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CN103946237A - 白蛋白结合抗体及其结合片段 - Google Patents

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CN103946237A CN201280055064.0A CN201280055064A CN103946237A CN 103946237 A CN103946237 A CN 103946237A CN 201280055064 A CN201280055064 A CN 201280055064A CN 103946237 A CN103946237 A CN 103946237A
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Abstract

提供了血清白蛋白结合抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列的重链可变结构域和/或包含具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的序列的轻链可变结构域，特别是包含具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的序列的重链可变结构域和轻链可变结构域，或包含具SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的序列的重链可变结构域和轻链可变结构域。本公开内容还涉及编码所述抗体或片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体以及能够表达所述多核苷酸的宿主细胞。本公开内容还包括，包含所述抗体或片段的药物组合物和使用任一种所述抗体或片段的治疗剂。

Description

白蛋白结合抗体及其结合片段
本发明涉及新的白蛋白结合抗体及其片段。此类抗体可用于例如延长缀合至其的药物或蛋白质的体内血清半衰期。还提供了用于产生此类分子和包含它们的药物组合物的方法。
抗体的高特异性和亲和力使得它们成为理想的诊断剂和治疗剂，特别是用于调节蛋白质间相互作用。重组抗体技术领域中的进展已导致抗体片段例如Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段及其它抗体片段的产生。这些较小的分子保持完整抗体的抗原结合活性并且相较于完整免疫球蛋白分子，还可显示改善的组织渗透和药代动力学性质。事实上，抗体片段已被证明为通用的治疗剂，如通过最近获得成功的产品例如和所看到的。虽然此类片段似乎显示许多优于完整免疫球蛋白的有利方面，但它们还遭受增加的从血清清除的速率，因为它们不存在赋予长体内寿命的Fc结构域(Medasan等人,1997,J.Immunol.158:2211-2217)。
改善抗体片段例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2和其它抗体片段的半衰期的方法是已知的。一个方法是将片段缀合至聚合物分子。因此，Fab'、F(ab')2片段在动物中的短循环半衰期已通过缀合至聚乙二醇(PEG；参见，例如，WO98/25791、WO99/64460和WO98/37200)得到改善。另一个方法是通过缀合至与FcRn受体相互作用的试剂来修饰抗体片段(参见，例如，WO97/34631)。延长半衰期的另一个方法是使用结合血清白蛋白的多肽(参见例如，Smith等人,2001,BioconjugateChem.12：750-756；EP0486525；US6267964；WO04/001064；WO02/076489和WO01/45746)。血清白蛋白是血管和血管外区室中丰富的蛋白质，在人中具有约19天的半衰期(Peters,1985,Adv Protein Chem.37：161-245)。这与IgG1的半衰期相似，IgG1的半衰期为约21天(Waldeman&Strober,1969,Progr.Allergy,13：1-110)。
已描述了抗血清白蛋白结合单可变结构域以及它们用作缀合物增加药物包括NCE(化学实体)药物、蛋白质和肽的半衰期的用途，参见例如，Holt等人,Protein Engineering,Design&Selection,第21卷,5,pp283-288,WO04003019、WO2008/096158、WO05118642、WO2006/0591056和WO2011/006915。其它抗血清白蛋白抗体及其在多特异性抗体形式中的用途已描述于WO2009/040562、WO2010/035012和WO2011/086091中。特别地，已描述了称为645gH1和645gL1的、具有本文SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中给出的序列的两个可变结构域。
本发明提供了来源于这些序列的改良的白蛋白结合抗体。有利地，本公开内容的抗体具有与起始抗体相当的亲和力，且此外可具有一个或多个使得它们适合用于治疗产品的性质，例如减小的免疫原性、增加的稳定性、改善的表达等等。
优选地，本发明的抗体结合人血清白蛋白。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合食蟹猴血清白蛋白、鼠血清白蛋白和/或大鼠血清白蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供了包含具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的序列的重链可变区的白蛋白结合抗体或其片段。
在一个实施方案中，本发明提供了包含具有SEQ ID NO：3或SEQID NO：4所示的序列的轻链可变区的白蛋白结合抗体或其片段。
在一个实施方案中，本发明提供了包含具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的序列的轻链可变区的白蛋白结合抗体或其片段。
在一个实施方案中，重链可变区在重链的位置44上具有半胱氨酸并且具有SEQ ID NO：2所示的序列。
在一个实施方案中，轻链可变区在轻链的位置100上具有半胱氨酸并且具有SEQ ID NO：4所示的序列。
本发明的抗体可变区可被整合进入任何适当的抗体形式。此类抗体包括完整抗体及其功能活性片段或衍生物。因此，此类白蛋白结合抗体可包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单可变结构域抗体、scFv、双价、三价或四价抗体、双-scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、三体(tribody)、DVD-Ig、DART、BiTE及上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217)。用于产生和制备这些抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如Verma等人,1998,Journal of ImmunologicalMethods,216,165-181)。多价抗体可包括多特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853、WO99/37791和WO05/113605)。其它多价/多特异性形式包括WO2009/040562、WO2010/035012和WO2011/086091中公开的形式，包括分别在本文的图1A和1B中举例说明的Fab-Fv和Fab-dsFv。
考虑到期望的抗体分子的功能，特别地可能需要的效应子功能，可选择本发明的抗体分子的恒定区结构域(如果存在的话)。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。应理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用Angal等人,Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中描述的、位置241上的丝氨酸被改变成脯氨酸的IgG4分子。本领域技术人员还理解，抗体可经历各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。常见修饰是因羧肽酶的作用而导致的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris,RJ.Journal of Chromatography705：129-134,1995中描述的)。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，抗体轻链包含CL结构域(κ或λ)。
应理解，需要时，可将此类白蛋白结合抗体或其片段缀合至任何其它抗体或其片段，其它蛋白质例如酶、激素、细胞因子、肽或其它分子或药物。本发明的白蛋白结合抗体在延长缀合至其的此类实体的血清半衰期中是特别有用的。
在一个实例中，将本发明的白蛋白结合抗体共价或非共价地连接至选择的治疗性或诊断性化合物。适当的治疗性化合物可包括例如受体激动剂或拮抗剂、酶抑制剂、金属螯合剂、抗病毒剂、抗真菌剂、心血管药物和化学治疗性药物。
在一个实施方案中，将根据本发明的白蛋白结合抗体或其片段融合或缀合至结合目标抗原的第二抗体或其片段。
在一个实施方案中，被第二抗体或抗体片段结合的目标抗原可以是细胞结合蛋白，例如细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目标抗原还可以是任何医学相关蛋白例如在疾病或感染期间被上调的那些蛋白质，例如受体和/或它们的相应配体。细胞表面蛋白的具体实例包括粘附分子例如整联蛋白例如β1整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P选择蛋白或L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134(OX40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、DPCR1、DPCR1、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、结合素-样2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA),人乳脂球蛋白(HMFG1和2)、MHC I类和MHC II类抗原，以及VEGF，以及在适当的情况下，其受体。
可溶性抗原包括白细胞介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17、病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原、免疫球蛋白例如IgE、干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF以及血小板衍生生长因子例如PDGF-α和PDGF-β，并且在适当的情况下，其受体。其它抗原包括细菌细胞表面抗原、细菌毒素、病毒例如流感病毒、EBV、HepA、B和C、生物恐怖剂、放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
在一个实施方案中，抗体或其片段可用于功能性改变目标抗原的活性。例如，抗体可直接或间接中和、拮抗或激动所述抗原的活性。
缀合至本发明的白蛋白结合抗体的抗体或其片段可来自任何物种，但优选来源于单克隆抗体、完全人抗体或人源化抗体。用于本发明的抗体片段可来源于免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG,IgE,IgM,IgD或IgA)或亚类，并且可获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、骆马、山羊或人。
在一个实施方案中，抗体是Fab或Fab'片段，其为单克隆、完全人、人源化或嵌合抗体片段。在一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段是完全人或人源化的。
单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,Nature,1975,256,495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunology Today,1983,4,72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,“Monoclonal antibodies andCancer Therapy”,pp.77-96,Alan R.Liss,Inc.,1985)来制备。
用于本发明的抗体还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA来产生，所述cDNA通过例如Babcook,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93(15),7843-7848,WO92/02551、WO2004/051268和WO2004/106377描述的方法，从经选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生。
人源化抗体是来自非人物种的、具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见，例如，US5,585,089)。
用于本发明的抗体还可使用本领域已知的各种噬菌体展示法产生，包括Brinkman等人,J.Immunol.Methods,1995,182,41-50；Ames等,J.Immunol.Methods,1995,184,177-186；Kettleborough等人Eur.J.Immunol.,1994,24,952-958；Persic等人,Gene,1997187,9-18；和Burton等人,Advances in Immunology,1994,57,191-280；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；和WO95/20401；以及US5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108中描述的那些方法。此外，转基因小鼠或其它生物包括其它哺乳动物可用于产生人源化抗体。
完全人抗体是其中重链和轻链的可变区和恒定区(当存在时)都是人来源的，或大体上与人来源的序列相同，但不必来自相同抗体的那些抗体。完全人抗体的实例可包括例如，通过上述噬菌体展示法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，在所述小鼠中，鼠免疫球蛋白可变区和/或恒定区基因已被它们的人对应物所替代(例如，如EP0546073B1、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP0438474B1和EP0463151B1中的一般性术语所描述的)。
用于本发明的抗体片段例如Fab或Fab'起始材料可使用任何适当的酶促切割和/或消化技术，例如通过用胃蛋白酶处理，从任何完整抗体，特别地完整单克隆抗体获得。备选地或此外，抗体起始材料可通过使用重组DNA技术(包括操纵和重表达编码抗体可变区和/或恒定区的DNA)来制备。标准分子生物学技术可根据需要用于修饰、添加或缺失氨基酸或结构域。对可变区或恒定区的任何改变仍然包括在本文使用的术语'可变'和'恒定'区中。
抗体片段起始材料可获自任何物种包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、骆马、山羊或人。抗体片段的部分可获自超过一种物种，例如抗体片段可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一个物种并且可变区来自另一个物种。抗体片段起始材料还可以是修饰的。在另一个实例中，已使用重组DNA工程技术产生抗体片段的可变区。此类工程形式包括例如通过天然抗体的氨基酸序列中的插入、缺失或变化从天然抗体可变区产生的那些形式。该类型的具体实例包括，包含来自一种抗体的至少一个CDR以及任选地一个或多个构架氨基酸和来自第二抗体的可变区结构域的其余部分的那些抗体。用于产生和制备这些抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如，Boss等人,US4,816,397；Cabilly等人,US6,331,415；Shrader等人,WO92/02551；Ward等人,1989,Nature,341,544；Orlandi等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3833；Riechmann等人,1988,Nature,322,323；Bird等人1988,Science,242,423；Queen等人,US5,585,089；Adair,WO91/09967；Mountain and Adair,1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev,10,1-142；Verma等人,1998,Journalof Immunological Methods,216,165-181)。
在一个实例中，将本发明的白蛋白结合可变结构域融合至单结构域抗体或dAb。用于本发明的也称为单结构域抗体或dAb的单可变结构域可使用本领域已知的方法来产生，并且包括WO2005118642,Ward等人,1989,Nature,341,544-546和Holt等人,2003,Trends inBiotechnology,21,484-490中公开的那些单可变结构域。在一个实施方案中，用于本发明的单结构域抗体是重链重链可变结构域(VH)或轻链结构域(VL)。各个轻链结构域可以是κ或λ亚组。用于分离VH和VL结构域的方法已在本领域中进行了描述，参见例如EP0368684和Ward等人，同上。此类结构域可来源于任何适当的物种或抗体起始材料。在一个实施方案中，单结构域抗体可来源于啮齿类动物、人或其它物种。在一个实施方案中，单结构域抗体是人源化的。
在一个实施方案中，单结构域抗体来源于噬菌体展示文库，使用例如WO2005/118642,Jespers等人,2004,Nature Biotechnology,22,1161-1165和Holt等人,2003,Trends in Biotechnology,21,484-490中公开的方法。优选地，此类单结构域抗体是完全人的，但也可来源于其它物种。在一个实施方案中，单可变结构域是嵌合的，因为构架在来源上是人的或大体人的，并且CDR是非人来源的。应理解，可修饰分离后的单结构域抗体的序列以改善单结构域抗体的特征例如溶解度，如Holt等人(同上)中描述的。
如本文中使用的，大体上人意指，来源材料的人特征得到保留，这可与免疫原性相关。大体上人的材料可包括，其中构架序列中的一个氨基酸被添加、缺失或被另一个氨基酸替代的人材料。
在一个实施方案中，dAb是获自scFv噬菌体展示或转基因HumouseTM或VelocimouseTM或人源化的啮齿类动物的人序列。
在一个实施方案中，dAb获自人或人源化的啮齿类动物、骆驼科或鲨鱼。此类dAb优选是人源化的。在一个实例中，单结构域抗体是基于骆驼科免疫球蛋白的VHH结构域，如EP0656946中描述的。在一个实例中，用目标抗原免疫骆驼或骆马，当滴度适当时收集血液。编码dAb的基因可通过单细胞PCR来克隆，或编码dAb的B细胞可通过EBV转化或通过与永生化细胞系融合来进行永生化。
在一个实例中，将一个或多个本发明的抗体可变结构域整合进入如WO2009/040562,WO2010/035012或WO2011/086091中描述的多价抗体形式。此类形式可以是单特异性、双特异性或三特异性的。因此，在一个优选实施方案中，本发明的抗体融合蛋白是翻译融合蛋白，即遗传融合蛋白，所述融合蛋白的每一个的序列由表达载体编码。或者，可使用化学方法，即通过化学缀合或化学交联融合抗体融合蛋白的组分。此类化学方法在本领域是已知的。
具有或不具有二硫键的此类翻译融合蛋白的实例举例说明于图1A和1B中。
因此，在一个实施方案中，提供了包含具有对于目标抗原的特异性的抗体Fab或Fab'片段的多特异性抗体融合蛋白，所述片段融合至至少一个对于具有SEQ ID NO：1,2,3或4所示的序列的人血清白蛋白具有特异性的单可变结构域序列。
在一个实例中，本发明的白蛋白结合抗体可变结构域融合至抗体片段，例如具有天然或修饰的铰链区的Fab'片段。当用于制备本发明的此类融合蛋白的抗体片段是Fab'片段时，所述片段通常在重链的C末端延长一个或多个氨基酸。因此，本发明的抗体融合蛋白可包含直接或通过接头翻译地融合(或化学融合)至白蛋白结合可变区的Fab'片段。此外，适当的抗体Fab'片段的实例包括WO2005003170和WO2005003171中描述的那些抗体Fab'片段。
在另一个实例中，抗体片段是Fab片段。因此，本发明的抗体融合蛋白可包含翻译地融合(或化学融合)至接头序列的Fab片段，所述接头序列又翻译地融合(或化学融合)至一个或多个白蛋白结合可变区。优选地，Fab片段是在链间半胱氨酸上终止的Fab片段，如WO2005/003169中描述的。
在本发明中，每一个融合至Fab或Fab'片段的抗白蛋白可变结构域可直接连接或通过接头连接。
如本文中使用的，直接连接意欲指，Fab或Fab'的“最后一个”氨基酸通过肽键连接至本发明的白蛋白结合抗体的单可变结构域的“第一个”氨基酸(或反之亦然)。
用于将可变结构域连接至Fab或Fab'的适当的接头区域的实例包括但不限于，柔性接头序列和刚性接头序列。柔性接头序列包括Huston等人,1988,PNAS85:5879-5883；Wright&Deonarain,Mol.Immunol.,2007,44(11):2860-2869；Alfthan等人,Prot.Eng.,1995,8(7):725-731；Luo等人,J.Biochem.,1995,118(4):825-831；Tang等人,1996,J.Biol.Chem.271(26):15682-15686；和Turner等人,1997,JIMM205,42-54中公开的那些柔性接头序列(关于代表性实例，参见表1)。
表1.柔性接头序列
SEQ ID NO： 序列
21 SGGGGSE
22 DKTHTS
23 (S)GGGGS
24 (S)GGGGSGGGGS
25 (S)GGGGSGGGGSGGGGS
26 (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
27 (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
28 AAAGSG-GASAS
29 AAAGSG-XGGGS-GASAS
30 AAAGSG-XGGGSXGGGS-GASAS
31 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
32 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
33 AAAGSG-XS-GASAS
34 PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
35 ATTTGSSPGPT
36 ATTTGS
- GS
37 EPSGPISTINSPPSKESHKSP
38 GTVAAPSVFIFPPSD
39 GGGGIAPSMVGGGGS
40 GGGGKVEGAGGGGGS
4l GGGGSMKSHDGGGGS
42 GGGGNLITIVGGGGS
43 GGGGVVPSLPGGGGS
44 GGEKSIPGGGGS
45 RPLSYRPPFPFGFPSVRP
46 YPRSlYIRRRHPSPSLTT
47 TPSHLSHILPSFGLPTFN
48 RPVSPFTFPRLSNSWLPA
49 SPAAHFPRSIPRPGPIRT
50 APGPSAPSHRSLPSRAFG
51 PRNSIHFLHPLLVAPLGA
52 MPSLSGVLQVRYLSPPDL
53 SPQYPSPLTLTLPPHPSL
54 NPSLNPPSYLHRAPSRIS
55 LPWRTSLLPSLPLRRRP
56 PPLFAKGPVGLLSRSFPP
57 VPPAPVVSLRSAHARPPY
58 LRPTPPRVRSYTCCPTP-
59 PNVAHVLPLLTVPWDNLR
60 CNPLLPLCARSPAVRTFP
(S)在序列23至27中是任选的。
刚性接头的实例包括，肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO：61)、PPPP(SEQ ID NO：62)和PPP。
在一个实施方案中，抗体铰链序列或其部分用作接头例如上铰链序列。通常地，用于本发明的抗体Fab’片段具有天然或修饰的铰链区。此类铰链区用作连接白蛋白结合可变结构域部分的天然接头。天然铰链区是通常与抗体分子的CH1结构域连接的铰链区。修饰的铰链区是在长度和/或组成上与天然铰链区不同的任意铰链。此类铰链可包括来自任何其它物种例如人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、骆马或山羊铰链区的铰链区。其它修饰的铰链区可包括，来源于其种类或亚类与CH1结构域的种类或亚类不同的抗体的完整铰链区。因此，例如，可将种类γ1的CH1结构域连接至种类γ4的铰链区。或者，修饰的铰链区可包含天然铰链的部分或重复单位，其中重复中的每一个单位来源于天然铰链区。在其它选择中，可通过将一个或多个半胱氨酸或其它残基转化成中性残基例如丙氨酸，或通过将适当位置的残基转化成半胱氨酸来改变天然铰链区。通过此类方式，可增加或减少铰链区中的半胱氨酸残基的数目。此外，可控制铰链的其它特征，例如铰链半胱氨酸与轻链链间半胱氨酸的距离，铰链的半胱氨酸与可影响铰链的性质例如柔性的铰链中的其它氨基酸组分之间的距离，例如可将甘氨酸掺入铰链以增加旋转柔性或可将脯氨酸掺入以减小柔性。或者，可将带电荷或疏水性残基的组合掺入铰链以赋予多聚化性质，参见例如，Richter等人，2001，Prot.Eng.14(10)：775-783(关于带电荷的或离子性尾，例如酸性尾用作接头的用途)，和Kostelny等人，1992，J.Immuno1.5(1)：1547-1553(关于亮氨酸拉链序列)。其它修饰的铰链区可以是完全合成的，并且可被设计来具有期望的性质例如长度、组成和柔性。
许多修饰的铰链区已描述于例如US5,677,425，US6642356，WO9915549，WO2005003170，WO2005003169，WO2005003170，WO9825971和WO2005003171中，这些文献通过引用并入本文。此类铰链通常后续于CH1区域，但也可被整合至轻链κ或λ片段的恒定区的末端；关于实例，参见表3。
表3.铰链接头序列
SEQ ID NO： 序列
63 DKTHTCAA
64 DKTHTCPPCPA
65 DKTHTCPPCPATCPPCPA
66 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
67 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
68 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
69 DKTHTCCVECPPCPA
70 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
71 DKTHTCPSCPA
本发明的抗体可变结构域是协同地结合抗原的互补VH/VL对，即它们是具有相同结合特异性的互补VH/VL对。它们事实上是来源于相同抗体的VH/VL对。
在一个实施方案中，将VH结构域融合至重链恒定区(CH1)的C末端并且将VL结构域融合至轻链恒定区(Cκ或Cλ)的C末端。
在一个实施方案中，VH与VL通过二硫键连接，所述二硫键被认为给构建体提供额外的稳定性，这可以是有利的。
在一个或多个实施方案中，重链与轻链恒定区(例如在Fab中)之间，例如CH结构域与CL或CK结构域之间的二硫键不存在，例如因为形成所述二硫键的一个或多个半胱氨酸被替代。所述一个或多个半胱氨酸可例如被丝氨酸替代。
在一个或多个实施方案中，存在重链与轻链之间，CH结构域与CL或CK结构域之间的链间二硫键。
在一个实例中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含：
从N末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域和第二重链可变结构域(VH2)的重链，
从N末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域和第二轻链可变结构域(VL2)的轻链，
其中所述重链和轻链对齐以便VH1与VL1形成第一抗原结合部位并且VH2与VL2形成第二抗原结合部位，
其中被第二抗原结合部位结合的抗原是人血清白蛋白，并且其中所述第二重链可变结构域(VH2)具有SEQ ID NO：1所示的序列，并且所述第二轻链可变结构域(VL2)具有SEQ ID NO：3所示的序列。
在一个实施方案中，白蛋白结合重链和轻链可变区通过二硫键连接。因此，在一个实例中，本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，其包含：
从N末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域和第二重链可变结构域(VH2)的重链，
从N末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域和第二轻链可变结构域(VL2)的轻链，
其中所述重链和轻链对齐以便VH1与VL1形成第一抗原结合部位并且VH2与VL2形成第二抗原结合部位，
其中被第二抗原结合部位结合的抗原是人血清白蛋白，
其中所述第二重链可变结构域(VH2)具有SEQ ID NO：2所示的序列，并且所述第二轻链可变结构域(VL2)具有SEQ ID NO：4所示的序列，和
所述第二重链可变结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)通过二硫键连接。
在一个实例中，本发明提供了多特异性抗体融合蛋白，其包含：
从N末端开始依次地包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域、第二重链可变结构域(VH2)和第三重链可变结构域(VH3)的重链，
从N末端开始依次地包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域、第二轻链可变结构域(VL2)和第三轻链可变结构域(VL3)的轻链，
其中所述重链和轻链对齐，以便VH1与VL1形成第一抗原结合部位，VH2与VL2形成第二抗原结合部位，以及VH3与VL3形成第三抗原结合部位，
其中被第二或第三抗原结合部位结合的抗原是人血清白蛋白，和
其中第二或第三重链可变结构域具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列，并且第二或第三轻链可变结构域具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的序列。
应理解，在上文所列的结构域的一个或多个之间可存在接头。特别地，可在CL与VL2之间和CH1与VH2之间和，当存在时，在VL2与VL3之间和VH2与VH3之间存在接头。适当的接头已在上文中进行了描述。在图2(e)和(f)中提供了另外的接头，SEQ ID NO：5和6。
在一个实施方案中，抗体是scFv。在一个实施方案中，抗体是可变结构域(VH和VL)通过SEQ ID NO：17所示的接头连接的scFv。
本发明的抗体可变结构域以足以延长缀合物例如Fab或Fab'的体内半衰期的结合亲和力结合白蛋白。已报导，小于或等于2.5μM亲和力的对于白蛋白的亲和力可延长体内半衰期(Nguyen,A.等人(2006)Protein Engineering,Design&Selection,19(7),291-297)。在一个实例中，本发明的可变结构域抗体对具有高结合亲和力，例如3nM(纳摩尔)。在一个实例中，单结构域抗体具有纳摩尔(nM)或微摩尔(μM)的对于抗原的结合亲和力。可使用本领域已知的任何适当方法，包括表面等离子体共振技术，使用天然或重组血清白蛋白来测量亲和力。
优选地，本发明的白蛋白结合抗体具有约1μM或更好的对于人血清白蛋白的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约500M或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约200nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约100nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约50nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约20nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约10nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约5nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约2nM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，抗体具有约1nM或更小的结合亲和力。应理解，本发明提供的抗体的亲和力可使用本领域已知的任何适当方法来改变。本发明从而还涉及本发明的抗体分子的变体，其具有改善的对于白蛋白的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟方案来获得，所述方案包括突变CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌的增变株(Low等人,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)论述了这些亲和力成熟方法。
本发明还提供了，编码本发明的白蛋白结合抗体或融合蛋白的分离的DNA序列。本发明的DNA序列可包括合成的DNA(例如通过化学过程产生的)、cDNA、基因组DNA或其任意组合。
编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列可通过本领域技术人员公知的方法获得。例如，可根据需要从确定的DNA序列或基于对应的氨基酸序列合成编码抗体片段、接头和/或dAb的部分或全部的DNA序列。
分子生物学标准技术可用于制备编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成期望的DNA序列。可根据情况使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
本发明还涉及包含一个或多个本发明的DNA序列的克隆性载体或表达载体。因此，提供了包含一个或多个编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列的克隆性或表达载体。在一个优选实施方案中，克隆性或表达载体包含单个编码完整双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。因此，克隆性或表达载体依次包含DNA编码的转录单位，以便产生翻译融合蛋白。
事实上，本领域技术人员理解，本发明的融合蛋白可在N末端或C末端具有白蛋白结合可变结构域，由此白蛋白结合DNA编码的转录单位将在编码翻译融合蛋白的DNA序列内分别位于最前面或最后面。因此，翻译融合蛋白可包含N末端可变结构域和C末端Fab或Fab'。此外，翻译融合蛋白可包含N末端Fab或Fab'和C末端白蛋白结合可变结构域。
应理解，可将抗体或其片段的重链和轻链整合进入相同或不同的载体。在一个实施方案中，一个载体可包含含有重链的翻译融合蛋白，并且另一个载体可包含含有轻链的翻译融合蛋白。
可将包含在本发明的翻译融合蛋白内的抗体片段的DNA编码以本领域技术人员已知的构型整合进入载体作为转录单位，例如转录单位可包含轻链的编码、随后重链的编码或反之亦然；特别地，参见Humphreys等人,2002,Protein Expression and Purification,26：309-320。
优选地，根据本发明的载体包含适当的前导序列，例如抗体前导序列。此类前导序列在本领域是公知的。
构建载体的一般方法、转染和转化方法以及培养方法对于本领域技术人员来说是公知的。在这方面，参考“Current Protocols inMolecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York和由Cold Spring Harbor Publishing提供的ManiatisManual。
还提供了包含一个或多个克隆性或表达载体的宿主细胞，所述载体含有一个或多个编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。任何适当的宿主细胞/载体系统可用于表达编码双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。可使用细菌例如大肠杆菌以及其它微生物系统，或也可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适当的哺乳动物宿主细胞包括NS0、CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。因此，在一个实施方案中，本发明的融合蛋白在大肠杆菌中表达。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白在哺乳动物细胞中表达。
本发明还提供了用于产生白蛋白结合抗体或融合蛋白的方法，包括在适合于从编码所述白蛋白结合抗体的DNA序列表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞。本发明还提供了用于分离白蛋白结合抗体的方法。
在生产后，必要时，可使用本领域已知的任何适当的方法纯化本发明的白蛋白结合抗体。例如，但不限于，可使用层析技术例如离子交换层析、尺寸排阻层析、蛋白G或疏水相互作用层析。
抗体或抗体融合蛋白的尺寸可通过本领域已知的常规方法例如尺寸排阻层析和非还原SDS-PAGE来确认。此类技术可用于例如确认蛋白质未二聚化和/或不具有部分丢失。如果检测到二聚体并且期望均质的单体产物，则可使用上述常规层析技术将单体抗体融合蛋白从二聚体种类中纯化出来。在本发明中，SEQ ID NO：1至4中所示的改善的可变区导致产生更多单体。
本发明的抗体、缀合物和融合蛋白用于治疗疾病或障碍，包括炎性疾病和障碍、免疫疾病和障碍、纤维变性障碍和癌症。
术语“炎性疾病”或“障碍”和“免疫疾病或障碍”包括类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、斯蒂尔病、Muckle Wells病、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、SLE(系统性红斑狼疮)、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、脉管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。
术语“纤维变性障碍”包括特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化症(或硬皮病)、肾纤维化、糖尿病性肾病、IgA肾病、高血压、终末期肾脏疾病、腹膜纤维变性(持续非卧床腹膜透析)、肝硬化、年龄相关黄斑变性(ARMD)、视网膜病变、心脏反应性纤维化、疤痕、疤痕疙瘩、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉架桥手术、关节成形术和白内障手术。
术语“癌症”包括在皮肤或更常见地身体器官(例如：乳腺、卵巢、前列腺、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠)的衬里中发现的、从上皮产生的恶性肿瘤。癌症倾向于浸润入相邻组织并扩散(转移)至远处器官，例如：扩散至骨、肝、肺或脑。
因此，根据本发明的其它方面，提供了包含与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的本发明的抗体、抗体融合蛋白或缀合物的药物组合物。还提供了本发明的抗体融合蛋白用于制造用于治疗疾病或障碍的药剂的用途。最优选，疾病或障碍是炎性疾病或障碍。
根据本发明的药物组合物可采用适合用于口服、含服、胃肠外、皮下、经鼻、局部、经眼或经直肠施用的形式，或适合用于通过吸入或吹入施用的形式。
适当时，例如如果抗体融合蛋白的单结构域抗体结合白蛋白，则可期望使用本领域已知的任何适当的方法，利用人或重组血清白蛋白预配制双特异性融合蛋白。
当药物制剂是液体，例如溶液或悬浮液时，则制剂还可包含白蛋白例如人血清白蛋白，特别地重组白蛋白例如重组人血清白蛋白。适当的量可以为少于2％w/w的总制剂，特别地少于1、0.5或0.1％w/w。这可帮助稳定制剂中的抗体组分。可冷冻干燥药物组合物，以待以后用含水溶剂进行重建。
在一个实施方案中，提供了包含根据本发明的冻干“抗体”的单位剂量容器例如小瓶。
对于口服施用，药物组合物可采取例如，通过常规方法用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸钠)或湿润剂(例如月桂基硫酸钠))制备的片剂、锭剂或胶囊的形式。片剂可通过本领域公知的方法进行包被。用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬浮剂的形式，或可将它们作为干燥产物提供，用于在使用前用水或其它适当的媒介物重建。此类液体制剂可通过常规方法，利用药学上可接受的添加剂例如混悬剂、乳化剂、非水性媒介物或防腐剂来制备。适当时，制剂还可包含缓冲盐、调味剂、着色剂或甜味剂。
可适当地配制用于口服施用的制剂以提供活性化物的受控释放。
对于含服施用，组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
本发明的抗体、融合蛋白和/或缀合物可被配制用于通过注射例如通过单次快速静脉注射或输注而胃肠外施用。用于注射的制剂可以以单位剂量形式，例如于玻璃安瓿或多剂量容器例如玻璃小瓶中提供。用于注射的组合物可采取形式，例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可包含配制剂例如混悬剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂。或者，活性成分可以以粉剂的形式存在，以待使用前用适当的媒介物例如无菌无热原水来重建。
除了上述制剂外，还可将本发明的抗体配制为迟效制剂。此类长效制剂可通过植入或通过肌内注射来施用。
对于经鼻施用或吸入施用，可通过使用适当的喷射剂(例如二氯二氟甲烷、氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体或气体的混合物)，以气雾剂喷雾制剂(用于加压的包装或喷雾器)的形式方便地递送根据本发明的化合物。
必要时，可在包装或分配装置中提供组合物，所述包装或分配装置可包含一个或多个包含活性成分的单位剂量形式。包装或分配装置可附随施用说明书。
对于局部施用，可在包含悬浮于或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的适当软膏中方便地配制根据本发明的化合物。具体的载体包括例如矿物油、液态石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡和水。或者，可将根据本发明的化合物配制于包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的适当洗剂中。具体的载体包括例如矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、苯甲醇、2-辛基十二烷醇和水。
在一个实施方案中，制剂以用于局部施用包括吸入的制剂提供。
适当的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含喷射剂气体的计量气雾剂或不含喷射剂气体的可吸入溶液。根据本公开内容的包含活性物质的可吸入粉剂可仅由上述活性物质组成或由上述活性物质与生理上可接受的赋形剂的混合物组成。
这些可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、低聚糖或多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些物质彼此的混合物。单糖或二糖是适合使用的，乳糖或葡萄糖的使用，特别地但不排他地以其水合物的形式使用。
用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米，例如1-9微米例如0.1至5μm，特别地1至5μm的粒度。活性成分(例如抗体或片段)的粒度是最重要的。
可用于制备可吸入气雾剂的喷射剂气体在本领域是已知的。适当的喷射剂气体选自烃类例如正-丙烷、正-丁烷或异丁烷以及卤代烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。可单独地使用或以其混合物使用上述喷射剂气体。
特别适合的喷射剂气体是选自TG11、TG12、TG134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别适合的。
含喷射剂气体的可吸入气雾剂还可包含其它成分例如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活性试剂)、抗氧化剂、润滑剂以及用于调整pH的装置。所有这些成分在本领域是已知的。
根据本发明的含喷射剂气体的可吸入气雾剂可包含，至多按重量计5％的活性物质。根据本发明的气雾剂包含例如按重量计0.002至5％、按重量计0.01至3％、按重量计0.015至2％、按重量计0.1至2％、按重量计0.5至2％、按重量计或0.5至1％的活性成分。
或者，对肺的局部施用还可以是通过液体溶液或悬浮液制剂的施用，例如使用装置例如喷雾器，例如连接至压缩器的喷雾器(例如由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的连接至Pari Master(R)压缩器的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器)。
可将本发明的抗体形式分散在溶剂中，例如以溶液或悬浮液的形式来进行递送。可将其悬浮于适当的生理溶液例如盐水或其它药学上可接受的溶剂或缓冲液中。本领域已知的缓冲液可包含0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸以及0.45mg至0.55mg的柠檬酸钠/1ml水，以获得约4.0至5.0的pH。悬浮液可使用例如冻干的抗体。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域是公知的，包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。可将溶液或悬浮液封装在脂质体或生物可降解的微球体中。制剂通常通过使用无菌制备方法以大体上无菌的形式来提供。
这可包括生产和灭菌，通过过滤用于配制的缓冲溶剂/溶液、将抗体在无菌缓冲溶剂溶液中无菌悬浮，以及用本领域技术人员熟知的方法将制剂分配入无菌容器。
根据本公开内容的可喷雾制剂可以例如以包装在铝箔袋中的单个剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每一个小瓶在一定体积(例如2ml)的溶剂/溶液缓冲剂中包含单位剂量。
本发明的抗体形式被认为适合于通过喷雾法递送。
为了进行经眼施用，可方便地将根据本发明的化合物在等渗的、pH经调整的无菌盐水(具有或不具有防腐剂例如杀细菌或杀真菌剂，例如硝酸苯汞、苯扎氯铵或醋酸氯己定)中配制为微粒化悬浮液。或者，为了经眼施用，可将化合物配制于软膏例如矿脂中。
为了直肠施用，可方便地将根据本发明的化合物配制为栓剂。这些栓剂可通过将活性组分与适当的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此在直肠中将熔化，从而释放活性组分。此类材料包括例如可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
预防或治疗特定病况所需的本发明化合物的量将取决于选择的化合物和待治疗的患者的病况。然而，一般地，日剂量可以为约10ng/kg至1000mg/kg，通常100ng/kg至100mg/kg，例如约0.01mg/kg至40mg/kg体重(对于口服或含服施用)，约10ng/kg至50mg/kg体重(对于胃肠外施用)，以及约0.05mg至约1000mg，例如约0.5mg至约1000mg(对于经鼻施用或通过吸入或吹入进行的施用)。
本发明的各个实施方案的优选特征可根据实际的情形做必要的修正，而用于每一个其它实施方案。本说明书中引用的所有公开案，包括但不限于专利和专利申请通过引用并入本文，就如同将每一个公开案明确且单独地以全文引用的方式并入本文。
在本说明书的背景中，包含意欲指包括。
当技术上合适时，可组合本发明的实施方案。
实施方案在本文中被描述为包括某些特征/元素。本公开内容还扩展至由所述特征/元素组成或基本上由所述特征/元素组成的实施方案。
现参考下列实施例来描述本发明，所述实施例仅仅是举例说明性的，并且不应当以任何方式稀释为限定本发明的范围。
附图列表：
图1A：Fab-Fv的图示。
图1B：Fab-dsFv的图示。
图2至5：本发明的序列。
图6：显示AlexaFluor488标记的A26Fab-dsFv对活化的人CD4+OX40+T细胞的结合。
图7：显示通过在HEK293细胞中瞬时表达而产生的抗体构建体的ug/ml。
图8：显示Fab二硫键稳定的scFv的SDS-PAGE。
图9：显示与各种构建体的对人血清白蛋白的结合亲和力相关的汇总数据。
图10：显示不同构建体的Fab结合抗原的亲和力的汇总数据。
图11：显示通过在CHO细胞中瞬时表达而产生的抗体构建体的ug/ml。
图12：显示不同构建体的SDS-PAGE分析。
图13：显示CHO细胞中表达的不同构建体的热稳定性数据。
DNA操作和一般方法
将感受态大肠杆菌菌株用于转化和常规培养生长。DNA限制性内切酶和修饰酶获自Roche Diagnostics Ltd.和New England Biolabs。使用Maxi Plasmid Purification试剂盒(QIAGEN,目录号12165)进行质粒制备。使用ABI Prism Big Dye Terminator Sequencing试剂盒(目录号4304149)进行DNA测序反应，并在ABI3100自动化测序仪(Applied Biosystems)上运行。使用程序Sequencher(Genecodes)分析数据。寡核苷酸获自Sigma或Invitrogen。编码初始V区域序列的基因利用DNA2.0通过自动化合成法来构建，并且通过寡核苷酸定向诱变来进行修饰，以产生移植形式。通过基于蛋白G的HPLC法测定Fab-Fv的浓度。
实施例1
A26Fab-645dsFv中的645的不同人源化移植物的产生和分析
我们先前已在WO2010/035012中描述了Fab-dsFv抗体形式(图1B)和称为‘645gH1gL1’的人源化抗白蛋白抗体。我们还在WO2010096418中描述了称为‘A26’的人源化拮抗性抗OX40抗体的产生。此处我们描述了称为645dsgH5gL4的抗体‘645’的新型改良的人源化移植物的产生，以及在Fv组分中包含该移植物且在Fab组分中包含‘A26’可变区的Fab-dsFv抗体分子的产生。
645gH1和gL1的序列示于图3(a)和(b)，SEQ ID NO：9和10中。
A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)质粒的构建
将A26Fab-645dsFv(gL1)轻链(SEQ ID NO：12)的整个编码区克隆入UCB哺乳动物表达载体，于HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列的控制之下。通过重叠PCR法将645dsFv(gL1)(SEQ ID NO：10)的轻链可变区突变成645dsFv(gL4)(SEQ ID NO：4)。将A26Fab-645dsFv(gH1)重链(SEQ ID NO：11)的整个编码区克隆入UCB哺乳动物表达载体，于HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列的控制之下。通过重叠PCR法将645dsFv(gH1)(SEQ ID NO：9)的重链可变区突变成645dsFv(gH5)(SEQID NO：2)。通过测序验证构建体。
A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)的哺乳动物表达
按照制造商的说明书，使用Invitrogen's293fectin转染剂，用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简言之，在RT下用100μl293fectin和1700μl Optipro培养基温育25μg重链质粒和25μg轻链质粒20分钟。随后将混合物添加至50x106HEK293细胞(于50ml悬浮液中)并在37℃，于摇动的条件下温育6天。6天后，通过以1500xg离心10分钟(以除去细胞)来收集上清液，随后将其进行0.22μm无菌过滤。
A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)的蛋白G纯化
使用Amicon Ultra-15浓缩器，利用10kDa截留分子量的膜和以4000xg在甩平式转头中离心来将约50ml的0.22μm过滤的上清液浓缩至约2ml。将1.8ml的浓缩上清液以1ml/min应用至在20mM磷酸盐,40mM NaCl pH7.4中平衡的1ml Gammabind Plus Sepharose(GEHealthcare)柱。用20mM磷酸盐,40mM NaCl pH7.4洗涤柱子，利用0.1M甘氨酸/HCl pH2.7洗脱结合的材料。收集洗脱峰，用2M Tris/HClpH8.5将pH调整至约pH7。使用Amicon Ultra-15浓缩器，利用10kDa截留分子量的膜，并以4000xg在甩平式转头中离心来浓缩pH经调整的洗脱物，并将其渗滤至20mM磷酸盐,150mM NaCl pH7.4中，直至约0.3ml的终体积。
A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)的尺寸排阻分析
通过尺寸排阻HPLC分析蛋白G纯化的样品。在利用PBS pH7.4的等度梯度开发的Superdex20010/300GL Tricorn柱(GEHealthcare)上以1ml/min分离样品。在280nm处进行峰检测，且通过与已知分子量的蛋白质对洗脱体积的标准曲线比较来计算表观分子量。将645dsFv的人源化移植物从gH1gL1改变成gH5gL4导致表达的A26Fab-645dsFv的单体百分比从59％增加至71％(12％的增加)，而dsFv的热稳定性(数据未显示)或dsFv对HSA的结合亲和力(数据未显示)无任何变化。
实施例2
2.1A26Fab-dsFv(645gH5gL4)结合OX40的BIAcore动物学
在本实施例和所有随后的实施例中，A26Fab-dsFv645gH5gL4具有SEQ ID NO：7所示的重链序列(图2(g))和SEQ ID NO：8所示的轻链序列(图2(h))，即重链包含SEQ ID NO：5,图2(e)中显示的G4S、G4T、G4S接头。
使用BIAcore T200(GE Healthcare)进行BIA(生物分子相互作用分析)。通过胺偶联化学将Affinipure F(ab')2片段山羊抗人IgG(F(ab')2片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5传感器芯片上，至≈5000响应单位(RU)的捕获水平。以10μL/min的流速将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,GE Healthcare)用作运行缓冲液。注射10μL的0.5μg/mL的A26Fab'或1μg/mL的A26Fab-dsFv，用于被固定的抗人IgG-F(ab')2捕获。以30μL/min的流速以不同浓度(25nM至1.5625nM)在捕获的A26上滴定人OX40。通过注射2x10μL的50mM HCl，随后注射5μL的5mM NaOH(以10μL/min的流速)再生表面。按照标准方法，使用T200evaluation软件(1.0版)分析扣除本底的结合曲线。根据拟合算法测定动力学参数。
4个测定的平均值。
2.2.A26Fab-dsFv(645gH5gL4)结合白蛋白的BIAcore动力学
使用BIAcore T200(GE Healthcare)进行BIA(生物分子相互作用分析)。通过胺偶联化学将Affinipure F(ab')2片段山羊抗人IgG(F(ab')2片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5传感器芯片上，至≈5000响应单位(RU)的捕获水平。以10μL/min的流速将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,GE Healthcare)用作运行缓冲液。注射10μL的0.75μg/mL的Fab-Fv，用于被固定的抗人IgG-F(ab')2捕获。以30μL/min的流速以不同浓度(50nM至6.25nM)在捕获的Fab-Fv上滴定人血清白蛋白(HSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)和食蟹猴血清白蛋白(CSA)。通过注射2x10μL的50mM HCl，随后注射5μL的5mM NaOH(以10μL/min的流速)再生表面。按照标准方法，使用T200evaluation软件(1.0版)分析扣除本底的结合曲线。根据拟合算法测定动力学参数。
3个测定的平均值。
2.3A26Fab-dsFv(645gH5gL4)同时结合OX40和白蛋白的证实
评估人OX40和人血清白蛋白对A26Fab-dsFv的同时结合。如用于A26Fab-dsFv结合白蛋白的Biacore动力学的方法中所述，将A26Fab-dsFv构建体捕获至传感器芯片表面。在捕获的A26Fab-dsFv上分别滴定50nM HSA、25nM OX40或具有50nM HSA和25nM OX40的终浓度的混合溶液。组合的HSA/OX40溶液的结合响应与单独注射的响应之和相等。这确认了Fab-dsFv能够同时结合人OX40和HSA。
2.4A26Fab-dsFv(645gH5gL4)的基于细胞的亲和力
方法：
A26Fab-Fv对人活化的CD4+OX40+T细胞的结合
通过在Ficoll梯度上进行分离来分离PBMC，利用4μg/mL PHA-L在37℃,5％CO2,100％湿度下活化分离的PBMC，进行3天。使用磁珠(用于人的CD4+T细胞分离试剂盒II；Miltenyi Biotec)通过负选择来分离CD4+T细胞。在4℃、在抗体存在的情况下，于Facs缓冲液(PBS/0.2％BSA/0.09％NaN3)或补充有5％HSA的Facs缓冲液中温育约1x105个细胞。抗体的终浓度在48nM-0.0005nM的范围内。于PBS中洗涤细胞，随后使用FACScalibur(Becton Dickinson)通过流式细胞术进行分析。在两种缓冲条件(一种具有A26Fab-dsFv，另一种具有无关对照Fab-Fv，用于测定非特异性结合)下产生两组滴定数据。结合的抗体的摩尔数通过使用来自标准曲线的内插值来计算，所述标准曲线使用包含不同但已知量的荧光染料的珠粒产生。在细胞和珠粒的流式细胞术分析中测定几何平均荧光值。从A26Fab-dsFv的值扣除非特异性结合，使用单位点结合公式(Graphpad)通过非线性回归分析所产生的特异性结合曲线，以测定KD。
为了测定A26Fab-dsFv对细胞表面表达的抗原的亲和力，使用活化的CD4+OX40+T细胞和Alexa Fluor488-标记的A26Fab-dsFv进行饱和结合实验。将一系列抗体浓度上的平衡时的抗体对受体的特异性结合用于测定KD，假定仅有极少部分的抗体在结合曲线上的任意点上结合受体。
使用下列公式描述平衡结合：
抗体与受体的缔合速率＝konx[受体游离]x[抗体游离]
受体-抗体复合物的解离速率＝koffx[受体-抗体]
平衡时，缔合速率与解离速率相等，且可获得描述结合等温线的公式；在半对数曲线上，结合是S形的。KD由koff/kon定义，并且可根据结合曲线计算为发生半最大结合时的浓度。
AlexaFluor488-标记的A26Fab-Fv对活化的人CD4+OX40+T细胞的结合在跨5个对数浓度的范围上通过流式细胞术来测量。
A26Fab-Fv的代表性结合曲线示于图4中。
使用来自5个不同供体的活化细胞获得的平均KD值为145pM。
实施例3:645gL4gH5作为scFv的表达
质粒构建
从两个密切相关的UCB修饰的哺乳动物表达质粒之一表达scFv；将pVKΔPvuII用于以HL取向克隆和表达scFv，而将pKHΔEcoRV用于以LH取向克隆和表达scFv。所有scFv被设计来包含20个氨基酸的接头肽(GGGGS)4(SEQ ID NO：17)和C末端10xHis标签。scFv接纳体质粒362HL和240LH编码在vH(PvuII和XhoI)和vL(EcoRV和BsiWI)的FW1-FW4边界上的独特限制位点，从而使得能够通过两步骤连接限制性克隆随后的scFv可变区。利用DNA2.0合成编码645gH5vH和645gL4vL的基因，利用Kabat位置vH44和vL100上的半胱氨酸摇摆性来产生二硫键稳定的(ds)scFv。使用PvuII和XhoI(vH)或EcoRV和BsiWI(vL)将这些V-区域基因克隆进入接纳体scFv质粒，并通过DNA测序验证成功的连接。
表达和纯化
用50μg质粒DNA转染HEK293F细胞(50ml的106个细胞/ml的培养物)，将其于37℃培养在FreeStyleTM培养基中。转染后6天收集上清液，通过分批Ni2+-NTA纯化来纯化scFv。浓缩纯化的蛋白质，将缓冲液交换成PBS，以进行随后的生物物理表征。
热稳定性测定
进行Thermofluor测定以评估纯化的分子的热稳定性。将纯化的蛋白质(0.1mg/ml)与Orange染料(Invitrogen)混合，将混合物以一式四份分配入384PCR光学孔板。在7900HT Fast Real-TimePCR系统(Agilent Technologies)上，在20℃至99℃的温度范围内，以1.1℃/min的变温速度分析样品。将每孔的荧光强度变化针对温度作图，所得斜率的拐点用于产生Tm。
尺寸排阻HPLC
在Superdex20010/300GL Tricorn柱(GE Healthcare)上通过尺寸排阻HPLC分析纯化的蛋白质(10μg和50μg)。以1ml/min的流速使用等度梯度的PBS pH7.4，在214nm和280nm处进行UV检测。
结果概述
645gH5gL4HLds具有97％的单体和75.6℃的Tm。
645gH5gL4HL具有86％的单体和75.6℃的Tm。
实施例4
FabA-dsscFv融合蛋白的构建
用于在哺乳动物中表达的质粒
通过以HL取向经柔性接头(SEQ ID：17)连接人血清白蛋白结合抗体的轻链与重链可变区结构域(SEQ ID：1和3或2和4)来构建单链Fv(scFv)。在Fv的重链和轻链的构架区的选择的残基上，将点突变引入DNA序列。引入突变以在Fv的重链与轻链之间产生链间二硫键，所述突变是重链G44C与轻链G100C，用于形成二硫键连接的-scFv(dsscFv)。通过将dsscFv融合至FabA的轻链区(具有κ恒定区的Km3同种异型)或重链(人γ-1CH1恒定区，γ1同种型)的恒定区的C末端来构建FabA-dsscFv融合蛋白。柔性(SEQ ID NO：18和5)接头用于将scFv分别连接至cκ区(SEQ ID NO：19)或CHI区(SEQ ID NO：20)。化学地制备FabA-dsscFv(CL-dsscFv)、FabA-dsscFv(CH1-dsscFv)、FabA轻链和FabA重链，随后将其克隆入哺乳动物表达载体，处于HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列的控制之下。
这些构建体的各种数据示于图7至13中。构建体的热稳定性数据显示，各个构建体的Tm为约82℃。
在本说明书的背景中，包含意欲指包括。
当技术上合适时，可组合本发明的实施方案。
实施方案在本文中被描述为包括某些特征/元素。本公开内容还扩展至由所述特征/元素组成或基本上由所述特征/元素组成的实施方案。
当然应理解，本发明仅通过举例说明的方式进行了描述，绝不意味着是限定性的，并且可在下文的权利要求的范围内进行细节的变动。本发明的各个实施方案的优选特征可根据实际的情形做必要的修正，而用于每一个其它实施方案。本说明书中引用的所有公开案，包括但不限于专利和专利申请通过引用并入本文，就如同将每一个公开案明确且单独地并入本文，如同全文描述一样。

Claims (14)

1.一种血清白蛋白结合抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列的重链可变结构域。
2.一种血清白蛋白结合抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的序列的轻链可变结构域。
3.一种血清白蛋白结合抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO：1所示的序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：3所示的序列的轻链可变结构域。
4.一种血清白蛋白结合抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO：2所示的序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：4所示的序列的轻链可变结构域。
5.权利要求1至4的任一项的血清白蛋白结合抗体或片段，其中所述抗体或片段选自Fab、修饰的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单可变结构域抗体、scFv、双价、三价或四价抗体、双-scFv、双链抗体、三链抗体、三体、DVD-Ig和BiTE。
6.一种双特异性抗体融合蛋白，其包含：
从N末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域和第二重链可变结构域(VH2)的重链，
从N末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域和第二轻链可变结构域(VL2)的轻链，
其中所述重链和轻链对齐，以便VH1与VL1形成第一抗原结合部位并且VH2与VL2形成第二抗原结合部位，
其中被第二抗原结合部位结合的抗原是人血清白蛋白并且其中所述第二重链可变结构域(VH2)具有SEQ ID NO：1所示的序列，并且所述第二轻链可变结构域(VL2)具有SEQ ID NO：3所示的序列，和
所述第二重链可变结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)任选地通过二硫键连接。
7.一种双特异性抗体融合蛋白，其包含：
从N末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域和第二重链可变结构域(VH2)的重链，
从N末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域和第二轻链可变结构域(VL2)的轻链，
其中所述重链和轻链对齐，以便VH1与VL1形成第一抗原结合部位并且VH2与VL2形成第二抗原结合部位，
其中被第二抗原结合部位结合的抗原是人血清白蛋白，
其中所述第二重链可变结构域(VH2)具有SEQ ID NO：2所示的序列，并且所述第二轻链可变结构域(VL2)具有SEQ ID NO：4所示的序列，和
所述第二重链可变结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)任选地通过二硫键连接。
8.编码权利要求1至7任一项中定义的抗体或片段的多核苷酸。
9.包含权利要求8中定义的多核苷酸的载体。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求8的多核苷酸或权利要求9的载体。
11.产生权利要求1至7任一项中定义的抗体或片段的方法，其包括从权利要求10中定义的宿主细胞表达所述抗体或片段。
12.包含权利要求1至7任一项中定义的抗体或片段的药物制剂。
13.权利要求1至7任一项中定义的抗体或片段用于制造药剂的用途。
13.权利要求1至7的任一项的抗体或片段，其用于治疗。
14.治疗有此需要的患者的方法，其包括施用治疗有效量的包含权利要求1至7任一项中定义的抗体或片段的抗体分子的步骤。
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