CN103173457B - 抗cd20单克隆抗体可变区序列及其制备方法 - Google Patents

Abstract

抗CD20单克隆抗体可变区序列，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为51802-VH和51802-VL。用CD20蛋白作为抗原，免疫小鼠后，检测得到相应抗体表达呈阳性的小鼠，分离其脾细胞后，融合脾细胞和骨髓瘤细胞，在HAT培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的cDNA，再用特异引物PCR获得相应抗体重链可变区和轻链可变区，并进行克隆和测序。

Description

抗CD20单克隆抗体可变区序列及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及抗CD20单克隆抗体可变区序列及其制备方法。

背景技术

CD20分子是人类B淋巴细胞表面特有的标识，在B淋巴细胞表面以寡聚体形式存在。CD20的结构与一些离子通道相似，每一个CD20单体都是4次跨膜，分子的N端和C端在细胞质的同侧，可形成多聚体，CD20可在B淋巴细胞膜上形成钙离子通道，CD20抗体在BCR的作用下，可形成钙离子流。B细胞活化后，BCR—CD20复合物解离，磷蛋白、钙调素结合蛋白会暂时被招募到CD20，从而参与胞内信号的传导。

在人体中几乎所有正常或恶性B淋巴细胞都存在CD20抗原。但是，其他血细胞如T淋巴细胞、NK细胞及粒细胞等不存在CD20抗原。因此，CD20抗原是单克隆抗体治疗的一个理想的靶抗原。现在已经合成了一种针对CD20抗原的特异性抗体，称为抗CD20，用于治疗病情缓慢、侵袭性低的B细胞非霍奇金淋巴瘤，有效率达30％-50％。

人体对鼠源抗体具有免疫反应，这也是鼠源抗体应用于临床治疗的主要障碍。通过基因工程抗体技术可以在基因水平上改造抗体，降低鼠源抗体的免疫原性，提高抗体特异性、稳定性和亲和力。对鼠源抗体进行人源化改造，可保留抗体可变区与人源抗体恒定区融合，提高抗体亲和力；或改造抗体结构，构建只保留抗体可变区的scFv或含抗体可变区和部分恒定区的Fab,可提高抗体在体内的吸收百分比和半衰期。

发明内容

如上所述，抗CD20应用于B淋巴细胞瘤的临床治疗，疗效显著，毒副作用小，如今对抗CD20的分析研究越来越多，基于这一背景，本发明的目的是构建抗CD20单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列，同上提供制备上述核苷酸序列的方法。

为实现上述目的，本发明用CD20蛋白作为抗原来免疫小鼠，然后检测出相应抗体表达呈阳性的小鼠，取表达呈阳性小鼠的脾脏，分离脾细胞，然后融合脾细胞和骨髓瘤细胞，得到杂交瘤细胞；在HAT培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的cDNA，再通过PCR扩增获得相应抗体重链可变区和轻链可变区，由此实现本发明。

本发明提供了下述各项：

抗CD20单克隆抗体可变区序列，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为51802-VH和51802-VL。

优选的，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏号为407CT20.1.2的杂交瘤细胞株制备而成。

优选的，所述51802-VH编码117个氨基酸，分子量为13273D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为26aa-33aa,51aa-60aa和99aa-106aa。

优选的，所述51802-VL编码113个氨基酸，分子量为12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为27aa-37aa,55aa-57aa和94aa-102aa。

优选的，还包括与上述两种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。

优选的，还包括经过一个或者几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。

制备抗CD20单克隆抗体可变区序列的方法，包括以下步骤：

（1）杂交瘤细胞的制备：首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；

（2）单克隆细胞的筛选：将上述杂交瘤细胞在HAT培养基中培养，对ELISA检测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后将筛选出的ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存；

（3）杂交瘤细胞抗CD20单克隆抗体的获得：首先鉴定步骤（2）所制备的单克隆细胞的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗CD20单克隆抗体；

（4）抗CD20单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆：提取步骤（3）中所用的单克隆细胞的总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到cDNA，最后克隆得到抗CD20单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。

本发明提供了抗CD20单克隆抗体可变区序列，及其克隆测序方法，其可用于用于制备重组抗体、ScFv抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单域抗体等；在制备用于B淋巴细胞瘤的治疗和诊断药物中具有重要价值。

附图说明

图1.407CT20.1.2克隆抗体的免疫印迹图

其中1-5条带分别表示8ug/mL,4ug/mL，3ug/mL，1ug/mL，0.5ug/mL；“-”表示阴性血清；“+”表示阳性血清。

图2.407CT20.1.2克隆抗体可变区VH和VL的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果

其中泳道1为VH基因，泳道2为VL基因，泳道3为DL2000DNA Marker。

图3.407CT20.1.2克隆抗体可变区VH和VL目的片段构建到pMD18-T载体上酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图

其中泳道1为pMD18-T/VH，泳道2为pMD18-T/VL，泳道3为DL2000DNAMarker。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前题下对本发明制备方法的简单改进，对本发明可变区核苷酸序列的利用都属于本发明要求保护的范围。

实施例1.抗CD20单克隆抗体可变区序列的制备与鉴定

1、杂交瘤细胞制备

1.1动物免疫

以CD20蛋白抗原同时免疫3只6-8周龄的雌性健康的BALB/c小鼠，3次免疫后，7天采血并测血清中抗体的效价，选择1：4000稀释时ELISA检测OD值大于1.0的血清，同时血清WB检测呈阳性的BALB/c小鼠用于融合，融合之前的3天，用不加佐剂的抗原腹腔加强免疫注射，注射剂量为50ug/只。

1.2收集B淋巴细胞

追加免疫后3天，小鼠摘眼球取血，离心后获得血清作阳性对照；无菌状态下取小鼠脾脏，并将脾脏放在10mL预温不完全培养基中，去除结缔组织，置于100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，边研磨边滴加不完全培养基冲洗；收集过滤后的细胞悬液于离心管中，离心后弃上清液，然后用不完全培养基悬浮细胞，取1×10⁸个细胞，在室温下放置待用。

1.3小鼠骨髓瘤细胞的制备

融合前10天,将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，在1min内使冻存液完全溶解；离心，弃上清液，置IMDM完全培养基中，37℃，5%CO₂细胞扩大培养；融合前2-3天，细胞应处于对数生长期。融合前将对数生长期小鼠骨髓瘤细胞收集到离心管中，计数，取2×10⁷-3×10⁷个细胞，离心弃上清液，用不完全培养基悬浮细胞，置室温待用。

1.4细胞融合

融合前将50%PEG置37℃，5%CO₂细胞培养箱中调整温度，将2×10⁷-3×10⁷个骨髓瘤细胞悬液和1×10⁸个脾脏B淋巴细胞悬液移至一个50mL离心管中，补加30mL不完全培养基，在转速1200rpm的条件下离心10min，弃去上清液，轻轻弹击管底，使细胞团松散，一边均匀地转动离心管，一边用1mL吸量管吸取1mL预温的PEG融合剂，在离心管的离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，从加入到加完的时间控制在60s，轻摇离心管30s，静置60s，然后立即加入20mL不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用，具体加法是第一分钟加1mL,第二分钟加4mL，随后的三分钟之内将剩余液体加完，在37℃水浴中静置10min，1200rpm，离心10min，弃去上清，加入含有HAT的完全培养基，制成细胞悬液，铺到96孔细胞培养板上，置37℃，5%CO₂细胞培养箱中。

1.5单克隆细胞的筛选

细胞在HAT培养基中培养，未融合的骨髓瘤细胞和未融合的淋巴细胞逐渐死亡；融合的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。在37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养7-10天；用抗原包被酶标板，37℃包被2h，然后用2%BSA封闭；吸取96孔板中生长克隆的细胞上清加到封闭好的酶标板中，37℃孵育1h；洗涤5遍后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；洗涤后加入TMB显色液，然后加2M硫酸终止反应，在酶标仪上进行读数；将ELISA检测阳性的克隆挑入24孔细胞培养板培养，3天后进行ELISA复筛，将筛选出的ELISA阳性克隆进行WB复筛，WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆扩大培养后定株、冻存。

2、杂交瘤细胞抗CD20单克隆抗体的获得及生物学鉴定

2.1杂交瘤细胞抗CD20单克隆抗体的获得

将定株的单克隆细胞的细胞上清液用美国BD公司Mouse MonoclonalAntibody Isotyping Kit鉴定单抗的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，生产的腹水通过层析纯化后的得到抗体。

2.2Western blot检测抗体的特异性

取已处理的细胞裂解液，在凝胶上进行垂直SDS-PAGE，120v90min，电泳结束后，取下凝胶，置于PVDF膜上，将蛋白用半干法转染到PVDF膜上，10v,120min；将转印后的PVDF膜在5%脱脂奶粉中室温封闭2h；将抗体溶解于3mL封闭液中，4℃过夜；用洗涤液洗涤3次，每次5min，用封闭液来稀释HRP标记的羊抗鼠IgG，室温下孵育2h；再用洗涤液洗涤3次，将化学发光试剂加到PVDF膜上，到暗室曝光到X胶片上，通过显影和定影，将结果反映在胶片上；扫描胶片，分析结果，其结果参照图1。

2.3单克隆抗体亲和常数测定

用包被液将抗原稀释，分别加入酶标板，100微升/孔，37℃2h，PBS洗涤5次，拍干，加2%BSA封闭液200微升/孔，4℃过夜，洗涤5次，拍干；将抗体从4ug/mL开始进行梯度稀释后加入到包被好的酶标板中，100微升/孔，37℃1h，洗涤5次，拍干；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，工作液100微升/孔，37℃1h，洗涤5次，拍干；加入TMB显色液，37℃反应5-10min，加终止液50微升/孔，立即在酶标仪上以450nm波长测定OD值，按照公式计算出单克隆抗体亲和常数。

3、抗CD20单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆

所用细胞株为采用上述方法获得的能分泌高亲和力、高特异性的抗CD20抗体的杂交瘤细胞株，对应的保藏编号为407CT20.1.2，其分泌的抗体分子亚型IgG1。取对数生长期的407CT20.1.2杂交瘤细胞，用QIAGEN公司的试剂盒RNeasy MiniKit（货号：QIAGEN-74106）提取总RNA，取少量用nanodrop定量及1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测，随后用SuperScript.III First-StrandSynthesis System for RT-PCR试剂盒（货号：Invitrogen-18080-051）反转录cDNA，用特异引物扩增抗CD20抗体基因的轻链或重链可变区。将含有相应重链可变区或轻链可变区片段的PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒（捷瑞-GK2042）纯化目的产物后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的纯度；之后，将回收得到的相应重链可变区和轻链可变区克隆至测序载体pMD18-T，后测序，对测序结果进行同源性和结构分析。

相关操作具体步骤如下：

3.1RT-PCR扩增CD20抗体轻链和重链可变区

3.1.1引物设计

根据IgG可变区的序列，在信号区和恒定区合成5’和3’端引物用于扩增CD20抗体重链可变区，引物序列如下：

VHF（5’-ACTAGTCGACATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT-3’），含有SalⅠ酶切位点；

VHR（5’-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3’），含有HindⅢ酶切位点。

根据IgG可变区的序列，在信号区和恒定区合成5’和3’端引物用于扩增CD20抗体轻链可变区，引物序列如下：

LHF（5’-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’），含有SalⅠ酶切位点；

LHR（5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’），含有HindⅢ酶切位点。

3.1.2杂交瘤细胞总RNA提取

用上述的杂交瘤细胞407CT20.1.2提取总RNA，具体步骤如下：

收集对数生长期杂交瘤细胞407CT20.1.2，各2×10⁶个，800rpm离心5min，去上清，沉淀下来的细胞可保存于-80℃，或直接用于RNA提取；

每份细胞样品（细胞数约2×10⁶个）中加入350μL RTL溶液，涡旋30s；

向以上每体系中加入70%乙醇，用1mL移液枪轻轻吹打均匀；

将以上体系混合液转入RNeasy spin column，8000x g离心15s，去滤液；

向以上RNeasy spin column中各加入700μL RW1溶液，8000x g离心15s，去滤液；

向以上RNeasy spin column中各加入500μL RPE溶液，8000x g离心15s，去滤液；

向以上RNeasy spin column中各加入500μL RPE溶液，8000x g离心2min，去滤液；

将RNeasy spin column换到无RNA酶的2mL收集管中，全速离心1min；

将RNeasy spin column换到无RNA酶的1.5mLEP管中，加入30-50μL无RNA酶的H₂O，8000x g离心1min，洗脱RNA。

3.1.3反转录PCR

以杂交瘤细胞407CT20.1.2总RNA为模板，用Invitrgen的RT-PCR第一链合成SuperScript.III试剂盒（货号18080-051)，反转录cDNA，具体步骤如下：

（1）引物与模板变性

按表1中所示，配成10μL体系，65℃,5min，随后冰上放置1min，利于引物与RNA模板结合。

表1

成分	体积（μL）
		RNA	100ng<x<1ug
引物Oligo(dT)20	1
		dNTP	1
无RNA酶H2O	8-x

（2）复性

按表2所示，配成10μL体系，加入引物与RNA模板变性的体系，50℃，50min；85℃，5min。

表2

成分	体积（μL）
		10×RT buffer	2
25mM MgCl2	4
		0.1M DTT	2
RNase OUT	1
		SuperScriptIII RT	1

(3)RNA消化

向以上每个体系中加入1μL RNaseH,37℃,20min。

3.1.4抗体可变区特异引物PCR

按表3和表4所示，以反转录得到的cDNA为模板，用特异引物合成抗体重链和轻链可变区。

表3

成分	体积（μL）
		H2O	37.4
10×pfu buffer(Mg2+)	5
		dNTP(10mM)	1
pfu	0.4
		taq	0.2
Sense primer(20uM)	1
		Ant i-sense primer(20uM)	1
cDNA	4

表4

4.抗CD20单克隆抗体重链和轻链可变区基因的测序

4.1PCR产物克隆、测序

将PCR得到的重链可变区和轻链可变区核苷酸片段产物胶回收后，分别构建到测序载体上，送测序。具体步骤如下：

（1）胶回收PCR产物

PCR产物跑1%琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收目的条带，用捷瑞胶回收试剂盒（货号GK-2042）回收；步骤如下：

每100mg琼脂糖凝胶加入400μL结合液B，60℃水浴锅中放置至凝胶块完全融化；

将上述混合液转移至套有2mL收集管的GenClean柱中，室温放置2min，6000rpm离心1min，去废液；

加入500μL洗涤液,12,000rpm，室温离心1min，去废液；

重复上一步；

将GenClean柱放回收集管，12,000rpm，室温离心1min；

将GenClean柱放至1.5mLEP管，加入30-50μL洗脱液，37℃放置2min，12,000rpm，室温离心1min以洗脱目的片段。

（2）酶切

酶切体系如表5和表6所示：

表5

成分	体积（μL）
		质粒	X(1ug)
10×FD buffer	5
		酶1	1
酶2	1
		H2O	43-X

表6

成分	体积(μL)
		抗体目的片段	17
10×FD buffer	2
		酶1	0.5
酶2	0.5

酶切条件：37℃,30min；85℃，5min；

跑胶回收质粒酶切体系中长片段，抗体目的片段酶切体系直接用于连接。

（3）连接

连接体系如表7所示:

表7

成分	体积（μL）
		载体胶回收大片段	1.5
抗体目的片段	7
		10×ligase buffer	1
ligase	0.5

连接条件：16℃,4h。

（4）转化

向连接体系加入100μL DH5α感受态细胞，冰浴30min；

42℃热击90s，冰浴3min；

加入500μLLB培养基，37℃,120rpm，复苏50min；

4000rpm离心2min，去上清，留100μL上清重悬细胞沉淀，涂相应抗性LB平板。待平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370C培养12-16h可出现菌落。

(5)菌落PCR鉴定

挑每块转化板上单克隆4-6个，点到相应抗性LB平板后，做菌落PCR鉴定，PCR反应产物跑1%琼脂糖凝胶检测有无目的长度片段，其结果参照图2。

菌落PCR体系如表8和表9所示：

表8

成分	体积（μL）
		H2O	15.8
10×pfu buffer(Mg2+)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq	0.2
		Sense primer(20uM)	0.5
Anti-sense primer(20uM)	0.5
		克隆	1个

表9

(6)提质粒

挑菌落PCR鉴定为阳性的单克隆摇菌，20%甘油保菌后，用Biomiga-PlasmidMiniprep kit(货号为BIOMEGA-PD1211-02)提质粒。具体步骤如下：

取4mLLB新鲜菌液，室温下1000rpm离心1min，收集菌体，尽可能吸去上清；

加入250μL BufferA1(已加入RNase A)，涡旋震荡充分悬浮细菌细胞；

加入250μL BufferB1，轻轻反转10次以混合均匀，静置5min至溶液粘稠而澄清；

加入350μL Buffer N1,立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀；

将离心管转至高速离心机，在室温下13,000rpm离心10min（若上清中有白色沉淀，可再次离心）；

小心吸取离心后的上清液至带有收集管的离心柱中（避免吸起沉淀），室温下13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回收集管中；

向DNA柱中加入500μL Buffer KB,室温下离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回收集管中；

向离心柱中加入500μL DNA洗涤液(已加入无水乙醇)，室温下，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将离心柱重新放回到收集管中，重复此步骤一次；

将离心柱放回高速离心机中，13,000rpm室温下开盖离心5-10min，以彻底去除残留的乙醇。

将离心柱转移至一个新的1.5mL离心管中，向DNA柱的正中间加入50μL60℃预热的洗脱液,室温放置2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。

(7)酶切鉴定

将提取的质粒DNA用相应限制性内切酶酶切鉴定，体系如表10：

表10

成分	体积（μL）
		质粒	X(500ng)
10×FD buffer	2
		酶1	0.5
酶2	0.5
		H2O	17-X

酶切条件：37℃,30min；85℃，5min,跑1%琼脂糖凝胶电泳鉴定是否有目的条带。

（8)质粒PCR鉴定

酶切鉴定阳性的质粒再PCR鉴定是否有目的条带，反应体系如表11和表12所示：

表11

成分	体积（μL）
		H2O	14.8
10×pfu buffer(Mg2+)	2
		dNTP(10mM)	1
taq	0.2
		Sense primer(20uM)	0.5
Ant i-sense primer(20uM)	0.5
		酶切鉴定阳性质粒	1

表12

PCR产物跑1%琼脂糖凝胶电泳，若有阳性条带，则送测序。

4.2测序比对和结构分析

51802-VH链通过FR-IGMT和CDR-IGMT分析显示：

CDR1：GGATTCACCTTCATTACCTACGCC

CDR2：ATAAGAAGTAAAAATAATAATTTTGCAACA

CDR3：GTGAGGGGGTCCTCCTTTGACTTC

属于IgH-V10VH10家族

51802-VL链通过FR-IGMT和CDR-IGMT分析显示：

CDR1：CAGAGTCTCCTAGATGGCAAAGGCATCACTTAT

CDR2：CAGATGTCC

CDR3：GCTCAAAATCTAGAACTTCCGTATACG

属于IGKV24/25亚群

51802-VH编码117个氨基酸，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为26aa-33aa,51aa-60aa和99aa-106aa，分子量约为13273D。

51802-VL编码113个氨基酸，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为27aa-37aa,55aa-57aa和94aa-102aa，分子量约为12297D。

51802-VH核苷酸为：

GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAGAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCATTACCTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAGAAATTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAATAATAATTTTGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAGAGACAGGTTCACCATCTTCAGAGATGATTCACAAAACCTACTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAAACTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTGAGGGGGTCCTCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

51802-VH 编码的氨基酸序列为：

EVQLVESGGGLVQPRGSLKLSCAASGFTFITYAMNWVRQAPGRNLEWVARIRSKNNNFA

TYYADSVRDRFTIFRDDSQNLLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRGSSFDFWGQGTTLTVSS

51802-VL核苷酸序列为：

GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAGCGTCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTCCTAGATGGCAAAGGCATCACTTATTTCAATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGTCTCAGGAGTCCCAAACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTACTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGTATACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT

51802-VL 编码的氨基酸序列为：

DIVMTQAAFSNPVTLGASASISCRSSQSLLDGKGITYFNWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLV

SGVPNRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKR

 

 

Claims (2)

1.抗CD20单克隆抗体可变区序列的编码序列，其特征在于，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为51802-VH和51802-VL；所述51802-VH 编码 117 个氨基酸，分子量为 13273D，其中CDR1、CDR2 和 CDR3 的区域相应地分别为 26aa-33aa, 51aa-60aa 和 99aa-106aa；所述51802-VL 编码 113 个氨基酸，分子量为 12297D，其中 CDR1、CDR2 和 CDR3 的区域相应地分别为 27aa-37aa,55aa-57aa 和 94aa-102aa。

2.根据权利要求1所述的抗CD20单克隆抗体可变区序列的编码序列，其特征在于，还包括：与上述两种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。