueleto de pHMM comprende sitios SamHI y C/al únicos en el gene. El cartucho de expresión 17, comprendiendo el gene lacl bajo la expresión de su secuencia de promotor natural y el gene de T7 RNA polimerasa bajo la regulación del promotor lacUV5 es clonado entonces como un fragmento Bam \ de pAR1219 en el esqueleto de pHMM. La orientación del cartucho de expresión T7 es opuesta a aquélla del operón galETK para prevenir la lectura a través de transcripción de las secuencias corriente arriba galE. A continuación, un gene de resistencia de kanamicina como un fragmento Stu\ es obtenido mediante PCR. Los iniciadores de PCR que son usados para amplificar el gene de resistencia, son diseñados dentro de las secuencias de repeticiones invertidas presentes en el gene de kanamicina de plantilla pACYC177. Los iniciadores de PCR contienen sitios de restricción Stu\ en sus colas y se usan en una reacción de amplificación. El producto de PCR de aproximadamente 1 kb resultante es clonado directamente en un plásmido de clonación de PCR y clones putativos son seleccionados para platinar directamente en placas de agar T conteniendo kanamicina. El gene de resistencia de kanamicina resultante es subclonado como un fragmento Stu\ en el sitio Stu\ del adaptador que fue clonado previamente en el esqueleto de pMAK705. La orientación del gene de kanamicina es opuesta a aquélla del cartucho de expresión T7. Finalmente, el gene lacl del cartucho de expresión T7 es removido esencialmente como se describe para pHMM223. El gene lacl es suprimido mediante digestión del plásmido usando Bgl\. Un adaptador de DNA sintético es clonado en el sitio Bgl\ para reconstituir el promotor lacilV5 que es suprimido en el proceso de digestión de Bgl\. A continuación, el promotor lacl es eliminado mediante la inserción de un adaptador de Pst\ a Ase\ que reemplaza completamente la secuencia de promotor lac\. La supresión de Bgl\ también remueve el flanco galE corriente abajo. Con el fin de reconstituir esta región e incorporar el gene de resistencia de kanamicina sin las repeticiones invertidas, un fragmento BamH\ a Xba\ es subclonado en los sitios BglW a Xjbal del plásmido de integración. Esto resulta en un plásmido de integración designado pHMM228, el cual contiene el cartucho de expresión T7 sin una copia del gene lacl y el promotor lacl, gene de resistencia de kanamicina sin repeticiones invertidas y un flanco galE completo. El pHMM228 es usado para intentos para integrar en el sitio galE del cromosoma.

Integración/Clasificación de pHMM209: El plásmido de integración pHMM209 es transformado en una línea de células madres de E. coli comprendiendo un operón de galactosa, se platinó en placas de agar T conteniendo Cm y se incubó durante la noche a 30°C. Las colonias fueron escogidas, transferidas a caldo T conteniendo Cm y se cultivaron durante la noche a 30°C. El cultivo durante la noche resultante es diluido en caldo T en la presencia de Cm y se incubó a 44°C, hasta que el cultivo alcanza la fase logarítmica. El cultivo es platinado entonces en placas de agar T comprendiendo Cm y se incubó durante la noche a 44°C para inducir la formación de cointegrado. Una combinación de colonias de cointegrado son escogidas, transferidas a 250 mi de caldo T conteniendo Cm, e incubadas a 30°C para excisión y resolución. Este cultivo es mantenido durante dos días más al sub-cultivar a una dilución 1:500 con caldo T conteniendo Cm e incubando el matraz a 30°C. En el cuarto día, el cultivo es sub-cultivado en un matraz pre-calentado de caldo T a 44°C. Este cultivo se hace crecer y es sub-cultivado durante tres días consecutivos a 44°C para promover el curado del plásmido pH 209. El cultivo tentativamente integrado, cortado y curado es platinado entonces en placas de agar T conteniendo Km y es incubado durante la noche a 30°C. Colonias individuales son parchadas subsecuentemente en placas de agar T conteniendo Cm y Km, entonces en placas de agar T conteniendo Km, entonces en placas de agar T. Los integrados positivos deberían ser Cms y Kmr. Se probaron casi 1000 colonias individuales y solamente se formó un integrado. Este integrado es designado RQ209. Análisis adicionales mostraron que la cepa RQ209 poseyó T7 RNA polimerasa funcional que fue inducida mediante la adición de IPTG. Sin embargo, cuando se realizó mapeo de PCR en la cepa RQ209, se encontró que la T7 RNA polimerasa no se había integrado específicamente en las regiones galK o lacl del cromosoma.

Integración/Clasificación para pHMM228: Los experimentos de integración fueron realizados esencialmente como se describe en la integración/clasificación de pHMM209 antes. La tabla a continuación muestra el número de cointegrados formados.

Tabla 1: Conintegrados de pHMM228 TNTC: a numerosos a cuenta ND: no determinada Las colonias que crecieron en las placas de 44°C fueron cultivadas subsecuentemente en caldo T a 44°C. Nueve aislados individuales se cultivaron además de un cultivo que fue combinado de colonias representando aproximadamente 1/2 de una placa entera. Estos 10 cultivos fueron agitados (315 rpm) durante la noche bajo selección de Cm a 44°C. El día siguiente, muestras de 100 ul de cada uno fueron recolectadas mediante centrifugación para análisis de PCR subsecuentes. Además, las placas pre-calentadas a 44°C fueron usadas para rayar aislados individuales de estos cultivos y se incubaron durante la noche a 44°C. Los resultados de PCR y mapeo de restricción mostraron que casi todos de los 10 cultivos líquidos contenían un producto de amplificación consistente con el caso de integración esperado. Los clones individuales son clasificados al re-parchar a 44°C. El aislado individual #2 fue cultivado en caldo T conteniendo Cm a 30°C durante la noche para promover la excisión de pHMM228. Después del crecimiento durante la noche, una muestra de 100 ul de células se recolectó y usó como plantilla para una reacción de PCR. Los iniciadores de fuera de los flancos galE fueron elegidos de manera que la única amplificación sería la versión cortada de pHMM228. Así, si el caso de excisión regenera pHMM228, se esperaría un producto de PCR de aproximadamente 7 kb. Sin embargo, si la excisión resultó de un segundo caso de cruzamiento dejando la T7 RNA polimerasa en el cromosoma, se esperaría un producto de PCR de aproximadamente 1.5 Kb. Como se esperaba, se observa una mezcla de productos de excisión. El cultivo cortado es rayado subsecuentemente para obtener aislados individuales, los cuales son clasificados por la presencia del producto de PCR de 1.5 Kb. Tres aislados fueron cultivados entonces durante la noche sin selección a 44°C en caldo T para promover el curado del pHMM228 cortado. Después del cultivo durante la noche a 44°C, se aislaron colonias simples de placas de agar T rayadas y 72 individuos de cada uno de los tres aislados originales fueron parchados en plascas T más Cm, placas T más Km y placas T para determinar aquéllos que habían sido curados exitosamente del pHM 228 cortado. La tabla a continuación detalla los resultados de estos experimentos.

Tabla 2: Eficiencia de curado Aislado Total de Cmr Kmr Eficiencia de individuos curado (%) analizados #1 72 24 72 66.7 #6 72 37 72 48.6 #15 72 14 56 56.9 Un individuo sensible a Cm simple designado RQ228 fue elegido subsecuentemente del aislado #1 y se rayó para purificación dos veces y se verificó fenotípicamente. La tabla a continuación muestra los resultados del análisis fenotípico.

Tabla 3: Resultados fenotípicos Una colonia de la cepa RQ228 que fue fenotipo confirmado fue elegida entonces y se cultivó durante la noche un cultivo de 10 mi para conservación local así como de largo plazo y se usó para hacer un lote de células competentes. Esta misma colonia fue usada en mapeo de PCR de integridad de integración.

Ensayo de regulación y actividad de T7: Además de confirmar las características fenotípicas y la integridad del caso de integración, la cepa RQ228 también fue examinada por su capacidad para expresar T7 RNA polimerasa funcional así como la capacidad de esta expresión para ser regulada. La capacidad de la cepa RQ228 para rescatar el fago probador de T7 defectuoso fue examinado como se describe a continuación.

Ensayo de T7 RNA polimerasa: Se utilizó un ensayo de actividad de 17 RNA polimerasa con el fin de determinar si la cepa RQ209 o la cepa RQ228 poseían T7 RNA polimerasa funcional. La cepa RQ209 o la cepa RQ228 se cultivaron a aproximadamente 37°C durante la noche en caldo T complementado con 0.2% de maltosa y 10 mM MgS04. Los cultivos durante la noche fueron diluidos nuevamente a OD6oo = 0.05 en caldo T nuevamente complementado con 0.2% de maltosa y 10 mM MgS04 y se cultivaron agitando a OD 6oo— 0.5 y 100 ul de cada cultivo bacteriano se adicionó a 100 ul de una dilución 10"6 en amortiguador SM del fago probador de T7. Las muestras fueron mezcladas suavemente al hacer vórtice con el dedo e incubar a 37°C durante 20 minutos para permitir la absorción de fagos. Tres mililitros de 0.4% de agarosa superior T (complementada con 0.2% de maltosa y 10 mM MgS04) se adicionaron entonces a las muestras, se agitaron vortiginosamente y se vaciaron en placas de agar T pre-calentadas. Cada muestra fue preparada por duplicado, de manera que una podría ser platinada en agar T y la otra podría ser platinada en agar T conteniendo 400 uM IPTG. El fago probador de T7 puede unirse a las células pero puede replicar y lisar solamente aquellas células que infecta que tienen T7 RNA polimerasa funcional disponible. Debido a que la expresión de T7 RNA polimerasa está bajo el control del promotor lacLIVS, la expresión debería resultar solamente en la presencia del inductor, IPTG. Las placas en la placa conteniendo IPTG y ninguna placa en la placa sin IPTG, constituye una indicación positiva de expresión controlada de T7 RNA polimerasa.

Confirmación de PCR final de la integridad de integración: La cepa RQ228 fue analizada para confirmar la integridad/especificidad del caso de integración. Las amplificaciones de PCR se realizaron para examinar ambas uniones del caso de integración enfocado a galE, así como la confirmación del tamaño del cartucho de integración completo.

Expresión de PTH usando RQ228: Un plásmido de expresión comprendiendo el gene para PTH es transformado en cualquiera de RQ228 o una célula huésped DE3 usando métodos convencionales. Ambas cepas son cultivadas a 37°C en caldo T conteniendo tetraciclina e inducidas mediante la adición de IPTG a 10 uM. Los cultivos son continuados para incubar durante 6 horas. Las muestras de los cultivos muestran que ambas células huésped expresan PTH. Sin embargo, solo la PTH producida en la célula huésped RQ228 está libre de fagos, mientras que la PTH producida en la célula huésped DE3 tiene niveles medibles de contaminación de fagos en el caldo de fermentación. La E. coli es cultivada a saturación a 37°C durante la noche en caldo T complementado con 0.2% de maltosa y 10 mM MgS04. El cultivo durante la noche es diluido nuevamente a OD 6oo - 0.05 en caldo T nuevamente complementado con 0.2% de maltosa y 10 mM MgS04 y se cultivó agitando a OD6oo = 0.5 y 100 ul de cultivo de E. coli es adicionado a 100 ul de caldo de fermentación. La muestra es mezclada suavemente al agitar vortiginosamente con dedo y se incubó a 37°C durante 20 minutos para permitir la adsorción de fagos. Tres mililitros de 0.4% de agarosa superior T (complementada con 0.2% de maltosa y 10 mM MgS04) son adicionados a la muestra, agitados vortiginosamente y vaciados en placas de agar T pre-calentadas. Las placas son incubadas a 37°C durante aproximadamente 12 horas. El caldo de fermentación libre de fagos no producirá placas observables.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula huésped que comprende un gene de T7 RNA polimerasa integrado de manera homologa bajo control de un promotor lac.

2. La célula huésped de la reivindicación 1, en donde la T7 RNA polimerasa es integrada en un cromosoma de célula huésped sin el uso de un lisógeno de fago.

3. La célula huésped de la reivindicación 2, en donde el promotor lac es promotor lacUV5.

4. La célula huésped de la reivindicación 2 o 3, en donde el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el operón de galactosa del cromosoma huésped.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, en donde el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el operón de galactosa de un plásmido de integración seleccionado del grupo que consiste de pHMM209, pHMM22, pHMM223 y pHMM228.

6. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la célula huésped comprende además un gene no integrado que codifica una proteína objetivo bajo control de un promotor Jllac.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, en donde la proteína objetivo es hormona paratíroidea (PTH).

8. La célula huésped de la reivindicación 7, en donde la PTH es un fragmento N-terminal de 1-84.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en donde el fragmento N-terminal es 1-34.

10. La célula huésped de la reivindicación 6, en donde la proteína objetivo es péptido-1- similar a glucagón (GLP-1) o un análogo o derivado de GLP-1.

11. Un sistema de expresión para producir una proteína objetivo en caldo de fermentación libre de fagos, en donde el sistema de expresión comprende una célula huésped con un gene de T7 RNA polimerasa integrado de manera homologa en un gene no esencial de una célula huésped y un gene no integrado que codifica la proteína objetivo, y en donde el gene no integrado está bajo control de un promotor lilac.

12. El sistema de expresión de la reivindicación 11, en donde el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el operón de galactosa del cromosoma huésped.

13. El sistema de expresión de la reivindicación 12, en donde el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el operón de galactosa a partir de un plásmido de integración seleccionado del grupo que consiste de pHMM209, pHMM22, pH M223 y pHMM228.

14. El sistema de expresión de la reivindicación 13, en donde la proteína objetivo es hormona paratiroidea (PTH).

15. El sistema de expresión de la reivindicación 14, en donde la PTH es un fragmento N-terminal de 1-84.

16. El sistema de expresión de la reivindicación 15, en donde el fragmento N-terminal es 1-34.

17. El sistema de expresión de la reivindicación 13, en donde la proteína objetivo es péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) o un análogo o derivado de GLP-1.

18. Un proceso para preparar una célula huésped que comprende integrar de manera homologa un gene de T7 RNA polimerasa bajo control de un promotor lacUV5 en un gene no esencial del huésped, de manera que sobre la inducción del gene de T7 RNA polimerasa, el caldo de fermentación estará libre de fagos.

19. El proceso de la reivindicación 18, en donde el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el operón de galactosa.

20. El proceso de la reivindicación 19, en donde el gene de T7 RNA polimerasa es integrado en el operón de galactosa a partir de un plásmido de integración seleccionado del grupo que consiste de pHMM209, pHMM22, pHMM223 y pHMM228.

21. Un proceso para preparar una proteína objetivo, la cual comprende a. preparar una célula huésped que comprende integrar de manera homologa un gene de T7 RNA polimerasa bajo control de un promotor lacUV5 en un gene no esencial del huésped, b. transformar la célula huésped con un gene no integrado que codifica una proteína objetivo, y en donde el gene no integrado está bajo control de un promotor lilac, c. inducir la célula huésped para producir T7 RNA polimerasa, d. incubar la célula huésped en el caldo de fermentación durante un tiempo suficiente para permitir que la T7 RNA polimerasa produzca la proteína objetivo y en donde el caldo de fermentación estará libre de fagos

22. El proceso de la reivindicación 21, en donde la proteína objetivo es hormona paratiroidea (PTH).

23. El proceso de la reivindicación 22, en donde la PTH es un fragmento N-terminal de 1-84.

24. El proceso de la reivindicación 23, en donde el fragmento N-terminal es 1-34.

25. El proceso de la reivindicación 21, en donde la proteína objetivo es péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) o un análogo o derivado de GLP-1.