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CN103688176A - 利用cereblon作为预报因子治疗癌和炎性疾病的方法 - Google Patents

利用cereblon作为预报因子治疗癌和炎性疾病的方法 Download PDF

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Abstract

蛋白质cereblon作为癌症、炎性疾病以及患者对药物治疗的反应的临床灵敏性预报因子的应用。

Description

利用CEREBLON作为预报因子治疗癌和炎性疾病的方法
本发明申请主张2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61/481066，2011年7月26日提交的No.61/511986和2011年12月22日提交的No.61/579600的优先权；以上专利的全部内容作为参考并入本文。
1.技术领域
本文提供了蛋白质cereblon作为癌和炎性疾病以及患者对药物治疗的反应的临床灵敏性预报因子的使用。
2.背景技术
2.1癌症的病理学
癌症的主要特征为来自特定正常组织中的异常细胞数量上升，这些异常细胞入侵邻近组织，或将恶性细胞通过淋巴或血源传播至局部的淋巴结和远端位点（转移）。临床数据和分子生物学研究显示癌症是一个多步过程，它起始于微小的癌前变化，并可能在特定条件下发展至瘤形成。肿瘤性病变可克隆演化并发展出提高的入侵、生长、转移和异质性的能力，特别是在肿瘤性细胞脱离了宿主免疫监视的情况下。Roitt,I.,Brostoff,J和Kale,D.,Immunology,17.1-17.12（第3版，Mosby,St.Louis,Mo.,1993）。
癌症种类繁多，其具体信息可见于医学文献。例子包括肺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、血癌和肠癌。随着整体人群的老龄化，新型癌症的产生，以及易感人群（例如，感染AIDS的人或是过度暴露在阳光中的人）的增长，癌症的发病率持续攀升。然而，癌症治疗的选择是有限的。例如，就血癌（例如，多发性骨髓瘤）来说，可用的治疗选择较少，特别是当常规化疗失败并且骨髓移植不可选择时。因此，仍非常需要可以用于治疗癌症患者的新方法和组合物。
许多类型的癌症均与新血管的形成（一种称为血管生成的过程）有关。人们已经阐明了几种涉及肿瘤诱导血管生成的机制。其中最直接的机制是由肿瘤细胞分泌具有血管生成性质的细胞因子。这些细胞因子的例子包括酸性和碱性纤维原细胞生长因子（a，b-FGF）、血管生成素、血管内皮生长因子（VEGF）以及TNF-α。作为另外一种选择，肿瘤细胞可以通过蛋白酶生成以及储存某些细胞因子（例如，b-FGF）的胞外基质的后续分解释放血管生成肽。血管生成还可通过炎性细胞（特别是巨噬细胞）的募集及其后续释放血管生成细胞因子（例如，TNF-a，b-FGF）而被间接诱导。
淋巴瘤是指发生于淋巴系统中的癌症。淋巴瘤的特征在于淋巴细胞-B淋巴细胞和T淋巴细胞（即B细胞和T细胞）的恶性赘生物。淋巴瘤通常开始于淋巴结或器官中淋巴组织集中的地方，所述器官包括（但不限于）胃或肠。在一些情况下，淋巴瘤可以涉及骨髓和血液。淋巴瘤可以从一个位点扩展到身体的其他部分。
例如，在美国专利No.7468363中描述了多种形式的淋巴瘤的治疗，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。这些淋巴瘤包括（但不限于）霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤B-细胞淋巴瘤、激活的B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤（DLBCL）、外套细胞淋巴瘤（MCL）、滤泡中心型淋巴瘤、转化型淋巴瘤、中度分化的淋巴细胞性淋巴瘤、中间淋巴细胞性淋巴瘤（ILL）、弥散性低分化淋巴细胞性淋巴瘤（PDL）、中心细胞性淋巴瘤、弥漫性小核裂细胞淋巴瘤（DSCCL）、外周T细胞淋巴瘤（PTCL）、皮肤T-细胞淋巴瘤和外套层淋巴瘤和低级别滤泡性淋巴瘤。
非霍奇金淋巴瘤（NHL）是美国男性和女性中第五常见的癌症，在2007年预计新发病63190例，死亡18660例。Jemal A等人，CA Cancer J Clin2007;57(1):43-66。发生NHL的可能性随年龄增加，并且在过去十年中，NHL在老年人中的发病率稳步增加，从而导致对美国人口老龄化趋势的担忧。同上。Clarke C A等人,Cancer2002;94(7):2015-2023。
弥漫性大B-细胞淋巴瘤（DLBCL）约占非霍奇金淋巴瘤的三分之一。尽管使用常规化疗治愈了一些DLBCL患者，但其余患者死于该疾病。抗癌药导致淋巴细胞快速并且持续减少，这可能是通过成熟T和B细胞中直接细胞凋亡诱导所造成的。参见，K.Stahnke等人,Blood2001,98:3066-3073。绝对淋巴细胞计数（ALC）已表明是滤泡性非霍奇金淋巴瘤中的预后因素，并且近期的结果表明在诊断时ALC是弥漫性大B-细胞淋巴瘤的重要预后因素。
根据它们的基因谱图，可以将弥漫性大-B细胞淋巴瘤（DLBCL）分为不同的分子亚类：生发中心B细胞淋巴瘤（GCB-DLBCL）、活化B细胞淋巴瘤（ABC-DLBCL）和原发纵隔大B细胞淋巴瘤（PMBL）或未分类类型。这些亚类的特征在于存活、化学反应性和信号通路依赖性，特别是NF-ΚB通路中独特的差异。参见，D.Kim等人，Journal of Clinical Oncology,2007ASCO年度会议论文集，第I部分，第25卷，No.18S（6月20日增刊），2007:8082。参见Bea S等人，Blood2005;106:3183-90；Ngo V.N.等人，Nature2011;470:115-9。这些差异促使寻求DLBCL更有效并且亚类特异性的治疗策略。
白血病是指血液形成组织的恶性赘生物。例如，在美国专利No.7393862和2002年5月17日提交的美国临时专利申请No.60/380842中描述了多种形式的白血病，以上专利的全部内容作为参考并入本文。尽管据报道病毒在动物中造成了几种形式的白血病，但是人类中白血病的原因很大程度上仍是未知的。The Merck Manual,944-952（第17版，1999）。通常在单个细胞中通过两步或更多步以及后续增殖和克隆扩增发生了向恶性肿瘤的转化。在一些白血病中，已鉴别特定染色体易位具有稳定的白血病细胞形态和特定的临床特征（例如，慢性粒细胞性白血病中9和22的易位，以及急性早幼粒细胞白血病中15和17的易位）。急性白血病是主要未分化细胞群体和慢性白血病更成熟的细胞形式。
急性白血病分为成淋巴细胞型（ALL）和非成淋巴细胞型（ANLL）。The Merck Manual,946-949（第17版，1999）。还可以根据法国-美国-英国（FAB）分类通过它们的形态学或细胞化学形态或根据它们的类型和分化程度将它们再分类。特异性B细胞和T细胞以及骨髓-抗原单克隆抗体的使用对于分类来说是最有用的。ALL主要是儿童疾病，其通过化验所见和骨髓检查确诊。ANLL（也称为急性髓性白血病或急性骨髓性白血病（AML））在所有年龄发生并且是成年人中最常见的急性白血病；它是通常与辐射作为致病因素有关的形式。
慢性白血病被称为是淋巴细胞（CLL）或髓细胞（CML）的。The MerckManual,949-952（第17版，1999）。CLL的特征在于血液、骨髓和淋巴器官中成熟淋巴细胞的出现。CLL的标志是绝对淋巴细胞持续增多（>5000/μL）以及骨髓中淋巴细胞的提高。大部分CLL患者还具有B细胞特性的淋巴细胞的无性扩增。CLL是中年或老年疾病。在CML中，特征在于血液、骨髓、肝、脾及其他器官中所有分化阶段的粒细胞占优势。在诊断的具有症状的患者中，白细胞（WBC）总计数通常为约200000/μL，但可以达到1000000/μL。由于费城染色体的存在，CML是相对容易诊断的。
熟知骨髓基质细胞支持CLL疾病发展和对化学疗法的耐受性。CLL细胞和基质细胞之间相互作用的破坏是CLL化学疗法的另一个目标。
除了急性和慢性分类外，还基于导致该病症的细胞将赘生物分为前体或周围赘生物。参见，例如，美国专利公开No.2008/0051379，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。前体赘生物包括ALL和成淋巴细胞性淋巴瘤并且在它们分化为T细胞或B细胞前在淋巴细胞中发生。周围赘生物是在已分化为T细胞或B细胞的淋巴细胞中发生的那些。这些周围赘生物包括（但不限于）B细胞CLL、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、膜相关淋巴组织的结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤和非洲淋巴瘤。在95%以上的CLL病例中，无性扩增属于B细胞系。参见“癌症：肿瘤学原理和实践（Cancer:Principles&Practice of Oncology）”（第3版）（1989）（第1843-1847页）。在不到5%的CLL病例中，肿瘤细胞具有T细胞表型。尽管有这些分类，然而，正常造血作用的病理损伤是所有白血病的标志。
多发性骨髓瘤（MM）是骨髓中的浆细胞癌。通常，浆细胞产生抗体并在免疫功能中起关键作用。然而，这些细胞不受控制的生长导致骨痛和骨折、贫血、感染及其他并发症。多发性骨髓瘤是第二常见的血液恶性肿瘤，尽管造成多发性骨髓瘤的准确原因仍是未知的。多发性骨髓瘤导致血液、尿液和器官中高蛋白水平，其包括（但不限于）M-蛋白及其他免疫球蛋白（抗体）、白蛋白和β-2-微球蛋白。M-蛋白是单克隆蛋白的缩写（也称为副蛋白），它是骨髓瘤浆细胞所产生的特别异常的蛋白并且可以存在于几乎所有多发性骨髓瘤患者的血液和尿液中。
包括骨痛在内的骨骼症状是临床上最显著的多发性骨髓瘤症状。恶性浆细胞释放破骨细胞刺激因子（包括IL-1、IL-6和TNF），其导致钙从骨中析出，从而导致溶骨病变；血钙过多是另一种症状。破骨细胞刺激因子也称为细胞因子，它可以防止细胞凋亡或骨髓瘤细胞死亡。在诊断时，50%的患者具有放射性可检测的骨髓瘤相关骨骼病变。多发性骨髓瘤的其他常见临床症状包括多神经病、贫血、高血粘度、感染和肾功能不全。
熟知骨髓基质细胞支持多发性骨髓瘤疾病发展和对化学疗法的耐受性。多发性骨髓瘤细胞和基质细胞之间相互作用的破坏是多发性骨髓瘤化学疗法的另一个目标。
脊髓发育不良综合征（MDS）是指一组不同的造血干细胞病症。MDS的特征在于形态和成熟受损的细胞髓（脊髓发育不良）、周围血液血细胞减少症和发展为急性白血病的变化的风险（从而导致无效血细胞产生）。参见The Merck Manual953（第17版，1999）和List等人，1990,J Clin.Oncol.8:1424。在美国专利公开No.2004/0220144中描述了使用免疫调节化合物的MDS的治疗，该专利的全部内容作为参考并入本文。
实体瘤是异常组织块，它可以但通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性的（非癌症）或恶性的（癌症）。不同类型的实体瘤通过形成它们的细胞类型来命名。实体瘤类型的实例包括（但不限于）恶性黑色素瘤、肾上腺癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和未知的原发性癌。一般施用于患有多种类型或阶段的实体瘤的患者的药物包括（但不限于）celebrex、依托泊苷、环磷酰胺、多西他赛、apecitabine、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF或它们的组合。
尽管在初始疗法后实现完全缓解的患者具有良好的治愈机会，但是不起反应或复发的那些患者中有不到10%的患者实现了治愈或持续超过3年的反应。参见Cerny T等人，Ann Oncol2002;13Suppl4:211-216。
已知利妥昔单抗能够除去正常的宿主B细胞。参见，M.Aklilu等人，Annals of Oncology15:1109-1114,2004。尽管这种疗法广泛使用，但是使用利妥昔单抗的B细胞减少的长期免疫学作用以及在淋巴瘤患者中重新组成B细胞混合物的特征仍未明确定义。参见，Jennifer H.Anolik等人，ClinicalImmunology,第122卷，第2期，2007年2月，第139-145页。
用于患有复发性或难治性疾病的患者的方法主要依赖于实验治疗以及随后的干细胞移植，这可能不适合表现状态较差或老年患者。因此，仍非常需要可以用于治疗NHL患者的新方法。
已经明确确定了癌症和改变的细胞代谢之间的联系。参见，Cairns,R.A.等人，Nature Rev.,2011,11:85-95。对肿瘤细胞代谢及其相关遗传变化的了解可以导致鉴别改善的癌症治疗方法。同上。例如，已经将通过提高的葡萄糖代谢的肿瘤细胞存活和增殖与PIK3途径相联系，借此肿瘤抑制基因（如PTEN）中的突变激活肿瘤细胞代谢。同上。AKT1（也称为PΚB）通过与PFKFB3、ENTPD5、mTOR和TSC2（也称为马铃薯球蛋白）之间的多种相互作用来刺激与肿瘤细胞生长有关的葡萄糖代谢。同上。
转录因子HIF1和HIF2主要负责细胞对通常与肿瘤有关的低氧条件的反应。同上。一旦激活，HIF1促进肿瘤细胞进行糖酵解的能力。同上。因此，HIF1的抑制可以减缓或逆转肿瘤细胞代谢。HIF1的激活已与PI3K、肿瘤抑制蛋白质（如VHL）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和延胡索酸水化酶相联系。同上。致癌转录因子MYC也与肿瘤细胞代谢，具体地糖酵解相联系。同上。MYC还通过谷氨酰胺代谢途径促进细胞增殖。同上。
AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）起代谢检查点的作用，为了增殖肿瘤细胞必须克服该代谢检查点同上。已鉴别了几种抑制肿瘤细胞中AMPK信号的突变。参见，Shackelford,D.B.&Shaw,R.J.,Nature Rev.Cancer,2009,9:563-575。已将STK11鉴别为与AMPK作用有关的肿瘤抑制基因。参见，Cairns,R.A.等人，Nature Rev.,2011,11:85-95。
作为肿瘤抑制剂的转录因子p53在细胞代谢调控中还具有重要作用。同上。肿瘤细胞中p53的丧失可以是肿瘤细胞代谢中向糖酵解途径改变的重要原因。同上。作为化疗的另一个可能目标的OCT1转录因子可以在调节肿瘤细胞代谢中与p53配合。同上。
丙酮酸激酶M2（PKM2）促进细胞代谢改变，这通过支持细胞增殖赋予癌细胞代谢优势。同上。例如，已发现表达PKM2超过PKM1的肺癌细胞具有这种优势。同上。临床上，已在多种癌症类型中将PKM2鉴别为过表达。同上。因此，PKM2可以是肿瘤早期检测的有用的生物标志物。
具体地，在成胶质细胞瘤和急性髓细胞性白血病中，已将异柠檬酸脱氢酶IDH1和IDH2中的突变与肿瘤发生相联系。参见，Mardis,E.R.等人，N.Engl.J.Med.,2009,361:1058-1066；Parsons,D.W.等人，Science,2008,321:1807-1812。
随着整体人群的老龄化，新型癌症的产生，以及易感人群（例如，感染AIDS的人、老年人或是过度暴露在阳光中的人）的增长，癌症的发病率持续攀升。因此，仍非常需要可以用于治疗癌症患者的新方法、治疗和组合物，所述癌症患者包括（但不限于）那些淋巴瘤、NHL、多发性骨髓瘤、AML、白血病和实体瘤患者。
多种其他疾病和病症还与不希望的血管生成有关或以不希望的血管生成为特征。例如，增加或不受调控的血管生成与多种疾病和医学病况有关，其包括（但不限于）眼部新血管疾病、脉络膜新血管疾病、视网膜新血管疾病、潮红（角的新生血管形成）、病毒性疾病、遗传性疾病、炎症疾病、过敏性疾病、纤维化、关节炎和自身免疫性疾病。这些疾病和病况的实例包括（但不限于）：糖尿病性视网膜病；早产儿视网膜病变；角膜移植排斥；新生血管型青光眼；晶状体后纤维组织形成和增殖性玻璃体视网膜病变。
因此，可以控制和/或抑制不希望的血管生成或抑制某些细胞因子（包括TNF-α）产生的化合物可用于治疗和预防多种疾病和病况。
2.2炎性疾病
炎症在宿主防御和免疫介导性疾病的发展中起基础作用。通过复杂的事件（包括化学介质（例如，细胞因子和前列腺素）和炎性细胞（例如，白血球））级联，对损伤（例如，创伤、缺血和外来颗粒）和感染（例如，细菌或病毒感染）起反应来引起炎性反应。炎性应答的特征在于血流提高、毛细血管渗透性提高和吞噬细胞的流入。这些事件在损伤或感染位点处导致肿胀、发红、发热（热方式改变）和脓形成。
细胞因子和前列腺素控制炎性应答，并且它们以有序和自我限制级联释放到血液中或影响组织。细胞因子和前列腺素的释放提高了流向损伤或感染区域的血流，并且可以导致发红和发热。这些化学物质中的一些造成液体渗漏到组织中，从而导致肿胀。这种保护过程可以刺激神经并导致疼痛。当在相关区域中发生有限的时间段时，这些变化以对身体有益的方式起作用。
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是主要通过单核吞噬细胞对免疫刺激因子起反应而释放的细胞因子。TNF-α能够提高大多数细胞代谢过程，如分化、招募、增殖和蛋白水解降解作用。在低水平时，TNF-α提供了抗感染剂、肿瘤和组织损伤的保护。但TNF-α还在多种疾病中起作用。当施用于哺乳动物或人时，TNF-α导致或加重了炎症、发烧、心血管影响、出血、凝血和与急性感染和休克状态期间所见的那些类似的急性期反应。提高的或无限制的TNF-α的产生涉及多种疾病和医学病况，例如，癌症，如实体瘤和血液传播的肿瘤、心脏病，如充血性心力衰竭；和病毒性、遗传性、炎性、过敏性和自身免疫疾病。
腺苷3',5'-环化一磷酸（cAMP）还在多种疾病和病况中起作用，如（但不限于）哮喘和炎症及其他病况（Lowe和Cheng,Drugs of the Future,17(9),799-807,1992）。已表明炎性白血球中cAMP的升高抑制了它们的激活以及后续炎症介质（包括TNF-α和NF-κB）的释放。cAMP水平的提高还导致呼吸道平滑肌的松弛。
炎性应答中体液和细胞免疫元素之间微妙、均衡的相互作用使得能够除去有害物剂并起始损伤组织的修复。当这种微妙、平衡的相互作用受到破坏时，炎性应答可以导致正常组织的显著损害并且可以比引起该反应的原始损害更有害。在不受控制的炎性反应的这些情况下，需要临床干预来防止组织损伤和器官功能障碍。疾病（如牛皮癣、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎、克罗恩氏病、哮喘、变应性或炎症性肠病）的特征在于慢性炎症。炎性疾病（如关节炎）、相关关节炎病况（例如，骨关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣关节炎）、炎症性肠病（例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎）、脓毒病、牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎和慢性阻塞性肺病、慢性炎症性肺病也是普遍的并且是疑难疾病。提高的或无限制的TNF-α的产生在炎性应答中起着重要作用并且在炎性疾病的动物模型中它们的拮抗剂的施用阻断了慢性和急性应答。
关节炎是全身性自身免疫病，它可以表示与身体关节损害有关的一组病况。存在100种以上不同形式的关节炎。最常见的形式是骨关节炎（退行性关节病），并且其他关节炎形式是类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和相关自身免疫疾病，如狼疮和痛风。类风湿性关节炎的特征在于关节的慢性炎症。滑液组织和液体均被炎性细胞侵入，从而导致细胞因子的产生。T细胞和单核细胞浸润关节表现出1型和2型免疫应答标志物激活的提高。
牛皮癣关节炎是影响皮肤、关节、以及腱、韧带和筋膜插入位点的慢性炎症性关节炎病况。Gladman,Current Opinion in Rheumatology,“Currentconcepts in psoriatic arthritis,”2002,14:361-366和Ruddy等人，Rheumatology,第2卷，第71章，第1071页，第6版，2001。牛皮癣关节炎一般与牛皮癣有关。同上。约7%的牛皮癣患者发展出牛皮癣关节炎。The Merck Manual,448（第17版，1999）。牛皮癣关节炎可以以多种临床类型出现。有五种一般的牛皮癣关节炎类型：远端指间关节炎、破坏性关节炎、不能与类风湿性关节炎区分的对称性多发性关节炎、不对称性寡关节炎和脊椎关节病。Ruddy等人，第1073页。在60-80%的患者中，牛皮癣似乎早于牛皮癣关节炎的发生。偶尔地，关节炎和牛皮癣同时出现。关节病可以在皮疹之前。
牛皮癣是在皮肤上出现的慢性全身性自身免疫病。有五种类型的牛皮癣：斑块型、点滴型、反转型、脓疱型和红皮病型。最常见的形式是斑块型牛皮癣，它通常观察为出现在顶部第一层表皮上的红色和白色鳞状片。然而，一些患者没有皮肤学症状。在斑块型噬菌斑中，皮肤在这些位点快速积累，从而使其具有银白色形态。斑块型牛皮癣通常发生在肘和膝盖皮肤上，但是可以影响任何区域，包括头皮、手掌和脚底以及生殖器。与湿疹相反，牛皮癣很可能出现在关节外侧。该病症是慢性复发性病况，其严重程度从较少的局部片至覆盖全身。手指甲和脚趾甲经常受到影响（牛皮癣性甲营养不良）并且可以视为单独的症状。牛皮癣还可以导致关节炎，称为牛皮癣关节炎。在牛皮癣中，一种假设是T细胞激活，迁移至真皮并触发细胞因子（具体地，TNF-α）的释放，这导致了炎症和角化细胞的快速增殖。
2.3化合物
以提供可以安全有效地用于治疗与TNF-α的异常产生有关的疾病的化合物为目标，已进行了多种研究。参见，例如，Marriott,J.B.等人，Expert Opin.Biol.Ther.,2001,1(4):1-8；G.W.Muller等人，J Med Chem.,1996,39(17):3238-3240；和G.W.Muller等人，Bioorg&Med Chem Lett.,1998,8:2669-2674。一些研究集中在根据它们通过LPS刺激的PBMC有效抑制TNF-α产生的能力所选的一组化合物。L.G.Corral等人，Ann.Rheum.Dis.,1999,58:(Suppl I)1107-1113。这些化合物不仅显示出有效的TNF-α抑制，而且显示出LPS诱导的单核细胞IL1β和IL12产生的显著抑制。LPS诱导的IL6也受这些化合物的抑制，尽管是部分抑制。这些化合物是LPS诱导的IL10的有效刺激物。同上。
用于本文所提供的方法的化合物包括（但不限于）均授权于G.W.Muller等人的美国专利第6281230号和第6316471号中所述的取代的2-(2,6-二氧哌啶-3-基)邻苯二酰亚胺和取代的2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异吲哚。本文所公开的其他具体的化合物属于美国专利no.6395754、6555554、7091353、美国专利公开第2004/0029832号和国际专利公开No.第WO98/54170号中所公开的一类异吲哚-酰亚胺，以上每篇专利作为参考并入本文。
沙利度胺、来那度胺和玻马利度胺已在多发性骨髓瘤、淋巴瘤及其他血液疾病（如脊髓发育不良综合征）患者中显示出了显著的反应。参见Galustian C等人，Expert Opin Pharmacother.,2009,10:125-133。这些药物显示出广泛的活性，其包括抗血管生成性、促炎细胞因子的调节、T细胞的共刺激、NK细胞毒性的提高、直接的抗肿瘤效果和干细胞分化的调节。
例如，作为新近诊断的患者中、化疗或移植失败的晚期疾病患者中以及复发性或难治性多发性骨髓瘤患者中多发性骨髓瘤治疗的重要选择，出现了沙利度胺和来那度胺。已经批准来那度胺与地塞米松结合以用于治疗先前接受了至少一种疗法的多发性骨髓瘤患者。玻马利度胺也可以结合地塞米松施用。美国专利公开No.2004/0029832A1公开了多发性骨髓瘤治疗，该专利公开以其全部内容并入本文。
本文所提供的另一种化合物是3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮（“化合物B”），其具有以下结构：
Figure BDA0000450181650000091
或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。
可以根据本文所提供的实施例中所述的方法或者如美国专利No.7635700中所述制备化合物B，以上专利公开以其全部内容作为参考并入本文。还可以基于本文所教导的内容根据对本领域技术人员显而易见的其他方法合成所述化合物。在某些实施方式中，化合物B处于2011年3月11日提交的美国临时专利申请No.61/451806所述的结晶形式，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。在一些实施方式中，在本文所提供的方法中使用了化合物B的盐酸盐。在2011年3月11日提交的美国临时专利申请No.61/451995中描述了使用化合物B治疗、预防和/或控制癌症及其他疾病的方法，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
2.4Cereblon
蛋白质Cereblon（CRBN）是从植物到人均保守的442个氨基酸的蛋白质。在人类中，已将CRBN基因鉴别为常染色体隐性遗传非综合征轻型精神发育迟缓（ARNSMR）的候选基因。参见，Higgins,J.J.等人，Neurology,2004,63:1927-1931。起初，将CRBN鉴定为大鼠脑中与钙激活钾通道蛋白（SLO1）相互作用的含有RGS的新型蛋白，随后CRBN显示在视网膜中通过电压门控氯通道（CIC-2）与AMPK7和DDB1相互作用。参见，Jo,S.等人，J.Neurochem,2005,94:1212-1224；Hohberger B.等人，FEBS Lett,2009,583:633-637；Angers S.等人，Nature,2006,443:590-593。DDB1最初被鉴别为与受损的DNA结合蛋白2（DDB2）有关的核苷酸切除修复蛋白。它的缺陷活性导致患有遗传性E群着色性干皮病（XPE）的患者中的修复缺陷。DDB1似乎还起到多种不同DCX（DDB1-CUL4-X-盒）E3泛素-蛋白质连接酶复合物组分的作用，所述复合物介导靶标蛋白质的泛素化和后续的蛋白酶体降解。还已将CRBN鉴别为开发用于大脑皮层疾病的治疗剂的靶标。参见WO 2010/137547A1。
最近，已将Cereblon鉴别为与沙利度胺结合并导致先天缺陷的重要分子靶标。参见Ito,T.等人，Science,2010,327:1345-1350。发现DDB1与CRBN相互作用，并因此与沙利度胺间接相关。此外，沙利度胺能够抑制CRBN体外自泛素化，这表明沙利度胺是E3泛素-连接酶抑制剂。同上。重要地，在野生型细胞中通过沙利度胺抑制了该活性，但是在具有防止沙利度胺结合的突变CRBN结合位点的细胞中不能抑制。同上。在CRBN中，将沙利度胺结合位点定位在高度保守的C末端104氨基酸区域。同上。作为CRBN中单个的点突变体，Y384A和W386A对沙利度胺结合均为缺陷型，其中双重点突变体具有最低的沙利度胺结合活性。同上。在斑马鱼和鸡胚动物模型中确认了CRBN和沙利度胺致畸作用之间的联系。同上。
是否与CRBN、CRBN E3泛素-连接酶复合物或CRBN的一种或多种底物结合是沙利度胺有益效果所需要的并且其他药物还有待建立。对与沙利度胺及其他药物靶标的这些相互作用的了解将允许定义效力和/或毒性的分子机制并且可以导致产生效力和毒性谱改善的药物。
2.5治疗癌症的方法
目前的癌症疗法可包括通过外科手术、化学疗法、激素疗法和/或放射治疗以根除患者体内的肿瘤性细胞（参见，例如，Stockdale,1998,Medicine，第3卷，Rubenstein和Federman主编，第12章，第IV节）近来，癌症治疗还可以包括生物疗法或免疫疗法。所有这些疗法对患者均有显著的缺陷。例如，可能由于患者的健康状况或患者不愿接受而无法使用外科手术。此外，手术可能无法完全去除肿瘤性组织。放射疗法仅在肿瘤性组织比普通组织对放射具有更高的敏感度时才能有效。放射治疗还常常会引发严重的副作用。激素疗法极少作为单独的试剂使用。尽管激素疗法可能有效，它通常用于在其他疗法去除大部分癌症细胞后预防或延迟癌症的复发。某些生物疗法及其他疗法数量有限且可能产生如皮疹或肿胀、流感样症状（包括发烧）、寒战和疲劳、消化道问题或过敏反应等副作用。
关于化学疗法，现已存在多种用于治疗癌症的化学治疗剂。多数癌症化疗剂均通过直接地或间接抑制脱氧核苷酸三磷酸前体的生物合成抑制DNA合成以防止DNA复制和伴随的细胞分裂而产生作用。Gilman等人，Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版（McGraw Hill,New York）。
尽管已经存在多种化学治疗剂，化学疗法存在许多缺陷。Stockdale,Medicine,第3卷，Rubenstein和Federman主编，第12章，第10节，1998。几乎所有的化学治疗剂都有毒性，且化学疗法会引起明显的、通常甚至危险的副作用，包括重度恶心、骨髓抑制以及免疫抑制反应。此外，即使施用化学治疗剂的组合，许多肿瘤细胞仍对化学治疗剂具有耐药性或形成耐药性。事实上，对治疗方案中所用的特定化学治疗剂具有耐药性的细胞通常被证明对其他药物也有耐药性，即使这些治疗剂与在特定治疗中使用的药物以不同的机制产生作用。这种现象被称为多药耐药性。由于这种耐药性，许多癌症对于标准的化疗治疗方案具有难治性。
与不希望的血管生成有关或以不希望的血管生成为特征的其他疾病和病况也是难以治疗的。然而，已提议一些化合物（如鱼精蛋白、肝素和类固醇）在与不希望的血管生成有关或以不希望的血管生成为特征的某些具体疾病的治疗中有用。Taylor等人，Nature297:307(1982)；Folkman等人，Science221:719(1983)；和美国专利No.5001116和4994443。基于它们的多种活性，还提议沙利度胺和某些沙利度胺衍生物用于这些疾病和病况的治疗。授权于D’Amato的美国专利No.5593990、5629327、5712291、6071948和6114355。
尽管如此，对于能治疗、预防和控制癌症及其他疾病和病况，包括对于标准治疗（例如，外科手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法）具有难治性的疾病，同时能减少或避免传统疗法伴随的毒性和/或副作用的安全有效的方法仍有着巨大的需求。
2.6治疗炎性疾病的方法
当前用于炎性疾病和病症的治疗涉及症状药物和免疫抑制剂来控制症状。例如，非类固醇抗炎药物（NSAID），如阿司匹林、布洛芬、非诺洛芬、萘普生、托美丁、舒林酸、甲氯芬那酸钠、吡罗昔康、氟比洛芬、双氯芬酸、奥沙普秦、萘丁美酮、依托度酸和酮洛芬，具有止痛和抗炎效果。然而，据信NSAID不能改变疾病的发展。（Tierney等人主编，Current MedicalDiagnosis&Treatment，第37版，Appleton&Lange(1998)，第793页）。此外，NSAID经常导致胃肠副作用，影响下肠道，从而导致穿孔或加重炎症性肠病，产生肾毒性，和延长出血时间。皮质类固醇是常用于控制炎性症状的另一类药物。皮质类固醇（如NSAID）不会改变疾病的自然发展，并因此当停止用药时，通常会出现活性疾病的临床表现。长时间的皮质类固醇疗法所造成的不良反应的严重问题（例如，骨质疏松症、感染风险提高、食欲增强、高血压、浮肿、消化性溃疡、精神异常）大大限制了其长期使用。
低剂量免疫抑制剂（如细胞毒素试剂）可以用于炎性病症的治疗。例如，牛皮癣和关节炎的一些治疗方法是基于缓解疾病的抗风湿性药物（DMARD，如环胞霉素A和甲氨蝶呤）、消炎剂（TNF-α抑制剂，如依那西普）和止痛剂。
仍在寻找用于炎性和自身免疫性病症的新型治疗方法。具体地，仍在寻找能够降低当前所使用的药剂的剂量和/或施用频率，或者能够使当前所用的治疗方法更有效的任何新型治疗方法。
3.发明内容
本文提供了蛋白质cereblon（CRBN）作为癌症和炎性疾病以及患者对使用本文所提供的化合物的治疗的反应的临床灵敏性预报因子的使用。在某些实施方式中，本文所提供的化合物直接结合至CRBN-DDB1。
本文还提供了使用CRBN作为本文所提供的化合物的预测或预后因子来治疗或控制癌症的方法。在某些实施方式中，本文提供了使用CRBN水平作为预测或预后因子，筛选或鉴别使用沙利度胺、来那度胺和/或玻马利度胺治疗的癌症患者（例如，多发性骨髓瘤、DLBCL、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和/或MDS患者）的方法。在一些实施方式中，本文提供了使用CRBN水平作为预测或预后因子，选择对使用沙利度胺、来那度胺和/或玻马利度胺的疗法具有较高反应率的患者的方法。
在一种实施方式中，本文提供了预测患者对使用沙利度胺、来那度胺和/或玻马利度胺的癌症或炎性疾病治疗的反应的方法，所述方法包括从所述患者获得生物材料和测量是否存在CRBN。
在一种实施方式中，mRNA或蛋白质纯化自肿瘤并且生物标志物的存在与否是通过基因或蛋白质表达分析测量的。在某些实施方式中，通过实时定量PCR（QRT-PCR）、微阵列、流式细胞术或免疫荧光测量生物标志物的存在与否。在其他实施方式中，生物标志物的存在与否是通过基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法或本领域中已知的其他类似方法测量的。例如，在美国专利公开No.2011/0223157中描述了与非霍奇金淋巴瘤有关的生物标志物，该专利的全部内容以其全部作为参考并入本文。
在另一种实施方式中，本文提供了预测癌症患者中患者对治疗的反应的方法，所述方法包括从患者获得癌细胞，在存在或不存在本文所提供的化合物的情况下培养该细胞，从所培养的细胞纯化蛋白质或RNA并通过（例如）蛋白质或基因表达分析测量生物标志物的存在与否。所监测的表达可以是（例如）mRNA表达或蛋白质表达。在一种实施方式中，所述癌症患者是淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤患者。
在另一种实施方式中，本文提供了监测癌症患者中肿瘤对化合物（例如，药物）治疗的反应的方法。所述方法包括从患者获得生物样品，测量所述生物样品中生物标志物的表达，向患者施用一种或多种化合物（例如，药物），此后从该患者获得第二生物样品，测量第二生物样品中生物标志物的表达并比较表达水平，其中治疗后生物标志物表达水平的提高表明有效肿瘤反应的可能性。在一种实施方式中，所述癌症患者是淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤患者。
在一种实施方式中，治疗后生物标志物表达水平的降低表明有效肿瘤反应的可能性。所监测的生物标志物表达可以是（例如）mRNA表达或蛋白质表达。治疗样品中的表达可以提高（例如）约1.5×、2.0×、3×、5×或以上。在一种实施方式中，所述肿瘤为淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL或黑素瘤。
在另一种实施方式中，本文提供了预测癌症患者（具体地，多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤患者（例如，DLBCL））中对化合物（例如，药物）治疗的敏感性的方法。所述方法包括从患者获得生物样品，任选地从所述生物样品分离或纯化mRNA，通过（例如）RT-PCR扩增mRNA转录本，其中特定生物标志物较高的基线水平表明了癌症将对使用化合物（例如，药物）的治疗敏感的更高可能性。在某些实施方式中，所述生物标志物是与多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤（例如，DLBCL）有关的基因或蛋白质。在一种实施方式中，所述基因选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括鉴别与CRBN有关的基因或蛋白质。在一种实施方式中，与CRBN有关的基因或蛋白质选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL或黑素瘤的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括测量该患者中CRBN的活性水平。在另一种实施方式中，测量患者中CRBN的活性水平包括测量得自该患者的细胞中的DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和/或NFκB。
在其他实施方式中，本文提供了预测患有疾病或病症的患者中对化合物（例如，药物）治疗敏感的方法，所述疾病或病症选自全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎和纤维化病况（如系统性硬化）。所述方法包括从患者获得生物样品，任选地从所述生物样品分离或纯化mRNA，通过（例如）RT-PCR扩增mRNA转录本，其中特定生物标志物较高的基线水平表明了所述疾病或病症将对使用化合物（例如，药物）的治疗敏感的更高可能性。在某些实施方式中，所述生物标志物是基因或蛋白质，其选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎或系统性硬化的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括鉴别与CRBN有关的基因或蛋白质。在一种实施方式中，与CRBN有关的基因或蛋白质选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎或系统性硬化的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括测量该患者中CRBN的活性水平。在另一种实施方式中，测量患者中CRBN的活性水平包括测量得自患者的细胞中的DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和/或NFκB。
在一种实施方式中，所述化合物是沙利度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是来那度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是玻马利度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮，或其对映异构体，或其可药用盐、多晶形物、溶剂化物或水合物。
本文还提供了用于预测有效淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤治疗的可能性或用于监测使用一种或多种化合物（例如，药物）的治疗的有效性的试剂盒。所述试剂盒包含固体载体，和检测生物样品中至少一种生物标志物的蛋白质表达的方式。这种试剂盒可以使用（例如）量杆、膜、芯片、盘、测试带、过滤器、微球体、载玻片、多孔板或光学纤维。所述试剂盒的固体载体可以是（例如）塑料制品、硅、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、片材、球体、多糖、毛细管、薄膜、板或载玻片。所述生物样品可以是（例如）细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物流体、血液样品、尿液样品或皮肤样品。所述生物样品可以是（例如）淋巴结活体组织检查、骨髓活体组织检查或周围血液肿瘤细胞样品。
在另一种实施方式中，所述试剂盒包含固体载体，与所述载体接触的核酸，其中所述核酸与mRNA的至少20、50、100、200、350或更多个碱基互补，以及用于检测生物样品中mRNA表达的方式。
在某些实施方式中，本文所提供的试剂盒使用了通过实时定量PCR（QRT-PCR）、微阵列、流式细胞术或免疫荧光检测生物标志物表达的方式。在其他实施方式中，生物标志物的表达是通过基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法或本领域中已知的其他类似方法测量的。
在其他实施方式中，本文提供了对预测疾病或病症的有效治疗的可能性有用的试剂盒，所述疾病或病症选自全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎和纤维化病况（如系统性硬化）。
除上述方法之外，结合通常用于治疗、预防或控制本文所述的疾病或病症的疗法施用本文所提供的化合物。这些常规疗法的实例包括（但不限于）手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、生物疗法和免疫疗法。
本文还提供了药物组合物，单一单位剂量形式、剂量施用方案和试剂盒，其包含本文所提供的化合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、笼形物或前体药物，和第二或其他活性剂。第二活性剂包括药物的特定组合或“混合物”。
4.附图说明
图1A和1B：H929和U266多发性骨髓瘤细胞中通过siRNA的CRBN抑制的确认。
图2A-2C：CRBN抑制终止了来那度胺（“Len”）、玻马利度胺（“Pom”）和化合物B诱导的G1期停滞。
图3A：通过RT-PCR确认U266B1细胞中CRBN的抑制。
图3B：CRBN抑制中止了来那度胺和玻马利度胺对U266细胞中细胞周期的影响。
图3C和3D：CRBN的抑制防止来那度胺和玻马利度胺处理的U266细胞中p21WAF1的提高，如通过RT-PCR和免疫印迹分析所检测的。
图4A-4D：CRBN的抑制终止了药物对H929细胞中pRb和IRF-4磷酸化的影响。
图5A-5C：CRBN-siRNA转染的U266B1细胞中细胞周期和基因表达谱图。
图6A-6D：DDB1抑制仅部分影响U266细胞中来那度胺和玻马利度胺诱导的细胞周期延迟。
图7A和7B：H929中，来那度胺和玻马利度胺降低了总K48连接的聚泛素化，但不能降低K-63-连接的泛素化。
图8：1小时上调的泛素化，无MG132。
图9：4小时上调的泛素化，无MG432。
图10：1小时上调的泛素化，MG132。
图11：4小时上调的泛素化，MG132。
图12A-12D：CRBN抑制对T细胞中TNFα和IL-2水平的影响。
图13A-13C：CUL4A和CUL4A抑制对T细胞中TNFα和IL-2水平的影响。
图14：来那度胺的抗增殖活性相对于DLBCL细胞中CRBN的表达。
图15A：CRBN_034克隆的谱图。
图15B：DDB1_004克隆的谱图。
图16A：CRBN敏感性骨髓瘤细胞中来那度胺的抗增殖活性。
图16B：CRBN敏感性骨髓瘤细胞中玻马利度胺的抗增殖活性。
图16C：CRBN敏感性骨髓瘤细胞中化合物B的抗增殖活性。
图17：1小时泛素化实验中，无MG132时来那度胺（“Len”）和玻马利度胺（“Pom”）调节的肽。
图18：1小时泛素化实验中，有MG132时来那度胺（“Len”）和玻马利度胺（“Pom”）调节的肽。
图19：4小时泛素化实验中，无MG132时来那度胺（“Len”）和玻马利度胺（“Pom”）调节的肽。
图20：4小时泛素化实验中，有MG132时来那度胺（“Len”）和玻马利度胺（“Pom”）调节的肽。
图21：泛素化实验中来那度胺（“Len”）和玻马利度胺（“Pom”）之间常见肽表。
图22：多次来那度胺（“Len”）和玻马利度胺（“Pom”）泛素化实验中常见命中表。
图23：来那度胺（“Len”或“Rev”）、玻马利度胺（“Pom”）和化合物B的Ubiscan数据。
图24A：ABC-DLBCL标签基因。
图24B：DLBCL细胞中NF-κB活性和IRF4活性。
图24C：DLBCL细胞系的“ABC得分”。
图25：来那度胺体外抑制ABC-DLBCL细胞的增殖。
图26：来那度胺治疗还诱导敏感细胞系（如OCI-Ly10）的细胞凋亡。
图27A-27C：来那度胺对ABC-DLBCL细胞系中IRF4表达的影响。
图28：DLBCL细胞系中CARD11卷曲螺旋结构域1的突变分析。
图29A-29C：来那度胺抑制敏感DLBCL细胞系中CARD11-Bcl-10-MALT1复合物的激活。
图30A-30C：来那度胺抑制ABC-DLBCL细胞中NF-κB活性。
图31A-31D：ABC-DLBCL细胞中IRF4表达的变化影响细胞对来那度胺的敏感性。
图32A-32D：通过来那度胺的IRF4、NF-κB和增殖的下调需要存在cereblon。
图33A-33B：来那度胺抑制OCI-Ly10ABC-DLBCL小鼠异种移植模型中的肿瘤生长。
图34A-34B：“ABC得分”和基线IRF4/CRBN水平与DLBCL细胞的来那度胺敏感性的关联。
图35：抗体CGN-6-1-11（上部；SEQ ID NO:5）与CGN-6-4-5（下部；SEQ ID NO:8）的重链氨基酸序列之间的比对。
图36：抗体CGN-6-1-11（上部；SEQ ID NO:7）与CGN-6-4-5（下部；SEQ ID NO:11）的轻链氨基酸序列之间的比对。
图37A和37B：使用1μg/ml CGN-6-4-5抗体（绿色）（A）或CGN-6-4-5抗体/CRBN阻断肽混合物（1:5过量比）的DF15（左侧部分）和DF15R细胞（右侧部分）的共聚焦免疫荧光分析。用Dapi（蓝色）进行核染色。
图38：用含有内源CRBN（DF15）的骨髓瘤细胞、不含CRBN的DF15R和表达重组flag标签CRBN的HEK293细胞的免疫印迹。
图39A和39B：沙利度胺及其他化合物与CRBN的结合。
5.具体实施方式
本文所提供的方法部分基于以下发现：cereblon与某些药物（如本文所提供的化合物）的抗增殖活性有关。在一些实施方式中，Cereblon（CRBN）可以用作生物标志物以表明使用本文所提供的化合物的疾病治疗的有效性或进展。
不受具体理论的束缚，CRBN结合可以促进某些化合物（如本文所提供的化合物）的抗增殖或其他活性，或者是这些活性所必需的。在某些实施方式中，本文所提供的化合物直接结合至CRBN-DDB1和/或CRBN E3泛素-连接酶复合物。CRBN中的突变可以与对本文所提供的化合物的耐受性有关。
例如，与相对应的亲本系相比，玻马利度胺耐受性细胞系DF15R和来那度胺耐受性细胞H929R10-1、H929R10-2、H929R10-3、H929R10-4和MM1/R中CRBN的水平显著较低。此外，在对来那度胺具有获得耐受性的骨髓瘤系之一的CRBN基因中发现了有趣的突变，而在亲本系中CRBN基因为野生型。该突变定位至CRBN中的DDB1结合域。因此，在某些实施方式中，癌细胞（例如，骨髓瘤细胞）或患有癌症的患者对使用本文所提供的化合物的疗法的敏感性与CRBN表达有关。
在复发性或难治性弥漫性大B-细胞淋巴瘤（DLBCL）中，在激活的B细胞样（ABC）亚类中所见的反应比在生发中心样B细胞样亚类中所见的更高。如本文使用DLBCL细胞系所提供的，表明来那度胺治疗优先抑制ABC-DLBCL细胞体外增殖并且延缓人肿瘤异种移植模型中肿瘤的生长，同时对非ABC-DLBCL细胞的影响最小。这种杀肿瘤作用与作为ABC-DLBCL细胞的标志的干扰素调节因子4（IRF4）的下调有关。
来那度胺对IRF4的抑制导致B细胞受体（BCR）依赖性NF-κB激活的下调。尽管IRF4特异性siRNA与来那度胺降低NF-κB激活的作用类似，但是IRF4过表达提高了NF-κB激活并且赋予对来那度胺的耐受性。此外，来那度胺引起的IRF4下调需要CRBN的表达。不受具体理论的束缚，这些数据显示来那度胺可以通过阻断IRF4表达和BCR-NF-κB信号通路以CRBN依赖性方式对DLBCL细胞，优选地ABC-DLBCL细胞具有直接抗癌活性。
已提出CRBN蛋白作为Cul4-E3-连接酶复合物的底物受体通过它与DDB1的相互作用来起作用。如本文所提供的，已研究了体内泛素化与否与多发性骨髓瘤细胞中药物反应有关。在H929细胞中，在30分钟治疗后，本文所提供的化合物降低了总K48连接的聚泛素化，但不能降低K-63-连接的泛素化。目前，已报道近24种蛋白被Cul4-DDB1连接酶2降解。一些研究表明核心组蛋白、DNA修复蛋白、细胞周期调节子和关键信号通路分子的Cul4/DDB1-依赖性泛素化。mTORC1信号需要蛋白酶体功能以及CUL4-DDB1泛素E3连接酶的参与。使用CST Ubiscan技术，鉴别了在短暂处理（1-4h）后受本文所提供的化合物显著调节的162种独特的泛素-肽。相应的蛋白参与核酸酶体（nucleasome）和染色质功能、蛋白质-DNA组装和组蛋白H2A。这种早期修饰在本文所提供的化合物的作用方式中的相关性以及与CRBN和CUL4/DDB1活性的关系仍在研究。
本文提供了使用CRBN作为本文所提供的化合物的预测或预后因子来治疗或控制癌症和炎性疾病的方法。在某些实施方式中，本文提供了使用CRBN水平作为预测或预后因子，筛选或鉴别使用沙利度胺、来那度胺和/或玻马利度胺治疗的癌症患者（例如，淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤患者）的方法。在一些实施方式中，本文提供了使用CRBN水平作为预测或预后因子，选择对使用沙利度胺、来那度胺和/或玻马利度胺的疗法具有较高反应率的患者的方法。
在一种实施方式中，本文提供了预测患者对使用沙利度胺、来那度胺和/或玻马利度胺的癌症或炎性疾病治疗的反应的方法，所述方法包括从所述患者获得生物材料和测量是否存在CRBN。
在一种实施方式中，mRNA或蛋白质纯化自肿瘤并且生物标志物的存在与否是通过基因或蛋白质表达分析测量的。在某些实施方式中，通过实时定量PCR（QRT-PCR）、微阵列、流式细胞术或免疫荧光测量生物标志物的存在与否。在其他实施方式中，生物标志物的存在与否是通过基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法或本领域中已知的其他类似方法测量的。
在另一种实施方式中，本文提供了预测癌症患者（如，多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤患者）中对化合物（例如，药物）治疗的敏感性的方法。所述方法包括从患者获得生物样品，任选地从所述生物样品分离或纯化mRNA，通过（例如）RT-PCR扩增mRNA转录本，其中特定生物标志物较高的基线水平表明了癌症将对使用化合物（例如，药物）的治疗敏感的更高可能性。在某些实施方式中，所述生物标志物是与多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤（例如，DLBCL）有关的基因或蛋白质。在一种实施方式中，所述基因选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括鉴别与CRBN有关的基因或蛋白质。在一种实施方式中，与CRBN有关的基因或蛋白质选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、MDS或黑素瘤的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括测量该患者中CRBN的活性水平。在另一种实施方式中，测量患者中CRBN的活性水平包括测量得自该患者的细胞中的DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和/或NFκB。
在一种实施方式中，所述化合物是沙利度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是来那度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是玻马利度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮，或其对映异构体，或其可药用盐、多晶形物、溶剂化物或水合物。
在一种实施方式中，所述癌症是多发性骨髓瘤。
在另一种实施方式中，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。在一种实施方式中，所述非霍奇金淋巴瘤具有激活的B细胞表型。
在另一种实施方式中，所述癌症是弥漫性大B-细胞淋巴瘤。在一种实施方式中，所述弥漫性大B-细胞淋巴瘤具有激活的B细胞表型。
在另一种实施方式中，所述癌症是外套细胞淋巴瘤。
在另一种实施方式中，所述癌症是滤泡性淋巴瘤。
在另一种实施方式中，所述癌症是急性髓母细胞性白血病。
在另一种实施方式中，所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病。
在另一种实施方式中，所述癌症是脊髓发育不良综合征。
在另一种实施方式中，所述癌症是黑素瘤。
在其他实施方式中，本文提供了预测患有疾病或病症的患者中对化合物（例如，药物）治疗敏感的方法，所述疾病或病症选自全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎和纤维化病况（如系统性硬化）。所述方法包括从患者获得生物样品，任选地从所述生物样品分离或纯化mRNA，通过（例如）RT-PCR扩增mRNA转录本，其中特定生物标志物较高的基线水平表明了所述疾病或病症将对使用化合物（例如，药物）的治疗敏感的更高可能性。在某些实施方式中，所述生物标志物是基因或蛋白质，其选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎或系统性硬化的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括鉴别与CRBN有关的基因或蛋白质。在一种实施方式中，与CRBN有关的基因或蛋白质选自DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和NFκB。
在一种实施方式中，鉴别患有全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎或系统性硬化的患者对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和/或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮的治疗敏感包括测量该患者中CRBN的活性水平。在另一种实施方式中，测量患者中CRBN的活性水平包括测量得自该患者的细胞中的DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4和/或NFκB。
在一种实施方式中，所述化合物是沙利度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是来那度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是玻马利度胺。
在另一种实施方式中，所述化合物是3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮，或其对映异构体，或其可药用盐、多晶形物、溶剂化物或水合物。
本文还提供了用于预测有效淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性髓母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合征或黑素瘤治疗的可能性或用于监测使用一种或多种化合物（例如，药物）的治疗的有效性的试剂盒。所述试剂盒包含固体载体，和检测生物样品中至少一种生物标志物的蛋白质表达的方式。这种试剂盒可以使用（例如）量杆、膜、芯片、盘、测试带、过滤器、微球体、载玻片、多孔板或光学纤维。所述试剂盒的固体载体可以是（例如）塑料制品、硅、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、片材、球体、多糖、毛细管、薄膜、板或载玻片。所述生物样品可以是（例如）细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物流体、血液样品、尿液样品或皮肤样品。所述生物样品可以是（例如）淋巴结活体组织检查、骨髓活体组织检查或周围血液肿瘤细胞样品。
在另一种实施方式中，所述试剂盒包含固体载体，与所述载体接触的核酸，其中所述核酸与mRNA的至少20、50、100、200、350或更多个碱基互补，以及用于检测生物样品中mRNA表达的方式。
在某些实施方式中，本文所提供的试剂盒使用了通过实时定量PCR（QRT-PCR）、微阵列、流式细胞术或免疫荧光检测生物标志物表达的方式。在其他实施方式中，生物标志物的表达是通过基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法或本领域中已知的其他类似方法测量的。
在其他实施方式中，本文提供了对预测疾病或病症的有效治疗的可能性有用的试剂盒，所述疾病或病症选自全身性红斑狼疮、ANCA-诱导的血管炎、血管球性肾炎、急性韦格氏肉芽肿、重症肌无力、干燥综合征、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎和纤维化病况（如系统性硬化）。
本文提供了基于癌症中CRBN表达水平或DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4或NFκB的表达水平，出于对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物预测临床反应、监测临床反应或监测患者对给药的顺应性的目的，选择一组癌症患者的方法；其中所述癌症患者选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、黑素瘤和实体瘤患者。
在一种实施方式中，所述癌症患者为多发性骨髓瘤患者。
在一种实施方式中，所述癌症患者为非霍奇金淋巴瘤患者。在一种实施方式中，所述非霍奇金淋巴瘤具有激活的B细胞表型。
在一种实施方式中，所述癌症患者为弥漫性大B-细胞淋巴瘤患者。在一种实施方式中，所述弥漫性大B-细胞淋巴瘤具有激活的B细胞表型。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于癌症中DDB1的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于癌症中DDB2的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中GSK3B的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中CUL4A的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中CUL4B的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中XBP-1的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中FAS1的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中RANBP6的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中DUS3L的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中PHGDH的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中AMPK的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于癌症中IRF4的表达水平。
在一种实施方式中，选择一组癌症患者的方法是基于所述癌症中NFκB的表达水平。
本文还提供了基于CRBN基因中突变的存在或出现，鉴别或监测多发性骨髓瘤患者对沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮疗法的耐受性的方法。
在一种实施方式中，CRBN基因的突变是导致CRBN的DDB1结合域内蛋白中氨基酸变化249D>YD的编码区c.745C>CA中的单核苷酸多态性。
在另一种实施方式中，本文提供了基于CRBN表达水平或患者T细胞中DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4或NFκB的表达水平，出于预测对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的临床反应、监测所述临床反应或监测患者对施用所述药物的顺应性的目的，选择一组对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的治疗起反应的患者的方法。
本文还提供了分离的CRBN抗体，例如，“CRBN70”，如根据下文实施例6.20或6.21所制备的。在一种实施方式中，抗体是多克隆抗体。在另一种实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是兔多克隆抗体。在其他实施方式中，所述抗体为兔单克隆抗体。
在另一种实施方式中，本文提供了分离的抗体，其免疫特异性结合至具有氨基酸序列EEFHGRTLHDDDC（SEQ ID NO:1）的表位上。在另一种实施方式中，所述抗体免疫特异性结合至具有氨基酸序列EEFHGRTLHDDDC（SEQ ID NO:1）的表位上，其中所述肽偶联至钥孔血蓝素（KLH）。在一种实施方式中，抗体是多克隆抗体。在另一种实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是兔多克隆抗体。在其他实施方式中，所述抗体为兔单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体免疫特异性结合人CRBN（SEQ ID NO:12）的肽65-76（SEQ IDNO:1）。
在某些实施方式中，本文提供了抗体，所述抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的重链。在其他实施方式中，所述抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的轻链。在某些实施方式中，所述抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQID NO:9中所示的氨基酸序列的重链。在其他实施方式中，所述抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的轻链。在某些实施方式中，所述抗体免疫特异性结合人CRBN（SEQ ID NO:12）的肽65-76（SEQID NO:1）。
本文还提供了使用CRBN抗体（例如，兔多克隆或单克隆抗体CRBN70，或结合人CRBN（SEQ ID NO:12）的肽65-76（SEQ ID NO:1）的兔多克隆或单克隆抗体）以测量患者肿瘤或宿主细胞中CRBN表达水平，从而对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的预测临床反应、监测所反应或监测患者对给药的顺应性，或监测对使用所述药物的疗法的耐受性的发展的方法。在一种实施方式中，CRBN抗体免疫特异性结合至具有氨基酸序列EEFHGRTLHDDD（SEQ ID NO:1）的表位上。在一种实施方式中，CRBN抗体特异性结合至EEFHGRTLHDDD（SEQ ID NO:1），所述肽偶联至钥孔血蓝素（KLH）。在一种实施方式中，CRBN抗体是多克隆抗体，如兔多克隆抗体。在另一种实施方式中，CRBN抗体是单克隆抗体，如兔单克隆抗体。
5.1定义
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“治疗”是指在患者患有特定癌症时所发生的作用，该作用降低了癌症的严重程度或者延迟或减缓了癌症的发展。
当表示使用化合物治疗时，术语“敏感性”和“敏感”是相对术语，它表示所述化合物对减轻或降低待治疗肿瘤或疾病的发展的有效程度。例如，当表示与化合物有关的细胞或肿瘤的治疗时，术语“提高的敏感性”是指肿瘤治疗的有效性提高了至少5%或以上。
如本文所使用的并且除非另作说明，术语化合物的“治疗有效量”是在癌症的治疗或控制中足以提供治疗益处，或者足以延缓或最大程度降低与所述癌症的存在有关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量表示单独或与其他疗法结合，在癌症的治疗或控制中提供治疗益处的治疗剂的量。术语"治疗有效量"可以涵盖改善整体疗法，降低或避免癌症的症状或原因，或者提高另一种治疗剂的治疗效力的量。
如本文所使用的，“有效患者肿瘤反应”是指任何对患者治疗益处的增加。“有效患者肿瘤反应”可以是（例如）肿瘤发展速率降低5%、10%、25%、50%或100%。“有效患者肿瘤反应”可以是（例如）癌症的身体症状降低了5%、10%、25%、50%或100%。“有效患者肿瘤反应”还可以是（例如）患者反应提高5%、10%、25%、50%、100%、200%或更大，如通过任何适合的方法（如基因表达、细胞计数、测定结果等）所测量的。
术语“可能性”一般地是指事件可能性的提高。当表示患者肿瘤反应的有效性时，术语“可能性”一般是指肿瘤发展速率或肿瘤细胞生长将减低的可能性的提高。当用于表示患者肿瘤反应的有效性时，术语“可能性”还可以一般地表示可能表现出肿瘤治疗进展提高的指示物（如mRNA或蛋白质表达）的增加。
术语“预测”一般表示提前确定或分辩。例如，当用于“预测”癌症治疗有效性时，术语“预测”可以表示可以在一开始，在开始治疗之前或在进行了大部分治疗期之前确定癌症治疗结果的可能性。
如本文所使用的，术语“监测”一般是指对活动的监督、监察、管理、监视、追踪或管制。例如，术语“监测化合物的有效性”是指追踪治疗患者中或肿瘤细胞培养中的癌症的有效性。类似地，当结合患者顺应性使用时，“监测”单独地或在临床试验中是指追踪或确认患者确实按照处方接受所测试的药物。可以（例如）通过追踪mRNA或蛋白质生物标志物的表达进行监测。
癌症或癌症相关疾病的改善可以鉴别为完全或部分反应。“完全反应”是指临床可检测的疾病的消失，任何先前异常的放射照相研究、骨髓和脑脊髓液（CSF）或异常单克隆蛋白测量转为正常。“部分反应”是指在不存在新的病变的情况下，所有可测量的肿瘤负荷（即受试者中存在的恶性细胞的个数，或所测量的整个肿瘤量或异常单克隆蛋白质的量）的至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的降低。术语“治疗”考虑了完全和部分反应。
如本文所使用的，“肿瘤”是指所有新生细胞的生长和增殖，无论是恶性或良性的，并且指所有的癌前细胞和癌细胞及组织。如本文所使用的，“新生的”是指失调或不受管制的细胞生长的任何形式，无论是恶性或良性的，从而造成异常组织生长。因此，“新生细胞”包括具有失调或不受管制的细胞生长的恶性和良性细胞。
术语“癌症”和“癌的”表示或描述通常以无限制细胞生长为特征的哺乳动物中的生理条件。癌症的实例包括但不限于血液传播肿瘤（例如，多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病）和实体瘤。
术语“难治性或耐受性”是指即使在强化治疗后患者在它们的淋巴系统、血液和/或血液形成组织（例如，髓）中仍具有残留癌细胞（例如，白血病或淋巴瘤细胞）的情况。
如本文中可替换使用的，如本文所使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指在顺序排列中通过肽键连接的三个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物。术语“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等。如本文所使用的术语多肽还可以表示肽。构成多肽的氨基酸可以是天然来源的或者可以是合成的。所述多肽可以纯化自生物样品。
在本文中广义地使用了术语“抗体”并且它包括完整组装的抗体、保留了特异性结合抗原（例如，Fab、F(ab')2、Fv和其他片段）的能力的抗体片段、单链抗体、双体抗体、抗体嵌合体、杂交抗体、双重特异性抗体、人源化抗体等。术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体两者。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可以替换使用。在本文中术语“免疫特异性结合至CRBN抗原的抗体”、“免疫特异性结合至CRBN表位的抗体”、“CRBN抗体”、“抗CRBN抗体”和类似术语也是可互换使用的并且表示特异性结合至CRBN多肽（如CRBN抗原或表位（例如，EEFHGRTLHDDD（SEQ ID NO:1）或肽65-76人CRBN（SEQ ID NO:12））的抗体及其片段。抗体包括特异性结合至CRBN多肽的修饰抗体（即包含修饰的IgG（例如，IgG1）恒定域的抗体）和未修饰的抗体（即不包含修饰的IgG（例如，IgG1）恒定域的抗体）。免疫特异性结合至CRBN抗原的抗体或其片段可以与相关抗原具有交叉反应。在某些实施方式中，免疫特异性结合至CRBN抗原的抗体或其片段不与其他抗原交叉反应。可以通过（例如）免疫测定、BIAcore或本领域技术人员所知的其他技术鉴别免疫特异性结合至CRBN抗原的抗体或其片段。如使用实验技术（如放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA））所确定的，当与CRBN抗原结合的亲合力比任何交叉反应抗原的更高时，抗体或其片段特异性结合至CRBN抗原。通常地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪音的至少两倍，并且更通常地，是背景的10倍以上。有关抗体特异性的讨论，参见，例如，Paul主编，1989,基础免疫学（Fundamental Immunology），第二版，Raven Press,New York，第332-336页。
本文所提供的抗体包括（但不限于）合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多重特异性抗体（包括双重特异性抗体）、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单链Fv（scFv）（例如，包括单特异性、双重特异性等）、骆驼化抗体、Fab片段、F(ab'')片段、二硫键连接的Fv（sdFv）、抗独特型（抗Id）抗体和上述任何抗体的表位结合片段。具体地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即抗原结合域或者含有免疫特异性结合至CRBN抗原的抗原结合位点（例如，抗CRBN抗体的一个或多个互补决定区（CDR））的分子。本文所提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、任何种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或任何亚类（例如，IgG2a和IgG2b）。在一些实施方式中，抗CRBN抗体是完全的人抗体，如完全的人单克隆CRBN抗体。在某些实施方式中，本文所提供的抗体是IgG抗体，或其同类（例如，人IgG1或IgG4）或亚类。
术语“抗原结合域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”以及类似的术语表示包含与抗原相互作用并且赋予结合剂其对抗原的特异性和亲合力的氨基酸残基的抗体部分（例如，CDR）。抗原结合区可以来源于任何动物种类，如啮齿动物（例如，兔、大鼠或仓鼠）和人。在一些实施方式中，抗原结合区将是人来源的。
术语抗体的“恒定区”或“恒定域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合但是表现出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用。该术语表示相对于免疫球蛋白的另一部分（含有抗原结合位点的可变域），具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恒定域含有重链的CH1、CH2和CH3域和轻链的CL域。
如本文所使用的术语“表位”是指能够结合至抗体的一个或多个抗原结合区并且在动物（如哺乳动物，例如人）中具有能够引起免疫应答的抗原或免疫原活性的抗原表面上的局部区域，如CRBN多肽或CRBN多肽片段。具有免疫原活性的表位是在动物中引起抗体反应的多肽部分。具有抗原活性的表位是抗体免疫特异性结合的多肽部分，如通过本领域中熟知的任何方法所确定的，例如，通过本文所述的免疫测定确定的。抗原表位不必需是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并且具有特异性立体结构特性以及特异性电荷特性。有助于表位的多肽区可以是所述多肽邻接的氨基酸，或者所述表位可以由所述多肽的两个或更多个非邻接区域聚集在一起。表位可以是或者可以不是抗原的立体表面特征。本文所提供的CRBN的示例性表位是EEFHGRTLHDDD（SEQ IDNO:1）或CRBN的肽65-60（SEQ ID NO:13）。
术语“完全人抗体”或“人抗体”在本文中是可互换使用的并且表示包含人可变区和，在一些实施方式中，人恒定区的抗体。在具体的实施方式中，这些术语表示包括人来源的可变区和恒定区的抗体。在某些实施方式中，“完全人”抗CRBN抗体还可以涵盖结合CRBN多肽并且由核酸序列编码的抗体，所述核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列天然存在的体细胞变体。在具体的实施方式中，本文所提供的抗CRBN抗体是完全人抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物No.91-3242,1991。例如，在本文的实施例中提供了产生完全人抗体的示例性方法，但是可以使用本领域中已知的任何方法。
短语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，如使用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、分离自重组细胞的抗体、组合人抗体文库、分离自对于人免疫球蛋白基因是转基因和/或转染色体的动物（例如，小鼠或牛）的抗体（参见，例如，Taylor,L.D.等人，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295）或者通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体可以具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。参见Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物No.91-3242。然而，在某些实施方式中，对这些重组人抗体进行体外致突变（或者，当使用对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞致突变），并且重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可能不会天然存在于体内人抗体种系库内的序列，尽管它们来源于并且和人种系VH和VL序列有关。
当用于表示抗体时，术语“重链”是指基于重链恒定域的氨基酸序列，称为α、δ、ε、γ和μ的五种不同类型。这些不同类型的重链是熟知的并且导致产生了五类抗体，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG1、IgG3和IgG4。在一些实施方式中，所述重链是人重链。
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是承认的，并且表示对比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变（即高度可变）的氨基酸残基的编号系统。Kabat等人，(1971)Ann.any Acad.Sci.190:382-391和Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物No.91-3242。对于重链可变区，高变区通常对于CDR1的范围是从氨基酸位置31至35，对于CDR2是从氨基酸位置50至65，并且对于CDR3是从氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，高变区通常对于CDR1的范围是从氨基酸位置24至34，对于CDR2是从氨基酸位置50至56，并且对于CDR3是从氨基酸位置89至97。其他编号方案将是本领域技术人员容易理解的。
当用于表示抗体时，术语“轻链”是指基于恒定域的氨基酸序列，两种不同的类型，其称为κ和λ。轻链氨基酸序列在本领域中是熟知的。在某些实施方式中，所述轻链是人轻链。
术语“单克隆抗体”是指得自均一或基本均一的抗体群体的抗体，并且每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单一表位。在一些实施方式中，如本文所使用的“单克隆抗体”是通过单个杂交瘤或其他细胞所产生的抗体，其中该抗体免疫特异性地结合仅CRBN表位，如所确定的，例如，通过ELISA或本领域中已知的或本文所提供的实施例中的其他抗原结合或者竞争性结合测定所确定的。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何具体方法。例如，可以通过如Kohler等人；Nature,256:495(1975)中所述的杂交瘤方法制备本文所提供的单克隆抗体或者可以使用（例如）如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。用于制备克隆细胞系以及由它所表达的单克隆抗体的其他方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Short Protocols in Molecular Biology,(2002)，第5版，Ausubel等人主编，John Wiley and Sons,New York中的第11章。在本文的实施例中提供了产生其他单克隆抗体的其他示例性方法。
如本文所使用的“多克隆抗体”是指在对具有多个表位的蛋白的免疫原反应中产生的抗体群体，并因此包括针对该蛋白内相同和不同表位的多个不同的抗体。用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Short Protocols in Molecular Biology,(2002)，第5版，Ausubel等人主编，JohnWiley and Sons,New York中的第11章。
术语“cereblon”或者“CRBN”以及类似术语是指包含任何CRBN的氨基酸序列的多肽（在本文中“多肽”、“肽”和“蛋白质”是可互换使用的），所述CRBN的氨基酸序列如人CRBN蛋白（例如，人CRBN同工型1，GenBank登录号No.NP_057386（SEQ ID NO:12）；或人CRBN同工型2，GenBank登录号No.NP_001166953（SEQ ID NO:13），每条氨基酸序列以其全部作为参考并入本文）和相关多肽，包括其SNP变体。相关CRBN多肽包括等位变体（例如，SNP变体）；剪接变体；片段；衍生物；替换、缺失和插入变体；融合多肽；和种间同源物，在某些实施方式中，它保留了CRBN活性和/或足以产生抗CRBN免疫应答。
术语“CRBN抗原”是指抗体免疫特异性结合的CRBN多肽的一部分。CRBN抗原还是指抗体免疫特异性结合的CRBN多肽的类似物或衍生物或者它的片段。CRBN抗原表面上能够引起免疫应答的局部区域是CRBN“表位”。有助于表位的CRBN多肽区可以是所述多肽邻接的氨基酸，或者所述表位可以由所述多肽的两个或更多个非邻接区域聚集在一起。表位可以是或者可以不是抗原的立体表面特征。在某些实施方式中，CRBN表位是EEFHGRTLHDDD（SEQ ID NO:1）或者人CRBN的肽65-76（SEQ IDNO:12）。
术语“可变区”或“可变域”是指轻链和重链的部分，通常在重链中为约氨基末端120至130个氨基酸，在轻链中为约100至110个氨基酸，在抗体中它们的序列显著不同并且在每个具体抗体对其具体抗原的结合和特异性中使用。序列差异度集中在称为互补决定区（CDR）的那些区域，而可变域中更高度保守的区域被称为框架区（FR）。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。本文所使用的氨基酸位置编号是根据EU索引编号的，如参见Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物No.91-3242。在一些实施方式中，可变区是人可变区。
如本文所使用的术语“表达的”或“表达”是指从基因转录以产生与该基因的两条核酸链中的一条的区域至少部分互补的RNA核酸分子。如本文所使用的术语“表达的”或“表达”还是指从RNA分子翻译以产生蛋白质、多肽或其部分。
在给定处理或条件下，“上调”的mRNA通常会提高。“下调的”mRNA一般是指对给定处理或条件起反应使mRNA的表达水平降低。在一些情况下，在给定处理或条件下，mRNA水平可以保持不变。
当用药物治疗时，与未治疗的对照相比，来自患者样品的mRNA可以“上调”。这种上调可以是（例如）比较对照mRNA水平的约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、100%、200%、300%、500%、1000%、5000%或以上的提高。
作为另外一种选择，在对某些化合物或其他试剂的施用起反应后，mRNA可以“下调”或以较低水平表达。下调的mRNA可以（例如）以比较对照mRNA水平的约99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、1%或更低的水平存在。
类似地，当用药物治疗时，与未治疗的对照相比，来自患者样品的多肽或蛋白生物标志物的水平可以是提高的。这种提高可以是比较对照蛋白水平的约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、100%、200%、300%、500%、1000%、5000%或以上。
作为另外一种选择，对某些化合物或其他试剂的施用起反应，蛋白生物标志物的水平可以是降低的。例如，这种降低可以以比较对照蛋白水平的约99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、1%或更小的水平存在。
如本文所使用的术语“确定”、“测量”、“评价”、“估计”和“测定”一般是指任何形式的测量，并且包括确定元素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定两者。估计可以是相对的或绝对的。“对存在性的估计”可以包括确定所存在的某物的量，以及确定它是否存在。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可替换地用于描述由核苷酸（例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）组成的任何长度的聚合物，或者通过合成产生的化合物，它可以与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交，例如，可以参与沃森-克里克碱基配对相互作用。如本文所使用的，在多核苷酸序列的背景中，术语“碱基”与“核苷酸”是同义的，即多核苷酸的单体亚单位。术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括不但含有已知嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有已修饰的其他杂环碱基的那些部分。这些修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、乙酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。另外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不但含有常规核糖和脱氧核糖，而且还含有其他糖的那些部分。修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团取代，或者官能化为醚、胺等。“类似物”是指具有在文献中识别为模拟物、衍生物、具有类似结构或其他相似项的结构特征的分子，并且包括（例如）多核苷酸掺入的非天然核苷酸、核苷酸模拟物（如2'-修饰的核苷）、肽核酸、寡聚核苷膦酸酯和具有添加的取代基的任何多核苷酸，如保护基或连接部分。
术语“互补”是指基于多核苷酸的序列，所述多核苷酸之间的特异性结合。如本文所使用的，如果第一多核苷酸和第二多核苷酸在严格的条件下在杂交测定中彼此结合，例如，如果在杂交测定中它们产生给定或可检测的信号水平，则它们是互补的。如果遵守常规碱基配对原则，则多核苷酸部分是彼此互补的，例如，A与T（或U）配对并且G与C配对，尽管可以存在小区域（例如，小于约3个碱基）的错配、插入或缺失序列。
在两条核酸序列的背景中“序列同一性”或“同一性”是指当对指定比较窗进行最大一致性比对，并且可以考虑添加、缺失和替换时，两条序列中相同的残基。
在多核苷酸的背景中，术语“基本同一性”或“同源的”以它们多种语法形式一般地表示与参考序列相比，包含具有所需同一性的序列的多核苷酸，例如，至少60%的同一性，优选地至少70%的序列同一性，更优选地至少80%，更优选地至少90%并且甚至更优选地至少95%。核苷酸序列基本相同的另一种指示是在严格的条件下两种分子是否彼此杂交。
术语“分离”和“纯化”是指物质（如mRNA、抗体或蛋白质）的分离，从而所述物质占它所在样品的大部分，即大于通常以天然或未分离状态存在的所述物质。通常，所述样品的大部分包括（例如）所述样品的大于1%、大于2%、大于5%、大于10%、大于20%、大于50%或以上，通常多至约90%-100%，或更多的，通常多至约90%-100%。例如，分离的mRNA样品通常可以包含至少约1%的总mRNA。用于纯化多核苷酸的技术在本领域中是熟知的，并且包括（例如）凝胶电泳、离子交换色谱法、亲和色谱法、流式分选和根据密度沉降。
如本文所使用的术语“样品”是指材料或材料的混合物，通常尽管并不一定，它处于含有一种或多种所关心成分的液体形式。
如本文所使用的“生物学样品”是指得自生物受试者的样品，其包括体内或原位获得、触及或收集的生物组织或液体来源的样品。生物样品还包括来自具有癌前或癌细胞或组织的生物受试者的区域的样品。这些样品可以是但不限于分离自哺乳动物的器官、组织、部份和细胞。示例性生物样品包括但不限于细胞溶胞产物、细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物流体、血液样品、尿液样品、皮肤样品等。优选的生物样品包括但不限于全血、部分纯化的血液、PBMC、组织活检样品等。
如本文所使用的术语“捕获剂”是指通过足以使所述试剂从均一混合物中结合和浓缩mRNA或蛋白质的相互作用结合mRNA或蛋白质的试剂。
如本文所使用的术语“探针”是指针对具体靶标mRNA生物标志物序列的捕获剂。相应地，探针组中的每个探针具有各自的靶标mRNA生物标志物。探针/靶标mRNA双螺旋是通过探针与其靶标mRNA生物标志物杂交所形成的结构。
术语“核酸”或“寡核苷酸探针”是指能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成与具有互补序列的靶标核酸（如本文所提供的mRNA生物标志物）结合的核酸。如本文所使用的，探针可以包括天然的（例如，A、G、C或T）或修饰的碱基（7-去氮鸟嘌呤核苷、肌苷等）。另外，只要不干扰杂交，探针中的碱基可以通过除了磷酸二酯键以外的键结合。本领域技术人员将理解基于杂交条件的严格性，探针可以结合对所述探针序列缺乏完全互补性的靶标序列。优选地，用同位素（例如，发色团、发光团、生色团）直接标记所述探针，或者用抗生蛋白链菌素复合物可以随后结合的生物素间接标记。通过测定探针是否存在，则可以检测所关心的靶标mRNA生物标志物是否存在。
术语“严格测定条件”是指与产生具有足够互补性的核酸结合对（例如，探针和靶标mRNA）相容从而在该测定中提供所需的特异性水平，同时一般对互补性不足的结合元件之间的结合对形成不相容以提供所需的特异性。术语严格测定条件一般是指杂交和清洗条件的组合。
与核酸有关的“标记物”或“可检测部分”是指当与核酸连接，使得所述核酸通过（例如）分光光度法、光化学法、生物化学法、免疫化学法或化学法可检测的组合物。示例性标记物包括（但不限于）放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体微粒、荧光染料、酶、生物素、地高辛配基、半抗原等。“标记的核酸或寡核苷酸探针”通常是通过接头或者化学键与标记物共价结合的，或者通过离子键、范德华力、静电引力、疏水性相互作用或氢键与标记物非共价结合的探针，从而可以通过检测与核酸或探针结合的标记物的存在性来检测核酸或探针的存在性。
如本文所使用的术语“聚合酶链反应”或“PCR”一般是指其中如（例如）授权于Mullis的美国专利No.4683195中所述，少量核酸、RNA和/或DNA被扩增的程序。通常，所关心的区域末端或以外的序列信息需要是可用的，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上将与待扩增模版的相对的链相同或相似。两条引物的5'末端核苷酸可以与扩增材料的末端一致。PCR可用于从总基因组DNA扩增特异的RNA序列、特异的DNA序列，和从总细胞RNA、噬菌体或质粒序列转录cDNA等。一般地参见Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich主编，PCRTechnology,(Stockton Press,NY,1989)。
当在本文中用于表示PCR方法时，术语“循环数”或“CT”是指荧光水平通过给定设置的阈值水平的PCR循环数。例如，CT测量可用于估计原始样品中mRNA的水平。当从另一种核酸的CT中减去一种核酸的CT时，CT测量通常以“dCT”或“CT差异”得分来使用。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“光学纯”是指包含化合物的一种光学异构体并且基本不含该化合物的另一种异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的化合物的光学纯组合物将基本不含该化合物相反的对映异构体。具有两个手性中心的化合物的光学纯组合物将基本不含该化合物的其他非对映体。典型的光学纯化合物包含大于约80wt%的所述化合物的一种对映异构体和小于约20wt%的所述化合物的其他对映异构体，更优选地大于约90wt%的所述化合物的一种对映异构体和小于约10wt%的所述化合物的其他对映异构体，更优选地大于约95wt%的所述化合物的一种对映异构体和小于约5wt%的所述化合物的其他对映异构体，更优选地大于约97wt%的所述化合物的一种对映异构体和小于约3wt%的所述化合物的其他对映异构体，并且最优选地大于约99wt%的所述化合物的一种对映异构体和小于约1wt%的所述化合物的其他对映异构体。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“可药用盐”涵盖了该术语所提及的化合物的无毒的酸和碱加成盐。可用的无毒酸加成盐包括来源于本领域中已知的有机和无机酸或碱的那些，包括（例如）盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲基磺酸、乙酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、山梨酸、乌头酸、水杨酸、邻苯二甲酸、扑酸、庚酸等。
性质为酸性的化合物能够与多种药物可用的碱形成盐。可用于制备这些酸性化合物的药物可用的碱加成盐的碱是形成无毒的碱加成盐的那些，即含有药理学可用的阳离子的盐，例如但不限于，碱金属或碱土金属盐，并且具体地，钙、镁、钠或钾盐。适合的有机碱包括但不限于N,N-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺（N-甲葡糖胺）、赖氨酸和普鲁卡因。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“溶剂化物”是指本文所提供的化合物或其盐，其进一步包含通过非共价分子间作用力结合的化学计量的或非化学计量量的溶剂。当溶剂为水时，所述溶剂化物为水合物。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“立体异构纯的”是指包含化合物的一个立体异构体并且基本不含该化合物的其他立体异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的化合物的立体异构纯的组合物将基本不含该化合物相反的对映异构体。具有两个手性中心的化合物的立体异构纯的组合物将基本不含该化合物的其他非对映体。典型的立体异构纯的化合物包含大于约80wt%的所述化合物的一个立体异构体和小于约20wt%的所述化合物的其他立体异构体，更优选地大于约90wt%的所述化合物的一个立体异构体和小于约10wt%的所述化合物的其他立体异构体，更优选地大于约95wt%的所述化合物的一个立体异构体和小于约5wt%的所述化合物的其他立体异构体，并且最优选地大于约97wt%的所述化合物的一个立体异构体和小于约3wt%的所述化合物的其他立体异构体。如本文所使用的并且除非另外说明，术语“立体异构富集的”是指含有大于约60wt%的该化合物的一种立体异构体，优选地大于约70wt%，更优选地大于约80wt%的该化合物的一种立体异构体的组合物。如本文所使用的并且除非另外说明，术语“对映体纯的”是指具有一个手性中心的化合物的立体异构纯的组合物。相似的，术语“立体异构富集的”是指具有一个手性中心的该化合物的立体异构富集的组合物。
如本文所使用的并且除非另外说明，术语“共晶体”是指在晶格中含有一种以上化合物的结晶形式。共晶体包括在晶格中通过非离子相互作用结合在一起的两种或更多种非挥发性化合物的晶体分子配合物。如本文所使用的，共晶体包括药物共晶体，其中晶体分子配合物含有治疗性化合物和一种或多种其他非挥发性化合物（本文中称为配位分子）。药物共晶体中的配位分子通常是无毒的药物可用分子，例如食品添加剂、防腐剂、药物赋形剂或其他API。在一些实施方式中，药物共晶体提高了药物产品的某些物理化学性质（例如，溶解度、溶解速率、生物利用率和/或稳定性），而不损害活性药物组分（API）的化学结构完整性。参见，例如，Jones等人，“Pharmaceutical Cocrystals:An Emerging Approach to Physical PropertyEnhancement,”MRS Bulletin,2006,31,875–879；Trask,“An Overview ofPharmaceutical Cocrystals as Intellectual Property,”Molecular Pharmaceutics,2007,4(3),301–309；Schultheiss&Newman,“Pharmaceutical Cocrystals andTheir Physicochemical Properties,”Crystal Growth&Design,2009,9(6),2950–2967；Shan&Zaworotko,“The Role of Cocrystals in PharmaceuticalScience,”Drug Discovery Today,2008,13(9/10),440–446；和Vishweshwar等人，“Pharmaceutical Co-Crystals,”J.Pharm.Sci.,2006,95(3),499–516。
生物学标志物或“生物标志物”是其检测表明特定生物状态（例如，癌症的存在）的物质。在一些实施方式中，可以单独确定生物标志物，或者可以同时测量几个生物标志物。
在一些实施方式中，“生物标志物”表明了可以与疾病风险或发展或者疾病对给定治疗的易感性相关联的mRNA表达水平的改变。在一些实施方式中，所述生物标志物是核酸，如mRNA或cDNA。
在其他实施方式中，“生物标志物”表明了可以与疾病的风险、对治疗的易感性或发展相关联的多肽或蛋白质表达水平的改变。在一些实施方式中，所述生物标志物可以是多肽或蛋白质，或其片段。可以通过本领域中已知的方法确定特定蛋白的相对水平。例如，可以使用基于抗体的方法，如免疫印迹法、酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他方法。
应注意如果所示的结构和名称给出的结构之间存在差异，则更看重所示的结构。另外，如果没有用（例如）黑体或下划线标出结构的立体化学或结构部分，则所述结构或所述结构部分应理解为涵盖其所有立体异构体。
除非另外指明，否则本文所提供的实施方式的实践将使用在本领域中使用的那些技术之内的分子生物学、微生物学和免疫学的常规方法。在文献中充分说明了这些技术。特别适合参考的教科书的实例包括：Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning;A Laboratory Manual（第2版）；D.N Glover主编，(1985)DNA Cloning，I和II卷；M.J.Gait主编，(1984)OligonucleotideSynthesis；B.D.Hames和SJ.Higgins主编，(1984)Nucleic Acid Hybridization；B.D.Hames和S.J.Higgins主编，(1984)Transcription and Translation；R.I.Freshney主编，(1986)Animal Cell Culture;Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Scopes(1987)Protein Purification:Principles andPractice（第2版，Springer Verlag,N.Y.）；和D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，(1986)Handbook of Experimental Immunology,I-IV卷。
5.2临床试验终点
将“总体存活率”定义为从无规则分布获得的直至由任何原因所导致的死亡的时间，并且是在意图治疗的群体中测量的。应在随机对照研究中评价总体存活率。如果毒性谱图是可接受的并且通常支持新药批准，则可以认为整体存活率中统计学显著的改善的证明是临床上有意义的。
几种终点是以癌症评价为基础的。这些终点包括无病存活率（DFS）、客观反应率（ORR）、进展时间（TTP）、无进展存活率（PFS）和治疗失败时间（TTF）。与这些时间依赖性终点有关的数据的采集和分析是基于间接评价、计算和估计（例如，肿瘤测量）的。
通常，“无病存活率”（DFS）定义为从无规则分布获得的直至癌症复发或由任何原因所导致的死亡的时间。尽管整体存活率是大部分佐剂环境的常规终点，但是在可以延长存活率从而使存活期终点不实际的情况下，DFS可以是重要的终点。DFS可以是临床益处的替代或者它可以提供临床益处的直接证据。这种确定是基于效果的大小，其风险-益处关系和疾病环境。DFS的定义可以是复杂的，特别是在无先前癌症发展记录的情况下观察到死亡时。这些事件可以作为疾病复发或者作为审查事件来打分。尽管所有死亡的统计分析方法具有某些限制，但是将所有死亡（由所有原因导致的死亡）作为复发考虑可以最大程度降低偏倚。使用该定义可以过高估计DFS，特别是在长期未观察的死亡患者中。如果研究分组间长期随访的频率不同或者如果中途退出不是由于毒性所造成的随机的，则可以引入偏倚。
“客观反应率”（ORR）的定义是具有预定量癌症减轻并且对于最短时间段的患者的比例。反应时间通常是从初始反应时间直至所记录的癌症发展来测量的。通常，FDA定义的ORR为部分反应加完全反应之和。当以这种方式定义时，ORR是药物抗癌活性的直接测量，它可以在单一分组研究中评价。如果可用，则标准化标准应用于确定反应。已认为多种反应标准是合适的（例如，RECIST标准）（Therasse等人，(2000)J.Natl.Cancer Inst,92:205-16）。通过其大小和时间以及完全反应的百分比来评价ORR的显著性（无可检测的癌症迹象）。
“进展时间”（TTP）和“无进展存活期”（PFS）已用作药物批准的主要终点。TTP的定义为从无规则分布获得的直至目标癌症发展的时间；TTP不包括死亡。PFS的定义为从无规则分布获得的直至目标癌症发展或死亡的时间。与TTP相比，PFS是优选的控制终点。PFS包括死亡并因此可以更好地与整体存活期关联。PFS假定患者死亡与癌症发展是随机相关的。然而，在大部分死亡与癌症无关的情况下，TTP可以是可接受的终点。
作为支持药物批准的终点，PFS可以反映癌症生长并且可以在确定存活期益处之前评价。它的确定不受后续疗法的混淆。对于给定样本大小，对PFS影响的大小可以大于对整体存活期的影响。然而，PFS的正规验证作为所存在的多种不同恶性肿瘤的存活期的替代可以是困难的。有时，数据不足以在对存活期和PFS的影响之间建立稳健的相关性评价。癌症试验通常是小规模的，并且现有药物已证明的存活期益处通常是适度的。在不同癌症背景中，PFS作为支持许可证批准的终点的作用是不同的。PFS的改善是代表直接临床益处还是临床益处的替代取决于与可用的疗法相比，新的治疗作用的大小以及风险-益处。
“治疗失败时间”（TTF）的定义为测量从无规则分布到由于任何原因的治疗停止的时间的复合终点，所述原因包括疾病发展、治疗毒性和死亡。不建议TTF作为药物批准的控制终点。TTF不足以将效力与这些其他变量相区分。控制终点应明确区分药物效力与毒性、患者或医生的退出或患者的不耐性。
5.3第二活性剂
在本文所提供的方法和组合物中，本文所提供的化合物可以与其他药理学活性化合物(“第二活性剂”）结合使用。据信某些组合可以在治疗特定类型的癌症和与不希望的血管生成和/或炎症相关或以其为特征的某些疾病和病况中起协同作用。本文所提供的化合物还可以起作用以缓解与某些第二活性剂有关的副作用，并且一些第二活性剂可用于缓解与本文所提供的化合物有关的副作用。
一种或多种第二活性成分或试剂可以与本文所提供的化合物一起在本文所提供的方法和组合物中使用。第二活性剂可以是大分子（例如，蛋白质）或小分子（例如，合成的无机、有机金属或有机分子）。
大分子活性剂的实例包括但不限于造血生长因子、细胞因子以及单克隆抗体和多克隆抗体。在某些实施方式中，大分子活性剂为生物分子，如天然存在的或人工制备的蛋白质。在本发明公开中特别有用的蛋白包括能在体外或体内刺激造血前体细胞和免疫活性造血细胞的存活和/或增殖的蛋白质。其他蛋白在体外或体内刺激定向红系祖细胞分裂和分化。具体的蛋白质包括，但不限于：白细胞介素，如IL-2（包括重组IL-II（“rIL2”）和金丝雀痘IL-2）、IL-10、IL-12和IL-18；干扰素，如干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia和干扰素γ-Ib；GM-CF和GM-CSF；和EPO。
可用于本发明的方法和组合物的具体蛋白质包括（但不限于）在美国以商品名
Figure BDA0000450181650000391
（Amgen,Thousand Oaks,CA）出售的非格司亭；在美国以商品名
Figure BDA0000450181650000392
（Immunex,Seattle,WA）出售的沙莫司亭；以及在美国以商品名
Figure BDA0000450181650000393
（Amgen,Thousand Oaks,CA）出售的重组EPO。
重组和突变形式的GM-CSF可根据美国专利No.5391485；5393870；和5229496的记载而制备；以上每篇专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。重组和突变形式的G-CSF可根据美国专利No.4810643；4999291；5528823；和5580755的记载而制备；以上每篇专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。
本发明涵盖了原生的、天然产生的和重组的蛋白质的使用。本发明还涵盖了天然产生的蛋白质的突变体以及衍生物（例如，修饰型），这些突变体在体内至少具有突变源蛋白质的一些药理学活性。突变体的实例包括，但不限于，具有一个或多个与天然产生型蛋白质的相应残基不同的氨基酸残基的蛋白质。术语“突变型”还涵盖了缺少碳水化物部分的蛋白质，而该部分在天然产生型（例如，非糖基化型）中通常是存在的。衍生物的实例包括，但不限于，PEG化的衍生物和融合蛋白，如通过向所关心的蛋白或蛋白的活性部分融合IgGl或IgG3形成的蛋白质。参见，例如，Penichet,M.L.和Morrison,S.L.,J.Immunol.Methods248:91-101(2001)。
可用于与本文所提供的式I所表示的化合物相结合的抗体包括单克隆和多克隆抗体。抗体的实例包括（但不限于）曲妥珠单抗
Figure BDA0000450181650000394
美罗华贝伐单抗（AVASTINTM）、pertuzumab（OMNITARGTM）、托西莫单抗
Figure BDA0000450181650000396
依决洛单抗
Figure BDA0000450181650000397
帕尼单抗和G250。本文所提供的式I所表示的化合物还可以与抗-TNF-α抗体相结合或结合使用。
大分子活性剂可以抗癌疫苗的形式施用。例如，分泌或引起细胞因子（如IL-2、SCF、CXCl4（血小板因子4）、G-CSF和GM-CSF）分泌的疫苗可用于本发明的方法、药物组合物和试剂盒。参见，例如，Emens,L.A.等人,Curr.Opinion Mol.Ther.3(1):77-84(2001)。
小分子第二活性剂还可以用于减轻与本文所提供的式I所表示的化合物的施用有关的副作用。然而，像一些大分子一样，当与式I所表示的化合物（例如，之前、之后或同时）施用时，认为多种小分子活性剂能够提供协同作用。小分子第二活性剂的实例包括，但不限于，抗癌试剂、抗生素、免疫抑制剂和类固醇。
抗癌试剂的实例包括，但不限于，阿伯利斯（abraxane）、ace-11、阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑盐酸盐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌乙酸盐；氨柔比星；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；比生群盐酸盐；双奈法德二甲磺酸盐；比折来新；博来霉素硫酸盐；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；卡柔比星盐酸盐；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔（COX-2抑制剂）；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克立那托甲磺酸盐；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；柔红霉素盐酸盐；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；地扎胍宁甲磺酸盐；地吖醌；多西他赛；多柔比星；多柔比星盐酸盐；屈洛昔芬；屈洛昔芬柠檬酸盐；屈他雄酮丙酸盐；达佐霉素；依达曲沙；依氟鸟氨酸盐酸盐；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；表柔比星盐酸盐；厄布洛唑；依索比星盐酸盐；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷磷酸盐；氯苯乙嘧胺；法倔唑盐酸盐；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；氟达拉滨磷酸盐；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；吉西他滨盐酸盐；赫赛汀；羟基脲；伊达比星盐酸盐；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；伊立替康盐酸盐；兰瑞肽乙酸盐；拉帕替尼；来曲唑；亮脯利特乙酸盐；利阿唑盐酸盐；洛美曲索钠；洛莫司汀；洛索蒽醌盐酸盐；马索罗酚；美登素；氮芥盐酸盐；甲地孕酮；十六次甲基甲地孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；草绿霉素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌盐酸盐；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；培洛霉素硫酸盐；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡罗蒽醌盐酸盐；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸甲基下肼；嘌罗霉素；嘌罗霉素盐酸盐；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗米地辛（romidepsin）；沙芬戈；沙芬戈盐酸盐；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；锗螺胺盐酸盐；螺莫司汀；螺铂；干细胞治疗剂，如PDA-001；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；泰索帝；替加氟；替洛蒽醌盐酸盐；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫唑嘌呤胺；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；托瑞米芬柠檬酸盐；曲托龙乙酸盐；曲西立滨磷酸盐；三甲曲沙；三甲曲沙葡萄糖醛酸盐；曲普瑞林；妥布氯唑盐酸盐；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸醛基长春碱；长春地辛；长春地辛硫酸盐；长春匹定硫酸盐；长春甘酯硫酸盐；长春罗新硫酸盐；长春瑞滨酒石酸盐；长春罗定硫酸盐；长春利定硫酸盐；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；和佐柔比星盐酸盐。
其他抗癌药包括但不限于：20-表-1,25-二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；3,4-二羟基苄胺肟（amidox）；氨磷汀；氨基-γ-酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯（antarelix）；抗背侧形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素物质；抗瘤酮；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸盐；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；无嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司琼；阿扎毒素；氮杂酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰星孢菌素；β内酰胺衍生物；β-alethine；β-clamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫堇；卡泊三醇；卡弗他丁C；喜树碱衍生物；卡培他滨；氨甲酰基氨基三唑；羧酰氨三唑；CaRest M3；CARN700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂（ICOS）；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；绿素类（chlorlns）；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式-卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他丁A4；考布他丁类似物；conagenin；crambescidin816；克立那托；cryptophycin8；cryptophycin A衍生物；curacin A；环戊烯蒽醌（cyclopentanthraquinone）；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸盐；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱水代代宁B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；3，4-二羟荃苯并氧肟酸（didox）；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮胞苷；9-二氢紫杉醇；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌毒素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin盐酸盐；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德克萨卟啉钆；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼
Figure BDA0000450181650000421
咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N三醋酯盐；兰瑞肽；雷拉霉素（leinamycin）；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮脯利特+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；德克萨卟啉镥；利索茶碱；裂解肽；美坦新；制甘糖酶素A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素（mitotoxin）成纤维细胞生长因子-肥皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；爱必妥，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰酯A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；芥末抗癌剂；印度洋海绵B（mycaperoxide B）；分支杆菌细胞壁萃取；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；奥利默森
Figure BDA0000450181650000422
O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口腔细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；副球菌素；帕折普汀；培门冬酶；培得星；木聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；帕斯婷A；帕斯婷B；纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙酯化血红蛋白聚氧乙烯结合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化的瑞替普汀；羟乙二磷酸铼Re186；根霉素；核糖酶；RII视黄酰胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi1模拟物；司莫司汀；衰老源抑制剂1（senescence derived inhibitor1）；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；solverol；促生长因子结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D；螺莫司汀；脾脏五肽；海绵抑制素1；角鲨胺；stipiamide；基质降解酶抑制剂；sulfinosine；超强血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆碱；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；未端酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；十氧化四氯（tetrachlorodecaoxide）；tetrazomine；菌体胚素；噻可拉林；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；topsentin；托瑞米芬；转化抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿甙（triacetyluridine）；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸蛋白激酶抑制剂（tyrphostins）；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；维拉雷琐；藜芦明；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；整合素拮抗剂（Vitaxin）；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯。
具体的第二活性剂包括，但不限于，oblimersen
Figure BDA0000450181650000431
remicade、多西他赛、塞来昔布、美法仑、地塞米松
Figure BDA0000450181650000432
类固醇、吉西他滨、顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、环磷酰胺、替莫唑胺、卡铂、丙卡巴胼、卡莫斯汀、他莫昔芬、拓普替康、甲氨喋呤、
Figure BDA0000450181650000433
紫杉醇、泰索帝、氟尿嘧啶、亚叶酸、依立替康、希罗达、CPT-11、干扰素α、PEG化的干扰素α（例如，PEG INTRON-A）、卡培他滨、顺铂、塞替派、氟达拉滨、卡铂、脂质体柔红霉素、阿糖胞苷、多西紫杉醇（doxetaxol）、紫杉醇（pacilitaxel）、长春碱、IL-2、GM-CSF、达卡巴嗪、长春瑞滨、唑来磷酸、palmitronate、biaxin、白消安、泼尼松、双磷酸酯、三氧化二砷、长春新碱、多柔比星紫杉醇、更昔洛韦、多柔比星、雌莫司汀磷酸钠舒林酸和依托泊苷。
5.4治疗和预防的方法
在一种实施方式中，本文提供了治疗和预防癌症的方法，其包括向患者施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。
在另一种实施方式中，本文提供了控制癌症的方法，其包括向患者施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。
本文还提供了治疗先前已治疗了癌症但对标准疗法不起反应的患者以及先前未治疗的患者的方法。本发明还涵盖了不考虑患者年龄来治疗患者的方法，尽管一些疾病或病症在某些年龄组中更常见。本发明还涵盖了治疗已进行手术以尝试治疗有争论的疾病或病况的患者以及未进行手术的患者的方法。由于癌症患者具有不同的临床表现和不同的临床结果，因此基于他的预后，给予患者的治疗可以是不同的。熟练的临床医师将能够容易地确定可以有效地用于治疗个体癌症患者的具体的第二试剂、手术类型和非基于药物的标准疗法的类型而无需过度的实验。
在另一种实施方式中，本文提供了治疗、控制或预防除癌症之外的疾病和病症的方法，所述癌症与不希望的血管生成有关或以不希望的血管生成为特征，其包括向患者施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。
如本文所使用的，术语“癌症”包括但不限于，实体瘤和血液传播肿瘤。术语“癌症”是指皮肤组织、器官、血液和脉管的疾病，这些疾病包括（但不限于）膀胱癌、骨癌、血癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胸癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头癌、肾癌、肝癌、淋巴结癌、肺癌、口腔癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌和子宫癌。具体的癌症包括但不限于，晚期恶性肿瘤、淀粉样病变、神经母细胞瘤、脑（脊）膜瘤、血管外皮细胞瘤、多发性脑转移肿瘤（multiple brainmetastase）、多形性成神经胶质细胞瘤、成神经胶质细胞瘤、脑干神经胶质瘤、预后不良恶性脑肿瘤、恶性神经胶质瘤、再发性恶性神经胶质瘤、退行发育性星形细胞瘤、退行发育性少突神经胶质瘤、神经内分泌肿瘤、直肠腺癌、Dukes C期和D期结肠直肠癌、不可切除直肠结肠癌、转移性肝细胞癌、卡波氏肉瘤、karo型急性成髓细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、表皮T-细胞淋巴瘤、表皮B-细胞淋巴瘤、弥散性大B-细胞淋巴瘤、低级恶性囊泡淋巴瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、恶性胸膜渗漏间皮瘤综合征、腹膜癌、乳头状浆液性癌、妇科肉瘤、软组织肉瘤、硬皮病、表皮脉管炎、郎格罕细胞组织细胞增生症、平滑肌肉瘤、进行性骨化性纤维发育不良、耐激素性前列腺癌、可切除的高危软组织肉瘤、不可切除的肝细胞癌、Waldenstrom's巨球蛋白血症、郁积型骨髓瘤、无痛性骨髓瘤、输卵管癌、非雄激素依赖性前列腺癌、雄激素依赖型IV期非转移性前列腺癌、激素-非敏感性前列腺癌、化疗-非敏感性前列腺癌、乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌以及平滑肌瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是血液传播肿瘤。在某些实施方式中，所述血液传播肿瘤是转移性的。在某些实施方式中，所述血液传播肿瘤是抗药性的。在某些实施方式中，所述癌症是骨髓瘤或淋巴瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是实体瘤。在某些实施方式中，所述实体瘤是转移性的。在某些实施方式中，所述实体瘤是抗药性的。在某些实施方式中，所述实体瘤是肝细胞癌、前列腺癌、卵巢癌或成胶质细胞瘤。
如本文用于表示除癌症之外的疾病和病况的术语“与不希望的血管生成有关或以不希望的血管生成为特征的疾病或病症”、“与不希望的血管生成有关的疾病或病症”和“以不希望的血管生成为特征的疾病或病症”表示导致、介导或伴有不希望的、不想要的或不受控制的血管生成的疾病、病症和病况，包括但不限于，炎性疾病、自身免疫疾病、遗传性疾病、过敏性疾病、细菌性疾病、眼睛新生血管性疾病、脉络膜新生血管性疾病和视网膜新生血管性疾病。
与不希望的血管生成有关的这些疾病或病症的实例包括但不限于，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、新生血管型青光眼、晶状体后纤维组织形成、增殖性玻璃体视网膜病变、沙眼、近视、视凹、流行性角膜结膜炎、特应性角膜炎、上边缘角膜炎、干燥性翼状裔肉角膜炎、舍格伦病、玫瑰痤疮、小水疱病、梅毒、脂质变性、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、莫伦溃疡、Terrien角膜边缘性变性、边缘性角质分离、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、创伤、韦格纳结节病、巩膜炎、史-约病、类天疱疮放射状角膜切开术、镰刀形红细胞贫血病、结节病、弹性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、莱姆病、伊尔斯病、贝切特氏病、视网膜炎、脉络膜炎、假定的眼组织胞浆菌病、贝斯特病、斯达加特病、睫状体平坦部炎、慢性视网膜脱落、高粘滞综合征、弓形体病、虹膜发红、结节病、硬化症、soriatis、牛皮癣、原发性硬化性胆管炎、直肠炎、原发性胆汁性肝硬化（primary biliarysrosis）、特发性肺纤维化和酒精性肝炎。
在某些实施方式中，化合物的治疗或预防有效量是约0.005至约1000mg/天，约0.01至约500mg/天，约0.01至约250mg/天，约0.01至约100mg/天，约0.1至约100mg/天，约0.5至约100mg/天，约1至约100mg/天，约0.01至约50mg/天，约0.1至约50mg/天，约0.5至约50mg/天，约1至约50mg/天，约0.02至约25mg/天或约0.05至约10mg/天。
在某些实施方式中，治疗或预防有效量是约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约150mg/天。
在一种实施方式中，对于本文所述的病况所述化合物的建议日剂量范围在每天约0.5mg至约50mg的范围内，其作为单一每天一次的剂量施用，或分为几个剂量在一天内施用。在一些实施方式中，所述剂量范围从每天约1mg至约50mg。在其他实施方式中，所述剂量范围从每天约0.5至约5mg。每天具体的剂量包括每天0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg。在其他实施方式中，每天具体的剂量包括每天0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或4mg。
在具体的实施方式中，建议的起始剂量可以是每天0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、10、15、20、25或50mg。在另一种实施方式中，建议的起始剂量可以是每天0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或4mg。所述剂量可以逐步升高至15、20、25、30、35、40、45和50mg/天。在具体的实施方式中，可以向癌症患者施用约25mg/天的量的化合物。在具体的实施方式中，可以向癌症患者施用约10mg/天的量的化合物。
在某些实施方式中，治疗或预防有效量是约0.001至约100mg/kg/天，约0.01至约50mg/kg/天，约0.01至约25mg/kg/天，约0.01至约10mg/kg/天，约0.01至约9mg/kg/天，0.01至约8mg/kg/天，约0.01至约7mg/kg/天，约0.01至约6mg/kg/天，约0.01至约5mg/kg/天，约0.01至约4mg/kg/天，约0.01至约3mg/kg/天，约0.01至约2mg/kg/天或约0.01至约1mg/kg/天。
施用剂量还可以表示为除mg/kg/天之外的单位。例如，肠胃外施用的剂量可以表示为mg/m2/天。本领域的技术人员将容易地知道如何将剂量从mg/kg/天转化为对于给定的受试者高度或体重或两者的mg/m2/天（参见，www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm）。例如，对于65kg的人，1mg/kg/天的剂量近似等于38mg/m2/天。
在某些实施方式中，所施用的化合物的量足以提供处于稳态的化合物的血浆浓度，所述浓度的范围为约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM或约1至约20μM。
在其他实施方式中，所施用的化合物的量足以提供处于稳态的化合物的血浆浓度，所述浓度的范围为约5至约100nM、约5至约50nM、约10至约100nM、约10至约50nM或约50至约100nM.
如本文所使用的，术语“处于稳态的血浆浓度”是在本文所提供的化合物施用一段时间之后所达到的浓度，所述化合物例如式I所表示的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。一旦达到稳态，在化合物血浆浓度与时间有关的曲线上存在较少的峰值和谷值。
在某些实施方式中，所施用的化合物的量足以提供化合物的最大血浆浓度（峰值浓度），所述浓度的范围为约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM或约1至约20μM。
在某些实施方式中，所施用的化合物的量足以提供化合物的最小血浆浓度（谷值浓度），所述浓度的范围为约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.01至约25μM、约0.01至约20μM、约0.02至约20μM、约0.02至约20μM或约0.01至约20μM。
在某些实施方式中，所施用的化合物的量足以提供以下范围的化合物的曲线下面积（AUC），所述范围为约100至约100,000ng*hr/mL、约1,000至约500,00ng*hr/mL、约5,000至约25,000ng*hr/mL或约5,000至约100,00ng*hr/mL。
在某些实施方式中，要使用本文所提供的方法之一治疗的患者在施用所述药物之前未用抗癌疗法治疗。在某些实施方式中，要使用本文所提供的方法之一治疗的患者在施用所述药物之前已用抗癌疗法治疗。在某些实施方式中，使用本文所提供的方法之一治疗的患者对抗癌疗法发展出耐药性。
本文所提供的方法涵盖了不考虑患者年龄来治疗患者，尽管一些疾病或病症在某些年龄组中更常见。本文还提供了治疗已进行手术以尝试治疗有争论的疾病或病况的患者以及未进行手术的患者的方法。由于癌症受试者具有不同的临床表现和不同的临床结果，因此基于他的预后，给予特定受试者的治疗可以是不同的。熟练的临床医师将能够容易地确定可以有效地用于治疗个体癌症受试者的具体的第二试剂、手术类型和非药物基标准疗法的类型而无需过度的实验。
基于待治疗的疾病和受试者的情况，可以通过口服、肠胃外（例如，肌内、腹膜内、静脉内、CIV、脑池内注射或输注、皮下注射或植入）、吸入、鼻部、阴道、直肠、舌下或局部（例如，透皮或局部）施用途径施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。可以单独配制所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，或者可以以适合的剂量单位与适合于每种施用途径的药物可用的赋形剂、载体、佐剂和载体一起配制。
在一种实施方式中，口服施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。在另一种实施方式中，肠胃外施用所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。在另一种实施方式中，静脉内施用所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。
所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物可以作为单一剂量递送，如单一推注剂或口服片剂或丸剂；或随时间递送，如（例如）随时间连续输注或随时间分为弹丸剂量。如有必要，可以反复施用所述化合物，例如，直至患者病情稳定或疾病消退，或直至患者疾病发展或经受不可接受的毒性。例如，实体瘤稳定的病情一般是指与上次测量相比，可测量病变的垂直直径增加不到25%或以上。实体瘤反应评价标准（RECIST）指南（ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST)Guidelines），Journal of theNational Cancer Institute92(3):205-216(2000)。
通过本领域中已知的方法确定稳定的疾病或缺少稳定的疾病，所述方法如患者症状评价、身体检查、已使用X射线、CAT、PET或MRI扫描成像的肿瘤显象以及其他通常接受的评价方式。
所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物可以每天施用一次（QD），或者每天分成多个剂量，如每天两次（BID）、每天三次（TID）和每天四次（QID）。另外，所述施用可以是连续的（即，连续日每日施用或者每日施用）、间歇的，例如，循环施用（即包括不施用药物停止数天、数周或数月）。如本文所使用的，术语“每天”旨在表示每天施用治疗性化合物一次或一次以上，并施用（例如）一段时间。术语“连续”旨在表示每天施用治疗性化合物，并施用至少10天至52周的不间断的一段时间。如本文所使用的术语“间歇的”或“间歇地”旨在表示以规则或不规则的间隔停止和开始。例如，化合物的间歇施用是每周施用1至6天，循环施用（例如，每天施用，连续施用2至8周，然后是停止期，不施用多至一周），或者隔日施用。如本文所使用的术语“循环”旨在表示每天或连续施用治疗性化合物，但是有停止期。
在一些实施方式中，施用频率在约每日剂量至约每月剂量的范围内。在某些实施方式中，施用是每天一次，每天两次，每天三次，每天四次，每隔一天一次，每周两次，每周一次，每两周一次，每三周一次或每四周一次。在一种实施方式中，每天施用一次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。在另一种实施方式中，每天施用两次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。在另一种实施方式中，每天施用三次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。在另一种实施方式中，每天施用四次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其药物仍用的盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。
在某些实施方式中，每天施用一次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，施用一天至六个月，一周至三个月，一周至四周，一周至三周或一周至两周。在某些实施方式中，每天施用一次所述化合物，或其可药用盐或溶剂化物，施用一周、两周、三周或四周。在一种实施方式中，每天施用一次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，施用一周。在另一种实施方式中，每天施用一次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，施用两周。在另一种实施方式中，每天施用一次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，施用三周。在另一种实施方式中，每天施用一次所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其药物仍用的盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，施用四周。
5.5与第二活性剂的组合疗法
本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物还可以与在本文所述的疾病的治疗和/或预防中有用的其他治疗剂混合或组合使用。
在一种实施方式中，本文提供了治疗、预防或控制癌症的方法，其包括结合一种或多种第二活性剂并且任选地结合放射疗法、输血或手术，向患者施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物；或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。本文公开了第二活性剂的实例（参见，例如，5.3节）。
如本文所使用的，术语“结合”包括不止一种疗法（例如，一种或多种预防剂和/或治疗剂）的使用。然而，术语“结合”的使用不限制向患有疾病或病症的患者施用疗法（例如，预防剂和/或治疗剂）的顺序。可以在向受试者施用第二疗法（例如，预防剂或治疗剂）之前（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1星期、2星期、3星期、4星期、5星期、6星期、8星期或12星期），与所述第二疗法一起或者在施用所述第二疗法之后（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1星期、2星期、3星期、4星期、5星期、6星期、8星期或12星期），施用第一疗法（例如，预防剂或治疗剂，如本文所提供的化合物，本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物）。本文还考虑了三重疗法。
所述化合物和一种或多种第二活性剂向患者的施用可以同时进行或者通过相同或不同的施用途径顺序进行。用于特定活性剂的特定施用途径的适合性将取决于活性剂本身（例如，它是否可以口服施用而不会在进入血流之前分解）和待治疗的癌症。
所述化合物的施用途径与第二疗法的施用途径无关。在一种实施方式中，口服施用所述化合物。在另一种实施方式中，静脉内施用所述化合物。因此，根据这些实施方式，口服或静脉内施用所述化合物，并且可以口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌内、直肠、经口含化、鼻内、脂质体、通过吸入法、阴道、眼内、通过导管或支架的局部递送、皮下、脂肪内、关节内、鞘内或以缓释剂量形式施用所述第二疗法。在一种实施方式中，通过相同施用方式（口服或通过IV）施用所述化合物和第二疗法。在另一种实施方式中，通过一种施用方式（例如，通过IV）施用所述化合物，而通过另一种施用方式（例如，口服）施用第二试剂（抗癌剂）。
在一种实施方式中，以约1至约1000mg，约5至约500mg，约10至约350mg或约50至约200mg的量静脉内或皮下施用第二活性剂，每天施用一次或两次。第二活性剂的具体的量将取决于所使用的具体试剂、待治疗或控制的疾病类型、疾病的严重程度和阶段以及本文所提供的药物的量和同时施用给患者的任何任选的其他活性剂。在某些实施方式中，所述第二活性剂是奥利默森
Figure BDA0000450181650000511
GM-CSF、G-CSF、SCF、EPO、泰索帝、伊立替康、达卡巴嗪、反式视黄酸、拓扑替康、己酮可可碱、环丙沙星、地塞米松、长春新碱、多柔比星、COX-2抑制剂、IL2、IL8、IL18、IFN、阿糖胞苷、长春瑞滨或它们的组合。
在某些实施方式中，在4周或6周循环中在约5天内，以约1至约750mg/m2/天，约25至约500mg/m2/天，约50至约250mg/m2/天或约50至约200mg/m2/天的量皮下施用GM-CSF、G-CSF、SCF或EPO。在某些实施方式中，可以以约60至约500mcg/m2的量在2小时内静脉内施用GM-CSF，或者以约5至约12mcg/m2/天的量皮下施用。在某些实施方式中，可以开始以约1mcg/kg/天的量皮下施用G-CSF，然后可以根据粒性白细胞总数的升高进行调节。可以以约300（在较小的患者中）或480mcg的量皮下施用维持剂量的G-CSF。在某些实施方式中，可以以10,000单位的量每周皮下施用EPO三次。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与美法仑和地塞米松一起施用于淀粉样变性患者。在某些实施方式中，可以将本文所提供的化合物，例如，式I所表示的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与类固醇一起施用于淀粉样变性患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与吉西他滨和顺铂一起施用于患局部晚期或转移性移行细胞膀胱癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与如下所示的第二活性成分结合施用：与替莫唑胺结合施用于患有复发性或进行性脑肿瘤或复发性神经母细胞瘤的儿童患者；与塞来昔布、依托泊苷和环磷酰胺结合施用于患有复发性或进行性CNS癌症的患者；与temodar结合施用于患有复发性或进行性脑(脊)膜瘤、恶性脑(脊)膜瘤、血管外皮细胞瘤、多发性脑转移、复发性脑肿瘤或新诊断的多形性胶质母细胞瘤的患者；与依立替康结合施用于患有复发性胶质母细胞瘤的患者；与卡铂结合施用于患有脑干神经胶质瘤的儿童患者；与丙卡巴肼结合施用于患有进行性恶性神经胶质瘤的儿童患者；与环磷酰胺结合施用于患有预后不良恶性脑肿瘤、新诊断的或复发的多形性胶质母细胞瘤的患者；与
Figure BDA0000450181650000521
结合施用于患有高度复发性恶性神经胶质瘤的患者；与替莫唑胺和他莫昔芬结合施用于患有退行发育性星形细胞瘤的患者；或与拓普替康结合施用于患有神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、退行发育性星形细胞瘤或退行发育性少突神经胶质瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与甲氨蝶呤、环磷酰胺、紫杉烷、abraxane、拉帕替尼、赫赛汀、芳香酶抑制剂、选择性雌激素调节剂、雌激素受体拮抗剂和/或PLX3397（Plexxikon）结合施用于患有转移性乳腺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与替莫唑胺一起施用于患有神经内分泌肿瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与吉西他滨一起施用于患有复发性或转移性头颈部癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与吉西他滨一起施用于患有胰癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与
Figure BDA0000450181650000522
阿瓦斯丁、红豆杉醇和/或泰索帝一起施用于患有结肠癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与卡培他滨和/或PLX4032（Plexxikon）一起施用于患有难治性结肠直肠癌的患者、或在一线疗法中失败的患者、或在结肠或直肠腺癌中表现较差的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与氟尿嘧啶、亚叶酸和伊立替康一起施用于患有Dukes C期和D期结肠直肠癌的患者或之前进行过转移性结肠直肠癌治疗的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与卡培他滨、希罗达和/或CPT-11一起施用于患有难治性结肠直肠癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与卡培他滨和伊立替康一起施用于患有难治性结肠直肠癌的患者或患有不可切除性或转移性结肠直肠癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物单独或与干扰素α或卡培他滨一起施用于患有不可切除性或转移性肝细胞癌的患者；或者与顺铂和塞替派一起施用于患有原发性或转移性肝癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与聚乙二醇化的干扰素α一起施用于患有卡波西肉瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与氟达拉滨、卡铂和/或拓扑替康一起施用于患有难治性或复发性或高危性急性骨髓性白血病的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与脂质体柔红霉素、拓扑替康和/或阿糖胞苷一起施用于患有不利的karo型急性成髓细胞白血病的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与吉西他滨、abraxane、厄洛替尼、吉非替尼和/或伊立替康一起施用于患有非-小细胞肺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与卡铂和伊立替康结合施用于患有非-小细胞肺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与多西他赛一起施用于患有非-小细胞肺癌并且之前用carbo/VP16和放射疗法进行治疗的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与卡铂和/或泰索帝结合或与卡铂、紫杉醇（pacilitaxel）和/或胸部放射疗法结合施用于患有非-小细胞肺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与泰索帝结合施用于患有IIIB或IV期非-小细胞肺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与奥利默森
Figure BDA0000450181650000541
结合施用于患有小细胞肺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，例如式I所表示的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与ABT-737（Abbott Laboratories）和/或obatoclax（GX15-070）结合施用于患有淋巴瘤及其他血癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物单独或与第二活性成分（如长春碱或氟达拉滨）结合施用于患有多种类型的淋巴瘤的患者，所述淋巴瘤包括，但不限于，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、皮肤B-细胞淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤或者复发性或难治性低级别滤泡性淋巴瘤。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与泰索帝、IL-2、IFN、GM-CSF、PLX4032（Plexxikon）和/或达卡巴嗪结合施用于患有多种类型或阶段的黑素瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物单独或与长春瑞滨结合施用于患有恶性间皮瘤、或含胸膜移植物的IIIB期非-小细胞肺癌或恶性胸膜渗漏间皮瘤综合征的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与地塞米松、唑来膦酸、palmitronate、GM-CSF、biaxin、长春碱、美法仑、白消安、环磷酰胺、IFN、帕米膦酸（palmidronate）、泼尼松、双磷酸盐类（bisphosphonate）、塞来考昔、三氧化二砷、PEG INTRON-A、长春新碱或它们的组合结合施用于患有多种类型或阶段的多发性骨髓瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与多柔比星长春新碱和/或地塞米松
Figure BDA0000450181650000552
结合施用于患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与红豆杉醇、卡铂、多柔比星、吉西他滨、顺铂、希罗达、紫杉醇、地塞米松或它们的组合结合施用于患有多种类型或阶段的卵巢癌（如腹膜癌、乳头状浆液性癌、难治性卵巢癌或复发性卵巢癌）的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与希罗达、5FU/LV、吉西他滨、伊立替康加吉西他滨、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松、GM-CSF、塞来考昔、泰索帝、更昔洛韦、紫杉醇、多柔比星、多西他赛、雌莫司汀、Emcyt、denderon或它们的组合结合施用于患有多种类型或阶段的前列腺癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与卡培他滨、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF、
Figure BDA0000450181650000553
或它们的组合结合施用于患有多种类型或阶段的肾细胞癌的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与IFN、COX-2抑制剂
Figure BDA0000450181650000554
和/或舒林酸结合施用于患有多种类型或阶段的妇科、子宫或软组织肉瘤癌症的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与celebrex、依托泊苷、环磷酰胺、多西他赛、apecitabine、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF或它们的组合结合施用于患有多种类型或阶段的实体瘤的患者。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与celebrex、依托泊苷、环磷酰胺、多西他赛、apecitabine、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF或它们的组合结合施用于患有硬皮病或皮肤血管炎的患者。
本文还涵盖了增加抗癌药物或试剂的剂量的方法，该试剂或药物可安全有效的向患者施用，该方法包括向患者（例如，人）施用或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物。可以从此方法中受益的患者是那些可能遭受副作用的患者，这些患者的副作用是与治疗特定的皮肤癌、皮下组织癌、淋巴结癌、脑癌、肺癌、肝癌、骨癌、肠癌、结肠癌、心脏癌、胰脏癌、肾上腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌或它们的组合的抗癌药物有关的。施用本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物能减缓或减轻严重的副作用，所述副作用是如此严重以致限制了抗癌药物的用量。
在一种实施方式中，本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物以约0.1至约150mg、约1至约50mg或约2至约25mg的量在与施用抗癌药物有关的副作用发生之前、期间或之后每天口服施用于患者。在某些实施方式中，本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与具体的试剂（如肝素、阿司匹林、苄丙酮香豆素钠或G-CSF）结合施用，以避免与抗癌药物有关的副作用，例如但不限于，中性粒细胞减少或血小板减少。
在一种实施方式中，本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与其他活性成分（其包括但不限于抗癌药、抗炎剂、抗组胺药、抗生素和类固醇）结合施用于患有与不希望的血管生成有关或以之为特征的疾病和病症的患者。
在另一种实施方式中，本文涵盖了治疗、预防和/或控制癌症的方法，其包括结合常规疗法（例如，在此之前、与此同时或在此之后）施用所述化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物，所述常规疗法包括但不限于目前用于治疗、预防或控制癌症的手术、免疫疗法、生物学疗法、放射疗法或其他非药物基疗法。本文所提供的化合物与常规疗法的结合使用可以提供独特的治疗方案，该治疗方案对于某些患者具有意想不到的效果。不受理论的限制，据信当与常规疗法一同使用时，式I所表示的化合物可以提供相加或协同效果。
如在本文中其他部分所讨论的，本文涵盖了减少、治疗和/或预防与常规疗法有关的副作用或不希望的作用的方法，所述常规疗法包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、生物学疗法和免疫疗法。本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物以及其他活性成分可以在与常规疗法有关的副作用发生之前、期间或之后施用于患者。
在一种实施方式中，所述化合物可以在使用常规疗法之前、期间或之后以约0.1至约150mg，约1至约25mg，约2至约10mg，或约0.5至约4mg的量单独或结合本文所公开的第二活性剂（参见，例如，4.3节）每天口服施用。
在某些实施方式中，将本文所提供的化合物，或对映异构体或其对映异构体的混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物与多西他赛一起施用于患有非-小细胞肺癌并且之前用carbo/VP16和放射疗法进行治疗的患者。
5.6药物组合物
药物组合物可以在各个、单一单位剂量形式的制剂中使用。本文所提供的药物组合物和剂量形式包括化合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、笼形物或前体药物。本文所提供的药物组合物和剂量形式还可以包含一种或多种赋形剂。
本文所提供的药物组合物和剂量形式还可以包含一种或多种其他活性成分。本文公开了任选的第二或其他活性成分的实例。
单一单位剂量形式适合于口服、粘膜（例如，鼻部、舌下、阴道、口腔或直肠）、肠胃外（例如，皮下、静脉内、推注、肌内或动脉内）、局部（例如，滴眼剂或其他眼科制剂）、透皮或经皮方式施用患者。剂量形式的实例包括但不限于，片剂；囊片剂；胶囊，如弹性软明胶胶囊；扁囊剂；锭剂；糖锭剂；分散剂；栓剂；粉末；气溶剂（例如，鼻部喷雾剂或吸入剂）；凝胶剂；适于口腔或粘膜施用患者的液体剂量形式，包括混悬液（例如，水性或非水性液体混悬液、水包油乳液或油包水液体乳液）、溶液剂和酏剂；适于向患者肠胃外施用的液体剂量形式；适于局部施用的滴眼剂或其他眼科制剂；以及可重新配制以提供适于患者肠胃外施用的无菌固体（例如，结晶或无定形固体）。
本文所提供的剂量形式的组成、形状和类型通常将根据它们的用途而改变。例如，用于疾病的急性治疗的剂量形式与用于相同疾病慢性治疗的剂量形式相比，可以含有更大量的一种或多种活性成分。相似的，肠胃外剂量形式与用于治疗相同疾病的口服剂量形式相比，可以含有更少量的一种或多种活性成分。其中本文所提供的具体剂量形式将彼此不同的这些和其他方式对于本领域技术人员将是显而易见的。参见，例如，“雷明顿氏药学科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）”，第18版，Mack Publishing,Easton PA(1990)。
典型的药物组合物和剂量形式包含一种或多种赋形剂。适合的赋形剂对于药学领域技术人员来说是熟知的，并且本文提供了适合的赋形剂的非限制性实例。特定赋形剂是否适合掺入到药物组合物或剂量形式中取决于本领域中熟知的多种因素，其包括但不限于所述剂量形式将施用给患者的方式。例如，口服剂量形式（如片剂）可能含有不适合于在肠胃外剂量形式中使用的赋形剂。特定赋形剂的适合性还可以取决于所述剂量形式中具体的活性成分。例如，通过一些赋形剂（如乳糖），或者当暴露于水时，可以加快一些活性成分的分解。包含伯胺或仲胺的活性成分对这种加速分解是特别敏感的。因此，本文提供了药物组合物和剂量形式，其含有少量（如果有的话）乳糖、其他单糖或二糖。如本文所使用的，术语“不含乳糖的”是指所存在的乳糖的量（如果有的话）不足以显著提高活性成分的降解速率。
本文所提供的不含乳糖的组合物可以包含本领域熟知的并且在（例如）美国药典（USP）25-NF20（2002）中所列的赋形剂。一般说来，不含乳糖的组合物包含药物相容的并且药物可用的量的活性成分、粘结剂/填充剂和润滑剂。在一种实施方式中，不含乳糖的剂量形式包含活性成分、微晶纤维素、预胶凝淀粉和硬脂酸镁。
由于水可以有利于一些化合物的降解，因此本文还提供了包含活性成分的无水药物组合物和剂量形式。例如，在药学领域中加入水（例如，5%）作为模拟长期储存的方式以确定制剂随时间的特性（如货架期或稳定性）是广泛接受的。参见，例如，Jens T.Carstensen,“药物稳定性：原理与实践（Drug Stability:Principles&Practice）”，第2版，Marcel Dekker,NY,NY,1995,第379-80页。实际上，水和热加快了一些化合物的分解。因此，水对制剂的影响可以是显著的，这是因为在制剂的生产、处理、包装、存储、运输和使用期间一般会遇到水分和/或潮气。
可以使用无水或含有低水分的成分以及低水分或低湿度条件制备无水药物组合物和剂量形式。如果预期在生产、包装和/或存储期间会与水分和/或潮气发生显著接触，则包含乳糖和至少一种含有伯氨或仲胺的活性成分的药物组合物和剂量形式优选地为无水的。
应制备和存储无水药物组合物从而维持其无水性质。因此，优选地使用已知防止暴露于水的材料包装无水组合物从而使它们可以包含在适合的配方试剂盒中。适合的包装的实例包括但不限于气密性箔片、塑料制品、单位剂量容器（例如，小瓶）、泡罩包装和条状包装。
本文还提供了药物组合物和剂量形式，其包含一种或多种降低活性成分分解速率的化合物。这些化合物（在本文中称为“稳定剂”）包括但不限于抗氧化剂（如抗坏血酸）、pH缓冲剂或盐缓冲剂。
5.7口服剂量形式
适合于口服的药物组合物可以作为分开的剂量形式存在，如（但不限于）片剂（例如，咀嚼片）、囊片剂、胶囊和液体剂（例如，调味糖浆）。这些剂量形式含有预定量的活性成分，并且可以通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。一般地参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing,Easton PA(1990)。
典型的口服剂量形式是根据常规药物混合技术通过将活性成分与至少一种赋形剂密切混合制备的。根据施用所期望的制剂形式，赋形剂可以采取多种形式。例如，适用于在口服液体或气溶胶剂量形式中使用的赋形剂包括但不限于水、乙二醇、油剂、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。适用于在固体口服剂量形式（例如，粉剂、片剂、胶囊和囊片）中使用的赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶微结晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘结剂和崩解剂。
由于它们易于施用，因此片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下使用固体赋形剂。如果需要，可以通过标准水性或非水性技术涂覆片剂。可以通过任何药学方法制备这些剂量形式。一般地，通过将活性成分与液体载体、细碎的固体载体或两者均匀并且密切地混合，然后如有必要将产物成形为所需的外观来制备药物组合物和剂量形式。
例如，可以通过挤压或模制制备片剂。可以通过将任选地与赋形剂混合的自由流动形式（如粉末或颗粒）的活性成分在适合的机械中挤压来制备压制片剂。可以通过将用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物在适合的机械中模制来制备模制片剂。
可以在本文所提供的口服剂量形式中使用的赋形剂的实例包括但不限于粘结剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适合在药物组合物和剂量形式中使用的粘结剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶，如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、其他海藻酸盐、粉末黄芪胶、瓜耳豆胶、纤维素及其衍生物（例如，乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠）、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素（例如，No.2208、2906、2910）、微晶纤维素及其混合物。
适合的微晶纤维素的形式包括但不限于，以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105（得自FMC Corporation,American Viscose Division,Avicel Sales,Marcus Hook,PA）出售的材料及其混合物。具体的粘结剂为作为AVICEL RC-581出售的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物。适合的无水或低水分赋形剂或添加剂包含AVICEL-PH-103TM和淀粉1500LM。
适合在本文所公开的药物组合物和剂量形式中使用的填充剂的实例包括但不限于滑石粉、碳酸钙（例如，颗粒或粉末）、微晶纤维素、粉末纤维素、葡聚糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶凝淀粉及其混合物。本发明的药物组合物中的粘结剂或填充剂通常以所述药物组合物或剂量形式的约50至约99wt%存在。
在组合物中使用崩解剂以提供当暴露于水相环境时分解的片剂。含有过多崩解剂的片剂可能会在储存时分解，而含有过少的那些可能在所需条件下不会以所需的速率分解。因此，应使用既不多也不少的不会有害地改变活性成分释放的足够量的崩解剂来形成固体口服剂量形式。所使用的崩解剂的量根据制剂类型而改变，并且是本领域那些技术人员易于分辨的。典型的药物组合物包含约0.5wt%至约15wt%的崩解剂，优选地约1wt%至约5wt%的崩解剂。
可以在药物组合物和剂量形式中使用的崩解剂包括但不限于，琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟基乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、其他褐藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。
可以在药物组合物和剂量形式中使用的润滑剂包括（但不限于）硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油（例如，花生油、棉花子油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油）、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。其他润滑剂包括（例如）syloid硅胶（AEROSIL200，由W.R.Grace Co.of Baltimore,MD生产）、凝固的合成二氧化硅气溶胶（由Degussa Co.of Plano,TX出售）、CAB-O-SIL（焦化二氧化硅产品，由Cabot Co.of Boston,MA出售）及其混合物。如果非要使用，则润滑剂通常以小于其所掺入的药物组合物或剂量形式的约1wt%的量使用。
在一种实施方式中，本发明的固体口服剂量形式包括本文所提供的化合物、无水乳糖、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸、胶体无水氧化硅和明胶。
5.8缓释剂量形式
可以通过缓释方式或通过本领域那些技术人员熟知的递送装置施用活性成分。实例包括但不限于美国专利No.3845770；3916899；3536809；3598123；和4008719、5674533、5059595、5591767、5120548、5073543、5639476、5354556和5733566中所述的那些，以上每篇专利作为参考并入本文。通过以不同的比例使用（例如）羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体、微球或它们的组合以提供所需的释放分布图，这些剂量形式可以用于提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放。可以容易地选择包括本文所述的那些在内的本领域那些技术人员已知的适合的缓释制剂以用于和本文所提供的活性成分一起使用。因此，本文提供了适合于口服的单一单位剂量形式，如但不限于，适合于缓释的片剂、胶囊剂、胶丸（gelcaps）和囊片剂。
所有缓释药物产品具有共同的目标：改善药物疗法以优于其不缓释的对应物。理想地，在医学治疗中优化设计的缓释制剂的使用的特征在于在最短的时间内使用最少的药物物质来治愈或控制病况。缓释制剂的优势包括延长的药物活性、降低的剂量频率和提高的患者顺应性。另外，缓释制剂可以用于影响作用或其他特征的发生时间，如药物的血液水平，并因此可以影响副作用（例如，不良作用）的发生。
大部分缓释制剂设计在开始时释放快速产生所需治疗效果的药物（活性成分）量，并逐渐和不断地释放其他量的药物以在延长的一段时间内维持这种治疗或预防效果的水平。为了在体内维持药物的这种恒定水平，必须以将替代代谢掉和从体内排出的药物量的速率从所述剂量形式中释放药物。可以通过多种条件刺激活性成分对照物-解除缓释，其包括（但不限于）pH、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。
5.9肠胃外剂量形式
肠胃外剂量形式可以通过多种途径施用至患者，包括（但不限于）皮下、静脉内（包括推注）、肌内和动脉内施用。由于肠胃外剂量形式的施用通常绕过了患者对污染物的天然防御，因此肠胃外剂量形式优选地为无菌的或者能够在施用至患者前灭菌。肠胃外剂量形式的实例包括（但不限于）注射用溶液、溶解或悬浮在注射用可药用赋形剂中的干产品、注射用混悬剂和乳剂。
可用于提供肠胃外剂量形式的适合的赋形剂对于本领域技术人员来说是熟知的。实例包括但不限于：注射用水USP；水性载体，例如但不限于，氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水溶性载体，例如但不限于，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水载体，例如但不限于，玉米油、棉花子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
本文所公开的提高一种或多种活性成分溶解性的化合物也可以加入到本文所提供的肠胃外剂量形式中。例如，环糊精及其衍生物可用于提高化合物及其衍生物的溶解度。参见，例如，美国专利No.5134127，该专利作为参考并入本文。
5.10局部和粘膜剂量形式
本文所提供的局部和粘膜剂量形式包括但不限于，喷雾剂、气溶剂、溶液、乳液、混悬液、滴眼剂或其他眼科制剂或者其他本领域技术人员已知的形式。参见，例如，“雷明顿氏药学科学（Remington’s PharmaceuticalSciences），第16版和第18版，Mack Publishing,Easton PA(1980&1990)；和“药学剂量形式简介（Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms）”，第4版，Lea&Febiger,Philadelphia(1985)。适用于治疗口腔内粘膜组织的剂量形式可以配制成漱口药或口腔凝胶剂。
可用于提供局部和粘膜剂量形式的适合的赋形剂（例如，载体和稀释剂）和其他材料对于药学领域的那些技术人员来说是熟知的，并且取决于将施用给定药物组合物或剂量形式的特定组织。考虑到该事实，典型的赋形剂包括但不限于，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油及其混合物，以形成无毒的和可药用的溶液、乳剂或凝胶剂。如果需要，也可以向药物组合物和剂量形式中加入增湿剂或润湿剂。这些其他成分的实例是本领域熟知的。参见，例如，“雷明顿氏药学科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences），第16和18版，Mack Publishing,Easton PA(1980&1990)。
还可以调节药物组合物或剂量形式的pH以改善一种或多种活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载体的极性、其离子强度或张力来改善递送。还可以将化合物（如硬脂酸酯）加入至药物组合物或剂量形式中以有利地改变一种或多种活性成分的亲水性或亲油性，从而改善递送。在这点上，硬脂酸酯可以用作制剂的脂质载体、用作乳化剂或表面活性剂以及用作递送增强剂或透过增强剂。可以使用活性成分的不同的盐、水合物或溶剂化物以进一步调节得到的组合物的性质。
5.11试剂盒
在一些实施方式中，本文所提供的活性成分优选地未同时或通过相同施用途径施用于患者。因此，本文提供了试剂盒，当开业医生使用时，所述试剂盒可以简化适当量的活性成分向患者的施用。
在一种实施方式中，本文所提供的试剂盒包含本文所提供的化合物，或其可药用盐、溶剂化物或水合物。试剂盒还可以包含其他活性剂，其包括但不限于本文所公开的那些。
本文所提供的试剂盒还可以包含用于施用所述活性成分的装置。这些装置的实例包括但不限于注射器、输液袋（drip bags）、贴片和吸入器。
试剂盒还可以包含用于移植的细胞或血液以及可用于施用一种或多种活性成分的药物可用的载体。例如，如果活性成分是以必须复原以用于肠胃外施用的固体形式提供的，则所述试剂盒可以包括适合载体的密封容器，其中所述活性成分可以溶解以形成适合于肠胃外施用的不含颗粒的无菌溶液。药物可用的载体的实例包括但不限于：注射用水USP；水性载体，例如但不限于，氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水溶性载体，例如但不限于，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水载体，例如但不限于，玉米油、棉花子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
5.12抗体
本文所提供的与CRBN免疫特异性结合的抗体（抗CRBN抗体）包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多重特异性抗体（包括双重特异性抗体）、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单链Fv（scFv）（例如，包括单特异性、双重特异性等）、骆驼化抗体、Fab片段、F(ab'')片段、二硫键连接的Fv（sdFv）、抗独特型（抗Id）抗体和上述任何抗体的抗原或表位结合片段。
具体地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合CRBN抗原的抗原结合位点的分子。本文所提供的免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类的免疫球蛋白分子。在具体的实施方式中，本文所提供的抗体是IgG抗体，并且在某些实施方式中，是IgG1或IgG4。
本文还提供了分离的CRBN抗体，例如，“CRBN70”，如根据下文实施例6.20或6.21所制备的。在一种实施方式中，抗体是多克隆抗体。在另一种实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是兔多克隆抗体。在其他实施方式中，所述抗体为兔单克隆抗体。
在另一种实施方式中，本文提供了分离的抗体，其免疫特异性结合至具有氨基酸序列EEFHGRTLHDDDC（SEQ ID NO:1）的表位上。在另一种实施方式中，所述抗体免疫特异性结合至具有氨基酸序列EEFHGRTLHDDDC（SEQ ID NO:1）的表位上，其中所述肽偶联至钥孔血蓝素（KLH）。在一种实施方式中，抗体是多克隆抗体。在另一种实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是兔多克隆抗体。在其他实施方式中，所述抗体为兔单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体免疫特异性结合人CRBN（SEQ ID NO:12）的肽65-76（SEQ IDNO:1）。
在某些实施方式中，本文提供了免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列或其VH域、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的重链的抗体。在其他实施方式中，抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或其VL域、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的轻链。在一些实施方式中，抗体包含具有SEQID NO:5中所示的氨基酸序列或其VH域、VH CDR1、VH CDR2和/或VHCDR3的重链；和具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或其VL域、VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的轻链。在某些实施方式中，抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或其VH域、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的重链。在其他实施方式中，抗体免疫特异性结合CRBN并且包含具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或其VL域、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的轻链。在一些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或其VH域、VHCDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的重链；和具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或其VL域、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的轻链。在某些实施方式中，所述抗体免疫特异性结合人CRBN（SEQ ID NO:12）的肽65-76（SEQ ID NO:1）。
本文所提供的任何CRBN抗体可以在本文所提供的任何方法中使用。
抗体的变体和衍生物包括保留了特异性结合至表位的能力的抗体片段。示例性片段包括Fab片段（含有抗原结合域并且包含通过二硫键桥联的轻链和重链部分的抗体片段）；Fab'（含有单个抗结合域的抗体片段，所述抗结合域通过铰链区包含Fab和重链的其他部分）；F(ab')2（通过重链铰链区中的链间二硫键连接的两个Fab'分子；Fab'分子可以针对相同或不同的表位）；双重特异性Fab（具有两个抗原结合域的Fab分子，每个抗原结合域可以针对不同的表位）；包含可变区的单链Fab链，也称为sFv（通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体单条轻链和重链的可变抗原结合决定区）；二硫键连接的Fv或dsFv（通过二硫键连接在一起的抗体单条轻链和重链的可变抗原结合决定区）；骆驼化VH（抗体单条重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面处的一些氨基酸是在天然存在的骆驼抗体的重链中存在的那些）；双重特异性sFv（具有两个抗原结合域的sFv或者dsFv分子，每个抗原结合域可以针对不同的表位）；双链抗体（当第一sFv的VH域与第二sFv的VL域组装并且第一sFv的VL域与第二sFv的VH域组装时形成的二聚sFv；双链抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同的表位）；和三链抗体（以类似于双链抗体的方式形成的三聚sFv，但是其中三种抗原结合域是在单一复合物中产生的；三个抗原结合域可以针对相同或不同的表位）。抗体的衍生物还包括抗体结合位点的一种或多种CDR序列。当存在两个或更多个CDR序列时，CDR序列可以在骨架上连接在一起。在某些实施方式中，抗CRBN抗体包含单链Fv（“scFv”）。scFv是包含抗体的VH和VL域的抗体片段，其中这些域存在于单多肽链中。一般地，scFv多肽还包含VH和VL域之间的多肽接头，它使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag,New York,第269-315页（1994）。
本文提供了免疫特异性结合至CRBN表位的抗体，所述抗体包含本文所述的免疫特异性结合至CRBN抗原或CRBN表位的VH和VL链的衍生物。本领域技术人员所知的标准技术可用于向编码本发明的分子的核苷酸序列中引入突变，所述技术包括（例如）定向突变和导致氨基酸替换的PCR介导的突变。优选地，相对于原始分子，所述衍生物包含小于25个氨基酸的替换，小于20个氨基酸的替换，小于15个氨基酸的替换，小于10个氨基酸的替换，小于5个氨基酸的替换，小于4个氨基酸的替换，小于3个氨基酸的替换或小于2个氨基酸的替换。在优选的实施方式中，所述衍生物在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处具有保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的一种替换。已经在本领域中定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，门冬氨酸、谷氨酸）、不带电的极性侧链（例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β-支链侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。作为另外一种选择，可以通过（如）饱和突变沿编码序列的全部或部分随机引入突变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴别保留活性的突变体。突变后，可以表达所编码的蛋白质并且可以确定所述蛋白质的活性。
在另一种实施方式中，免疫特异性结合至CRBN表位的抗体包含与CGN-6-1-11的氨基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的氨基酸序列或CGN-6-1-11，或其抗原结合片段，如VH域、VL域、VH链或VL链。在一种实施方式中，免疫特异性结合至CRBN表位的抗体包含与SEQ ID NO:5、7、9或11中所示的氨基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，免疫特异性结合CRBN抗原的抗体包含核苷酸序列编码的VH链氨基酸序列和/或VL链氨基酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下（例如，在约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中杂交至过滤器结合的DNA，然后在约50-65℃在0.2×SSC/0.1%SDS中清洗一次或多次），在高度严格的条件下（例如，在约45℃在6×SSC中杂交至过滤器结合的DNA，然后在约68℃在0.1×SSC/0.2%SDS中清洗一次或多次），或者在本领域技术人员所知的其他严格杂交条件下与（1）编码SEQ ID NO:5或9（H链）和/或SEQ ID NO:7或11（L链）中所示的VH和/或VL链中任一个的核苷酸序列的互补序列杂交。（参见，例如，Ausubel,F.M.等人主编，1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green PublishingAssociates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页）。
抗CRBN抗体可以来自任何动物来源，其包括鸟和哺乳动物（例如，人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡）。在某些实施方式中，抗CRBN抗体是人或人源化单克隆抗体。如本文所使用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并且包括分离自人免疫球蛋白文库或表达来自人基因的抗体的小鼠的抗体。
在某些实施方式中，抗CRBN抗体是完全人抗体，如免疫特异性结合CRBN多肽、CRBN多肽片段或CRBN表位的完全人抗体。当施用于受试者时，相对于完全小鼠（或其他完全或部分非人种抗体）、人源化抗体或嵌合抗体，这些完全人抗体将是有利的以最大程度减少不希望或不需要的副作用的发展，如对非完全人抗体（例如，来源于其他种的抗CRBN抗体）的免疫应答。
本文所提供的抗CRBN抗体可以是单特异性的、双重特异性、三重特异性的或具有更多重特异性。多重特异性抗体可以对CRBN多肽的不同表位具有特异性，或者可以对CRBN多肽以及对异源表位（如异源多肽或固体支持材料）两者具有特异性。在某些实施方式中，本文所提供的抗体对CRBN多肽的给定表位具有单特异性并且不会免疫特异性结合其他表位。
在某些实施方式中，本文提供了免疫特异性结合CRBN表位（例如，EEFHGRTLHDDD（SEQ ID NO:1）或人CRBN肽65-76（SEQ ID NO:12））或CRBN抗原的抗CRBN抗体及其使用方法。
本领域技术人员所知的标准技术可用于向编码本文所提供的抗CRBN的核苷酸序列中引入突变，所述技术包括（例如）定向突变和导致氨基酸替换的PCR介导的突变。"保守的氨基酸替换"是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的一种替换。已经在本领域中定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，门冬氨酸、谷氨酸）、不带电的极性侧链（例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β-支链侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。作为另外一种选择，可以通过（如）饱和突变沿编码序列的全部或部分随机引入突变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴别保留活性的突变体。突变后，可以表达所编码的蛋白质并且可以确定所述蛋白质的活性。
在一些实施方式中，所述抗体是完全人抗人CRBN抗体，如完全人单克隆抗体。可以通过本领域中已知的任何方法产生完全人抗体。示例性的方法包括用能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体谱的转基因动物（例如，小鼠）的CRBN抗原（能够引起免疫应答并且任选地结合至载体的任何CRBN多肽）免疫。参见，例如，Jakobovits等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,90:2551；Jakobovits等人，(1993)Nature,362:255258(1993)；Bruggermann等人，(1993)Year in Immunol.,7:33。产生抗CRBN抗体的其他方法可见于本文所提供的实施例中。
作为另外一种选择，可以通过体外噬菌体展示抗体文库筛选产生完全人抗体；参见，例如，Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)，以上参考文献作为参考并入本文。已描述了多种含抗体的噬菌体展示文库并且可以通过本领域的一位技术人员容易地制备所述文库。文库可以含有多种人抗体序列，如人Fab、Fv和scFv片段，所述人抗体序列可以针对适当的目标进行筛选。
抗CRBN抗体包括化学修饰的抗体，即通过将任何类型的分子共价连接至所述抗体。例如，但不作为限制，所述抗体衍生物包括已通过（例如）糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基/封端基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白连接等化学修饰的抗体。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，其包括（但不限于）特异性化学切割、乙酰化、制剂、衣霉素的代谢合成等。另外，所述抗体可以含有一种或多种非典型氨基酸。
在某些实施方式中，免疫特异性结合至CRBN抗原的抗CRBN抗体包含本领域技术人员所知的框架区（例如，人或非人片段）。所述框架区可以是（例如）天然存在的或共有框架区。在一些实施方式中，抗CRBN抗体的框架区是人框架区（有关人框架区的列表，参见，例如，Chothia等人，1998,J.Mol.Biol.278:457-479，该参考文献以其全部内容作为参考并入本文）。另外参见，Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，（美国卫生和公众服务部,Washington,D.C.），第五版。
在某些实施方式中，本文所提供的抗CRBN抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，本文所提供的抗体包含在以下残基中的一个、两个、三个或更多个处具有一个或多个氨基酸替换的人框架区：（a）在鼠抗体框架（即供体抗体框架）和人抗体框架（即受体抗体框架）之间不同的稀有框架残基；（b）当在供体抗体框架和受体抗体框架之间不同时的游标区残基；（c）在供体抗体框架和受体抗体框架之间不同的VH/VL界面处的链间封装残基；（d）在供体抗体框架和受体抗体框架间不同的规范残基（canonical residue），特别是对于鼠抗体CDR环的规范性分类的定义关键的框架区；（e）邻近CDR的残基；（g）能够与抗原相互作用的残基；（h）能够与CDR相互作用的残基；和（i）在VH域和VL域之间的接触残基。在某些实施方式中，包含在一个、两个、三个或多个上述指定的残基处具有一个或多个氨基酸替换的人框架区的免疫特异性结合CRBN抗原的抗体是拮抗性CRBN抗体。
在其他实施方式中，本文提供了包含抗CRBN抗体的融合蛋白，其免疫特异性结合至CRBN抗原和异源多肽。
5.13抗体的诊断使用
本文所提供的免疫特异性结合至CRBN抗原的标记的CRBN抗体及其衍生物和类似物可用于诊断目的以检测、诊断或监测患者中CRBN表达水平或CRBN介导的疾病。
在一些实施方式中，本文提供了利用CRBN抗体测量患者肿瘤或宿主细胞中CRBN表达水平的方法，以预测对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、其立体异构体或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的疗法的临床反应。本文还提供了利用本文所提供的CRBN抗体测量患者肿瘤或宿主细胞中CRBN表达水平的方法，以监测对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、其立体异构体或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的疗法的临床反应。本文还提供了利用本文所提供的CRBN抗体测量患者肿瘤或宿主细胞中CRBN表达水平的方法，以监测患者对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、其立体异构体或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物剂量的疗法的顺应性。本文还提供了利用本文所提供的CRBN抗体测量患者肿瘤或宿主细胞中CRBN表达水平的方法，以监测对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、其立体异构体或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的疗法的耐受性的发展。
本文提供了用于诊断CRBN-介导的疾病的诊断测定，其包括：（a）使用免疫特异性结合至CRBN抗原的一种或多种本发明的抗体测定个体的细胞或组织样品中CRBN抗原的水平；和（b）将CRBN抗原水平与对照水平（例如，正常组织样品中的水平）相比较，借此与CRBN抗原的对照水平相比，测定的CRBN抗原水平的升高是CRBN-介导的疾病的指示。
使用如本文所述的或如本领域技术人员所知的经典免疫组织学方法，本文所提供的抗体可用于测定生物样品中CRBN抗原的水平（例如，参见，Jalkanen等人，1985,J.Cell.Biol.101:976-985；和Jalkanen等人，1987,J.Cell.Biol.105:3087-3096）。用于检测蛋白质基因表达的其他抗体基方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和放射免疫测定（RIA）。适合的抗体测定标记物是本领域已知的并且包括酶标记物，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘（125I、121I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（121In）和锝（99Tc）；发光标记物，如氨基苯二酰肼；和荧光标记物，如荧光素和罗丹明，和生物素。
本文提供了用于检测患者中CRBN的方法。在一种实施方式中，所述方法包括：a）向受试者施用（例如，肠胃外、皮下或腹膜内施用）有效量的标记的免疫特异性结合至CRBN抗原的抗体；b）在施用后，等待一定时间间隔以允许所述标记的抗体优选地在受试者中表达CRBN抗原的位点处集中（以及未结合的标记分子从背景水平中清除）；c）确定背景水平；和d）检测受试者中标记的抗体，从而高于背景水平的标记抗体的检测表明该受试者具有提高的CRBN表达。可以通过多种方法确定背景水平，其包括将所检测的标记分子的量与先前对特定系统确定的标准值进行比较。
在本领域中将理解受试者的大小以及所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。就放射性同位素部分来说，对于人受试者，所注射的放射性的量通常将在约5至20毫居里的99Tc的范围内。然后，标记的抗体将优选地在含有特异性蛋白质的细胞位置处积累。在S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments.”（Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.Burchiel和B.A.Rhodes主编，Masson Publishing Inc.(1982)中的第13章）中描述了体内肿瘤成像。
基于若干变量，包括所使用的标记物的类型和施用模式，施用后允许标记抗体优选地在受试者位点处集中和未结合的标记抗体清除至背景水平的时间间隔为6至48小时，或6至24小时，或6至12小时。在另一种实施方式中，施用后的时间间隔为5至20天或5至10天。
可以使用本领域中已知的用于体内扫描的方法检测受试者中标记分子的存在。这些方法取决于所使用的标记物的类型。熟练的技术人员将能够确定用于检测特定标记物的适当方法。可以在本发明的诊断方法中使用的方法和装置包括（但不限于）计算机断层（CT）、全身扫描如正电子发射体层成像（PET）、磁共振成象（MRI）和声图描记法。
在具体的实施方式中，用放射性同位素标记分子并使用辐射反应性手术设备检测患者中标记的分子（Thurston等人，美国专利No.5441050）。在另一种实施方式中，用荧光化合物标记分子并使用荧光反应扫描设备检测患者中标记的分子。在另一种实施方式中，用正电子发射金属标记分子并使用正电子发射断层成像术检测患者中标记的分子。在另一种实施方式中，用顺磁标记物标记分子并使用磁共振成象（MRI）检测患者中标记的分子。
6.实施例
通过以下非限制性实施例说明了本发明的某些实施方式。
6.13-(4-氨基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮（来那度胺）的制备
甲基2-溴甲基-3-硝基苯甲酸盐
将甲基-2-甲基-3-硝基苯甲酸盐（14.0g，71.7mmol）和N-溴代琥珀酰亚胺（15.3g，86.1mmol）在四氯化碳（200mL）中的搅拌混合物在温和回流下加热15小时，同时将置于三角瓶2cm处的100W灯泡在三角瓶上照射。将所述混合物过滤并用二氯甲烷（50mL）清洗固体。用水（2×100mL）、盐水（100mL）清洗滤液并干燥。真空下除去溶剂并通过快速色谱法（己烷/乙酸乙酯，8/2）纯化残余物以提供19g黄色固体状产物（96%）：mp70.0-71.5℃;1ΗNMR(CDC13)δ8.12-8.09(dd,J=1.3和7.8Hz,1H),7.97-7.94(dd,J=1.3和8.2Hz,1H),7.54(t,J=8.0Hz,1H).5.15(s,2H),4.00(s,3H);13C NMR(CDC13)δ165.85,150.58,134.68,132.38,129.08,127.80,53.06,22.69;HPLC,Water Nove-Pak/C18,3.9x150mm,4微米,1mL/min,240nm,40/60CH3CN/0.1%H3PO4(aq)7.27min(98.92%);C9H8NO4Br的理论分析值：C,39.44;H,2.94;N,5.11;Br,29.15。实验值：C,39.46;H,3.00;N,5.00;Br,29.11。
叔丁基N-(1-氧-4-硝基异吲哚啉-2-基)-L-谷氨酰胺
将三乙胺（2.9g，28.6mmol）滴加至甲基-2-溴甲基-3-硝基苯甲酸盐（3.5g，13.0mmol）和L-谷氨酰胺叔丁酯盐酸盐（3.1g，13.0mmol）在四氢呋喃（90mL）中的搅拌混合物中。将混合物加热回流24小时。向冷却的混合物中加入二氯甲烷（150mL），并用水（2×40mL）、盐水（40mL）清洗混合物并干燥。真空下除去溶剂，并通过快速色谱法（3%CH3OH在二氯甲烷中的溶液）纯化残余物以提供2.84g粗产物（60%），该粗产物在下一反应中直接使用：1ΗNMR(CDC13)δ8.40(d,J=8.1Hz,1H),8.15(d,J=7.5Hz,1H),7.71(t,J=7.8Hz,1H),5.83(s,1H),5.61(s,1H),5.12(d,J=19.4Hz,1H),5.04-4.98(m,1H),4.92(d,J=19.4Hz,1H),2.49-2.22(m,4H).1.46(s,9H);HPLC,Waters Nova-Pak C18,3.9x150mm,4微米,1mL/min,240nm,25/75CH3CN/0.1%H3PO4(aq)6.75min(99.94%)。
N-(1-氧-4-硝基异吲哚啉-2-基)-L-谷氨酰胺
将氯化氢气体鼓泡至叔丁基N-(1-氧-4-硝基-异吲哚啉-2-基)-L-谷氨酰胺（3.6g，9.9mmol）在二氯甲烷（60mL）中搅拌的5℃溶液中1小时。然后，将混合物在室温下再搅拌1小时。加入乙醚（40mL），并将所得混合物搅拌30分钟。过滤浆液，用乙醚清洗并干燥以提供3.3g产物：1ΗNMR(DMSO-d6)δ8.45(d,J=8.1Hz,1H),8.15(d,J=7.5Hz,1H),7.83(t,J=7.9Hz.1H),7.24(s,1H),6.76(s,1H),4.93(s,2H),4.84-4.78(dd,J=4.8和10.4Hz,1H),2.34-2.10(m,4H);13C NMR(DMSO-d6)δ173.03,171.88,165.96,143.35,137.49,134.77,130.10,129.61,126.95,53.65,48.13,31.50,24.69;C13H13N3O6的理论分析值：C,50.82;H,4.26;N,13.68。实验值：C,50.53;H.4.37;N,13.22。
(S)-3-(1-氧-4-硝基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
用异丙醇/干冰浴将N-(1-氧-4-硝基异吲哚啉-2-基)-L-谷氨酰胺（3.2g，10.5mmol）在无水二氯甲烷（150mL）中的搅拌悬液混合物冷却至-40℃。将亚硫酰氯（0.82mL，11.3mmol）滴加至冷却混合物，然后加入吡啶（0.9g，11.3mmol）。30分钟后，加入三乙胺（1.2g，11.5mmol），并将混合物在-30℃至-40℃搅拌3小时。将该混合物倒入冰水（200mL）中，并用二氯甲烷（40mL）萃取水层。用水（2×60mL）、盐水（60mL）清洗二氯甲烷溶液并干燥。真空下除去溶剂并将固体残余物与乙酸乙酯（20mL）混合成浆以提供2.2g白色固体状产物（75%）：mp285℃;1ΗNMR(DMSO-d6)δ:1.04(s,1H),8.49-8.45(dd,J=0.8和8.2Hz,1H),8.21-8.17(dd,J=7.3Hz,1H),7.84(t,J=7.6Hz,1H),5.23-5.15(dd,J=4.9和13.0Hz,1H),4.96(dd,J=19.3和32.4Hz,2H),3.00-2.85(m,1H),2.64-2.49(m,2H),2.08-1.98(m,1H);13C NMR(DMSO-d6)δ172.79,170.69,165.93,143.33,137.40,134.68,130.15,129.60,127.02,51.82,48.43,31.16.22.23;HPLC,Waters Nove-Pak/C18,3.9x150mm,4微米,1mL/min,240nm,20/80CH3CN/0.1%H3PO4(aq)3.67min(100%);C13HnN3O5的理论分析值：C,53.98;H,3.83;N,14.53。实验值：C,53.92;H,3.70;N,14.10。
3-(4-氨基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮
将(S)-3-(1-氧-4-硝基异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮（1.0g，3.5mmol）和10%Pd/C（0.3g）在甲醇（600mL）中的混合物在Parr-振荡装置中用50psi的氢气氢化5小时。将混合物通过硅藻土（Celite）滤过并真空浓缩滤液。将固体在热乙酸乙酯中混合成浆30分钟，过滤并干燥以提供0.46g（51%）白色固体状产物：mp235.5-239℃;1H NMR(DMSO-d6)δ11.01(s,1H).7.19(t,J=7.6Hz,1H).6.90(d.J=7.3Hz,1H),6.78(d,J=7.8Hz,1H),5.42(s,2H).5.12(dd.J=5.1和13.1Hz,1H),4.17(dd,J=17.0和28.8Hz,2H),2.92-2.85(m,1H).2.64-2.49(m,1H).2.34-2.27(m,1H),2.06-1.99(m,1H);13C NMR(DMSO-d6)δ172.85,171.19,168.84,143.58,132.22.128.79,125.56,116.37,110.39,51.48,45.49,31.20,22.74;HPLC.Waters Nova-Pak/C18,3.9x150mm,4微米,1mL/min,240nm,10/90CH3CN/0.1%H3PO4(aq)0.96min(100%);手性分析,Daicel Chiral Pak AD,40/60己烷/IPA,6.60min(99.42%);C13H13N3O3的理论分析值：C,60.23;H,5.05;N,16.21。实验值：C,59.96;H.4.98;N,15.84。
还可以通过本领域中已知的方法制备3-(4-氨基-1-氧-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮，例如，Drugs of the Future,2003,28(5):425-431中所提供的，该参考文献的全部内容作为参考并入。
6.24-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3-二酮（玻马利度胺）的制备
例如，在美国专利第7812169号和第7709502号中描述了4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3-二酮的制备，以上每篇文献的全部内容作为参考结合于本文。
向羧基苄氧基-L-谷氨酰胺（2.8g,10mmol）在40mL无水THF的搅拌溶液中加入1,1-羰二咪唑（1.92g，12mmol）。将反应混合物加热回流18小时。蒸发THF并将产物溶于氯仿。用水和盐水清洗氯仿层并在无水CaSO4上干燥，过滤并蒸发以得到白色固体。将固体产物从乙醚中结晶以获得2.4克结晶粉末（90%）。（作为另外一种选择，可以通过在-70℃至0℃用SOCl2在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理使羧基苄氧基-L-谷氨酰胺环化以形成产物）。将反应混合物用CHCl3稀释并用5%Na2CO3清洗，在无水Na2SO4上干燥，过滤并蒸发以得到2.5g（90%得率）S(-)-(3-苄氧基羰基氨基)-戊二酰亚胺。1H NMR(CDCl3)δ8.2(1H,s宽峰),7.4(5H,s,芳香族),5.8(1H,d),5.15(2H,s),4.4(1H,dd,J=4.5,3),2.95-2.4(3H,m),1.86(1H,d,t,J=11.5,6.5).m.p.122-124℃(lit.122-124℃).
在20℃，向S(-)-(2-苄氧基羰基氨基)戊二酰亚胺（1.2g，4.6mmol）在15mL冰醋酸中的溶液中加入8mL30%HBr/乙酸溶液。将反应混合物的温度升至RT并搅拌1小时。S-(-)-2-氨基-戊二酰亚胺HBr的白色固体粉末开始在反应混合物中出现。将固体过滤并用5mL冰醋酸，然后用乙醚清洗以获得1.8g（80%）产物。产物在旋光计上的分析显示(-)旋光度，[a]25D（c=1，水）=37.5°，并确认产物为S-(-)-2-氨基-戊二酰亚胺。DMSO-D6中的1H NMR确认产物为2-氨基-L-戊二酰亚胺HBr。
向（4.18g，20mmol）S-(-)-2-氨基-戊二酰亚胺HBr在50mL无水DMF的溶液中加入3.8g（20mmol）的3-硝基邻苯二甲酸酐。加入100mL（冰）醋酸后，将反应混合物在约70℃至约80℃加热24小时。此后，真空蒸发溶剂以获得米白色固体。将10mL乙醇加入固体时，形成米白色粉末产物。分离产物并用20mL乙醇清洗。1H NMR(DMSO-D6)δ11.25(1H,s宽峰),8.35(1H,d,J=7.2),8.25(1H,d,J=7.0),8.15(1H,t,J=8.0),5.2(1H,dd,J=5.5,7.2),3.00-2.85(1H,m),2.65-2.4(2H,m),2.15-2.05(1H,m).m.p.:228-229℃(lit.228.5-229.5℃)。
将4-硝基-沙利度胺（1g，3.3mmol）在50mL二恶烷/甲醇（4:1）的混合物中溶解，并在存在Pd/C5%催化剂的情况下，在40psi氢气下在Parr氢化器中氢化约4小时。通过硅藻土过滤剂过滤反应混合物后，将溶剂真空蒸发以获得黄色粉末。将产物从乙酸乙酯/二恶烷中重结晶以获得800mg（85%纯度）的S(-)-4-氨基-沙利度胺。1H NMR in DMSO-D6:11.10(1H,s宽峰),7.45(1H,t,J=7.5),7.05(1H,d,J=5.2),6.95(1H,d,J=5.2),6.5(2H,s宽峰),5.05(1H,dd,J=5.0,13.42),2.95-2.80(1H,m),2.65-2.5(2H,m),2.05-1.95(1H,m).m.p.318.2-319.5℃。通过将(R)-和(S)-4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3-二酮的旋光率[a]25D与类似化合物R(+)-和S(-)-沙利度胺相比较来确定绝对构型。产物在旋光计上的分析显示(-)旋光度，[a]25D（C=0.5，二恶烷）=-27.70°，并确认产物为S(-)-4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3-二酮。
通过手性HPLC柱Welk-01（10mm×750mm）分辨两个对映异构体并用CH3CN/MeOH/H201:1:5混合物洗脱。在240nm下，以2mL/min的流速S(-)对映异构体的保留时间为33.74分钟，R(+)对映异构体为35.62分钟。
6.33-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮（化合物B）的制备
在0℃，向氢氧化钾（16.1g，286mmol）在水（500mL）中的溶液中部分地加入3-硝基邻苯二甲酰亚胺（25.0g，130mmol）。将悬液在0℃搅拌3小时，然后加热到30℃3小时。向所述溶液中加入HCl（100mL，6N）。将所得悬液冷却至0℃1小时。将所述混悬液过滤并用冷水清洗（2×10mL）以获得白色固体的3-硝基-酞氨酸（24.6g，90%的得率）：1H NMR(DMSO-d6)δ7.69(brs,1H,NHH),7.74(t,J=8Hz,1H,Ar),7.92(dd,J=1,8Hz,1H,Ar),8.13(dd,J=1,8Hz,1H,Ar),8.15(brs,1H,NHH),13.59(s,1H,OH);13CNMR(DMSO-d6)δ125.33,129.15,130.25,132.54,136.72,147.03,165.90,167.31。
在0℃，向3-硝基-酞氨酸（24.6g，117mmol）和氢氧化钾（6.56g，117mmol）在水（118mL）中的混合物中加入溴（6mL）、氢氧化钾（13.2g，234mmol）在水中（240mL）的混合物，然后加入氢氧化钾（19.8g，351mmol）在水（350mL）中的溶液。在0℃保持5分钟后，将混合物在100℃的油浴中加热1小时。将反应溶液冷却至室温，然后在冰-水浴中保持30分钟。在0℃，向混合物中滴加HCl溶液（240mL，2N），并将所得混合物保持1小时。将混悬液过滤并用水清洗（5mL）以获得黄色固体的2-氨基-6-硝基-苯甲酸（15.6g，73%得率）：HPLC:Waters Symmetry C18,5μm,3.9x150mm,1mL/min,240nm,CH3CN/0.1%H3PO4,5分钟内5%至95%的梯度,5.83min(85%);1H NMR(DMSO-d6)δ6.90(dd,J=1,8Hz,1H,Ar),7.01(dd,J=1,9Hz,1H,Ar),7.31(t,J=8Hz,1H,Ar),8.5-9.5(brs,3H,OH,NH2);13CNMR(DMSO-d6)δ105.58,110.14,120.07,131.74,149.80,151.36,166.30;LCMS:MH=183。
将2-氨基-6-硝基-苯甲酸（1.5g，8.2mmol）在乙酸酐（15mL）中的混合物在微波炉中在200℃加热30分钟。将混合物过滤并用乙酸乙酯（20mL）清洗。真空浓缩滤液。将固体在乙醚（20mL）中搅拌2小时。将混悬液过滤并用乙醚（20mL）清洗以获得浅棕色固体的2-甲基-5-硝基-苯并[d][1,3]恶嗪-4-酮（1.4g,85%得率）：HPLC:Waters Symmetry C18,5μm,3.9x150mm,1mL/min,240nm,CH3CN/0.1%H3PO4,5分钟内5%至95%的梯度,5.36min(92%);1H NMR(DMSO-d6)δ2.42(s,3H,CH3),7.79(dd,J=1,8Hz,1H,Ar),7.93(dd,J=1,8Hz,1H,Ar),8.06(t,J=8Hz,1H,Ar);13C NMR(DMSO-d6)δ20.87,107.79,121.54,128.87,137.19,147.12,148.46,155.18,161.78;LCMS:MH=207。
将分别装有5-硝基-2-甲基-苯并[d][1,3]恶嗪-4-酮（0.60g，2.91mmol）和3-氨基-哌啶-2,6-二酮氯化氢（0.48g，2.91mmol）在吡啶（15mL）中的悬液的两个小瓶在微波炉中在170℃加热10分钟。将混悬液过滤并用吡啶（5mL）清洗。真空浓缩滤液。将所得混合物在HCl（30mL，1N）、乙酸乙酯（15mL）和乙醚（15mL）中搅拌2小时。将所述混悬液过滤并用水（30mL）和乙酸乙酯（30mL）清洗以获得深棕色固体，将该固体与甲醇（50mL)在室温下搅拌过夜。将所述混悬液过滤并用甲醇清洗以获得黑色固体3-(2-甲基-5-硝基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮（490mg，27%得率）。将所述固体不用进一步纯化而用于下一步。
将3-(2-甲基-5-硝基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮（250mg）和在碳上的Pd(OH)2（110mg）在DMF（40mL）中的混合物在氢气（50psi）下振荡12小时。将混悬液过滤通过硅藻土垫并用DMF（10mL）清洗。真空浓缩滤液并将所得的油通过快速柱色谱（硅胶，甲醇/二氯甲烷）纯化以获得白色固体的3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮（156mg，69%得率）：HPLC:Waters Symmetry C18,5μm,3.9x150mm,1mL/min,240nm,10/90CH3CN/0.1%H3PO4,3.52min(99.9%);mp:293-295℃;1HNMR(DMSO-d6)δ2.10-2.17(m,1H,CHH),2.53(s,3H,CH3),2.59-2.69(m,2H,CH2),2.76-2.89(m,1H,CHH),5.14(dd,J=6,11Hz,1H,NCH),6.56(d,J=8Hz,1H,Ar),6.59(d,J=8Hz,1H,Ar),7.02(s,2H,NH2),7.36(t,J=8Hz,1H,Ar),10.98(s,1H,NH);13C NMR(DMSO-d6)δ20.98,23.14,30.52,55.92,104.15,110.48,111.37,134.92,148.17,150.55,153.62,162.59,169.65,172.57;LCMS:MH=287;C14H14N4O3+0.3H2O的理论分析指：C,57.65;H,5.05;N,19.21。实验值：C,57.50;H,4.73;N,19.00。
6.4直接化合物靶标的鉴定
为了鉴别沙利度胺及其他相关药物的直接靶标，我们开发了亲合纯化技术。将偶联至Affigel-10的化合物对照（“化合物A”）（10μmol药物/毫克Affigel）用于亲合纯化实验。
化合物A（TNF IC50=622nM;Jurkat IL-2EC200=3.47μM）
通过与化合物A-Affigel结合，然后使用游离化合物A洗脱，从Jurkat T细胞溶胞产物中分离了蛋白质。切下考马斯亮蓝染色条带并送至哈佛大学微量化学研究室（Harvard Microchemistry Facility）进行序列分析。将蛋白质蛋白水解消化并在Finnigan LCQ DECA四极离子阱质谱仪上通过毛细管反相HPLC纳喷串联质谱分析。使用Sequest算法及其他程序将MS/MS谱与已知序列相关联，然后通过科学家审查肽序列与已知蛋白质的一致性，并手动确认结果的保真度。
结果总结：使用化合物A固定珠从Jurkat提取物中亲合纯化了DDB1（DNA损伤结合蛋白1（XPCE，人）)。与（例如）大部分代表糖原分支酶（55条肽）的第二蛋白相比，DDB1高度出现在洗脱部分（108条肽）中。DDB1直接与CRBN相互作用，并且可以通过其与CRBN的结合拉开。
6.5在敏感性多发性骨髓瘤细胞系中CRBN siRNA抑制的CRBN
在两个来那度胺敏感性多发性骨髓瘤细胞系H929和U266B1中使用抑制实验确认了cereblon（CRBN）在来那度胺MOA中的作用。发现CRBN的下调终止了药物诱导的细胞周期阻滞、肿瘤抑制剂的激活、致癌基因的抑制以及基因表达谱和泛素化的整体变化。
在H929和U266B1细胞中评价了10个不同的单一和混合的抗CRBN的siRNA。在24和48小时转染后，使用RT-PCR测试了抑制效率。结果显示与其他siRNA和空白siRNA相比，CRBN-siRNA-1、CRBN-siRNA-7、CRBN-siRNA-9、CRBN-siRNA-10和CRBN-siRNA-11显著降低了CRBNmRNA的表达（表1）。
表1：CRBN-siRNA对CRBN基因表达的影响。
Figure BDA0000450181650000761
6.6CRBN的抑制终止了药物在多发性骨髓瘤细胞中的抗增殖作用
药物（如来那度胺和玻马利度胺）通过诱导G1期的细胞周期阻滞和随后的存活力降低而对MM细胞具有直接的抗增殖活性。为了研究CRBN在来那度胺中的作用以及其他药物的抗增殖活性，用CRBN-siRNA或对照siRNA对两个敏感性骨髓瘤系H929和U266B1细胞转染24、48、72和96小时。用DMSO（0.1%）、玻马利度胺（1μM）和来那度胺（10μM）转染1、2、3天后，将细胞处理24小时以评价化合物对CRBN蛋白、mRNA表达的作用以及对细胞周期和增殖的作用。RT-PCR和免疫印迹测定显示CRBN siRNA抑制CRBN。使用CRBN70抗体通过RT-PCR和免疫印迹确认CRBN下调（图1）。使用来那度胺和玻马利度胺的处理即不显著影响mRNA又不影响CRBN的蛋白质表达。
来那度胺和玻马利度胺引起细胞周期发展的延迟，如S期中细胞个数减少所测量的，它们在对照空白和阴性对照siRNA-转染的细胞中分别引起40%和50%的延迟（处理3天时的平均抑制）（图2A和2B）。CRBN的抑制显著终止了U266B1细胞中来那度胺和玻马利度胺引起的细胞周期发展的延迟。同上。
还评价了CRBN在H929细胞中的作用。用空白、阴性对照siRNA和CRBN-siRNA-7转染H929细胞24、48、72和96h。用DMSO（0.1%）、玻马利度胺（1μM）、来那度胺（10μM）或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮（“化合物B”）转染1、2、3天后，将细胞处理24h并研究了对细胞周期和增殖的影响。在对照空白和阴性对照siRNA转染的细胞中，在72小时处理后，来那度胺、玻马利度胺和化合物B诱导了细胞周期发展的延缓，如S期细胞个数减少所测量的。CRBN的抑制显著终止了H929细胞中免疫调节性药物诱导的细胞周期发展的延缓（图2C），对于来那度胺从50至4%，对于玻马利度胺从70至15%，并且对于化合物B从65至22%。
6.7CRBN的抑制终止了药物对细胞周期、肿瘤抑制剂和凋亡蛋白质的影响
为了进一步研究CRBN对药物诱导的细胞周期阻滞的影响，我们使用RT-PCR和免疫印迹分析来测量重要细胞周期和凋亡调节因子的水平。用空白、阴性对照siRNA、CRBN-siRNA-7和CRBN-siRNA-11转染U266B1细胞24、48、72和96h（图3A）。用DMSO（0.1%）、玻马利度胺（1μM）和来那度胺（10μM）转染1、2、3天后，将细胞处理24h，并评价对细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂p21WAF-1的mRNA和蛋白水平的影响。已表明来那度胺和玻马利度胺诱导的细胞周期阻滞取决于U2669中p21WAF-1的上调。我们的结果显示在对照空白和阴性对照siRNA-转染的细胞中来那度胺和玻马利度胺使p21上调（图3C），表明由来那度胺和玻马利度胺G1期停滞所引起的S期细胞的减少（图3B）。然而，CRBN的抑制阻止了p21WAF-1的诱导，表明G1期停滞的成功终止以及S期发展的恢复（图3C和3D）。
在H929细胞中，药物的G1期细胞周期阻滞与肿瘤抑制剂、pRb、磷酸化作用和致癌基因以及骨髓瘤存活因子IRF4的降低是一致的。免疫印迹分析显示来那度胺、玻马利度胺和化合物B降低了pRB的磷酸化作用（图4A和4B）以及蛋白质IRF4的总水平（图4C和4D）。CRBN的抑制降低了药物的作用，表明药物对细胞周期发展的抑制需要CRBN蛋白质。
6.8CRBN的抑制降低了来那度胺和玻马利度胺对基因表达的作用
使用微阵列技术的基因表达谱鉴别了与DMSO处理的对照相比，用玻马利度胺（1μM）或来那度胺（10μM）处理的阴性对照siRNA-转染的U266B1细胞中差异调节的759或609个基因（±1.7倍；P<0.05，ANOVA p值）（图5A和5B）。
玻马利度胺中下调基因的代表性显著基因本体（GO）种类包括：细胞周期（87个基因；P=5.2E-56）、有丝分裂（43个基因；P=1.2E-39）、细胞骨架（58个基因；P=2.6E-16）和对DNA损害刺激物的反应（36个基因；P=1.8E-21）。上调基因的代表性显著基因本体（GO）种类包括：抗原处理和递呈（12个基因；P=2.8E-17）、免疫应答（35个基因；P=5.70E-14）和细胞死亡（50个基因；P=1.7E-10）。
来那度胺中上调基因的代表性显著基因本体（GO）种类包括：抗原处理和递呈（11个基因；P=1.9E-16）、免疫应答（37个基因；P=3.9E-13）和细胞死亡（55个基因；P=1.0E-10）（表4和5）。通过使用4种不同的siRNA的CRBN抑制终止了U266中来那度胺和玻马利度胺对细胞周期和基因表达谱的影响（图5A-5C）。
6.9在对来那度胺或玻马利度胺耐受的多发性骨髓瘤细胞中CRBN水平降低
尽管来那度胺基疗法的发展显著改善了临床反应，但是大部分多发性骨髓瘤患者最终复发或对它们的治疗方案成为难治性。为了评价造成来那度胺耐受的可能机制，已发展了对来那度胺的抗增殖作用耐受的多发性骨髓瘤细胞系。
由于CRBN对来那度胺、玻马利度胺及其他免疫调节剂的抗增殖反应的相关性，在具有获得性来那度胺或玻马利度胺耐受性细胞的亲本敏感系的匹配对中比较了CRBN蛋白的水平。与来那度胺和玻马利度胺的抗增殖活性所需的CRBN一致，与相对应的亲本系相比，玻马利度胺耐受性细胞系DF15R和来那度胺耐受性细胞H929R10-1、H929R10-2、H929R10-3、H929R10-4和MM1/R中CRBN蛋白的水平显著降低（表2）。
表2.来那度胺或玻马利度胺耐受性细胞和相应的亲本细胞之间CRBN蛋白水平的差异倍数
Figure BDA0000450181650000791
6.10来自人细胞系和原代细胞的CRBN、DDB1和GSK3的基因组DNA测序
对来自多个人细胞系和原代细胞的靶标基因CRBN、DDB1和GSK3B测序。CRBN基因测序鉴别了来那度胺耐受性人细胞系中的突变，所述突变在亲本细胞中是不存在的。
序列富集、NexGen测序和数据分析获得了结果，如下表3-6中所示。每个表列出了从中获得数据的细胞系。参考核苷酸是指该位置处的野生型核苷酸。“覆盖度”是指该位置处读取的总数。总体突变得分（“得分”）基于Phred得分的概念，其最大值为30，表示突变检出（mutations call）错误的概率为1/1000；20，1/100；和10，1/10。然后，得分不必需表示突变很可能是错误突变。低得分仅表示突变不能被称为是具有绝对确定性的真实突变。“突变检出”表示核苷酸变化。例如，T>TG表示从参考T至T和G的杂合变化。T>G表示从参考T至G的纯合变化。术语“c."是指编码序列，而“IVS”是指内含子变体。“氨基酸变化”列使用了与“突变检出”列相似的表示方法。
结果
在27个细胞系的大规模序列分析中，发现内含子突变比外显子突变多。多发性骨髓瘤细胞系ANBL-6显示了在野生型中未观察到的来那度胺耐受性系的CRBN中的突变。ANBL-6.wt仅用DMSO处理，并且CRBN编码序列与参考完全匹配。然而，在对10μM来那度胺具有耐受性的ANBL-6.R10R中，编码区c.745C>CA中的SNP导致蛋白质中氨基酸变化249D>YD。该氨基酸变化定位至CRBN的DDB1结合域。
HepG2和JeKo-1的CRBN编码区中存在的沉默突变是杂合的c.735A>AG，而KMS-12-BM是纯合c.735A>G。细胞系OPM2在CRBN编码区c.1209C>CT中具有不同的沉默突变。氨基酸变化不是由这些SNP造成的。
DDB1的测序结果揭示编码区c.909T>TA中的SNP导致ANBL-6.wt和ANBL-6.R10R细胞系中的氨基酸变化303E>ED。在Jurkat细胞系中发现了不同的SNP，其中DDB1编码区中的突变c.2143C>CT改变了氨基酸序列715V>VI。
ANBL-6.wt、ANBL-6.R10R和SH-SY5Y的DDB1编码区中在c.153G>GA存在的沉默突变不改变氨基酸序列。得自健康供体的PBMC样品还在DDB1编码区c.2265G>GA中具有沉默突变，但是它不改变氨基酸序列。
一个GSK3β突变存在于PMBC样品中。编码区c.1187C>CT中的突变导致氨基酸变化396R>RQ。该突变不定位至激酶域。其他突变如表11所示。这些中的大部分具有低覆盖度。这可以是由于靶向这些区域的引物和/或测序错误所造成的。
尽管未发现CRBN、DDB1和GSK3-β中一致的突变与这些MM细胞系中的来那度胺或玻马利度胺耐受性有关，但是在来那度胺耐受性ANBL-6MM细胞中观察到的自然突变（如249D>YD CRBN突变）举例说明了多态性的类型，所述多态性可以在临床环境中发生在这些基因中，并且可以构成耐受性的机制。需要进一步研究以确认或推翻该假设。
表3CRBN突变
Figure BDA0000450181650000801
Figure BDA0000450181650000811
a=沉默突变；b=DDB1相互作用所需的区域
表4DDB1突变
细胞系 突变检出 氨基酸变化
ANBL-6.R10R c.153G>AG 51P>PPa
ANBL-6.wt c.153G>AG 51P>PPa
SH-SY5Y c.153G>AG 51P>PPa
Jurkat c.2143C>CT 715V>VI
PBMC c.2265G>AG 755S>SSa
ANBL-6.R10R c.909T>AT 303E>DE
ANBL-6.wt c.909T>AT 303E>DE
ANBL-6.wt IVS1123-29A>G
EJM IVS1123-29A>G
H929 IVS1123-29A>G
H929_R10-3 IVS1123-29A>G
H929-1uM-CC5013 IVS1123-29A>G
HepG2 IVS1123-29A>G
JeKo-1 IVS1123-29A>G
MM.1S.wt IVS1123-29A>G
OPM2 IVS1123-29A>G
SK-Hep1 IVS1123-29A>G
U266_B1 IVS1123-29A>G
ANBL-6.wt IVS1123-30C>T
EJM IVS1123-30C>T
H929 IVS1123-30C>T
H929_R10-3 IVS1123-30C>T
H929-1uM-CC5013 IVS1123-30C>T
HepG2 IVS1123-30C>T
JeKo-1 IVS1123-30C>T
MM.1S.wt IVS1123-30C>T
OPM2 IVS1123-30C>T
SK-Hep1 IVS1123-30C>T
U266_B1 IVS1123-30C>T
PBMC IVS1225+30T>C
MM.1S.R10R IVS1225+30T>CT
MM.1S.wt IVS1225+30T>CT
RPMI-8226 IVS1225+30T>CT
JJN-3 IVS1862-26A>AT
OPM2 IVS1862-26A>AT
H929-0.1uM-CC4047 IVS1862-27A>AC
JJN-3 IVS1862-27A>AC
OPM2 IVS1862-27A>AC
SH-SY5Y IVS1862-27A>AC
H929 IVS2278-26T>GT
H929-1uM-CC5013 IVS2278-26T>GT
Jurkat IVS2278-26T>GT
KMS-12-BM IVS2278-26T>GT
OPM2 IVS2278-26T>GT
ANBL-6.wt IVS2278-27C>CT
EJM IVS2278-27C>CT
H929 IVS2278-27C>CT
H929_R10-2 IVS2278-27C>CT
H929-1uM-CC5013 IVS2278-27C>CT
JJN-3 IVS2278-27C>CT
Jurkat IVS2278-27C>CT
KMS-12-BM IVS2278-27C>CT
OPM2 IVS2278-27C>CT
PBMC IVS2278-27C>CT
SH-SY5Y IVS2278-27C>CT
SK-Hep1 IVS2278-27C>CT
SKMM2 IVS2278-27C>CT
U266_B1 IVS2278-27C>CT
U87 IVS2278-27C>CT
ANBL-6.wt IVS2278-28C>T
H929 IVS2278-28C>T
H929_R10-2 IVS2278-28C>T
H929_R10-3 IVS2278-28C>T
H929-1uM-CC5013 IVS2278-28C>T
Jurkat IVS2278-28C>T
KMS-12-BM IVS2278-28C>T
OPM2 IVS2278-28C>T
PBMC IVS2278-28C>T
SH-SY5Y IVS2278-28C>T
SKMM2 IVS2278-28C>T
U266_B1 IVS2278-28C>T
U87 IVS2278-28C>T
JJN-3 IVS2661+6C>CT
PBMC IVS2832+6C>CT
RPMI-8226 IVS2832+6C>CT
a=沉默突变
表5GSK3β突变
细胞系 突变检出 氨基酸变化
PBMC c.1187C>CT 396R>RQ
Jurkat IVS282+3delT
U266_B1 IVS366+29A>AG
H929 IVS366+29A>G
Jurkat IVS909+11delA
表6其他突变
Chr Y:LOC100288025
Chr M:ATP6,COX1,CYTB,ND1,ND4,ND4L,ND5
Chr2:C2orf67
Chr1:ITLN1
Chr19:KLK10
Chr17:KRT15
Chr14:PRMT5,FMNL1
Chr9:NOTCH1
6.11药物和泛素蛋白酶体系统之间关系的研究
将聚泛素链的特异性抗体用于研究免疫调节药物对整体泛素化水平的影响。用来那度胺（1μM）、玻马利度胺（1μM）或蛋白酶体抑制剂MG132处理H929细胞。30分钟后，处理细胞以进行免疫荧光。通过Cellomics对整体K63-连接的聚泛素化水平进行定量。如图7A和7B中所示，H929中，免疫调节药物降低了总K48连接的聚泛素化，但不能降低K-63-连接的泛素化。
6.12药物对泛素化和蛋白质丰度的整体变化的影响的研究
使用CST Ubiscan技术研究了来那度胺和玻马利度胺对蛋白质泛素化的影响。将处理样品送至Cell Signaling Technology进行泛素化肽的富集和通过LC/MS/MS的定量。将原始强度用于该分析以鉴别被药物或药物和蛋白酶体抑制剂MG132显著调节的肽。分析显示与MG132相比，来那度胺和玻马利度胺对泛素化肽的影响较小。在MG132组合中，观察到了更多的泛素化肽（与它们的对照相比）。单独的来那度胺和玻马利度胺，或与MG132一起在1小时或4小时显著上调了162种独特的泛素化肽。这些肽对应于176种独特的蛋白质。少数几个排名靠前的组为：核小体、染色质、蛋白质-DNA复合物组件、组蛋白H2A。在176种蛋白质中，我们发现5种蛋白质属于“泛素-蛋白质连接酶活性”类，它们是MDM2、HERC2、UBE2D3（仅通过玻马利度胺）、UBE2N（仅来那度胺）、UBE2M（两者）。图8和9（无MG132）以及图10和11（有MG132）中显示了通过条件分类的采样数结果。
6.13对原代T细胞中药物诱导的TNFα和IL-2的CRBN抑制影响
在这些研究中，从血液中分离了人T细胞并在37℃用1μg/ml PHA-L处理。24小时刺激后，对T细胞进行使用指明的siRNA的siRNA转染。24h转染后，通过qRT-PCR分析抑制效率，并将剩余转染的细胞接种到用OKT3预结合的96孔板中并在37℃用DMSO或1和10μM的沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和邻苯二酰亚胺处理48小时，重复两次。48小时后，收集上清液并通过ELISA测试TNFα和IL-2的产生（图12A-12D）。该数据表明CRBN的siRNA抑制终止了抗CD3-刺激的原代人T细胞中药物诱导的TNFα和IL-2产生。
6.14同时抑制Cul4A和Cul4B部分终止了T细胞中来那度胺、玻马利度胺或化合物B诱导的TNFα和IL-2
测量了药物治疗之前的Cul4A抑制效率。Cul4A siRNA-1和Cul4A+Cul4B siRNA将Cul4A的基因表达分别降低了82%和76%（图13A）。Cul4B和Cul4A+Cul4B siRNA将Cul4B的基因表达分别抑制了70%和63%。Cul4A或Cul4B单独的抑制对10μM来那度胺、玻马利度胺或化合物B诱导的T细胞TNF-α或IL-2产生无影响（图13B和C）。然而，Cul4A和Cul4B同时的双重抑制导致由于来那度胺、玻马利度胺和化合物B的化合物诱导的TNF产生升高的显著但部分逆转（图13B）。当Cul4A和Cul4B被抑制时，存在IL-2诱导逆转的趋势（图13C）。这些数据表明来那度胺、玻马利度胺和化合物B介导的T细胞共刺激取决于Cul4A和Cul4B的表达，并且这些蛋白在T细胞中起丰富的功能。
6.15淋巴瘤细胞中CRBN的表达和对来那度胺的灵敏度
在弥漫性大B-细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系中研究了来那度胺相对于基线CRBN表达的抗增殖活性。评价了以下DLBCL细胞系对来那度胺的灵敏度：OCI-Ly10-NCI、U2932、OCI-Ly-3、DB、RIVA、TMD8、Toledo、OCI-Ly-19、Pfeiffer、WSU-DLCL2、Karpas-1106P和SU-DHL-4。图14中显示了结果。
6.16CRBN-DDB1复合物的制备
为CRBN向pBV-ZZ-HT-LIC和pBV-notag-LIC的克隆设计引物。制备了两种引物，“CRBN_For”和“CRBN_Rev”。
CRBN_For:GTGCCGCGTGGCTCCATGATGGCCGGCGAAGGAGATCA
CRBN_Rev:GCTTCCTTTCGGGCTTATTACAAGCAAAGTATTACTT
使用引物从cDNA文库扩增CRBN基因。将产物凝胶纯化并在存在TTP的情况下用T4DNA聚合酶处理，从而仅制备对连接依赖性克隆相容的单链末端。然后，将CRBN DNA退火至pBV-ZZ-HT-LIC以产生CRBN_034（图15A）。
对DDB1，制备了两种引物，“DDB1_For”和“DDB1_Rev”。
DDB1_For:TCGGGCGCGGCTCTCGGTCCGAAAAGGATGTCGTACAACTACGTGGTAAC
(SEQ ID NO:2)
DDB1_Rev:GCTTCCTTTCGGGCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAATGGATCCGAGTTAGCTCCT
(SEQ ID NO:3)
DDB1_Rev在DDB1的C-末端添加了StrepTag。从cDNA文库扩增DDB1基因，凝胶纯化并在存在TTP的情况下用T4聚合酶处理。然后，将DDB1基因退火至pBV-notag-LIC以产生质粒DDB1_004（图15B）。
杆状病毒中构件的表达和纯化
在昆虫细胞中测试了构件的表达。将重组pBV-HT-LIC和pBV-GST-LIC质粒转化至DH10Bac以产生杆粒。通过蓝白斑筛选和PCR跟踪重组完整性。将重组杆粒用于转染无血清Grace培养基中每孔9×105个Sf9贴壁细胞。转染后，加入含有抗生素和谷氨酰胺的新鲜Grace培养基。
通过在显微镜下对细胞单层的观察跟踪感染。5至7天后，收获上清液（P1病毒）并分析颗粒的重组蛋白表达。在24深孔板中进行病毒扩增，其中每孔4mL2×106个Sf9细胞/毫升。除去等份以评价蛋白质表达动力学。4天后，将板离心，收集上清液（P2病毒）并通过小规模标记蛋白质纯化分析颗粒。最后，将病毒在750mL含有抗生素和谷氨酰胺的Grace培养基中扩增并收集上清液作为P3病毒。使用得自Amersham Biosciences的AKATxpress或AKTA纯化器收集和纯化颗粒。
纯化
将含有CRBN-DDB1的细胞糊在含有50mM Tris pH8.0、500mM NaCl、20mM咪唑、10%甘油和2mM DTT和蛋白酶抑制剂的缓冲液中溶胞。然后，通过离心使溶胞产物澄清。然后，使用得自Amersham Biosciences的AKTAExpress从上清液中纯化标记蛋白。将5mL HisTrap HP柱用于亲合步骤，而将16mm×60cm Sephacryl S-200HR用于排阻色谱步骤。在加载柱后，用20体积溶胞缓冲液清洗柱，然后用10柱体积50mM Tris pH8.0、1000mMNaCl、40mM咪唑、10%甘油和2mM DTT清洗。用含有500mM咪唑的溶胞缓冲液进行结合蛋白质的洗脱。将洗脱的蛋白质直接进样到在25mM TrispH8.0、200mM NaCl、5%甘油和2mM DTT平衡的凝胶过滤柱。通过4-20%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析馏分。
将含有CRBN和DDB1两者的部份混合并用凝血酶消化以从CRBN中除去ZZ-HT标记。在4℃以1:2000（重量/重量）的凝血酶和CRBN-DDB1消化5-6小时。将切割的CRBN-DDB1在25mM Tris pH8.0、5%甘油和2mMDTT中稀释，并加载到在25mM Tris pH8.0、75mM NaCl、5%甘油和2mMDTT中平衡的8ml MonoQ柱（Amersham-Pharmacia）上。加载后，用2体积25mM Tris pH8.0、75mM NaCl、5%甘油和2mM DTT清洗柱，并用75mM至400mM在25mM Tris pH8.0、5%甘油和2mM DTT中的梯度洗脱结合的蛋白质。
进行最后的凝胶过滤以精制CRBN-DDB1复合物。将来自MonoQ的混合部分加载到140ml S200HR凝胶过滤柱上并在25mM Tris pH8.0、200mMNaCl、5%甘油和2mM DTT中运行。分析馏分，并将阳性部分混合并浓缩至约15mg/ml。将等份在-80℃储存。
6.17Ubiscan泛素化实验
在图17-22中显示了1小时和4小时泛素化实验的结果，其表明某些肽受来那度胺和/或玻马利度胺调节。
图23的表显示了来那度胺、玻马利度胺和化合物B的Ubiscan数据结果。在U266中Rev和Pom一般地提高了Ub-蛋白质IKZF3、RPL19、PCM1和NEDD8的丰度，而在T细胞中化合物B提高。在U266中，Rev和Pom一般地降低了蛋白质GNB2L1和HNRNPR的丰度，而在T细胞中化合物B降低。
使用化合物B的T细胞处理导致两种泛素化肽SECTM1和ZC3H15更大的丰度（相对于DMSO对照）。
蛋白质与来那度胺、玻马利度胺和化合物B一样：IKZF3、RPL19、PCM1、NEDD8、GNB2L1和HNRNPR。
表7来那度胺和玻马利度胺的最终Ubiscan采样数（1hr）
表8来那度胺和玻马利度胺的最终Ubiscan采样数（MG1hr）
Figure BDA0000450181650000881
Figure BDA0000450181650000891
Figure BDA0000450181650000901
表9来那度胺和玻马利度胺的最终Ubiscan采样数（4hr）
Figure BDA0000450181650000902
Figure BDA0000450181650000911
表10来那度胺和玻马利度胺的最终Ubiscan采样数（MG4hr）
Figure BDA0000450181650000912
Figure BDA0000450181650000921
Figure BDA0000450181650000931
6.18激活的B细胞样亚类DLBCL中来那度胺的效力取决于IRF4和CRBN的表达
细胞增殖测定
使用3H-胸苷掺入测定评价了细胞增殖。简要地，在96孔培养板中在具有指定浓度的来那度胺或DMSO对照的完全培养基中培养对数生长的DLBCL细胞。在37℃孵育5天后，将1μCi3H-胸苷（GE HealthcareBiosciences,Piscataway,NJ）加入到每个孔中以进行最终的5小时孵育。然后使用细胞收集器（Tomtec,Hamden,CT），将细胞收获到UniFilter GF/C滤板（PerkinElmer,Waltham,MA）上，并让板干燥过夜。然后，使用TopCountNXT微孔板闪烁发光计数器（Packard BioScience,Meriden,CT）测量每个孔的3H-胸苷掺入。计算细胞增殖的抑制百分率并将其归一化至DMSO对照。
蛋白质表达分析
使用测试化合物或0.1%DMSO将细胞处理指定的时间。孵育后，收集细胞，通过离心成粒，并立即在0.1ml含有10mM Tris-HCl pH8.0、10mMEDTA、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%SDS、1mM DTT、1mM Na3VO4加上完全蛋白酶抑制剂混合片剂（Roche Applied Science,Indianapolis,IN）的溶胞缓冲液中溶胞，然后使用QiashredderTM（Qiagen,Valencia,CA）处理1分钟，并在干冰上冷冻。用6×SDS样品缓冲液稀释样品，然后煮沸5分钟。将约30μl的该混合物加载到Criterion预制4-12%Tris-HCl凝胶（Bio-Rad,Hercules,CA）的泳道上，电泳，并转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad,Hercules,CA）上。在室温下使用封闭缓冲液（LI-COR Biosciences,Lincoln,Nebraska）封闭膜1小时，然后在4℃用抗BCL-10、IRF4、CRBN或β-肌动蛋白的抗体孵育过夜。清洗膜并在室温下与IRDye二抗（1:30000）孵育1小时。然后，使用红外成像系统和软件（LI-COR Biosciences,Lincoln,NE），按照标准规程进行信号检测。
NF-κB活性测定
如所说明的，使用测试试剂处理对数生长的DLBCL细胞。使用核提取试剂盒（Active Motif,Carlsbad,CA）制备核提取物，并通过二辛可宁酸测定（Thermo Scientific,Rockford,IL）确定蛋白质浓度。根据制造商（ActiveMotif）的说明书，使用敏感性低聚物基比色酶联免疫吸附测定（ELISA）法进行NF-κB活性检测。简要地，将DLBCL细胞的核提取物杂交至用含有NF-κB共有序列结合序列的单拷贝的野生型DNA寡核苷酸涂覆的96孔板。然后，用对p50、p65（Rel A）或p70亚单位特异的抗体检测结合的NF-κB蛋白质。加入结合至辣根过氧化酶的二抗，然后以655nm的参考波长，在450nm下通过分光光度法对板读数。基于OD450/655nm计算NF-κB活性。
对于NF-κB驱动的荧光素酶报告基因测定，使用Nucleofector试剂盒V和根据生产商的规程（Amaxa Biosystems,Gaithersburg,MD）的程序013用pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]质粒（Promega,Madison,WI）转染细胞。转染24小时后，用测试试剂处理细胞2天，并使用
Figure BDA0000450181650000942
荧光素酶测定系统（Promega）制备溶胞产物。使用TopCount NXT微孔板闪烁发光计数器（Packard BioScience）测量每个样品的荧光素酶活性。
实时定量反转录酶-PCR分析
细胞处理48小时后，使用QiaCubeTM系统（Qiagen Inc.,Valencia,CA）通过
Figure BDA0000450181650000943
微型试剂盒纯化总RNA。根据标准方法（Applied BiosystemsInc.），使用反转录试剂盒和对所关心基因特异的
Figure BDA0000450181650000944
PCR探针进行25-100ng总RNA的实时定量RT-PCR。将产物的量归一化至作为内源管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。使用比较Ct法（2-ΔΔCt）计算基因表达提高的倍数。
用于IRF4过表达和抑制的电穿孔
为了抑制IRF4，使用用于转染的
Figure BDA0000450181650000945
试剂盒V，用最终浓度为0.2-1μM的针对IRF4、CRBN的
Figure BDA0000450181650000946
选择siRNA（小干扰RNA，Applied Biosystems）或
Figure BDA0000450181650000947
选择阴性对照siRNA转染细胞。对于IRF4的过表达，使用如上所述的细胞系Nucleofector试剂盒V，用IRF4-或绿色荧光蛋白（GFP）-巨细胞病毒（CMV）表达质粒（OriGene Technologies,Rockville,MD）转染细胞24h。转染24小时后，用来那度胺处理细胞2天，然后进行荧光素酶测定、RT-PCR基因表达分析和免疫印迹分析。
人肿瘤异种移植模型
雌性CB17严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（6-12周大）得自CharlesRiver实验室（Wilmington,MA）并在无菌条件下饲养在microisolator笼中。将总计10×106个OCI-Ly10DLBCL细胞在100%Matrigel（Becton Dickinson,San Jose,CA）中的溶液皮下注射到小鼠的右侧。一周对小鼠中肿瘤的形态监测2或3次。一旦肿瘤达到100-150mg的平均尺寸，用赋形剂（0.5%羧甲基纤维素；0.25%吐温80在去离子水中的溶液）或指定剂量的来那度胺（qd×28，p.o.）或阳性对照长春新碱（q4d×4，i.v.）处理每组中10只小鼠。每天监测小鼠的健康状况和肿瘤生长。用数字卡尺测量所有小鼠的肿瘤，并根据以下公式计算体积：肿瘤体积（mm3）=长度（mm）×宽度（mm）2。当肿瘤大小超过1000mm3时，处死小鼠。
统计分析
通过单因素方差分析，然后通过Dunnett事后检验进行用于多组比较的分析，并使用
Figure BDA0000450181650000951
5.01版（San Diego,CA），使用双尾P-值皮尔逊检验进行相关分析。在所有分析中，认为P值<0.05是显著的。
结果
6.18.1ABC-DLBCL细胞比非ABC-DLBCL细胞对来那度胺更敏感
为了限定特定患者群体中DLBCL疗法的来那度胺的位置并且为了理解效力的分子机制，在该研究中收集了一组DLBCL细胞系。基于文献信息（Lenz G等人，Proc Natl Acad Sci USA2008;105:13520-5）和分子分析，包括胞内NF-κB活性或IRF4表达，以及激活B细胞的重要标签基因的基因表达谱，确认了细胞系的DLBCL亚类。参见图24A-24C。发现浓度范围0.01-100μM的来那度胺处理不同程度地抑制了DLBCL细胞系的细胞增殖。来那度胺对PBML和GCB-DLBCL细胞的增殖影响最小，但是显著抑制除OCI-Ly3之外的ABC-DLBCL细胞系的增殖。参见图24。来那度胺处理还引起敏感细胞系（如OCI-Ly10）的细胞凋亡。参见图26。
6.18.2来那度胺降低ABC-DLBCL细胞中IRF4的表达
为了理解来那度胺对ABC-DLBCL细胞的分子机制，研究了来那度胺对这些细胞中IRF4表达的影响。发现来那度胺处理1-3天会显著下调敏感细胞系（如U2932和OCI-Ly10）中IRF4蛋白的水平，但是对不敏感系OCI-Ly3细胞不会。参见图27A-C。早在药物处理的第1天就发生了来那度胺-引起的IRF4表达降低，其动力学与B细胞中BCR结合时参与NF-κB激活的两个关键酶MALT1和PKCβ的抑制剂（分别为zVRPR-fmk和LY-333531）的动力学相似。在OCI-Ly3细胞中，在1-3天处理期间，来那度胺和PKCβ抑制剂对IRF4水平均无任何显著影响。然而，MALT1抑制剂抑制OCI-Ly3中IRF4的表达，在处理2-3天后，观察到完全抑制。综合来说，这些数据表明来那度胺介导的IRF4表达抑制可以是重要机制并且似乎与细胞对药物的敏感性有关。
6.18.3来那度胺降低ABC-DLBCL细胞的CARD11-BCL-10-MALT1复合物活性
我们的DNA测序数据确认了先前的报道（Lenz,G.等人，Science2008,319:1676-9）：来那度胺-不敏感性ABC-DLBCL系OCI-Ly3在编码卷曲螺旋域的外显子内的CARD11中具有独特的点突变，而来那度胺敏感性ABC-DLBCL系OCI-Ly10、U2932、TMD8和Riva没有。参见图28。该突变已报道会导致BCR信号通路的CARD11-BCL-10-MALT1（CBM）复合物的组成型形成和激活，从而导致在淋巴瘤细胞中的NF-κB的过度激活。参见Lenz,G.等人，Science2008,319:1676-9；Thome,M.等人，Cold SpringHarb Perspect Biol.2010;2:a003004。为了研究这些细胞中来那度胺引起的IRF4抑制中CBM复合物的可能参与，通过测量MALT1副半胱天冬酶（paracaspase）酶活力检查来那度胺对复合物活性的影响。与BCL-10和CARD11结合时，MALT1被激活以形成活性CBM复合物，然后切割掉其结合伴侣如BCL-10。参见图29A-C。
与特异性MALT1抑制剂和PKCβ抑制剂的作用类似，在敏感性ABC-DLBCL细胞系OCI-Ly10和U2932中，来那度胺以浓度依赖性的方式抑制MALT1-引起的BCL-10切割。时间-动力学研究显示尽管在处理1天内MALT1-和PKCβ-抑制剂影响BCL-10的切割，但是在处理2天后发生了来那度胺对BCL-10的显著抑制。参见图29A和29B。与MALT1抑制剂不同，PKCβ抑制剂和来那度胺对OCI-Ly3细胞中BCL-10的切割均无任何影响，这可能是由于CARD11突变造成的，它导致CBM复合物的过度激活。参见图29C。这些数据表明与PKCb抑制剂类似，来那度胺可以显著阻断敏感性ABC-DLBCL细胞中CBM复合物的形成/激活或其他上游事件。
6.18.4来那度胺降低ABC-DLBCL细胞的NF-κB活性但是不降低非ABC亚类细胞
通过测量结合至共有序列的NF-κB亚单位蛋白水平和NF-κB驱动的荧光素酶活性来检查多种DLBCL细胞中来那度胺对NF-κB活性的影响。如所期望的，ABC-DLBCL细胞中NF-κB表明与非ABC-DLBCL相比提高的NF-κB DNA结合。参见图24B。NF-κB驱动的荧光素酶测定表明在药物处理2天后，在来那度胺敏感性ABC-DLBCL细胞系OCI-Ly10和U2932中来那度胺将NF-κB的转录活性抑制了32-56%。参见图30A。在几种ABC-DLBCL细胞系中，来那度胺还以浓度依赖性方式部分抑制通过RelA/p65、p50和c-rel/p70NF-κB亚单位的结合，尽管作用不像对照IKKα/β抑制剂CC-415501那样有效。参见图30B和30C。相反，在GCB-DLBCL系和正常周围血单核细胞中来那度胺对NF-κB DNA结合没有影响。含有CARD11突变的来那度胺不敏感性ABC-DLBCL OCI-Ly3系仅显示出IKKα/β抑制剂的显著NF-κB抑制，而来那度胺没有。参见图30B和30C。这些数据表明在敏感性ABC-DLBCL细胞中来那度胺在CBM复合物或上游事件处抑制NF-κB信号。
6.18.5敏感性ABC-DLBCL细胞中IRF4表达的变化赋予对来那度胺的耐受性
研究了BCR-NF-κB信号转导中IRF4表达的依赖性作用和来那度胺处理对IRF4的后续影响。用IRF4特异性siRNA或者IRF4-CMV-基表达质粒转染来那度胺-敏感性ABC-DLBCL细胞以调节IRF4表达。当用IRF4siRNA转染U2932或OCI-Ly10细胞以抑制IRF4的表达时，NF-κB的转录活性降低了36-53%。参见图31A。因此，在这些细胞中IRF4siRNA模拟了来那度胺对NF-κB的影响。来那度胺向IRF4siRNA-转染的细胞的加入甚至导致了NF-κB转录活性的进一步下调。
与IRF4siRNA转染相反，在这些细胞中过表达IRF424h会将NF-κB活性显著提高3.6-7.9倍。参见图31B。此外，IRF4过表达降低了CBM组分BCL-10的蛋白质表达水平。参见图31C。另外，IRF4过表达拮抗了U2932和OCI-Ly10细胞中来那度胺和PKCb抑制剂对NF-ΚB驱动的荧光素酶表达的影响，但是不会拮抗IKK抑制剂。参见图31D。因此，IRF4对BCR-NF-κB途径的阳性反馈作用似乎位于PKCβ和IKK之间的某点。
6.18.6来那度胺对ABC-DLBCL细胞的影响需要Cereblon
已表明Cereblon是沙利度胺致畸性的主要介体。由于它在来那度胺和玻马利度胺的抗骨髓瘤和免疫调节活性中的重要作用，研究了cereblon在DLBCL的来那度胺敏感性中的作用。在ABC-DLBCL细胞中，siRNA对CRBN的抑制赋予了对来那度胺的耐受性，如通过来那度胺对IRF4表达、BCL-10切割、NF-ΚB活性和这些细胞的增殖的抑制作用的终止所表明的，尽管PKCβ和IKK的抑制剂的活性未受影响。参见图32A-32D。这些数据表明来那度胺对ABC-DLBCL细胞的抗癌作用需要cereblon的存在。
6.18.7来那度胺下调了OCI-Ly10小鼠异种移植模型中IRF4/NF-κB的信号
为了确认ABC-DLBCL中来那度胺介导的体内NF-κB/IRF4信号抑制的相关性，建立了皮下OCI-Ly10异种移植模型。在该模型中，3-30mg/kg（po，qd×28）的来那度胺显著减小了肿瘤尺寸（p<0.01）。参见图33A。在整个研究中，基于小鼠体重，未观察到来那度胺显著的毒性。与赋形剂对照组相比，来那度胺处理7天将IRF4表达和BCL-10切割降低了15-35%（p<0.05）。参见图33B。这些数据表明在ABC-DLBCL模型中来那度胺可以降低IRF4体内表达并延缓肿瘤生长，从而支持了来那度胺在临床研究中作为ABC-DLBCL治疗的治疗剂的潜在价值。
6.18.8 DLBCL细胞的IRF4和CRBN基线mRNA水平以及“ABC得分”与对来那度胺的灵敏度有关
由于多项研究已表明相对于非ABC亚类，ABC-DLBCL细胞的来那度胺敏感性更大，因此研究了预示对来那度胺起治疗反应的可能生物标志物。来自多个亚类的11个DLBCL细胞系的体外混合数据显示DLBCL亚类的来那度胺敏感性与IRF4和CRBN mRNA表达的基线水平高度相关。另外，基于Staudt等人（Ann. Rev. Med., 2002, 53:303-18）所提议的ABC-DLBCL细胞标签基因的基线水平所计算的整体“ABC得分”与来那度胺活性相关，并且还确认了该亚类独特的敏感性。参见图34A和25。与GCB-DLBCL细胞系相比，来那度胺敏感性ABC-DLBCL细胞系趋于表达较高的CRBN和IRF4蛋白水平。参见图34B。值得注意的，来那度胺耐受性OCI-Ly3ABC-DLBCL细胞系缺乏CRBN蛋白质表达。这些数据支持临床研究中所观察到的ABC-DLBCL中来那度胺的优先效力，并且表明“ABC得分”或IRF4或CRBN本身的表达可以用作来那度胺效力预测的可能生物标志物。
6.19多克隆CRBN70抗体
通过用CRBN肽序列EEFHGRTLHDDD（SEQ ID:1）接种兔产生了兔多克隆抗体CRBN70，其中C末端半胱氨酸EEFHGRTLHDDDC（下划线）还用于将所述肽偶联至钥孔血蓝素（KLH）。
Seq. Mod.
EEFHGRTLHDDDC.KLH KLH.Peptlde Gys
用于制备抗体的SEQ ID NO:1中所示的肽对应于CRBN同工型1（NP_057386）（SEQ ID NO:12）的氨基酸65-76（加粗）：
1 magegdqqda ahnmgnhlpl lpaeseeede mevedqdske akkpniinfd tslptshtyl
61 gadmeefhgr tlhdddscqv ipvlpqvmmi lipgqtlplq lfhpqevsmv rnliqkdrtf
121 avlaysnvqe reaqfgttae iyayreeqdf gieivkvkai grqrfkvlel rtqsdgiqqa
181 kvqilpecvl pstmsavqle slnkcqifps kpvsredqcs ykwwqkyqkr kfhcanltsw
241 prwlyslyda etlmdrikkq lrewdenlkd dslpsnpidf syrvaaclpi ddvlriqllk
301 igsaiqrlrc eldimnkcts lcckqcqete ittkneifsl slcgpmaayv nphgyvhetl
361 tvykacnlnl igrpstehsw fpgyawtvaq ckicashigw kftatkkdms pqkfwgltrs
421 allptipdte deispdkvil cl
注意：CRBN的同工型2（GenBank登录号No. NP_001166953；SEQ IDNO:13）在框架剪接位点中使用了替代，其导致丙氨酸的去除（下划线），但是没有其他变化：
1 magegdqqda ahnmgnhlpl lpeseeedem evedqdskea kkpniinfdt slptshtylg
61 admeefhgrt lhdddscqvi pvlpqvmmil ipgqtlplql fhpqevsmvr nliqkdrtfa
121 vlaysnvqer eaqfgttaei yayreeqdfg ieivkvkaig rqrfkvlelr tqsdgiqqak
181 vqilpecvlp stmsavqles lnkcqifpsk pvsredqcsy kwwqkyqkrk fhcanltswp
241 rwlyslydae tlmdrikkql rewdenlkdd slpsnpidfs yrvaaclpid dvlriqllki
301 gsaiqrlrce ldimnkctsl cckqcqetei ttkneifsls lcgpmaayvn phgyvhetlt
361 vykacnlnli grpstehswf pgyawtvaqc kicashigwk ftatkkdmsp qkfwgltrsa
421 llptipdted eispdkvilc l
纯化了多克隆CRBN70抗体。然后，通过抗结合至固相的肽或蛋白的间接ELISA滴定纯化抗体以测量洗脱后抗体的反应性以及血清中保留的抗体的量（流动通过）。
样品 体积(mL) 浓度(mg/mL) 总计(mg) 滴度(ng) 流动通过
CRBN70 6 0.414 2.484 5 2048
洗脱液“滴度”表示CRBN70抗体可以有效检测CRBN抗原的最小浓度。“流动通过”滴度表示在通过柱后血清中保留的抗体的反应性。
6.20 抗CRBN抗体的VH和VL序列
用人CRBN（SEQ ID NO:12）的氨基酸序列65-76（SEQ ID NO:1）使兔易感，并除去脾以用于IgG分型和单克隆抗体产生。
通过Epitomics对来自两个CGN-6杂交瘤克隆的IgG重链和轻链测序。两个克隆是CGN-6-1-11和CGN-6-4-5。
RabMAb IgG分子克隆方法的简要说明：
根据生产商建议的规程，使用TURBOCAPTURE试剂盒（Qiagen:目录号#72232）分离来自杂交瘤细胞的信使RNA（mRNA），然后使用低聚dT引物反转录到cDNA中。使用专利保护的引物OYZ64-2和OYZvh3，PCR扩增重链可变区（VH）。使用专利保护的引物OYZ62和OYZ71，PCR扩增整条轻链（LC）。在1%的琼脂糖凝胶上分辨PCR产物，然后使用Qiagen凝胶纯化试剂盒（Qiagen：目录号#28704）纯化，并对纯化的DNA片段进行测序。
CGN-6-1-11-重链核苷酸序列（SEQ ID NO:4）：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCACTGTCAGTCAGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTTACTATGGAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTAGAATACATCGGATACATTTATAGTGATAGTGATAAGACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATTTGAAAATCACCAGTCCGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTACTCCGCTTGCTAGTTATAGCATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTTAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA
CGN-6-1-11-重链蛋白序列（SEQ ID NO:5）：
METGLRWLLLVAVLKGVHCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSYYGVSWVRQAPG
KGLEYIGYIYSDSDKTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTIEDTATYFCARGTPLAS
YSIWGPGTLVTVSLGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTL
TNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCP
PPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPP
LREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYT
MGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKL
SVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK-
CGN-6-1-11-轻链核苷酸序列（SEQ ID NO:6）：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCCCAGGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAATAACTATTTATCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATTTACGAAGCGTCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCCCCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATTTGGGACACAGTTCACTTTCACCATTAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCTTTTACTACTGTGCAGGCGGTTATTATGGTAATATTTTTTTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG
CGN-6-1-11-轻链蛋白序列（SEQ ID NO:7）：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNYLSWF
QQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPPRFKGSGFGTQFTFTISDLECDDAAFYYCAGGYYGNI
FFFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQT
TGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC-
CGN-6-4-5-重链核苷酸序列（SEQ ID NO:8）：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGGTATGGAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAACACATCGGATACATTTATAGTGATCCTGGTATGACATTCTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATTTGAAAATGACCAGTCCGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTACTCCGCTTGCTAGTTATAGCACCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTTAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA
CGN-6-4-5-重链蛋白序列（450个氨基酸）（SEQ ID NO:9）：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPG
KGLEHIGYIYSDPGMTFYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSPTIEDTATYFCARGTPLA
SYSTWGPGTLVTISLGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGT
LTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTC
PPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARP
PLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVY
TMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSK
LSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK-
CGN-6-4-5-轻链核苷酸序列（SEQ ID NO:10）：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCTCAAGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTGAGAATATTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATCAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACGATTCAGTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTGGTAATATTTTTACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG
CGN-6-4-5-轻链蛋白序列（SEQ ID NO:11）：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPASVSAAVGGTVTINCQSSENIYKNNYLSWF
QQKPGQPPKLLIYQASTLASGVPSRFKGSGSGTRFSLTISDLECDDAATYYCAGGYSGNI
FTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQT
TGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC-
图35（重链）和36（轻链）中提供了CGN6-1-11和CGN6-4-5抗体的重链和轻链的氨基酸序列比对。
6.21使用抗CRBN的单克隆抗体CGN-6-4-5的免疫印迹法和免疫荧光法
兔单克隆抗体CGN-6-4-5特异性识别变性免疫印迹上全长51kDa的人CRBN蛋白质。
共聚焦显微免疫荧光法：
1:1000稀释CGN-6-4-5。图37中显示了DF15和DF15R细胞的示例性细胞染色。具体地，图37A和37B显示了使用1μg/ml CGN-6-4-5抗体（绿色）（A）或CGN-6-4-5抗体/CRBN阻断肽混合物（1:5过量比）（B）的DF15（左侧部分）和DF15R细胞（右侧部分）的共聚焦免疫荧光分析。用Dapi（蓝色）进行核染色。
免疫印迹法
在0.1%吐温PBS缓冲液中1:10000稀释CGN-6-4-5。图38中显示了使用含有内源CRBN（DF15）的骨髓瘤细胞、无CRBN的DF15R和表达重组flag标记的CRBN的HEK293细胞的示例性免疫印迹法。通过将抗体与5倍（按重量计）过量的阻断肽在500μl PBS中混合并在室温下以恒定旋转孵育2小时来进行肽中和。
6.22沙利度胺、来那度胺和玻马利度胺通过戊二酰亚胺部分结合至CRBN
研究了苯邻二甲酰亚胺和戊二酰亚胺与CRBN的结合以说明沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺和在结构上类似的化合物的CRBN结合机制。戊二酰亚胺与CRBN结合，而苯邻二甲酰亚胺不结合。因此，这些结果支持沙利度胺、来那度胺和玻马利度胺通过戊二酰亚胺部分与CRBN结合的假设。参见图39A。
6.23甲基-玻马利度胺的CRBN结合是对映选择性
研究了S-甲基-玻马利度胺和R-甲基-玻马利度胺的结合以确定CRBN结合是否是对映选择性的。S-甲基-玻马利度胺对CRBN的亲合力比R-甲基-玻马利度胺大。参见图39B。
提供了上述实施例，从而为本领域的一般技术人员提供如何实施和使用所主张的实施方式的完整发明公开和说明，并且上述实施例不意欲限制本文所公开内容的范围。对于本领域技术人员显而易见的改变旨在处于以下权利要求的范围内。在本说明书中引用的所有专利公开、专利和专利申请如具体并且单独指明每个专利公开，专利或专利申请作为参考并入本文的一样作为参考并入本文。

Claims (31)

1.一种出于对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物预测临床反应、监测临床反应或监测患者的顺应性的目的，基于癌症中CRBN表达水平或DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4或NFκB的表达水平选择一组癌症患者的方法；其中，所述癌症患者是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、黑素瘤或实体瘤患者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症患者是多发性骨髓瘤患者。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症患者是非霍奇金淋巴瘤患者。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中DDB1的表达水平。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中DDB2的表达水平。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中GSK3B的表达水平。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中CUL4A的表达水平。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中CUL4B的表达水平。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中XBP-1的表达水平。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中FAS1的表达水平。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中RANBP6的表达水平。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中DUS3L的表达水平。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中PHGDH的表达水平。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中AMPK的表达水平。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中IRF4的表达水平。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于所述癌症中NFκB的表达水平。
17.一种基于CRBN基因中突变的存在或出现，鉴别或监测多发性骨髓瘤患者对沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮疗法的耐受性的方法。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述CRBN基因的突变是编码区c.745C>CA中的单核苷酸多态性，导致CRBN的DDB1结合域内蛋白质中氨基酸的变化249D>YD。
19.一种选择对使用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、其立体异构体，或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的治疗起反应的一组癌症患者的方法；
其基于CRBN表达水平或患者T细胞、B细胞或浆细胞中DDB1、DDB2、GSK3B、CUL4A、CUL4B、XBP-1、FAS1、RANBP6、DUS3L、PHGDH、AMPK、IRF4或NFκB的表达水平，目的在于对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物预测临床反应、监测临床反应或监测患者对给药的顺应性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述癌症患者是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、黑素瘤或实体瘤患者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述癌症患者是多发性骨髓瘤患者。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述癌症患者是弥漫性大B-细胞淋巴瘤患者。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述弥漫性大B-细胞淋巴瘤是激活的B-细胞样亚类。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，选择一组癌症患者的方法基于患者T细胞、B细胞或浆细胞内CRBN或IRF4的表达水平。
25.一种免疫特异性结合至CRBN中表位的分离抗体，其中，所述表位具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。
26.根据权利要求25所述的分离抗体，其中，所述抗体是多克隆的。
27.一种免疫特异性结合CRBN的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQID NO:5或SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的重链。
28.一种免疫特异性结合CRBN的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQID NO:7或SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的轻链。
29.一种包含具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的轻链的分离抗体。
30.一种包含具有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的轻链的分离抗体。
31.利用根据权利要求25所述的抗体来测量患者肿瘤或宿主细胞中CRBN表达水平的方法，所述方法用于对施用沙利度胺、来那度胺、玻马利度胺或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮、或其立体异构体、或其可药用盐、溶剂化物、水合物、共晶体、笼形物或多晶形物的疗法的预测临床反应、监测临床反应或监测患者对给药的顺应性或监测对所述疗法的耐受性的发展。
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