CN103936853B - 一种检测tim-3试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种检测TIM‑3试剂盒及使用方法，本发明还公开用于检测Tim‑3的单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，各个CDR具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。本发明提供的单克隆抗体能够特异性与人Tim‑3相结合，用所述抗体制备的检测人Tim‑3的试剂盒，具有较高的灵敏度，能够检测出较低浓度的人Tim‑3。

Description

一种检测TIM-3试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及抗人Tim-3的单克隆抗体、其制备方法和在制备检测TIM-3试剂中应用。

背景技术

Tim-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell ImmunoglobμLin domain and Mucin domain protein，Tim)家族成员。Tim-3特异性表达于活化的Th1、Th17效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9，Gal-9)为Tim-3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，Gal-9与Th1、Th17细胞上的Tim-3分子特异性结合，可引发后者的调亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。除了膜结合形式的Tim-3分子，可溶性的Tim-3分子是否，以及如何影响免疫调节过程是目前尚不清楚的内容。目前，研究证实Tim-3分子主要通过调节不同CD4⁺T细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过程。

目前，研究证实Tim-3表达的异常与许多疾病有密切的关系，如研究发现HIV感染的患者、HCV感染的患者、HBV感染的患者、脓毒症的患者以及一些肿瘤患者T细胞上Tim-3的表达升高。例如，与正常小鼠相比，脓毒症小鼠模型腹腔中T细胞、DC细胞上Tim-3表达水平显著增高。Tim-3能介导T效应细胞调亡，传递负性调节信号，可导致机体的免疫功能瘫痪。研究表明，任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均可以使Th1、Th17细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能。

一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表达的升高，导致Th1细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的 恢复，缓解疾病的进程。例如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3/Gal-9结合，增强Th1细胞活性，纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Th1/Th2细胞平衡。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Th1效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用。

上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，Tim-3表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。尽管研究表明Tim-3的中和抗体在某些疾病模型中发挥了很好的干预作用，但是，目前并没有上市的Tim-3抗体。因此，提供一种特异性强的Tim-3抗体，对某些疾病的发病机理研究、疾病诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗人Tim-3的单克隆抗体、其制备方法和应用，该抗人Tim-3的单克隆抗体或其片段能特异性与人Tim-3结合，可以用于制备检测人Tim-3的试剂盒，所得试剂盒具有较高的灵敏度，能够检测出较低浓度的人Tim-3。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种抗人Tim-3的单克隆抗体或其片段，其包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

轻链CDR1具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；

重链CDR1具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

优选地，本发明提供的单克隆抗体或其片段，其轻链可变区包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，其重链可变区包括重链CDR1、重链CDR2 和重链CDR3；

轻链CDR1具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；

重链CDR1具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

优选地，本发明提供的单克隆抗体或其片段，其轻链可变区具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列。

优选地，本发明提供的单克隆抗体或其片段，其重链可变区具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的单克隆抗体或其片段为单克隆抗体，其轻链可变区具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；其重链可变区具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，命名为L3A单克隆抗体。

本发明还提供了一种单克隆抗体或其片段的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：获得具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的DNA分子、具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的DNA分子；

步骤2：取步骤1所得具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的DNA分子与第一表达载体融合，构建第一重组表达载体；取步骤1所得具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的DNA分子与第二表达载体融合，构建第二重组表达载体；或将具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的DNA分子和具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的DNA分子与第三表达载体融合，构建第三重组表达载体；

步骤3：取步骤2所得第一重组表达载体和步骤2所得第二重组表达载体，共转染转入宿主细胞；或将步骤2所得第三重组表达载体转染转入宿主细胞；表达，纯化，即得；

该单克隆抗体或其片段的轻链可变区具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；重链可变区具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中第一表达载体为含有抗体轻链恒定区基因的pcDNA3.1质粒。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中第二表达载体为含有抗体重链恒定区基因的pcDNA3.1质粒。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中第三表达载体为含有抗体恒定区基因的pcDNA3.1质粒。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤3中宿主细胞为哺乳动物细胞。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的单克隆抗体L3A的制备方法包括以下步骤：

步骤1：获得编码轻链的DNA分子，该DNA分子包含具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列；获得编码重链的DNA分子，该DNA分子包含具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；

步骤2：取步骤1所得编码轻链的DNA分子，与第一表达载体融合，构建第一重组表达载体；取步骤1所得编码重链的DNA分子与第二表达载体融合，构建第二重组表达载体；

步骤3：取所得步骤2所得第一重组表达载体、第二重组表达载体，共转染转入哺乳动物细胞中，表达，纯化，即得。

本发明还提供了获得单克隆抗体L3A轻链可变区、重链可变区核苷酸序列和氨基酸序列的方法，具体为：

1、抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

首先，获得人Tim-3蛋白，免疫BALB/c小鼠，用常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。对所得杂交瘤细胞进行了染色体核型分析，杂交瘤细胞染色体平均数目为108条，用双相琼脂扩散实验证明所得杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。

2、单克隆抗体L3A的轻链可变区、重链可变区基因的钓取和轻链可变区、重链可变区基因的确定

提取所得杂交瘤细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物分别钓取抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因。采用常规方法将所得轻链可变区基因转入载体、转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定正确后，进行DNA测序；将所得重链可变区基因转入载体、转化感受态细胞，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定正确后，进行DNA测序；经序列分析、比对，获得了单克隆抗体L3A的轻链可变区基因和重链可变区基因。所得单克隆抗体L3A的轻链可变区基因序列为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，重链可变区基因序列为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。

3、单克隆抗体L3A轻链、重链可变区氨基酸序列的确定

用www.expasy.org在线软件将编码人Tim-3单克隆抗体L3A的轻链、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体L3A的轻链、重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7所示氨基酸序列、SEQ ID NO：8所示氨基酸序列所示。根据Kabat数据库确定单克隆抗体L3A轻链可变区序列中的互补决定区轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。重链可变区序列中的互补决定区重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种编码本发明提供的单克隆抗体或其片段的DNA分子，其具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，该单克隆抗体或其片段的轻链可变区具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码本发明提供的单克隆抗体或其片段的DNA分子，其具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，该单克隆抗体或其片段的重链可变区具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。

本发明成功地从培养的人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得轻链可变区基因和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆到的人Tim-3单克隆抗体L3A轻链可变区基因、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编 码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于人Tim-3表达水平检测的免疫检测工具，制备诊断和治疗Tim-3高表达所导致疾病的药物。

本发明还提供了一种单克隆抗体或其片段在制备用于检测人Tim-3的免疫检测工具中的应用，该单克隆抗体或其片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

轻链CDR1具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；

重链CDR1具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

优选地，本发明提供的应用中的免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用中的免疫检测工具为试剂盒。

本发明还提供了一种含本发明提供的单克隆抗体或其片段的试剂盒，该单克隆抗体或其片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

轻链CDR1具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；

重链CDR1具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒包括L3A单克隆抗体、兔抗人Tim-3多克隆抗体和HRP标记羊抗兔抗体。

本发明提供的单克隆抗体L3A特异性强，能够特异性与人Tim-3相结合，当其应用于制备检测人Tim-3的试剂盒时，显著提高了试剂盒的灵敏度。实验结果表明，本发明提供的试剂盒能够灵敏地检测生物样品中Tim-3的含量， 其灵敏度达到0.1ng/mL～1000ng/mL。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的兔抗人Tim-3多克隆抗体的制备方法包括：

获得人Tim-3抗原；

将所得人Tim-3免疫兔之后，采集抗血清，纯化，即得。

本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

步骤1：4℃条件下，包被L3A单克隆抗体16h～18h；

步骤2：加入生物样品，37℃孵育1h；

步骤3：加入兔抗人Tim-3多克隆抗体，37℃孵育1h；

步骤4：加入HRP标记羊抗兔抗体，经37℃孵育0.5h之后，显色，终止，检测；

步骤5：根据检测结果判断生物样品中所含的人Tim-3的浓度。

本发明提供了一种抗人Tim-3的单克隆抗体或其片段。该抗人Tim-3的单克隆抗体或其片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，其中轻链CDR1具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；重链CDR1具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；重链CDR2具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。实验结果表明，本发明提供的单克隆抗体或其片段能够特异性与人Tim-3相结合，可以用于制备检测人Tim-3的试剂盒，所得试剂盒具有较高的灵敏度，能够检测出较低浓度的人Tim-3。

附图说明

图1示采用间接ELISA方法检测本发明实施例5制得的兔抗人Tim-3的多克隆抗体的抗血清效价的结果示意图，其中曲线1示实施例5制得的兔抗人Tim-3的单克隆抗体与人Tim-3结合曲线；曲线2示对照组血清与人Tim-3结合曲线；

图2示本发明实施例6制得的试剂盒的灵敏度检测结果，其中，曲线1 示实验组检测结果，曲线2示对照组检测结果；

图3示本发明实施例8中采用实施例6制得的试剂盒检测不同生物样本中人Tim-3水平的结果，其中其中图3A为成人样品：样品1：健康对照，样品2：TID(1型糖尿病)，样品3：SLE(系统性红斑狼疮)；图3B为儿童：样品4：健康对照，样品5：哮喘。

图4示本发明实施例9中采用实施例6制得的试剂盒检测不同程度的脓血症患者血清中人Tim-3水平的结果。

具体实施方式

本发明公开了一种抗人Tim-3的单克隆抗体、其制备方法和应用。本领域技术人员可以参考本文内容，实施该制备方法，获得抗人Tim-3的单克隆抗体，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的抗人Tim-3的单克隆抗体、其制备方法和应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

1.材料

福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂，显色试剂TMB：Sigma公司产品；20％胎牛血清：北京元亨圣马生物技术研究所产品；无血清RPMI1640：Gibco公司产品；SP2/0细胞：ATCC引进，军事医学科学院基础医学研究所保存；BALB/c以及C57BL/6小鼠：军事医学科学院实验动物中心提供；重组人Tim-3(rhTim-3)由军事医学科学院基础医学研究所制备。其余试剂均为市购。

2.方法和结果

(1)BALB/c小鼠免疫。选用4～6周龄的雌性BALB/c小鼠6只，用100μg篦麻毒素(Sigma公司)于腹股沟皮下免疫，第一针加福氏完全佐剂，第二针加福氏不完全佐剂，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，用间接ELISA检测抗体产生情况，在融合前3天，以100μg ricin腹腔加强免疫一次，第3天融合。

(2)细胞融合。将免疫的小鼠摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合。具体方法为：①将免疫的小鼠摘眼球放血后脱颈处死，75％酒精浸泡3min，无菌取出脾脏，用200目钢网研磨单个细胞悬液，无血清RPMI1640洗两次并记数；②收集对数生长期的SP2/0细胞，用无血清RPMI1640洗两次并记数；③按SP2/0细胞：脾细胞＝1∶5的比例混合两种细胞，用RPMI1640洗1次，弃尽上清，轻轻将细胞打散；④在1min时间里缓慢加入1mL50％PEG(M_W为1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、5min时间时分别加无血清RPMI16401mL、5mL、10mL；⑥800r/min离心7min，弃上清，尽可能轻地将细胞悬起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×10⁶/mL，混匀后滴加在铺有滋养细胞(1×10⁴细胞/孔)96孔培养板(Gibco)中，100μL/孔，置于37℃的5％CO₂孵箱中培养。

(3)用间接ELISA筛选抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞。用10μg/mL重组人Tim-3(rhTim-3)包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，以及1∶500稀释的50μLHRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物显色后，于450nm波长测定OD值。

(4)杂交瘤细胞克隆化。用间接ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法：①在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞：脱颈处死昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5mL1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，用加20％胎牛血清的1640培养液稀释后滴入96孔板，每孔约0.1mL。②取少许待作克隆化的杂交瘤细 胞移至另一无菌试管中，并准确计数。③有限稀释法进行亚克隆。④将培养板置于37℃的5％CO₂孵箱中培养，5天后在显微镜下观察细胞克隆。适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株进行扩大培养，及时冻存细胞株。

(5)杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型的确定。用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，对所得杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验，结果表明上述杂交瘤细胞培养上清只能与羊抗鼠IgG2a抗体形成结合条带，证明本实施例所得杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。通过上述步骤，筛选到人Tim-3单克隆抗体，命名为L3A单克隆抗体。

实施例2人Tim-3单克隆抗体L3A轻链可变区、重链可变区基因的钓取

1.材料

(1)轻链可变区上下游引物

轻链上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7，其序列分别见序列表SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；轻链下游引物MuCK，其序列见序列表SEQ ID NO：14，引物在PCR扩增时的使用浓度均为10pmol/μL。

(2)重链可变区上下游引物

重链上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8，其序列见序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；重链下游引物MuIgG2a见序列表中SEQ ID NO：19，引物在PCR扩增时的使用浓度为10pmol/μL。

(3)DNA片段纯化试剂盒：OMEGA生物科技公司产品；T4DNA连接酶：New England Biolabs产品；载体PGEM Teasy：Promega公司产品；感受态细菌JM109：购自Promega公司。其余试剂来源同实施例1。

2.方法结果

(1)取对数生长期的实施例1制的单克隆抗体L3A的细胞株5×(10⁶～10⁷)个，离心去除上清，将细胞均匀弹起。加1mL TRIzol(Invitrogen)反复吹打使细胞充分裂解，振荡5分钟后，加入0.2mL氯仿，振荡15秒，室温放置2～3min，2℃～8℃12000r/min，离心15分钟，取上清于另一新管中，加500μL异丙醇混匀后室温放置10分钟，2℃～8℃12000r/min离心 10min。75％乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20μL无RNA酶的去离子水溶解沉淀。

(2)取含1μg总RNA的溶液，依次加入AMV5×缓冲液4μL，Oligo(dT)(500ng/μL)0.5μL，2.5mmol/L dNTP2μL，RNasin(50U/μL)0.5μL，补去离子水至20μL、反转录酶2～5U，42℃延伸1小时。95℃变性5min，置冰浴中，所得产物为cDNA第一链。分别用特异性引物扩增轻链可变区基因和重链可变区基因。

轻链可变区基因扩增体系：取上述所得产物，即反转录产物2μL，Taq酶10×buffer2μL，轻链上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7各1μL，下游引物MuCK3μL，2.5mmol/L dNTP4μL，加Taq酶1～2U，补去离子水至50μL。PCR扩增条件为：95℃变性2分钟，循环参数为：94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，72℃后延伸10min，将所得扩增产物标记为扩增产物1。

重链可变区基因扩增体系：取上述所得产物，即反转录产物2μL，Taq酶10×buffer2μL，重链上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8各1μL，下游引物MuIgG2a3μL，2.5mmol/L dNTP4μL，加Taq酶1～2U，补去离子水至50μL。PCR扩增条件为：95℃变性2分钟，循环参数为：94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，72℃后延伸10min，将所得扩增产物标记为扩增产物2。

(3)用琼脂糖凝胶电泳分别分离出扩增产物1和扩增产物2中欲回收的DNA片段，即目的DNA片段，在长波紫外光下分别切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，一一标记，加入三倍胶体积的化胶液，55℃水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒分别回收扩增产物1中目的DNA片段和扩增产物2中的目的片段中并将纯化的DNA片段溶解在水溶液里，分别标记，将回收的PCR产物在T4DNA连接酶缓冲液中按2∶1的比例(摩尔比)和载体PGEM Teasy混合后，加入0.5U的T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接反应的总体积为10μL，并一一对应标记。

(4)取上述所得连接液10μL，加于200μL感受态细菌JM109中并轻柔 混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2min，加800μLLB培养基，转入37℃恒温摇床，以150r/min的速度摇动45min，4000r/min离心1min，弃去800μL上清，取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg/mL)的固体LB平板，将平板倒置于37℃孵箱12～18h，并一一对应标记。

(5)在所得上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，并一一对应标记。37℃恒温摇床170r/min，震荡培养过夜。分别取3mL菌液加入1.5mL Eppendorf管中，10000r/min离心1min，弃上清。采用质粒提取试剂盒，将沉淀菌体重悬于100μL溶液I中，加新鲜配制的溶液II200μL，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150μL溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4℃，12000r/min离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000r/min离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置3h。4℃，12000r/min离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40μL无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及DNA测序分析。

通过上述步骤构建了含有人Tim-3的单克隆抗体L3A轻链可变区基因的载体、重链可变区基因的载体。经序列比对，获得了编码L3A单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列和编码L3A单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列。所得编码L3A单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列；所得编码L3A单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7所示氨基酸序列、SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。

实施例3单克隆抗体L3A的表达和纯化

1.材料

Protein A Sepharose CL4B柱蛋白柱：北京本元正阳生物技术有限公司产品；pcDNA3.1质粒：Invitrogen；其余试剂和材料的来源同实施例1。

2.方法和结果

将实施例2获得的单克隆抗体L3A轻链可变区基因，轻链恒定区基因装入pcDNA3.1质粒，得含单克隆抗体L3A轻链基因的载体；将实施例2获得的单克隆抗体L3A重链可变区基因，重链恒定区基因装入pcDNA3.1质粒，获得含单克隆抗体L3A重链基因的载体。含有单克隆抗体L3A轻链基因的载体、重链基因的载体共转染转入哺乳动物细胞中，进行表达。收集表达上清，加入1mL pH8.0、0.1mol/L磷酸缓冲液并用1mol/L TRIS-HCL调整pH至9.0。把小鼠腹水加入已经用pH8.0、0.1mol/L磷酸缓冲液平衡好的Protein A Sepharose CL4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1mol/L pH8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01mol/L的PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280，计算蛋白质含量，冻干后于-20℃保存。

实施例4单克隆抗体L3A的特异性检测

1.材料

脓毒症患者血清为收集于解放军总医院脓毒症病人的血液经处理获得；正常人血清为收集于正常人的血液经处理获得；ELISA包被液、PBST、TMB、H2SO₄、TNF-a、硫氧环蛋白均为市售，其余试剂和材料的来源同实施例1。

2.方法和结果

采用间接ELISA方法考察实施例3制得的L3A单克隆抗体的特异性。实验设对照组1、对照组2、对照组3、实验组、阳性对照组、阴性对照组。其中对照组1包被无关抗原TNF-a1μg/mL，对照组2包被无关抗原硫氧环蛋白(TRX)1μg/mL；对照组3包被BSA1μg/mL；实验组包被脓毒症病人血清；阳性对照组包被人TIM-3抗原(即重组人Tim-3)1μg/mL；阴性对照组包被正常人血清。每组样品用包被液稀释，每个样品包被2孔于ELISA板中，每孔100μL，4℃过夜。PBST洗5遍，封闭，200μL封闭液，37℃，封闭2小时，PBST洗5遍。按10μg/mL的终浓度加入L3A单克隆抗体50μL，37℃反应1小时，PBST洗5遍。加入300×稀释anti-mouse抗体(KPL公 司)，37℃反应45min。PBST洗7遍，加入50μL/孔的TMB，室温避光孵育10min后，加入50μL/孔的1mol/L的硫酸终止反应，酶标仪检测450nm处OD值，计算每组两孔数值的平均值。单克隆抗体L3A特异性检测结果见表1。

表1单克隆抗体L3A特异性检测结果

根据表1中数据可知，阴性对照组、对照组1、对照组2和对照组3(三个无关蛋白对照)的四个组别的OD450值差异不显著，说明实施例3制得的单克隆抗体L3A不与无关蛋白相结合；与阴性对照组相比较，阳性对照组和实验组OD450值差异及其显著，呈现明显的阳性结果。与阳性对照相比较，实验组与阳性对照组的OD450值相当，实验组中含有人Tim-3抗原，说明实施例3制得的单克隆抗体L3A能够特异性与人Tim-3相结合，而不与其他蛋白结合，可以用于制备检测人Tim-3的免疫检测工具。

实施例5兔抗人Tim-3多克隆抗体的制备

1.材料

成年家兔：雄性，体重2-3kg，军事医学科学院实验动物中心提供；福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂：Sigma公司产品；其余试剂和材料来源同实施例1。

2.方法和结果

(1)兔子免疫。将人Tim-3抗原(PBS溶解)与佐剂1∶1混合，乳化完全。第一次用完全辐式佐剂(CFA)免疫，第二、第三次用不完全辐式佐剂IFA免疫，间隔2-3周。选用雄性兔2只，免疫前每只兔子经耳静脉采血各1mL，分离血清，一一标记，用于对照样本。免疫方法为皮下多点注射，总剂量2mL(1mL人Tim-3抗原+1mL佐剂)/只。末次注射后第7天，耳静 脉采血1mL，分离血清，一一标记，用试管凝集试验滴定效价，检测结果为两者的抗血清的效价分别为1∶3000和1∶4000(1∶2000以上可用)，均符合要求。

(3)抗血清采集。取抗血清效价为1∶4000的兔子，颈动脉放血，并收集于无菌三角烧瓶中凝固后4℃冰箱过夜，分离上层血清。然后2500r/min离心10min，收集收集上层血清。收集的血清经鉴定纯化后，小量分装，-20℃冻存。

(4)ELISA方法检测抗血清效价。实验分为两组，为实验组和对照组；实验组和对照组包被人Tim-3抗原1μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。PBST洗5遍，封闭，200μL封闭液，37℃，封闭2小时，PBST洗5遍。然后分别加入不同稀释度的(3)所得的抗血清及对照组血清来考察本实施例获得的兔抗人Tim-3的抗血清50μL，37℃反应1小时，PBST洗5遍。加入HRP标记山羊抗兔抗体，37℃反应60min。PBST洗7遍，加入50μL/孔的TMB，室温避光孵育10min后，加入50μL/孔的1mol/L的硫酸终止反应，酶标仪OD450nm检测。减去空白对照孔吸收值后，以OD450nm值与抗血清稀释倍数作图，得本实施例制得的兔抗人Tim-3抗血清与人Tim-3的结合情况。以(样品吸光值-空白吸光值)/(阴性吸光值-空白吸光值)＞2.1，即认为是阳性，来计算本实施例所得的兔抗人Tim-3抗血清效价。本实施例制得的兔抗人Tim-3抗血清(即多克隆抗体)与人Tim-3抗原结合情况见图1，对比对照组，按照上述公式计算，得本实施例获得的兔抗人Tim-3的抗血清的效价为1∶3000，即本实施例获得的兔抗人Tim-3的多克隆抗体的效价为1∶3000。

实施例6试剂盒的制备和使用方法

1.试剂盒的制备

本发明提供的试剂盒包括以下组分：L3A单克隆抗体、兔抗人Tim-3多克隆抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品重组人Tim-3(100ug/mL，0.1mL)、阴性对照样品BSA。

其中L3A单克隆抗体，由本发明实施例3提供的制备方法制备获得；兔 抗人Tim-3多克隆抗体，由本发明实施例4提供的制备方法制备获得。辣根过氧化物酶底物缓冲液的配置方法为：称取10mg3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于5mL无水乙醇中制备成TMB贮存液。待使用时取0.5mL TMB贮存液加到10mL磷酸柠檬酸底物缓冲液(0.2mol/L Na₂HPO₄，0.1mol/L柠檬酸)中，再加入32μL0.75％H₂O₂混匀，配置成辣根过氧化物酶底物缓冲液。其余试剂来源同实施例1。

2.试剂盒的使用方法

采用本发明提供的试剂盒检测人Tim-3的方法如下：

步骤1：包被单克隆抗体L3A(10μg/mL)到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤2：按合适的稀释度(如，1∶2～1∶10)稀释正常人或患者的血浆，加入到步骤1所得的包被有L3A的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤3、加入兔抗人Tim-3的多克隆抗体(1∶5000)，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤4、加入HRP标记羊抗兔抗体(1∶1000)，37℃孵育0.5小时之后，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。

步骤5、根据检测结果判断患者的血浆中所含的人Tim-3的浓度。

实施例7试剂盒灵敏度检测

1.材料

试剂盒为实施例6提供的制备方法制得。其他试剂均为市购。

2.方法

实验设实验组和对照组，实验组待检测蛋白为蛋白标准品重组人Tim-3，对照组待检测蛋白为Trx蛋白。不同组别之间，除了待检测蛋白样品不同外，其他完全一致，具体操作如下：

步骤1：包被单克隆抗体L3A到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含 0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤2：取蛋白标准品重组人Tim-3蛋白，配置成不同的浓度(浓度分别为0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL和10000ng/mL)，加入到步骤1所得的包被有L3A的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤3：加入兔抗人Tim-3的多克隆抗体，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤4：加入HRP标记羊抗兔抗体，37℃孵育0.5小时之后，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。

步骤5：以OD450值和蛋白浓度做图，判断生物样品中所含的人Tim-3的水平。

检测结果见图2，对其进行分析可知，实验组中随着蛋白浓度的增加，OD450值逐渐增大，而对照组所有组别的OD450值都较低，并且未随蛋白浓度变化而变化，说明了本发明提供的试剂盒能够特异性检测生物样品中人Tim-3的含量，其检出限为0.1ng/mL到1000ng/mL，与已报道的人Tim-3的最低检出限1ng/mL相比，显著提高了人Tim-3检测试剂盒的检出限和灵敏度。

实施例8试剂盒检测生物样本中人Tim-3的水平

1.材料

试剂盒为实施例6制得的试剂盒；正常人血清来自于10名正常人；哮喘患者血清来自于医院10名哮喘患者；I型糖尿病患者血清来自于医院10名I型糖尿病患者；系统性红斑狼疮患者的血清来自于解放军总医院系统性红斑狼疮6名患者；其他试剂均为市售。

2.方法与结果

实验分为阴性对照、正常人血清组、哮喘患者血清组、I型糖尿病患者血清组和系统性红斑狼疮患者血清组。不同组别之间，除了待检测生物样品 不同外，其他完全一致，具体操作如下：

步骤1：包被单克隆抗体L3A到高亲和力ELISA板中，分别标记，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤2：取正常人血清、哮喘患者血清、I型糖尿病患者血清和系统性红斑狼疮患者血清，加入到步骤1所得的包被有L3A的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤3：加入兔抗人Tim-3的多克隆抗体，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤4：加入HRP标记羊抗兔抗体，37℃孵育0.5小时之后，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。

步骤5：统计各个组别所得的检测结果，进行分析总结。

实验结果表明阴性对照吸收值很低，说明试剂盒试剂正常，数据可靠。本实施例各个组别所得的检测结果见图3，根据图3可知，与成人正常人血清相比较，I型糖尿病患者血清中可溶性Tim-3(sTim-3)的含量显著降低，与儿童正常人血清中可溶性Tim-3相比，哮喘儿童患者血清中可溶性Tim-3(sTim-3)的含量显著升高；哮喘患者血清、系统性红斑狼疮患者血清中Tim-3出现了不同程度的变化，与研究报道相一致；这些都说明了本发明制得的试剂盒能够应用于科研和临床检测。

实施例9试剂盒检测生物样本中人Tim-3的水平

1.材料

试剂盒为实施例6制得的试剂盒；不同脓毒症阶段的患者的血清：炎症综合症患者(其临床病症轻于脓毒症患者)血清来自于医院10名患者；脓毒症患者血清来自于医院10名患者；严重脓毒症患者血清来自于医院10名患者；脓毒症休克患者的血清来自于解放军总医院10名患者；其他试剂均为市售。

2.方法与结果

实验分为炎症综合症组、脓毒症组、严重脓毒症组和脓毒症休克组。各个组别除了待测生物样品不同外，其他完全一致，具体操作如下：

步骤1：包被单克隆抗体L3A到高亲和力ELISA板中，分别标记，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤2：取炎症综合症血清组、脓毒症血清组、严重脓毒症血清组和脓毒症休克血清，加入到步骤1所得的包被有L3A的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤3：加入兔抗人Tim-3的多克隆抗体，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

步骤4：加入HRP标记羊抗兔抗体，37℃孵育0.5小时之后，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。

步骤5：统计各个组别所得的检测结果，进行分析总结。

实验结果见图4，从图中可以得出不同脓毒症阶段患者血清中可溶性Tim-3(sTim-3)的含量不同，其含量随着疾病严重程度的增加而增多，与研究报道一致。说明我们的试剂盒能用于科研和疾病临床监测。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抗人Tim-3的单克隆抗体，其特征在于，其包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.一种编码如权利要求2所述的单克隆抗体的DNA分子，其特征在于，其具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

5.一种编码如权利要求3所述的单克隆抗体的DNA分子，其特征在于，其具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。

6.如权利要求1至3任意一项所述的单克隆抗体在制备用于检测人Tim-3的免疫检测工具中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

8.一种含权利要求1至3任意一项所述的单克隆抗体的试剂盒。