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KR20200134333A - 발효에 의한 히스타민 생산을 위해 조작된 생합성 경로 - Google Patents

발효에 의한 히스타민 생산을 위해 조작된 생합성 경로 Download PDF

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KR20200134333A
KR20200134333A KR1020207033290A KR20207033290A KR20200134333A KR 20200134333 A KR20200134333 A KR 20200134333A KR 1020207033290 A KR1020207033290 A KR 1020207033290A KR 20207033290 A KR20207033290 A KR 20207033290A KR 20200134333 A KR20200134333 A KR 20200134333A
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ala
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gly
val
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KR1020207033290A
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캐라 앤 트레이스웰
알렉산더 글레넌 시어러
마이클 샤리프 시디퀴
스티븐 엠 에드가
니콜라우스 허먼
무르타자 샤비르 후세인
Original Assignee
지머젠 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 개시는 히스타민의 발효 생산을 위한 미생물 세포의 조작을 기술하고 신규한 조작된 미생물 세포 및 배양물을 비롯하여, 관련 히스타민 제조 방법을 제공한다.

Description

발효에 의한 히스타민 생산을 위해 조작된 생합성 경로
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 4월 20일 출원된 미국 가출원 제62/660,875호의 우선권을 청구하고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
정부 지원 연구 및 개발로 수행된 본 발명의 권리에 관한 진술
본 발명은 DARPA가 수여하는 협약 번호 HR0011-15-9-0014 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
서열 목록의 참조 편입
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하고 이의 전문은 참조로 본 명세서에 편입된다. 2019년 4월 17일에 생성된 이러한 ASCII 사본은 명칭이 ZMGNP011WO_Seq_List_ST25.txt이고 크기는 312,107 바이트이다.
본 개시의 분야
본 개시는 일반적으로 발효를 통한 히스타민의 생산을 위해 미생물을 조작하는 영역에 관한 것이다.
생원성 아민은 발효 식품 및 음료에서 빈번하게 발견되는, 생물학적 활성이 부여된 유기 염기이다. 히스타민은 실제로 발효 식품 예컨대 요거트 (13 - 36 mg/kg) [1], 된장 (24 mg/kg) [2], 및 적포도주 (24 mg/L) [3]에 존재하는 것으로 알려져 있다. 인간 소화관에서 사는 일부 박테리아가 또한 히스타민을 만들며, 항염증 효과를 통해 면역계를 조절하는 기능을 한다 [4]. 발효 식품에서 히스타민의 생산은 히스티딘 디카르복실라제를 함유하는 미생물 및 히스티딘을 함유하는 단백질의 공급원에 의존적이다. 히스타민은 효소 히스티딘 디카르복실라제 (EC 4.1.1.22)에 의해 특이적으로 촉매되는 히스티딘의 디카르복실화 산물이다. 단순한, 비단백질, 탄소 및 질소 공급원으로부터 산업 발효로 히스타민의 제조는 고도로 활성인 히스티딘 디카르복실라제 및 아미노산 전구체 히스티딘의 개선된 생합성과 경로의 어셈블리를 필요로 한다.
본 개시는 하기를 포함하여, 조작된 미생물 세포, 미생물 세포의 배양물, 및 히스타민의 제조를 위한 방법을 제공한다:
구현예 1: 비천연 히스티딘 디카르복실라제를 발현하는 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 히스타민을 생산한다.
구현예 2: 구현예 1의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해 증가된 것이다.
구현예 3: 구현예 2의 조작된 미생물 세포에 있어서, 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실-ATP 파이로포스파타제, 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제, 5'ProFAR 이소머라제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 신타제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 포스파타제, 히스티디놀 디히드로게나제, 및 리보스 포스페이트 파이로포스포키나제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 4: 구현예 1-3 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 하나 이상의 효소(들)의 감소된 활성을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해 감소된 것이다.
구현예 5: 구현예 4의 조작된 미생물 세포에 있어서, 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 하나 이상의 효소(들)는 에놀라제, 피루베이트 디히드로게나제, 펜토스 포스페이트 경로 당 이소머라제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 및 리불로스-5-포스페이트 이소머라제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 6: 구현예 4 또는 구현예 5의 조작된 미생물 세포에 있어서, 감소된 활성은 상기 하나 이상의 효소에 대한 유전자의 천연 프로모터를 활성이 덜한 프로모터로 교체하여 획득된다.
구현예 7: 구현예 1-6 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 피드백-탈조절된 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 또는 피드백-탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 추가로 발현한다.
구현예 8: 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 비천연 히스티딘 디카르복실라제를 발현하기 위한 수단을 포함하고, 조작된 미생물 세포는 히스타민을 생산한다.
구현예 9: 구현예 8의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)의 활성을 증가시키기 위한 수단을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해 증가된 것이다.
구현예 10: 구현예 9의 조작된 미생물 세포에 있어서, 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실-ATP 파이로포스파타제, 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제, 5'ProFAR 이소머라제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 신타제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 포스파타제, 히스티디놀 디히드로게나제, 및 리보스 포스페이트 파이로포스포키나제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 11: 구현예 8-10 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 하나 이상의 효소(들)의 활성을 감소시키기 위한 수단을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해 감소된 것이다.
구현예 12: 구현예 11의 조작된 미생물 세포에 있어서, 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 하나 이상의 효소(들)는 에놀라제, 피루베이트 디히드로게나제, 펜토스 포스페이트 경로 당 이소머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 및 리불로스-5-포스페이트 이소머라제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 13: 구현예 11 또는 구현예 12의 조작된 미생물 세포에 있어서, 감소된 활성은 상기 하나 이상의 효소에 대한 유전자의 천연 프로모터를 활성이 덜한 프로모터로 교체하기 위한 수단에 의해 획득된다.
구현예 14: 구현예 8-13 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 또는 피드백-탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 발현시키기 위한 수단을 추가로 포함한다.
구현예 15: 구현예 1-14 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 진균 세포를 포함한다.
구현예 16: 구현예 15의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 효모 세포를 포함한다.
구현예 17: 구현예 16의 조작된 미생물 세포에 있어서, 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 야로위아 (Yarrowia) 속의 세포이다.
구현예 18: 구현예 17의 조작된 미생물 세포에 있어서, 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속 및 세레비지아에 (cerevisiae) 종의 세포이다.
구현예 19: 구현예 17의 조작된 미생물에 있어서, 효모 세포는 야로위아 (Yarrowia) 속 및 리폴리티카 (lipolytica) 종의 세포이다.
구현예 20: 구현예 1-19 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 비천연 히스티딘 디카르복실라제는 크로모박테리움 (Chromobacterium) sp. LK1 또는 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii) 균주 AB0057 유래의 히스티딘 디카르복실라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 히스티딘 디카르복실라제를 포함한다.
구현예 21: 구현예 1 및 16-20 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해 증가된 것이고, 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 포함한다.
구현예 22: 구현예 21의 조작된 미생물 세포에 있어서, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 증가된 활성은 이를 이종적으로 발현하여 획득된다.
구현예 23: 구현예 22의 조작된 미생물 세포에 있어서, 이종성 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
구현예 24: 구현예 16-23 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 피드백-탈조절된 변이체를 포함한다.
구현예 25: 구현예 1-14 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 박테리아 세포이다.
구현예 26: 구현예 25의 조작된 미생물 세포에 있어서, 박테리아 세포는 코리네박테리아 (Corynebacteria) 또는 바실러스 (Bacillus) 속의 세포이다.
구현예 27: 구현예 26의 조작된 미생물 세포에 있어서, 박테리아 세포는 코리네박테리아 (Corynebacteria) 속 및 글루타미컴 (glutamicum) 종의 세포이다.
구현예 28: 구현예 26의 조작된 미생물 세포에 있어서, 박테리아 세포는 바실러스 (Bacillus) 속 및 서브틸리스 (subtilis) 종의 세포이다.
구현예 29: 구현예 25-28 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 비천연 히스티딘 디카르복실라제는 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii) 또는 락토바실러스 (Lactobacillus) sp. (균주 30a) 유래의 히스티딘 디카르복실라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 히스티딘 디카르복실라제를 포함한다.
구현예 30: 구현예 1 및 25-29 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해 증가된 것이고, 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 및 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제를 포함한다.
구현예 31: 구현예 30의 조작된 미생물 세포에 있어서, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 또는 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제의 증가된 활성은 이를 이종적으로 발현하여 획득된다.
구현예 32: 구현예 31의 조작된 미생물 세포에 있어서, 이종성 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) S288c 또는 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) LT2 유래의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이종성 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 유래의 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
구현예 33: 구현예 25-32 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 조작된 미생물 세포는 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 피드백-탈조절된 변이체를 포함한다.
구현예 34: 구현예 1-33 중 어느 하나의 조작된 미생물 세포에 있어서, 배양 시, 조작된 미생물 세포는 적어도 20 mg/배양 배지의 L의 수준으로 생산한다.
구현예 35: 구현예 34의 조작된 미생물 세포에 있어서, 배양 시, 조작된 미생물 세포는 히스타민을 적어도 300 mg/배양 배지의 L의 수준으로 생산한다.
구현예 36: 구현예 1-35 중 어느 하나에 따른 조작된 미생물 세포의 배양물.
구현예 37: 구현예 36의 배양물에 있어서, 조작된 미생물 세포는 배양물이 10-500의 600 nm에서의 광학 밀도를 갖게 하는 농도로 존재한다.
구현예 38: 구현예 36-37 중 어느 하나의 배양물에 있어서, 배양물은 히스타민을 포함한다.
구현예 39: 구현예 36-38 중 어느 하나의 배양물에 있어서, 배양물은 히스타민을 적어도 20 mg/배양 배지의 L의 수준으로 포함한다.
구현예 40: 구현예 1-35 중 어느 하나에 따른 조작된 미생물 세포를 배양하는 방법으로서, 방법은 히스타민을 생산하기 위해 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
구현예 41: 구현예 40의 방법에 있어서, 방법은 1-100 g/L 범위의 초기 글루코스 수준에 이어서, 제어된 당 공급이 후속되는 유가식 배양을 포함한다.
구현예 42: 구현예 40-41 중 어느 하나의 방법에 있어서, 발효 기질은 우레아, 암모늄 염, 암모니아, 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 질소원 및 글루코스를 포함한다.
구현예 43: 구현예 40-42 중 어느 하나의 방법에 있어서, 배양물은 배양 단계 동안 pH-제어된다.
구현예 44: 구현예 40-43 중 어느 하나의 방법에 있어서, 배양물은 배양 단계 동안 통기된다.
구현예 45: 구현예 40-44 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조작된 미생물 세포는 히스타민을 적어도 20 mg/배양 배지의 L의 수준으로 생산한다.
구현예 46: 구현예 40-45 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 히스타민을 배양물로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예 47: 히스타민을 생산하도록 조작된 미생물 세포를 사용하여 히스타민을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은 (a) 비천연 히스티딘 디카르복실라제를 미생물 세포에서 발현시키는 단계; (b) 히스타민을 생산할 수 있게 하는 조건 하에 적합한 배양 배지에서 미생물 세포를 배양하는 단계로서, 히스타민은 배양 배지로 방출되는 것인 단계; 및 히스타민을 배양 배지로부터 단리시키는 단계를 포함한다.
도 1: 히스타민의 생합성 경로.
도 2: 제1 라운드 조작된 숙주 코리네박테리아 글루타미컴 (Corynebacteria glutamicum)에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가 (또한, 실시예 1, 표 1 참조).
도 3: 제1 라운드 조작된 숙주 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가 (또한, 실시예 1, 표 1 참조).
도 4: 제2 라운드 조작된 숙주 코리네박테리아 글루타미컴에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가 (또한, 실시예 1, 표 2 참조)
도 5: 제2 라운드 조작된 숙주 사카로마이세스 세레비지아에에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가 (또한, 실시예 1, 표 2 참조)
도 6: 제1 라운드 조작된 숙주 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가 (또한, 실시예 2, 표 4 참조)
도 7: 제1 라운드 조작된 숙주 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가.
도 8: 숙주 평가 디자인을 발현하는 사카로마이세스 세레비지아에의 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 산 역가.
도 9: 숙주 평가 디자인을 발현하는 코리네박테리아 글루타미컴의 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 산 역가.
도 10: 제3 라운드 숙주 사카로마이세스 세레비지아에에 의한 발효 이후에 세포외 액체 배지에서 측정된 히스타민 역가 (개선 라운드).
도 11: 사카로마이세스 세레비지아에 및 야로위아 리폴리타카로 프로모터-유전자-종결인자의 통합.
도 12: 사카로마이세스 세레비지아에 및 야로위아 리폴리티카에서 프로모터 교체.
도 13: 사카로마이세스 세레비지아에 및 야로위아 리폴리티카에서 표적화된 유전자 결실.
도 14: 코리네박테리아 글루타미컴 및 바실러스 서브틸리스로 프로모터-유전자-종결인자의 통합.
본 개시는 단순 탄소 및 질소 공급원, 예컨대 각각 글루코스 및 우레아로부터 미생물 숙주에 의한 발효를 통해서 소형 분자 히스타민의 제조를 위한 방법을 기술한다. 이러한 목적은 대규모 화학 산물의 산업 발효를 위해 적합한 미생물 숙주에게 비천연 물질대사 경로를 도입시켜 달성될 수 있다. 예시적인 숙주는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lypolytica), 코리네박테리아 글루타미컴 (Corynebacteria glutamicum) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 포함한다. 조작된 물질대사 경로는 숙주의 중심 물질대사를 비천연 경로와 연결시켜서 히스타민의 생산을 가능하게 한다. 이러한 접근법의 가장 단순한 구현예는 히스티딘을 생산할 수 있는 미생물 숙주 균주에서, 효소, 비천연 히스티딘 디카르복실라제 효소의 발현이다. 핵심 상류 경로 효소, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 과발현 및 돌연변이를 통해서 미생물 숙주 중심 물질대사의 변형을 통한 물질대사 경로의 추가 조작은 505 mg/L 히스타민의 역가를 획득할 수 있게 하였다.
하기 개시는 단순 탄소원 및 질소원으로부터 산업적으로 실현가능한 역가로 히스타민을 생산하기 위한 필수 특징을 갖는 미생물을 조작하는 방법을 기술한다. 활성 히스티딘 디카르복실라제가 동정되었고, 피드백-탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 및/또는 천연 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 항상적 발현이 발효를 통해 히스타민의 역가를 개선시킨다는 것을 발견하였다.
정의
본 명세서 및 청구항에서 사용되는 용어는 달리 명시되지 않으면 하기 기재된 바와 같이 정의된다.
용어 "발효"는 임의의 화학적 전환 단계를 필요로 하지 않고, 하나 이상의 생물학적 전환 단계를 통해서 미생물 세포가 하나 이상의 기질(들)을 바람직한 산물 (예컨대 히스타민)로 전환시키는 과정을 의미하고자 본 명세서에서 사용된다.
세포에 대한 용어 "조작된"은 천연 발생 세포와 조작된 세포를 구별짓는 인간이 도입시킨 적어도 하나의 표적화된 유전자 변경을 세포가 함유한다는 것을 의미하고자 본 명세서에서 사용된다.
용어 "천연"은 특정 세포에서 천연적으로 존재하는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 같은, 세포 성분을 의미하고자 본 명세서에서 사용된다. 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 세포에 내생적이다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 사용될 때, 용어 "비천연"은 특정 세포에 천연적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
유전자가 발현되는 상황에 대해 사용될 때, 용어 "비천연"은 그것이 천연적으로 발현되는 게놈 및 세포 상황이 아닌 임의의 상황에서 발현되는 유전자를 의미한다. 비천연 방식으로 발현되는 유전자는 숙주 세포에서 상응하는 유전자와 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만, 천연 유전자의 유전자좌와 상이한 게놈 내 통합 지점 또는 벡터로부터 발현될 수 있다.
용어 "이종성"은 숙주 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 설명하고자 본 명세서에서 사용된다. 이 용어는 숙주 세포의 것과는 상이한 유기체, 종, 또는 균주로부터 유래된, 각각 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포괄한다. 이러한 경우에, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 동일한 숙주 세포에서 발견되는 임의의 서열(들)과 상이한 서열을 갖는다. 그러나, 이 용어는 또한 숙주 세포에서 발견되는 서열과 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포괄하고, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 천연 서열과 상이한 환경으로 존재한다 (예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드는 상이한 프로모터에 연결될 수 있고 천연 서열의 것과 상이한 게놈 위치에 삽입될 수 있음). 따라서 "이종성 발현"은 숙주 세포에 비천연인 서열의 발현을 비롯하여, 비천연 상황에서 숙주 세포에게 천연인 서열의 발현을 포괄한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 사용되는, 용어 "야생형"은 분자의 출처와 무관하게, 천연 발생 유기체로부터의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 존재하는, 뉴클레오티드 서열을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드, 또는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하고, 다시 말해서, 용어 "야생형"은 분자가 천연 공급원으로부터 정제되건, 재조합적으로 발현된 후, 정제되건, 또는 합성되건 무관하게, 서열 특징을 의미한다. 용어 "야생형"은 또한 천연 발생 세포를 의미하고자 사용된다.
"대조군 세포"는 조작된 세포에서 시험되는 특이적 유전자 변형(들)이 결여된 것을 제외하고, 조작된 세포와 동일한 속 및 종인 것을 포함하여, 시험되는 조작된 세포와 동일한 세포이다.
본 명세서에서 효소는 달리 표시하지 않으면 그들이 촉매하는 반응으로 식별되고, 식별된 반응을 촉매할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 달리 표시하지 않으면, 효소는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고 천연 또는 돌연변이된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 충분히 공지된 바와 같이, 효소는 때때로 그들이 유래되는 근원 유기체에 의존하여, 다수의 기능 및/또는 다수의 명칭을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 효소 명칭은 하나 이상의 추가 기능 또는 상이한 명칭을 가질 수 있는 효소를 포함하여, 오솔로그를 포괄한다.
본 명세서에서 용어 "피드백-탈조절된"은 특정 세포에서 효소 경로의 하류 산물에 의해 보통 음성적으로 조절 (즉, 피드백-억제)되는 효소에 대해 사용된다. 이러한 상황에서, "피드백-탈조절된" 효소는 세포에 천연인 천연 효소보다 피드백-억제에 덜 민감한 효소의 형태이다. 피드백-탈조절된 효소는 천연 효소에 하나 이상의 돌연변이를 도입시켜 생산될 수 있다. 대안적으로, 피드백-탈조절된 효소는 특정 미생물 세포로 도입시, 천연의, 천연 효소만큼 피드백-억제에 민감하지 않은, 단순히 이종성, 천연 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 피드백-탈조절된 효소는 미생물 세포에서 피드백-억제를 보이지 않는다.
용어 "히스타민"은 2-(1I-이미다졸-4-일)에탄아민 (CAS# 51-45-6)을 의미한다.
둘 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 용어 "서열 동일성"은 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사를 통해서 측정하여, 최대 상응도로 비교 및 정렬될 때, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 둘 이상의 서열을 의미한다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 서열 비교의 경우에, 전형적으로 하나의 서열은 "기준 서열"로서 작용하여, "시험" 서열과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면, 하위 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그러면, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로, 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬은 디폴트 매개변수로 설정된 BLAST를 사용해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역가"는 배양물 부피로 나눈 미생물 세포의 배양물에 의해 생산된 산물 (예를 들어, 히스타민)의 질량을 의미한다.
세포 배양물로부터 히스타민을 회수하는 단계와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "회수 단계"는 세포 배양 배지의 적어도 하나의 다른 성분으로부터 히스타민을 분리시키는 단계를 의미한다.
히스타민 생산을 위한 미생물 조작
히스타민 생합성 경로
히스타민은 전형적으로 아미노산 히스티딘으로부터 유래된다. 히스타민 생합성 경로는 도 1에 도시된다. 아미노산 생합성 경로의 제1 효소, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 히스티딘에 의한 피드백 억제를 겪는다. 히스타민 생산은 히스티딘 디카르복실라제 (EC 4.1.1.22)에 의해 촉매되는, 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lypolytica), 코리네박테리아 글루타미컴 (Corynebacteria glutamicum) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 숙주에서 단일 비천연 효소 단계의 첨가를 통해 가능하다.
미생물 히스타민 생산을 위한 조작
조작되는 미생물 세포에서 활성인 임의의 히스티딘 디카르복실라제는 전형적으로 표준 유전자 조작 기술을 사용해 효소(들)를 코딩하는 유전자(들)를 도입 및 발현시켜서, 세포로 도입될 수 있다. 적합한 히스티딘 디카르복실라제는 식물, 조류, 진균, 그람-양성 박테리아, 및 그람-음성 박테리아 공급원을 포함하여, 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 공급원은 제한없이 아에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida) subsp. 펙티놀리티카 (pectinolytica) 34mel, 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii) (균주 AB0057), 크로모박테리움 해몰리티컴 (Chromobacterium haemolyticum), 크로모박테리움 (Chromobacterium) sp. LK1, 시트로박터 파스테우리이 (Citrobacter pasteurii), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster), 락토바실러스 아비아리우스 (Lactobacillus aviarius) DSM 20655, 락토바실러스 프룩티보란스 (Lactobacillus fructivorans), 락토바실러스 레우테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 (Lactobacillus) sp. (균주 30a), 메타노사르시나 바케리 (Methanosarcina barkeri) (균주 푸사로/DSM 804), 메타노사르시나 바케리 str. 비스모어 (Methanosarcina barkeri str. Wiesmoor), 모르가넬라 사이크로톨레란스 (Morganella psychrotolerans), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 오에노코커스 오에니 (Oenococcus oeni) (류코노스톡 오에노스 (Leuconostoc oenos)), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) (아르트로박터 시데로캅술라터스 (Arthrobacter siderocapsulatus)), 슈도모나스 리조스파에라에 (Pseudomonas rhizosphaerae), 슈도모나스 (Pseudomonas) sp. bs2935, 솔라눔 리코페르시쿰 (Solanum lycopersicum), 오리자 사티바 (Oryza sativa), 페니실리움 마르네페이 (Penicillium marneffei), 스트렙토마이세스 히그로스코피커스 (Streptomyces hygroscopicus), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) (애기장대), 글리신 소자 (Glycine soja) (야생 대두), 솔라눔 리코페르시쿰 (Solanum lycopersicum) (토마토) (리코페르시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum)), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 락토바실러스 부크네리 (Lactobacillus buchneri), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (초파리), 모르가넬라 모르가니이 (Morganella morganii) (프로테우스 모르가니이 (Proteus morganii)), 이. 콜라이 (E. coli), 보스 타우루스 (Bos taurus)(소), 라오우텔라 플란티콜 (Raoutella planticol) (클렙시엘라 플란티콜라 (Klebsiella planticola)), 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 해몰리티커스 (Acinetobacter haemolyticus), 포토박테리움 담셀라에 (Photobacterium damselae), 테트라게노코커스 무리아티커스 (Tetragenococcus muriaticus), 모리텔라 (Moritella) sp JT01, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 시트로박터 얀가에 (Citrobacter youngae), 라오울텔라 오미티놀리티카 (Raoultella omithinolytica), 및 라오울텔라 플란티콜라 (Raoultella planticola)를 포함한다.
히스티딘 디카르복실라제 유전자의 하나 이상의 카피는 선택된 미생물 숙주 세포로 도입될 수 있다. 유전자의 하나 초과의 카피가 도입되면, 카피들은 동일하거나 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 유전자(들) 중 하나 또는 둘 모두는 강력한, 항상성 프로모터로부터 발현된다. 일부 구현예에서, 이종성 히스티딘 디카르복실라제 유전자(들)는 유도성 프로모터로부터 발현된다. 이종성 유전자(들)는 임의로는 선택된 미생물 숙주 세포에서 발현을 증강시키기 위해서 코돈-최적화될 수 있다. 실시예에서 사용되는 숙주에 대한 예시적인 코돈-최적화 표는 다음과 같다: 바실러스 서브틸리스 카즈사 코돈 표: www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=1423&aa=1&style=N; 야로위아 리폴리티카 카즈사 코돈 표: www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4952&aa=1&style=N; 코리네박테리아 글루타미컴 카즈사 코돈 표: www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=340322&aa=1&style=N; 사카로바이세스 세레비지아에 카즈사 코돈 표: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4932&aa=1&style=N. 또한 하기에 재현된 에스. 세레비지아에 및 씨. 글루타미컴에 대해 변형된, 조합 코돈 용법 체계도 사용되었다.
Sc 및 Cg에 대한 변형 코돈 용법 표
Figure pct00001
Figure pct00002
상류 효소의 활성 증가
이러한 생산을 할 수 있는 미생물 세포에서 히스타민 생산을 증가시키기 위한 한 접근법은 히스타민 생합성 경로의 하나 이상의 상류 효소의 활성을 증가시키는 것이다. 상류 경로 효소는 모든 공급원료로부터 마지막 천연 대사산물 (하기 실시예에 기술된 예시적인 미생물 세포에서, 히스티딘)로의 전환에 관여되는 모든 효소를 포함한다. 이러한 효소는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실-ATP 파이로포스파타제, 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제, 5'ProFAR 이소머라제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 신타제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 포스파타제, 히스티디놀 디히드로게나제, 및 리보스 포스페이트 파이로포스포키나제를 포함한다. 이들 효소를 코딩하는 적합한 상류 경로 유전자는 예를 들어 히스티딘 디카르복실라제 유전자에 대한 공급원으로서 상기 기술된 것들을 포함하여, 임의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상류 경로 효소의 활성은 천연 효소(들)의 발현 또는 활성을 조절하여 증가된다. 예를 들어, 이러한 효소의 발현 또는 활성의 천연 조절인자가 적합한 효소의 활성을 증가시키기 위해서 이용될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 하나 이상의 프로모터는 예를 들어 도 12에 예시된 것과 같은 기술을 사용하여 천연 프로모터를 대체할 수 있다. 일정 구현예에서, 대체 프로모터는 천연 프로모터에 비해 더 강력하고/하거나 항상성 프로모터이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상류 경로 효소의 활성은 히스티딘 디카르복실라제-발현 미생물 숙주 세포로 상응하는 유전자 중 하나 이상을 도입시켜 보충된다. 도입된 상류 경로 유전자는 숙주 세포의 것과 상이한 유기체로부터 유래될 수 있거나 또는 단순히 천연 유전자의 추가 카피일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 유전자는 히스타민 생산을 할 수 있는 미생물 숙주 세포로 도입되어 강력한 항상성 프로모터로부터 발현되고/되거나 선택된 미생물 숙주 세포에서 발현을 증강시키기 위해서 임의로 코돈-최적화될 수 있다.
실시예 1은 아시네토박터 바우만니이 유래의 이종성 히스타민 디카르복실라제 (SEQ ID NO:1)를 발현시키고 이종성 씨. 글루타미컴 이미다졸글리세롤-포스페이트 디히드라타제 (SEQ ID NO:2)를 항상적으로 발현시키기 위한 씨. 글루타미컴의 성공적인 조작을 기술한다. 이러한 균주는 2 라운드의 유전자 조작으로부터 생성되었고 히스타민을 24 mg/배양 배지의 L의 역가로 생산하였다. 이러한 역가는 아시네토박터 바우만니이 (균주 AB0057) 유래 히스타민 디카르복실라제 (SEQ ID NO:1) 및 에스. 세레비지아에 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3)를 발현시키도록 조작된 씨. 글루타미컴 균주에서 68 mg/L까지 증가되었다.
실시예 2는 505 mg/L의 히스타민 역가를 제공하기 위해서 아시네토박터 바우만니이 (균주 AB0057) 유래 히스티딘 디카르복실라제 (SEQ ID NO:1) 및 에스. 세레비지아에 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3)를 발현하도록 와이. 리폴리티카의 성공적 조작을 기술한다. 실시예 2는 또한 18 mg/L의 히스타민 역가를 제공하기 위해서 락토바실러스 sp. (균주 30a) 유래 히스타민 디카르복실라제 (SEQ ID NO:4) 및 살모넬리 티피뮤리움 LT2 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:5)를 발현하도록 조작되는 비. 서브틸리스를 기술한다. 또한 실시예 2에서, 에스. 세레비지아에는 111 mg/L의 히스타민 역가를 제공하기 위해서 크로모박테리움 sp. LK1 유래 히스타민 디카르복실라제 (SEQ ID NO:6) 및 에스. 세레비지아에 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3)를 발현시키도록 조작되었다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 상류 경로 효소의 활성을 증가시키기 위해 히스타민-생산 미생물 세포의 조작은 히스타민 역가를 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 또는 적어도 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 또는 100배까지 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 히스타민 역가의 증가는 10% 내지 100배, 2배 내지 50배, 5배 내지 40배, 10배 내지 30배의 범위, 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정되는 임의 범위이다 (본 명세서의 범위는 그들의 종결점을 포함함). 이들 증가는 상류 경로 효소의 활성의 임의 증가가 결여된 히스타민-생산 미생물 세포에서 관찰된 히스타민 역가에 대해서 결정된다. 이러한 기준 세포는 히스타민 생산의 증가를 목적으로 하는 하나 이상의 다른 유전자 변경을 가질 수 있고, 예를 들어 세포는 피드백-탈조절된 효소를 발현할 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 상류 경로 유전자의 활성을 증가시켜서 획득된 히스타민 역가는 적어도 1, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 또는 10 gm/L이다. 다양한 구현예에서, 역가는 10 mg/L 내지 10 gm/L, 20 mg/L 내지 5 gm/L, 50 mg/L 내지 4 gm/L, 100 mg/L 내지 3 gm/L, 500 mg/L 내지 2 gm/L의 범위 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정된 임의 범위이다.
피드백-탈조절된 효소의 도입
히스티딘 생합성이 피드백 억제를 겪으므로, 히스타민을 생산하도록 조작된 미생물 세포에서 히스타민 생산을 증가시키기 위한 다른 접근법은 정상적으로 피드백 조절을 겪는 하나 이상의 효소의 피드백-탈조절된 형태를 도입시키는 것이다. 이러한 효소의 예는 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 및 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 포함한다. 피드백-탈조절된 형태는 특정 미생물 숙주 세포에서 천연 효소에 비해서 피드백 억제에 덜 민감한, 이종성, 천연 효소일 수 있다. 대안적으로, 피드백-탈조절된 형태는 상응하는 천연 효소에 비해서 피드백 억제에 덜 민감하게 만드는 하나 이상의 돌연변이 또는 절두를 갖는 천연 또는 이종성 효소의 변이체일 수 있다. 후자의 예는 아미노산 치환 N215K, L231F, 및 T235A를 함유하는 변이체 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (씨. 글루타미컴 유래) (SEQ ID NO:7) 및 아미노산 Q207 및 E208의 결실을 함유하는 변이체 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (살모넬라 티피뮤리움 유래) (SEQ ID NO:5)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 피드백-탈조절된 효소를 발현시키기 위한 히스타민-생산 미생물 세포의 조작은 히스타민 역가를 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 또는 적어도 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 또는 100배 까지 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 히스타민 역가의 증가는 10% 내지 100배, 2배 내지 50배, 5배 내지 40배, 10배 내지 30배, 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정된 임의 범위이다. 이들 증가는 피드백-탈조절된 효소를 발현하지 않는 히스타민-생산 미생물 세포에서 관찰된 히스타민 역가에 대해 결정된다. 이러한 기준 세포는 히스타민 생산의 증가를 목적으로 하는 다른 유전자 변경을 가질 수 있고 (그러나 그럴 필요는 없음), 다시 말해서 세포는 피드백-비감수성 이외의 일부 수단으로 인한 상류 경로 효소의 증가된 활성을 가질 수 있다.
다양한 구현예에서, 히스타민 생합성 경로를 통하는 흐름을 증가시키기 위해 피드백-탈조절된 효소를 사용해 획득된 히스타민 역가는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 10, 20, 50 g/L이다. 다양한 구현예에서, 역가는 50 ㎍/L 내지 50 g/L, 75 ㎍/L 내지 20 g/L, 100 ㎍/L 내지 10 g/L, 200 ㎍/L 내지 5 g/L, 500 ㎍/L 내지 4 g/L, 1 mg/L 내지 3 g/L, 500 mg/L 내지 2 g/L 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정된 임의 범위이다.
하나 이상의 천연 효소의 활성 보충 및/또는 하나 이상의 피드백-탈조절된 효소 도입의 접근법은 보다 더 높은 히스타민 생산 수준을 획득하기 위해서 히스타민 디카르복실라제-발현 미생물 세포에서 조합될 수 있다. 예를 들어, 385 mg/L의 히스타민 역가가 하기 3종의 유전자의 도입으로부터 2 라운드의 조작에서 에스. 세레비지아에서 획득되었다: 히스티딘 디카르복실라제 유전자 (크로모박테리움 sp. LK1 유래) (SEQ ID NO:6), 아미노산 치환 N215K, L231F, 및 T235A를 함유하는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (씨. 글루타미컴 유래) (SEQ ID NO:7), 및 에스. 세레비지아에 S288c 유래의 항상적으로 발현되는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3) (실시예 1).
전구체 소비의 감소
이러한 생산을 할 수 있는 미생물 세포에서 히스타민 생산을 증가시키기 위한 다른 접근법은 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 하나 이상의 효소의 활성을 감소시키는 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 효소의 활성은 천연 효소(들)의 발현 또는 활성을 조절하여 감소된다. 이러한 유형의 예시적인 효소는 에놀라제, 피루베이트 디히드로게나제, 펜토스 포스페이트 경로 당 이소머라제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 및 리불로스-5-포스페이트 이소머라제를 포함한다. 이러한 효소의 활성은 예를 들어, 상응하는 유전자(들)의 천연 프로모터를 활성이 덜하거나 또는 불활성인 프로모터로 치환하거나 또는 상응하는 유전자(들)를 결실시켜서 감소시킬 수 있다. 에스. 세레비지아에 및 와이. 리폴리티카에서, 각각 프로모터 치환 및 표적화된 유전자 결실에 대한 계획의 예는 도 12 및 13을 참조한다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 하나 이상의 부차 경로를 통한 전구체 소비를 감소시키기 위한 히스타민-생산 미생물 세포의 조작은 히스타민 역가를 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 또는 적어도 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 또는 100배 까지 증가시킨다. 다양한 구현예에서, 히스타민 역가의 증가는 10% 내지 100배, 2배 내지 50배, 5배 내지 40배, 10배 내지 30배의 범위, 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정되는 임의 범위이다. 이들 증가는 전구체 소비를 감소시키기 위한 유전자 변경을 포함하지 않는 히스타민-생산 미생물 세포에서 관찰되는 히스타민 역가에 대해서 결정된다. 이러한 기준 세포는 히스타민 생산 증가를 목적으로 하는 다른 유전자 변경을 가질 수 있고 (그러나 그럴 필요는 없음), 다시 말해서, 세포는 상류 경로 효소의 증가된 활성을 가질 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 부차 경로에 의한 전구체 소비를 감소시켜 획득된 히스타민 역가는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 10, 20, 50 g/L이다. 다양한 구현예에서, 역가는 50 ㎍/L 내지 50 g/L, 75 ㎍/L 내지 20 g/L, 100 ㎍/L 내지 10 g/L, 200 ㎍/L 내지 5 g/L, 500 ㎍/L 내지 4 g/L, 1 mg/L 내지 3 g/L, 500 mg/L 내지 2 g/L의 범위 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정되는 임의 범위이다.
하나 이상의 천연 효소의 활성 증가 및/또는 하나 이상의 피드백-탈조절된 효소의 도입 및/또는 하나 이상의 부차 경로에 의한 전구체 소비 감소에 대한 접근법은 보다 더 높은 히스타민 생산 수준을 획득하기 위해서 조합될 수 있다.
미생물 숙주 세포
도입된 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있는 임의의 미생물은 상기 기술된 바와 같이 히스타민의 발효적 생산을 위해 조작될 수 있다. 일정 구현예에서, 미생물은 히스타민의 발효적 생산을 천연적으로 할 수 없는 것이다. 일부 구현예에서, 미생물은 쉽게 배양되는 것, 예컨대, 예를 들어, 관심 화합물의 발효적 생산에서 숙주 세포로서 유용하다고 알려진 미생물이다. 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아를 포함하는 박테리아 세포가 상기 기술된 바와 같이 조작될 수 있다. 예에는 씨. 글루타미컴 (C. glutamicum) 세포이외에도, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilus), 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis), 비. 렌투스 (B. lentus), 비. 브레비스 (B. brevis), 비. 스테아로써모필러스 (B. stearothermophilus), 비. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), 비. 아밀로리케파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 비. 클라우시이 (B. clausii), 비. 할로두란스 (B. halodurans), 비. 메가테리움 (B. megaterium), 비. 코아굴란스 (B. coagulans), 비. 실쿨란스 (B. circulans), 비. 라우투스 (B. lautus), 비. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 에스. 알부스 (S. albus), 에스. 리비단스 (S. lividans), 에스. 코엘리콜로르 (S. coelicolor), 에스. 그리세우스 (S. griseus), 슈도모나스 (Pseudomonas) sp., 피. 알칼리게네스 (P. alcaligenes), 피. 시트레아 (P. citrea), 락토바실리스 (Lactobacilis) spp. (예컨대, 엘. 락티스 (L. lactis), 엘. 플란타럼 (L. plantarum)), 엘. 그라이이 (L. grayi), 이. 콜라이 (E. coli), 이. 파에시움 (E. faecium), 이. 갈리나럼 (E. gallinarum), 이. 카셀리플라부스 (E. casseliflavus), 및/또는 이. 파에칼리스 (E. faecalis) 세포를 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법에서 미생물 숙주 세포로서 사용될 수 있는 수많은 유형의 혐기성 세포가 존재한다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 절대 혐기성 세포이다. 절대 혐기균은 전형적으로 산소가 존재하는 조건 하에서 잘 자라지 않는다. 소량의 산소가 존재할 수 있고, 다시 말해서, 절대 혐기군이 낮은 수준의 산소에 대해서 가지는 어느 정도 수준의 내성 수준이 존재한다는 것을 이해한다. 상기 기술된 바와 같이 조작된 절대 혐기균은 실질적으로 산소-무함유 조건 하에서 성장할 수 있고, 존재하는 산소의 양이 혐기균의 성장, 유지, 및/또는 발효에 유해하지 않다.
대안적으로, 본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 미생물 숙주 세포는 통성 혐기성 세포일 수 있다. 통성 혐기균은 산소가 존재하면 호기성 호흡 (예를 들어, TCA 사이클의 이용)을 통해 세포 ATP를 발생시킬 수 있다. 그러나, 통성 혐기균은 또한 산소 부재 하에서도 성장할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 조작된 통성 혐기균은 실질적으로 산소-무함유 조건 하에서 성장할 수 있고, 존재하는 산소의 양은 혐기균의 성장, 유지, 및/또는 발효에 유해하지 않거나, 또는 대안적으로 더 많은 양의 산소 존재 하에서 성장할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 미생물 숙주 세포는 사상성 진균 세포이다 (예를 들어, [Berka & Barnett, Biotechnology Advances, (1989), 7(2):127-154] 참조). 예에는 트리코더마 론지브라키아텀 (Trichoderma longibrachiatum), 티. 비리데 (T. viride), 티. 코닌지이 (T. koningii), 티. 하지아넘 (T. harzianum), 페니실리움 (Penicillium) sp., 후미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 에이치. 라누기노스 (H. lanuginose), 에이치. 그리세아 (H. grisea), 크리소스포리움 (Chrysosporium) sp., 씨. 루크노웬스 (C. lucknowense), 글리오클라디움 (Gliocladium) sp., 아스퍼질러스 (Aspergillus) sp. (예컨대, 에이. 오리자에 (A. oryzae), 에이. 니거 (A. niger), 에이. 소자에 (A. sojae), 에이. 자포니커스 (A. japonicus), 에이. 니둘란스 (A. nidulans), 또는 에이. 아와모리 (A. awamori)), 푸사리움 (Fusarium) sp. (예컨대, 에프, 로세움 (F. roseum), 에프. 그라미넘 (F. graminum), 에프. 세레알리스 (F. cerealis), 에프. 옥시스포루임 (F. oxysporuim), 또는 에프. 베네나텀 (F. venenatum)), 뉴로스포라 (Neurospora) sp. (예컨대, 엔. 크라싸 (N. crassa) 또는 히포크레아 (Hypocrea) sp.), 무코르 (Mucor) sp. (예컨대, 엠. 미에헤이 (M. miehei)), 리조푸스 (Rhizopus) sp., 및 에메리셀라 (Emericella) sp. 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 기술된 바와 같이 조작되는 진균 세포는 에이. 니둘란스 (A. nidulans), 에이. 아와모리 (A. awamori), 에이. 오리자에 (A. oryzae), 에이. 아쿨레아투스 (A. aculeatus), 에이. 니거 (A. niger), 에이. 자포니커스 (A. japonicus), 티. 리세이 (T. reesei), 티. 비리데 (T. viride), 에프. 옥시스포럼 (F. oxysporum) 또는 에프. 솔라니 (F. solani)이다. 이러한 숙주와 사용을 위한 예시적인 플라스미드들 또는 플라스미드 성분은 미국 공개 특허 출원 제2011/0045563호에 기술된 것들을 포함한다.
효모가 또한 본 명세서에 기술된 방법에서 미생물 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) sp., 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) sp., 피키아 (Pichia) sp., 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 피키아 스티피테스 (Pichia stipites), 클루이베로마이세스 마르시아너스 (Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) spp., 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 및 칸디다 (Candida) sp.를 포함한다. 일부 구현예에서, 사카로마이세스 sp.는 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae)이다 (예를 들어, [Romanos et al., Yeast, (1992), 8(6):423-488] 참조). 이러한 숙주와 사용을 위한 예시적인 플라스미드들 또는 플라스미드 성분들은 미국 특허 제7,659,097호 및 미국 공개 특허 출원 제2011/0045563호에 기술된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 예를 들어 녹조류, 적조류, 회조류 (glaucophyte), 클로라라크니오파이트 (chlorarachniophyte), 유클레니드 (euglenid), 크로미스타 (chromista), 또는 와편모충 (dinoflagellate)으로부터 유래된 조류 세포일 수 있다. (예를 들어, [Saunders & Warmbrodt, "Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast," (1993), National Agricultural Library, Beltsville, Md.] 참조). 조류 세포에서 사용을 위한 예시적인 플라스미드들 또는 플라스미드 성분들은 미국 공개 특허 출원 제2011/0045563호에 기술된 것들을 포함한다.
다른 구현예에서, 숙주 세포는 시아노박테리움 (cyanobacterium), 예컨대 형태학을 기반으로 임의의 하기 군으로 분류되는 시아노박테리움이다: 클로로코칼레스 (Chlorococcales), 플레우로캅살레스 (Pleurocapsales), 오실라토리알레스 (Oscillatoriales), 노스토칼레스 (Nostocales), 시네코시스틱 (Synechosystic) 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales) (예를 들어, [Lindberg et al., Metab. Eng., (2010) 12(1):70-79] 참조). 시아노박테리아 세포에서 사용을 위한 예시적인 플라스미드들 또는 플라스미드 성분들은 미국 특허 출원 제2010/0297749호 및 제2009/0282545호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/034863에 기술된 것들을 포함한다.
유전자 조작 방법
미생물 세포는 당분야에 속하는, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 및 생화학의 통상의 기술을 사용하여 발효적 히스타민 생산을 위해 조작될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 완전하게 설명되어 있으며, 예를 들어 다음을 참조한다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," fourth edition (Sambrook et al., 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" (R. I. Freshney, ed., 6th Edition, 2010); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction," (Mullis et al., eds., 1994); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994).
벡터는 세포로 유전 물질을 도입시키는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 비히클이다. 본 명세서에 기술된 방법에서 유용한 벡터는 선형 또는 원형일 수 있다. 벡터는 숙주 세포의 표적 게놈으로 통합될 수 있거나 또는 숙주 세포에서 독립적으로 복제될 수 있다. 많은 적용을 위해서, 안정한 형질전환체를 생성시킨 통합 벡터가 바람직하다. 벡터는 예를 들어, 복제 기원, 다중 클로닝 부위 (MCS), 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 특정 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열 (종종 코딩 서열)의 발현을 촉진하는 조절 엘리먼트를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 제한없이 통합 벡터, 원핵생물 플라스미드, 에피솜, 바이러스 벡터, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함한다.
발현 카세트에서 사용될 수 있는 예시적인 조절 엘리먼트는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 다른 발현 제어 엘리먼트 (예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함한다. 이러한 조절 엘리먼트는 예를 들어 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 게놈 편집을 수행할 수 있는 시스템, 예컨대 CRISPR 시스템을 도입시키는데 사용될 수 있다 (2014년 3월 6일 공개된 미국 공개 특허 출원 제2014/0068797호; 또한, [Jinek M., et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity," Science 337:816-21, 2012] 참조). 제II형 CRISPR-Cas9 시스템에서, Cas9는 부위-지정 엔도뉴클레아제로서, 즉 2종의 별개 엔도뉴클레아제 도메인 (HNH 및 RuvC/RNase H-유사 도메인)을 사용하여 특정 표적 서열에서 폴리뉴클레오티드를 절단하거나 또는 절단하도록 지정할 수 있는 효소이다. Cas9는 임의의 바람직한 부위에서 DNA를 절단하도록 조작될 수 있는데 Cas9는 RNA에 의해 이의 절단 부위로 지정되기 때문이다. 그러므로 또한 Cas9는 "RNA-가이드된 뉴클레아제"로서 설명된다. 보다 특히, Cas9는 표적 폴리뉴클레오티드의 특이적 서열과 RNA 분자(들)의 적어도 일부분의 하이브리드화를 기반으로 특이적 폴리뉴클레오티드 표적으로 Cas9를 가이드하는, 하나 이상의 RNA 분자와 회합된다. Ran, F.A. 등 ("In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9," Nature 520(7546):186-91, 2015, Apr 9], 모든 확장 데이터 포함)은 crRNA/tracrRNA 서열 및 8종의 제II형 CRISPR-Cas9 시스템의 2차 구조를 제시한다. Cas9-유사 합성 단백질이 또한 당분야에 공지되어 있다 (2014년 10월 23일 공개, 미국 공개 특허 출원 제2014-0315985호 참조).
실시예 1은 씨. 글루타미컴 및 에스. 세레비지아에 세포의 게놈으로 폴리뉴클레오티드 및 다른 유전자 변경을 도입시키기 위한 예시적인 통합 접근법을 기술한다.
벡터 또는 다른 폴리뉴클레오티드는 임의의 다양한 표준 방법, 예컨대 형질전환, 접합, 전기영동, 핵 미세주입, 형질도입, 형질감염 (예를 들어, 리포펙션 매개 또는 DEAE-덱스트린 매개 형질감염 또는 재조합 파지 바이러스 사용의 형질감염), 칼슘 포스페이트 DNA 침전물과 인큐베이션, DNA-코팅된 미세발사체를 사용한 고속 폭격, 및 원형질체 융합을 통해 미생물 세포로 도입될 수 있다. 형질전환체는 당분야에 공지된 임의 방법으로 선별될 수 있다. 형질전환체를 선별하기 위한 적합한 방법은 미국 공개 특허 출원 제2009/0203102호, 제2010/0048964호, 및 제2010/0003716호, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2009/076676, WO 2010/003007, 및 WO 2009/132220에 기술되어 있다.
조작된 미생물 세포
상기 기술된 방법은 히스타민을 생산하고, 일부 구현예에서, 과생산하는 조작된 미생물 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 조작된 미생물 세포는 천연 미생물 세포, 예컨대 본 명세서에 기술된 임의의 미생물 숙주 세포와 비교하여, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 유전자 변경, 예컨대 30-100 변경을 가질 수 있다. 하기 실시예에 기술된 조작된 미생물 세포는 1, 2, 또는 3개의 유전자 변경을 갖지만, 당업자는 본 명세서에 기재된 지침에 따라서, 추가의 변경을 갖는 미생물 세포를 디자인할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 미생물 세포는 천연 미생물 세포와 비교하여, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4 이하의 유전자 변경을 갖는다. 다양한 구현예에서, 히스타민 생산을 위해 조작된 미생물 세포는 임의의 하기 예시적인 범위에 속하는 수의 유전자 변경을 가질 수 있다: 1-10, 1-9, 1-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4 등.
일부 구현예에서, 조작된 미생물 세포는 예컨대 히스타민을 천연적으로 생산하지 않는 미생물 숙주 세포의 경우에, 적어도 하나의 이종성 히스타민 디카르복실라제를 발현한다. 다양한 구현예에서, 미생물 세포는 예를 들어, (1) 단일 이종성 히스타민 디카르복실라제 유전자, (2) 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 둘 이상의 이종성 히스타민 디카르복실라제 유전자 (달리 말해서, 다수 카피의 동일한 이종성 히스타민 디카르복실라제 유전자가 도입될 수 있거나 또는 다수의 상이한 이종성 히스타민 디카르복실라제 유전자가 도입될 수 있음), (3) 세포에 천연이 아닌 단일 이종성 히스타민 디카르복실라제 유전자 및 하나 이상의 추가 카피의 천연 히스타민 디카르복실라제 유전자, 또는 (4) 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 둘 이상의 비천연 히스타민 디카르복실라제 유전자, 및 하나 이상의 추가 카피의 천연 히스타민 디카르복실라제 유전자를 포함하고 발현할 수 있다.
이러한 조작된 숙주 세포는 히스티딘의 생산을 유도하는 경로를 통한 흐름 (히스타민의 중간 전구체)을 증가시키는 적어도 하나의 추가 유전자 변경을 포함할 수 있다. 경로에서 이들 "상류" 효소는 (당업자가 쉽게 이해하는 바와 같이 상이한 명칭으로 공지될 수 있는) 이들 효소 활성을 갖는 임의의 이소폼, 파라로그 또는 오솔로그를 포함하여, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실-ATP 파이로포스파타제, 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제, 5'ProFAR 이소머라제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 신타제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 포스파타제, 히스티디놀 디히드로게나제 및 리보스 포스페이트 파이로포스포키나제를 포함한다. 적어도 하나의 추가 변경은 예를 들어 (1) 천연 효소(들)의 발현 또는 활성 조절, (2) 천연 효소에 대한 유전자의 하나 이상의 추가 카피 발현, 및/또는 (3) 하나 이상의 비천연 효소에 대한 유전자의 하나 이상의 카피 발현을 통해서, 임의의 이용가능한 수단에 의해 상류 경로 효소(들)의 활성을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 경로를 통해 증가된 흐름은 상기 논의된 바와 같이, 피드백-탈조절된 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현하여 획득될 수 있다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포는 하나 이상의 피드백-탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 포함하고 발현할 수 있다.
조작된 미생물 세포는 천연 뉴클레오티드 서열을 갖거나 또는 천연과 상이한 도입된 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 천연 뉴클레오티드 서열은 특정 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 임의의 이들 도입된 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 천연일 수 있거나 또는 천연과 상이할 수 있다. 다양한 구현예에서, 아미노산 서열은 천연 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 히스타민에 대한 전구체의 증가된 이용가능성은 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 효소, 예컨대 에놀라제, 피루베이트 디히드로게나제, 펜토스 포스페이트 경로 당 이소머라제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, 리불로스-5-포스페이트 에피머라제, 및 리불로스-5-포스페이트 이소머라제의 발현 또는 활성을 감소시켜 획득될 수 있다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포는 임의의 이들 효소의 발현을 하향 조절하기 위해서 하나 이상의 프로모터 교체를 포함할 수 있고/있거나 그들 발현을 전체로 제거하기 위해서 그들 유전자를 결실시킬 수 있다.
본 명세서에 기술된 접근법은 박테리아 세포, 즉 씨. 글루타미컴 및 비. 바실러스 (원핵생물), 및 진균 세포, 즉 효모 에스. 세레비지아에 및 와이. 리폴리티카 (진핵생물)에서 수행되었다 (실시예 1 및 2 참조).
예시적인 조작된 효모 세포
일정 구현예에서, 조작된 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아에) 세포는 크로모박테리움 (Chromobacterium) sp. LK1 유래 히스타민 디카르복실라제 (예를 들어, SEQ ID NO:6)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 히스타민 디카르복실라제를 발현한다. 특정 구현예에서, 크로모박테리움 sp. LK1 히스타민 디카르복실라제는 SEQ ID NO:6을 포함할 수 있다. 조작된 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아에) 세포는 또한 에스. 세레비지아에 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 에스. 세레비지아에 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:3을 포함한다.
일정 구현예에서, 조작된 효모 (예를 들어, 와이. 리폴리티카) 세포는 아시네토박터 바우만니이 균주 AB0057 유래 히스타민 디카르복실라제 (예를 들어, SEQ ID NO:1)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 히스타민 디카르복실라제를 발현한다. 특정 구현예에서, 아시네토박터 바우만니이 균주 AB0057의 히스타민 디카르복실라제는 SEQ ID NO:1을 포함할 수 있다. 조작된 효모 (예를 들어, 와이. 리폴리티카) 세포는 또한 에스. 세레비지아 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 에스. 세레비지아 S288c의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:3을 포함한다.
이들은 조작된 효모 세포의 유일한 유전자 변경일 수 있거나, 또는 효모 세포는 상기에 보다 일반적으로 논의된 바와 같이, 하나 이상의 추가 유전자 변경을 포함할 수 있다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 상기 기술된 조작된 효모 에스. 세레비지아에 세포는 아미노산 치환 N215K, L231F 및 T235A를 함유하는 씨. 글루타미컴 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 변이체 (SEQ ID NO:7)와 전형적으로 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 씨. 글루타미컴의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제의 피드백 탈조절된 변이체를 추가로 발현한다. 특정 구현예에서, 씨. 글루타미컴의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 변이체는 SEQ ID NO:7을 포함할 수 있다.
예시적인 조작된 박테리아 세포
일정 구현예에서, 조작된 박테리아 (예를 들어, 씨. 글루타미컴) 세포는 아시네토박터 바우만니이 유래 히스타민 디카르복실라제 (예를 들어, SEQ ID NO:1)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 히스타민 디카르복실라제를 발현한다. 특정 구현예에서, 아시네토박터 바우만니이의 히스타민 디카르복실라제는 SEQ ID NO:1을 포함할 수 있다. 조작된 박테리아 (예를 들어, 씨. 글루타미컴) 세포는 또한 사카로마이세스 세레비지아에 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:3)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 에스. 세레비지아에 S288c의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:3을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 박테리아 (예를 들어, 씨. 글루타미컴) 세포는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 대신에, 씨. 글루타미컴 유래 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제 (SEQ ID NO:2)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제를 발현한다. 특정 구현예에서, 씨. 글루타미컴의 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제는 SEQ ID NO:2를 포함한다.
일정 구현예에서, 조작된 박테리아 (예를 들어, 비. 서브틸리스) 세포는 락토바실러스 sp. (균주 30a) 유래 히스타민 디카르복실라제 (예를 들어, SEQ ID NO:4)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 히스타민 디카르복실라제를 발현한다. 특정 구현예에서, 락토바실러스 sp. (균주 30a)의 히스타민 디카르복실라제는 SEQ ID NO:4를 포함할 수 있다. 조작된 박테리아 (예를 들어, 비. 서브틸리스) 세포는 또한 살모넬라 티피뮤리움 LT2 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO:5)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 이종성 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 발현할 수 있다. 특정 구현예에서, 살모넬라 티피뮤리움 LT2 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO:5를 포함한다.
조작된 미생물 세포의 배양
본 명세서에 기술된 임의의 미생물 세포는 예를 들어 유지, 성장 및/또는 히스타민 생산을 위해 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양물은 10-500의 600 nm에서의 광학 밀도, 예컨대 50-150의 광학 밀도까지 성장된다.
다양한 구현예에서, 배양물은 생산된 히스타민을 적어도 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 ㎍/L, 또는 적어도 1, 10, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mg/L 또는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 10, 20, 50 g/L의 역가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 역가는 10 ㎍/L 내지 10 g/L, 25 ㎍/L 내지 20 g/L, 100 ㎍/L 내지 10 g/L, 200 ㎍/L 내지 5 g/L, 500 ㎍/L 내지 4 g/L, 1 mg/L 내지 3 g/L, 500 mg/L 내지 2 g/L 또는 상기 열거된 임의 값으로 한정된 임의 범위이다.
배양 배지
미생물 세포는 제한없이, 최소 배지, 즉 세포 성장이 가능한 최소 영양소를 함유하는 것을 포함한 임의의 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 최소 배지는 전형적으로 (1) 미생물 성장을 위한 탄소원; (2) 특정 미생물 세포 및 성장 조건에 의존적일 수 있는, 염; 및 (3) 물을 함유한다. 적합한 배지는 또한 하기의 임의 조합을 포함할 수 있다: 성장 및 생성물 형성을 위한 질소원, 성장을 위한 황원, 성장을 위한 포스페이트원, 성장을 위한 금속 염, 성장을 위한 비타민, 및 기타 성장을 위한 보조인자.
임의의 적합한 탄소원이 숙주 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 용어 "탄소원"은 미생물 세포에 의해 대사될 수 있는 하나 이상의 탄소-함유 화합물을 의미한다. 다양한 구현예에서, 탄소원은 탄수화물 (예컨대 단당류, 이당류, 올리고당류, 또는 다당류), 또는 전화당 (예를 들어, 효소 처리 수크로스 시럽)이다. 예시적인 단당류는 글루코스 (덱스트로스), 프룩토스 (레불로스), 및 갈락토스를 포함하고; 예시적인 올리고당류는 덱스트란 또는 글루칸을 포함하고, 예시적인 다당류는 전분 및 셀룰로스를 포함한다. 적합한 당은 C6 당류 (예를 들어, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 또는 글루코스) 및 C5 당류 (예를 들어, 자일로스 또는 아라비노스)를 포함한다. 다른, 덜 비싼 탄소원은 사탕수수 주스, 비스 주스, 수수 주스 등을 포함하고, 이들 중 어느 하나는 완전 또는 부분 탈이온될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
배양 배지 중 염은 일반적으로 세포가 단백질 및 핵산을 합성할 수 있도록 마그네슘, 질소, 인 및 황과 같은 필수 원소를 제공한다.
최소 배지는 하나 이상의 선별제, 예컨대 항생제가 보충될 수 있다.
히스타민을 생산하기 위해서, 배양 배지는 글루코스 및/또는 질소원 예컨대 우레아, 암모늄 염, 암모니아, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있고/있거나, 배양 동안 보충된다.
배양 조건
미생물 세포의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2009/0203102호, 제2010/0003716호, 및 제2010/0048964호, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/033646, WO 2009/076676, WO 2009/132220, 및 WO 2010/003007, [Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994)] 또는 [Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass]를 참조한다.
일반적으로, 세포는 적절한 온도, 가스 혼합물, 및 pH (예컨대 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 6% 내지 약 84% CO2, 및 약 5 내지 약 9의 pH)에서 성장되고 유지된다. 일부 양상에서, 세포는 35℃에서 성장된다. 일정 구현예에서, 예컨대 호열성 박테리아가 숙주 세포로서 사용되는 경우에, 더 높은 온도 (예를 들어, 50℃-75℃)가 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 발효를 위한 pH 범위는 약 pH 5.0 내지 약 pH 9.0 (예컨대 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0 또는 약 6.5 내지 약 7.0)이다. 세포는 특정 세포의 요건을 기반으로 유산소, 저산소, 또는 무산소 조건 하에서 성장될 수 있다.
사용할 수 있는 표준 배양 조건 및 발효 방식, 예컨대 회분식, 유가식, 또는 연속 발효는 미국 공개 특허 출원 제2009/0203102호, 제2010/0003716호, 및 제2010/0048964호, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2009/076676, WO 2009/132220, 및 WO 2010/003007에 기술되어 있다. 회분식 및 유가식 발효는 당분야에 일반적으로 충분히 공지되어 있고, 예는 [Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc]에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 제한 당 (예를 들어, 글루코스) 조건 하에서 배양된다. 다양한 구현예에서, 첨가되는 당의 양은 세포가 소비할 수 있는 당의 양의 약 105% 이하 (예컨대 약 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10%)이다. 특정 구현예에서, 배양 배지에 첨가되는 당의 양은 특정 시간 기간 동안 세포가 소비하는 당의 양과 대략 동일하다. 일부 구현예에서, 세포 성장 속도는 세포 배지 중 당의 양에 의해 뒷받침될 수 있는 속도로 세포가 성장하도록 첨가되는 당의 양을 제한하여 제어된다. 일부 구현예에서, 당은 세포가 배양되는 시간 동안 축적되지 않는다. 다양한 구현예에서, 세포는 약 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 70시간 이상 또는 최대 약 5-10일의 시간 동안 제한된 당 조건 하에서 배양된다. 다양한 구현예에서, 세포는 세포가 배양되는 총 시간 길이의 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 100% 이상 동안 제한된 당 조건 하에서 배양된다. 임의의 특정 이론에 국한하려는 것은 아니나, 제한된 당 조건은 세포의 보다 유리한 조절을 허용할 수 있다고 여겨진다.
일부 양상에서, 세포는 회분식 배양으로 성장된다. 세포는 또한 유가식 배양 또는 연속 배양으로 성장될 수 있다. 추가로, 세포는 제한없이, 임의의 상기 기술된 최소 배지를 포함하여, 최소 배지에서 배양될 수 있다. 최소 배지는 1.0% (w/v) 이하의 글루코스 (또는 임의의 다른 6-탄당)가 더 보충될 수 있다. 특히, 최소 배지는 1% (w/v), 0.9% (w/v), 0.8% (w/v), 0.7% (w/v), 0.6% (w/v), 0.5% (w/v), 0.4% (w/v), 0.3% (w/v), 0.2% (w/v), 또는 0.1% (w/v)의 글루코스가 보충될 수 있다. 일부 배양에서, 유의하게 더 높은 수준의 당 (예를 들어, 글루코스)은 예를 들어 적어도 10% (w/v), 20% (w/v), 30% (w/v), 40 % (w/v), 50% (w/v), 60% (w/v), 70% (w/v), 또는 배지 중 당의 용해도 한계까지 사용된다. 일부 구현예에서, 당 수준은 상기 값 중 어느 2개의 범위, 예를 들어 0.1-10% (w/v), 1.0-20% (w/v), 10-70% (w/v), 20-60% (w/v), 또는 30-50% (w/v)에 속한다. 더 나아가서, 상이한 당 수준이 배양의 상이한 시기 동안 사용될 수 있다. (예를 들어, 에스. 세레비지아에 또는 씨. 글루타미컴의) 유가식 배양의 경우, 당 수준은 회분식 기간에 약 100-200 g/L (10-20% (w/v))이고 그 다음에 최대 약 500-700 g/L (공급물 중 50-70%)일 수 있다.
추가로, 최소 배지는 0.1% (w/v) 이하의 효모 추출물이 보충될 수 있다. 특히, 최소 배지는 0.1% (w/v), 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07% (w/v), 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 0.02% (w/v), 또는 0.01% (w/v)의 효모 추출물이 보충될 수 있다. 대안적으로, 최소 배지는 1% (w/v), 0.9% (w/v), 0.8% (w/v), 0.7% (w/v), 0.6% (w/v), 0.5% (w/v), 0.4% (w/v), 0.3% (w/v), 0.2% (w/v), 또는 0.1% (w/v)의 글루코스 및 0.1% (w/v), 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07% (w/v), 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 또는 0.02% (w/v)의 효모 추출물이 보충될 수 있다. 일부 배양에서, 유의하게 더 높은 수준의 효모 추출물이, 예를 들어 적어도 1.5% (w/v), 2.0% (w/v), 2.5% (w/v), 또는 3% (w/v)로 사용될 수 있다. (예를 들어, 에스. 세레비지아에 또는 씨. 글루타미컴의) 일부 배양에서, 효모 추출물 수준은 상기 값 중 임의의 2개의 범위, 예를 들어 0.5-3.0% (w/v), 1.0-2.5% (w/v), 또는 1.5-2.0% (w/v)에 속한다.
본 명세서에 기술된 조작된 미생물 세포의 유지 및 성장에 적합한 예시적인 재료 및 방법은 하기 실시예 1에서 확인할 수 있다.
히스타민 생산 및 회수
본 명세서에 기술된 임의 방법은 히스타민을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소위 수확 스트림에 함유된 생산된 히스타민은 생산 용기로부터 회수/수확된다. 수확 스트림은 예를 들어 생산 용기 중 휴지기 세포에 의한 생산 기질의 전환 결과로서 히스타민을 함유하는, 생산 용기로부터 생성된 세포-무함유 또는 세포-함유 수용액을 포함할 수 있다. 수확 스트림에 여전히 존재하는 세포는 당분야에 공지된 임의의 작업, 예컨대 여과, 원심분리, 디켄테이션, 막 직교류 한외여과 또는 미세여과, 접선 유동 한외여과 또는 미세여과 또는 데드 엔드 여과를 통해 히스타민으로부터 분리될 수 있다. 이러한 세포 분리 작업 이후에, 수확 스트림은 본질적으로 세포가 없다.
수확 스트림에 함유된 다른 성분들로부터 생산된 히스타민의 분리 및/또는 정제의 추가 단계, 즉 소위 하류 처리 단계가 임의로 수행될 수 있다. 이들 단계는 당업자에게 공지된 임의 수단, 예컨대, 예를 들어, 농축, 추출, 결정화, 침전, 흡착, 이온 교환, 및/또는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 임의의 이들 절차는 단독으로 또는 히스타민 정제를 위해 조합하여 사용될 수 있다. 추가의 정제 단계는 예를 들어, 농축, 결정화, 침전, 세척 및 건조, 활성탄 처리, 이온 교환, 나노여과, 및/또는 재결정화 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 정제 프로토콜의 디자인은 세포, 배양 배지, 배양 크기, 생산 용기 등에 따라 좌우될 수 있고, 당분야의 기술 수준 내이다.
하기 실시예는 본 개시의 다양한 구현예를 예시하는 목적으로 제공되고 임의 방식으로 본 개시를 제한하려는 것을 의미하지 않는다. 청구항의 범주에 의해 한정되는, 본 개시의 사조 내에 포괄되는 그 안의 변화 및 다른 용도는 당업자가 식별가능할 것이다.
실시예 1 - 히스타민을 생산하도록 조작된 코리네박테리아 글루타미컴 및 사카로마이세스 세레비지아에 균주의 구축 및 선별
플라스미드/DNA 디자인
이 작업에서 시험된 모든 균주는 독점 소프트웨어를 사용해 디자인된 플라스미드 DNA로 형질전환시켰다. 플라스미드 디자인은 이 작업에서 조작된 각각의 숙주 유기체에 특이적이었다. 플라스미드 DNA는 표준 DNA 조립 방법을 통해 물리적으로 구축되었다. 그 다음으로 이러한 플라스미드 DNA는 각각 하기에 기술된, 2종의 숙주-특이적 방법 중 하나를 통해서 물질대사 경로 삽입부를 통합시키는데 사용되었다.
씨. 글루타미컴 경로 통합
"루프-인, 단일-크로스오버" 게놈 통합 전략이 씨. 글루타미컴 균주를 조작하기 위해 개발되었다. 도 14는 루프-인 단독 및 루프-인/루프-아웃 구성체의 게놈 통합 및 콜로니 PCR을 통한 올바른 통합의 검증을 예시한다. 루프-인 단독 구성체 (제목 "루프-인"으로 도시)는 단일 2-kb 상동성 팔부 ("통합 유전자좌"로 표시), 양성 선별 마커 ("마커"로 표시), 및 관심 유전자(들) ("프로모터-유전자-종결인자"로 표시)를 함유하였다. 단일 크로스오버 사건은 플라스미드를 씨. 글루타미컴 염색체로 통합시켰다. 통합 사건은 항생제 (25 ㎍/mL의 카나마이신)의 존재 하에서 성장을 통해 게놈에 안정하게 유지된다. 루프-인 통합으로부터 유래된 콜로니에서 올바른 게놈 통합은 UF/IR 및 DR/IF PCR 프라이머를 사용한 콜로니 PCR을 통해 확인하였다.
루프-인, 루프-아웃 구성체 (제목 "루프-인, 루프-아웃"으로 도시)는 2개의 2-kb 상동성 팔부 (5' 및 3' 팔부), 관심 유전자(들) (화살표), 양성 선별 마커 ("마커"로 표시), 및 역선별 마커를 함유하였다. "루프-인" 단독 구성체와 유사하게, 단일 크로스오버 사건은 플라스미드를 씨. 글루타미컴의 염색체로 통합시켰다. 주: 2종의 가능한 통합 중 오직 하나만 여기에 도시된다. 올바른 게놈 통합은 콜로니 PCR을 통해 확인하였고 역선별은 플라스미드 골격 및 역선별 마커가 절개될 수 있도록 적용되었다. 이것은 2개 가능성 중 하나의 결과를 야기시켰다: 야생형으로 반전 (아래 좌측 박스) 또는 바람직한 경로 통합 (아래 우측 박스). 다시, 올바른 게놈 루프-아웃은 콜로니 PCR을 통해 확인된다. (약어: 프라이머: UF = 상류 전방향, DR = 하류 역방향, IR = 내부 역방향, IF = 내부 전방향).
에스. 세레비지아에 경로 통합
"분할-마커, 이중-크로스오버" 게놈 통합 전략은 에스. 세레비지아에 균주를 조작하기 위해 개발되었다. 도 11은 상보성, 분할-마커 플라스미드의 게놈 통합 및 에스. 세레비지아에에서 콜로니 PCR을 통한 올바른 게놈 통합의 검증을 예시한다. 상보성 5' 및 3' 상동성 팔부 및 URA3 선별 마커의 중복된 절반 (해시 바로 표시된 직접 반복부)을 갖는 2개 플라스미드는 메가뉴클레아제로 분해되었고 선형 단편으로서 형질전환되었다. 삼중-크로스오버 사건은 바람직한 이종성 유전자를 표적화된 유전자좌로 통합시켰고 전체 URA3 유전자를 재구축하였다. 이러한 통합 사건으로부터 유래된 콜로니는 5' 및 3' 접합부 둘 모두를 확인하기 위해 2개의 3-프라이머 반응을 사용해 어세이되었다 (UF/IF/wt-R 및 DR/IF/wt-F). 추가 조작이 바람직한 균주의 경우에, 균주는 본래 직접 반복부의 작은 단일 카피를 남겨둔 채 URA3의 제거에 대해 선별하기 위해서 5-FOA 플레이트 상에 플레이팅될 수 있다. 이러한 게놈 통합 전략은 동일한 작업 흐름으로 유전자 녹-아웃, 유전자 녹-인, 및 프로모터 적정을 위해 사용될 수 있다.
세포 배양
에스. 세레비지아에에 대해 확립된 작업 흐름은 플레이트 전체에서 균주를 임의 추출하는 자동화 작업흐름을 사용해 성공적으로 구축된 균주를 강화시키는 히트-피킹 (hit-picking) 단계를 포함하였다. 성공적으로 구축된 각각의 균주에 대해서, 콜로니 대 콜로니 변이 및 다른 과정 변이를 시험하기 위해 개별 콜로니로부터 최대 4개의 복제물을 시험하였다. 4개 미만의 콜로니가 수득되었으면, 존재하는 콜로니는 적어도 4개 웰이 각각의 바람직한 유전자형으로부터 시험되도록 복제하였다.
콜로니는 선별 배지 (에스. 세레비지아의 경우 SD-ura)가 존재하는 96-웰 플레이트에서 강화시켰고 포화까지 2일 동안 배양한 후에 저장을 위해서 16.6% 글리세롤 존재로 -80℃에서 냉동시켰다. 그 다음에 냉동된 글리세롤 스톡은 냉동으로부터 성장 및 회수를 돕기 위해서 낮은 수준의 아미노산이 존재하는 최소 배지에서 씨드 단계를 접종하는데 사용되었다. 씨드 플레이트는 30℃에서 1일 내지 2일 동안 성장시켰다. 다음으로 씨드 플레이트는 최소 배지의 주요 배양 플레이트를 접종하는데 사용되었고 48-88시간 동안 성장되었다. 플레이트는 바람직한 시점에 제거되었고 세포 밀도 (OD600), 생존능 및 글루코스에 대해 시험되었고, 상청액 샘플은 관심 산물에 대한 LC-MS 분석을 위해 저장되었다.
세포 밀도
세포 밀도는 600 nm에서 각 웰의 흡광도를 검출하는 분광광도 어세이를 사용해 측정되었다. 로봇공학을 사용하여서 각 배양 플레이트로부터의 고정량의 배양물을 어세이 플레이트로 전달한 후에, 175 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.0)와 혼합하여 10배 희석물을 생성시켰다. 어세이 플레이트는 Tecan M1000 분광광도계를 사용해 측정하였고 어세이 데이터는 LIMS 데이터베이스에 업로드하였다. 비접종된 대조군을 사용해 배경 흡광도를 차감하였다. 세포 성장은 각 단계에서 다수 플레이트를 접종하여 모니터링하였고, 그 다음에 각 시점에 전체 플레이트를 희생시켰다.
(측정 동안 비대표적 샘플을 초래할 수 있는) 다수의 플레이트를 취급하면서 세포의 침전을 최소화하기 위해서, 각 플레이트는 각각의 판독 이전에 10초 내지 15초 동안 진탕되었다. 플레이트 내 세포 밀도의 광범위한 변동은 또한 선형 검출 범위를 벗어난 흡광도 측정을 초래할 수 있어서, 그 결과로 더 높은 OD 배양물의 과소평가를 야기시킬 수 있다. 일반적으로, 지금까지 시험된 균주는 이것을 우려할 만큼 충분히 유의하게 다양하지 않았다
액체-고체 분리
LC-MS를 통한 분석을 위해 세포외 샘플을 수확하기 위해서, 액체 및 고체 상들을 원심분리를 통해 분리시켰다. 배양 플레이트를 2000 rpm에서 4분 동안 원심분리시켰고, 상청액을 로봇공학을 사용해 목적 플레이트로 옮겼다. 75 ㎕의 상청액을 각 플레이트로 옮겼고, 그 중 하나는 4℃에 저장하였고, 두번째는 장기간 저장을 위해서 80℃에 저장하였다.
코리네박테리아 글루타미컴 및 사카로마이세스 세레비지아에에서 제1 라운드 유전자 조작 결과
라이브러리 접근법을 사용하여 히스타민 경로를 확립하기 위해 이종성 경로 효소를 스크리닝하였다. 히스티딘 디카르복실라제의 경우, 18종의 이종성 서열이 표 1에 열거된 박테리아, 조류, 녹색식물, 척추동물문, 후생동물, 및 절지동물문 공급원으로부터 시험되었다. 히스티딘 디카르복실라제는 사카로마이세스 세레비지아에 및 코리네박테리아 글루타미컴 숙주 둘 모두에서 코돈-최적화되고 발현되었다.
히스티딘 생합성은 피드백 억제를 겪으므로, 피드백 탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제가 히스티딘 디카르복실라제에 대한 기질인, 히스티딘의 생산을 개선시키기 위해서 히스티딘 디카르복실라제와 함께 시험되었다. 시험된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 살모넬라 티피뮤리움 및 코리네박테리아 글루타미컴에서 유래되었고, 피드백 억제에 내성이게 만드는 공지된 결실 및 점 돌연변이를 보유하였다.
제1 라운드 유전자 조작 결과는 표 1 및 도 2 (씨. 글루타미컴) 및 도 3 (에스. 세레비지아에)에 표시된다.
표 1. 코리네박테리아 글루타미컴 및 사카로마이세스 세레비지아에 에서 제1 라운드 유전자 조작 결과
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
주: "Cg"는 코리네박테리움 글루타미컴에 대한 코돈 최적화를 의미하고; "Sc" 는 사카로마이세스 세레비지아에에 대한 코돈 최적화를 의미한다.
코리네박테리아 글루타미컴 및 사카로마이세스 세레비지아에에서 제2 라운드 유전자 조작 결과
라이브러리 접근법을 사용하여 속도 제한 단계에 대해 스크리닝하기 위해서 항상성 프로모터를 사용해 각각의 상류 경로 효소를 별개로 발현시켜 히스타민 생산을 개선시켰다. 스크리닝된 히스티딘 경로 효소는 표 2에 열거된다. 표 2에서 효소 이외에도, 균주는 제1 라운드로부터의 최고 효소를 함유하였다: 코리네박테리아 글루타미컴 숙주는 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID B7I459) (SEQ ID NO: 1) 및 결실 Q207-E208을 함유하는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00499) (SEQ ID NO: 5)를 함유하였고, 사카로마이세스 세레비지아에 숙주는 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID J6KM89)(SEQ ID NO: 6) 및 아미노산 치환 N215K, L231F 및 T235A를 함유하는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID Q9Z472) (SEQ ID NO: 7)를 함유하였다.
제2 라운드 유전자 조작 결과는 표 2 및 도 4 (씨. 글루타미컴) 및 도 5 (에스. 세레비지아에)에 표시된다.
씨. 글루타미컴에서, 24 mg/L의 역가가 2개 유전자의 통합으로부터 제2 라운드의 조작 이후에 획득되었다: 아시네토박터 바우만니이 유래 히스티딘 디카르복실라제 유전자, 및 씨. 글루타미컴 유래 이미다졸글리세롤-포스페이트 디히드라타제의 항상적 발현.
에스. 세레비지아에에서, 385 mg/L의 역가는 3개 유전자의 통합으로부터 제2 라운드의 조작에서 획득되었다: 크로모박테리움 sp. LK1 유래 히스티딘 디카르복실라제 유전자 (SEQ ID NO: 6), 아미노산 치환 N215K, L231F 및 T235A를 함유하는 씨. 글루타미컴 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO: 7), 및 에스. 세레비지아에 유래의 항상적으로 발현되는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (SEQ ID NO: 3).
표 2. 코리네박테리아 글루타미컴 및 사카로마이세스 세레비지아에 에서 제2 라운드의 유전자 조작 결과
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
사카로마이세스 세레비지아에에서 제3 라운드 유전자 조작 결과
히스타민 생산은 에스. 세레비지아에에서 계속 진행하였고, 우리는 유전자의 천연 조절을 피하기 위해서 강한 항상성 프로모터에 의해 발현되는 상류 경로 유전자의 추가 카피를 통합시키도록 플라스미드를 디자인하였다 (표 3). 활성으로서 초기에 동정된 효소와 유사한 서열을 갖는 추가 히스티딘 디카르복실라제를 시험하기 위해 확대 검색을 착수하였다 (표 3).
동시에 우리는 히스타민 생산을 더욱 개선시키기 위해서 천연 유전자 발현을 조절하고자 하였다. 우리의 조작 접근법은 제2 라운드로부터의 최고 에스. 세레비지아에 균주를 선택하고 천연 프로모터 대신에 강하거나 또는 약한 항상성 프로모터를 시험하는 것이었다. 프로모터 변화를 위한 유전자 표적은 히스티딘으로의 전구체 공급 흐름을 재지정하도록 선택되었다. 시험하려는 균주 디자인은 비천연 피드백 탈조절된 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 (zwf)를 발현시켜 펜토스 포스페이트 경로 흐름을 증가시키고 당 이소머라제 효소를 통한 "하위" 펜토스 포스페이트 경로 흐름을 감소시키기 위한 디자인을 포함한다.
필수적 (즉, 결실할 수 없음)으로 여겨지지만, 히스타민 생산을 위해 이용가능한 상위 해당작용 대사산물 풀을 증가시키는 것으로 기대되는 유전자의 하위 발현을 위한 프로모터 교체가 표적화되었다: 1) 하위 해당작용을 통한 흐름을 감소시키기 위한, 에놀라제 (Eno2), 2) C3/C2 노드를 통한 하위 흐름을 위한 피루베이트 디히드로게나제 (PDH, Lpd1), 및 3) 히스타민 물질대사 전구체 리보스-5-포스페이트 (Tal1)를 사용하는, 펜토스 포스페이트 경로 당 이소머라제. 에스. 세레비지아에서 프로모터-교환 ("proswap") 및 결실 ("녹아웃") 표적의 예시적인 목록은 다음을 포함한다:
Figure pct00012
프로모터는 Lee 등 [7]의 발현 데이터를 기반으로 선택되었다.
에스. 세레비지아에 대한 추가의 유전자 조작 결과는 표 3 및 도 10에 표시되어 있다. 표 3에 표시된 균주 디자인을 위한 부모 균주 (또한 기준 균주, ScHISMN_41)는 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID J6KM89) 및 아미노산 치환 N215K, L231F 및 T235A를 보유한 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID Q9Z472), 및 에스. 세레비지아에 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 함유하였다. 기준 균주는 131 mg/L의 히스타민 역가를 가졌다.
강한 항상성 프로모터로부터 하기 효소 각각을 발현한 균주에서 개선된 역가가 관찰되었다:
1. 펜토스 포스페이트 경로에서 당의 상호전환을 촉매하고, 히스티딘 생합성 경로의 초기 대사산물인, PPRP에 대한 전구체인 리보스-5-포스페이트를 생산하는, 트랜스케톨라제 (EC 2.2.1.1) (SEQ ID NO: 27).
2. 리보스-포스페이트 파이로포스포키나제 (EC 2.7.6.1) (SEQ ID NO: 28) (최고 역가: 실험 대조군 131 mg/L에 비해서 191 mg/L).
3. ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (EC 2.4.2.17) (SEQ ID NO: 3).
4. 3기능성 히스티디놀 디히드로게나제 (EC 1.1.1.23)/ 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제 (EC 3.5.4.19) / 포스포리보실-ATP 디포스파타제 (EC 3.6.1.31) (SEQ ID NO: 29).
5. 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.9) (SEQ ID NO: 14).
6. 5'ProFAR 이소머라제 (EC 5.3.1.16) (SEQ ID NO: 31).
7. 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제 (EC 4.3.1.B2) (SEQ ID NO: 21).
8. 아미노산 치환 I170V (SEQ ID NO: 32) 또는 I170T [8]를 보유하는 아미노산 치환을 보유한, 트리오스-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.1).
9. 아미노산 치환 A243T를 보유한, 글루코스-6-포스페이트 1-디히드로게나제 (EC 1.1.1.49) (SEQ ID NO: 26).
10. 다양한 히스티딘 디카르복실라제 (EC 4.1.1.22):
a. UniProt ID A0A089YPE5 (SEQ ID NO: 33)
b. UniProt ID A0A126S6G9 (SEQ ID NO: 34)
c. UniProt ID A0A0A1R6V3 (SEQ ID NO: 35)
d. UniProt ID A0A1W0CM88 (SEQ ID NO: 36)
e. UniProt ID P00862 (SEQ ID NO: 4)
f. UniProt ID A0A0K6GJ74 (SEQ ID NO: 37)
g. UniProt ID T0QL99 (SEQ ID NO: 38)
h. UniProt ID A0A1B8HLR1 (SEQ ID NO: 39)
표 3. 사카로마이세스 세레비지아에 에서 제3 라운드 유전자 조작 결과
구축 및 시험 균주 디자인:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
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Figure pct00017
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Figure pct00021
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Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
주: E1, E2, 및 E3 유전자는 Cg 및 Sc에 대해 변형된 코돈 용법에 따라 코돈-최적화되었음
실시예 2 - 히스타민 생산을 위한 숙주 평가
히스타민 생산은 또한 2종의 추가 숙주, 바실러스 서브틸리스 및 야로위아 리폴리티카에서도 시험되었는데, 이들은 최고-성능 코리네박테리움 글루타미컴 및 사카로마이세스 세레비지아에 균주 유래의 효소를 발현하도록 조작되었다.
숙주 평가 디자인은 1-3개 효소를 발현하도록 선택되었고, 각각의 디자인은 숙주 유기체 씨. 글루타미컴, 에스. 세레비지아에, 비. 서브틸리스, 및 와이. 리폴리티카를 기반으로 4종의 상이한 코돈 최적화에 대해 시험되었다. 시험된 코돈 최적화는 유전자 코돈 최적화에 대해 각 숙주에 대해서 표작성된 카즈사 코돈 용법 표를 기반으로 하였다 (www.kazusa.or.jp/codon/).
히스타민 생산은 와이. 리폴리티카 (도 6) 및 비. 서브틸리스 (도 7)에서 입증되었고 씨. 글루타미컴 (도 9) 및 에스. 세레비지아에 (도 8)에서 더욱 개선되었다.
와이. 리폴리티카 (도 6, 하기 표 4)에서, 최고 성능 균주는 505 mg/L의 히스타민을 생산하였고, DNA 서열이 와이. 리폴리티카에 대해 코돈-최적화된, 아시네토박터 바우만니이 균주 AB0057 유래의 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID B7I459), 및 DNA 서열이 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화된 에스. 세레비지아에 S288c 유래의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00498)를 발현하였다. DNA 서열이 비. 서브틸리스 및 에스. 세레비지아에에 대해 코돈 최적화된 동일한 2개 유전자를 또한 시험하였고 최종 균주는 히스타민 역가를 생산하지 않았다.
와이. 리폴리티카의 두번째 최고-성능 균주는 DNA 서열이 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화된, 아시네토박터 바우만니이 균주 AB0057 유래의 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID B7I459), 및 DNA가 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화된 살모넬라 티피뮤리움 LT2 유래의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00499)를 발현하였다. DNA 서열이 비. 서브틸리스에 대해 코돈 최적화 (0 역가 생산), 에스. 세레비지아에 대해 코돈 최적화 (33 마이크로그램 히스타민 생산), 그리고 에스. 세레비지아에 및 씨. 글루타미컴에 대한 조합된 코돈 표를 사용해 코돈-최적화 (97 mg/L 히스타민 생산)된 경우에서 이들 2개 유전자의 형태를 또한 시험하였다.
와이. 리폴리티카에서 세번째 최고-성능 균주는 258 mg/L의 히스타민을 생산하였고, DNA 서열이 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화된 크로모박테리움 sp. LK1 유래 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID A0A0J6KM89), 및 DNA 서열이 와이 리폴리티카에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 64)되고, 아미노산 치환 N215K, L231F, T235A (SEQ ID NO: 7)을 보유하는, 씨. 글루타미컴 ATCC 13032 유래의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID Q9Z472)를 발현하였다. DNA 서열이 에스. 세레비지아에 (SEQ ID NO: 65, 66) 또는 비. 서브틸리스 (SEQ ID NO: 67, 68)에 대해 코돈 최적화된 이들 2개 유전자의 형태가 또한 시험되었고, 이들 와이. 리폴리티카 균주는 각각 1.8 mg/L 및 0.3 mg/L를 생산하였다. 따라서, 유전자의 코돈 최적화는 와이. 리폴리티카에서의 발현에 영향을 미친다.
비. 서브틸리스 (도 7, 하기 표 5)에서, 최고 성능 균주는 18 mg/L의 히스타민을 생산하였고, 락토바실러스 sp. (균주 30a) 유래 히스타민 디카르복실라제 (UniProt ID P00862)(SEQ ID NO: 4)와 살모넬라 티피뮤리움 LT2 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00499)(SEQ ID NO: 5)를 발현하였고 여기서 DNA 서열은 바실러스 서브틸리스에 대해 코돈 최적화되었다 (SEQ ID NO: 69, 59). DNA 서열이 에스 세레비지아에에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 70, 60)되거나 또는 씨. 글루타미컴 및 에스. 세레비지아에 대한 변형된 코돈 용법 표에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 71, 62)된, 동일한 2개 유전자가 또한 시험되었고, 이들 균주는 각각 6.7 mg/L 또는 0 mg/L의 히스타민을 생산하였다.
숙주 평가 디자인은 또한 에스. 세레비지아에 및 씨. 글루타미컴에서 시험되었다. 에스. 세레비지아에 (도 8, 하기 표 6)에서, 최고 성능 균주는 111 mg/L의 히스타민을 생산하였고 크로모박테리움 sp. LK1 유래 히스타민 디카르복실라제 (UniProt ID A0A0J6KM89)(SEQ ID NO: 51) 및 사카로마이세스 세레비지아에 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00498)(SEQ ID NO: 3)를 발현하였고, 여기서 DNA 서열은 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화되었다 (SEQ ID NO: 63, 53). DNA 서열이 에스. 세레비지아에 (SEQ ID NO: 65, 57) 및 비. 서브틸리스 (SEQ ID NO: 67, 55)에 대해 코돈 최적화된 동일한 2개 유전자가 또한 시험되었고 각각 86 mg/L 및 101 mg/L를 생산하였다.
씨. 글루타미컴 (도 9, 표 7)에서, 최고-성능 균주는 68 mg/L의 히스타민을 생산하였고 아시네토박터 바우만니이 (균주 AB0057) 유래 히스타민 디카르복실라제 (UniProt ID B7I459) (SEQ ID NO: 1)와 사카로마이세스 세레비지아에 S288c 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00498) (SEQ ID NO: 3)를 발현하였고 여기서 DNA 서열은 씨. 글루타미컴 및 에스. 세레비지아에 대한 변형된 코돈 용법 표를 사용해 코돈-최적화되었다 (SEQ ID NO: 72, 73). DNA 서열이 와이. 리폴리티카 (SEQ ID NO: 52, 53) 또는 에스. 세레비지아에 (SEQ ID NO: 56, 57)에 대해 코돈 최적화된 동일한 2개 유전자가 또한 시험되었고, 이들 균주는 각각 16 mg/L 및 18 마이크로그램/L의 히스타민을 생산하였다.
씨. 글루타미컴에서 두번째 최고-성능 균주는 15 mg/L의 히스타민을 생산하였고 또한 DNA 서열이 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 52)된, 아시네토박터 바우만니이 균주 AB0057 유래 히스티딘 디카르복실라제 (UniProt ID B7I459) (SEQ ID NO: 1), 및 DNA 서열이 와이. 리폴리티카에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 58)된, 살모넬라 티피뮤리움 LT2 유래 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (UniProt ID P00499) (SEQ ID NO: 5)를 발현하였다. 이들 동일한 2개 유전자가 또한 시험되었는데, 여기서 DNA 서열은 비. 서브틸리스에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 54, 59) (8 mg/L 히스타민 생산)되거나 또는 에스. 세레비지아에에 대해 코돈 최적화 (SEQ ID NO: 56, 60)(9.3 mg/L 히스타민 생산)되었다.
최고 성능 균주는 숙주 와이. 리폴리티카이므로, 추가 균주 개선은 이 숙주 유기체에서 계속할 수 있다. 와이. 리폴리티카에서 히스타민 생산을 더욱 증강시킬 수 있는 디자인은 다음을 포함한다:
1. 펜토스 포스페이트 경로에서 당의 상호전환을 촉매하고, 히스티딘 생합성 경로의 초기 대사산물인, PPRP에 대한 전구체인 리보스-5-포스페이트를 생산하는, 트랜스케톨라제 (EC 2.2.1.1) (SEQ ID NO: 27).
2. 리보스-포스페이트 파이로포스포키나제 (EC 2.7.6.1) (SEQ ID NO: 28).
3. ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 (EC 2.4.2.17) (SEQ ID NO: 5).
4. 3기능성 히스티디놀 디히드로게나제 (EC 1.1.1.23)/ 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제 (EC 3.5.4.19) / 포스포리보실-ATP 디포스파타제 (EC 3.6.1.31) (SEQ ID NO: 20).
5. 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.9) (SEQ ID NO: 14).
6. 5'ProFAR 이소머라제 (EC 5.3.1.16) (SEQ ID NO: 31).
7. 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제 (EC 4.3.1.B2) (SEQ ID NO: 21).
8. 아미노산 치환 I170V (SEQ ID NO: 32)를 보유하는 트리오스-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.1).
9. 아미노산 치환 A243T (SEQ ID NO: 26)를 보유하는 글루코스-6-포스페이트 1-디히드로게나제 (EC 1.1.1.49).
10. 다양한 히스티딘 디카르복실라제:
a. UniProt ID A0A089YPE5 (SEQ ID NO: 33)
b. UniProt ID A0A126S6G9 (SEQ ID NO: 34)
c. UniProt ID A0A0A1R6V3 (SEQ ID NO: 35)
d. UniProt ID A0A1W0CM88 (SEQ ID NO: 36)
e. UniProt ID P00862 (SEQ ID NO: 4)
f. UniProt ID A0A0K6GJ74 (SEQ ID NO: 37)
g. UniProt ID T0QL99 (SEQ ID NO: 38)
h. UniProt ID A0A1B8HLR1 (SEQ ID NO: 39)
실시예 3 - 히스타민을 생산하도록 조작된 야로위아 리폴리티카에서 히스타민 생산의 개선
유전자 조작의 3회 개선 라운드가 야로위아 리폴리티카에서 수행되었다.
야로위아 리폴리티카에서 제1-개선 라운드 유전자 조작
전략 : 2종 효소의 과발현을 통한 히스티딘 및 그 후 히스타민으로의 흐름을 개선한다.
Figure pct00027
요약 : ATP 포스포리보실트랜스퍼라제는 히스티딘 생합성 경로의 최초 수행 단계를 촉매한다. 이 효소는 히스티딘에 의해 알로스테릭하게 피드백-억제되고 AMP 및 ADP에 의해 경쟁적으로 억제된다. 결과는 P00498의 활성 및/또는 억제를 의미하지 않았다.
야로위아 리폴리티카에서 제2 개선 라운드 유전자 조작
전략 : 한 효소의 과발현. 히스타민 생합성의 최종 단계는 단백질 폴딩을 개선시키기 위해 가용성 태그를 포함하도록 변형된 최고 제1 라운드 히스티딘 디카르복실라제를 이용하여 증강되었다.
Figure pct00028
요약 : 제2 라운드의 유전자 조작에 사용된 히스티딘 디카르복실라제는 제1 라운드의 경우에서와 동일하였지만, 코돈 최적화는 상이하였다. 더 나아가서, N-말단 가용성 태그 (MQYKLALNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVT, SEQ ID NO:142)가 제2 라운드 효소에 포함되었다.
야로위아 리폴리티카에서 제3 개선 라운드 유전자 조작
전략 : 포스포리보실 파이로포스페이트 (PRPP)로의 흐름을 개선시키기 위해 히스티딘 생합성의 상류 경로에서 2개 효소의 과발현.
Figure pct00029
요약: 리보스-포스페이트 파이로포스포키나제는 ADP에 의해 경쟁적으로 억제된다. 효소 상의 ATP 결합 부위에서 L135I 돌연변이는 ADP 억제를 완화시킨다. 이러한 균주는 히스타민을 1.68 g/배양 배지의 L의 역가로 발현하였다.
표 4. 야로위아 리폴리티카 에서 히스타민 생산을 위한 제1 라운드 결과
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
표 5. 바실러스 서브틸리스 에서 히스타민의 생산을 위한 제1 라운드 결과
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
표 6. 사카로마이세스 세레비지아에 에서 시험된 히스타민의 생산을 위한 숙주 평가 디자인
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
표 7 . 코리네박테리움 글루타미컴 에서 시험된 히스타민의 생산을 위한 숙주 평가 디자인
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
표 8. SEQ ID NO 교차 참조 표
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
참조문헌
Figure pct00065
SEQUENCE LISTING <110> Zymergen Inc. <120> ENGINEERED BIOSYNTHETIC PATHWAYS FOR PRODUCTION OF HISTAMINE BY FERMENTATION <130> ZMGNP011PWO <150> US 62/660,875 <151> 2018-04-20 <160> 143 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 383 <212> PRT <213> Acinetobacter baumannii (strain AB0057) <400> 1 Met Ile Leu Ser Pro Ala Asp Gln Glu Arg Ile Glu Thr Phe Trp Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Lys His Gln Tyr Phe Asn Ile Gly Tyr Pro Glu Ser Ala 20 25 30 Asp Phe Asp Tyr Ser Ala Leu Phe Arg Phe Phe Lys Phe Ser Ile Asn 35 40 45 Asn Cys Gly Asp Trp Lys Asp Tyr Ser Asn Tyr Ala Leu Asn Ser Phe 50 55 60 Asp Phe Glu Lys Asp Val Met Ala Tyr Phe Ala Glu Ile Phe Gln Ile 65 70 75 80 Pro Phe Glu Glu Ser Trp Gly Tyr Val Thr Asn Gly Gly Thr Glu Gly 85 90 95 Asn Met Phe Gly Cys Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Phe Ser Asp Ser Thr 100 105 110 Leu Tyr Tyr Ser Lys Asp Thr His Tyr Ser Val Gly Lys Ile Ala Lys 115 120 125 Leu Leu Gln Met Lys Ser Cys Val Ile Glu Ser Leu Asp Asn Gly Glu 130 135 140 Ile Asp Tyr Asp Asp Leu Ile His Lys Ile Lys Thr Asn Lys Glu Ser 145 150 155 160 His Pro Ile Ile Phe Ala Asn Ile Gly Thr Thr Met Thr Gly Ala Ile 165 170 175 Asp Asp Ile Glu Met Ile Gln Glu Arg Leu Ala Gln Ile Gly Ile Met 180 185 190 Arg Arg Asp Tyr Tyr Ile His Ala Asp Ala Ala Leu Ser Gly Met Ile 195 200 205 Leu Pro Phe Val Asp His Pro Gln Ala Phe Ser Phe Ala His Gly Ile 210 215 220 Asp Ser Ile Cys Val Ser Gly His Lys Met Ile Gly Ser Pro Ile Pro 225 230 235 240 Cys Gly Ile Val Val Ala Lys Arg Gln Asn Val Glu Arg Ile Ser Val 245 250 255 Asp Val Asp Tyr Ile Ser Thr Arg Asp Gln Thr Ile Ser Gly Ser Arg 260 265 270 Asn Gly His Thr Val Leu Leu Met Trp Ala Ala Ile Arg Ser Gln Thr 275 280 285 Asn Leu Gln Arg Arg Gln Arg Ile Gln His Cys Leu Lys Met Ala Gln 290 295 300 Tyr Ala Val Asp Arg Phe Gln Ala Val Gly Ile Pro Ala Trp Arg Asn 305 310 315 320 Pro Asn Ser Ile Thr Val Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu His Ile Trp 325 330 335 Lys Lys His Tyr Leu Ala Thr Ser Gly Asn Met Ala His Leu Ile Thr 340 345 350 Thr Ala His His Arg Asp Thr Arg Gln Ile Asp Ser Leu Ile Asp Asp 355 360 365 Val Ile Phe Asp Leu Gln Gly Ala Ser Lys Arg Thr Val Gly Phe 370 375 380 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Codon-optimized and/or mutated sequence <400> 2 Met Thr Val Ala Pro Arg Ile Gly Thr Ala Thr Arg Thr Thr Ser Glu 1 5 10 15 Ser Asp Ile Thr Val Glu Ile Asn Leu Asp Gly Thr Gly Lys Val Asp 20 25 30 Ile Asp Thr Gly Leu Pro Phe Phe Asp His Met Leu Thr Ala Phe Gly 35 40 45 Val His Gly Ser Phe Asp Leu Lys Val His Ala Lys Gly Asp Ile Glu 50 55 60 Ile Asp Ala His His Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile Val Leu Gly Gln 65 70 75 80 Ala Leu Leu Asp Ala Ile Gly Asp Lys Lys Gly Ile Arg Arg Phe Ala 85 90 95 Ser Cys Gln Leu Pro Met Asp Glu Ala Leu Val Glu Ser Val Val Asp 100 105 110 Ile Ser Gly Arg Pro Tyr Phe Val Ile Ser Gly Glu Pro Asp His Met 115 120 125 Ile Thr Ser Val Ile Gly Gly His Tyr Ala Thr Val Ile Asn Glu His 130 135 140 Phe Phe Glu Thr Leu Ala Leu Asn Ser Arg Ile Thr Leu His Val Ile 145 150 155 160 Cys His Tyr Gly Arg Asp Pro His His Ile Thr Glu Ala Glu Tyr Lys 165 170 175 Ala Val Ala Arg Ala Leu Arg Gly Ala Val Glu Met Asp Pro Arg Gln 180 185 190 Thr Gly Ile Pro Ser Thr Lys Gly Ala Leu 195 200 <210> 3 <211> 297 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Asp Leu Val Asn His Leu Thr Asp Arg Leu Leu Phe Ala Ile Pro 1 5 10 15 Lys Lys Gly Arg Leu Tyr Ser Lys Ser Val Ser Ile Leu Asn Gly Ala 20 25 30 Asp Ile Thr Phe His Arg Ser Gln Arg Leu Asp Ile Ala Leu Ser Thr 35 40 45 Ser Leu Pro Val Ala Leu Ile Phe Leu Pro Ala Ala Asp Ile Pro Thr 50 55 60 Phe Val Gly Glu Gly Lys Cys Asp Leu Gly Ile Thr Gly Val Asp Gln 65 70 75 80 Val Arg Glu Ser Asp Val Asp Val Asp Leu Ala Ile Asp Leu Gln Phe 85 90 95 Gly Asn Cys Lys Leu Gln Val Gln Val Pro Val Asn Gly Glu Tyr Lys 100 105 110 Lys Pro Glu Gln Leu Ile Gly Lys Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Lys 115 120 125 Leu Ala Glu Lys Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Gly Thr Thr Val Glu Lys 130 135 140 Met Thr Thr Arg Ile Lys Phe Val Ser Gly Ser Val Glu Ala Ser Cys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Ile Gly Asp Ala Ile Val Asp Leu Val Glu Ser Gly Glu 165 170 175 Thr Met Arg Ala Ala Gly Leu Val Asp Ile Ala Thr Val Leu Ser Thr 180 185 190 Ser Ala Tyr Leu Ile Glu Ser Lys Asn Pro Lys Ser Asp Lys Ser Leu 195 200 205 Ile Ala Thr Ile Lys Ser Arg Ile Glu Gly Val Met Thr Ala Gln Arg 210 215 220 Phe Val Ser Cys Ile Tyr Asn Ala Pro Glu Asp Lys Leu Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Lys Val Thr Pro Gly Arg Arg Ala Pro Thr Ile Ser Lys Ile Asp 245 250 255 Asp Glu Gly Trp Val Ala Val Ser Ser Met Ile Glu Arg Lys Thr Lys 260 265 270 Gly Val Val Leu Asp Glu Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser Asp Ile Met 275 280 285 Val Phe Glu Ile Ser Asn Cys Arg Val 290 295 <210> 4 <211> 311 <212> PRT <213> Lactobacillus sp. (strain 30a) <400> 4 Met Ser Glu Leu Asp Ala Lys Leu Asn Lys Leu Gly Val Asp Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ile Ser Pro Tyr Lys Gln Trp Thr Arg Gly Tyr Met Glu Pro Gly 20 25 30 Asn Ile Gly Asn Gly Tyr Val Thr Gly Leu Lys Val Asp Ala Gly Val 35 40 45 Arg Asp Lys Ser Asp Asp Asp Val Leu Asp Gly Ile Val Ser Tyr Asp 50 55 60 Arg Ala Glu Thr Lys Asn Ala Tyr Ile Gly Gln Ile Asn Met Thr Thr 65 70 75 80 Ala Ser Ser Phe Thr Gly Val Gln Gly Arg Val Ile Gly Tyr Asp Ile 85 90 95 Leu Arg Ser Pro Glu Val Asp Lys Ala Lys Pro Leu Phe Thr Glu Thr 100 105 110 Gln Trp Asp Gly Ser Glu Leu Pro Ile Tyr Asp Ala Lys Pro Leu Gln 115 120 125 Asp Ala Leu Val Glu Tyr Phe Gly Thr Glu Gln Asp Arg Arg His Tyr 130 135 140 Pro Ala Pro Gly Ser Phe Ile Val Cys Ala Asn Lys Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Glu Arg Pro Lys Asn Asp Ala Asp Met Lys Pro Gly Gln Gly Tyr Gly 165 170 175 Val Trp Ser Ala Ile Ala Ile Ser Phe Ala Lys Asp Pro Thr Lys Asp 180 185 190 Ser Ser Met Phe Val Glu Asp Ala Gly Val Trp Glu Thr Pro Asn Glu 195 200 205 Asp Glu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Gly Arg Arg Lys Ala Met Ala Lys 210 215 220 Ser Ile Ala Glu Cys Gly Gln Asp Ala His Ala Ser Phe Glu Ser Ser 225 230 235 240 Trp Ile Gly Phe Ala Tyr Thr Met Met Glu Pro Gly Gln Ile Gly Asn 245 250 255 Ala Ile Thr Val Ala Pro Tyr Val Ser Leu Pro Ile Asp Ser Ile Pro 260 265 270 Gly Gly Ser Ile Leu Thr Pro Asp Lys Asp Met Glu Ile Met Glu Asn 275 280 285 Leu Thr Met Pro Glu Trp Leu Glu Lys Met Gly Tyr Lys Ser Leu Ser 290 295 300 Ala Asn Asn Ala Leu Lys Tyr 305 310 <210> 5 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Codon-optimized and/or mutated sequence <400> 5 Met Leu Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Ile Gln Lys Ser Gly Arg 1 5 10 15 Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile 20 25 30 Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile 35 40 45 Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp 50 55 60 Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Leu Thr Leu 85 90 95 Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val 100 105 110 Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Asp Gly Lys Arg Ile Ala 115 120 125 Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Val 130 135 140 Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg 145 150 155 160 Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr 165 170 175 Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys 180 185 190 Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Ala Gln Ser Lys Leu Ile 195 200 205 Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Ser Glu Arg Leu Glu Glu Val Ile 225 230 235 240 Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu Ala Gly 245 250 255 Glu Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr Leu Phe 260 265 270 Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser Ile Leu 275 280 285 Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu 290 295 <210> 6 <211> 387 <212> PRT <213> Chromobacterium sp. LK1 <400> 6 Met Ser Leu Ser Pro Leu Asp Gln Asn Arg Ile Glu Ser Phe Trp Gln 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Gln His Gln Tyr Phe Asn Leu Ala Tyr Pro Glu Ser Ala 20 25 30 Asp Phe Asp Tyr Ala Pro Leu His Arg Phe Leu Arg Phe Ser Ile Asn 35 40 45 Asn Cys Gly Asp Trp Asn Glu Ser Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Ser Phe 50 55 60 Asp Phe Glu Arg Glu Val Met His Phe Phe Ala Glu Leu Phe His Ile 65 70 75 80 Pro Phe Asp Glu Ser Trp Gly Tyr Val Thr Asn Gly Gly Thr Glu Gly 85 90 95 Asn Met Phe Gly Cys Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Phe Pro Asp Ala Thr 100 105 110 Leu Tyr Tyr Ser Lys Asp Ser His Tyr Ser Val Ala Lys Ile Ile Lys 115 120 125 Leu Leu Arg Ile Lys Ser Arg Ala Val Asp Ser Leu Pro Ser Gly Glu 130 135 140 Ile Asp Tyr Asp Asp Leu Val Ala Lys Ile Gln Gln Asp Gln Glu Arg 145 150 155 160 His Pro Ile Val Phe Val Asn Val Gly Thr Thr Met Lys Gly Ala Val 165 170 175 Asp Asp Ile Gly Val Ile Gln His Lys Leu Ala Glu Ala Gly Ile Pro 180 185 190 Arg Gln Asp Tyr Tyr Leu His Ala Asp Ala Ala Leu Ser Gly Met Ile 195 200 205 Leu Pro Phe Val Asp Ala Pro Gln Pro Tyr Ser Phe Ala Asp Gly Ile 210 215 220 Asp Ser Ile Ser Val Ser Gly His Lys Met Ile Gly Ser Pro Met Pro 225 230 235 240 Cys Gly Ile Val Leu Ala Lys Arg Ser Asn Val Ser Arg Ile Ser Val 245 250 255 Glu Ile Asp Tyr Ile Ser Ala Lys Asp Gln Thr Ile Ser Gly Ser Arg 260 265 270 Asn Gly His Thr Pro Met Met Leu Trp Ala Ala Ile Lys Ser Arg Pro 275 280 285 Leu Ala Glu Trp Arg Arg Lys Val Arg His Cys Leu Asp Met Ala Gln 290 295 300 Tyr Ala Ile Asp Arg Leu Gln Ala Ala Gly Ile Gln Ala Trp Arg Cys 305 310 315 320 Lys Asn Ser Ile Thr Val Val Phe Pro Ser Pro Ser Glu Pro Val Cys 325 330 335 Asp Lys His Gly Leu Ala Arg Ser Gly Gly Thr Ala His Leu Ile Thr 340 345 350 Thr Pro His His His Asp Ser Gln Arg Leu Asp Arg Leu Leu Asp Asp 355 360 365 Ile Val Gln Asp Leu Gly Ala Met Thr Ala Pro Ala Gly Ala Thr Met 370 375 380 Ser Ala Ala 385 <210> 7 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Codon-optimized and/or mutated sequence <400> 7 Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys 20 25 30 Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu 35 40 45 Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His 65 70 75 80 Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala 85 90 95 Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile 100 105 110 Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly 115 120 125 Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile 130 135 140 Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr 165 170 175 Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu 180 185 190 Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn 195 200 205 Phe Leu Met Leu Asp Tyr Lys Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala 210 215 220 Thr Ala Val Thr Pro Gly Phe Ser Gly Pro Ala Val Ser Pro Leu Ala 225 230 235 240 Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala 245 250 255 Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu 260 265 270 Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile 275 280 <210> 8 <211> 334 <212> PRT <213> Methanosarcina barkeri str. Wiesmoor <400> 8 Met Gln Lys Tyr Glu Tyr Asp Pro Lys Trp Val Ile Asn Asn Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ser Glu Arg Glu Phe Cys Thr Gly Tyr Gln Asn Pro Gly Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gly Tyr Val Thr Thr Ile Lys Leu Ser Thr Gly Leu Val Asp 35 40 45 Ile Thr Pro Trp Glu Lys Val Gln Ala Met Ser Glu His Glu Val Ile 50 55 60 Lys Phe Asp Arg Gly Cys Ser Asn Ile Val Ser Tyr Asp Arg Cys Glu 65 70 75 80 Cys Asn Asp Ala Tyr Ile Gly Ala Ile Asn Met Leu Thr Ala Ser Ser 85 90 95 Phe Ser Gly Leu Gln Gly Val Ile Trp Gly Tyr Asp Ile Ala Val Val 100 105 110 Glu Asn Leu Arg Ser Arg Lys Leu Tyr Asp Gln Lys Trp Pro Ser Gly 115 120 125 Asp Pro Asn Ser Glu Tyr Ser Thr Pro Val Tyr Ser Ile Glu Pro Leu 130 135 140 Leu Asn Ala Thr Glu Arg Leu Phe Gly His Ala Glu Pro Gly Lys Arg 145 150 155 160 Arg Phe Asn Pro Ile Pro Gly Ser Met Val Val Cys Ala Asn Lys Ser 165 170 175 Ala Thr Ser Asp Pro Ser Ser Asp Val Lys Glu Gly Trp Ala Phe Ser 180 185 190 Val Ile Ser Leu Ala Ile Leu Glu Asn Arg Asn Ser Gly Ser Asn Leu 195 200 205 Phe Ile Glu Asp Cys Asp Ile Ile Asp Ile Asn Asn Pro Asp Gly Thr 210 215 220 Arg Lys Thr Lys Glu Asp Val Lys Ala Met Leu Asp Thr Thr Leu Arg 225 230 235 240 Lys Val Thr Glu Cys Thr Val Leu Cys Gly Leu Asp Gln His Ile Lys 245 250 255 Tyr Lys Glu Ile Phe Ile Gly Tyr Lys Val Ile Lys Phe Asn Glu Lys 260 265 270 Gln Val Gly Cys Ala Leu Ala Cys Ala Pro Tyr Val Thr Leu Ala Arg 275 280 285 Asn Ala Val Pro Gln Gly Met Lys Pro Ser Lys Leu Thr Asp Met Asn 290 295 300 Ile Ser Gln Trp Glu Asn Ala Leu Asn Leu Gln Pro Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Glu Lys Ser Lys Ile Gly Ile Leu Gly Met Gly Val Leu Asp 325 330 <210> 9 <211> 349 <212> PRT <213> Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) <400> 9 Met Thr Leu His Ser Arg Tyr Ser Lys Leu Lys Gly Glu Asn Lys Met 1 5 10 15 Gln Lys Tyr Glu Tyr Asp Pro Lys Trp Val Ile Asn Asn Ala Ile Ser 20 25 30 Ser Glu Arg Glu Phe Cys Thr Gly Tyr Gln Asn Pro Gly Ala Ser Gly 35 40 45 Asn Gly Tyr Val Thr Thr Ile Lys Leu Ser Thr Gly Leu Val Asp Ile 50 55 60 Thr Pro Trp Glu Lys Val Gln Ala Met Ser Glu His Glu Val Ile Lys 65 70 75 80 Phe Asp Arg Gly Cys Ser Asn Ile Val Ser Tyr Asp Arg Cys Glu Cys 85 90 95 Asn Asp Ala Tyr Ile Gly Ala Ile Asn Met Leu Thr Ala Ser Ser Phe 100 105 110 Ser Gly Leu Gln Gly Val Ile Trp Gly Tyr Asp Ile Ala Val Val Glu 115 120 125 Asn Leu Arg Ser Arg Lys Leu Tyr Asp Gln Lys Trp Pro Ser Gly Asp 130 135 140 Pro Asn Ser Glu Tyr Ser Thr Pro Val Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Leu 145 150 155 160 Asn Ala Thr Glu Arg Leu Phe Gly His Ala Glu Pro Gly Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Asn Pro Ile Pro Gly Ser Met Val Val Cys Ala Asn Lys Ser Ala 180 185 190 Thr Ser Asp Pro Ser Ser Asp Val Lys Glu Gly Trp Ala Phe Ser Val 195 200 205 Ile Ser Leu Ala Ile Leu Glu Asn Arg Asn Ser Gly Ser Asn Leu Phe 210 215 220 Ile Glu Asp Cys Asp Ile Ile Asp Ile Asn Asn Pro Asp Gly Thr Arg 225 230 235 240 Lys Thr Lys Glu Asp Val Lys Ala Met Leu Asp Thr Thr Leu Arg Lys 245 250 255 Val Thr Glu Cys Thr Val Leu Cys Gly Leu Asp Gln His Ile Lys Tyr 260 265 270 Lys Glu Ile Phe Ile Gly 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120 125 Pro Asp Ala Phe Leu His Leu Ser Ser Gln Ser Gln Gly Gly Gly Val 130 135 140 Leu Gln Thr Thr Ala Ser Glu Ala Thr Leu Val Cys Leu Leu Ala Gly 145 150 155 160 Arg Thr Arg Ala Ile Gln Arg Phe His Glu Arg His Pro Gly Tyr Gln 165 170 175 Asp Ala Glu Ile Asn Ala Arg Leu Val Ala Tyr Cys Ser Asp Gln Ala 180 185 190 His Ser Ser Val Glu Lys Ala Ala Leu Ile Gly Leu Val Arg Met Arg 195 200 205 Tyr Ile Glu Ala Asp Asp Asp Leu Ala Met Arg Gly Lys Leu Leu Arg 210 215 220 Glu Ala Ile Glu Asp Asp Ile Lys Gln Gly Leu Val Pro Phe Trp Val 225 230 235 240 Cys Ala Thr Leu Gly Thr Thr Gly Ser Cys Ser Phe Asp Asn Leu Glu 245 250 255 Glu Ile Gly Ile Val Cys Ala Glu His His Leu Trp Leu His Val Asp 260 265 270 Ala Ala Tyr Ala Gly Ser Ala Phe Ile Cys Pro Glu Phe Arg Thr Trp 275 280 285 Leu Arg Gly Ile Glu Arg Ala Asp Ser Ile Ala Phe Asn Pro Ser Lys 290 295 300 Trp Leu Met Val His Phe Asp Ala Thr Ala Leu Trp Val Arg Asp Ser 305 310 315 320 Thr Ala Val His Arg Thr Phe Asn Val Glu Pro Leu Tyr Leu Gln His 325 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Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) <400> 22 Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys 20 25 30 Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu 35 40 45 Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His 65 70 75 80 Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala 85 90 95 Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile 100 105 110 Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly 115 120 125 Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile 130 135 140 Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr 165 170 175 Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu 180 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ttgtgtccat aaagaaatta agcaaggata tgttgaccaa agaagtgctt 420 ggtgaagtac gtacagaccg tcctgacggt ttatatacca ccctagttgt cgaccaatat 480 gagcgttgtc tagggttggt gtattcttcg aagaaatcta tagcaaaggc catcgatttg 540 ggtcgtggcg tttattattc tcgttctagg aatgaaatct ggatcaaggg tgaaacttct 600 ggcaatggcc aaaagctttt acaaatctct actgactgtg attcggatgc cttaaagttt 660 atcgttgaac aagaaaacgt tggattttgc cacttggaga ccatgtcttg ctttggtgaa 720 ttcaagcatg gtttggtggg gctagaatct ttactaaaac aaaggctaca ggacgctcca 780 gaggaatctt atactagaag actattcaac gactctgcat tgttagatgc caagatcaag 840 gaagaagctg aagaactgac tgaggcaaag ggtaagaagg agctttcttg ggaggctgcc 900 gatttgttct actttgcact ggccaaatta gtggccaacg atgtttcatt gaaggacgtc 960 gagaataatc tgaatatgaa gcatctgaag gttacaagac ggaaaggtga tgctaagcca 1020 aagtttgttg gacaaccaaa ggctgaagaa gaaaaactga ccggtccaat tcacttggac 1080 gtggtgaagg cttccgacaa agttggtgtg cagaaggctt tgagcagacc aatccaaaag 1140 acttctgaaa ttatgcattt agtcaatccg atcatcgaaa atgttagaga caaaggtaac 1200 tctgcccttt tggagtacac agaaaagttt gatggtgtaa aattatccaa tcctgttctt 1260 aatgctccat tcccagaaga atactttgaa ggtttaaccg aggaaatgaa ggaagctttg 1320 gacctttcaa ttgaaaacgt ccgcaaattc catgctgctc aattgccaac agagactctt 1380 gaagttgaaa cccaacctgg tgtcttgtgt tccagattcc ctcgtcctat tgaaaaagtt 1440 ggtttgtata tccctggtgg cactgccatt ttaccaagta ctgcattaat gcttggtgtt 1500 ccagcacaag ttgcccaatg taaggagatt gtgtttgcat ctccaccaag aaaatctgat 1560 ggtaaagttt cacccgaagt tgtttatgtc gcagaaaaag ttggcgcttc caagattgtt 1620 ctagctggtg gtgcccaagc cgttgctgct atggcttacg ggacagaaac tattcctaaa 1680 gtggataaga tcttgggtcc aggtaatcaa tttgtgactg ccgccaaaat gtatgttcaa 1740 aatgacactc aagctctatg ttccattgat atgccagctg gcccaagtga agttttggtt 1800 attgccgatg aagatgccga tgtggatttt gttgcaagtg atttgctatc gcaagctgaa 1860 cacggtattg actcccaagt tatccttgtt ggtgttaact tgagcgaaaa gaaaattcaa 1920 gagattcaag atgctgtcca caatcaagct ttacaactgc cacgtgtgga tattgttcgt 1980 aaatgtattg ctcacagtac gatcgttctt tgtgacggtt acgaagaagc ccttgaaatg 2040 tccaaccaat atgcaccaga acatttgatt ctacaaatcg ccaatgctaa cgattatgtt 2100 aaattggttg acaatgcagg gtccgtattt gtgggtgctt acactccaga atcgtgcggt 2160 gactattcaa gtggtactaa ccatacatta ccaacctatg gttacgctag gcagtacagt 2220 ggtgccaaca ctgcaacctt ccaaaagttt atcactgccc aaaacattac ccctgaaggt 2280 ttagaaaaca tcggtagagc tgttatgtgc gttgccaaga aggagggtct agacggtcac 2340 agaaacgctg tgaaaatcag aatgagtaag cttgggttga tcccaaagga tttccag 2397 <210> 30 <211> 843 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 30 atgttgaaaa tcgctgtccc aaacaagggc tcgctgtccg agcgcgccat ggaaatcctc 60 gccgaagcag gctacgcagg ccgtggagat tccaaatccc tcaacgtttt tgatgaagca 120 aacaacgttg aattcttctt ccttcgccct aaagatatcg ccatctacgt tgcaggtggc 180 cagctcgatt tgggtatcac cggccgcgac cttgctcgcg attcccaggc tgatgtccac 240 gaagttcttt ccctcggctt cggttcctcc accttccgtt acgcagcacc agctgatgaa 300 gagtggagca tcgaaaagct cgacggcaag cgcatcgcta cctcttaccc caaccttgtt 360 cgcgatgacc tcgcagcacg tgggctttcc gctgaggtgc tccgcctcga cggtgcagta 420 gaggtatcca tcaagcttgg tgtcgcagat gccatcgccg atgttgtatc caccggccgc 480 acgctgcgtc agcaaggtct tgcacctttc ggcgaggttc tgtgcacctc tgaggctgtc 540 attgttggcc gcaaggatga aaaggtcacc ccagagcagc agatcctgct tcgccgcatc 600 cagggaattt tgcacgcgca gaacttcctc atgctggatt acaacgtcga ccgcgacaac 660 ctggacgctg ccactgcagt aaccccaggc ctatccggcc caacggtatc cccactggca 720 cgcgacaact gggttgctgt acgcgccatg gtgccacgca ggtcagctaa cgccatcatg 780 gataagcttg ctggactcgg cgctgaagcc atcctggctt ctgaaatccg catcgcccgc 840 atc 843 <210> 31 <211> 261 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) (Baker's yeast) <400> 31 Met Thr Lys Phe Ile Gly Cys Ile Asp Leu His Asn Gly Glu Val Lys 1 5 10 15 Gln Ile Val Gly Gly Thr Leu Thr Ser Lys Lys Glu Asp Val Pro Lys 20 25 30 Thr Asn Phe Val Ser Gln His Pro Ser Ser Tyr Tyr Ala Lys Leu Tyr 35 40 45 Lys Asp Arg Asp Val Gln Gly Cys His Val Ile Lys Leu Gly Pro Asn 50 55 60 Asn Asp Asp Ala Ala Arg Glu Ala Leu Gln Glu Ser Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 Gln Val Gly Gly Gly Ile Asn Asp Thr Asn Cys Leu Glu 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<210> 37 <211> 311 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <400> 37 Met Ser Glu Leu Asp Thr Lys Leu His Lys Leu Gly Val Asp Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ile Ser Pro Tyr Lys Gln Trp Ser Arg Gly Tyr Met Glu Pro Gly 20 25 30 Asn Ile Gly Asn Gly Tyr Val Thr Gly Leu Lys Val Asp Ala Gly Val 35 40 45 Arg Asp Lys Thr Asp Asp Glu Val Leu Asp Gly Ile Val Ser Tyr Asp 50 55 60 Arg Ala Glu Thr Lys Asn Ala Tyr Ile Gly Gln Ile Asn Met Thr Thr 65 70 75 80 Ala Ser Ser Phe Thr Gly Pro Gln Gly His Cys Ile Gly Tyr Asp Leu 85 90 95 Leu Arg Asn Pro Glu Val Asp Thr Ala Glu Pro Leu Phe Thr Val Lys 100 105 110 Gln Trp Asp Gly Ser Glu Leu Pro Ile Tyr Asp Ala Lys Pro Leu Gln 115 120 125 Asp Ser Leu Val Glu Tyr Phe Gly Thr Asn Asn Asn Arg Arg His Tyr 130 135 140 Pro Ala Pro Gly Ser Phe Ile Val Cys Ala Asn Lys Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Glu Arg Pro Met Asn Asp Ser Asp Met Lys Pro Gly Gln Gly Tyr Gly 165 170 175 Val Trp Ser Ala Ile Ala Leu Ser Phe Ala Lys Asp Pro Ala Lys Asp 180 185 190 Ser Ser Met Phe Ile Glu Asp Ala 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(Baker's yeast) <400> 45 Met Pro Thr Asn Ser Ile Lys Leu Leu Ala Pro Asp Val His Arg Gly 1 5 10 15 Leu Ala Glu Leu Val Ala Lys Arg Leu Gly Leu Gln Leu Thr Ser Ser 20 25 30 Lys Leu Lys Arg Asp Pro Thr Gly Glu Val Ser Phe Ser Ile Gly Glu 35 40 45 Ser Val Arg Asp Gln Asp Ile Phe Ile Ile Thr Gln Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Val Val Asn Asp Arg Val Leu Glu Leu Leu Ile Met Ile Asn Ala Ser 65 70 75 80 Lys Thr Ala Ser Ala Arg Arg Ile Thr Ala Ile Ile Pro Asn Phe Pro 85 90 95 Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Asp Lys Ser Arg Ala Pro Ile Thr Ala 100 105 110 Lys Leu Met Ala Asp Met Leu Thr Thr Ala Gly Cys Asp His Val Ile 115 120 125 Thr Met Asp Leu His Ala Ser Gln Ile Gln Gly Phe Phe Asp Val Pro 130 135 140 Val Asp Asn Leu Tyr Ala Glu Pro Ser Val Val Arg Tyr Ile Lys Glu 145 150 155 160 Asn Val Asn Tyr Met Asp Ser Ile Ile Ile Ser Pro Asp Ala Gly Gly 165 170 175 Ala Lys Arg Ala Ala Thr Leu Ala Asp Arg Leu Asp Leu Asn Phe Ala 180 185 190 Leu Ile His Lys Glu Arg Ala Arg Ala Asn Glu Val Ser Arg Met Val 195 200 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LK1 <400> 51 Met Ser Leu Ser Pro Leu Asp Gln Asn Arg Ile Glu Ser Phe Trp Gln 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Gln His Gln Tyr Phe Asn Leu Ala Tyr Pro Glu Ser Ala 20 25 30 Asp Phe Asp Tyr Ala Pro Leu His Arg Phe Leu Arg Phe Ser Ile Asn 35 40 45 Asn Cys Gly Asp Trp Asn Glu Ser Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Ser Phe 50 55 60 Asp Phe Glu Arg Glu Val Met His Phe Phe Ala Glu Leu Phe His Ile 65 70 75 80 Pro Phe Asp Glu Ser Trp Gly Tyr Val Thr Asn Gly Gly Thr Glu Gly 85 90 95 Asn Met Phe Gly Cys Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Phe Pro Asp Ala Thr 100 105 110 Leu Tyr Tyr Ser Lys Asp Ser His Tyr Ser Val Ala Lys Ile Ile Lys 115 120 125 Leu Leu Arg Ile Lys Ser Arg Ala Val Asp Ser Leu Pro Ser Gly Glu 130 135 140 Ile Asp Tyr Asp Asp Leu Val Ala Lys Ile Gln Gln Asp Gln Glu Arg 145 150 155 160 His Pro Ile Val Phe Val Asn Val Gly Thr Thr Met Lys Gly Ala Val 165 170 175 Asp Asp Ile Gly Val Ile Gln His Lys Leu Ala Glu Ala Gly Ile Pro 180 185 190 Arg Gln Asp Tyr Tyr Leu His Ala Asp Ala Ala Leu Ser Gly Met Ile 195 200 205 Leu Pro 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gcaaaattgc gaaattactt caaatgaaaa gttgtgtcat tgagagttta 420 gataacggcg aaatcgacta tgatgattta atacataaaa ttaaaacaaa taaagaatca 480 catccaatca tatttgcgaa tatcggaact acaatgacgg gagctattga cgacatcgag 540 atgatacaag agagattagc acaaattgga attatgcgcc gcgattacta tattcacgca 600 gacgcggcct tgtcagggat gatacttcct tttgttgatc acccgcaggc attttctttc 660 gcgcatggta tcgatagcat ctgtgtttca ggacataaaa tgattgggag cccgatccca 720 tgtggtattg tcgtagcgaa aagacagaat gtcgaaagaa taagcgttga tgtggattac 780 attagcacac gcgaccagac aattagcggc tcacgtaacg gacatacagt cctgttaatg 840 tgggctgcta ttagatccca aactaattta caaagaagac aacgcatcca acattgcctt 900 aaaatggcac agtacgcggt agacagattt caagctgttg gaattccggc gtggagaaac 960 ccgaattcaa ttactgtagt ctttccgtgc ccttcggaac atatttggaa gaagcattat 1020 ttagcgacga gcgggaacat ggcccatctt atcacgacgg ctcaccacag agatacacgt 1080 caaattgatt ctttgattga tgatgtaatt ttcgatctgc aaggagccag taagagaacc 1140 gtgggattt 1149 <210> 55 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Codon-optimized and/or 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taatggcgag tataagaagc cggaacagtt aataggaaaa 360 acaatagtta cctcttttgt gaagttagct gaaaaatact ttgccgactt agaaggtacg 420 actgtggaaa aaatgacaac aagaattaag tttgttagtg gttctgtcga agcatcctgc 480 gcactaggaa ttggtgatgc tattgtagac ttagtagaga gtggagaaac aatgagggcc 540 gcaggtttgg tagatattgc taccgtatta tcaacatccg catatcttat tgagtctaaa 600 aatcctaaat ccgacaaaag tttgatcgct actataaagt caaggattga gggtgtcatg 660 acagctcaga gatttgtatc atgcatctat aatgctcccg aagacaagct gcctgaatta 720 ctaaaggtaa caccgggaag aagggcacca actatcagca agattgatga tgaaggatgg 780 gtcgccgttt catcaatgat tgaaagaaag acaaaaggtg tggttcttga cgaacttaaa 840 cgtttgggag ccagtgatat catggtcttc gaaatttcta attgccgtgt g 891 <210> 58 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Codon-optimized and/or mutated sequence <400> 58 atgctggaca acacaagact gcgaattgcc atccagaagt ctggtagact cagcgatgat 60 tccagagagc ttctggcccg ttgtggcatt aaaatcaacc ttcatactca gcggctcatc 120 gccatggccg aaaacatgcc tatcgatatt cttagagtcc gagatgatga catccctgga 180 ctggtcatgg 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Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Asn Val Gly Val Gln 20 25 30 Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile 35 40 45 Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser 50 55 60 Thr Ser Ala Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val 65 70 75 80 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro 85 90 95 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro 100 105 110 Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr 115 120 125 Arg Val Ile Ala Leu Asp Ile His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe 130 135 140 Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly His Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Gly Lys Asp Leu Lys Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His 165 170 175 Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro 180 185 190 Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Glu Val Glu Val 195 200 205 Met Asn Ile Val Gly Asn Val Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp 210 215 220 Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu 225 230 235 240 Val Glu Asn Gly Ala Ala Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val 245 250 255 Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Lys Ile Lys Glu 260 265 270 Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu 275 280 285 Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile 290 295 300 Arg Val His Glu Lys Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser 305 310 315

Claims (15)

  1. 비천연 히스티딘 디카르복실라제를 발현하는 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 히스타민을 생산하는 것인 조작된 미생물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해 증가된 것인 조작된 미생물 세포.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실-ATP 파이로포스파타제, 포스포리보실-AMP 시클로히드롤라제, 5'ProFAR 이소머라제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 신타제, 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 포스파타제, 히스티디놀 디히드로게나제, 및 리보스 포스페이트 파이로포스포키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조작된 미생물 세포.
  4. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 히스타민 경로 전구체를 소비하는 하나 이상의 효소(들)의 감소된 활성을 포함하고, 상기 감소된 활성은 대조군 세포에 비해 감소된 것인 조작된 미생물 세포.
  5. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 피드백-탈조절된 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 또는 피드백-탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 추가로 발현하는 것인 조작된 미생물 세포.
  6. 조작된 미생물 세포로서, 조작된 미생물 세포는 비천연 히스티딘 디카르복실라제를 발현시키기 위한 수단을 포함하고, 조작된 미생물 세포는 히스타민을 생산하는 것인 조작된 미생물 세포.
  7. 제6항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 또는 피드백-탈조절된 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 발현시키기 위한 수단을 추가로 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  8. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 진균 세포를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  9. 제1항에 있어서, 비천연 히스티딘 디카르복실라제는 크로모박테리움 (Chromobacterium) sp. LK1 또는 아시네토박터 바우만니이 (Acinetobacter baumannii) 균주 AB0057 유래의 히스티딘 디카르복실라제와 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 히스티딘 디카르복실라제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  10. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 박테리아 세포인 조작된 미생물 세포.
  11. 제1항에 있어서, 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)의 증가된 활성을 포함하고, 상기 증가된 활성은 대조군 세포에 비해 증가된 것이고, 하나 이상의 상류 히스타민 경로 효소(들)는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 및 이미다졸-글리세롤 포스페이트 디히드라타제를 포함하는 것인 조작된 미생물 세포.
  12. 제1항에 따른 조작된 미생물 세포의 배양물.
  13. 제12항에 있어서, 배양물은 히스타민을 적어도 20 mg/배양 배지의 L의 수준으로 포함하는 것인 배양물.
  14. 제1항에 따른 조작된 미생물 세포를 배양하는 방법으로서, 방법은 히스타민을 생산하기에 적합한 조건 하에서 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 것인, 배양 방법.
  15. 히스타민을 생산하도록 조작된 미생물 세포를 사용하여 히스타민을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
    (a) 비천연 히스티딘 디카르복실라제를 미생물 세포에서 발현시키는 단계;
    (b) 미생물 세포가 히스타민을 생산할 수 있게 하는 조건 하에 적합한 배양 배지에서 미생물 세포를 배양하는 단계로서, 히스타민은 배양 배지로 방출되는 것인 단계; 및
    (c) 히스타민을 배양 배지로부터 단리하는 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
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